PROTEINA CINASE C E A REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE RECEPTORES MUSCARÍNICOS EM CÉLULAS DA RETINA DE RATOS NEONATOS: PAPEL DOS FATORES TRÓFICOS. ¹Luis Eduardo Gomes Braga; ²Marcelo Gomes Granja; 3Elizabeth Giestal de Araujo; 4 Aline Araujo dos Santos Rabelo. RESUMO A proteína cinase C (PKC) tem um importante papel em diferentes fenômenos do desenvolvimento do sistema nervoso como proliferação, sobrevida e diferenciação. A ativação crônica da PKC pelo PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) por 48h diminui a proliferação das células da retina de ratos neonatos in vitro através de um efeito dependente da ativação dos receptores muscarínicos do tipo 1 (M1) e da liberação de polipeptídios. Observamos também que o tratamento com PMA por 45 min aumenta a expressão de BDNF e modula a expressão de receptores muscarínicos do tipo M1 e M3. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do tratamento do PMA por 45 minutos sobre a expressão de NGF, bem como estudar o perfil de expressão dos receptores M1 e M3 em culturas de células da retina tratadas com BDNF e NGF por 48h. Nossos resultados demonstram um aumento significativo na expressão de NGF em culturas tratadas com PMA (50ng/mL) por 45 minutos. Analisamos também o perfil da expressão dos receptores M1 e M3 em culturas tratadas com BDNF (50ng/mL) e NGF (50ng/mL) por 48h. Houve uma diminuição na expressão dos receptores M1 em culturas tratadas tanto com BDNF quanto com NGF, sendo o efeito do NGF mais pronunciado. No entanto, não há nenhuma mudança na expressão do receptor M3 após os tratamentos com BDNF ou com NGF. Nossos resultados indicam que o tratamento PMA regula a produção de BDNF e NGF em células da retina de ratos, e sugerem que estas neurotrofinas possam ser responsáveis pela diminuição da expressão de receptores M1 induzido pelo tratamento com PMA. Palavras chaves: PMA, Receptor muscarínico, cultura celular, retina e ratos. ABSTRACT Protein kinase C (PKC) plays an important role in different phenomena that occur during nervous system development as proliferation, survival and differentiation. The PKC chronic activation mediated by PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) treatment, for 48h, induces a decrease in rat retinal cells proliferation in culture; an effect mediated by M1 receptors activation and polypeptide release. Previous results from our laboratory also demonstrate that PMA treatment, for 45 minutes, increases BDNF expression and modulates the expression of the M1 and M3 muscarinic receptors. The aim of this work was to analyze the effect of PMA treatment for 45 minutes in NGF expression and also to study the pattern of M1 and M3 receptors expression in rat retinal cells cultures treated with NGF and BDNF for 48 hours. We observed that cultures treated with PMA by 45 minutes, expressed a significant increase in the _______________________ ¹ Farmacêutico, Mestrando em Neurociências pela Universidade Federal Fluminense – UFF. ² Médico Veterinário, Mestrando em Neurociências pela Universidade Federal Fluminense – UFF. ³Médica, Doutora em Ciências pela Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ e Professora Associada III pela Universidade Federal Fluminense/UFF. 4 Médica, Doutora em Ciências pela Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ e Professora Adjunto II da Universidade Federal Fluminense/UFF. Endereço: Rua Hernani Pires de Mello, 101, São Domingos – Niterói – Rio de Janeiro. CEP 24210-130. E-mail: [email protected]. NGF expression. We also analyzed the expression pattern of M1 and M3 muscarinic receptors in retinal cells cultures treated with BDNF (50ng/mL) and NGF (50ng/mL) for 48 hours. We observed that both treatments elicit a decrease in M1 receptors expression, being the NGF effect more pronounced. However, there is no change on M3 receptor expression after BDNF or NGF treatments. Our results demonstrate that PMA treatment regulates BDNF and NGF production in rat retinal cells, and also suggest that these neurotrophins could be responsible for the decrease of M1 receptors expression in PMA treatment. Keywords: PMA, muscarinic receptors, cell culture, rat retina and neurotrophins. A proteína cinase C (PKC) foi descoberta em 1977 em estudos utilizando extratos do cérebro de ratos (GIORGI et al, 2009) e tem um papel na regulação de processos biológicos essenciais como a diferenciação, a proliferação e morte celular (KIM et al, 2011). O PMA é um éster de forbol isolado do óleo das sementes da planta Croton tiglium e de outras