INNO-LiPA HLA-A Update
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2
TABLE OF CONTENTS
Symbols used . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
English
Intended use . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
Test principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
Description, preparation for use and recommended storage conditions . . .9
Materials required but not provided . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
Safety and environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
Specimens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Manipulation procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Strip handling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Directions for manual incubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Directions for manual changing of liquid in the troughs . . . . . . . . . . .14
Remarks and precautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
Manual test procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
Samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
Denaturation and hybridization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
Stringent wash . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
Color development . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
Automated test procedure: Auto-LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
Reading . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
Interpretation of results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Interpretation software: LiRAS™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Limitations of the procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Test performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
Accuracy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
Resolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Probe reactivity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Sensitivity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Precision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Français
But du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21
Principe du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21
Réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
Description, préparation et conditions de conservation . . . . . . . . . . .22
Matériel nécessaire non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24
Consignes de sécurité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24
Echantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
Manipulations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
Manipulation des bandelettes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
Directives pour incubation manuelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
Directives pour changement des solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
Remarques et précautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
*INNOGENETICS® is a Registered Trademark of Innogenetics N.V.
3
INNO-LiPA HLA-A Update
Procédure manuelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
Echantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
Dénaturation et hybridation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
Lavage Stringent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29
Révélation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29
Procédure automatisée: Auto-LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29
Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Lecture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Interprétation des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
Logiciel d'interprétation: LiRAS™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
Limites du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
Performances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
Précision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
Résolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
Réactivité des sondes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
Sensibilité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
Reproductibilité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
Deutsch
Beabsichtigter Verwendungszweck . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34
Testprinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34
Gelieferte Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
Beschreibung, Vorbereitung, empfohlene Lagerung und Haltbarkeit .35
Zusätzlich erforderliche Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
Sicherheitshinweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38
Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
Vorbereitung und Hinweise zur Handhabung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
Handhabung der Teststreifen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
Hinweise zur manuellen Inkubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
Hinweise zum manuellen Auswechseln der Flüssigkeit in den
Inkubationswannen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
Manueller Arbeitsablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
Denaturierung und Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
Stringentes Waschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
Farbentwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
Automatischer Arbeitsablauf: Auto-LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43
Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
Ablesen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
Validierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
Interpretation der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
Automatische Interpretation der Ergebnisse mit Software: LiRAS™ . .45
Einschränkungen der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
Leistungsfähigkeit des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Exaktheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Auflösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Sondenreaktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
Empfindlichkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
Präzision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
INNOGENETICS®
4
Italiano
Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48
Principio del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48
Reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49
Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazione
raccomandate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49
Materiali richiesti ma non forniti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51
Sicurezza e ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51
Campioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53
Procedure di manipolazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53
Trattamento delle strip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53
Indicazioni per l' incubazione manuale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53
Indicazioni per il cambiamento manuale dei liquidi nelle vaschette . .54
Note e precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54
Procedura manuale del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
Campioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
Denaturazione e ibridazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
Lavaggio stringente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56
Sviluppo del colore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56
Procedura automatica del test: Auto-LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57
Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57
Lettura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57
Validazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57
Interpretazione dei risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58
Software di interpretazione: LiRAS™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
Limiti della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
Test performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
Accuratezza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
Risoluzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60
Reattività delle sonde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60
Sensibilità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
Precisione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
Español
Uso al que está destinado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
Principios del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .62
Descripción, preparación para el uso y condiciones de
almacenamiento recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .62
Materiales necesarios pero no se suministrados . . . . . . . . . . . . . . . . .64
Seguridad y medio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65
Muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66
Procedimientos de manipulación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66
Manipulación de las tiras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66
Instrucciones para la incubación manual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .67
Instrucciones para cambiar manualmente el líquido de las cubetas .67
Observaciones y precauciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68
Procedimiento manual del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68
Muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68
Desnaturalización e hibridación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69
5
INNO-LiPA HLA-A Update
Lavado astrigente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69
Desarrollo de color . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70
Procedimiento de ensayo automatizado: Auto-LiPA . . . . . . . . . . . . . . .70
Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
Lectura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
Validación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
Interpretación de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72
Software de interpretación: LiRAS™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72
Limitaciones del procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72
Protocolo del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
Precisión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
Resolución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74
Reactividad de las sondas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74
Sensibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74
Precisión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75
Português
Utilização . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75
Princípio do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75
Reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76
Descrição, preparação para utilização e condições recomendadas de
conservação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76
Materiais necessários mas não fornecidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78
Segurança e meio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .79
Amostra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80
Procedimentos de Manipulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80
Manuseamento das tiras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80
Indicações para incubação manual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80
Instruções para a mudar manualmente o líquido nas cuvetes . . . . . .81
Observações e precauções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81
Procedimento manual do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82
Amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82
Desnaturação e hibridação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82
Lavagem adstringente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83
Desenvolvimento da cor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83
Procedimento automático de teste: Auto-LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84
Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84
Leitura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84
Validação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85
Interpretação dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85
Software de interpretação: LiRAS™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .86
Limites do procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .86
Performance do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .86
Precisão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .87
Resolução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .87
Reactividade das sondas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .87
Sensibilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .88
Precisão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .88
INNOGENETICS®
6
Symbols used
Manufactured by
Fabriqué par
Hersteller
Prodotto da
Fabricado por
In vitro diagnostic medical device
Pour In vitro diagnostic
Hilfsmittel für die medizinische in-vitro Diagnostik
Dispositivo medico - diagnostico in vitro
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Dispositivo médico para diagnóstico In vitro
Lot number
Numéro de lot
Chargennummer
Numero di lotto
Número de lote
Catalogue number
Référence catalogue
Katalognummer
Codice
Número de catálogo
Use by
Utiliser jusqu'au
Durchführung durch
Uso
Para ser usado por
Uso por
Consult instructions for use
Instructions d'emploi
Siehe Bedienungsanleitung
Consultare le istruzioni per l'uso
Consulte las instrucciones de uso
Consultar instruções de utilização
Temperature limitation
Température de stockage
Temperaturlimits
Limiti di temperatura
Limitaciones de temperatura
Limitações de temperatura
Strips 1
Ref. 56714
Bandelettes 1
Teststreifen 1
Tiras 1
7
INNO-LiPA HLA-A Update
Strips 2
Ref. 56715
Bandelettes 2
Teststreifen 2
Tiras 2
LiPA Control
Ref. 56717
Contrôle LiPA
LiPA-Kontrollel
Controllo LiPA
Control LiPA
Controlo LiPA
Denaturation Solution
Ref. 56718
Solution de Dénaturation
Denaturierungslösung
Soluzione di Denaturazione
Solución de desnaturalización
Solução de Desnaturação
Hybridization Solution
Ref. 56719
Solution d'Hybridation
Hybridisierungslösung
Soluzione di Ibridazione
Solución de hibridación
Solução de Hibridação
Stringent Wash Solution
Ref. 56720
Solution de Lavage Stringent
Stringente Waschlösung
Soluzione di Lavaggio Stringente
Solución de lavado astrigente
Solução de Lavagem Adstringente
Conjugate 100x
Ref. 56716
Conjugué 100x
100-fach konzentriertes Konjugat
Coniugato 100x
Conjugado 100x
Conjugate Diluent
Ref. 55671
Diluant Conjugué
Konjugatverdünner
Diluente del Coniugato
Diluyente de conjugado
Diluente do conjugado
Substrate BCIP/NBT 100x
Ref. 55723
Substrat BCIP/NBT 100x
100-fach konzentriertes BCIP/NBT-Substrat
Sustrato BCIP/NBT 100x
Substrato BCIP/NBT 100x
INNOGENETICS®
8
Substrate Buffer
Tampon Substrat
Substratpuffer
Tampone del Substrato
Tampón sustrato
Tampão de Substrato
Rinse Solution 5x
Solution de Rinçage 5x
5-fach konzentrierte Waschlösung
Soluzione di Risciacquo 5x
Solución de aclarado 5x
Solução de Enxaguamento 5x
Ref. 55732
Ref. 56721
English
Intended use
The INNO-LiPA HLA-A Update is a line probe assay, for in vitro use,
designed for the molecular typing of human leukocyte antigen (HLA) A
alleles at the allele group level.
Test principle
The INNO-LiPA HLA typing tests are based on the reverse hybridization
principle summarized in Figure 1. Amplified biotinylated DNA material is
chemically denatured, and the separated strands are hybridized with specific
oligonucleotide probes immobilized as parallel lines on membrane-based strips.
This is followed by a stringent wash step to remove any mismatched amplified
material. After the stringent wash, streptavidin conjugated with alkaline
phosphatase is added and bound to any biotinylated hybrid previously formed.
Incubation with a substrate solution containing a chromogen results in a
purple/brown precipitate.
The reaction is stopped by a wash step, and the reactivity pattern of the
probes is recorded.
With the INNO-LiPA HLA-A Update, an amplification kit (INNO-LiPA HLA-A
Multiplex) is available for standardized preparation of biotinylated amplified
material. The amplification kit is based on the polymerase chain reaction
(PCR*).
Amplification products are subsequently hybridized using 2 typing strips on
which 43 sequence-specific probes and 2 control lines are fixed (Figure 2).
* Use of this product is covered by a license from F. Hoffmann La Roche Ltd. and Roche Molecular Systems, Inc.
9
INNO-LiPA HLA-A Update
Line Probe Assay (LiPA)
Reverse hybridization principle
Chromogen
(NBT/BCIP)
Purple
precipitate
Alkaline phosphatase
Streptavidin
Biotin
Amplified target
DNA probe
Nitrocellulose strip
Figure 1: Principle of the INNO-LiPA HLA typing test procedure
INNO-LiPA HLA-A Update: steps involved
Step 1
Multiplex amplification of exons 1 to 4 of the HLA-A locus
Step 2
Hybridization and stringent wash with 44 probe lines immobilized on two
INNO-LiPA HLA-A Update Strips (56°C).
Step 3
Color development
Step 4
Interpretation of the probe reactivity pattern
The INNO-LiPA HLA-A Update is designed to give the best possible
resolution, using the reverse hybridization assay format, at the allele group
level (this means the first two digits after the asterisk in an allele name
when following standard HLA nomenclature e.g. HLA-A*26).
In addition to the allele group interpretation, the software will give all
possible allele combinations, this information however, should be
considere as extra and not as decisive.
Reagents
Description, preparation for use and recommended storage
conditions
-
Unopened and stored at 2 - 8°C, all test reagents including the coated test
strips are stable until the expiry date of the kit. Do not freeze reagents.
All reagents and the plastic tubes containing the test strips should be
brought to room temperature (20 - 25°C) approximately 60 minutes before
use and should be returned to the refrigerator immediately after use.
Alterations in physical appearance of kit components may indicate
instability or deterioration.
INNOGENETICS®
-
10
The kit should be stored isolated from any source of contaminating
DNA, especially amplified DNA products.
To minimise the possibility that strips curl before use, it is recommended to
store the tube horizontally.
Each pack contains:
Component
Strips 1
Quantity
1 x 20
Strips 2
1 x 20
LiPA Control
1 x 0.05 ml
Denaturation Solution 1 x 1 ml
Hybridization Solution 2 x 80 ml
Stringent Wash
Solution
2 x 200 ml
Conjugate Diluent
1 x 150 ml
Conjugate 100x
1 x 1.5 ml
Substrate Buffer
1 x 235 ml
Storage Description
2 - 8°C Containing 20 strips 1 for INNO-LiPA
HLA-A Update marked with a Prussian
blue marker line.
2 - 8°C Containing 20 strips 2 for INNO-LiPA
HLA-A Update marked with a turquoise
marker line.
2 - 8°C Containing ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) and 0.01%
methylisothiazolon (MIT)/0.1%
chloroacetamide (CAA) as preservative.
2 - 8°C Alkaline solution containing EDTA. The vial
should be closed immediately after use;
prolonged exposure of this solution to air
leads to a rapid deterioration of the
denaturing strength.
2 - 8°C Saline sodium phosphate EDTA (SSPE)
buffer containing 0.5% sodium dodecyl
sulfate (SDS). The Hybridization Solution
should be pre-warmed to a temperature of
at least 37°C and must not exceed 56°C
(all crystals should be dissolved before
use).
2 - 8°C SSPE buffer containing 0.1%
SDS. The Stringent Wash Solution should
be pre-warmed to a temperature of at
least 37°C and must not exceed 56°C (all
crystals should be dissolved before use).
2 - 8°C Phosphate buffer containing NaCl, Triton®,
protein stabilizers, and 0.01% MIT/0.1%
CAA as preservative.
2 - 8°C Streptavidin labeled with alkaline
phosphatase in Tris buffer containing
protein stabilizers and 0.01% MIT/0.098%
CAA as preservative, to be diluted 1/100 in
Conjugate Diluent before use. Prepare
2 ml Conjugate working solution for each
test trough + 2 ml in excess (Conjugate
working solution can be prepared during
stringent wash) for manual testing.
For Auto-LiPA, make 10 ml in excess.
The Conjugate working solution is stable
for 24 hours at room temperature
(20 - 25°C) if stored in the dark.
2 - 8°C Tris buffer containing NaCl, MgCl2 and
0.01% MIT/0.1% CAA as preservative.
11
INNO-LiPA HLA-A Update
Substrate BCIP/NBT 1 x 1.5 ml
100x
2 - 8°C
Rinse Solution 5x
2 x 80 ml
2 - 8°C
Incubation tray
Reading card
Data reporting sheet
5
1
2
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl
phosphate p-toluidine salt (BCIP) and
nitroblue tetrazolium (NBT) in
dimethylformamide (DMF), to be diluted
1/100 in Substrate buffer before use.
Prepare 2 ml Substrate working solution
for each test trough + 2 ml in excess
(Substrate working solution can be
prepared during conjugate incubation) for
manual testing. For Auto-LiPA, make
10 ml in excess. The Substrate working
solution is stable for 24 hours at room
temperature (20 - 25°C) if stored in the
dark.
Phosphate buffer containing NaCl,
Triton®, and 0.05% MIT/0.48% CAA as
preservative, to be diluted 1/5 (1 part +
4 parts) in distilled or deionized water
before use. Prepare 8 ml Rinse working
solution for each test trough + 10 ml in
excess. For Auto-LiPA, make 20 ml in
excess.The Rinse working solution is
stable for 2 weeks at 2 - 8°C.
Containing 8 troughs each.
For identification of positive probes.
For storage of developed strips.
Materials required but not provided
-
-
INNO-LiPA HLA-A Multiplex.
Water bath with shaking platform (80 rpm; with inclined lid; temperature
adjustable to 56°C ± 0.5°C).
Aspiration apparatus.
Calibrated thermometer.
Orbital, reciprocal, or rocking platform shaker.
Recommendations for an orbital shaker:
•
the diameter of the circular motion should be equal or superior to 13 mm.
•
recommended speed for a 13 mm circular motion is 160 rpm.
Recommendation for a reciprocal shaker:
•
recommended speed for the to-and-fro motion is 80 movements per minute.
Recommendation for a rocking platform shaker:
•
the shaking angle should not exceed 13° to avoid spilling of liquid.
•
recommended speed is 50 rpm.
Vortex mixer or equivalent.
Graduated cylinders (10, 25, 50, and 100 ml).
Distilled or deionized water.
Disposable gloves.
Disposable sterile pipette tips (preferably cotton-plugged).
Forceps for strip handling.
Adjustable pipettes to deliver 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, and 200 - 1000 µl.
Dispensing Multipipette (Eppendorf, optional).
Timer, 2 hours (± 1 minute).
INNOGENETICS®
12
Safety and environment
Please refer to the manufacturer's safety data sheet and product labeling
for information on potentially hazardous components.
R20/21, R36, R45, R61, S36/37, S45 S53
Toxic! Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.
May cause cancer. May cause harm to unborn child. Wear suitable protective
clothing and gloves. In case of accident or if you feel unwell, seek medical
advice immediately (show the label if possible). Avoid exposure obtain special
instructions for use. Restricted to professional users.
Contains Dimethylformamide, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate ptoluidine salt: Substrate BCIP/NBT 100x.
R43, S24-37
Irritant! Avoid contact with skin. May cause sensitisation by skin contact.
Wear suitable gloves. Contains 2-chloroacetamide: Rinse Solution, Substrate
Buffer, Conjugate Diluent and LiPA Control.
R36/38, S23-24-26
Irritant! Irritating to eyes and skin. Do not inhale vapour. Avoid contact with
skin. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and
seek medical advice. Contains sodium hydroxide: Denaturation Solution.
- Specimen should always be handled as potentially infectious.
Therefore, all blood components and biological materials should be
considered as being potentially infectious and should be handled as
such. Only adequately trained personnel should be permitted to
perform the test procedure. All blood components and biological
materials should be disposed of in accordance with established safety
procedures.
• Autoclave for at least 15 minutes at 121°C
• Incinerate disposable material.
• Mix liquid waste with sodium hypochlorite so that the final
concentration is ± 1% sodium hypochlorite. Allow to stand overnight
before disposal.
CAUTION: Neutralize liquid waste that contains acid before adding
sodium hypochlorite.
- Use of personal protective equipment is necessary: gloves and safety
spectacles when manipulating dangerous or infectious agents.
- Waste should be handled according to the institution's waste disposal
guidelines. Also observe all federal, state, and local environmental
regulations.
13
INNO-LiPA HLA-A Update
Specimens
Since the INNO-LiPA HLA-A Update test utilizes biotinylated, amplified
DNA material, an amplification kit INNO-LiPA HLA-A Multiplex is available
as an accompanying tool.
Manipulation procedures
Strip handling
-
The strips are designed to be used only once!
Do not touch the strips with bare hands; use clean forceps.
Use a pencil for identification of the test strips. Do not use ballpoints, etc.
Write the ID above the marker line on the strips.
Throughout the different incubation steps, test strips should always
remain in the same trough.
Unused or developed strips should be kept away from intense light
and heat.
Allow the developed strips to dry completely before interpretation,
covering, and storing.
Developed dry strips should be stored preferably in the dark at 20 - 25°C.
Do not reuse the troughs.
Directions for manual incubation
-
-
-
-
Incubation at 56°C ± 0.5°C during hybridization and stringent wash is the
most critical step in avoiding false positive (temperature too low) or false
negative/very weak signals (temperature too high).
A shaking water bath with inclined lid allows a good control of temperature
variations. Strict temperature control with a calibrated thermometer is
necessary.
Always close the lid of the water bath during incubation in order to
avoid false positive signals.
Do not use a hot air shaker for the hybridization and stringent wash.
For hybridization and stringent wash, the troughs should be placed on
the shaking platform of the water bath. Adjust the water level between
1/3 and 1/2 of the height of the trough. Make sure that the troughs do
not float on the water.
The water should be in direct contact with the troughs.
Incubation steps for the color development should be between
20 and 25°C. If the temperature is below 20°C, weaker results may be
obtained. If the temperature is above 25°C, high background and/or false
positive signals may be obtained.
Always incubate exactly for the duration as mentioned in the protocol.
The amplitude of the motion generated by both the shaking water bath
(hybridization and stringent wash procedure) and the shaker (color
development procedure) is critical in achieving maximum sensitivity and
homogeneous staining. The strip surface should be completely submerged.
The amplitude should be as high as possible. However, spilling of liquid
over the edges of the troughs should be avoided! This can lead to
cross-contamination and invalid results.
INNOGENETICS®
-
14
Shaking during incubation of the strips should be performed in such a
way that both the liquid and the test strips move back and forth in the
trough, without liquid being spilled over the edge of the troughs.
Do not cover the tray. During hybridization and stringent wash incubations,
the troughs can be left uncovered in the water bath. Covering the troughs
with microplate sealers may cause cross-contamination.
Directions for manual changing of liquid in the troughs
-
The liquid is aspirated from the trough with a pipette, preferably
attached to a vacuum aspirator. The tray is held at an angle to allow all
liquid to flow to one end of the trough.
Add 2 ml of the appropriate solution to each trough and follow the protocol.
A dispensing Multipipette (Eppendorf) is useful for this purpose.
Repeat this step as many times as indicated in the test procedure.
NOTE:
• Do not allow the strips to dry between two steps.
• Make sure not to damage the surface of the strips when aspirating.
Aspirate the liquid at the top of the strip above the marker line.
• Make sure all liquid is aspirated.
• Make sure the whole strip is thoroughly washed by complete
submersion in the solution.
• Adapt the speed of the shaker when necessary.
Remarks and precautions
-
-
For in vitro use only.
For professional use only.
In order to avoid DNA contamination, a maximum physical separation
between the pre- and post-amplification steps is recommended:
separate rooms, separate pipettes and other lab material, separate lab
coats and gloves (and their stock) are minimum precautions for good
laboratory practice.
Avoid any return from the post-amplification room to the pre-amplification
room.
The use of autoclaved disposable lab material is recommended.
Do not reuse disposable lab material.
Use a new sterile pipette tip for each aliquoted specimen.
Do not use the reagents beyond the expiry date.
Do not mix reagents between kits unless the components have
identical lot numbers.
Avoid microbial contamination of reagents.
Manual test procedure
NOTE:
- Throughout the different incubation steps, the test strips should always
remain in the same trough.
Before incubation, check the temperature of the water bath using a
calibrated thermometer, and adjust the temperature if necessary
before placing the tray in the water bath. Always close the lid.
The LiPA Control should be included in each test run.
15
INNO-LiPA HLA-A Update
Samples
1. HLA-A amplified product (use 10 µl). For sample preparation: see
INNO-LiPA HLA-A Multiplex instructions for use.
NOTE:
• Make sure exactly 10 µl of amplified sample is added. Too much or too
little sample may lead to in a wrong typing result.
2. LiPA Control sample for INNO-LiPA HLA-A Update (use 10 µl;
amplification is not required!)
3. Blank amplified control sample (negative control; use 10 µl).
Denaturation and hybridization
1. Heat a shaking water bath to 56°C ± 0.5°C. Check the temperature using a
calibrated thermometer, and adjust the temperature if necessary. Do not
exceed the indicated temperature. Pre-warm the Hybridization Solution and
Stringent Wash Solution in a water bath of at least 37°C and do not exceed
56°C. Mix before use. All crystals should be dissolved.
2. Using forceps, remove the required number of INNO-LiPA HLA-A
Update Strip 1 and Strip 2 from the tube (one strip 1 and one strip 2
per test sample). Include both strips for the LiPA Control sample for
INNO-LiPA HLA-A Update and for the blank amplified control sample.
Pencil an identification number above the Prussian blue/turquoise
marker line on the strip.
3. Take the required number of test troughs (one trough per strip) and
place them into the tray.
4. Pipette 10 µl Denaturation Solution into the upper corner of each trough.
NOTE:
• Close the vial immediately after use.
5. Add 10 µl sample (see Samples; see Instructions for use of INNO-LiPA
HLA-A Multiplex) and carefully mix by pipetting up and down.
Always use sterile pipette tips. Allow denaturation to proceed for 5 minutes
at 20 - 25°C.
6. Shake the pre-warmed Hybridization Solution and gently add 2 ml to the
denatured amplified product into each trough. Mix by gentle shaking.
Take care not to contaminate neighboring troughs during pipetting.
7. Immediately place the strip into the trough. The strips should be
completely submerged in the solution.
NOTE:
• Wear disposable gloves and use forceps.
8. Place the tray into the 56°C ± 0.5°C shaking water bath (80 rpm; see
Directions for manual incubation), close the lid, and incubate for
30 minutes.
NOTE:
• Avoid splashing water from the water bath into the trough. Adjust
the water level between 1/3 and 1/2 of the height of the trough.
To prevent the tray from sliding, immobilize the tray between two
heavy weights.
INNOGENETICS®
16
Stringent wash
1. After hybridization, remove the tray from the water bath.
2. Hold the tray at a low angle and aspirate the liquid from the trough
with a pipette, preferably attached to a vacuum aspirator.
Add 2 ml pre-warmed Stringent Wash Solution into each trough, place
the tray into the 56°C ± 0.5°C shaking water bath, close the lid and
incubate for 3 minutes.
3. After incubation, remove the tray from the water bath and aspirate the
liquid from the trough.
4. Repeat the 3 minutes incubation step and the aspiration step once.
5. At last, add 2 ml pre-warmed Stringent Wash Solution into each trough
and place the tray into the 56°C ± 0.5°C shaking water bath, close the
lid and incubate for 4 minutes.
NOTE:
• Dilute the concentrated Rinse Solution 5x and Conjugate 100x
during stringent wash. See Reagents.
Color development
All subsequent incubations are carried out at 20 - 25°C on a shaker.
During the incubations, the liquid and test strips should move back and
forth in the trough for homogeneous staining.
1. Wash each strip twice for 1 minute using 2 ml of the Rinse working solution
(see Directions for changing liquid in the troughs).
2. Add 2 ml of the Conjugate working solution to each trough and
incubate for 30 minutes while agitating the tray on the shaker.
NOTE:
• Dilute the Substrate BCIP/NBT 100x solution about 10 minutes
prior to the end of the conjugate incubation. See Reagents.
3. Wash each strip twice for 1 minute using 2 ml of the Rinse working
solution and wash once more using 2 ml Substrate Buffer.
4. Add 2 ml of the Substrate working solution to each trough and
incubate for 30 minutes while agitating the tray on the shaker.
CAUTION:
• Wear gloves and protective goggles.
5. Stop the color development by washing the strips twice in 2 ml distilled
water while agitating the tray on the shaker for at least 3 minutes.
6. Using forceps, remove the strips from the troughs and place them on
absorbent paper. Let the strips dry completely before reading the results.
Store the developed and dried strips in the dark.
Automated test procedure: Auto-LiPA
The LiPA test procedure is extremely well-suited for automation.
Therefore, the Auto-LiPA is designed to fully handle hybridization, stringent
wash, and color development steps.
The Auto-LiPA is featured as a walk-away system with automated heating
and cooling and with automated aspiration and pipetting.
The standard Auto-LiPA 48 protocol describes the testing of up to 24 samples
when using a single strip per trough. However, this number can be increased
17
INNO-LiPA HLA-A Update
to a maximum of 48. To perform this, two strips from the same locus are
tested in the same trough, while keeping all other protocol parameters the
same. Note also that weaker probe reactivities can occasionally be
observed. Therefore, those customers who intend to increase the number
of samples are advised to validate this '2 strips in one trough' procedure in
his/her laboratory.
For more information and specific protocols on the Auto-LiPA, please
contact Innogenetics or your local distributor.
Results
Reading
marker line
conj. control
HLA-A control
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
marker line
conj. control
HLA-A control
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Strip 1
Strip 2
Figure 2 illustrates the position of the different oligonucleotide probes on
the INNO-LiPA HLA-A Update strips. A line is considered positive when a
clear purple/brown band appears at the end of the test procedure.
Figure 2: Location of the marker line (Prussian blue line on Strip 1 and
turquoise line on Strip 2), the conjugate control line (conj.
control), the HLA-A Update control line (HLA-A control), and the
44 probe lines on the INNO-LiPA HLA-A Update Strips
Validation
-
-
Include one negative control and the LiPA Control (for INNO-LiPA HLA-A
Update) each time a test is performed. As with any new test procedure,
the inclusion of additional positive and negative controls is to be considered
until a high degree of confidence is reached in the ability to correctly
perform the test procedure. It is suggested that reference DNA should be
used to validate that the proper test conditions have been established.
The uppermost lines on the INNO-LiPA HLA-A Update strips (Figure 2)
are the marker lines (Prussian blue and turquoise lines). These lines
allow correct orientation of the strips.
