Diss. ETH No. 8824
THE NTA-MONOOXYGENASE FROM
PSEUDOMONAS sp. ATCC 29600
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the
degree
of
Doctor of Natural Sciences
CatE
Set.
presented by
RENE PETER SCHNEIDER
Natw. ETH
dipl.
Born
on
20
accepted
May
on
1960 in Sao
Paulo, Brazil
the recommendation of
Prof. Dr. G.
Hamer, examiner
Prof. Dr. W. Harder, co-examiner
ADAG Administration & Druck AG
Zurich 1989
87
6.0 SUMMARY
(NTA)
Nitrilotriacetate
is
widely
and has been shown to be
woik,
is
analysis
acetate
(IDA),
is
catalysed by
a
budder
m
place
that
in
aerobic bactena the first
postulated
were
developed
IDA
achieved
measuring eluant
Whereas NTA
determined
was
by
ATCC 29600
analysed
was
polyphosphates
was
product,
ion
iminodi¬
exclusion chro¬
In both cases, detection
aftei chemical suppression with
conductivity
In this
studied Methods
one
for using
chromatography
ion
of
NTA-Monooxygenase (NTA-Mo)
cell-free extract of the substrate, NTA, and of
m
matography
by
It
from Pseudomonas sp
Monooxygenase
for the
detergent
as a
biodegradable
biochemical transfonnation
NTA
used
a
was
membrane
suppiessoi
NADH and eithei
products
formed
be based
on
Mg2+,
Oxygen,
oxylate
or
were
glyoxylate, IDA,
detennination of either the
IDA However,
consumption
used to
is
dation occurred
use
based
measure
reaction
of assays based
on
Mn2+
substrates, O2,
of
on
produced
cleavage activity Assays
spect
time, whereas
of NTA-Mo and that
or
of
or
or
was
caused
by
Mg2+-NTA
Mn2+ IDA
was not a
cond, hitherto unidentified enzyme
was
FAD resulted
or
Mg2+
or
Co2+
an
assay
were
better substrate than
in
were
stimulation of
lmear with
considerable
NTA-cleavage capability
that the metal-NTA
be mvolved
pH optuna
in
was
complex
were
substrate for NTA-Mo, thus
must
formed, precluded
Sirmlar activity patterns resulted for
destruction of
was a
oxi¬
act as an
compounds Therefore,
observed with Mn2+ There
was
NADH
NADH
oxidation of NADH The
The temperature and
ions
can
products, gly¬
NTA-dependent
uncoupled
conducted with either
nonlineanty
nonlineanty
the
developed
was
significant H2O2 production Results suggested
of either Co2+
NTA
determination of either O2
Addition of either FMN
to
strate
or
and H2O2, where formate
glyoxylate
NTA
dence that this
NADH
the determmation of these
NTA cleavage with all tliree divalent metal
respectively
in
and the
H2O Assays for NTA-Mo activity
NTA-Mo activity, because
the determmation of NTA
25°C and 7 5,
NTA-cleavage
needed for
were
NAD+ and
the absence of NTA-cleavage This indicated that NTA could
in
possible chemical
or
must be taken when
care
effector for NTA-Mo, with H2O2
the
Co2+
NTA
is
re
evi
due
to
the sub
complexes
indicating
that
NTA-degradation by
a se¬
aerobic
bactena
Partial
purification
subunits (ABC)
of NTA-Mo
On
provided
gel fdtration,
a
evidence that
ABC, apparent MW 54000) eluted separately from
tometric
acUvity (BC, apparent MW 42000)
flavin-like spectrum, could be
trophotometric properties
were
it
fraction contaming
separated
B
a
comprized
fraction
(apparent
from BC
by
found for B and BC
ion
at
least three protem
NTA-cleavage activity (subunits
displaying only spectropho¬
MW 20000), which showed
chromatography
a
Different spec¬
88
7.0 ZUSAMMENFASSUNG
Der Einsatz des
biologisch
abbaubaren
biochemische
Abbauschritt
wird. In der
katalysiert
durch
das
mittels
Abbauprodukt
NTA-Monooxygenase
Enzym
analytische
Methoden
zur
und IDA mit
Leitfahigkeitsdetektor
chemisch durch Einsatz eines
NTA
Assays
notwendig,
fiir die
brauchsraten
Bestimmung
von
NTA
verwendet und die
gemessen. In
Eluentenleitfahigkeit
unterdriickt.