plantas da família Euphorbiacea (AFRASIABI et al., 2008). É um ativador da PKC cuja ação mimetiza a do ativador fisiológico diacilglicerol (NAKAGAWA et al., 2005). Devido a efeitos sobre a inibição da proliferação celular, os ésteres de forbol já são usados em ensaios clínicos de tratamento para câncer (SCHAAR, et al, 2006). O desenvolvimento do sistema nervoso é orquestrado por diferentes moléculas incluindo neurotrofinas e neurotransmissores através da ativação de vias de sinalização específicas. Na retina adulta, a acetilcolina é o neurotransmissor dominante de uma subpopulação de células amácrinas e trabalhos mostram que receptores muscarínicos são expressos por células amácrinas, ganglionares, e bipolares. As células imaturas da retina neural (células neuroblásticas) podem também liberar acetilcolina, pois marcadores colinérgicos são transitoriamente expressos na retina de mamíferos mesmo antes do período de sinaptogênese (MARTINS et al, 2008). O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do tratamento do PMA, por 45 minutos, sobre a expressão de NGF, bem como estudar o perfil de expressão dos receptores M1 e M3 em culturas de células da retina tratadas com BDNF e NGF por 48h. Ratos neonatos (P0-P2) da linhagem Lister Hooded foram sacrificados por decapitação e suas retinas dissecadas em solução salina livre de cálcio e magnésio. As retinas foram incubadas com uma solução de tripsina 0,1% para a dissociação enzimática das células e em seguida foi realizada uma dissociação mecânica com auxílio de uma pipeta Pasteur de ponta afilada. As células foram plaqueadas em densidade de 1,0 x105 cel/cm2 em placas de Petri, previamente tratadas com 25µg/mL de poli-L-ornitina. As culturas foram mantidas em meio completo (meio 199, 5% soro fetal bovino, glutamina e antibióticos) ou em presença de meio completo na presença de PMA (50ng/mL), em atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar, a 37°C por diferentes intervalos de tempo. A expressão do NGF e dos receptores M1 e M3 foi determinada pela técnica de Western Blot. Os resultados foram expressos em unidades artitrárias (% do controle) após análise das imagens pelo programa SCION Image. Os procedimentos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFF (projeto 00124/09). Nossos resultados mostram o aumento da expressão de NGF em cultura de células da retina tratadas com PMA (50ng/mL) por 45 minutos (CT 100%, PMA50 167,23 ± 8,96%, n=3). Analisamos a expressão dos receptores muscarinicos M1 e M3 em culturas de células da retina tratadas com BDNF (50ng/mL) e NGF (50ng/mL) por 48 horas. Observamos que os tratamentos tanto com BDNF quanto com NGF diminuem a expressão de receptores M1 (CT 100%, BDNF 68,94 ± 4,31% n= 3) e (CT 100%, NGF 43,56 ± 1,62% n= 3). No entanto, não há nenhuma mudança na expressão do subtipo de receptor M3 após os tratamentos com BDNF ou NGF (CT 100%, BDNF 103.33 ± 0.77% n=3) e (CT 100%, NGF 116.31 ± 1.51% n=3). A literatura demonstra que o TPA, um outro éster de forbol, é capaz de aumentar a síntese e liberação de BDNF e NGF em culturas primárias de astrócitos corticais de ratos 2 neonatos, tendo um papel importante no processo de diferenciação celular (MIKLICK, et al, 2004). Nosso trabalho sugere que o efeito antiproliferativo do PMA é mediado pela liberação de neurotrofinas e por uma mudança no padrão colinérgico das culturas. A ativação da PKC é capaz de regular a liberação de neurotransmissores em diferentes regiões do sistema nervoso, incluindo a liberação de acetilcolina (Vaughan et al., 1998 para revisão; Iannazzo et al., 2000). Já foi demonstrado que a acetilcolina regula a proliferação de células neuronais (LI, et al, 2001) exercendo um importante papel em estágios precoces do desenvolvimento, mesmo antes da formação das sinapses, contribuindo para a regulação da diferenciação dos diferentes tecidos (Berzaghi et al., 1993). Além disso, é importante ressaltar que existe uma mudança no padrão de expressão dos receptores muscarínicos na transição das fases de proliferação para a de diferenciação celular (MARTINS et al, 2008). Nossos resultados indicam que o tratamento com PMA regula a produção de NGF em células da retina de ratos e sugerem que esses fator possam ser responsáveis pela diminuição na expressão dos receptores muscarinicos do tipo M1 observado no tratamento com PMA. Fonte financeira: CAPES, CNPq, FAPERJ, PROPPI e PRONEX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AFRASIABI, E.; AHLGREN, J.; BERGELIN, N. , et al. 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