The next line controls the addition of reactive Conjugate and Substrate
working solution during the detection procedure. This line should be lined
up with the conjugate control line on the plastic reading card. This line
should always be positive (if not: no interpretation should be done!) and
INNOGENETICS®
-
-
-
18
should have approximately the same intensity on each strip in the same
test run.
The next line is the HLA-A Update internal hybridization control line
(HLA-A control on the reading card) which indicates whether or not an
appropriate amount of HLA-A amplified material was added for
hybridization. This line should always be positive, except for the
negative control, but its intensity may vary between samples.
The assay result of each negative control should give no apparent signal
for any of the lines on the strip, except for the Conjugate control line.
The LiPA Control sample for INNO-LiPA HLA-A Update should yield the
following pattern of positive probes: conjugate control, HLA-A Control,
15, 30, and 35. Every other probe should be negative.
This control sample is composed of biotinylated oligonucleotides,
complementary to the mentioned hybridization probes.
Positive hybridization on these probes thus demonstrates satisfactory
performance of the assay including hybridization, stringent washing,
color development, and detection. A different pattern may indicate assay
performance problems such as incorrect temperature during hybridization
or deviations from the prescribed incubation times or temperatures.
Color intensities of probes on a strip may differ from one line to another.
Interpretation of results
-
Check for the correct reactivity pattern of the LiPA Control sample.
The conjugate control line on the strip should be lined up with the
conjugate control line on the plastic reading card.
First check the positivity of the control lines (first two lines) in order to
validate each individual strip (see Validation).
Typing results are based on the reactivity of the probes in the kit. A list
of probe specificities is available.
Identify all probe numbers that are positive on the INNO-LiPA HLA-A
Update strips and deduce the HLA-A type by using the INNO-LiPA
HLA-A Update typing table or the LiPA interpretation software.
(see Interpretation software LiRAS).
The software often gives more results than the intended use suggests:
interpretation at allele group is given, as well as all possible allele
combinations. Since the kit was not designed to specially type these
alleles at the allelic level, this information should be considered as extra,
not as decisive.
Interpretation software: LiRAS™
The LiRAS software for INNO-LiPA HLA is designed to assist with the
interpretation of the LiPA results.
Please contact your local distributor to obtain the latest updated version.
Limitations of the procedure
-
Use of this product should be limited to personnel trained in the
techniques of hybridization.
19
-
-
INNO-LiPA HLA-A Update
Only good laboratory practice and careful performance of the specified
procedures, will allow specific hybridization and correct typing of target
DNA.
The INNO-LiPA HLA-A Update strips have been designed to give
resolution at allele group level (A*01 to A*80). However, a combination
of certain alleles could lead to a non-unique probe combination and
thus to an ambiguous answer of two or more possible allelic group
combinations.
New alleles might have polymorphisms outside probe regions, this should
be taken into consideration when interpreting the results.
The HLA-A Update control lines are not only specific for HLA-A, but also for
almost all HLA-B and HLA-C alleles. Therefore, the HLA-A control lines
might also react with HLA-B and HLA-C amplified products.
Test performance
The performance of INNO-LiPA HLA-A Update was evaluated in 4 European
tissue typing laboratories on routine typing samples.
A total of 346 samples were analyzed. DNA was extracted from fresh or
frozen EDTA-anticoagulated or citrate-anticoagulated blood. DNA
extraction methods included salting out, QIAamp 96 DNA blood kit
(Qiagen), Genomic DNA Purification kit (Promega) and Puregene (Gentra
Systems). Fresh or frozen DNA was amplified using the Perkin Elmer 9600
or 9700 thermal cycler. Amplicons were stored at 2 - 8°C or -25/-15°C
before they were applied on the strips.
No amplification failures were encountered, although repeat testing was
needed for 1 sample.
The samples were processed using the Auto-LiPA instrument and interpreted
with a clinical trial version of the LiRAS™ interpretation software.
Accuracy
An HLA-A typing result was obtained for 345 out of the 346 samples.
Repeat testing was needed for 18 samples from one center.
One sample resulted in 'no typing deducible' but according to the
investigator, this was probably due to DNA contamination.
Accuracy at allele group level was calculated as a percentage of observed
concordance with alternative DNA assays (Biotest ELPHA HLA-AB
LowRes Typing kit, Dynal SSP, LiPA HLA-A, sequencing, Micro SSP™,
OLERUP SSP™, Biotest HLA-A SSP). The INNO-LiPA HLA-A Update
results were considered concordant with the reference assay result if the
two results were identical, if the INNO-LiPA HLA-A Update results were
more specific than the reference result, or if the INNO-LiPA HLA-A Update
results showed a lower resolution but correct result in comparison with the
reference methods.
Initial accuracy was 99.1% (342/345). Discrepancy testing resulted in an
accuracy of 99.7% (344/345). Action has been taken to prevent future mistyping
such as occurred for one sample during the study.
INNOGENETICS®
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Resolution (typing table version v1.0/2001-03-31)
INNO-LiPA HLA-A Update is designed to resolve HLA-A alleles to the
allele group level, i.e. the level of serological equivalents. 'Allele group' is
the designation of the first two digits following the asterisk in standard HLA
nomenclature (e.g. HLA A*32). Furthermore, the kit is designed to detect
the following null alleles: A*0232N (exon 3), A*0303N (exon 3), A*2409N
(exon 4), A*2611N (exon 3) and A*6811N (exon 1). The A*2402102L allele,
which has a low expression level, can also be detected (intron 2).
The theoretical resolution at allele group level (i.e. 2 digits) is calculated as
99.5%. The resolution at allele group level observed during this study, after
discrepancy analysis, was 99.4% (343/345). Initially, one ambiguity was
observed (A*02 x A*66 or A*02 x A*26). A second ambiguity arose as a
result of the adaption of the typing table (A*3201 x A*3201 or A*3201 x
A*7403). Five ambiguities (14 samples) observed with the reference
method were reduced to a single clear-cut typing result using the INNOLiPA HLA-A Update assay. Two null alleles were identified during this
clinical evaluation: A*0303N and A*6811N.
Probe reactivity
Ten probes reacted false positive and six probes reacted weak to false negative
on one or more occasions during this clinical trial. This information, if not
already present, has been implemented in the software and/or guidelines to
facilitate future typing. All but one of the false reactivities were identified as such
and concordant typing at allele group level was achieved when the LiRAS™
interpretation software was used. The risk of mistyping, caused by one false
negative reaction, has been addressed by adapting the typing table.
Consult the guidelines for specific information on probe reactivity.
A complete list of probe and primer specificities is available.
All probes are designed to hybridize specifically with their complementary
sequence at the level of one mismatch, unless stated otherwise in the list.
Sensitivity
Internal evaluation of a dilution series of 3 DNA samples, varying from
0.01 µg/µl to 2 µg/µl, showed that all samples were visible on agarose gel
and were typed correctly.
The external performance evaluation included 346 DNA samples with a
concentration between 20 ng/µl and 1500 ng/µl and with a purity
(A260nm/A280nm) ≥1.5. The DNA was diluted to a concentration between 20 ng/µl
and 250 ng/µl prior to amplification. No amplification failures were encountered,
although repeat testing was needed for 1 sample.
Precision
Internal data:
Three samples were tested in quadruplicate, by two different persons
using the manual method, or by one person on two different Auto-LiPA
instruments. Two samples were analyzed on three different lots in two
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INNO-LiPA HLA-A Update
different runs. Interpretation of the results was the same for all samples.
Probe reactivities were comparable in all cases.
External validation:
- Inter-lot variability was assessed by analyzing a proficiency panel
(5 samples with known reactivity and interpretation) with two different
batches of product. For each sample the same typing result was
obtained, independent of the batch used.
- Inter-lab variability was assessed by having the same proficiency
panel tested by the four centers. Each center obtained the same typing
results for the five samples.
Français
But du test
INNO-LiPA HLA-A Update est un test sur bandelette à usage in vitro pour le
typage moléculaire, au niveau groupe d'allèles, des allèles HLA-A (Human
Leucocyte Antigen).
Principe du test
Les tests de typage INNO-LiPA HLA sont basés sur le principe de l'hybridation
inverse résumé Figure 1. Les amplicons biotynilés chimiquement dénaturés
sont hybridés avec des sondes oligonucléotidiques immobilisées en bandes
parallèles sur une bandelette. Cette phase est suivie d'une étape de lavage
stringent destinée à éliminer tout matériel amplifié non fixé. Après lavage
stringent, un conjugué streptavidine marqué à la phosphatase alcaline est
ajouté et va se fixer sur tout hybride biotinylé préalablement formé. L'incubation
avec un chromogène entraîne un précipité brun/violet. La réaction est alors
stoppée par une étape de lavage et le profil de réactivité des sondes est établi.
Un kit d'amplification (INNO-LiPA HLA-A Multiplex) est disponible avec le
kit INNO-LiPA HLA-A Update pour standardiser la préparation de matériel
amplifié biotinylé. Le kit d'amplification est basé sur une réaction de PCR*.
Les amplicons sont ensuite hybridés sur 2 bandelettes de typage comportant
43 sondes de séquences spécifiques et 2 bandes Contrôle. (Figure 2).
* L'utilisation de ce produit est couverte par une licence F.Hoffmann La Roche Ltd et Roche Molecular Systems Inc.
Figure 1 (voir page 9): Principe du test de typage INNO-LiPA HLA.
INNO-LiPA HLA-A Update:
Etape 1 Amplification Multiplex des exons 1 à 4 du locus HLA-A
Etape 2 Hybridation et lavage stringent avec 44 bandes sondes immobilisées sur
2 bandelettes INNO-LiPA HLA-A Update (56°C).
Etape 3 Révélation
Etape 4 Interprétation du profil de réactivité des sondes
INNO-LiPA HLA-A Update est conçu pour donner la meilleure résolution
possible par la technique d'hybridation inverse, au niveau groupe d'allèles
(c'est à dire les 2 premiers chiffres après l'astérisque qui suit le nom de
l'allèle selon la nomenclature HLA standard, par exemple HLA-A*26).
INNOGENETICS®
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En plus de l'interprétation des groupes d'allèles, le logiciel fournira toutes
les combinaisons d'allèles possibles. Cette information, toutefois,doit être
considérée comme un plus et non comme un facteur décisif.
Réactifs
Description, préparation et conditions de conservation
-
-
Non ouverts et maintenus à 2 - 8°C, tous les réactifs, y compris les
bandelettes, sont stables jusqu'à la date de péremption du kit.
Ne pas congeler les réactifs.
Ramener à température ambiante (20 - 25°C) tous les réactifs ainsi
que les tubes plastiques contenant les bandelettes environ 60 minutes
avant le début du test, puis les replacer à 2 - 8°C immédiatement
après utilisation.
Une altération de l'apparence physique des composants du kit peut
indiquer une instabilité ou une détérioration
Le kit doit être stocké isolé de toute contamination, spécialement de
produits ADN amplifiés.
Afin d'éviter au maximum la possibilité de recourbement des
bandelettes avant usage, il est recommandé de conserver les tubes
horizontalement.
Chaque kit contient:
Composants
Bandelettes 1
Quantité
1 x 20
Bandelettes 2
1x
Contrôle LiPA
1x
Solution de
Dénaturation
1x
Solution d'Hybridation 2 x
Solution de Lavage
Stringent
Stockage Description
2 - 8°C 20 bandelettes 1 INNO-LiPA HLA-A
Update marquée avec une ligne de repère
bleu de Prusse.
20
2 - 8°C 20 bandelettes 2 INNO-LiPA HLA-A
Update marquée avec une ligne de
repère turquoise.
0.05 ml 2 - 8°C Contenant acide
éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et
0.01% méthylisothiazolone (MIT)/
0.1% chloroacétamide (CAA) comme
conservateur.
1 ml
2 - 8°C Solution alcaline contenant
EDTA. Le flacon doit être immédiatement
refermé après usage. Une exposition
prolongée à l'air conduit à une rapide
détérioration du pouvoir dénaturant.
80 ml
2 - 8°C Tampon EDTA sodium phosphate Salin
(SSPE) contenant 0.5% de dodecyl
sulfate de sodium (SDS). La Solution
d'Hybridation doit être préchauffée à
une température d'au moins 37°C et
n'excédant pas 56°C (tous les cristaux
doivent être dissous avant emploi).
2 x 200 ml 2 - 8°C
Tampon SSPE contenant 0.1%
SDS. La Solution de Lavage Stringent
doit être préchauffée à une température
d'au moins 37°C et n'excédant pas 56°C
23
INNO-LiPA HLA-A Update
(tous les cristaux doivent être dissous
avant emploi
Conjugate Diluent
1 x 150 ml 2 - 8°C
Tampon phosphate contenant NaCl,
Triton®, protéines stabilisatrices, et
0.01% MIT/0.1% CAA comme
conservateur.
Conjugate 100x
1 x 1.5 ml
Sreptavidine marquée à la phosphatase
alcaline en tampon Tris contenant des
protéines stabilisatrices et 0.01% MIT/
0.098% CAA comme conservateur, à
diluer au 1/100 en Diluant Conjugué
avant emploi.
Préparer 2 ml de Solution de travail de
Conjugué par compartiment + 2 ml en
excès (la Solution de travail de
Conjugué peut être préparée durant
l'étape de Lavage Stringent) pour la
technique manuelle. Pour l'Auto-LiPA,
prévoir un excès de 10 ml.
La Solution de travail de Conjugué est
stable 24 heures à température
ambiante (20 - 25°C) et à l'obscurité.
Tampon Substrat
1 x 235 ml 2 - 8°C
Tampon Tris contenant NaCl, MgCl2 et
0.01% MIT/0.1% CAA comme
conservateur.
Substrat BCIP/NBT
100x
1 x 1.5 ml
2 - 8°C
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl
phosphate sel de p-toluidine (BCIP) et
nitrobleu tétrazolium (NBT) in
diméthylformamide (DMF), à diluer au
1/100 en Tampon Substrat avant emploi.
Préparer 2 ml de Solution de travail de
Substrat par compartiment + 2 ml en
excès (la Solution de travail de Substrat
peut être préparée durant l'étape
d'incubation du Conjugué) pour la
technique manuelle. Pour l'Auto-LiPA,
prévoir un excès de 10 ml.
La Solution de travail Substrat est
stable 24 heures à température
ambiante (20 - 25°C) et à l'obscurité.
Solution de Rinçage 5x 2 x 80 ml
2 - 8°C
Tampon Phosphate contenant NaCl,
Triton®, et 0.05% MIT/0.48% CAA comme
conservateur, à diluer au 1/5
(1 part + 4 parts) en eau distillée ou
desionisée avant emploi.
Préparer 8 ml de Solution de travail de
Rinçage pour chaque compartiment +
20 ml en excès pour la technique
manuelle et pour l'Auto-LiPA.
La Solution de travail de Rinçage est
stable 2 semaines conservée à 2 - 8°C.
Contenant 8 compartiments chacune.
Pour l'identification des sondes positives.
Plaque d'incubation
Carte de lecture
5
1
2 - 8°C
INNOGENETICS®
Feuille de résultats
24
2
Pour la conservation des bandelettes
développées.
Matériel nécessaire non fourni
-
INNO-LiPA HLA-A Multiplex
Bain-marie agitant (80 rpm avec couvercle à pentes, température
ajustable à 56°C ± 0.5°C)
Système d'aspiration
Thermomètre calibré
Agitateur-plan (orbital, linéaire ou oscillant)
-
Vortex ou équivalent
Eprouvettes graduées (10, 25, 50, 100 ml)
Eau distillée ou desionisée
Gants jetables
Embouts stériles (de préférence avec filtre coton) pour pipettes
Pince plastique pour la manipulation des bandelettes
Pipettes ajustables 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, 200 - 1000 µl
Multipette (type Eppendorf) en option
Minuteur (2 heures ± 1 min.)
Recommandations pour un agitateur orbital:
•
Le diamètre du mouvement circulaire doit être égal ou supérieur à 13 mm.
•
La vitesse recommandée pour un mouvement de 13 mm est de 160 rpm.
Recommandations pour un agitateur linéaire:
•
La vitesse recommandée est de 80 mouvements par minute.
Recommandations pour un agitateur oscillant:
•
L'angle d'inclinaison doit être inférieur à 13° pour éviter des débordements.
•
La vitesse recommandée est de 50 rpm.
Consignes de sécurité
Se référer aux fiches de sécurité du fabricant et à l'étiquetage du
produit pour toute information sur des composants potentiellement
dangereux.
R20/21, R36, R45, R61, S36/37, S45 S53
Toxique! Nocif par inhalation et contact avec la peau. Irritant pour les
yeux. Cancérigène. Tératogène. Porter des gants et des vêtements de
protection. En cas d'accident ou de malaise, consulter immédiatement un
médecin (montrer l'étiquette si possible). Eviter toute exposition Se procurer les instructions spéciales d'utilisation. Limité à un usage par
des professionnels. Contient diméthylformamide, 5-Bromo-4-chloro-3indolylphosphate sel de p-toluidine: Substrat BCIP/NBT 100x.
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INNO-LiPA HLA-A Update
R43, S24-37
Irritant! Eviter le contact avec la peau. Peut causer des irritations par
contact avec la peau. Porter des gants de protection. Contient 2chloroacétamide: Solution de Rinçage, Tampon Substrat, Diluant
Conjugué et Contrôle LiPA.
R36/38, S23-24-26
Irritant! Irritant pour la peau et les yeux. Ne pas inhaler. Eviter le contact
avec la peau. En cas de contact avec les yeux, rincer abondamment à
l'eau et consulter un médecin. Contient hydroxyde de sodium: Solution
de Dénaturation.
- Les échantillons doivent toujours être manipulés comme
potentiellement infectieux.
Tout constituant dérivé du sang, ainsi que tout matériel biologique, doit
donc être considéré comme potentiellement infectieux et devra être
manipulé avec les précautions d'usage. Seul le personnel qualifié doit
être autorisé à réaliser le test. Tous les dérivés sanguins et matériels
biologiques doivent être éliminés selon l'une des méthodes de
traitement suivantes:
• Autoclave au moins 15 min à 121°C.
• Incinération des matériels jetables.
• Mélanger les déchets liquides avec de l'hypochlorite de sodium à
une concentration finale d'environ 1%. Laisser en contact une nuit
avant l'évacuation.
ATTENTION: Les liquides contenant de l'acide doivent être
neutralisés avant ajout d'hypochlorite de sodium.
- L'utilisation d'un équipement pour protection du personnel est
nécessaire: gants et écrans lors de la manipulation d'agents
dangereux ou infectieux.
- Les déchets doivent être éliminés selon le règlement du laboratoire, et
la réglementation en vigueur pour l'environnement doit être suivie.
Echantillons
Dans la mesure où INNO-LiPA HLA-A Update nécessite du matériel ADN
amplifié biotinylé, un kit d'amplification INNO-LiPA HLA-A Multiplex est
également disponible en complément.
Manipulations
Manipulation des bandelettes
-
Les bandelettes ne sont pas réutilisables!
Ne pas manipuler les bandelettes à mains nues. Utiliser des pinces
propres.
INNOGENETICS®
-
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Utiliser un crayon à papier pour identifier les bandelettes. Ne pas
utiliser de stylos ou autre. Noter le numéro d'identification au-dessus
de la ligne de repère.
Les bandelettes doivent toujours rester dans le même compartiment
durant les différentes étapes d'incubation.
Tenir les bandelettes neuves ou développées éloignées de toute
source de lumière intense et de chaleur.
Laisser sécher les bandelettes à l'obscurité avant interprétation,
fixation et conservation.
Les bandelettes développées et sèches doivent être de préférence
conservées à l'obscurité entre 20 - 25°C.
Ne pas réutiliser les compartiments.
Directives pour incubation manuelle
-
-
-
-
-
Le respect de la température d'incubation à 56°C ± 0.5°C durant
l'Hybridation et le Lavage Stringent est le paramètre le plus critique
pour éviter les faux positifs (température trop basse) ou les faux
négatifs/faibles signaux (température trop haute). Un bain-marie
agitant avec un couvercle à pentes inclinées est nécessaire pour le
bon contrôle des variations de température. Vérifier strictement la
température avec un thermomètre calibré.
Maintenir fermé le couvercle du bain-marie agitant durant les
incubations pour éviter des faux positifs.
Ne pas utiliser de système d'incubation agitant à air chaud pulsé
pour l'Hybridation et le Lavage Stringent.
Pour l'Hybridation et le Lavage Stringent, la plaque doit être bloquée
sur la plate-forme du bain-marie agitant et le niveau d'eau doit être
ajusté au 1/3 - 1/2 de la hauteur de la plaque. Vérifier que la plaque
ne flotte pas sur l'eau. L'eau doit être en contact direct avec la plaque.
Les étapes d'incubations impliquées dans la révélation des bandelettes
doivent être réalisées entre 20 - 25°C. Une température inférieure a 20°C
pourra être responsable de résultats plus faibles de même qu'une
température supérieure à 25°C pourra entraîner une coloration de fond trop
importante et/ou des signaux faussement positifs.
Respecter exactement les durées d'incubation indiquées dans la
procédure.
L'amplitude d'agitation des bandelettes LiPA dans leur compartiment
d'incubation, générée soit par le bain-marie (procédure d'hybridation), soit
par l'agitateur-plan (procédure de révélation) est un paramètre critique pour
optimiser la sensibilité et homogénéiser la coloration. La bandelette doit
être complètement immergée et l'amplitude doit être aussi grande que
possible en évitant tout débordement qui conduirait à des contaminations
croisées et donc des résultats invalides.
L'agitateur doit assurer un mouvement de va-et-vient de la bandelette
dans le compartiment et un mouvement du liquide par-dessus la
bandelette, en évitant tout débordement.
Ne pas couvrir la plaque. Durant les étapes d'Hybridation et de
Lavage Stringent, les compartiments doivent être non couverts dans le
bain-marie. Les couvrir avec un film pour microplaque pourrait
provoquer des contaminations croisées.
27
INNO-LiPA HLA-A Update
Directives pour changement des solutions
-
Aspirer le liquide de chaque compartiment de la plaque à l'aide d'une
pipette, de préférence branchée sur une pompe à vide. Incliner la
plaque et aspirer le liquide à l'angle du compartiment.
Ajouter 2 ml de la solution appropriée dans chaque compartiment et
suivre la procédure.
Une multipette (de type Eppendorf) est indiquée pour cet usage.
Répéter cette étape le nombre de fois indiqué dans la procédure.
NOTE:
• Ne pas laisser les bandelettes s'assécher durant ces étapes.
• Ne pas endommager la surface de la bandelette durant l'aspiration.
Aspirer le liquide de préférence au-delà de la ligne de repère.
• Bien aspirer la totalité du liquide.
• S'assurer que la bandelette est entièrement lavée par immersion
complète dans la solution.
• Réajuster la vitesse de l'agitation si nécessaire.
Remarques et précautions
-
-
Diagnostic in vitro.
Utilisation par des professionnels.
Afin d'éviter toute contaminations par de l'ADN, une séparation
physique maximum des étapes pré- et post-amplification est
recommandée: locaux séparés, pipettes et autres matériels de
laboratoire séparés, blouses et gants séparés ainsi que leur lieu de
stockage sont des précautions minimums pour le respect des bonnes
pratiques de laboratoire.
Eviter tout retour de la pièce post-amplification vers la pièce préamplification.
Utiliser du matériel de laboratoire jetable autoclavé.
Ne pas réutiliser le matériel jetable
Utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque échantillon.
Ne pas utiliser le kit au-delà de la date de péremption.
Ne pas mélanger les réactifs entre kits à moins que les composants ne
portent le même numéro de lot.
Veiller à éviter toute contamination microbienne des réactifs.
Procédure manuelle
NOTE:
- Les bandelettes doivent rester dans le même compartiment d'incubation
durant toutes les étapes.
Vérifier la température avec un thermomètre calibré et ajuster si
nécessaire avant de placer le plaque dans le bain-marie. Toujours
fermer le couvercle.
Inclure le Contrôle LiPA à chaque série.
Echantillons
1. Produit amplifié HLA-A (10 µl). Voir instructions INNO-LiPA HLA-A
Multiplex.
INNOGENETICS®
28
NOTE:
• Utiliser exactement 10 µl d'échantillon amplifié. Trop peu ou trop
d'échantillon ajouté peut entraîner un résultat de typage erroné.
2. Contrôle LiPA pour INNO-LiPA HLA-A Update (10 µl; pas d'amplification
requise!).
3. Contrôle Blanc amplifié (contrôle négatif; 10 µl).
Dénaturation et hybridation
1. Chauffer le bain-marie à 56°C ± 0.5°C. Vérifier la température avec un
thermomètre calibré et ajuster si nécessaire. Ne pas excéder cette
température. Préchauffer également les solutions d'hybridation et de lavage
stringent à 37°C minimum et 56°C maximum. Les homogénéiser avant
utilisation et s'assurer de la dissolution complète des cristaux.
2. A l'aide d'une pince plastique, préparer le nombre de bandelettes
INNO-LiPA HLA-A Update nécessaires (une bandelette 1 et une
bandelette 2 par échantillon). Inclure les 2 bandelettes pour le
Contrôle LiPA et aussi pour le Contrôle Blanc amplifié. Inscrire au
crayon un numéro d'identification au-dessus des lignes de repère
bleue de Prusse et turquoise des bandelettes.
3. Placer le nombre de compartiments nécessaires (1 par bandelette) dans le
portoir.
4. Déposer 10 µl de Solution de Dénaturation (DS) dans le coin supérieur
du compartiment.
NOTE:
• Refermer le flacon immédiatement après usage.
5. Ajouter 10 µl de produit amplifié (Voir § Echantillons; Voir Instructions
INNO-LiPA HLA-A Multiplex. Mélanger soigneusement par flux et
reflux. Utiliser toujours des embouts avec filtre coton. Laisser incuber
5 minutes à température ambiante (20 - 25°C).
6. Homogénéiser la Solution d'Hybridation (HS) préchauffée et ajouter
délicatement 2 ml dans chaque compartiment.
Mélanger soigneusement. ATTENTION: Ne pas contaminer les
compartiments voisins par des projections.
7. Introduire immédiatement la bandelette dans le compartiment approprié.
Vérifier que les bandelettes LiPA sont bien immergées.
NOTE:
• Porter des gants et utiliser une pince.
8. Placer immédiatement la plaque dans le bain-marie à 56°C ± 0.5°C et
déclencher l'agitation (80 rpm environ - voir Directives pour incubation
manuelle). Fermer le couvercle et incuber 30 minutes.
NOTE:
• Eviter que de l'eau du bain-marie gicle dans les compartiments.
Ajuster la hauteur de l'eau entre 1/2 et 1/3 de la hauteur de la
plaque. Pour éviter tout glissement de la plaque, s'assurer qu'elle
est parfaitement immobilisée au fond du bain-marie (entre 2 poids
par exemple).
29
INNO-LiPA HLA-A Update
Lavage Stringent
1. Après l'étape d'hybridation, retirer la plaque du bain-marie.
2. Incliner la plaque et aspirer le liquide de chaque compartiment à l'aide
d'une pipette, de préférence branchée sur une pompe à vide. Ajouter 2 ml
de Solution de Lavage Stringent préchauffée dans chaque compartiment,
placer la plaque à 56°C ± 0.5°C dans le bain-marie agitant, fermer le
couvercle et incuber 3 minutes.
