VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE OS ISOLADOS DE Alternaria macrospora DO ALGODOEIRO
Yeshwant R. Mehta1, D. Cassetari Neto2, Edivaldo Cia3, Maria A Pizzinato3, Eliria, A. Teixeira4, H.C.
Cunha4 . (1) IAPAR, C.P. 481, Londrina, PR, e-mail: [email protected], (2) Universidade Federal de Mato
Grosso, Cuiabá, MT, (3) IAC, C.P 28, Campinas, SP, (4) Agência Rural, Goiania, GO.
RESUMO
A Alternaria causada por Alternaria macrospora é transmitida pela semente e se manifesta em todas
as fases de desenvolvimento da planta. Estudou-se a variabilidade genética entre os isolados de A.
macrospora provenientes de diferentes cultivares e regiões produtoras do algodão no Brasil, através de
análise molecular. A única espécie de Alternaria ocorrendo no Brasil foi a A. macrospora. Segundo análise
de RAPD, 75% dos isolados dos estados do Paraná, São Paulo, e Mato Grosso formaram um grupo a 90%
de similaridade. Os isolados do Estado de Goiás foram distintos dos demais isolados a 65-80% de
precisão. Alguns isolados que mostraram diferença em agressividade na cultivar EPAMIG LIÇA, também
mostraram diferença entre si, segundo análise de RAPD e ERIC/REP-PCR. Os isolados menos agressivos
formaram um grupo separado, enquanto que, o isolado não patogênico de A. alternata formou um grupo
totalmente distinto. Análise da região ITS mostrou padrão de bandas semelhantes para todos os isolados.
Conclui-se que para estudos sobre a medição de grau de resistência das cultivares, a utilização de mistura
dos isolados mais agressivos provenientes das regiões geograficamente diferentes é desejável.
INTRODUÇÃO
A Alternaria causada por Alternaria macrospora é uma doença importante do algodoeiro no Brasil. A
doença é transmitida pela semente e se manifesta em todas as fases de desenvolvimento da planta entre
as folhas cotiledonárias e o amadurecimento de maçã. Os sintomas típicos da doença são manchas
circulares (2-3 mm) com centro esbranqueçado (Mehta et al, 2003). Entretanto, nos trabalhos de casa de
vegetação, a Alternaria transmitida pelas sementes naturalmente infectadas, produziu dois tipos de
sintomas nas plântulas da cultivar ITA 90, 35 dias após o plantio. Um tipo de sintoma foi caracterizado
como manchas circulares e outro como manchas necróticas lineares extendidas para as nervuras da folhas
primárias. O segundo tipo de sintoma foi considerado incomum para a Alternaria, pois era muito
semelhante aquele causado por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum. O Postulado de Koch
confirmou A. macrospora como agente causal de ambos os sintomas. Conhecimento detalhado sobre a
diversidade do patógeno é essencial para compreender a estrutura genética da população do patógeno a
fim de auxiliar na definição de estratégias dos programas de melhoramento genético. O presente trabalho
visa identificar variabilidade genética entre os isolados de A. macrospora provenientes de diferentes
cultivares e regiões produtoras do algodão no Brasil, através de análise molecular.
MATERIAL E MÉTODOS
Nos trabalhos de casa de vegetação, a Alternaria transmitida pelas sementes naturalmente
infectadas, produziu dois tipos de sintomas nas plântulas da cultivar ITA 90, 35 dias após o plantio. Um tipo
de sintoma foi caracterizado como manchas circulares e outro como manchas necróticas lineares
extendidas para as nervuras da folhas primárias. O segundo tipo de sintoma foi considerado incomum para
a Alternaria, pois era muito semelhante aquele causado por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum. O
Postulado de Koch confirmou A. macrospora como agente causal de ambos os sintomas. O presente
trabalho visa identificar variabilidade genética entre os isolados de A. macrospora.
Prospecção foi realizada nos campos comerciais do algodoeiro dos estados de Goiás, Mato Grosso,
São Paulo e Paraná, entre 1999 e 2002, abrangendo diversas cultivares e regiões para garantir a maior
representatividade possível da população de Alternaria spp. ocorrendo no Brasil. Todos os 44 isolados
monospóricos patogênicos e foram identificados como A. macrospora e nenhuma infecção causada por A.
alternata foi encontrada (Tabela 1).
