SEPARAÇÃO DE PROTEINAS POR
CROMATOGRAFIA
1. Princípio geral da cromatografia
a.matriz sólida capaz de reter a molécula alvo
b.passagem (forçada ou não) do fluido contendo
a molécula alvo através da matriz
c.retenção da molécula alvo por certo tempo
d.eluição separada dos componentes do fluido
e, consequentemente da molécula alvo
Cromatograma e algumas variáveis características
Resolução cromatográfica:
RS =
(trB – trA)
0,5 (WbA + WbB)
- Eficiência da purificação é avaliada pela
resolução cromatográfica (RS).
RS = (trB – trA) / 0,5 (WbA + WbB)
RS < 1 => separação incompleta
RS = 1 => curvas se tocam na base
RS > 1 => separação completa
* Normalmente a matriz é empacotada numa
coluna (leito fixo)
** Variante: adsorção em leito fluidizado. Neste
caso há movimento da matriz
2. Tipos de cromatografia (quanto à retenção e
liberação da molécula, em leito fixo)
2.1 Troca iônica
- retenção baseada na carga da superfície da
proteina/molécula
- mais comum, de grande aplicabilidade (resinas
têm alta capacidade de adsorver proteínas)
- Tem boa seletividade
- Separa a proteina das impurezas
- A molécula alvo é eluída com íons de mesma
carga que esta, porém com maior força de
interação com a fase estacionária
- A capacidade total de um trocador é dada
pela quantidade de grupos carregados na fase
móvel que podem ser trocados por unidade de
volume ou massa de matriz.
- Ampliação de escala: aumento do volume
da coluna (normalmente pelo aumento do seu
diâmetro).
Critério: velocidade superficial da fase
líquida (vazão/área da seção da coluna)
Obs.: manter constantes todas as demais
variáveis
2.2 Gel filtração
- Separação por tamanho (volume efetivo) da molécula
- Moléculas com volume efetivo maior que o poro são
expulsas da coluna no volume espacial (Ve)
- Moléculas menores penetram nos poros e em seguida
são arrastadas pelo eluente
- A separação obedece a sequência de volume efetivo
2.3 Cromatografia hidrofóbica
- Retenção da molécula pela interação da sua região
hidrofóbica com a matriz
- A proteína é colocada num meio com alta
concentração de sal
- A eluição é feita com um eluente de baixa
concentração de sal ou aumentando-se o
conteúdo de solvente orgânico
- O gel é mais caro que a resina de troca iônica
porém mais barato que as matrizes de afinidade
2.4 Focalização isoelétrica
- Retenção ocorre num tipo especial de resina
de troca iônica que contem grupos químicos
que conferem um gradiente de pH
- A eluição é feita com um fluido que contem
um anfólito especialmente formulado
- Permite separar isoproteínas (excelente resolução)
- Gel e eluente são caros
aplicação nos estágios finais da
purificação de produtos de alto valor agregado
2.5 Afinidade
- A matriz é formada
bioespecífico e seletivo
por
um
ligante
- O complexo formado entre o ligante e a proteína tem
que ser reversível
- A molécula alvo é retida e as impurezas são eliminadas
- Finalmente a proteína é eluída e o ligante regenerado
2.6 Fase reversa
- Compreende uma fase estacionária apolar e uma fase
móvel de polaridade moderada.
- Quanto mais apolar for a molécula alvo maior será o
seu tempo de retenção (e vice-versa).
- Alterando-se as forças de interação entre as fases
móvel e estacionária, promove-se a eluição da
molécula alvo. Isto possibilita também regular o seu
tempo de retenção.
3. Cromatografia em leito fluidizado
- Baseia-se na movimentação da matriz
- Útil para purificar proteínas de soluções
contendo ou não material particulado
(células suspensas ou fragmentos), uma vez
que permite integrar as etapas de
clarificação e purificação
grande interesse
- Ideal para os casos em que não se aplica o
sistema de leito empacotado e para reduzir perda
por ação de proteases (redução de tempo)
Por exemplo, proteínas heterólogas sintetizadas
por E. coli estão frequentemente num meio que
apresenta elevada viscosidade e contem
fragmentos da parede da bactéria, características
que o tornam inadequado para uma
centrifugação e cromatografia em leito
empacotado.
