PROTEINA CINASE C E A REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE
RECEPTORES MUSCARÍNICOS EM CÉLULAS DA RETINA DE RATOS
NEONATOS: PAPEL DOS FATORES TRÓFICOS.
¹Luis Eduardo Gomes Braga; ²Marcelo Gomes Granja; 3Elizabeth Giestal de Araujo;
4
Aline Araujo dos Santos Rabelo.
RESUMO
A proteína cinase C (PKC) tem um importante papel em diferentes fenômenos do
desenvolvimento do sistema nervoso como proliferação, sobrevida e diferenciação. A
ativação crônica da PKC pelo PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) por 48h diminui a
proliferação das células da retina de ratos neonatos in vitro através de um efeito dependente
da ativação dos receptores muscarínicos do tipo 1 (M1) e da liberação de polipeptídios.
Observamos também que o tratamento com PMA por 45 min aumenta a expressão de BDNF e
modula a expressão de receptores muscarínicos do tipo M1 e M3. O objetivo deste trabalho
foi analisar o efeito do tratamento do PMA por 45 minutos sobre a expressão de NGF, bem
como estudar o perfil de expressão dos receptores M1 e M3 em culturas de células da retina
tratadas com BDNF e NGF por 48h. Nossos resultados demonstram um aumento significativo
na expressão de NGF em culturas tratadas com PMA (50ng/mL) por 45 minutos. Analisamos
também o perfil da expressão dos receptores M1 e M3 em culturas tratadas com BDNF
(50ng/mL) e NGF (50ng/mL) por 48h. Houve uma diminuição na expressão dos receptores
M1 em culturas tratadas tanto com BDNF quanto com NGF, sendo o efeito do NGF mais
pronunciado. No entanto, não há nenhuma mudança na expressão do receptor M3 após os
tratamentos com BDNF ou com NGF. Nossos resultados indicam que o tratamento PMA
regula a produção de BDNF e NGF em células da retina de ratos, e sugerem que estas
neurotrofinas possam ser responsáveis pela diminuição da expressão de receptores M1
induzido pelo tratamento com PMA.
Palavras chaves: PMA, Receptor muscarínico, cultura celular, retina e ratos.
ABSTRACT
Protein kinase C (PKC) plays an important role in different phenomena that occur during
nervous system development as proliferation, survival and differentiation. The PKC chronic
activation mediated by PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) treatment, for 48h, induces a
decrease in rat retinal cells proliferation in culture; an effect mediated by M1 receptors
activation and polypeptide release. Previous results from our laboratory also demonstrate that
PMA treatment, for 45 minutes, increases BDNF expression and modulates the expression of
the M1 and M3 muscarinic receptors. The aim of this work was to analyze the effect of PMA
treatment for 45 minutes in NGF expression and also to study the pattern of M1 and M3
receptors expression in rat retinal cells cultures treated with NGF and BDNF for 48 hours. We
observed that cultures treated with PMA by 45 minutes, expressed a significant increase in the
_______________________
¹ Farmacêutico, Mestrando em Neurociências pela Universidade Federal Fluminense – UFF.
² Médico Veterinário, Mestrando em Neurociências pela Universidade Federal Fluminense – UFF.
³Médica, Doutora em Ciências pela Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ e Professora Associada III
pela Universidade Federal Fluminense/UFF.
4
Médica, Doutora em Ciências pela Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ e Professora Adjunto II da
Universidade Federal Fluminense/UFF. Endereço: Rua Hernani Pires de Mello, 101, São Domingos – Niterói –
Rio de Janeiro. CEP 24210-130. E-mail: [email protected]
NGF expression. We also analyzed the expression pattern of M1 and M3 muscarinic receptors
in retinal cells cultures treated with BDNF (50ng/mL) and NGF (50ng/mL) for 48 hours. We
observed that both treatments elicit a decrease in M1 receptors expression, being the NGF
effect more pronounced. However, there is no change on M3 receptor expression after BDNF
or NGF treatments. Our results demonstrate that PMA treatment regulates BDNF and NGF
production in rat retinal cells, and also suggest that these neurotrophins could be responsible
for the decrease of M1 receptors expression in PMA treatment.
Keywords: PMA, muscarinic receptors, cell culture, rat retina and neurotrophins.
A proteína cinase C (PKC) foi descoberta em 1977 em estudos utilizando extratos do
cérebro de ratos (GIORGI et al, 2009) e tem um papel na regulação de processos biológicos
essenciais como a diferenciação, a proliferação e morte celular (KIM et al, 2011). O PMA é
um éster de forbol isolado do óleo das sementes da planta Croton tiglium e de outras plantas
da família Euphorbiacea (AFRASIABI et al., 2008). É um ativador da PKC cuja ação
mimetiza a do ativador fisiológico diacilglicerol (NAKAGAWA et al., 2005). Devido a
efeitos sobre a inibição da proliferação celular, os ésteres de forbol já são usados em ensaios
clínicos de tratamento para câncer (SCHAAR, et al, 2006).