3. Après incubation, retirer la plaque du bain-marie agitant et aspirer le
liquide des compartiments.
4. Répéter une fois les étapes d'incubation de 3 minutes et d'aspiration.
5. Finalement, ajouter 2 ml de Solution de Lavage Stringent préchauffée
dans chaque compartiment, placer la plaque dans le bain-marie
agitant à 56°C ± 0.5°C, fermer le couvercle et incuber 4 minutes.
NOTE:
• Diluer les Solutions de Rinçage 5x et de Conjugué 100x durant
l'étape de lavage stringent. (Voir Réactifs).
Révélation
Toutes les étapes qui suivent sont menées à 20 - 25°C sur un agitateur.
Durant les incubations, le liquide et les bandelettes doivent effectuer un
mouvement de va et vient dans le compartiment pour assurer une
coloration homogène.
1. Laver 2 fois chaque bandelette pendant 1 minute avec 2 ml de
solution de Rinçage. (Voir Directives pour Changement des solutions).
2. Ajouter 2 ml de solution de travail de Conjugué dans chaque
compartiment et incuber pendant 30 minutes sous agitation.
NOTE:
• Diluer la solution de Substrat BCIP/NBT 100x 10 minutes avant la
fin de l'incubation du Conjugué. (Voir Réactifs).
3. Laver 2 fois chaque bandelette pendant 1 minute avec 2 ml de Solution de
Rinçage, puis 1 fois avec 2 ml de Tampon Substrat.
4. Ajouter 2 ml de solution de travail de Substrat dans chaque compartiment
et incuber 30 minutes sous agitation.
ATTENTION:
• Porter des gants et des lunettes de protection.
5. Arrêter le développement de coloration en lavant 2 fois chaque bandelette
avec 2 ml d'eau distillée pendant au moins 3 minutes sous agitation.
6. A l'aide des pinces en plastique, retirer les bandelettes de la plaque et
les placer sur un papier absorbant. Laisser sécher complètement
avant de lire les résultats. Conserver les bandelettes révélées et
sèches à l'obscurité.
Procédure automatisée: Auto-LiPA
La procédure LiPA se prête bien à l'automatisation. L'Auto-LiPA prend
totalement en charge l'hybridation, le lavage stringent et les étapes de
révélation. C'est un instrument automatisé avec chauffage et
refroidissement automatiques ainsi que les aspirations et les pipetages.
INNOGENETICS®
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Le protocole standard Auto-LiPA 48 indique la procédure de test pour
maximum 24 échantillons, avec utilisation d'un compartiment par bandelette.
Cependant, ce nombre peut être porté à 48 en déposant 2 bandelettes du
même locus dans le même compartiment, tandis que les autres paramètres
de test restent inchangés. Il est à noter que des réactivités de sondes plus
faibles peuvent être occasionnellement observées. En conséquence, il est
recommandé à l'utilisateur souhaitant augmenter le nombre d'échantillons
testés, de procéder à la validation dans son laboratoire, du protocole
"2 bandelettes dans 1 compartiment".
Pour plus d'information et pour les programmes spécifiques sur Auto-LiPA,
contacter Innogenetics ou votre distributeur.
Résultats
Lecture
La Figure 2 illustre les positions des différentes sondes oligonucléotidiques
sur les bandelettes INNO-LiPA HLA-A Update. Une bande est considérée
comme positive lorsqu'une coloration brun/violet nette est visible à la fin de
la procédure.
Figure 2 (voir page 17): Localisation des lignes de repère (bleue de
Prusse sur la bandelette 1 et turquoise sur la bandelette 2), de la bande
de contrôle Conjugué (contrôle Conj.), de la bande de contrôle HLA-A
Update (contrôle HLA-A), et des 44 bandes sondes sur les bandelettes
INNO-LiPA HLA-A Update.
Validation
-
-
Inclure un contrôle négatif et le Contrôle LiPA INNO-LiPA HLA-A Update
dans chaque série. Comme lors de toute nouvelle procédure, l'ajout de
contrôles positifs ou négatifs supplémentaires est envisagé jusqu'à
l'obtention d'un degré de confiance satisfaisant dans la capacité de
réalisation correcte du test. On peut recommander l'utilisation d'un témoin
ADN de référence pour s'assurer que les conditions de réalisation du test
ont été correctement établies.
Les lignes les plus à l'extrémité des bandelettes INNO-LiPA HLA-A Update
(Figure 2) sont les lignes de repère (bleue de Prusse et turquoise) et
permettent d'orienter correctement les bandelettes.
La bande qui suit est la bande de contrôle d'addition des Solutions de
Conjugué et de Substrat au cours de la procédure. Cette bande doit être
alignée avec celle de la bande contrôle Conjugué présente sur la carte de
lecture. Cette bande doit toujours être positive (si ce n'est pas le cas,
aucune interprétation ne doit être faite!) et doit toujours présenter environ la
même intensité sur chaque bandelette d'une même série. La bande
suivante est la bande de contrôle interne d'hybridation (contrôle HLA-A sur
la carte de lecture) qui indique si oui ou non un volume correct de matériel
HLA-A amplifié a été ajouté pour hybridation. Cette bande doit toujours être
positive à l'exception du contrôle négatif mais son intensité peut être
variable d'un échantillon à l'autre.
31
-
-
INNO-LiPA HLA-A Update
Aucun contrôle négatif ne doit présenter de réactivité vis à vis d'aucune
bande de la bandelette à l'exception de la bande contrôle Conjugué.
Le Contrôle LiPA pour INNO-LiPA HLA-A Update doit présenter un profil
de positivité pour les sondes suivantes: contrôle Conjugué, Contrôle
HLA-A, sondes 15, 30 et 35. Toutes les autres sondes doivent être
négatives. Ce Contrôle est composé d'oligonucléotides biotinylés
complémentaires des sondes d'hybridation mentionnées ci-dessus.
Une hybridation positive de ces sondes indique une réalisation
correcte de la procédure pour les étapes d'hybridation, lavage
stringent, révélation et détection. Un profil différent peut mettre en
évidence des problèmes tels qu'une température incorrecte
d'hybridation ou un non-respect des temps ou des températures
d'incubation indiqués.
Les intensités de coloration des sondes d'une bandelette peuvent
différer d'une bande à l'autre.
Interprétation des résultats
-
Vérifier que le Contrôle LiPA présente le profil de réactivité attendu.
La bande contrôle Conjugué de la bandelette doit être alignée avec
celle de la bande contrôle Conjugué présente sur la carte de lecture
Vérifier d'abord la réactivité des bandes de contrôle (2 premières bandes)
pour permettre la validation de chaque bandelette individuellement (voir
Validation).
Le résultat du typage est basé sur la réactivité des sondes du kit. Une
liste des spécificités des sondes est disponible.
Identifier les numéros des sondes réactives sur les bandelettes INNO-LiPA
HLA-A Update et en déduire le type HLA-A à l'aide de la table de typage
INNO-LiPA HLA-A Update ou du logiciel d'interprétation LiPA (voir Logiciel
d'interprétation LiRAS).
Le logiciel indique souvent plus de résultats que ce que ne suggère le
paragraphe «But du test»: l'interprétation au niveau du groupe d'allèles
est donnée ainsi que toutes les combinaisons d'allèles possibles. Dans
la mesure ou le kit n'a pas été spécialement conçu pour typer ces
allèles au niveau allélique, cette information ne doit être prise qu'à titre
supplémentaire et non comme décisive.
Logiciel d'interprétation: LiRAS™
Le logiciel LiRAS pour INNO-LiPA HLA est conçu pour assurer l'interprétation
des résultats du LiPA.
Contacter votre distributeur pour obtenir sa dernière version.
Limites du test
-
L'usage de ce produit doit être réservé au personnel entraîné aux
techniques d'hybridation.
Seuls de bonnes pratiques de laboratoires et un respect attentif de la
procédure peuvent permettre une hybridation spécifique et un typage
correct de la cible ADN.
Les bandelettes INNO-LiPA HLA-A Update ont été conçues pour une
résolution au niveau groupe d'allèles (A*01 à A*80). Cependant, la
INNOGENETICS®
-
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combinaison de certains allèles peut conduire à une combinaison de
sondes non unique et donc à un résultat ambigu de 2 combinaisons de
groupes alléliques possibles ou plus.
Des allèles nouveaux peuvent présenter un polymorphisme hors des
régions couvertes par les sondes. Cet élément doit être considéré lors
de l'interprétation des résultats.
La bande Contrôle HLA-A Update n'est pas uniquement spécifique de
HLA-A, mais également de la plupart des allèles HLA-B et HLA-C et
peut donc réagir en présence de produits amplifiés HLA-B et HLA-C.
Performances
Les performances du test INNO-LiPA HLA-A Update ont été évaluées dans
quatre laboratoires européens d'histocompatibilité sur des échantillons de
routine à typer. Au total, 346 échantillons étaient analysés. L'ADN avait été
extrait de sang, frais ou congelé, avec anticoagulant citrate ou EDTA.
Les méthodes d'extraction incluaient la précipitation, le kit QIAamp 96 DNA
blood (Qiagen), le kit Genomic DNA Purification (Promega) et Puregene
(Gentra Systems). Les ADN frais ou congelés étaient amplifiés en utilisant le
thermocycleur Perkin Elmer 9600 ou 9700. Les amplicons étaient conservés à
2 - 8°C ou entre -25/-15°C avant l'hybridation sur bandelettes LiPA.
Aucun échec d'amplification n'a été observé bien qu'un échantillon ait dû
être retesté. Les échantillons ont été testés sur Auto-LiPA et interprétés
avec une version d'essai clinique du logiciel d'interprétation LiRAS™.
Précision
Un résultat de typage HLA-A a été obtenu pour 345 des 346 échantillons.
Des reprises ont été nécessaires pour 18 échantillons dans un centre.
Un échantillon n'a pu être typé, mais de l'avis de l'investigateur, la cause en
était probablement une contamination ADN.
La précision de typage au niveau groupe d'allèles a été établie sur la base
d'un pourcentage de résultats concordants avec d'autres méthodes
disponibles (Biotest ELPHA HLA-AB LowRes Typing kit, Dynal SSP, LiPA
HLA-A, sequencing, Micro SSP™, OLERUP SSP™, Biotest HLA-A SSP).
Les résultats INNO-LiPA HLA-A Update ont été considérés comme
concordants avec les résultats de référence si les 2 résultats étaient
identiques, si les résultats INNO-LiPA HLA-A Update étaient plus
spécifiques que le résultat de référence, ou si INNO-LiPA HLA-A Update
démontrait une résolution inférieure mais un résultat correct comparé à la
méthode de référence. La précision initiale était de 99.1% (342/345).
Le test des discordances a conduit à une précision de 99.7% (344/345).
Des actions ont été entreprises pour prévenir toute future erreur de typage
telle que cela a pu être observé pour un échantillon au cours de l'étude.
Résolution (table de typage version v1.0/2001-03-31)
INNO-LiPA HLA-A Update est conçu pour une résolution des allèles HLA-A au
niveau du groupe d'allèles c'est à dire le niveau des équivalents sérologiques.
Le groupe d'allèles est la désignation des 2 premiers chiffres après
l'astérisque qui suit le nom de l'allèle selon la nomenclature HLA standard
(par exemple HLA-A*32). De plus, le kit est conçu pour détecter les allèles
33
INNO-LiPA HLA-A Update
nuls suivants: A*0232N (exon 3), A*0303N (exon 3), A*2409N (exon 4),
A*2611N (exon 3) and A*6811N (exon 1). L'allèle A*2402102L, de niveau
d'expression bas, peut également être détecté (intron 2).
La résolution théorique au niveau groupe d'allèles (i.e 2 digits) calculée
est de 99.5%. La résolution au niveau groupe d'allèle observée au cours
de cette étude après analyse des discordances a été de 99.4% (343/345).
Une ambiguïté avait été initiallement observée (A*02 x A*66 ou A*02 x
A*26). Une seconde ambiguïté est survenue à la suite d'une adaptation de
la table de typage (A*3201 x A*3201 ou A*3201 x A*7403). 5 ambiguïtés
de la méthode de référence (14 échantillons) ont été réduites à un résultat
clairement établi par INNO-LiPA HLA-A Update. 2 allèles nuls ont été
identifiés durant cette évaluation clinique: A*0303N et A*6811N.
Réactivité des sondes
10 sondes ont réagi de manière faussement positive et 6 ont réagi de manière
faible ou faussement négative en une ou plusieurs occasions durant l'étude.
Cette information, si absente, a été ajoutée dans le logiciel et/ou les
guides pour faciliter de futures typages.
La totalité, sauf une, des réactions faussement positives a été identifiée
comme telles et un typage concordant a pu être obtenu en utilisant le
logiciel d'interprétation LiRAS™. Le risque d'erreur de typage induit par
une réaction faussement négative a été traité par une adaptation de la
table de typage.
Consulter les guides pour des informations spécifiques sur la réactivité des
sondes.
Une liste complète des spécificités des sondes et des amorces est
disponible. Toutes les sondes sont conçues pour hybrider spécifiquement
leur séquence complémentaire à un mésappareillement près, à moins que
cela ne soit précisé différemment dans la liste.
Sensibilité
L'évaluation interne par dilutions sériées de 3 extraits ADN, variant de
0.01µg/µl à 2 µg/µl, montrait que tous les échantillons étaient visibles sur
gel d'agarose et étaient correctement typés.
L'évaluation externe de performance incluait 346 extraits ADN avec des
concentrations variant de 20 à 1500 ng/µl et de pureté (A260nm/A280nm) ≥1.5.
L'ADN était dilué à une concentration comprise entre 20 ng/ml et 250 ng/ml
avant amplification. Aucun échec d'amplification n'a été rencontré bien que
dans un centre, un échantillon ait dû être retesté.
Reproductibilité
Données internes:
3 échantillons ont été testés en quadruplicate par 2 personnes différentes en
méthode manuelle ou par une personne sur 2 instruments Auto-LiPA différents.
2 échantillons ont été analysés avec 3 lots différents au cours de 2 séries
différentes. L'interprétation des résultats a été la même pour tous les
échantillons. La réactivité des sondes a été comparable dans tous les cas.
INNOGENETICS®
34
Validation externe:
- La variabilité inter-lot a été établie par analyse d'un panel de
compétence (5 échantillons de réactivité et d'interprétation connues)
avec 2 différents lots de production de produit.
Le même résultat de typage a été obtenu pour chaque échantillon
indépendamment du lot utilisé.
- La variabilité inter-laboratoire a été établie à l'aide du même panel
testé dans 4 centres. Chaque centre a rendu les mêmes résultats pour
les 5 échantillons.
Deutsch
Beabsichtigter Verwendungszweck
Der INNO-LiPA HLA-A Update ist ein Line-Probe-Assay für die molekulare
in-vitro-Typisisierung von humanen Leukozyten-Antigen (HLA) A Allelen
auf Allelgruppenniveau.
Testprinzip
Der Test INNO-LiPA HLA-A Update beruht auf dem Prinzip der reversen
Hybridisierung (Schema s. Abb. 1). Amplifizierte biotinylierte DNA wird
chemisch denaturiert, und die separierten Stränge werden mit spezifischen
Oligonukleotidsonden hybridisiert, die als parallele Banden auf
Membranstreifen aufgetragen sind. Darauf folgt ein stringenter Waschschritt,
bei dem eventuell vorhandenes unspezifisch gebundenes amplifiziertes
Material ausgewaschen wird. Anschließend wird mit alkalischer Phosphatase
markiertes Streptavidin zugegeben, das an zuvor gebildete biotinylierte
Hybride bindet. Die darauf folgende Inkubation mit dem Chromogen
BCIP/NBT führt zu einem bräunlich-violetten Niederschlag. Die Reaktion wird
durch einen Waschschritt gestoppt, und das Reaktionsmuster der Proben
wird interpretiert.
Für die Durchführung des INNO-LiPA HLA-A Update Tests steht ein
zusätzlicher Amplifikationskit (INNO-LiPA HLA-A Multiplex) für die
Herstellung von amplifiziertem biotinyliertem Material zur Verfügung.
Die Amplifikation beruht auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR*).
Die Amplifikationsprodukte werden anschließend auf zwei
Typisierungsstreifen hybridisiert, die 43 Banden mit sequenzspezifischen
Sonden und zwei Kontrollbanden enthalten (Abb. 2).
* Die Verwendung dieses Produkts ist durch eine Lizenz F. Hoffmann La Roche Ltd und Roche Molecular Systems, Inc. lizensiert.
Abbildung 1 (siehe Seite 9): Funktionsprinzip der INNO-LiPA HLA
Typisierungs Testprozedur
35
INNO-LiPA HLA-A Update
INNO-LiPA HLA-A Update: Arbeitsschritte
Schritt 1 Multiplex-Amplifizierung der Exons 1 - 4 des HLA-A-Genlocus
Schritt 2 Hybridisierung und stringentes Waschen mit 44 DNA-Sonden, die auf zwei
INNO-LiPA HLA-A Update Teststreifen immobilisiert wurden (56°C).
Schritt 3 Färbung.
Schritt 4 Interpretation des Bandenmusters.
Der INNO-LiPA HLA-A Update Test wurde so konzipiert, dass er unter
Anwendung der reversen Hybridisierung die bestmögliche Auflösung auf
der Ebene von Allelgruppen ermöglicht (die ersten zwei Zahlen in einem
Allelnamen, die auf den Stern folgen, bei der Verwendung der StandardHLA-Nomenklatur, z.B. HLA-A*26).
Zusätzlich zu der Auswertung der Allelgruppe gibt die Software auch alle
möglichen Allel-Kombinationen aus. Diese Information sollte allerdings als
Zusatzinformation betrachtet werden und nicht als entscheidend.
Gelieferte Materialien
Beschreibung, Vorbereitung, empfohlene Lagerung und Haltbarkeit
-
-
-
Bei einer Lagerung zwischen 2 - 8°C sind alle Testreagenzien
einschließlich der beschichteten Teststreifen bis zum auf der
Verpackung angegebenen Verfallsdatum haltbar. Die Reagenzien
dürfen nicht eingefroren werden.
Alle Reagenzien und das Kunststoffröhrchen, das die Teststreifen
enthält, müssen auf Raumtemperatur (20 - 25°C) gebracht werden,
das heißt, sie müssen ca. 60 Min. vor Gebrauch aus dem Kühlschrank
entnommen werden und anschließend sofort wieder gekühlt werden.
Veränderung des Aussehens von Kitbestandteilen kann bedeuten,
dass die entsprechende Komponente sich zersetzt hat.
Der Kit muss so aufbewahrt werden, dass er auf keinen Fall mit anderer
DNA, vor allem mit amplifizierter DNA, kontaminiert werden kann.
Damit sich die Streifen nicht vor Gebrauch verziehen, sollte das
Röhrchen waagerecht gelagert werden.
Jeder Kit enthält:
Kitbestandteil
Teststreifen 1
Teststreifen 2
LiPA-Kontrolle
Menge
Aufbewah- Beschreibung
rung
1 x 20
2 - 8°C
20 Teststreifen 1 für INNO-LiPA HLA-A
Update marked mit königsblauer
Markierungslinie.
1 x 20
2 - 8°C
20 Teststreifen 2 für INNO-LiPA HLA-A
Update mit türkisfarbener
Markierungslinie.
1 x 0.05 ml 2 - 8°C
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
mit 0,01% Methylisothiazolon (MIT)/
0,1% Chloroacetamid (CAA) als
Konservierungsmittel.
INNOGENETICS®
36
Denaturierungslösung
1 x 1 ml
2 - 8°C
Hybridisierungslösung
2 x 80 ml
2 - 8°C
Stringente
Waschlösung
2 x 200 ml 2 - 8°C
Konjugatver-dünner
1 x 150 ml 2 - 8°C
100-fach konzentriertes 1 x 1.5 ml 2 - 8°C
Konjugat
Substratpuffer
1 x 235 ml 2 - 8°C
100-fach konzentriertes 1 x 1.5 ml 2 - 8°C
BCIP/NBT-Substrat
Alkalische Lösung mit EDTA.
Röhrchen sofort nach Gebrauch
verschließen. Längerer Kontakt mit Luft
verschlechtert innerhalb kürzester Zeit die
Denaturierungsstärke.
NatriumchloridNatriumphosphat-EDTA (SSPE) Puffer mit
0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS).
Hybridisierungslösung vor Gebrauch auf
eine Temperatur zwischen 37 und 56°C
erwärmen. Vor Gebrauch müssen alle
Kristalle gelöst sein.
SSPE-Puffer mit 0,1% SDS.
Die stringente Waschlösung vor Gebrauch
auf eine Temperatur zwischen 37 und
56°C erwärmen. Vor Gebrauch müssen
alle Kristalle gelöst sein.
Phosphatpuffer mit NaCl, Triton®
Proteinstabilisatoren, und 0,01% MIT/
0,1% CAA als Konservierungsmittel.
Mit alkalischer Phophatase
markiertes Streptavidin in Trispuffer mit
Proteinstabilisatoren und 0,01% MIT/
0,098% CAA als Konservierungsmittel, vor
Gebrauch 1:100 mit Konjugatverdünner
verdünnen.
Für die manuelle Testdurchführung von
der Konjugat-Arbeitslösung 2 ml je
Inkubationswanne und 2 ml Reserve
herstellen. (Die verdünnte Lösung kann
während des stringenten Waschvorgangs
zubereitet werden). Für Auto-LiPA 10 ml
zusätzlich herstellen.
Die fertige Konjugatlösung ist bei
Aufbewahrung im Dunkeln und bei
Raumtemperatur (20 - 25°C) 24 Stunden
stabil.
Trispuffer mit NaCl, MgCl2 und 0,01%
MIT/0,1% CAA als Konservierungsmittel.
5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, Toluidin-Salz (BCIP) und
Nitroblautetrazolium (NBT) in
Dimethylformamid (DMF), vor Gebrauch
1:100 mit Substratpuffer verdünnen.
Für die manuelle Testdurchführung von
der Substrat-Arbeitslösung 2 ml je
Inkubationswanne und 2 ml Reserve
herstellen. Für Auto-LiPA 10 ml zusätzlich
herstellen. Die fertige Substratlösung ist
bei Aufbewahrung im Dunkeln und bei
Raumtemperatur (20 - 25°C) 24 Stunden
stabil.
37
INNO-LiPA HLA-A Update
5-fach konzentrierte
Waschlösung
2 x 80 ml
2 - 8°C
Halter
5
Interpretations-vorlage 1
Protokollbögen
2
Phosphatpuffer mit NaCl,
Triton®, und 0,05% MIT/0,48% CAA als
Konservierungsmittel, vor Gebrauch mit
destilliertem oder deionisiertem Wasser
1:5 (1 Teil + 4 Teile) verdünnen.
Für die manuelle Testdurchführung von
der Waschlösung 8 ml je
Inkubationswanne und 10 ml Reserve
herstellen. Für Auto-LiPA 20 ml zusätzlich
herstellen.
Die fertige Waschlösung ist bei
Aufbewahrung bei 2 - 8°C 2 Wochen
stabil.
Je 8 Inkubationswannen.
Zur Identifikation positiver Sonden.
Zur Aufbewahrung der entwickelten
Teststreifen.
Zusätzlich erforderliche Materialien
-
-
INNO-LiPA HLA-A Multiplex Testkit.
Wasserbad mit Schüttler (80 Umin-1, mit geneigtem Deckel,
Temperatur auf 56 ± 0,5°C einstellbar).
Absaugvorrichtung.
Kalibriertes Thermometer.
Orbitalschüttler, Horizontalschüttler oder Wippschüttler (Rocker).
Einstellungsempfehlungen für Orbitalschüttler:
•
Der Durchmesser der Kreisbewegung sollte mindestens 13 mm betragen.
•
Bei einer Kreisbewegung von 13 mm wird eine Rotationsgeschwindigkeit
von 160 Umin-1 eingestellt.
Einstellungsempfehlungen für Horizontalschüttler:
•
Für die Hin- und Herbewegung wird eine Einstellung von 80 Bewegungen
pro Minute empfohlen.
Einstellungsempfehlungen für Wippschüttler:
•
Der Neigungswinkel sollte 13° nicht überschreiten, um ein Überlaufen der
Flüssigkeit zu vermeiden.
•
Die empfohlene Rotationsgeschwindigkeit beträgt 50 Umin-1.
Vortex-Mixer oder ähnliches.
Graduierte Messzylinder (10 ml, 25 ml, 50 ml und 100 ml).
Destilliertes oder deionisiertes Wasser.
Einmalhandschuhe.
Sterile Einmalpipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen).
Pinzette zum Entnehmen der Streifen.
Pipetten mit variablem Volumen: 1 - 20 µl, 20 - 200 µl und 200 - 1000 µl.
Mehrfachdispensierpipette (Eppendorf, optional).
Laborwecker, 2 Stunden (± 1 Minute).
INNOGENETICS®
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Sicherheitshinweise
Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblätter des Herstellers und die
Produktkennzeichnung bezüglich gefährlicher Substanzen.
R20/21, R36, R45, R61, S36/37, S45 S53
Giftig! Gesundheitsschädlich beim Einatmen und bei der Berührung mit der
Haut. Reizt die Augen. Kann Krebs erzeugen. Kann das Kind im Mutterleib
schädigen. Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung
tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich
dieses Etikett vorzeigen). Exposition vermeiden - vor Gebrauch besondere
Anweisungen einholen. Verwendung nur durch ausgebildetes Personal.
Gilt für Dimethylformamid, 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in Substrat.
R43, S24-37
Reizend! Berührung mit der Haut vermeiden. Sensibilisierung durch
Hautkontakt möglich. Geeignete Schutzhandschuhe tragen. Gilt für
2-Chloroacetamid in Waschlösung, Substratpuffer, Konjugatverdünner
und LiPA-Kontrolle.
R36/38, S23-24-26
Reizend! Reizt die Augen und die Haut. Dämpfe nicht einatmen.
Berührung mit der Haut vermeiden. Bei Berührung mit den Augen
gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren.
Gilt für Natriumhydroxid in Denaturierungslösung.
- Alle Proben sollten als potentiell infektiös angesehen und
dementsprechend behandelt werden.
Der Kit darf nur von hinreichend ausgebildetem medizinischem
Personal angewendet werden. Blut und biologische Materialien
müssen in Übereinstimmung mit den entsprechenden
Sicherheitsbestimmungen entsorgt werden.
• Mindestens 15 Minuten bei 121°C autoklavieren.
• Einwegmaterialien verbrennen.
• Flüssigabfall mit Natriumhypochlorit mischen. so dass die
Endkonzentration von Natriumhypochlorit bei etwa 1% liegt und
vor Entsorgung über Nacht stehen lassen.
ACHTUNG: Säurehaltigen Flüssigabfall vor Zugabe von
Natriumhypochlorit neutralisieren.
- Bei der Arbeit mit potentiell gefährlichen oder infektiösen Materialien
geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
- Bei Beseitigung der Chemikalien sind die entsprechenden Gesetze bzw.
Verordnungen der EG-Mitgliedsländer, der Bundesrepublik Deutschland
und der Bundesländer sowie hausinterne Vorschriften zu beachten.
39
INNO-LiPA HLA-A Update
Proben
Der INNO-LiPA HLA-A Update Test arbeitet mit biotinylierter, amplifizierter DNA
als Ausgangsmaterial. Um diese Moleküle aus dem Ausgangsmaterial zu
synthetisieren, steht der DNA-Amplifikationskit INNO-LiPA HLA-A Multiplex zur
Verfügung.
