Avaliação das moléculas da matriz extracelular que ligam
heparina e podem contribuir para o estímulo da síntese do
Proteoglicano de Heparam Sulfato
Klimeck, T. D. F.; Monteiro, P. S.; Biscaia, S. M. P.; Rossi, G.R.; Trindade, E.S.
Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Molecular
Introdução: Heparina é um glicosaminoglicano com
conhecida ação anticoagulante e antitrombótica. Nas
últimas décadas surgiu heparinas de baixo peso
molecular (LMWH), obtidas por fragmentação (química
ou enzimática) do polímero, que tem substituído a
heparina nas suas diversas aplicações clínicas, com
igual ou maior eficiência.
Objetivo: entender os requisitos estruturais de LMWH
que são necessários para desencadear o estímulo da
síntese de Proteoglicano de Heparam das células
endoteliais.
Métodos:
LMWH: Clexane® e o Fragmin®, previamente submetidas à
N-dessulfatação e 2-O-dessulfatação (NAGASAWA, INOUE e
TOKUYASU, 1979) e também à carboxirredução (TAYLOR e
CONRAD, 1972). Cultura de Células - As células endoteliais
utilizadas foram obtidas da aorta de coelho (BUONASSISI,
1973). Análise dos glicosaminoglicanos sintetizados Alíquotas da célula e do meio de cultura foram analisados
conforme descrito por TRINDADE et al, 2008. Marcação
citoquímica – Células endoteliais plaqueadas em lamínulas
foram expostas ou não (controle) a 100 mg/ml de Clexane ou
à Fragmin “overnight”. A foram marcadas para detecção de
Fibronectina e de Filamentos de actina, conforme descrito por
TRINDADE et al., 2008.
Referências:
BUONASSISI (1973). Exp.Cell Res.76:363-368.
DODGSON e PRICE (1962). Biochem. J. 84: 106–110.
NAGASAWA, INOUE e TOKUYASU (1979). J. Biochem. (Tokyo).
86:1323-1329.
TAYLOR e CONRAD Biochemistry (1972) 11(8):1383-1388.
TRINDADE et al., (2008) J Cell Physiol 217(2):328-337.
Resultados/Discussão:
Grupamentos Sulfatos e carboxílico
influenciam no estímulo da síntese
de PGHS: As células endoteliais
expostas para Clexane e Fragmin,
conforme descrito em métodos. A
Figura acima mostra a quantificação
de Heparam Sulfato secretado para o
meio de cultura, em com/mg de
proteínas
celulares.
DS8
–
Dessulfatado por 8 horas, N/O-DS – N
e
O-Dessulfatados,
CR
–
carboxirreduzido
Fibronectina e
Citoesqueleto de
Células
Endoteliais
expostas à
LMWH:
A-Células endoteliais
não
expostas
à
LMWH. B- Células
endoteliais expostas
à LMWH. C-Células
endoteliais expostas
LMWH
carboxirreduzida.
D-Células endotelias
expostas à LMWH Ndessulfatada.
E- Células endoteliais
expostas à LMWH 2O-dessulfatada.
F- Células endoteliais
expostas à LMWH 2O-dessulfata e Ndessulfatada.
Análises
por
microscopia
de
fluorescência
Confocal.
Conclusões: As LMWH utilizadas no presente estudo modificadas
químicas ou não, foi possível observar uma sutil alteração na marcação
de fibronetina, quando as células foram expostas às heparinas não
modificadas. Estudos adicionais também devem ser realizados para a
comprovação deste fato. Em relação à alterações da informação gênica
dos componentes da matriz extracelular, os resultados ainda prelimindar
mostram que trombospondina pode ser um dos alvos, além do PGHS,
que sofre alteração (up regulation). Demais ensaios devem ser
realizados.