Suppressors
wobei die Produkte IDA,
bestimmung
von
Pseudomonas sp.
lonenchromatografie
O2, NADH und ein divalentes Metallion (Mg2+, Co2+ oder Mn2+)
von
von
erste
(NTA-Mo)
Iminodiacetat (IDA) in Zellextrakten entwickelt. NTA wurde
Ionenausschlusschromatografie
beiden Fallen wurde ein
Mikroorganismen der
Arbeit wurde die NTA-Mo
vorliegenden
ATCC 29600 untersucht. Dafiir wurden
und dessen
Nitrilotriacetat (NTA) in
Phosphatersatzstoffes
Waschmitteln ist weit verbreitet. Es wird angenommen, dass in
der Aktivitat
Glyoxylat,
waren
NAD+ und
NTA-Mo miissen auf
von
Substraten oder der Bitdungsraten
von
fur den Umsatz
H2O entstanden.
Messung
der Ver-
Produkten beruhen. Es
zeigte
sich, dass die normalerweise in Monooxygenasenassays gemessenen O2 und/oder NADH
Verbrauchsraten
konnen,
entkoppelt
von
nur
bedingt
zur
da unter bestimmten
Bestimmung
Bedingungen
werden kann. Dabei entsteht
H2O2,
NTA in diesem Fall hinweist. Audi die
oxylat und H2O2 kann nicht
da die beiden
gebildet
wird.
zur
Verbindungen
Deswegen
der NTA-Mo Aktivitat verwendet werden
der NTA-Umsatz
was
Bestimmung
der NADH Oxidation
mogliche
auf eine
Messung
von
der beiden
Effektorfunktion
Reaktionsprodukte Gly¬
der NTA-Mo Aktivitat verwendet
chemisch miteinander
reagieren konnen,
werden,
wobei Formiat
wurde eine Methode entwickelt, welche auf der
Messung
der
NTA-Umsatzrate beruht. Ahnliches Umsatzverhalten wurde fur alle drei Metallionen gefunden und die
Temperatur- (25°C)
bzw.
pH-Optima (7.5)
wurden bestimmt. Der NTA-
Umsatz wurde durch FMN oder FAD stimuliert. Die Reaktionsraten
dung von Mg2+
satzraten mit
oder Co2+ linear. Hinweise deuten darauf
Mn2+ durch eine
verursacht wurden.
eigentliches
Schadigung
der NTA-Mo
bei Verwen-
hin, dass die nichtlinearen
infolge
starker
von
Mg2+ Komplex
der NTA-Mo nicht umgesetzt,
teren, bis anhin unbekannten
Enzyms
im
was
Stoffwechselweg
Um-
H2O2 Produktion
Die Resultate weisen darauf hin, dass ein Metall-NTA
Substrat der NTA-Mo ist, wobei der
scheint. IDA wurde
waren
Komplex
als bestes Substrat
er-
auf die Existenz eines wei-
von
NTA in aeroben Bakterien
hinweist.
Hinweise,
dass NTA-Mo
aus
drei Proteinuntereinheiten (ABC, scheinbares MG
54000)
besteht, wurden bei der partiellen Reinigung des Enzyms erhalten. In der Gelfiltration
waren
die Maxima fiir NTA-Umsatz (ABC, scheinbares MG
54000)
und
NTA-abhangiger
NADH-oxidation (BC, scheinbares MG 42000) in verschiedenen Fraktionen. Die Untereinheit B
(scheinbares MG 20000), die ein flavinahnliches Spektmm aufwies, wurde nach
lonenchromatografie erhalten.
ihren
Die beiden Untereinheiten B und BC unterschieden sich in
spektrophotometrischen Aktivitaten voneinander.
89
8.0 RESUMO
O acido nitrilotriac6tico
para
A
poUfosfatos.