Vorbereitung und Hinweise zur Handhabung
Handhabung der Teststreifen
-
Alle Teststreifen sind zum einmaligen Gebrauch bestimmt!
Berühren Sie die Streifen nicht mit bloßen Händen; verwenden Sie
eine saubere Pinzette.
Markieren Sie die Teststreifen mit einem Bleistift. Verwenden Sie
keine Kugelschreiber oder ähnliches. Beschriften Sie die Streifen
oberhalb der Markierungslinie.
Die Teststreifen müssen während der gesamten Inkubationsschritte in
derselben Testwanne bleiben.
Unbenutzte und entwickelte Teststreifen sollten kühl und im Dunkeln
aufbewahrt werden.
Vor Auswerten, Abdecken und Aufbewahren müssen die Teststreifen
komplett getrocknet sein.
Entwickelte, getrocknete Teststreifen können bei 20 - 25°C im Dunkeln
aufbewahrt werden.
Inkubationswannen nicht wiederverwenden.
Hinweise zur manuellen Inkubation
-
-
-
-
Die genaue Einhaltung einer Temperatur von exakt 56 ± 0,5°C während
der Hybridisierung und der stringenten Waschinkubation ist der
entscheidende Schritt zur Vermeidung falsch-positiver (Temperatur zu
niedrig) oder falsch-negativer/schwacher (Temperatur zu hoch) Signale.
Ein Wasserbad mit geneigtem Deckel ist optimal, um die eingestellte
Temperatur konstant zu halten. Es ist unbedingt erforderlich, die
Temperatur mit einem kalibrierten Thermometer zu überwachen.
Während der Inkubation im Wasserbad muss der Deckel immer
geschlossen sein, um falsch-positive Signale zu vermeiden.
Für Hybridisierung und stringentes Waschen darf auf keinen Fall mit
einem Heißluftschüttler gearbeitet werden.
Für Hybridisierung und stringentes Waschen müssen sich die Wannen auf
der Schüttelplattform des Wasserbades befinden. Die Wasserhöhe muss
zwischen einem Drittel und der Hälfte der Wannenhöhe liegen. Achten Sie
darauf, dass die Testwannen nicht auf dem Wasser schwimmen.
Die Wannen müssen in direktem Kontakt zum Wasser stehen.
Die Inkubationsschritte für die Färbung müssen bei Raumtemperatur
(20 - 25°C) vorgenommen werden. Ist die Temperatur niedriger als
20°C, ist die Färbung unter Umständen zu schwach, während bei
Temperaturen oberhalb von 25°C der Hintergrund zu hoch sein kann
oder falsch-positive Signale auftreten können.
Halten Sie die angegebenen Inkubationszeiten immer genau ein.
INNOGENETICS®
-
-
40
Sowohl bei Schüttelwasserbad (Hybridisierung und stringentes
Waschen) als auch bei Orbitalschüttler (Färbung) ist die
Schüttelamplitude ein entscheidender Faktor, um maximale
Empfindlichkeit und gleichmäßige Färbung zu erzielen. Dazu müssen
die Streifen vollständig in die Lösungen eintauchen, und die Flüssigkeit
muss sich gleichmäßig über die Streifen hin- und herbewegen.
Die Amplitude sollte so hoch wie möglich gewählt werden, ohne dass
Flüssigkeit über den Rand der Testwannen herausspritzt
(Kreuzkontamination und ungültige Ergebnisse!).
Beim Schütteln während der Inkubationsschritte sollten sich Streifen und
Lösungen in den Testwannen in Längsrichtung hin- und herbewegen, ohne
dass Flüssigkeit über den Rand der Testwannen herausspritzt.
Decken Sie die Inkubationswannen nicht ab. Während der
Hybridisierung und der stringenten Waschinkubation können die
Testwannen unbedeckt im Wasserbad bleiben. Das Abdecken der
Testwannen mit Deckeln/Folien für Mikrotiterplatten kann zu
Kreuzkontamination führen.
Hinweise zum manuellen Auswechseln der Flüssigkeit in den
Inkubationswannen
-
-
Zunächst wird die Flüssigkeit in den Wannen mit einer Pipette abgesaugt,
die möglichst mit einer Vakuumpumpe verbunden ist. Halten Sie die
Wanne schräg, so dass alle Flüssigkeit auf eine Seite fließt.
Geben Sie in jede Inkubationswanne 2 ml der erforderlichen Lösung, und
befolgen Sie die in der Bedienungsanleitung angegebenen Hinweise.
Für diese Schritte ist das Arbeiten mit einer Mehrfachdispensierpipette
[Multipette, Eppendorf] praktisch.
Wiederholen Sie diesen Schritt so oft, wie es in der Testvorschrift
angegeben ist.
HINWEIS:
• Achten Sie darauf, dass die Streifen zwischen den einzelnen
Waschschritten nicht austrocknen.
• Achten Sie darauf, dass Sie beim Absaugen der Flüssigkeit nicht
die Oberfläche der Streifen beschädigen. Am besten saugen Sie
die Flüssigkeit am oberen Ende der Streifen oberhalb der
Markierungslinie ab.
• Achten Sie darauf, dass alle Flüssigkeit abgesaugt wird.
• Achten Sie darauf, dass der Streifen vollständig in die Waschlösung
eintaucht. Nur so wird der Streifen optimal gewaschen.
• Stellen Sie nötigenfalls die Geschwindigkeit des Schüttlers nach.
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
-
Dieser Test ist nur für den in-vitro-Gebrauch bestimmt.
Der Kit darf nur von hinreichend ausgebildetem medizinischem
Personal angewendet werden.
Zur Vermeidung von Kontamination müssen die Arbeitsschritte vor und
nach der Amplifikation räumlich voneinander getrennt werden.
Zur Einhaltung der Guten Laborpraxis (GLP) wird die Verwendung
getrennter Gefäße, Pipetten etc. und auch das Tragen getrennter
Laborkittel und -handschuhe empfohlen.
41
-
INNO-LiPA HLA-A Update
Vermeiden Sie, zwischen den beiden Arbeitsplätzen hin- und herzugehen.
Die Verwendung von autoklaviertem Einmalmaterial wird empfohlen.
Einmalmaterialien nicht wiederverwenden.
Pipettieren Sie jedes Aliquot mit einer neuen, sterilen Pipettenspitze.
Verwenden Sie den Kit nicht nach Überschreitung des Verfallsdatums.
Mischen Sie keine Komponenten aus Kits außer sie haben identische
Chargennummern.
Vermeiden Sie mikrobielle Kontamination der Kitbestandteile.
Manueller Arbeitsablauf
HINWEIS:
- Die Teststreifen müssen während der gesamten Inkubationsschritte in
derselben Testwanne bleiben.
Überprüfen Sie vor jedem Inkubationsschritt die Temperatur des
Wasserbads mit einem kalibrierten Thermometer, und korrigieren Sie sie
nötigenfalls, bevor Sie den Halter in das Wasserbad stellen. Schließen Sie
immer den Deckel des Wasserbades.
Bei jeder Testserie ist eine LiPA-Kontrolle mitzuführen.
Proben
1. HLA-A-Amplifikationsprodukt (je 10 µl). Probenvorbereitung siehe
Packungsbeilage zu INNO-LiPA HLA-A Multiplex.
HINWEIS:
• Achten Sie darauf, dass das Probenvolumen genau 10 µl beträgt,
weil andernfalls möglicherweise fehlerhafte Ergebnisse erhalten
werden können.
2. LiPA-Kontrolle für INNO-LiPA HLA-A Update (je 10 µl, keine Amplifikation
erforderlich!).
3. Amplifizierte Leerkontrolle (Negativkontrolle, 10 µl).
Denaturierung und Hybridisierung
1. Erhitzen Sie das Schüttelwasserbad auf exakt 56 ± 0,5°C. Überprüfen Sie
die Temperatur mit einem kalibrierten Thermometer, und korrigieren Sie sie
nötigenfalls. Achten Sie darauf, dass die Temperatur auf keinen Fall
überschritten wird. Die gebrauchs-fertige Hybridisierungslösung und die
stringente Waschlösung müssen vor Gebrauch im Wasserbad auf eine
Temperatur zwischen 37 und 56°C erwärmt werden. Achten Sie darauf,
dass eventuell in der Lösung befindliche Kristalle aufgelöst sind. Durchmischen Sie die Lösung vor Verwendung.
2. Nehmen Sie mit einer Pinzette für jede Probe, die Kontrolle und den
amplifizierten Leerwert einen INNO-LiPA HLA-A Update Teststreifen 1
und einen Teststreifen 2 (jeweils 1 Streifen pro Probe) aus der
Verpackung. Markieren Sie die Streifen mit einem Bleistift oberhalb der
königsblauen bzw. türkisfarbenen Markierungslinie.
3. Nehmen Sie die benötigte Anzahl Inkubationswannen (je eine Wanne pro
Teststreifen) aus der Verpackung und setzen Sie sie in den Halter.
4. Pipettieren Sie in die obere Ecke jeder Wanne 10 µl Denaturierungslösung.
HINWEIS:
• Verschließen Sie das Fläschchen unmittelbar nach Gebrauch.
INNOGENETICS®
42
5. Geben Sie 10 µl Probe (s. Kapitel „Herstellung der Proben" in
Bedienungsanleitung für INNO-LiPA HLA-A Multiplex) hinzu und
durchmischen Sie die Lösungen sorgfältig, indem Sie sie mehrmals
hintereinander in einer Pipette hochziehen. Arbeiten Sie ausschließlich
mit sterilen Pipettenspitzen. Warten Sie 5 Minuten (bei 20 - 25°C),
bis die DNA denaturiert ist.
6. Schütteln Sie die vorgewärmte gebrauchsfertige Hybridisierungslösung,
und geben Sie vorsichtig 2 ml der Lösung zu dem denaturierten
amplifizierten Produkt in jede Wanne. Mischen Sie die Lösungen durch
vorsichtiges Schütteln. Achten Sie während des Pipettierens darauf, dass
Sie nicht die benachbarten Wannen kontaminieren.
7. Legen Sie Teststreifen sofort in die Wanne. Die Streifen müssen
vollständig mit Lösung bedeckt sein.
HINWEIS:
• Tragen Sie Einmalhandschuhe und arbeiten Sie mit einer Pinzette.
8. Stellen Sie die Wanne in ein Schüttelwasserbad mit 56 ± 0,5°C (etwa
80 Umin-1, s. „Hinweise zur Inkubation"), schließen Sie den Deckel,
und inkubieren Sie 30 Minuten.
HINWEIS:
• Achten Sie darauf, dass keine Flüssigkeit aus dem Wasserbad in
die Inkubationswanne spritzt. Die Wasserhöhe muss zwischen
einem Drittel und der Hälfte der Wannenhöhe liegen.
Immobilisieren Sie den Halter mit den Wannen mit zwei
Gewichten, damit er sich nicht hin- und herbewegt.
Stringentes Waschen
1. Nehmen Sie nach der Hybridisierung den Halter mit den Wannen aus
dem Wasserbad.
2. Halten Sie den Rahmenhalter leicht schräg, und saugen Sie die
Flüssigkeiten mit einer Pipette, die möglichst an eine Vakuumpumpe
angeschlossen ist, aus den Wannen ab. Geben Sie 2 ml erwärmte
gebrauchsfertige stringente Waschlösung in jede Wanne und stellen
Sie den Halter in das Wasserbad (56 ± 0,5°C) zurück. Schließen Sie
den Deckel, und inkubieren Sie die Probe 3 Minuten.
3. Nehmen Sie nach der Inkubation den Halter aus dem Wasserbad
heraus und saugen die Flüssigkeit aus den Inkunbationswannen ab.
4. Wiederholen Sie diesen 3-Minuten-Inkubationschritt einmal und
saugen Sie anschließend die Flüssigkeit wieder ab.
5. Geben Sie 2 ml erwärmte gebrauchsfertige stringente Waschlösung in jede
Wanne und stellen Sie den Halter in das Wasserbad (56 ± 0,5°C) zurück.
Schließen Sie den Deckel und inkubieren Sie den Halter 4 Minuten.
HINWEISS:
• Verdünnen Sie die 5-fach konzentrierte Waschlösung und das
100-fach konzentrierte Konjugat während des stringenten
Waschvorgangs. Siehe Kapitel „Gelieferte Materialien".
Farbentwicklung
Alle folgenden Inkubationen werden bei 20 - 25°C auf einem Schüttler
durchgeführt. Um eine gleichmäßige Anfärbung zu erzielen, ist es wichtig,
43
INNO-LiPA HLA-A Update
dass sich die Teststreifen während der Inkubation in der Wanne hin- und
herbewegen.
1. Jeder Streifen wird zweimal 1 Minute mit 2 ml verdünnter
Waschlösung gewaschen (s. Kapitel „Hinweise zum manuellen
Auswechseln der Flüssigkeit in den Inkubationswannen").
2. Geben Sie 2 ml verdünnte Konjugatlösung in jede Wanne, und
inkubieren Sie 30 Minuten, während die Wanne auf einem
Orbitalschüttler hin- und herbewegt wird.
HINWEIS:
• Bereiten Sie die 1:100 verdünnte BCIP/NBT-Substratlösung
10 Minuten vor Ende der Konjugatinkubation zu (s. Kapitel
„Gelieferte Materialien").
3. Waschen Sie jeden Streifen zweimal 1 Minute mit 2 ml der verdünnten
Waschlösung, und waschen Sie anschließend mit 2 ml Substratpuffer.
4. Geben Sie 2 ml verdünnte Substratlösung (s. Kapitel Vorbereitung) in jede
Wanne, und inkubieren Sie 30 Minuten, während die Wanne auf einem
Orbitalschüttler hin- und herbewegt wird.
ACHTUNG:
• Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und
Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen (S37/39).
5. Stoppen Sie den Färbevorgang, indem Sie die Streifen zweimal
mindestens 3 Minuten in 2 ml destilliertem Wasser waschen, während
die Wanne auf einem Orbitalschüttler hin- und herbewegt wird.
6. Nehmen Sie die Streifen mit einer Pinzette aus der Inkubationswanne
heraus, und legen Sie sie mit der Membranseite nach oben auf
Fließpapier. Interpretieren Sie die Ergebnisse erst dann, wenn die
Streifen vollständig getrocknet sind. Bewahren Sie die entwickelten
Streifen im Dunkeln auf.
Automatischer Arbeitsablauf: Auto-LiPA
Die Testprozedur des INNO-LiPA Tests ist hervorragend für eine
Automatisierung geeignet. Daher wurde ein automatisches Analysengerät, der
Auto-LiPA entwickelt, das in der Lage ist, die Arbeitschritte Hybridisierung,
stringentes Waschen und Färbereaktion vollständig zu automatisieren.
Das Auto-LiPA kann ohne Überwachung arbeiten; Heizen, Kühlen, Pipettieren
und Aspirieren werden automatisch durchgeführt.
Das Standard-Auto-LiPA-Protokoll beschreibt die Testung von bis zu 24 Proben,
wenn jeweils ein Streifen pro Inkubationswanne verwendet wird.
Diese Anzahl kann allerdings auf maximal 48 Proben erhöht werden.
Dazu werden zwei Teststreifen für denselben HLA-Locus jeweils in einer
Inkubationswanne inkubiert, wobei alle anderen Parameter des Protokolls
gleich bleiben. Beachten Sie, daß möglicherweise schwächere
Sondenreaktivität beobachtet werden kann. Daher sollten alle Kunden, die
beabsichtigen, die Anzahl der Proben pro Auto-LiPA-Lauf zu erhöhen,
dieses "2-Streifen-in-einer-Inkubationswanne"-Protokoll in dem jeweiligen
Labor validieren.
Wenn Sie weitere Informationen über den Auto-LiPA wünschen, setzen Sie sich
bitte mit der Niederlassung von Innogenetics in Verbindung.
INNOGENETICS®
44
Ergebnisse
Ablesen
Abbildung 2 zeigt die Position der verschiedenen Oligonukleotid-Sonden
auf den INNO-LiPA HLA-A Update Teststreifen. Eine Bande ist positiv,
wenn sie zu Ende des Tests violett-bräunlich gefärbt ist.
Abbildung 2 (siehe Seite 17): Position der Markierungslinie (königsblau auf
Streifen 1 und türkis auf Streifen 2), der Konjugatkontrollbande (conj. control),
der HLA-A Update Kontrollbande (HLA-A control) und der 44 DNA-Sonden auf
den INNO-LiPA HLA-A Update Teststreifen.
Validierung
-
-
-
-
Führen Sie bei jeder Testreihe eine Negativkontrolle und eine LiPAKontrolle (für INNO-LiPA HLA-A Update) mit. Wie bei jedem neuen
Laborverfahren müssen so lange Positiv- und Negativkontrollen
mitgeführt werden, bis die Erfahrung zeigt, dass deren Durchführung
zu zuverlässigen Ergebnissen führt. Es wird empfohlen, auch eine
Referenz-DNA mitzuführen, um sicherzustellen, dass die
Testbedingungen adäquat sind.
Die obersten Linien auf den INNO-LiPA HLA-A Update Teststreifen
(Abbildung 2) sind Markierungslinien (königsblau und türkisf). Anhand
dieser Linien ist die korrekte Orientierung der Teststreifen zu erkennen.
Die folgende Bande stellt eine Kontrolle für die Zugabe reaktiver Konjugatund Substrat-Arbeitslösung dar. Diese Bande entspricht der
Konjugatkontrollbande (conj. control) auf der Ablesehilfe und muss zur
Interpretation an diese angelegt werden. Sie muss immer positiv sein.
Andernfalls ist keinerlei Interpretation zulässig. Innerhalb einer Testreihe
müssen diese Banden auf allen Teststreifen in etwa die gleiche Intensität
aufweisen.
Die nächste Bande ist die interne Hybridisierungskontrolle für HLA-A
Update. Sie entspricht der HLA-A Update Kontrollbande (HLA-A control)
auf der Ablesehilfe, die anzeigt, ob genug amplifizierte HLA-A-DNA für die
Hybridisierung zugegeben wurde. Außer bei der Negativkontrolle muss
diese Bande immer positiv sein, die Intensität kann unterschiedlich stark
sein.
Bei den Negativkontrollen darf außer der Konjugatkontrollbande keine
weitere Bande gefärbt sein.
Die LiPA-Kontrolle für INNO-LiPA HLA-A Update muss folgendes Muster
an positiven Banden zeigen: Konjugatkontrolle, HLA-A-Kontrolle, 15, 30
und 35. Alle anderen Banden müssen negativ sein. Diese Kontrollprobe
besteht aus biotinylierten Oligonukleotiden, die komplementär zu den oben
aufgeführten Hybridisierungssonden sind. Die Hybridisierung bei diesen
Banden zeigt daher, dass alle Reaktionen des Tests einschließlich
Hybridisierung, stringentem Waschen, Färbung und Nachweis erfolgreich
durchgeführt wurden. Tritt ein anderes Muster auf, weist dies auf Probleme
bei der Testdurchführung hin, z.B. falsche Temperatur bei der
Hybridisierung oder Abweichungen von den angegebenen
Inkubationszeiten oder -temperaturen.
45
-
INNO-LiPA HLA-A Update
Die Farbintensitäten der einzelnen Banden auf einem Teststreifen
können differieren.
Interpretation der Ergebnisse
-
Überprüfen Sie, ob das Reaktionsmuster der LiPA-Kontrolle korrekt ist.
Legen Sie die Konjugatkontrollbande des Teststreifens an die
entsprechende Bande der Ablesehilfe an.
Überprüfen Sie als Erstes, ob die Kontrollbanden (= die ersten beiden
Banden) positiv sind. Wenn ja, können alle Teststreifen ausgewertet
werden (s. Kapitel „Validierung").
Die Typisierungsergebnisse hängen von der Reaktivität der im Kit
enthaltenen Sonden ab. Eine Liste dieser Spezifitäten ist verfügbar.
Identifizieren Sie die Nummern aller Sonden, die auf den INNO-LiPA
HLA-A Update Teststreifen positiv sind. Zur Ableitung des HLA-A-Typs
wird die INNO-LiPA HLA-A Update Typisierungstabelle herangezogen.
Auch eine automatische Interpretation der Ergebnisse mit der
entsprechenden Software (LiRAS) ist möglich.
Die Software gibt mehr Ergebnisse an, als für den beabsichtigten
Verwendungszweck erforderlich ist, nämlich Interpretation der
Allelgruppen und eine Liste aller möglichen Allelkombinationen. Da der
Kit nicht zur Typisierung von Allelen auf dem Allelniveau gedacht ist,
handelt es sich um eine Zusatzinformation, die aber nicht zu
Diagnosezwecken eingesetzt werden sollte.
Automatische Interpretation der Ergebnisse mit Software: LiRAS™
Das LiRAS-Softwarepaket für INNO-LiPA HLA ist zur Unterstützung der
Interpretation der LiPA-Ergebnisse bestimmt.
Um die jeweils aktuellste Version zu bestellen, setzen Sie sich bitte mit der
Niederlassung von Innogenetics in Verbindung.
Einschränkungen der Methode
-
-
-
Der Test darf nur von Laborpersonal ausgeführt werden, das die
Technik der DNA-Hybridisierung bereits beherrscht.
Die Einhaltung der Guten Laborpraxis und der Angaben in dieser
Bedienungsanleitung sind unbedingt erforderlich, um spezifische
Hybridisierungsergebnisse und und korrekte Typisierung der Ziel-DNA
zu erhalten.
Der INNO-LiPA HLA-A Update Test wurde so konzipiert, dass er die
bestmögliche Auflösung auf der Ebene von Allelgruppen ermöglicht. d.h.
von HLA-A*01 bis HLA-A*80. Es ist jedoch möglich, dass bestimmte
Allelkombinationen zu nicht eindeutigen Sondenkombinationen führen und
daher keine eindeutige Zuordnung zu einer bestimmten Allelgruppe
möglich ist.
Neue Allele können unter Umständen außerhalb des Sondenbereichs
Polymorphismen aufweisen. Dies sollte bei der Interpretation der
Ergebnisse berücksichtigt werden.
Die HLA-A Update Kontrollbanden sind nicht für HLA-A spezifisch,
sondern sie reagieren auch mit fast allen HLA-B- und HLA-C-Allelen.
INNOGENETICS®
46
Daher ist es möglich, dass die HLA-A Kontrollbanden auch mit
Amplifikationsprodukten von HLA-B und HLA-C reagieren.
Leistungsfähigkeit des Tests
Die Leistungsfähigkeit des INNO-LiPA HLA-A Update wurde in 4 europäischen
Gewebetypisierungslabors an Standard-Typisierungsproben evaluiert.
Insgesamt wurden 346 Proben analysiert. Aus frischem oder eingefrorenem
EDTA-antikoagulierten oder citrat-antikoagulierten Blut wurde die DNA
extrahiert.
Die Verfahren zur DNA-Extraktion umfassten Aussalzen, QIAamp 96 DNA
Blutkit (Qiagen), Genomic DNA Purification Kit (Promega) und Puregene
(Gentra Systems). Die frische bzw. gefrorene DNA wurde mittels Perkin Elmer
9600 oder 9700 Thermocycler amplifiziert. Vor der Applikation auf die Streifen
wurde das amplifizierte Material bei 2 - 8°C oder -25/-15°C gelagert.
Es wurden keine Amplifikationsfehler festgestellt, auch wenn bei einer
Probe der Test wiederholt werden musste.
Die Proben wurden mit dem Auto-LiPA-Gerät prozessiert und mit einer
klinischen Studienversion der LiRAS™ Interpretationssoftware interpretiert.
Exaktheit
Ein HLA-A Typisierungsergebnis wurde für 345 der 346 Proben ermittelt. Eine
Wiederholung des Tests war bei 18 Proben aus einem Zentrum erforderlich.
Eine Probe ergab das Resultat „keine Typisierung ableitbar", aber dem Prüfer
zufolge war dies wahrscheinlich auf eine DNA-Kontamination zurückzuführen.
Die Exaktheit auf Allelgruppenniveau wurde als prozentualer Anteil der
beobachteten Konkordanz mit alternativen DNA-Assays (Biotest ELPHA
HLA-AB LowRes Typisierungskit, Dynal SSP, LiPA HLA-A, Sequenzierung,
Micro SSP™, OLERUP SSP™, Biotest HLA-A SSP) berechnet.
Die Ergebnisse für das INNO-LiPA HLA-A Update wurden als mit dem
Ergebnis des Referenzassays übereinstimmend betrachtet, wenn die zwei
Resultate identisch waren, die Ergebnisse für das INNO-LiPA HLA-A Update
spezifischer als das Referenzergebnis waren oder wenn die Ergebnisse für das
INNO-LiPA HLA-A Update eine geringere Auflösung, aber ein korrektes
Ergebnis im Vergleich mit den Referenzverfahren zeigte.
Die initiale Exaktheit betrug 99,1% (342/345). Diskrepanztests führten zu
einer Exaktheit von 99,7% (344/345). Es wurden Maßnahmen ergriffen,
um in Zukunft eine fehlerhafte Typisierung, wie sie während der Studie bei
einer Probe auftrat, zu vermeiden.
Auflösung (Typisierungstabelle Version v1.0/2001-03-31)
Der INNO-LiPA HLA-A Update wurde als Test zur Auflösung von HLA-AAllelen auf Allelgruppenniveau konzipiert, d. h. auf Ebene serologischer
Äquivalente. „Allelgruppe" ist die Bezeichnung für die ersten beiden Stellen
nach dem Sternchen in der HLA-Standardnomenklatur (z. B. HLA A*32).
Darüber hinaus sollen mit dem Kit die folgenden Nullallele nachgewiesen
werden: A*0232N (Exon 3), A*0303N (Exon 3), A*2409N (Exon 4),
A*2611N (Exon 3) und A*6811N (Exon 1). Das Allel A*2402102L, welches
ein niedriges Expressionsniveau besitzt, kann ebenso nachgewiesen
werden (Intron 2).
47
INNO-LiPA HLA-A Update
Die theoretische Auflösung auf Allelgruppen-Niveau (d.h. 2 Ziffern) wurde
mit 99.5% berechnet. Die Auflösung auf Allelgruppen-Niveau, die in dieser
Studie nach Analyse der Diskrepanzen ermittelt wurde, war 99,4%
(343/345). Initial wurde eine Zweideutigkeit beobachtet (A*02 x A*66 oder
A*02 x A*26). Eine zweite Zweideutigkeit trat nach der Anpassung der
Typisierungstabelle auf (A*3201 x A*3201 oder A*3201 x A*7403). Fünf mit
dem Referenzverfahren beobachtete Ambiguitäten (14 Proben) wurden mit
Hilfe des INNO-LiPA HLA-A Update Assays auf ein einziges eindeutiges
Typisierungsergebnis reduziert.
Im Verlauf dieser klinischen Evaluation wurden zwei Nullallele ermittelt:
A*0303N und A*6811N.
Sondenreaktivität
In einem oder mehreren Fällen während dieser klinischen Studie reagierten
zehn Sonden falsch-positiv und sechs Sonden schwach bis falsch-negativ.
Diese Information - falls sie nicht bereits vorlag - wurde in die Software
und/oder den Leitfaden integriert, um die Typisierung in Zukunft zu erleichtern.
Alle außer einer der falschen Reaktivitäten wurden als solche erkannt, und bei
einem Einsatz der LiRAS™ Interpretationssoftware wurde eine
übereinstimmende Typisierung auf Allelgruppenebene erzielt. Auf das Risiko
einer Fehltypisierung durch eine falsch-negative Reaktion wurde durch
Anpassung der Typisierungstabelle eingegangen.