O DNA total foi extraído de acordo com Doyle & Doyle (1990). Para os ensaios de RAPD A
amplificação de DNA foi realizada conforme descrito anteriormente, utilizando os primers fornecidos pela
Operon Technologies, Inc. (Mehta, 2001; Bibanco et al, 2003). As reações de amplificação foram
verificadas através de eletroforese em gel de agarose e visualizados em luz U.V. após coloração com
brometo de etídio. Os dados foram analisados considerando a presença e ausência das bandas. A matriz
de distância foi construída através do programa UPGMA ("unweighted pair group method with arithmetic
mean"), utilizando o coeficiente de Jaccard, com o programa NTSYS-pc, versão 1.8.
Os primers REP1/REP2 e ERIC1/ERIC2 (Mehta et al, 2002a, 2002b) foram adquiridos da Life
Technologies, e foram utilizados para amplificar o DNA dos isolados, conforme descrito anteriormente
(Mehta et al, 2002a). Os isolados de A. macrospora também foram analisados para a região espaçadora
ITS de rDNA (PCR-RFLP), (Achenback & Patrick, 1997). Os produtos de amplificação foram digeridos
utilizando seis enzimas de restrição selecionadas ao acaso (Alu I, Bgl II, Dra I, Eco R1, Hind III, e Pst I). Os
produtos de digestão foram separados através de eletroforese em géis de agarose (2%). A digestão do
DNA foi realizada seguindo as instruções do fabricante.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados de prospecção demonstram que a principal espécie de Alternaria ocorrendo no Brasil
é a A. macrospora, sendo que nenhuma infecção causada por A. alternata foi encontrada (Tabela 1).
Segundo análise de RAPD, 75% dos isolados (30 isolados) formaram um grupo a 90% de similaridade.
Este grupo é formado pela maioria dos isolados dos estados do Paraná, São Paulo, e Mato Grosso. De
uma maneira geral os isolados do Estado de Goiás foram distintos dos demais isolados a 65-80% de
similaridade sendo que os isolados Nos. 41, 42, 43 e 44 formaram um grupo separado (Fig. 3). Alguns
isolados que mostraram diferença em agressividade na cultivar EPAMIG LIÇA, também mostraram
diferença entre si, segundo análise de RAPD (Fig. 1 e Tabela1). Os isolados menos agressívos Nos. 3, e 7,
formaram um grupo separado, emquanto que, o isolado não patogênico de A. alternata formou um grupo
totalmente distinto dos demais isolados. Resultados bastante semelhantes foram obtidos através de
ERIC/REP-PCR (Fig. 4), (Mehta et al, 2002). Análise da região ITS mostrou tamanho de fragmento de 600
pb para todos os isolados (Fig.2). Quando os produtos de amplificação foram digeridos com seis enzimas
de restrição, um padrão de bandas semelhante foi obtido para todos os isolados. Considerando a
variabilidade genética encontrada entre os isolados de A. macrospora, pode-se concluir que para estudos
sobre a medição de grau de resistência das cultivares do algodoeiro, a utilização de mistura dos isolados
mais agressivos provenientes das regiões geograficamente diferentes é desejável (Mehta et al, 2003).
Tabela 1. Origem dos isolados de Alternaria macrospora, utilizados no presente trabalho.