O desenvolvimento do sistema nervoso é orquestrado por diferentes moléculas
incluindo neurotrofinas e neurotransmissores através da ativação de vias de sinalização
específicas. Na retina adulta, a acetilcolina é o neurotransmissor dominante de uma
subpopulação de células amácrinas e trabalhos mostram que receptores muscarínicos são
expressos por células amácrinas, ganglionares, e bipolares. As células imaturas da retina
neural (células neuroblásticas) podem também liberar acetilcolina, pois marcadores
colinérgicos são transitoriamente expressos na retina de mamíferos mesmo antes do período
de sinaptogênese (MARTINS et al, 2008). O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do
tratamento do PMA, por 45 minutos, sobre a expressão de NGF, bem como estudar o perfil de
expressão dos receptores M1 e M3 em culturas de células da retina tratadas com BDNF e
NGF por 48h. Ratos neonatos (P0-P2) da linhagem Lister Hooded foram sacrificados por
decapitação e suas retinas dissecadas em solução salina livre de cálcio e magnésio. As retinas
foram incubadas com uma solução de tripsina 0,1% para a dissociação enzimática das células
e em seguida foi realizada uma dissociação mecânica com auxílio de uma pipeta Pasteur de
ponta afilada. As células foram plaqueadas em densidade de 1,0 x105 cel/cm2 em placas de
Petri, previamente tratadas com 25µg/mL de poli-L-ornitina. As culturas foram mantidas em
meio completo (meio 199, 5% soro fetal bovino, glutamina e antibióticos) ou em presença de
meio completo na presença de PMA (50ng/mL), em atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar, a
37°C por diferentes intervalos de tempo. A expressão do NGF e dos receptores M1 e M3 foi
determinada pela técnica de Western Blot. Os resultados foram expressos em unidades
artitrárias (% do controle) após análise das imagens pelo programa SCION Image. Os
procedimentos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em
Pesquisa Animal da UFF (projeto 00124/09).
Nossos resultados mostram o aumento da expressão de NGF em cultura de células da
retina tratadas com PMA (50ng/mL) por 45 minutos (CT 100%, PMA50 167,23 ± 8,96%,
n=3). Analisamos a expressão dos receptores muscarinicos M1 e M3 em culturas de células
da retina tratadas com BDNF (50ng/mL) e NGF (50ng/mL) por 48 horas. Observamos que os
tratamentos tanto com BDNF quanto com NGF diminuem a expressão de receptores M1 (CT
100%, BDNF 68,94 ± 4,31% n= 3) e (CT 100%, NGF 43,56 ± 1,62% n= 3). No entanto, não
há nenhuma mudança na expressão do subtipo de receptor M3 após os tratamentos com
BDNF ou NGF (CT 100%, BDNF 103.33 ± 0.77% n=3) e (CT 100%, NGF 116.31 ± 1.51%
n=3). A literatura demonstra que o TPA, um outro éster de forbol, é capaz de aumentar a
síntese e liberação de BDNF e NGF em culturas primárias de astrócitos corticais de ratos
2
neonatos, tendo um papel importante no processo de diferenciação celular (MIKLICK, et al,
2004). Nosso trabalho sugere que o efeito antiproliferativo do PMA é mediado pela liberação
de neurotrofinas e por uma mudança no padrão colinérgico das culturas. A ativação da PKC é
capaz de regular a liberação de neurotransmissores em diferentes regiões do sistema nervoso,
incluindo a liberação de acetilcolina (Vaughan et al., 1998 para revisão; Iannazzo et al.,
2000). Já foi demonstrado que a acetilcolina regula a proliferação de células neuronais (LI, et
al, 2001) exercendo um importante papel em estágios precoces do desenvolvimento, mesmo
antes da formação das sinapses, contribuindo para a regulação da diferenciação dos diferentes
tecidos (Berzaghi et al., 1993). Além disso, é importante ressaltar que existe uma mudança no
padrão de expressão dos receptores muscarínicos na transição das fases de proliferação para a
de diferenciação celular (MARTINS et al, 2008).
Nossos resultados indicam que o tratamento com PMA regula a produção de NGF em
células da retina de ratos e sugerem que esses fator possam ser responsáveis pela diminuição
na expressão dos receptores muscarinicos do tipo M1 observado no tratamento com PMA.
Fonte financeira: CAPES, CNPq, FAPERJ, PROPPI e PRONEX.
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