Eingehende Informationen zur Sondenreaktivität finden Sie im Leitfaden.
Es ist eine vollständige Auflistung der Sonden- und Primerspezifitäten erhältlich.
Wenn in der Liste nicht abweichend angegeben, sind alle Sonden darauf
ausgerichtet, speziell mit ihrer komplementären Sequenz auf der Ebene eines
„Mismatches" zu hybridisieren.
Empfindlichkeit
Die interne Evaluation einer Verdünnungsserie dreier DNA-Proben von
0,01 µg/µl bis 2 µg/µl ergab, dass alle Proben auf Agarosegel sichtbar
waren und korrekt typisiert wurden.
Die externe Evaluation der Leistungsfähigkeit umfasste 346 DNA-Proben
mit einer Konzentration zwischen 20 ng/µl und 1500 ng/µl und einer
Reinheit (A260nm/A280nm) ≥ 1,5. Die DNA wurde vor der Amplifikation auf
eine Konzentration zwischen 20 ng/µl und 250 ng/µl verdünnt. Es wurden keine
Amplifikationsfehler festgestellt, auch wenn bei einer Probe aus dem Zentrum
der Test wiederholt werden musste.
Präzision
Interne Daten:
Drei Proben wurden vierfach von zwei unterschiedlichen Personen manuell
bzw. von einer Person auf zwei verschiedenen Auto-LiPA-Geräten getestet.
Zwei Proben wurden auf drei verschiedenen Chargen in zwei unterschiedlichen
Läufen analysiert. Die Interpretation der Ergebnisse war für alle Proben
identisch. Die Sondenreaktivität war in allen Fällen vergleichbar.
INNOGENETICS®
48
Externe Validierung:
- Die Variabilität zwischen den Losen wurde mittels Analyse eines
proficiency panels (5 Proben mit bekannter Reaktivität und
Interpretation) bei zwei verschiedenen Chargen des Produkts beurteilt.
Für jede Probe wurde unabhängig von der verwendeten Charge
dasselbe Typisierungsergebnis erzielt.
- Die Variabilität zwischen den Labors wurde beurteilt, indem in allen
vier Einrichtungen dasselbe proficiency panel verwendet wurde. Alle
Einrichtungen erzielten für die fünf Proben dasselbe
Typisierungsresultat.
Italiano
Uso previsto
L' INNO-LiPA HLA-A Update è un test su striscia, per l'uso in vitro,
progettato per la tipizzazione molecolare degli alleli degli antigeni
leucocitari umani (HLA) A a livello di gruppo allelico.
Principio del test
I test di tipizzazione INNO-LiPA HLA si basano sul principio della
ibridazione inversa, riassunto nella Figura 1. Il DNA biotinilato e amplificato
viene denaturato chimicamente e i filamenti separati vengono ibridati con
sonde oligonucleotidiche specifiche immobilizzate in linee parallele sulla
membrana delle strip di reazione. Segue poi un passaggio di lavaggio
stringente per rimuovere ogni mismatch del materiale amplificato. Dopo il
lavaggio stringente, si aggiunge il coniugato, streptavidina, legato a
fosfatasi alcalina che si lega agli ibridi biotinilati formatisi in precedenza.
L'incubazione con una soluzione di substrato contenente un cromogeno
porta alla formazione di un precipitato viola/marrone. La reazione viene
fermata da un passaggio di lavaggio, e viene registrato il pattern di
reattività delle sonde.
Insieme ad INNO-LiPA HLA-A Update, è disponibile un kit di amplificazione
(INNO-LiPA HLA-A Multiplex) per la preparazione standardizzata del materiale
biotinilato e amplificato. Il kit di amplificazione si basa sulla reazione a catena
della polimerasi (PCR*).
I prodotti di amplificazione vengono successivamente ibridati usando
2 strip di tipizzazione sulle quali sono fissate 43 sonde sequenzaspecifiche e 2 bande di controllo (Figura 2).
* L'uso di questo prodotto è protetto da licenza di F. Hoffmann La Roche Ltd. e Roche Molecular Systems, Inc.
Figura 1 (vedere pagina 9): Principio della procedura del test di
tipizzazione INNO-LiPA HLA
49
INNO-LiPA HLA-A Update
INNO-LiPA HLA-A Update: step coinvolti
Step 1
Amplificazione Multiplex degli esoni da 1 a 4 del locus HLA-A
Step 2
Ibridazione e lavaggio stringente con 44 sonde immobilizzate su due strip
INNO-LiPA HLA-A Update (56°C).
Step 3
Sviluppo del colore
Step 4
Interpretazione del pattern di reattività delle sonde
L' INNO-LiPA HLA-A Update è stato progettato per fornire la migliore risoluzione
possibile, usando il formato di test a ibridazione inversa, a livello di gruppo
allelico (questo significa, nella nomenclatura HLA standard, le prime due cifre
dopo l'asterisco nel nome dell'allele es. HLA-A*26).
In aggiunta all'interpretazione di gruppo allelico, il software fornisce anche
tutte le possibili combinazioni alleliche, questa informazione, tuttavia,
dovrebbe essere considerata come aggiuntiva e non come decisiva.
Reagenti
Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazione
raccomandate
-
-
Chiusi e conservati a 2 - 8°C, tutti i reagenti del test incluse le strip
sono stabili fino alla data di scadenza del kit. Non congelare i reagenti.
Tutti i reattivi e il tubo di plastica contenente le strip dovrebbero essere
portati a temperatura ambiente (20 - 25°C) approssimativamente
60 minuti prima dell'uso e dovrebbero essere riposti in frigorifero
immediatamente dopo l'uso.
Alterazioni nell'aspetto fisico dei componenti del kit possono indicare
instabilità o deterioramento.
Il kit dovrebbe essere conservato isolato da qualsiasi sorgente di DNA
contaminante, in special modo dai prodotti di DNA amplificati.
Per ridurre la possibilità che le strisce si incurvino prima dell'uso, si
raccomanda di conservare orizzontalmente il tubo che le contiene.
Componente
Quantità
Conser- Descrizione
vazione
20
2 - 8°C Contenente 20 strips 1 per INNO-LiPA
HLA-A Update identificate da una linea
di colore blu di Prussia.
20
2 - 8°C
Contenente 20 strips 2 per INNO-LiPA
HLA-A Update identificate da una linea
di colore turchese.
0.05 ml 2 - 8°C Contenente acido
etilendiamminotetracetico (EDTA) e
0.01% metilisotiazolone (MIT)/
0.1% cloroacetammide (CAA) come
conservante.
1 ml
2 - 8°C Soluzione alcalina contenente
EDTA. Il flacone deve essere chiuso
immediatamente dopo l'uso; l'esposizione prolungata di questa soluzione
all'aria porta ad un rapido
deterioramento della forza denaturante.
Strips 1
1x
Strips 2
1x
Controllo LiPA
1x
Soluzione di
Denaturazione
1x
INNOGENETICS®
50
Soluzione di
Ibridazione
2 x 80 ml
2 - 8°C
Soluzione di
Lavaggio Stringente
2 x 200 ml 2 - 8°C
Diluente del
Coniugato
1 x 150 ml 2 - 8°C
Coniugato 100x
1 x 1.5 ml
Tampone Substrato
1 x 235 ml 2 - 8°C
2 - 8°C
Substrato BCIP/NBT 1 x 1.5 ml
100x
2 - 8°C
Soluzione di
Risciacquo 5x
2 - 8°C
2 x 80 ml
Soluzione salina-tampone
sodio fosfato-EDTA (SSPE) contenente
0.5% sodio dodecil solfato (SDS).
La Soluzione di Ibridazione deve essere
preriscaldata alla temperatura di
almeno 37°C e non deve superare i
56°C (tutti i cristalli devono essere
disciolti prima dell'uso).
Tampone SSPE contenente
0.1% SDS. La soluzione di Lavaggio
Stringente deve essere preriscaldata
alla temperatura di almeno 37°C e non
deve superare i 56°C (tutti i cristalli
devono essere disciolti prima dell'uso).
Tampone fosfato contenente
NaCl, Triton®, proteine stabilizzatrici e
0.01% MIT/0.1% CAA come conservante.
Streptavidina legata a fosfatasi alcalina in
tampone Tris contenente proteine
stabilizzatrici e 0.01% MIT/0.098% CAA
come conservante, da diluire 1/100 nel
Diluente del Coniugato prima dell'uso.
Per il test manuale preparare 2 ml di
soluzione di lavoro Coniugato per
ciascuna vaschetta del test + 2 ml in
eccesso (la soluzione di lavoro Coniugato
può essere preparata durante il lavaggio
stringente).Per Auto-LiPA, preparare 10 ml
in eccesso.
La soluzione di lavoro Coniugato è
stabile per 24 ore a T ambiente
(20 - 25°C) se conservata al buio.
Tampone Tris contenente NaCl, MgCl2 e
0.01% MIT/0.1% CAA come conservante.
5-Bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato sale di p-toluidina (BCIP) e
nitroblu di tetrazolio (NBT) in
dimetilformammide (DMF), da diluire
1/100 nel tampone substrato prima
dell'uso. Per il test manuale preparare
2 ml di soluzione di lavoro Substrato
per ciascuna vaschetta + 2 ml in
eccesso (la soluzione di lavoro
Substrato può essere preparata durante
l'incubazione del coniugato). Per AutoLiPA, preparare 10 ml in eccesso.
La soluzione di lavoro Substrato è stabile
per 24 ore a T ambiente (20 - 25°C) se
conservata al buio.
Tampone fosfato contenente
NaCl, Triton®, e 0.05% MIT/0.48% CAA
come conservante, da diluire 1/5 (1 parte
+ 4 parti) in acqua distillata o deionizzata
prima dell'uso. Preparare 8 ml di soluzione
di lavoro di Risciacquo per ciascuna
51
INNO-LiPA HLA-A Update
Vassoi Incubazione
Carta di lettura
5
1
Foglio di report dei dati 2
vaschetta del test + 10 ml in eccesso. Per
Auto-LiPA, preparare 20 ml in eccesso. La
soluzione di lavoro di Risciacquo è stabile
per 2 settimane a 2 - 8°C.
Contenenti 8 vaschette ciascuno.
Per l'identificazione delle sonde
positive.
Per la conservazione delle strip
sviluppate.
Materiali richiesti ma non forniti
-
-
INNO-LiPA HLA-A Multiplex.
Bagnomaria con piatto agitante (80 rpm; con coperchio inclinato;
temperatura programmabile a 56°C ± 0.5°C).
Apparato per aspirazione.
Termometro tarato.
Agitatore orbitale, reciproco o basculante.
Raccomandazioni per un agitatore orbitale:
•
il diametro del movimento circolare dovrebbe essere uguale o superiore a
13mm.
•
la velocità raccomandata per un moto da 13 mm è 160 rpm.
Raccomandazioni per un agitatore reciproco:
•
la velocità raccomandata per il moto avanti-indietro è di 80 movimenti/minuto.
Raccomandazioni per un agitatore basculante:
•
l'angolo di oscillazione non deve superare i 13° per evitare fuoriuscita di liquidi.
•
la velocità raccomandata è 50 rpm.
Vortex o equivalenti.
Cilindri graduati (10, 25, 50 e 100 ml).
Acqua distillata o deionizzata.
Guanti monouso.
Puntali sterili monouso (preferibilmente con filtro).
Pinzette per maneggiare le strip.
Pipette regolabili per dispensare da 1 - 20 µl, da 20 - 200 µl,
e da 200 - 1000 µl.
Pipetta a ripetizione (Eppendorf, opzionale).
Timer, 2 ore (± 1 minuto).
Sicurezza e ambiente
Per cortesia fare riferimento alle schede di sicurezza del produttore e
alle etichette del prodotto per informazioni relative ai componenti
potenzialmente pericolosi.
INNOGENETICS®
52
R20/21, R36, R45, R61, S36/37, S45 S53
Tossico! Nocivo se inalato o in contatto con la pelle. Irritante per gli occhi.
Può provocare cancro. Può causare danni al feto. Indossare appropriati
abiti protettivi e guanti. In caso di incidente o malore rivolgersi
immediatamente ad un medico (mostrando l'etichetta se possibile).
Evitare l'esposizione - utilizzare le speciali istruzioni per l'uso. Ristretto ad
utilizzatori professionali.
Contiene Dimetilformammide, 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato sale
di p-toluidina: Substrato BCIP/NBT 100x.
R43, S24-37
Irritante! Evitare il contatto con la pelle. Può causare sensibilizzazione per
contatto con la pelle. Indossare guanti adatti.
Contiene 2-cloroacetammide: Soluzione di Risciacquo, Tampone del
Substrato, Diluente del Coniugato e Controllo LiPA.
R36/38, S23-24-26
Irritant! Irritating to eyes and skin. Do not inhale vapour. Avoid contact with
Irritante! Irritante per gli occhi e la pelle. Non inalare i vapori. Evitare il contatto
con la pelle. In caso di contatto con gli occhi, risciacquare immediatamente ed
abbondantemente con acqua e cercare consulto medico.
Contiene idrossido di sodio: Soluzione di Denaturazione.
-
-
I campioni devono essere manipolati come potenzialmente infetti.
Quindi, tutti i componenti del sangue e i materiali biologici dovrebbero
essere considerati come potenzialmente infetti e trattati come tali.
L'esecuzione del test dovrebbe essere permessa solo a personale
adeguatamente preparato.
Tutti i componenti del sangue e i materiali biologici dovrebbero essere
smaltiti in accordo a procedure di sicurezza standardizzate.
• Autoclavare per almeno 15 minuti a 121°C.
• Incenerire il materiale monouso.
• Miscelare il liquido di scarto con ipoclorito di sodio in modo che la
concentrazione finale sia ± 1% di ipoclorito di sodio.
Lasciar riposare tutta la notte prima di smaltirlo.
ATTENZIONE: Neutralizzare il liquido di scarto che contiene acido
prima di aggiungere ipoclorito di sodio.
È necessario l'uso di equipaggiamento di protezione: indossare guanti e
occhiali di sicurezza quando si manipolano agenti pericolosi o infettivi.
Gli scarti devono essere trattati secondo le linee guida delle istituzioni
in materia. Osservare inoltre i regolamenti ambientali statali e locali.
53
INNO-LiPA HLA-A Update
Campioni
Poichè il test INNO-LiPA HLA-A Update utilizza DNA biotinilato e
amplificato, un kit di amplificazione, INNO-LiPA HLA-A Multiplex,
è disponibile come strumento di accompagnamento.
Procedure di manipolazione
Trattamento delle strip
-
Le strip possono essere usate solo una volta!
Non toccare le strip a mani nude; usare pinzette pulite.
Usare una matita per l'identificazione delle strip del test.
Non usare penne a sfera, etc. Scrivere il numero identificativo sopra la
linea di identificazione della strip.
Durante i diversi passaggi di incubazione, le strip devono sempre
rimanere nella stessa vaschetta.
Le strip non usate o quelle sviluppate dovrebbero essere tenute
lontane da luce intensa e calore.
Lasciare asciugare completamente le strip sviluppate prima
dell'interpretazione, copertura e conservazione.
Le strip sviluppate e asciugate dovrebbero essere conservate
preferibilmente al buio a 20 - 25°C.
Non riutilizzare le vaschette.
Indicazioni per l' incubazione manuale
-
-
-
-
L'incubazione a 56°C ± 0.5°C durante l'ibridazione e il lavaggio
stringente è il passaggio più critico per evitare falsi positivi
(temperatura troppo bassa) o segnali falsi negativi/molto deboli
(temperatura troppo alta). Un bagnomaria in agitazione con il
coperchio inclinato permette un buon controllo delle variazioni della
temperatura. È necessario un accurato controllo della temperatura con
un termometro calibrato. Chiudere sempre il coperchio del
bagnomaria durante le incubazioni per evitare segnali falsi positivi.
Non usare agitatori ad aria calda per l'ibridazione e il lavaggio
stringente.
Per l'ibridazione e il lavaggio stringente, le vaschette devono essere
posizionate sul piatto agitante del bagnomaria. Il livello dell'acqua deve
essere compreso tra 1/3 e 1/2 dell'altezza della vaschetta. Assicurarsi che
le vaschette non galleggino nell'acqua. L'acqua deve essere a contatto
diretto con le vaschette.
I passaggi di incubazione per lo sviluppo del colore dovrebbero svolgersi
tra 20 - 25°C. Se la temperatura è sotto i 20°C, si possono ottenere risultati
più deboli. Se la temperatura è sopra i 25°C, si possono ottenere elevate
colorazioni di fondo e/o segnali falsi positivi.
Incubare sempre esattamente per il tempo indicato nel protocollo.
L'ampiezza del movimento generato sia dal bagnomaria in agitazione
(procedura di ibridazione e lavaggio stringente) che dall'agitatore
(procedura di sviluppo di colore) è critica nel raggiungere il massimo di
sensibilità e colorazione omogenea. La superficie delle strip deve
essere completamente immersa. L'ampiezza dovrebbe essere più
INNOGENETICS®
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-
54
grande possibile. Comunque evitare che i liquidi si riversino sul
bordo delle vaschette! Questo può portare a cross-contaminazioni e
risultati invalidi.
L'agitazione durante l'incubazione delle strip dovrebbe essere eseguita
in maniera tale che sia il liquido che le strip si muovano avanti e
indietro nella vaschetta, senza che il liquido arrivi a versarsi sul bordo
delle vaschette.
Non coprire il vassoio portavaschette. Durante le incubazioni di
ibridazione e lavaggio stringente, le vaschette possono essere lasciate
scoperte dentro il bagnomaria. Coprire le vaschette con copripiastra
adesivo può causare cross-contaminazione.
Indicazioni per il cambiamento manuale dei liquidi nelle vaschette
-
Il liquido viene aspirato dalla vaschetta con una pipetta, preferibilmente
attaccata ad un aspiratore a vuoto. Il vassoio viene tenuto inclinato per
permettere a tutto il liquido di raccogliersi ad un angolo della vaschetta.
Aggiungere 2 ml della appropriata soluzione a ciascuna vaschetta e
seguire il protocollo. Una pipetta a ripetizione (Eppendorf) è utile a
questo scopo.
Ripetere questo passaggio tante volte quante indicate nella procedura
del test.
NOTA:
• Non lasciare asciugare le strip tra due passaggi.
• Assicurarsi di non danneggiare la superficie delle strip mentre si
aspira. Aspirare il liquido al di sopra della linea di identificazione
della strip.
• Assicurarsi che tutto il liquido sia aspirato.
• Assicurarsi che l'intera strip venga accuratamente lavata
immergendola completamente nella soluzione.
• Adattare se necessario la velocità dell'agitatore.
Note e precauzioni
-
-
Solo per uso in vitro.
Solo per uso professionale.
Per evitare contaminazione da DNA, si raccomanda la massima
separazione fisica tra i passaggi di pre- e post- amplificazione: stanze
separate, pipette e altro materiale di laboratorio dedicato, camici e
guanti separati (e i loro stock) sono precauzioni minime per le buone
pratiche di laboratorio.
Evitare di tornare dalla stanza della post-amplificazione alla stanza
della pre-amplificazione.
E' raccomandato l'uso di materiale di laboratorio monouso autoclavato.
Non riutilizzare il materiale di laboratorio monouso.
Usare un nuovo puntale sterile per ciascun campione aliquotato.
Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza.
Non miscelare i reagenti tra kit a meno che i componenti non abbiano
lo stesso numero di lotto.
Evitare la contaminazione microbica dei reagenti.
55
INNO-LiPA HLA-A Update
Procedura manuale del test
NOTA:
- Durante i differenti passaggi di incubazione, le strip devono sempre
rimanere nella stessa vaschetta.
Prima dell'incubazione, controllare la temperatura del bagnomaria
con un termometro tarato, e regolare la temperatura, se necessario,
prima di porre il vassoio portavaschette nel bagnomaria. Chiudere
sempre il coperchio.
Il Controllo LiPA dovrebbe essere sempre incluso in ciascuna seduta.
Campioni
1. Prodotti amplificati HLA-A (usare 10 µl). Per la preparazione dei campioni:
vedi le Istruzioni per l'uso di INNO-LiPA HLA-A Multiplex.
NOTA:
• Assicurarsi che siano aggiunti esattamente 10 µl del campione
amplificato. Troppo o poco campione può portare a erronei risultati
di tipizzazione.
2. Controllo LiPA per INNO-LiPA HLA-A Update (usare 10 µl; non è
richiesta l'amplificazione!)
3. Controllo bianco amplificato (controllo negativo; usare 10 µl).
Denaturazione e ibridazione
1. Scaldare un bagnomaria a 56°C ± 0.5°C. Controllare la temperatura
usando un termometro tarato e, se necessario, regolare la
temperatura. Non superare la temperatura indicata. Preriscaldare la
Soluzione di Ibridazione e la Soluzione di Lavaggio Stringente nel
bagnomaria ad almeno 37°C e senza superare i 56°C. Miscelare
prima dell'uso. Tutti i cristalli devono essere disciolti.
2. Usando delle pinzette, rimuovere il numero necessario di INNO-LiPA
HLA-A Update Strip 1 e Strip 2 dal tubo (una strip 1 e una strip 2 per
ciascun campione). Includere le strip per il Controllo LiPA per INNOLiPA HLA-A Update e per il controllo bianco amplificato.
A matita identificare le strip sopra le linee di identificazione blu di
Prussia/turchese.
3. Prelevare il numero richiesto di vaschette (una per ciascuna strip) e
alloggiarle nel vassoio portavaschette.
4. Pipettare 10 µl di Soluzione di Denaturazione nell'angolo superiore di
ciascuna vaschetta.
NOTA:
• Chiudere il flacone immediatamente dopo l'uso.
5. Aggiungere 10 µl di campione (vedi Campioni; vedi le Istruzioni per l'uso di
INNO-LiPA HLA-A Multiplex) e miscelare accuratamente pipettando su e
giù. Usare sempre puntali sterili. Lasciare a denaturare per 5 minuti a
20 - 25°C.
6. Agitare la Soluzione di Ibridazione pre-riscaldata e gentilmente
aggiungerne 2 ml al prodotto di amplificazione denaturato in ciascuna
vaschetta. Miscelare agitando gentilmente. Evitare di contaminare le
vaschette vicine durante il pipettamento.
INNOGENETICS®
56
7. Immediatamente porre le strip dentro le vaschette. Le strip devono
essere completamente immerse nella soluzione.
NOTA:
• Indossare guanti monouso e usare le pinzette.
8. Porre il vassoio portavaschette nel bagnomaria in agitazione a
56°C ± 0.5°C (80 rpm; vedere Indicazioni per l'incubazione manuale),
chiudere il coperchio e incubare per 30 minuti.
NOTA:
• Evitare che l'acqua del bagnomaria finisca nelle vaschette. Il livello
dell'acqua deve essere compreso tra 1/3 e 1/2 dell'altezza della
vaschetta. Per prevenire lo spostamento del portavaschette,
immobilizzarlo tra due oggetti pesanti.
Lavaggio stringente
1. Dopo l'ibridazione, rimuovere il vassoio portavaschette dal bagnomaria.
2. Tenere il portavaschette inclinato e aspirare il liquido dalla vaschetta con
una pipetta, preferibilmente attaccata ad un aspiratore a vuoto.
Aggiungere 2 ml della Soluzione di Lavaggio Stringente pre-riscaldata a
ciascuna vaschetta, porre il portavaschette nel bagnomaria in agitazione a
56°C ± 0.5°C, chiudere il coperchio e incubare per 3 minuti.
3. Dopo l'incubazione, rimuovere il portavaschette dal bagnomaria e
aspirare il liquido dalle vaschette.
4. Ripetere un'altra volta il passaggio di incubazione di 3 minuti e il
passaggio di aspirazione.
5. Al termine, aggiungere 2 ml della Soluzione di Lavaggio Stringente
pre-riscaldata in ciascuna vaschetta e porre il portavaschette nel
bagnomaria in agitazione a 56°C ± 0.5°C, chiudere il coperchio e
incubare per 4 minuti.
NOTA:
• Diluire la Soluzione di Risciacquo concentrata 5x e il Coniugato
100x durante il lavaggio stringente. Vedi Reagenti.
Sviluppo del colore
Tutte le incubazioni che seguono sono eseguite a 20 - 25°C su un
agitatore. Durante le incubazioni, il liquido e le strip devono muoversi
avanti e indietro nella vaschetta per ottenere una colorazione omogenea.
1. Lavare ciascuna strip due volte per un minuto usando 2 ml della
soluzione di lavoro di Risciacquo (vedi Indicazioni per il cambio dei liquidi
nelle vaschette).
2. Aggiungere 2 ml della soluzione di lavoro del Coniugato a ciascuna
vaschetta e incubare per 30 minuti sull'agitatore.
NOTA:
• Diluire la soluzione di Substrato BCIP/NBT 100x circa
10 minuti prima della fine dell'incubazione del coniugato.
Vedi Reagenti.
3. Lavare ciascuna strip 2 volte per 1 minuto usando 2 ml della
soluzione di lavoro di Risciacquo e lavare ancora una volta usando
2 ml del Tampone Substrato.
4. Aggiungere 2 ml della soluzione di lavoro del Substrato a ciascuna
vaschetta e incubare per 30 minuti sull'agitatore.
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INNO-LiPA HLA-A Update
ATTENZIONE:
• Indossare guanti e occhiali protettivi.
5. Fermare lo sviluppo del colore lavando le strip due volte con
2 ml di acqua distillata facendo agitare il portavaschette sull'agitatore
per almeno 3 minuti.
6. Usando le pinzette, rimuovere le strip dalle vaschette e porle su carta
assorbente. Lasciare asciugare completamente le strip prima di
leggere i risultati. Conservare le strip asciugate e sviluppate al buio.
Procedura automatica del test: Auto-LiPA
La procedura dei test LiPA è idonea per essere automatizzata.
L' Auto-LiPA è progettato infatti per gestire completamente i passaggi di
ibridazione, lavaggio stringente e sviluppo del colore.
L' Auto-LiPA è un sistema walk-away con riscaldamento e raffreddamento
automatici e con aspirazione e dispensazioni automatici.
Il protocollo standard per l'Auto-LiPA 48 descrive l'esecuzione per un numero di
campioni fino a 24 quando si usa una singola striscia per vaschetta.
Questo numero, comunque, può essere aumentato fino a 48. Per eseguire
questo, due strisce dallo stesso locus vengono testate nella stessa
vaschetta, mantenendo tutti gli altri parametri del protocollo immutati.
Da notare, però, che occasionalmente possono essere osservate reattività più
deboli delle sonde. Quindi, ai clienti che intendono aumentare il numero di
campioni consigliamo di validare questa procedura di "2 strisce in una
vaschetta" nel proprio laboratorio.
Per maggiori informazioni e protocolli specifici dell' Auto-LiPA, contattare
Innogenetics o i distributori locali.
Risultati
Lettura
La Figura 2 illustra la posizione delle differenti sonde oligonucleotidiche sulle
strip di INNO-LiPA HLA-A Update. Una linea è considerata positiva quando
appare una netta banda viola/marrone alla fine della procedura del test.
Figura 2 (vedere pagina 17): Posizioni della linea di identificazione (blu di
Prussia sulla Strip 1 e turchese sulla Strip 2), della linea di controllo del
coniugato (conj. control), della linea di controllo di HLA-A Update (HLA-A
control), e delle 44 sonde di INNO-LiPA HLA-A Update.