Isolado
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
Código
12649
13305
13314
13357
13365
13372
13409
13410
13411
13412
13413
13414
13415
13416
13417
13418
13419
484
510
512
514
13571
13573
13574
13588
13589
13591
13592
13593
13595
13789
13791
13795
13796
13806
13808
13814
13819
13820
13821
13822
13823
13827
15069
Local/Estado/Cultivar/Ano
Alternaria alternata (Saprófito de semente)**
Londrina/PR/Codetec 401/1999
Cambará/PR/linha avançada/2000
Primaveira d´Oeste,MT/Coodetec404/2001
Serra de Petrolina/MT/Disconhecida/2001
Campo Verde/MT/Desconhecida/2001
Campinas/SP/IAC 97-86/2001
Jaú/SP/Desconhecida/2001
Ituverava/SP/IAC 97-86/2001
Adamantina/SP/Desconhecida/2001
Presidente Bernardes/SP/Epamig Liça/2001
Caiabu/SP/Br 201/2001
Caiabu/SP/IAC 97-86/2001
Tatuí/SP/Desconhecida/2001
Tietê/SP/Desconhecida/2001
Tietê/SP/Desconhecida/2001
Holambra/SP/Desconhecida/2001
Descon(semente)/MT/Ita90/2001
Descon(semente)/BRS Facual/MT/2001
Descon(semente)/CD404/MT/2001
Descon(semente)/Makina/MT/2001
Rondonôpolis, MT/Popu.segre/2002
Umarama, PR/IPR 96/2002
Umarama, PR/IPR 96/2002
Goioeré, PR/Coodetec 404/2002
Juranda, PR/Coodetec 404/2002
Goioeré, PR/Coodetec401/2002
Campo Mourão, PR/Desc./2002
Juranda, PR/DeltaOpal/2002
Goioeré, PR/Descon/2002
Campo Verde/MT/1067/2002
Serra da Petrolina, MT/Descon./2002
Campo Verde, MT/Saturno/2002
Campo Verde, MT/Maquina/2002
Itiquira, MT/Maquina/2002
Itiquira, MT/Fibermax 986/2002
Panama, GO/Ita90/2002
Jatai, GO/Descon/2002
Acreuna, GO/Aroeira/2002
Acreuna, GO/Aroeira/2002
Acreuna, GO/Fibermax986/2002
Rio Verde, GO/Aroeira/2002
Acreuna, GO/Delta Opal/2002
Palmeiras de Goiás, GO/Ita90/2002
Patogenicidade*
0
2
1
1
2
4
1
2
4
3
3
2
2
2
3
1
2
4
5
5
4
5
4
5
4
4
4
5
5
3
3
4
4
4
3
4
5
3
3
4
3
5
4
5
*A patogenicidade foi testada na cultivar Epamig-Liça, utilizando uma escala visual de 0-5 (Mehta, 1998); onde 0=sem
sintomas; 1=pontuações pequenas <5% da área foliar infectada (AFI); 2= lesões necroticas, pequenas sem clorose 5 á 25%
de AFI; 3=lesões necroticas com clorose 26 á 50% de AFI; 4= lesões necroticas com clorose coalescendo, 51 á 75% de AFI; e
5=lesões coalescendo com clorose, AFI>76% e ou morte da planta. ** Isolado saprofítico de A alternata utilizado para
comparação.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
M 1 2 3 4 5 6 7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
800 pb-
600 pb400 pb200 pb-
Figura 1. Amostra de gel mostrando o padrão de
bandas RAPD produzidas pelo primer OPK-16. Linha
M=Marcador molecular 100 pb Ladder, Linha
1 a 19 isolados de A. macrospora.
Figura 2. Amostra de gel mostrando padrão de
bandas da região ITS em 19 isolados de A.
macrospora amplificado com par de primer ITS4 / ITS5
e digerido com enzima de restrição Hind III. Linha
M=Marcador molecular 100 pb Ladder.
.
Figura. 3. Dendrograma (Sj) produzida pela análise
UPGMA baseado nos dados obtidos com oito RAPD
primers utilizando DNA de 44 isolados de A. macrospora
Figura 4. Dendrograma (Sj) produzida pela análise
UPGMA baseado nos primers ERIC1/ERIC2 e REP1
/REP2 utilizando 44 isolados de A. macrospora
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BIBANCO, K.R.P.; MEHTA, Y.R.; CIA, E.; PIZZINATO, M.A. Identificação de variabilidade genética entre
os isolados de Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum do algodoeiro. Trabalho apresentado neste
Congresso. 2003.
DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15. 1990.
MEHTA, Y.R., MEHTA, A. & ROSATO, Y.B. ERIC and REP-PCR banding patterns and sequence analysis
of the internal transcribed spacer of rDNA of Stemphylium solani from cotton. Current Microbiology 44:323328. 2002.
MEHTA, Y.R.; TEIXEIRA, E. A.; CUNHA, H.F.; ERIVALDO, J.; RUANO, O. Resposta diferencial das
cultivares de algodoeiro a Alternaria macrospora. Trabalho apresentado neste Congresso. 2003.