NTA
em
(NTA)
primeira
nodiaceilco (IDA)
clusao de tons
utilisado
A
e
Co2+
em
do NTA
ou
da taxa de
ser
si,
como
a
atividade maxima
a
na
taxa
ou
forma9ao
um
extrema
de
o
que
a
porque
em
transforma9ao
o
IDA. Isto
biodegrada9ao do
do NTA
em
Evidfincia de que
a
estas
na
pela
e
com
a
que
NTA-Mo
ser
e
como
determmada
podem reagir qulmicamente
consumo
quanta FAD
na
progressiva
ser o
uma
ou um
complexo
substrata
da taxa de
a
con¬
destruicao da
com o
A NTA-Mo
enzima ainda desconhecida 6
es-
presen9a de
derivado deste. Os
do NTA
preferido.
ensaio
de NTA durante
Mn2+ foi provavelmente devida
o
um
divalentes, sendo que
7.5. Tanto FMN
pelo H2O2
do
pela taxa
re¬
cation,
nao
reage
responsavel pela
composta por tr6s subunidades prot6icas foi obtida ap6s
da enzima. Em
do NTA
que continha
flavoprotefna, p6de
subunidades B
de estlmulo
provenientes
enzima. Ensaios conduzidos
do NTA da enzima
ou
efetor,
ties cations
pH
O2
0
medicao do
com os
dos
o
pode
substancias
um
de
consumo
possibilidade
H2O. A
e
de
do IDA. Isto indica que
o
filtra9ao por gel,
a
fracao que continha atividade
(ABC, peso molecular (PM) aparente 54000) elufa
maximo da atividade
espectrofotometiica (BC,
aparente 42000). A subunidade B (PM aparente 20000), que exibia
uma
consumo
total absorcao dos el6trons
nao
dos cations
um
NAD+
enzima, tambem poderia agir
substrata real da enzima
transforma9ao
fra9ao
a
produ9ao
funcao do tempo. A inibicao
ensaios
significa
de
IDA.
purifica9ao parcial
maxima de
ex-
condutometro foi
de acido f6rmico. Diante disso, elaborou-se
complexo Mg2+-NTA parece
produto
cautela, devido
ocorra
temperatura de 25°C
Co2+ foram lineares
sultados sugerem que
da
dos
H2O2 devido
consumo
do NTA observada
antes
produtos.
sem
glioxilato
e
IDA, glioxilato,
Taxas de
substrata para
de
ocorreu a
de
sumo
sendo que
de
do IDA. Em ambos
e um
pela determina9ao
atividade da NTA-Mo baseado
Mg2+
capacidade
supressor
necessitava de NADH, O2
Resultados similares foram obtidos
timularam
com o
com
NTA
pelo
de H2O2 e/ou
para determinar
a reacao.
em um
A atividade da NTA-Mo tamb6m
que resulta
o
cromatografia
da taxa de
de
fonna9ao
forma9ao
na
oxigSnio.
produ9ao
entre
do
tra-
dcido imi-
produto
do
e
aplicada na determina9ao
da rea9ao foram
medida
ser
interpretadas
parte de servir
que resultaria
de
biodegrad&vel
degrada9ao
NTA-Mo. Neste
a
O NTA foi analisado por
anions foi
produtos
pode
da oxidacao do NADH
NADH por
monooxigenase,
uma
concentra5ao do substrata NTA
pela NTA-Mo
Mn2+. Os
ou
NADH devem
NTA,
a
extratos celulares.
cromatografia de
atividade da NTA-Mo
a
substituto
como
cadeia metabolica da
deteccao das substancias.
na
substrates
na
NTA-Mo obtida de Pseudomonas sp. ATCC 29600. Foram desen-
a
condutividade do eluente foi reduzida
a
transforma9ao
Mg2+,
detergentes
bioqulmica
rea9ao
volvidos mdtodos para medir
casos,
em
bact£rias aer6bicas 6 mediada por
balho foi estudada
os
utilisado
BC
ser
separada
do
complexo
BC por
distingiiiam-se pelas propriedades
um
cromatografia
da atividade
PM
espectro tfpico de
em
DEAE. As
espectrofotometiica.