Validazione
-
Includere un controllo negativo e il Controllo LiPA (per INNO-LiPA
HLA-A Update) ogni volta che si esegue un test. Come per ciascuna
nuova procedura, l'aggiunta di ulteriori controlli positivi e negativi deve
essere presa in esame fino a che non venga raggiunto un alto grado
di confidenza nella corretta esecuzione del test. Si suggerisce di usare
DNA di riferimento per assicurarsi che siano state raggiunte le più
idonee condizioni di esecuzione per il test.
INNOGENETICS®
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Le linee più in alto sulle strip INNO-LiPA HLA-A Update (Figura 2)
sono le linee di identificazione (blu di Prussica e turchese).
Queste linee permettono il corretto orientamento delle strip.
La linea successiva controlla l'aggiunta delle soluzioni di lavoro del
Coniugato e del Substrato durante la procedura di rilevazione. Questa
linea deve essere allineata con la linea di controllo del coniugato della
carta di lettura. Questa linea deve essere sempre positiva (altrimenti non
deve essere fatta alcuna interpretazione!) e dovrebbe avere
approssimativamente la stessa intensità nelle strip della stessa seduta.
La linea successiva è la linea di controllo interno di ibridazione di
HLA-A Update (sulla carta di lettura: HLA-A control) ed indica se si è
aggiunta per l'ibridazione una appropriata quantità di materiale
amplificato di HLA-A. Questa linea deve essere sempre positiva,
eccetto per il controllo negativo, ma la sua intensità può variare tra i
diversi campioni.
Il risultato di ciascun controllo negativo deve dare nessun segnale per
ciascuna delle linee sulla strip, eccetto che per la linea di controllo del
Coniugato.
Il Controllo LiPA per INNO-LiPA HLA-A Update deve mostrare il
seguente pattern di sonde positive: controllo coniugato, controllo
HLA-A, 15, 30, e 35. Ogni altra sonda deve essere negativa.
Questo controllo è costituito da oligonucleotidi biotilinati,
complementari alle sonde di ibridazione menzionate. L'ibridazione
positiva di queste sonde quindi dimostra una esecuzione
soddisfacente del test nei passaggi di ibridazione, lavaggio stringente,
sviluppo del colore e rilevazione. Un pattern diverso può indicare
problemi di esecuzione come temperatura non corretta durante
l'ibridazione o deviazioni dai tempi e temperature indicati.
Le intensità di colore delle sonde su una strip possono essere diverse
da una linea all'altra.
Interpretazione dei risultati
-
Controllare la corretta reattività del Controllo LiPA.
La linea di controllo del coniugato sulla strip deve essere allineata con la
linea di controllo del coniugato della carta di lettura.
Per prima cosa controllare la positività delle linee di controllo (le prime
due linee) per validare ciascuna singola strip (vedi Validazione).
I risultati di tipizzazione si basano sulla reattività delle sonde nel kit.
La lista delle specificità delle sonde è disponibile.
Identificare i numeri di tutte le sonde che sono positive sulle strip di INNOLiPA HLA-A Update e risalire al tipo di HLA-A usando la tabella di
tipizzazione di INNO-LiPA HLA-A Update o il software di interpretazione
LiPA (vedi Software di interpretazione LiRAS).
Il software spesso fornisce più risultati rispetto all'uso previsto del prodotto:
viene fornita l'interpretazione a livello di gruppo allelico, come pure tutte le
possibili combinazioni alleliche. Poiché il kit non è stato progettato per
tipizzare in maniera specifica questi alleli a livello allelico, queste
informazioni devono essere considerate come aggiuntive e non come
decisive.
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INNO-LiPA HLA-A Update
Software di interpretazione: LiRAS™
Il software LiRAS per INNO-LiPA HLA è stato studiato per assistere
nell'interpretazione dei risultati LiPA. Per cortesia contattare il distributore locale
per avere l'ultima versione aggiornata.
Limiti della procedura
-
-
L'uso di questo prodotto deve essere limitato a personale esperto nelle
tecniche di ibridazione.
Solo le buone pratiche di laboratorio e l'attenta esecuzione delle
procedure specificate permetteranno una ibridazione specifica e la
corretta tipizzazione del DNA target.
Le strip di INNO-LiPA HLA-A Update sono stare studiate per
permettere una risoluzione a livello di gruppo allelico (da A*01 a A*80).
Comunque, una combinazione di alcuni alleli può portare ad una
combinazione di sonde non unica e fornire una risposta ambigua per
due o più possibili combinazioni di gruppo allelico.
I nuovi alleli possono avere polimorfismi al di fuori delle regioni delle sonde,
questo deve essere considerato quando si interpretano i risultati.
Le linee di controllo di HLA-A Update non sono solo specifiche per
l'HLA-A, ma anche per quasi tutti gli alleli di HLA-B e HLA-C.
Quindi le linee di controllo di HLA-A possono anche reagire con i
prodotti di amplificazione di HLA-B e HLA-C.
Test performance
La performance di INNO-LiPA HLA-A Update è stata valutata in quattro
laboratori europei di tipizzazione tissutale su campioni tipizzati di routine.
E' stato analizzato un totale di 346 campioni. Il DNA è stato estratto da sangue
fresco o congelato in anticoagulante citrato o EDTA. I metodi di estrazione del
DNA utilizzati sono stati salting out, QIAamp 96 DNA blood kit (Qiagen),
Genomic DNA Purification kit (Promega) e Puregene (Gentra Systems). Il DNA
fresco o congelato è stato amplificato usando il thermal cycler Perkin Elmer
9600 o 9700. Gli ampliconi sono stati conservati a 2 - 8°C o -25/-15°C prima di
essere messi sulla striscia.
Non sono stati riscontrati fallimenti di amplificazione, sebbene sia stato
necessario ripetere il test per un campione. I campioni sono stati processati
utilizzando lo strumento Auto-LiPA e interpretati con una versione sperimentale
del software di interpretazione LiRAS™.
Accuratezza
Si è ottenuto un risultato di tipizzazione HLA-A per 345 su 346 campioni.
E' stato necessario ripetere 18 campioni di un centro.
Di un campione non è risultata deducibile la tipizzazione, ma in accordo
con l'operatore, ciò è stato probabilmente dovuto ad una contaminazione
del DNA.
L'accuratezza a livello di gruppo allelico è stata calcolata come
percentuale di concordanza con test di DNA alternativi (Biotest ELPHA
HLA-AB LowRes Typing kit, Dynal SSP, LiPA HLA-A, sequenziamento,
INNOGENETICS®
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Micro SSP™, OLERUP SSP™, Biotest HLA-A SSP). I risultati di INNOLiPA HLA-A Update sono stati considerati concordanti con il risultato del
test di riferimento, se i due risultati erano identici, se i risultati INNO-LiPA
HLA-A Update erano più specifici del test di riferimento, o se i risultati
INNO-LiPA HLA-A Update mostravano una minore risoluzione ma un
risultato corretto a confronto con i metodi di riferimento.
L'accuratezza iniziale è stata del 99.1% (342/345). Testando le
discrepanze l'accuratezza è risultata del 99.7% (344/345). E' stata
intrapresa un'azione di correzione per prevenire futuri errori di tipizzazione
come è avvenuto per un campione durante lo studio.
Risoluzione (tabella di tipizzazione versione v1.0/2001-03-31)
INNO-LiPA HLA-A Update è stato progettato per individuare gli alleli HLA-A
a livello di gruppo allelico, cioè a livello degli equivalenti sierologici.
'Gruppo allelico' è la designazione delle prime due cifre che seguono
l'asterisco nella nomenclatura HLA standard (es. HLA A*32). Inoltre, il kit è
progettato per determinare i seguenti alleli nulli: A*0232N (esone 3),
A*0303N (esone 3), A*2409N (esone 4), A*2611N (esone 3) e A*6811N
(esone 1). Anche l'allele A*2402102L, che ha un basso livello di
espressione, può essere determinato (introne 2).
La risoluzione teorica a livello di gruppo allelico (cioè le prime due cifre) è
calcolata come 99.5%. La risoluzione a livello di gruppo allelico osservata
durante questo studio, dopo l'analisi delle discrepanze, è stata del 99.4%
(343/345). Inizialmente, era stata osservata una ambiguità (A*02 x A*66 o A*02
x A*26). Una seconda ambiguità derivò come risultato dell'adattamento della
tabella di tipizzazione (A*3201 x A*3201 o A*3201 x A*7403). Sono state
osservate con il metodo di riferimento 5 ambiguità (14 campioni), che si sono
poi ridotte ad uno solo risultato chiaro utilizzando l' INNO-LiPA HLA-A Update.
Nel corso di questa valutazione clinica sono stati identificati due alleli nulli:
A*0303N e A*6811N.
Reattività delle sonde
Dieci sonde hanno reagito come false positive e sei sonde hanno reagito
come deboli o false negative in una o più occasioni durante la
sperimentazione clinica. Questa informazione, se non già presente, è stata
implementata nel software e/o nelle linee guida, per facilitare le future
tipizzazioni. Tutte le false reattività, tranne una, sono state identificate
come tali e risultati concordanti di tipizzazione a livello di gruppo allelico
sono stati raggiunti con l'utilizzo del software di interpretazione LiRAS™.
Il rischio di un'errata tipizzazione, causato da una reazione falsa negativa,
è stato risolto adattando la tabella di interpretazione.
Consultare le linee guida per specifiche informazioni sulla reattività delle sonde.
E' disponibile una completa lista della specificità delle sonde e dei primers.
Tutte le sonde sono state disegnate per ibridare specificamente con la loro
sequenza complementare a livello di un mismatch, a meno che
diversamente indicato nella lista.
61
INNO-LiPA HLA-A Update
Sensibilità
La valutazione interna di una diluizione seriale di 3 campioni di DNA, con
concentrazioni variabili tra 0.01 µg/µl e 2 µg/µl, ha mostrato che tutti i
campioni erano visibili su gel di agarosio e che erano tipizzati
correttamente. La valutazione esterna della performance ha compreso
346 campioni di DNA con una concentrazione compresa tra 20 ng/µl e
1500 ng/µl e con una purezza (A260nm/A280nm) ≥1.5. Il DNA è stato diluito a
concentrazioni comprese tra 20 ng/µl e 250 ng/µl prima dell'amplificazione. Non
sono stati rilevati fallimenti di amplificazione, sebbene sia stato necessario
ripetere il test su un campione.
Precisione
Dati interni:
Tre campioni sono stati testati in quadruplicato, da due diverse persone,
usando un metodo manuale, o da una persona su due diversi strumenti
Auto-LiPA. Due campioni sono stati analizzati con tre diversi lotti in due
diverse sedute. L'interpretazione dei risultati è stata la stessa per tutti i
campioni. La reattività delle sonde è stata comparabile in tutti i casi.
Validazione esterna:
- La variabilità inter-lotto è stata condotta analizzando un pannello di
controllo (5 campioni con reattività e interpretazione conosciute) con
due differenti lotti di prodotto. Per ogni campione è stato ottenuto lo
stesso risultato di tipizzazione, indipendentemente dal lotto di prodotto
utilizzato.
- La variabilità inter-laboratorio è stata valutata testando lo stesso
pannello di controllo in quattro centri. Ogni centro ha ottenuto gli stessi
risultati di tipizzazione per i cinque campioni.
Español
Uso al que está destinado
El INNO-LiPA HLA-A Update es un ensayo de sondas en tira, de uso in
vitro, diseñado para el tipaje molecular de alelos del locus A del antígeno
leucocitario humano (HLA) a nivel de grupo de alelos.
Principios del ensayo
Las pruebas de tipaje INNO-LiPA HLA se basan en los principios de
hibridación reversa que se resumen en la Figura 1. El material de ADN
biotinilado amplificado se desnaturaliza químicamente, y las hebras
separadas se hibridan con sondas de oligonucleótidos específicos,
inmovilizadas en líneas paralelas sobre tiras basadas en membranas.
Esto va seguido de una fase de lavado astrigente a fin de eliminar
cualquier material amplificado incorrectamente emparejado. Tras el lavado
astrigente, se añade estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina, que
queda ligada a cualquier híbrido biotinilado que se haya formado con
INNOGENETICS®
62
anterioridad. La incubación con una solución sustrato que contiene un
cromógeno produce un precipitado de color púrpura/marrón. La reacción
se interrumpe mediante una fase de lavado, tras la que se registra el
patrón de reactividad de las sondas.
Junto con el INNO-LiPA HLA-A Update se dispone de un kit de
amplificación (INNO-LiPA HLA-A Multiplex) que permite la preparación
estandarizada de material amplificado biotinilado. El kit de amplificación se
basa en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR*).
Posteriormente, los productos de la amplificación se hibridan utilizando
2 tiras de tipaje que llevan fijadas 43 sondas específicas de secuencia, así
como 2 líneas de control (Figura 2).
* La utilización de este producto está cubierta por una licencia
F. Hoffmann - La Roche Ltd y Roche Molecular Systems, Inc.
Figura 1 (ver página 9): Principios del procedimiento de ensayo de tipaje
INNO-LiPA HLA
INNO-LiPA HLA-A Update: pasos
Paso 1
Amplificación múltiplex de los exones 1 al 4 de locus A del HLA
Paso 2
Hibridación y lavado astrigente con 44 líneas de sondas inmovilizadas en
dos tiras INNO-LiPA HLA-A Update (56°C).
Paso 3
Desarrollo del color
Paso 4
Interpretación del patrón de reactividad de las sondas
El INNO-LiPA HLA-A Update está diseñado para proporcionar la mayor
resolución posible, utilizando el formato de ensayo de hibridación reversa,
a nivel de grupo de alelos (esto significa las dos primeras cifras
posteriores al asterisco en el nombre de un alelo cuando se sigue la
nomenclatura estándar para el HLA, por ejemplo, HLA-A*26).
Además de la interpretación a nivel de grupo de alelos, el software dará todas
las posibles combinaciones de alelos, información que, sin embargo, debería
ser considerada como extra pero no como decisiva.
Reactivos
Descripción, preparación para el uso y condiciones de
almacenamiento recomendadas
-
-
Si se mantienen a una temperatura de 2 - 8°C, todos los reactivos de
ensayo, incluidas las tiras de ensayo revestidas, son estables hasta la
fecha de caducidad indicada en el envase. No congele los reactivos.
Aproximadamente 60 minutos antes de su uso, deben precalentarse todos
los reactivos, así como los tubos de plástico que contienen las tiras de
ensayo, hasta que alcancen la temperatura ambiente (20 - 25°C); tras su
uso, deben devolverse inmediatamente al refrigerador.
Las alteraciones de la apariencia física del kit de reactivos pueden ser
signos de inestabilidad o deterioro.
El kit debe almacenarse completamente aislado de cualquier fuente
de ADN contaminante, especialmente productos de ADN amplificado.
Para minimizar la posibilidad de que las tiras se doblen antes de
usarlas, se recomienda guardar el tubo en posición horizontal.
63
INNO-LiPA HLA-A Update
Cada envase contiene:
Componente
Cantidad
Almace- Descripción
namiento
Tiras 1
1 x 20
2 - 8°C Contiene 20 Tiras 1 para el INNO-LiPA
HLA-A Update marcadas con una línea
marcadora en azul de Prusia.
Tiras 2
1 x 20
2 - 8°C Contiene 20 Tiras 2 para el INNO-LiPA
HLA-A Update marcadas con una línea
marcadora en color turquesa.
Control LiPA
1 x 0.05 ml 2 - 8°C Contiene ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA) y metilisotiazolona (MIT) al 0,01%/
cloroacetamida (CAA) al 0,1% como
conservante.
Solución de desnatura- 1 x 1 ml
2 - 8°C Solución alcalina que contiene
lización
EDTA. La botella debe cerrarse
inmediatamente después de su uso;
una exposición prolongada de esta
solución al aire lleva a un rápido
deterioro de su poder de
desnaturalización.
Solución de hibridación 2 x 80 ml
2 - 8°C Tampón de solución salina de fosfato
sódico de EDTA (SSPE) que contiene
sulfato de dodecilo sódico (SDS) al 0,5%.
La solución de hibridación debe
precalentarse a una temperatura mínima
de 37°C y máxima de 56°C (antes de
utilizarla deben haberse disuelto todos los
cristales).
Solución de lavado
2 x 200 ml 2 - 8°C Tampón SSPE que contiene
astrigente
SDS al 0,1%. La solución de lavado
astrigente debe precalentarse a una
temperatura mínima de 37°C y máxima
de 56°C (antes de utilizarla deben
haberse disuelto todos los cristales).
Diluyente del conjugado1 x 150 ml 2 - 8°C Tampón fosfatado con cloruro
sódico,Triton®, estabilizadores de las
proteínas y 0,01% MIT/0,1% CAA como
conservante.
Conjugado 100x
1 x 1.5 ml 2 - 8°C Estreptavidina marcada con fosfatasa
alcalina en tampón Tris que contiene
estabilizadores de las proteínas y MIT al
0,01%/CAA al 0,098% como conservante,
a diluir al 1/100 en diluyente del
conjugado antes de su uso.
Prepare 2 ml de solución de conjugado
por cubeta de ensayo + 2 ml adicionales
(la solución de conjugado se puede
preparar durante el lavado astrigente)
para el ensayo manual. Para el Auto-LiPA,
prepare un exceso de 10 ml.
La solución de conjugado es estable
durante 24 horas a temperatura ambiente
INNOGENETICS®
64
Tampón sustrato
1 x 235 ml 2 - 8°C
Sustrato BCIP/NBT
100x
1 x 1.5 ml
2 - 8°C
Solución de lavado 5x 2 x 80 ml
2 - 8°C
Bandeja de incubación5
Tarjeta de lectura
1
Hoja de registro de
datos
2
(20 - 25°C) si se mantiene en la
oscuridad.
Tampón Tris que contiene NaCl, MgCl2 y
MIT al 0,01%/CAA al 0,1% como
conservante.
Sal de 5-bromo-4-cloro-3indolil fosfato p-toluidina (BCIP) y nitroazul
de tetrazolio (NBT) en dimetilformamida
(DMF), a diluir al 1/100 en tampón
sustrato antes de su uso.
Para el ensayo manual, prepare 2 ml
de solución sustrato de trabajo para
cada cubeta de ensayo + un exceso de
2 ml (puede preparar la solución
sustrato de trabajo durante la
incubación del conjugado). Para el
Auto-LiPA, prepare un exceso de 10 ml.
La solución de sustrato así diluida es
estable durante 24 horas a temperatura
ambiente (20 - 25°C) si se conserva en
la oscuridad.
Tampón fosfato que contiene NaCl,
Triton® y MIT al 0,05%/CAA al 0,48%
como conservante, que se debe diluir al
1/5 (1 parte + 4 partes) con agua destilada
o desionizada antes de su uso.
Prepare 8 ml de solución de aclarado
diluida por cada cubeta + 10 ml para
ensayos manuales. Para el Auto-LiPA,
prepare un exceso de 20 ml.
La solución de aclarado diluida
permanece estable durante 2 semanas
a una temperatura de 2 - 8°C.
Contienen 8 cubetas cada una.
Para la identificación de las sondas
positivas.
Para el almacenamiento de las
tiras desarrolladas.
Materiales necesarios pero no se suministrados
-
INNO-LiPA HLA-A Multiplex.
Baño de agua con plataforma de agitación (80 rpm; con tapa
inclinada; temperatura regulable a 56°C ± 0,5°C).
Aspirador.
Termómetro calibrado.
Agitador orbital, recíproco, o de plataforma de sacudida.
Recomendaciones para un agitador orbital:
•
el diámetro del movimiento circular debe ser igual o superior a 13 mm.
•
la velocidad recomendada para un movimiento circular de 13 mm es de
160 rpm.
65
-
INNO-LiPA HLA-A Update
Recomendación para un agitador recíproco:
•
se recomienda utilizar una velocidad de agitación de 80 movimientos por minuto.
Recomendación para un agitador oscilante:
•
el ángulo de agitación no debe ser superior a 13° para evitar el derrame del
líquido.
•
una velocidad recomendada de 50 rpm.
Mezclador vórtex o equivalente.
Probetas graduadas: 10, 25, 50 y 100 ml.
Agua destilada o desionizada.
Guantes desechables.
Puntas de pipeta estériles desechables (preferentemente con tapón de
algodón).
Pinzas para la manipulación de las tiras.
Pipetas de volumen variable con capacidad de 1 - 20 µl, de 20 - 200 µl,
y de 200 - 1.000 µl.
Pipeta dispensadora múltiple (Eppendorf, opcional).
Cronómetro, 2 horas (± 1 minuto).
Seguridad y medio ambiente
Consulte la hoja de datos sobre seguridad del fabricante y el
etiquetado del producto para obtener información acerca de
componentes potencialmente peligrosos.
R20/21, R36, R45, R61, S36/37, S45 S53
Tóxicos! Tóxicos por inhalación y en contacto con la piel. Irritantes para
los ojos; Pueden ser cancerígenos; Potencialmente perjudiciales para el
feto. Utilice indumentaria y guantes de protección adecuados. En caso de
accidente o si no se siente bien, acuda al médico de inmediato (muestre
la etiqueta siempre que sea posible). Evite la exposición - consulte las
instrucciones de uso. Limitado su uso a personal especializado. Contiene
dimetilformamida, sal 5-bromo-4-cloro 3-indolil p-toluidina fosfato:
Sustrato BCIP/NBT 100x.
R43, S24-37
Irritante! Evite el contacto con la piel. Esta solución puede provocar
sensibilización por contacto con la piel. Utilice guantes de protección
adecuados. Contiene 2-cloroacetamida: Solución de aclarado, tampón
sustrato, diluyente del conjugado y control LiPA.
INNOGENETICS®
66
R36/38, S23-24-26
Irritante! Irrita la piel y los ojos. Evite inhalar el vapor. Evite el contacto
con la piel. En caso de contacto con los ojos, acláreselos inmediatamente
con agua abundante y busque asistencia médica. Contiene hidróxido de
sodio: Solución de desnaturalización.
-
-
Las muestras deben manipularse siempre como sustancias
potencialmente infecciosas.
Por lo tanto, toda la sangre y hemoderivados y los materiales
biológicos deberán considerarse como potencialmente infecciosos y
manipularse como tales. Únicamente el personal debidamente
capacitado debe llevar a cabo el procedimiento de ensayo. Toda la
sangre y hemoderivados y los materiales biológicos deben eliminarse
de acuerdo con los procedimientos de seguridad establecidos.
• Esterilice al menos 15 minutos en autoclave a 121ºC.
• Incinere el material desechable.
• Mezcle los residuos líquidos con hipoclorito sódico (lejía) hasta
obtener una concentración final de ± 1% de hipoclorito sódico.
Deje reposar durante toda la noche antes de su eliminación.
PRECAUCION: Neutralice los residuos líquidos que contengan ácido
antes de añadir el hipoclorito sódico.
Es imprescindible el uso de equipo protector personal: use guantes y
gafas de seguridad cuando manipule agentes peligrosos o infecciosos.
Deseche los residuos con arreglo a las normas de manejo de residuos
de su institución. Asimismo, cumpla con todas las normas
medioambientales nacionales, autonómicas y locales.
Muestra
Como el ensayo INNO-LiPA HLA-A Update utiliza material de ADN
amplificado biotinilado, como herramienta acompañante se proporciona el
kit de amplificación INNO-LiPA HLA-A Multiplex.
Procedimientos de manipulación
Manipulación de las tiras
-
Las tiras son de un solo uso.
No toque las tiras con las manos; use pinzas limpias.
Use un lápiz para identificar las tiras de ensayo. No utilice bolígrafos, etc.
Escriba el ID (identificador) encima de la línea marcadora en las tiras.
En las diferentes fases del proceso de incubación, las tiras de ensayo
deben permanecer siempre en la misma cubeta.
Mantenga alejadas de la luz y el calor fuertes las tiras reveladas o que
no se utilicen.
Deje secar completamente las tiras reveladas antes de interpretarlas,
cubrirlas y guardarlas.
Las tiras reveladas deben almacenarse preferiblemente en la
oscuridad y entre 20 - 25°C.
67
-
INNO-LiPA HLA-A Update
No vuelva a utilizar las cubetas.
Instrucciones para la incubación manual
-
-
-
-
-
La incubación a 56°C ± 0,5°C durante la hibridación y el lavado astrigente
es el paso más decisivo para evitar falsos positivos (temperatura
demasiado baja) o falsos negativos/señales muy débiles (temperatura
demasiado alta). Un baño de agua con agitación con tapa inclinada
permite un buen control de las variaciones de temperatura.
Es imprescindible controlar rigurosamente la temperatura utilizando un
termómetro calibrado.
Cierre siempre la tapa del baño de agua durante la incubación para
no obtener señales positivas falsas.
No utilice un agitador de aire caliente en la hibridación y el lavado
astrigente.
Para la hibridación y el lavado astrigente, debe colocar las cubetas sobre
la plataforma de agitación del baño de agua. Ajuste el nivel de agua de
manera que cubra entre un tercio y la mitad de la cubeta. Asegúrese de
que las cubetas no flotan en el agua.
El agua debe estar directamente en contacto con las cubetas.
Las fases de incubación para el desarrollo de color deben efectuarse
entre 20 - 25°C. Si la temperatura es inferior a 20°C, se obtendrán
resultados menos precisos. Si la temperatura supera los 25°C, puede
causar un color de fondo demasiado intenso y/o señales de falso
positivo.
El tiempo de incubación debe ser exactamente el que establece el
protocolo.
La amplitud del movimiento generado por el baño de agua con
agitación (procedimiento de hibridación y lavado astrigente) y el
agitador (procedimiento de desarrollo de color) es decisiva para lograr
una máxima sensibilidad y una tinción homogénea. La superficie de
las tiras debe quedar completamente sumergida. La amplitud debe ser
la máxima posible.
Sin embargo, debe evitarse cualquier derrame de líquido de las
cubetas. Esto podría producir una contaminación cruzada o invalidar
los resultados.
Durante la incubación de las tiras, éstas deben agitarse mediante un
movimiento de vaivén en el interior de las cubetas sin que se derrame
líquido de los mismos.
No cubra la bandeja. Durante las incubaciones de hibridación y lavado
astrigente, puede dejar las cubetas sin cubrir en el baño de agua.
Cubrir las cubetas con selladores de microplacas puede provocar
contaminaciones cruzadas.
Instrucciones para cambiar manualmente el líquido de las cubetas
-
Aspire el líquido de la cubeta con una pipeta, preferiblemente unida a
un aspirador al vacío. La bandeja se coloca en un ángulo que permita
que todo el líquido fluya hacia un extremo de la cubeta.
Añada 2 ml de la solución adecuada a cada cubeta y siga el protocolo.
Para ello puede utilizar una pipeta dispensadora múltiple (Eppendorf).
INNOGENETICS®
-
68
Repita este paso tantas veces como se indique en el procedimiento de
ensayo.
NOTA:
• Evite que las tiras se sequen de un paso al otro.
• Asegúrese de que no se deteriore la superficie de las tiras cuando
realice la aspiración. Aspire el líquido de la parte superior de la
tira, por encima de la línea marcadora.
• Asegúrese de aspirar todo el líquido.
• Asegúrese de lavar toda la tira sumergiéndola totalmente en la
solución.
• En caso necesario, adapte la velocidad del agitador.
Observaciones y precauciones
-
-
De uso exclusivo in vitro.
Para uso profesional exclusivamente.