Os ligantes clássicos
SP – sulfapropil, DEAE – dietil aminoetil – e IDA –
ácido iminodiacético - para adsorção por troca
iônica,
IgG - para adsorção por afinidade e
Streamline Phenyl - para adsorção por
hidrofobicidade,
são acoplados ao suporte das partículas adsorventes
(agarose-quartzo ou agarose-metal) elevando sua
densidade, e viabilizando a expansão do leito
Tipos de reatores contendo o meio adsorvente
suspenso:
Reator agitado (mais simples)
Processo clássico é o CARE (“Continuous
Adsorption Recycle Extraction”)
Reator expandido
Características dos fluidos
• F1 (sup.) = solução tampão contendo a molécula
alvo, sob condições favoráveis à adsorção
• F1 (inf.) = descarte - fase líquida rica em contaminantes e pobre em molécula alvo
•F2
•F2
(sup.)
(inf.)
= alimentação do tampão de eluição
= solução rica em molécula alvo
•F3 (dir.) = suspensão do adsorvente, rico em
molécula alvo, que alimenta o segundo reator
•F3 (esq.) = suspensão do adsorvente reciclado do
segundo reator
Analisar F1, F2 e F3 sob ponto de vista de vazão
Reator expandido
O material adsorvente (sólido) tem uma densidade
maior que a do líquido (eluente) que, por ser aplicado a
uma velocidade superficial adequada, faz com que o
leito sofra expansão
Analisar F1, F2 e F3 sob ponto de vista de vazão
Reator expandido
O material adsorvente (sólido) tem uma densidade
maior que a do líquido (eluente) que, por ser aplicado a
uma velocidade superficial adequada, faz com que o
leito sofra expansão
Esquema ilustrativo das etapas da adsorção em leito
expandido.
Variáveis importantes
(para Leito expandido)
A expansão do leito e os fatores a ela associados
interferem na ligação proteína-adsorvente
• Velocidade superficial do fluido (U),
velocidade terminal da partícula (UT),
porosidade () e índice de expansão (n) do leito
U
=
UT
n
n é função do número de Reynolds
• A velocidade superficial do fluido (U),
também chamada de velocidade linear, é
definida por:
Q
U=
A
•
Onde Q é a vazão de alimentação do leito
(m3/h) e A é a área da seção transversal da
coluna (m2).
A velocidade linear varia entre 100 e 300 cm/h nas
operações de expansão, aplicação do meio e
lavagem. Na operação de eluição a velocidade linear
é reduzida para cerca de 100 cm/h, o que eleva a
concentração da molécula alvo no eluído.
Outras variáveis:
- Grau de expansão do leito (GE = H/Ho)
H: altura do leito expandido
Ho: altura do leito em repouso
valores típicos de GE: 2 a 3
- Número de pratos teóricos
- Distribuição do tempo de residência
Dimensionamento para Cromatografia
convencional
• Variáveis envolvidas:
Número de colunas (Nco)
Produção diária (Q)
Capacidade da coluna por ciclo (Md)
Número de ciclos por dia (Nci)
Q
Nco =
Md . Nci
Considerando algumas situações limitantes
do processo, pode-se chegar à expressão:
53050 . Q
Nco =
D2 . V . P
Onde D é o diâmetro da coluna, V é a
velocidade do fluido na saída e P é a
concentração de proteína no eluído.
Purificação de pro-insulina
por cromatografia de
afinidade
Cromatograma e algumas variáveis características
Reator agitado
Solução com
molécula alvo
Fase rica em
contaminantes
Reator agitado
Solução com
molécula alvo
Tampão de
eluição
Fase rica em
contaminantes
Fase rica em
molécula alvo
Reator agitado
Solução com
molécula alvo
Tampão de
eluição
Adsorvente com
molécula alvo
Adsorvente sem
molécula alvo
Fase rica em
contaminantes
Fase rica em
molécula alvo