A fin de evitar la contaminación del ADN, se recomienda utilizar una
máxima separación física entre los pasos de pre y posamplificación:
salas separadas, pipetas (y demás material de laboratorio) separadas,
trajes y guantes de laboratorio (y sus recambios) separados, son las
precauciones mínimas para las buenas prácticas de laboratorio.
Una vez en la sala de posamplificación evite volver a la sala de
preamplificación.
Se recomienda utilizar material de laboratorio desechable y autoclavable.
No vuelva a utilizar el material de laboratorio desechable una vez utilizado.
Utilice una punta nueva por cada alícuota de muestra que pipetee.
No utilice los reactivos más allá de su fecha de caducidad.
No mezcle reactivos de distintos kits, a menos que los componentes
tengan idéntico número de lote.
Evite la contaminación microbiana de los reactivos.
Procedimiento manual del ensayo
NOTA:
- En las diferentes fases del proceso de incubación, las tiras de ensayo
deben permanecer siempre en la misma cubeta.
Antes de la incubación, compruebe la temperatura del baño de agua
utilizando un termómetro calibrado y, si es necesario, regule la
temperatura antes de colocar en él la bandeja.
Cierre siempre la tapa.
Debe incluirse el control LiPA en cada ejecución del ensayo.
Muestras
1. Producto amplificado HLA-A (utilice 10 µl). Para la preparación de la
muestra: consulte las instrucciones de uso del INNO-LiPA HLA-A Multiplex.
NOTA:
• Añada exactamente 10 µl de muestra amplificada. Una cantidad
demasiado grande o demasiado pequeña de muestra puede
producir un resultado de tipaje incorrecto.
2. Muestra de control LiPA para el INNO-LiPA HLA-A Update (utilice 10 µl;
no se requiere amplificación).
69
INNO-LiPA HLA-A Update
3. Muestra de control amplificada en blanco (control negativo; utilice 10 µl).
Desnaturalización e hibridación
1. Caliente un baño de agua con agitación a 56°C ± 0,5°C. Compruebe la
temperatura utilizando un termómetro calibrado y regúlela si es necesario.
No exceda la temperatura indicada. Precaliente la solución de
hibridación y la solución de el lavado astrigente en un baño de agua
con una temperatura mínima de 37°C y máxima de 56°C. Mézclelas
antes de utilizarlas. Deben disolverse todos los cristales.
2. Utilizando unas pinzas, retire el número requerido de Tiras 1 y Tiras 2
de INNO-LiPA HLA-A Update del tubo (una Tira 1 y una Tira 2 por
muestra a probar). Incluya ambas tiras para la muestra de control LiPA
del INNO-LiPA HLA-A Update y para la muestra de control amplificada
en blanco. Con un lápiz, escriba el número de identificación encima de
la línea marcadora de color azul de Prusia o turquesa en la tira.
3. Tome el número necesario de cubetas de ensayo (una por tira) y
colóquelas en la bandeja.
4. Pipetee 10 µl de solución de desnaturalización en la esquina superior
de cada cubeta.
NOTA:
• Cierre la ampolla inmediatamente después de utilizarla.
5. Agregue 10 µl de muestra (consulte Muestras; consulte Instrucciones
de uso del INNO-LiPA HLA-A Multiplex) y mezcle cuidadosamente
pipeteando arriba y abajo.
Utilice siempre puntas de pipetas esterilizadas. Proceda a la
desnaturalización durante 5 minutos a una temperatura de 20 - 25°C.
6. Agite la solución de hibridación precalentada y añada lentamente 2 ml
al producto amplificado desnaturalizado de cada cubeta. Mézclelo
todo agitando suavemente. Asegúrese de no contaminar las cubetas
vecinas cuando pipetee.
7. Coloque inmediatamente la tira en la cubeta. Las tiras deben quedar
completamente sumergidas en la solución.
NOTA:
• Utilice guantes desechables y pinzas.
8. Coloque la bandeja en el baño de agua con agitación a 56°C ± 0,5°C
(80 rpm; consulte Instrucciones para la incubación manual), cierre la
tapa e incube durante 30 minutos.
NOTA:
• Evite salpicar las cubetas con agua del baño. Ajuste el nivel de
agua de manera que cubra entre un tercio y la mitad de la cubeta.
Para que la bandeja no resbale, inmovilícela colocando un objeto
pesado a cada lado.
Lavado astrigente
1. Después de la hibridación, retire la bandeja del baño de agua.
2. Sujete la bandeja inclinándola ligeramente y aspire el líquido de la cubeta
con una pipeta, preferiblemente unida a un aspirador al vacío. Añada 2 ml
de solución de lavado astrigente precalentada a cada cubeta, coloque la
bandeja en el baño de agua con agitación a 56°C ± 0,5°C, cierre la tapa e
incube durante 3 minutos.
INNOGENETICS®
70
3. Después de la incubación, retire la bandeja del baño de agua y aspire
el líquido de la cubeta.
4. Repita una vez la fase de incubación de 3 minutos y la fase de aspiración.
5. Por último, añada 2 ml de solución de lavado astrigente precalentada
a cada cubeta y coloque la bandeja en el baño de agua con agitación
a 56°C ± 0,5°C, cierre la tapa e incube durante 4 minutos.
NOTA:
• Durante el lavado astrigente, diluya la solución de aclarado
concentrada 5x y el conjugado 100x. Véase Reactivos.
Desarrollo de color
Todas las incubaciones siguientes se realizan a una temperatura de entre
20 - 25°C en un agitador. Durante las incubaciones, el líquido y las tiras
de ensayo deben moverse adelante y atrás en la cubeta a fin de lograr
una tinción homogénea.
1. Lave cada tira dos veces durante 1 minuto utilizando 2 ml de solución de
aclarado (véase Instrucciones para cambiar el líquido de las cubetas).
2. Añada 2 ml de la solución de conjugado diluida a cada cubeta e
incúbelo durante 30 minutos mientra se agita la cubeta en el agitador.
NOTA:
• Unos 10 minutos antes del final de la incubación del conjugado,
diluya la solución de sustrato BCIP/NBT 100x. Véase Reactivos.
3. Lave cada tira de ensayo 2 veces durante 1 minuto con 2 ml de solución
de aclarado y una vez con 2 ml de tampón sustrato.
4. Añada 2 ml de la solución de lavado diluida a cada cubeta e incúbelo
durante 30 minutos agitando la cubeta en el agitador.
PRECAUCIÓN:
• Lleve guantes y gafas de protección.
5. Detenga el desarrollo de color lavando las tiras dos veces en 2 ml de
agua destilada y agitando la bandeja en el agitador durante al menos
3 minutos.
6. Con la ayuda de las pinzas, retire las tiras de las cubetas de ensayo y
colóquelas sobre papel absorbente. Deje que se sequen
completamente las tiras antes de realizar la lectura de los resultados
del ensayo. Almacene las tiras reveladas y secas en la oscuridad.
Procedimiento de ensayo automatizado: Auto-LiPA
El procedimiento de ensayo LiPA es extremadamente adecuado para su
automatización. Por lo tanto, el Auto-LiPA está diseñado para ejecutar
automáticamente, en su totalidad, las fases de hibridación, lavado
astrigente y desarrollo de color.
El Auto-LiPA es un sistema plenamente independiente que proporciona
calentamiento, enfriamiento, aspiración y pipeteado automatizados.
El protocolo estándar Auto-LiPA 48 describe el ensayo de hasta 24 muestras
cuando se utiliza una única tira por canal. Sin embargo, este número puede
ser incrementado hasta un máximo de 48. Para realizar esto se pueden
incubar dos tiras de un mismo locus en el mismo canal, manteniendo igual el
resto de parámetros del protocolo. Hay que tener en cuenta que en este caso
71
INNO-LiPA HLA-A Update
ocasionalmente se pueden observar reactividades más débiles para algunas
sondas. Por lo tanto, se aconseja que aquellos clientes que quieran
incrementar el número de muestras ensayadas validen el protocolo "dos tiras
en un canal" en su laboratorio.
Para obtener más información y protocolos de uso específico con el Auto-LiPA,
por favor, contacte con Innogenetics o con su distribuidor local.
Resultados
Lectura
La Figura 2 ilustra la posición de las diferentes sondas de oligonucleótidos
en las tiras de INNO-LiPA HLA-A Update. Una línea se considera positiva
cuando al final del procedimiento de ensayo aparece una banda de color
púrpura claro o marrón.
Figura 2 (ver página 17): Ubicación de la línea marcadora (azul de Prusia
en la Tira 1 y turquesa en la Tira 2), de la línea de control de conjugado
(control de conj.), de la línea de control del HLA-A Update (control del gen
A del HLA), y de las 44 líneas de sondas en las tiras de INNO-LiPA HLA-A
Update.
Validación
-
-
-
-
Incluya un control negativo y el control LiPA (para el INNO-LiPA HLA-A
Update) cada vez que realice un ensayo. Como con cualquier nuevo
procedimiento de ensayo, deberían incluirse controles positivos y
negativos adicionales hasta que el procedimiento de ensayo se
consiga desarrollar correctamente con un elevado grado de confianza.
Se recomienda utilizar ADN de referencia para comprobar que se han
creado las condiciones de ensayo adecuadas.
Las líneas ubicadas más arriba en las tiras de INNO-LiPA HLA-A Update
(Figura 2) son las líneas marcadoras (líneas de color azul de Prusia y
turquesa). Estas líneas permiten orientar correctamente las tiras.
La línea siguiente controla la adición de conjugado reactivo y solución
de sustrato de trabajo durante el procedimiento de detección. Esta
línea debería quedar alineada con la línea de control del conjugado en
la tarjeta de plástico de lectura. Esta línea debe ser siempre positiva
(si no lo es, no debe realizarse ninguna interpretación) y tener
aproximadamente la misma intensidad en cada tira en la misma
ejecución del ensayo.
La línea siguiente es la línea de control de hibridación interna del HLA-A
Update (control HLA-A en la tarjeta de lectura), que indica si se ha
añadido o no una cantidad adecuada de material amplificado HLA-A
para la hibridación. Esta línea debería ser siempre positiva, excepto
para el control negativo, pero su intensidad puede variar en las
diferentes muestras.
El resultado del ensayo para cada control negativo no debe dar señal
aparente alguna en ninguna de las líneas de la tira, excepto en la
línea de control del conjugado.
INNOGENETICS®
-
-
72
La muestra de control LiPA para el INNO-LiPA HLA-A Update debe
dar el siguiente patrón de sondas positivas: control del conjugado,
control del HLA-A, 15, 30 y 35. Todas las demás sondas deben dar
negativo. Esta muestra de control está compuesta de oligonucleótidos
biotinilados, complementarios de las sondas de hibridación
mencionadas. La hibridación positiva en estas sondas demuestra la
ejecución satisfactoria del ensayo, incluyendo las fases de hibridación,
lavado astrigente, desarrollo de color y detección. Un patrón diferente
puede ser indicio de problemas en la ejecución del ensayo, tales
como temperatura incorrecta durante la hibridación, o desviaciones
con respecto a los tiempos o temperaturas de incubación prescritos.
Las intensidades del color de las sondas de una tira pueden diferir de
una línea a otra.
Interpretación de los resultados
-
Compruebe que la muestra de control LiPA muestre el patrón de
reactividad correcto.
La línea de control del conjugado de la tira debería quedar alineada con la
línea de control del conjugado de la tarjeta de plástico de lectura.
A fin de validar cada tira individual (consulte Validación), compruebe
primero que las líneas de control (las primeras dos líneas) sean positivas.
Los resultados de tipaje se basan en la reactividad de las sondas del kit.
Tiene a su disposición una lista de las especificidades de las sondas.
Identifique todos los números de las sondas que den positivo en las
tiras de INNO-LiPA HLA-A Update y deduzca el tipaje de HLA-A
utilizando la tabla de tipaje del INNO-LiPA HLA-A Update o el software
de interpretación del LiPA (véase Software de interpretación LiRAS).
Este software a menudo proporciona más resultados de lo que se requiere
para el uso al que está destinado el ensayo: se proporciona interpretación
a nivel de grupo de alelos, así como todas las combinaciones de alelos
posibles. Como el kit no se diseñó especialmente para tipar estos alelos a
nivel de alelo, esta información debe ser considerada información
complementaria, y no como decisiva.
Software de interpretación: LiRAS™
El software LiRAS para el INNO-LiPA HLA está diseñado para ayudar a
interpretar los resultados del LiPA.
Póngase en contacto con su distribuidor local para obtener la última
actualización del programa.
Limitaciones del procedimiento
-
Este producto sólo debe ser utilizado por personal especializado en
técnicas de hibridación.
Sólo las buenas prácticas de laboratorio y una ejecución cuidadosa de
los procedimientos especificados permiten una hibridación específica
y un tipaje correcto del ADN diana.
Las tiras de INNO-LiPA HLA-A Update están diseñadas para
proporcionar una resolución a nivel de grupo de alelos (de A*01 a
A*80). No obstante, una combinación de ciertos alelos podría conducir
73
-
INNO-LiPA HLA-A Update
a una combinación de sondas no exclusiva y, por ello, a una
respuesta ambigua consistente en dos o más combinaciones posibles
de grupos de alelos.
Cuando interprete los resultados, tenga en cuenta que cualquier nuevo
alelo podría mostrar polimorfismos exteriores a las regiones de las sondas.
Las líneas de control del HLA-A Update no son sólo específicas del gen A
del HLA, sino de prácticamente todos los alelos del gen B del HLA y del
gen C del HLA. Por lo tanto, las líneas de control del gen A del HLA
podrían reaccionar también con productos amplificados de los genes B y C
del HLA.
Protocolo del ensayo
La evaluación del equipo INNO-LiPA HLA-A Update se realizó en cuatro
laboratorios europeos de tipaje de tejidos en tipajes de muestras de rutina.
Se analizaron un total de 346 muestras. El DNA se obtuvo de muestras de
sangre frescas o congeladas, con EDTA o citrato como anticoagulante.
La extracción del DNA se realizó utilizando el "salting out" o los equipos
QIAamp 96 DNA blood kit (Qiagen), Genomic DNA Purification kit
(Promega) y Puregene (Gentra Systems). El DNA, recién obtenido o
congelado, fue amplificado con los termocicladores Perkin Elmer 9600 o
9700, y los amplicones se conservaron a
2 - 8°C o -25/-15°C antes de ser aplicados a las tiras.
No se encontraron fallos en la amplificación, aunque una muestra tuvo
que ser tipada dos veces en un centro.
Las muestras fueron procesadas utilizando un Auto-LiPA y se analizaron con
una versión para ensayos clínicos del software de interpretación LiRAS™.
Precisión
Se obtuvo un resultado de tipaje HLA-A para 345 de 346 muestras de DNA. De
estas, en 18 muestras se tuvo que repetir el tipaje. Una muestra fue definida
como "tipaje no deducible" pero de acuerdo con el investigador esto fue
probablemente debido a una contaminación del DNA.
La exactitud a nivel de grupo de alelos se calculó como porcentaje de
concordancia observada con ensayos de DNA alternativos (Biotest ELPHA
HLA-AB LowRes Typing kit, Dynal SSP, LiPA HLA-A, secuenciación, Micro
SSP™, OLERUP SSP™, Biotest HLA-A SSP). Los resultados del INNO-LiPA
HLA-A Update se consideraron concordantes con el ensayo de referencia
cuando los dos resultados fueron idénticos, si el resultado del INNO-LiPA HLAA Update fue más específico que el resultado de referencia o cuando los
resultados del INNO-LiPA HLA-A Update mostraron menor resolución pero un
resultado correcto en comparación a los métodos de referencia.
La exactitud inicial fue del 99.1% (342/345). El ensayo de las
discrepancias permitió llegar a una exactitud del 99.7% (344/345). Se han
tomado medidas para evitar futuros errores en el tipaje como ocurrió con
una muestra durante el estudio.
INNOGENETICS®
74
Resolución (versión v1.0/2001-03-31 de la tabla de tipaje)
El equipo INNO-LiPA HLA-A Update está pensado para determinar alelos
HLA-A a nivel de grupo de alelos, por ejemplo a nivel de equivalentes
serológicos. 'Grupo de alelos' es la designación de los dos primeros
dígitos que siguen al asterisco en la nomenclatura HLA estándar (p.e. HLA
A*32). Además, el equipo está pensado para determinar los siguientes
alelos nulos: A*0232N (exón 3), A*0303N (exón 3), A*2409N (exón 4),
A*2611N (exón 3) y A*6811N (exón 1). El alelo A*2402102L, que tiene un
nivel de expresión muy bajo, también se detecta (intrón 2).
La resolución teórica a nivel de grupo de alelos (p.e. 2 dígitos) resultó ser
del 99,5%. La resolución a nivel de grupo de alelos observada durante
este ensayo, después del análisis de las discrepancias, fue del 99,4%
(343/345). Inicialmente, se observó una ambigüedad (A*02 x A*66 or A*02
x A*26). Una segunda ambigüedad surgió como resultado de la
adaptación de la tabla de tipaje (A*3201 x A*3201 or A*3201 x A*7403).
Cinco ambigüedades (14 muestras) observadas con el método de
referencia fueron reducidas a un único resultado de tipaje utilizando el
ensayo INNO-LiPA HLA-A Update. Durante la evaluación clínica se
identificaron dos alelos nulos: A*0303N y A*6811N.
Reactividad de las sondas
Diez sondas reaccionaron como falsos positivos y seis débilmente como falsos
negativos en una o más ocasiones durante el ensayo clínico. Esta información,
si no estaba ya presente, se ha aplicado en el software y/o en las instrucciones
para facilitar el tipaje. Cuando se utilizo el software de interpretación LiRAS™
todos menos uno de los falsos positivos fueron identificados como tal y se
alcanzo un tipaje concordante a nivel de grupo de alelo.
El riesgo de malinterpretación, causado por un falso negativo, se ha
abordado adaptando la tabla de tipaje.
Consultar las instrucciones para información específica sobre la reactividad de
las sondas.
Está disponible una lista completa de especificidad de las sondas y los primers.
Todas las sondas están diseñadas para hibridar específicamente con su
secuencia complementaria a nivel de un mismatch, excepto si está
especificado de manera distinta en la lista.
Sensibilidad
Una evaluación interna de series de diluciones de tres muestras de DNA,
variando de 0.01 µg/µl hasta 2 µg/µl, demostró que todas las muestras
eran visibles en un gel de agarosa y que fueron tipadas correctamente.
La evaluación externa del equipo incluyó 346 muestras de DNA con una
concentración entre 20 y 1500 ng/µl y una pureza (A260nm/A280nm) ≥1.5.
El DNA fue diluido hasta una concentración de entre 20 ng/µl y 250 ng/µl
antes de la amplificación. No se encontraron fallos en la amplificación,
aunque una muestra tuvo que ser tipada dos veces en un centro.
75
INNO-LiPA HLA-A Update
Precisión
Datos internos:
Tres muestras fueron ensayadas por cuadruplicado, por dos personas
distintas, utilizando el método manual, o por una persona en dos AutoLiPA distintos. Dos muestras fueron analizadas en tres lotes distintos y en
dos ensayos diferentes. La interpretación de los resultados fue la misma
para todas las muestras. La reactividad de las sondas fue comparable en
todos los casos.
Validación externa:
- La variación inter-lote fue evaluada analizando un panel de
proficiencia (cinco muestras con reactividad e interpretación
conocidas) con dos lotes distintos del producto. Para cada muestra se
obtuvo el mismo resultado, independientemente del lote utilizado.
- La variación inter-laboratorio fue evaluada analizando el mismo panel de
proficiencia en cuatro centros distintos. Cada uno de ellos obtuvo los
mismos resultados para las cinco muestras.
Português
Utilização
O INNO-LiPA HLA-A Update é um ensaio de sondas em linha, para
utilização in vitro, concebido para a tipagem molecular de alelos do locus
A do antigénio leucocitário humano (HLA) a nível do grupo de alelos.
Princípio do teste
Os testes de tipagem INNO-LiPA HLA são baseados no princípio da
hibridação inversa sumarizados na Figura 1. O material de ADN biotinilado
amplificado é desnaturado quimicamente e as cadeias separadas
hibridam-se com sondas de oligonucleotidos específicos, imobilizadas em
linhas paralelas sobre tiras baseadas em membranas. Segue-se uma fase
de lavagem adstringente para remover qualquer material amplificado
incorrectamente emparelhado. Após esta lavagem, adiciona-se
estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina que fica ligada a qualquer
híbrido biotinilado previamente formado. A incubação com uma solução de
substrato contendo um cromogénio produz um precipitado de cor
púrpura/acastanhada. A reacção é parada mediante uma fase de lavagem
e o padrão de reactividade das sondas é registado.
Com o INNO-LiPA HLA-A Update está disponível um kit de amplificação
(INNO-LiPA HLA-A Multiplex) que permite a para preparação standardizada de
material amplificado biotinilado. O kit de amplificação é baseado numa reacção
em cadeia de polimerase (PCR*).
Os produtos amplificados são subsequentemente hibridados usando duas tiras
de tipagem nas quais são fixadas 43 sondas específicas de sequência, assim
como 2 linhas de controlo (Figura 2).
* A utilização deste produto depende de licença de F. Hoffmann La Roche Ltd. e Roche Molecular Systems, Inc.
INNOGENETICS®
76
Figura 1 (ver página 9): Princípio do procedimento de teste de tipagem de
INNO-LiPA HLA.
INNO-LiPA HLA-A Update: passos envolvidos
Passo 1 Amplificação Multiplex de exons 1 a 4 do locus A do HLA
Passo 2 Hibridação e lavagem adstringente com 44 linhas de sondas
imobilizadas em duas tiras INNO-LiPA HLA-A Update (56°C).
Passo 3 Desenvolvimento da cor
Passo 4 Interpretação do padrão de reactividade das sonda
O INNO-LiPA HLA-A Update é concebido para proporcionar a maior resolução
possível, usando o formato de ensaio da hibridação reversa, ao nível do grupo
de alelos (isto é indicado pelos dois primeiros dígitos que se seguem ao
asterisco no nome de um alelo, quando se segue a nomenclatura standard
HLA ex: HLA-A*26).
Além da interpretação do grupo de alelo, o software dá todas as combinações
de alelo possíveis, contudo esta informação, deve ser considerada como extra
e não como decisiva.
Reagentes
Descrição, preparação para utilização e condições recomendadas de
conservação
-
-
Todos os reagentes do teste, incluindo as tiras de teste revestidas,
desde que fechados e conservados de 2 - 8°C, permanecem estáveis
até à data de validade do kit. Não congelar reagentes.
Todos os reagentes e os tubos plásticos contendo as tiras de teste
devem ser levados à temperatura ambiente (20 - 25°C)
aproximadamente 60 minutos antes de usar e devem ser devolvidos
ao frigorífico imediatamente após a utilização.
Alterações na aparência física dos componentes do kit podem indicar
instabilidade ou deterioração.
O kit deve ser conservado isolado de qualquer fonte de contaminação do
ADN, especialmente de produtos de ADN amplificado.
Para minimizar a possibilidade de enrolamento das tiras antes de serem
utilizadas, recomenda-se conservar o tubo na horizontal.
Cada conjunto contém:
Componente
Quantidade ArmaDescrição
zenagem
Tiras 1
1 x 20
2 - 8°C
Tiras 2
1 x 20
2 - 8°C
Controlo LiPA
1 x 0.05 ml 2 - 8°C
Contém 20 tiras 1 para INNO-LiPA
HLA-A Update marcadas com linha de
marcador azul da Prússia.
Contém 20 tiras 2 para INNO-LiPA HLA-A
Update marcadas com linha de marcador
turquesa.
Contém ácido etilenodiaminotetraacetico
(EDTA) e 0.01% metilisotiazolona (MIT)/
0.1% cloroacetamida (CAA) como
conservante.
77
Solução de
Desnaturação
INNO-LiPA HLA-A Update
1 x 1 ml
Solución de Hibridación 2 x 80 ml
2 - 8°C
2 - 8°C
Solução de Lavagem 2 x 200 ml 2 - 8°C
Adstringente
Diluente de Conjugado 1 x 150 ml 2 - 8°C
Conjugado 100x
1 x 1.5 ml
Tampão Substrato
1 x 235 ml 2 - 8°C
Substrato BCIP/NBT 1 x 1.5 ml
100x
2 - 8°C
2 - 8°C
Solução alcalina contendo
EDTA. O frasco deve ser fechado
imediatamente depois do uso;
exposição prolongada desta solução ao
ar conduz a uma rápida deterioração do
seu poder de desnaturação.
Tampão salino de fosfato de sódio EDTA
(SSPE) contendo 0.5% de sulfato de
sódio dodecyl (SDS). A Solução de
Hibridação deve ser pré-aquecida a uma
temperatura de, pelo menos, 37°C e não
deve exceder 56°C (todos os cristais
devem ser dissolvidos antes de usar).
Tampão SSPE contendo 0.1% SDS.
A solução de Lavagem Forte deve ser
pré-aquecida a uma temperatura de,
pelo menos, 37°C e não deve exceder
56°C (todos os cristais devem ser
dissolvidos antes de usar).
Tampão fosfato contendo NaCl, Triton®,
estabilizadores de proteína e 0.01% MIT/
0.1% CAA como conservante.
Estreptavidina marcada com fosfatase
alcalina em Tampão Tris contendo
estabilizadores de proteína e 0.01% MIT/
0.098% CAA como conservante para ser
diluído 1/100 em Diluente de Conjugado
antes de usar.
Preparar 2 ml de solução de trabalho do
Conjugado para cada cuvete de teste +
2 ml em excesso (a solução de trabalho
do Conjugado pode ser preparada
durante a lavagem forte) para teste
manual.
Para Auto-LiPA, fazer 10 ml em excesso.
A solução de trabalho do Conjugado é
estável por 24 horas à temperatura
ambiente (20 - 25°C) se guardada no
escuro.
Tampão Tris contendo NaCl, MgCl2 e
0.01% MIT/0.1% CAA como
conservante.
Sal de 5-Bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato p-toluidina (BCIP) e nitroazul
tetrazolium (NBT) em dimetilformamida
(DMF), para ser diluído 1/100 em tampão
de Substrato antes de usar.
Preparar 2 ml de solução de trabalho de
Substrato para cada cuvete de teste +
2 ml em excesso para o teste manual (a
solução de trabalho do Substrato pode ser
preparada durante a incubação do
Conjugado). Para Auto-LiPA, fazer 10 ml
em excesso.
A solução de trabalho de Substrato é
INNOGENETICS®
Solução de
Enxaguamento 5x
78
2 x 80 ml
Tabuleiro de incubação 5
Cartão de leitura
1
Folha de registo de 2
dados
2 - 8°C
estável por 24 horas à temperatura
ambiente (20 - 25°C) se mantida no
escuro.
Tampão fosfato contendo NaCl,
Triton®, e 0.05% MIT/0.48% CAA como
conservante, para ser diluído 1/5 (1 parte
+ 4 partes) em água destilada ou
desionizada antes de usar.
Preparar 8 ml solução de trabalho de
Enxagua-mento para cada cuvete de teste
+ 10 ml. Para Auto-LiPA, fazer 20 ml em
excesso.A solução de trabalho de
Enxaguamento mantem-se estável por
2 semanas de 2 - 8°C.
Contendo 8 cuvetes cada um.
Para identificação de sondas positivas.
Para armazenagem de tiras
reveladas.
Materiais necessários mas não fornecidos
-
-
INNO-LiPA HLA-A Multiplex.
Banho de água com plataforma de agitação (80 rpm; com tampa
inclinada, temperatura ajustável para 56°C ± 0.5°C).
Aspirador de vácuo.
Termómetro calibrado.
Agitador orbital, recíproco ou plataforma oscilante.
Recomendações para o agitador orbital:
•
o diâmetro do movimento circular deve ser igual ou superior a 13 mm.
•
a velocidade recomendada para um movimento circular de 13 mm é de 160 rpm.
Recomendação para um agitador recíproco:
•
recomenda-se utilizar uma velocidade de agitação de 80 movimentos por
minuto.
Recomendações para um agitador de plataforma oscilante:
•
o ângulo de oscilação não deve exceder 13° para evitar o derrame do líquido.
•
a velocidade recomendada é de 50 rpm.
Misturador Vortex ou equivalente.
Provetas graduadas (10, 25, 50, e 100 ml).
Água destilada ou desionizada.
Luvas descartáveis.
Pontas de pipeta esterilizadas descartáveis (de preferência com filtro
de algodão).
Pinças para manuseamento de tiras.
Pipetas de volume variável para dispensar 1 - 20 µl, 20 - 200 µl,
e 200 - 1000 µl.
Multipipeta dispensadora (Eppendorf, opcional).
Cronómetro, 2 horas (± 1 minuto).
79
INNO-LiPA HLA-A Update
Segurança e meio ambiente
Consultar as instruções de segurança do fabricante e a rotulagem do
produto com informações sobre componentes potencialmente
perigosos.
R20/21, R36, R45, R61, S36/37, S45 S53
Tóxico! Perigoso por inalação e em contacto com a pele. Irritante para os
olhos. Pode provocar o cancro. Potencialmente prejudiciais para o feto.
Usar roupa e luvas de protecção apropriadas. Em caso de acidente ou se
se sentir mal, procurar imediatamente conselho médico (mostre-lhe a
etiqueta, se possível). Evite a exposição - consulte as instruções especiais
de utilização. Uso limitado a utilizadores profissionais.
Contém Dimetilformamida, sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolyl fosfato
p-toluidina: Substrato BCIP/NBT 100x.
R43, S24-37
Irritante! Evitar contacto com a pele. Pode causar sensibilização por
contacto com a pele. Usar luvas apropriadas.
Contém 2-cloroacetamida: Solução de Enxaguamento, Tampão de
Substrato, Diluente de Conjugado e Controlo LiPA.
R36/38, S23-24-26
Irritante! Irritante para os olhos e para a pele. Não inalar o vapor. Evitar o
contacto com a pele. Em caso de contacto com os olhos, lavar
imediatamente com muita água e procurar conselho médico.
Contém hidróxido de sódio: Solução de Desnaturação.
- As amostras devem sempre ser manuseadas como potencialmente
infecciosas.
Portanto, todo o sangue, hemoderivados e materiais biológicos devem
ser considerados como potencialmente infecciosos e devem ser
manuseados como tal. Só pessoal treinado adequadamente deve ser
autorizado a realizar o teste. Todo o sangue, hemoderivados e
materiais biológicos devem ser eliminados de acordo com os
procedimentos de segurança estabelecidos.
• Esterilize em autoclave por, pelo menos, 15 minutos a 121°C.
• Incinerar o material descartável.
• Misturar o desperdício líquido com hipoclorito de sódio de modo a
que a concentração final seja de ± 1% de hipoclorito de sódio.
Deixar repousar de um dia para o outro antes de eliminar.
CUIDADO: Neutralizar o desperdício líquido que contenha ácido
antes de lhe adicionar o hipoclorito de sódio.
INNOGENETICS®
-
80
É necessário o uso de equipamento de protecção pessoal: luvas e
óculos de segurança, quando manusear agentes perigosos ou
infecciosos.
Os desperdícios devem ser tratados de acordo com as regras da
instituição relativas ao tratamento de desperdícios. Respeitar também
todos os regulamentos oficiais, locais e ambientais.
Amostra
Dado que o teste INNO-LiPA HLA-A Update utiliza material de ADN amplificado
biotinilado, como ferramenta de acompanhamento está disponível um kit de
amplificação INNO-LiPA HLA-A Multiplex.
Procedimentos de Manipulação
Manuseamento das tiras
-
As tiras estão concebidas para serem usadas apenas uma vez!
Não tocar nas tiras com as mãos nuas; usar pinças limpas.
Usar um lápis para identificação das tiras de teste. Não usar
esferográficas, etc. Escreva a ID acima da linha de marcação
existente nas tiras.
Durante as diferentes fases de incubação, as tiras de teste devem
permanecer sempre na mesma cuvete.
Tiras não utilizadas ou reveladas devem ser mantidas ao abrigo da luz
e calor intensos.
Deixar secar completam,ente as tiras reveladas antes de as
interpretar, cobrir e guardar.
Tiras reveladas, devem ser guardadas de preferência ao abrigo da luz
e entre 20 - 25°C.
Não reutilizar as cuvetes.
Indicações para incubação manual
-
-
-
A incubação a 56°C ± 0.5°C durante a hibridação e a lavagem
adstringente é o passo mais decisivo para evitar falsos positivos
(temperatura muito baixa) ou falsos negativos/sinais muito fracos
(temperatura muito alta). Um banho de água com agitação com tampa
inclinada permite um bom controlo das variações de temperatura.
É imprescindível controlar rigorosamente a temperatura utilizando um
termómetro calibrado.
Fechar sempre a tampa do banho de água durante a incubação, de
modo a evitar sinais falsos positivos.
Não usar um agitador de ar quente para a hibridação e a lavagem
adstringente.
Para a hibridação e a lavagem adstringente, as cuvetes devem ser
colocadas sobre a plataforma agitadora do banho de água. Ajustar o nível
da água de modo a cobrir entre 1/3 e 1/2 da altura da cuvete. Assegurarse de que as cuvetes não flutuam na água. A água deve estar em contacto
directo com as cuvetes.
As fases de incubação para o desenvolvimento da cor devem efectuar-se
entre 20 e 25°C. Se a temperatura estiver abaixo de 20°C, podem ser
81
-
-
INNO-LiPA HLA-A Update
obtidos resultados mais fracos. Se a temperatura estiver acima de 25°C,
pode causar uma coloração de fundo demasiado forte e/ou sinais de falsos
positivos.
O tempo de incubação deve ser exactamente o que está estabelecido
no protocolo.
A amplitude do movimento gerado pelo banho de água com agitação
(procedimento de hibridação e lavagem adstringente) e pelo agitador
(procedimento de desenvolvimento da cor) é decisiva para se atingir o
máximo de sensibilidade e uma coloração homogénea. A superfície
das tiras deve estar completamente submersa. A amplitude deve ser
tão grande quanto possível. No entanto, o derrame do líquido sobre
as bordas das cuvetes deve ser evitado! Isso pode conduzir a
contaminação cruzada e a resultados inválidos.
A agitação durante a incubação das tiras deve ser realizada de tal forma
que o líquido e as tiras de teste se movam na cuvete para trás e para
diante, sem que o líquido derrame sobre as bordas das cuvetes.
Não tapar o tabuleiro. Durante as incubações de hibridação e a
lavagem adstringente, as cuvetes devem ser deixadas destapadas no
banho de água. A cobertura das cuvetes com selos da microplaca
pode causar contaminação cruzada.
Instruções para a mudar manualmente o líquido nas cuvetes
-
Aspirar o líquido da cuvete com uma pipeta, de preferência ligada a
um aspirador de vácuo. Colocar o tabuleiro num ângulo que permita
ao líquido escorrer para uma extremidade da cuvete.
Juntar a cada cuvete 2 ml da solução apropriada e cumprir o protocolo.
Para isso pode usar-se uma multipipeta (Eppendorf) dispensadora.
Repetir este passo tantas vezes quantas as indicadas no
procedimento de teste.
NOTA:
• Não permitir que as tiras sequem entre cada passo.
• Certificar-se de não danificar a superfície das tiras quando da
aspiração. Aspirar o líquido a partir do topo da tira, acima da linha
de marcação.
• Assegurar-se de que todo o líquido é aspirado.
• Certificar-se de que a totalidade da tira é lavada por completa
submersão na solução.
• Adaptar a velocidade do agitador, quando necessário.
Observações e precauções
-
-
Apenas para uso in vitro.
Apenas para uso profissional.
Para evitar a contaminação do ADN, recomenda-se a máxima separação
física entre os passos de pré e pós amplificação: salas separadas, pipetas
e outro material de laboratório separado, batas e luvas de laboratório (e o
seu stock) separadas, são precauções mínimas para uma boa prática
laboratorial.
Uma vez na sala de pós amplificação evitar regressar à sala de préamplificação.
É recomendável o uso de material de laboratório descartável, autoclavado.
INNOGENETICS®
-
82
Não reutilizar material de laboratório descartável.
Usar uma nova ponta de pipeta esterilizada para cada alíquota da
amostra.
Não usar os reagentes para além do prazo de validade.
Não misturar reagentes de kits diferentes a não ser que os
componentes tenham números de lote idênticos.
Evitar a contaminação microbiana dos reagentes.
Procedimento manual do teste
NOTA:
- Ao longo dos diferentes passos de incubação, as tiras de teste devem
permanecer sempre na mesma cuvete.
Antes da incubação, verificar a temperatura do banho de água,
utilizando um termómetro calibrado e ajustar a temperatura, se
necessário, antes de colocar o tabuleiro no banho de água.
Fechar sempre a tampa.
O Controlo LiPA deve ser incluído em cada série de testes.
Amostras
1. Produto amplificado HLA-A (usar 10 µl). Para preparação da amostra:
ver as instruções de utilização do INNO-LiPA HLA-A Multiplex.
NOTA:
• Certificar-se de que se adicionam exactamente 10 µl da amostra
amplificada. Uma quantidade demasiado grande ou demasiado
pequena de amostra pode conduzir a um resultado de tipagem
incorrecto.
2. Amostra de Controlo LiPA para INNO-LiPA HLA-A Update (usar 10 µl;
a amplificação não é necessária!)
3. Amostra de controlo amplificado em branco (controlo negativo usar 10 µl).
Desnaturação e hibridação
1. Aquecer um banho de água com agitação até 56°C ± 0.5°C.
Verificar a temperatura usando um termómetro calibrado e ajustar a
temperatura, se necessário. Não exceder a temperatura indicada.
Pré-aquecer a Solução deHibridação e a Solução de Lavagem
Adstringente num banho de água a uma temperatura mínima de 37°C
e máxima de 56°C. Misturá-las antes de usar. Todos os cristais devem
ser dissolvidos.
2. Usando pinças, retirar a quantidade necessária de Tiras 1 e Tiras 2
INNO-LiPA HLA-A update do tubo (uma tira 1 e uma tira 2 por amostra
a testar). Incluir ambas as tiras para a amostra de Controlo LiPA de
INNO-LiPA HLA-A Update e para a amostra de controlo amplificado
em branco. Com um lápis, escrever o número de identificação acima
da linha marcadora de cor azul da Prússia ou turquesa da tira.
3. Retirar o número necessário de cuvetes de teste (uma cuvete por tira)
e colocá-las no tabuleiro.
4. Pipetar 10 µl de Solução de Desnaturação no canto superior de cada
cuvete.
83
5.
6.
7.
8.
INNO-LiPA HLA-A Update
NOTA:
• Fechar o frasco imediatamente após utilização.
Juntar 10 µl da amostra (ver Amostras; ver Instruções de uso de
INNO-LiPA HLA-A Multiplex) e misturar cuidadosamente, pipetando
para cima e para baixo.
Usar sempre pontas de pipeta esterilizadas. Proceda à desnaturação
durante 5 minutos a uma temperatura de 20 - 25°C.
Agitar a Solução de Hibridação pré-aquecida e juntar lentamente,
2 ml ao produto desnaturado amplificado de cada cuvete.
Misturar, agitando suavemente. Acautelar-se para não contaminar as
cuvetes vizinhas durante a pipetagem.
Colocar imediatamente a tira na cuvete. As tiras devem estar
completamente submersas na solução.
NOTA:
• Calçar luvas descartáveis e utilizar pinças.
Colocar o tabuleiro num banho de água com agitação a 56°C ± 0.5°C
(80 rpm; ver Instruções para incubação manual), fechar a tampa e
incubar durante 30 minutos.
NOTA:
• Evitar salpicos da água do banho para dentro da cuvete. Ajustar o
nível da água entre 1/3 e 1/2 da altura da cuvete. Para evitar que
o tabuleiro deslize, imobilize-o entre dois fortes pesos.
Lavagem adstringente
1. Retirar o tabuleiro do banho de água após a hibridação.
2. Manter o tabuleiro num ângulo pequeno e aspirar o líquido da cuvete
com uma pipeta, de preferência ligada a um aspirador de vácuo.
Juntar a cada cuvete 2 ml de Solução de Lavagem Adstringente préaquecida e colocar o tabuleiro num banho de água com agitação a
56°C ± 0.5°C, fechar a tampa e incubar durante 3 minutos.
3. Após a incubação, retirar o tabuleiro do banho de água e aspirar o
líquido da cuvete.
4. Repetir o passo de incubação de 3 minutos e a fase de aspiração
uma vez.
5. Finalmente. juntar a cada cuvete 2 ml de Solução de Lavagem
Adstringente pré-aquecida e colocar o tabuleiro num banho de água com
agitação a 56°C ± 0.5°C, fechar a tampa e incubar durante 4 minutos.
NOTA:
• Diluir a Solução concentrada de Enxaguamento 5x e o Conjugado
100x durante a lavagem adstringente. Ver Reagentes.
Desenvolvimento da cor
Todas as incubações subsequentes são realizadas de 20 - 25°C num
agitador. Durante as incubações, o líquido e as tiras de teste devem
mover-se na cuvete, para diante e para trás, para obtençaõ de uma
coloração homogénea.
1. Lavar cada tira duas vezes, durante 1 minuto, utilizando 2 ml de
solução de trabalho de Enxaguamento (ver Instruções para mudar o
líquido nas cuvetes).
INNOGENETICS®
84
2. Juntar 2 ml de solução de trabalho de Conjugado a cada cuvete e
incubar durante 30 minutos enquanto se agita o tabuleiro no agitador.
NOTA:
• Diluir a solução de Substrato BCIP/NBT 100x cerca de 10 minutos
antes do fim da incubação de conjugado. Ver Reagentes.
3. Lavar cada tira duas vezes por 1 minuto usando 2 ml de solução de
trabalho de Enxaguamento e lavar uma vez mais, usando 2 ml de
Tampão de Substrato.
4. Juntar a cada cuvete 2 ml de solução de trabalho de Substrato e incubar
por 30 minutos enquanto se agita o tabuleiro no agitador.
CUIDADO:
• Usar luvas e óculos de protecção.
5. Parar o desenvolvimento da cor lavando as tiras duas vezes em 2 ml
de água destilada, ao mesmo tempo que se agita o tabuleiro no
agitador por, pelo menos, 3 minutos.
6. Usando pinças, remover as tiras das cuvetes e colocá-las sobre papel
absorvente. Deixar as tiras secar completamente, antes de ler os
resultados. Guardar as tiras ao abrigo da luz depois de reveladas e secas.
Procedimento automático de teste: Auto-LiPA
O procedimento de teste LiPA é extremamente adequado para a sua
automatização. Por conseguinte o Auto-LiPA destina-se a realizar
completamente as fases de hibridação, lavagem adstringente e
desenvolvimento da cor.
O Auto-LiPA é um sistema independente que proporciona aquecimento,
arrefecimento, aspiração e pipetagem automáticos.
O protocolo standard para o Auto-Lipa 48 indica a execução de até
24 amostras quando se utiliza uma única tira por cavidade. Contudo, este
número pode ser aumentado até um máximo de 48. Para executar este
número, deverão ser testadas duas tiras do mesmo loco numa cavidade,
mantendo na mesma todos os outros parâmetros do protocolo. De notar
também que poderão ser observadas ocasionalmente reactividades de sonda
fracas. Por esse motivo, os utilizadores que pretendam aumentar o número de
amostras a testar, são alertados para validar este procedimento de “2 tiras
numa cavidade” no seu laboratório.
Para mais informações e protocolos específicos sobre Auto-LiPA, é favor
contactar Innogenetics ou o seu distribuidor local.
Resultados
Leitura
A Figura 2 ilustra a posição das diferentes sondas oligonucleóticas nas
tiras INNO-LiPA HLA-A Update. Uma linha é considerada positiva quando
aparece uma nítida banda púrpura claro ou castanha no final do
procedimento de teste.
Figura 2 (ver página 17): Localização da linha de marcação (linha Azul da
Prússia na Tira 1 e turquesa na Tira 2), a linha de controlo de conjugado
85
INNO-LiPA HLA-A Update
(conj. control), a linha de controlo de HLA-A Update (HLA-A control), e as
44 linhas de sondas nas Tiras INNO-LiPA HLA-A Update.
Validação
-
-
-
-
-
Incluir um controlo negativo e o Controlo LiPA (para o INNO-LiPA HLA-A
Update) de cada vez que o teste é realizado. Tal como em cada novo
procedimento de teste, deve ser considerada a inclusão de controlos
adicionais positivos e negativos, até que se consiga um alto grau de
confiança na possibilidade de realizar correctamente o procedimento
de teste. Sugere-se o uso de ADN de referência para confirmar que se
estabeleceram condições de teste apropriadas.
As linhas superiores nas tiras INNO-LiPA HLA-A Update (Figura 2) são as
linhas de marcação (linhas azul da Prússia e turquesa). Estas linhas
permitem uma orientação correcta das tiras.
A linha seguinte controla a adição de Conjugado reactivo e solução de
trabalho de Substrato durante o procedimento de detecção. Esta linha
deve ser ajustada com a linha de controlo do conjugado no cartão
plástico de leitura. Esta linha deve sempre ser positiva (caso contrario
não deve ser feita a interpretação!) e deve ter aproximadamente a
mesma intensidade em cada tira, numa mesma série de testes.
A linha seguinte é a linha de controlo interno de hibridação do HLA-A
Update (controlo HLA-A no cartão de leitura) a qual indica se foi ou não
adicionada, para hibridação, uma quantidade apropriada de material
amplificado HLA-A. Esta linha deve sempre ser positiva, excepto para o
controlo negativo, mas a sua intensidade deve variar nas diferentes
amostras.
O resultado do ensaio de cada controlo negativo não deve dar
nenhum sinal aparente em nenhuma das linhas da tira, excepto na
linha de controlo do Conjugado.
A amostra de Controlo LiPA para INNO-LiPA HLA-A Update deve
produzir o seguinte padrão de sondas positivas: controlo de conjugado,
Controlo HLA-A, 15, 30, e 35. Todas as outras sondas devem ser
negativas. Esta amostra de controlo é composta por oligonucleotidos
biotinilados, complementares para as mencionadas sondas de
hibridação. Uma hibridação positiva destas sondas demonstra uma
performance satisfatória do ensaio, incluindo as fases de hibridação,
lavagem adstringente, desenvolvimento da cor e detecção. Um padrão
diferente pode indicar problemas na performance do ensaio tais como
temperatura incorrecta durante a hibridação, desvios nos tempos ou
temperaturas de incubação descritas.
As intensidades das cores numa tira podem diferir de uma linha para
outra.
Interpretação dos resultados
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Comprovar que a amostra de Controlo LiPA apresenta o padrão de
reactividade correcto.
A linha de controlo de conjugado da tira deve estar coincidente com a
linha de controlo de conjugado do cartão plástico de leitura.
Verificar primeiro a positividade das linhas de controlo (primeiras duas
linhas), de forma a validar cada tira individual (ver Validação).
INNOGENETICS®
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Os resultados da tipagem baseam-se na reactividade das sondas do kit.
Está disponível uma lista de especificações das sondas.
Identificar todos os números das sondas que são positivas nas tiras de
INNO-LiPA HLA-A update e deduzir a tipo de HLA-A utilizando a tabela
de tipagem do INNO-LiPA HLA-A Update ou o software de
interpretação LiPA (ver software de interpretação LiRAS).
Este software frequentemente dá mais resultados do que é requerido
para o uso a que se destina o ensaio: proporciona-se interpretação a
nível do grupo de alelos, bem como todas as suas possíveis
combinações de alelos. Como o kit não foi concebido especialmente
para tipar estes alelos a nível de alelo, esta informação deve ser
considerada como complementar e não como decisiva.
Software de interpretação: LiRAS™
O software LiRAS para INNO-LiPA HLA foi concebido para auxiliar na
interpretação dos resultados do LiPA.
Contactar o distribuidor local para obter a última versão actualizada.
Limites do procedimento
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-
A utilização deste produto deve ser limitada a pessoal treinado em
técnicas de hibridação.
Apenas uma boa prática de laboratório e uma performance cuidadosa
dos procedimentos especificados permitirá uma hibridação específica
e uma correcta tipagem do ADN alvo.
As tiras INNO-LiPA HLA-A Update foram concebidas para dar
resolução ao nível do grupo de alelos (A*01 a A*80). No entanto, uma
combinação de certos alelos pode conduzir a uma combinação de
sondas não exclusiva e, portanto, a uma resposta ambígua para duas
ou mais possíveis combinações de grupos de alelos.
Novos alelos podem ter polimorfismos fora das regiões de sonda; isto
deve ser tomado em consideração, quando na interpretação de resultados.
As linhas de controlo do HLA-A Update não são apenas específicas para
HLA-A, mas também para quase todos os alelos HLA-B e HLA-C.
Por isso, as linhas de controlo HLA-A podem também reagir com
produtos amplificados de HLA-B e HLA-C.
Performance do teste
A avaliação do kit INNO-LiPA HLA-A Update realizou-se em quatro
laboratórios europeus de tipagem de tecidos em tipagens de amostras de
rotina. Analisaram-se um total de 346 amostras. O ADN foi obtido de
amostras de sangue frescas ou congeladas, com EDTA ou citrato como
anticoagulante. A extracção do ADN realizou-se utilizando o método de
"salting out" ou os kits QIAamp 96 DNA blood kit (Qiagen), Genomic DNA
Purification kit (Promega) e Puregene (Gentra Systems). O ADN, récem
obtido ou congelado, foi amplificado com os termocicladores Perkin Elmer
9600 ou 9700, e os amplicons conservaram-se a 2 - 8°C ou -25/-15°C
antes de serem aplicados nas tiras.
Não se encontraram falhas na amplificação, ainda que uma amostra tenha
tido que ser tipada duas vezes num dos centros.
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INNO-LiPA HLA-A Update
As amostras foram processadas utilizando um Auto-LiPA e analisaram-se com
uma versão para ensaios clínicos do software de interpretação LiRAS™.
Precisão
Obteve-se um resultado de tipagem HLA-A para 345 de 346 amostras de
ADN. Destas, em 18 amostras teve de se repetir a tipagem. Uma amostra
foi definida como "tipagem não deduzível" mas de acordo com o
investigador isto foi provavelmente devido a uma contaminação do ADN.
A exactidão a nível de grupo de alelos calculou-se como a percentagem
de concordância observada com ensaios de ADN alternativos (Biotest
ELPHA HLA-AB LowRes Typing kit, Dynal SSP, LiPA HLA-A,
sequênciação, Micro SSP™, OLERUP SSP™, Biotest HLA-A SSP).
Os resultados do INNO-LiPA HLA-A Update consideraram-se
concordantes com o ensaio de referência quando os dois resultados foram
idênticos, se o resultado do INNO-LiPA HLA-A Update foi mais específico
que o resultado de referência ou quando os resultados do INNO-LiPA
HLA-A Update mostraram menor resolução mas um resultado correcto em
comparação com os métodos de referência.
A exactidão inicial foi de 99.1% (342/345). O ensaio das discrepâncias
permitiu chegar a uma exactidão de 99.7% (344/345). Foram tomadas
medidas para evitar futuros erros na tipagem como ocurreu com uma
amostra durante o estudo.
Resolução (versão v1.0/2001-03-31 da tabela de tipagem)
O kit INNO-LiPA HLA-A Update está pensado para determinar alelos HLA-A a
nível de grupo de alelos, por exemplo a nível de equivalentes serológicos.
'Grupo de alelos' é a designação dos dois primeiros dígitos que se seguem ao
asterisco na nomenclatura HLA standard (p.e. HLA A*32). Além disso, o kit está
pensado para determinar os seguintes alelos nulos: A*0232N (exón 3),
A*0303N (exón 3), A*2409N (exón 4), A*2611N (exón 3) e A*6811N (exón 1).
O alelo A*2402102L, que tem um nível de expressão muito baixo, também se
detecta (intrón 2).
A resolução teórica a nível de grupo de alelo (i.e. 2 dígitos) está calculada
em 99.5%. A resolução a nível de grupo de alelo observada durante este
estudo, após análise das discrepâncias, foi de 99.4% (343/345).
Inicialmente, observou-se uma ambiguidade (A*02 x A*66 ou A*02 x A*26).
Uma segunda ambiguidade surgiu como resultado da adaptação da tabela
de digitação (A*3201 x A*3201 ou A*3201 x A*7403). Cinco ambiguidades
(14 amostras) observadas com o método de referência foram reduzidas a
um único resultado de tipagem utilizando o ensaio INNO-LiPA HLA-A
Update. Durante a avaliação clínica identificaram-se dois alelos nulos:
A*0303N e A*6811N.
Reactividade das sondas
Dez sondas reagiram como falsos positivos e seis fracamente como falsos
negativos numa ou mais ocasiões durante o ensaio clínico.
Esta informação, se não estava já presente, foi aplicada no software e/ou
nas instrucções para facilitar a tipagem. Quando se utilizou o software de
interpretação LiRAS™ todos menos um dos falsos positivos foram
INNOGENETICS®
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identificados como tal e foi alcançada uma tipagem concordante a nível de
grupo de alelo. O risco de má interpretação, causado por um falso
negativo, foi abordado adaptando a tabela de tipagem.
Consultar as instrucções para informação específica sobre a reactividade
das sondas.
Está disponível uma lista completa de especificidades das sondas e dos
primers. Todas as sondas estão desenhadas para hibridar
especificamente com a sua sequência complementar a nível de um
mismatch, excepto se está especificado de outro modo na lista.
Sensibilidade
Uma avaliação interna de séries de diluições de três amostras de ADN,
variando de 0.01 µg/µl sté 2 µg/µl, demostrou que todas as amostras
eram visíveis em gel de agarose e que foram tipadas correctamente.
A avaliação externa do kit incluiu 346 amostras de ADN com uma
concentração entre 20 e 1500 ng/µl e uma pureza (A260nm/A280nm) ≥ 1.5.
O ADN foi diluído até uma concentração entre 20 ng/µl e 250 ng/µl antes
da amplificação. Não se encontraram falhas na amplificação, ainda que
uma amostra tenha tido que ser tipada duas vezes num dos centros.
Precisão
Dados internos:
Três amostras foram ensaiadas em quadriplicado, por duas pessoas
distintas, utilizando o método manual, ou por uma pessoa em dois AutoLiPA distintos. Duas amostras foram analisadas em três lotes distintos e
em dois ensaios diferentes. A interpretação dos resultados foi a mesma
para todas as amostras.
A reactividade das sondas foi comparável em todos os casos.
Validação externa:
- A variação inter-lote foi avaliada analizando um painel de proficiência
(cinco amostras com reactividade e interpretação conhecidas) com
dois lotes distintos do producto. Para cada amostra obteve-se o
mesmo resultado, independentemente do lote utilizado.