Avaliação da viabilidade de Pantoea ananatis sob diferentes condições
ambientais.
Mayara Fernanda Ferreira de Souza (PIBIC/CNPq-UEL), Luzia Doretto
Paccola-Meirelles (Orientador), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual de Londrina/Centro de Ciências Biológicas
Palavras-chave: Mancha Branca do Milho; sobrevivência; bactérias
fitopatogênicas.
Resumo:
Pantoea ananatis, agente causal da Mancha Branca do Milho, apresenta
baixa viabilidade dependendo das condições de armazenamento. Este
trabalho teve por objetivo otimizar sua manutenção em laboratório. Foram
avaliadas três temperaturas: temperatura ambiente (20ºC á 25ºC), 2 á 3,3oC
e -20ºC e os seguintes meios de preservação: glicose 5%, fructose 5%,
sucrose 10%, lactose 7%, sodium glutamate 5%, polyethylene glycol
(0,05M), solução salina (8,6g NaCl/L água destilada), água, óleo vegetal,
glicerol (5M) e leite em pó desnatado reconstituído (10%). A avaliação da
viabilidade foi feita em intervalos de 15 dias. Os tratamentos leite em pó
desnatado reconstituído (10%) nas três temperaturas, sodium glutamate 5%
na temperatura de 2 á 3,3oC, água em temperatura ambiente e 2 á 3,3oC
(20ºC á 25ºC), fructose 5% na temperatura 2 á 3,3oC, glicose 5% em
temperatura de 2 á 3,3oC e em temperatura ambiente, lactose 7% na
temperatura de 2 á 3,3oC, e sucrose 10% na temperatura de 2 á 3,3oC,
mostraram-se muito eficazes. Para avaliar a patogenicidade, plantas da
cultivar HS200 com 97 dias de idade foram injuriadas e inoculadas com as
suspensões bacterianas conservadas durante 50 dias nos diferentes meios.
As bactérias preservadas em glicose 5% em temperatura ambiente (20ºC á
25ºC) foram mais eficientes em reproduzir os sintomas.
Introdução
O milho (Zea mays L.) é uma das culturas de maior importância no país, não
só pela extensão da área cultivada, mas por sua diversidade de utilização,
em que se destacam a alimentação animal e humana, e por seus reflexos
sócio-econômicos. A Mancha Branca do Milho é uma doença que se instalou
no país na década de 80 (FERNANDES e OLIVEIRA, 1997) e tem causado
perdas significativas na produção e qualidade do milho. A doença
caracteriza-se pelo aparecimento de lesões foliares do tipo anasarca que
posteriormente tornam-se necróticas, podendo ser circulares a elípticas
(PACCOLA-MEIRELLES et al., 1999). Em 2001 PACCOLA-MEIRELLES et
al. isolaram a bactéria Pantoea ananatis partir de lesões anasarcas de folhas
infectadas. Uma das dificuldades em se estudar a bactéria tem sido a baixa
viabilidade da mesma quando armazenada em meio de cultivo. Além da
perda da viabilidade também se observa que a bactéria perde a
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patogenicidade. Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes
meios de preservação da bactéria em diferentes temperaturas na
preservação da viabilidade e da patogenicidade da mesma.
Materiais e Métodos
Microrganismos, meios de cultura e soluções utilizados.
Foi utilizado o isolado da bactéria P. ananatis EMS05 do banco de linhagens
do Laboratório de Genética de Microrganismos da Universidade Estadual de
Londrina. Os meios de cultura utilizados foram o Tryptic Soy Broth (TSB) e
Tryptic Soy Agar (TSA) .
As soluções usadas na avaliação da manutenção da viabilidade e da
patogenicidade da bactéria estão descritas no Quadro 1.
Quadro 1: Soluções utilizadas na preservação do isolado bacteriano
sucrose
glicose
fructose
Lactose
(SUC10%) água
(GLI 5%) óleo vegetal
(FRU 5%) glicerol (GLI 5M)
(LAC7%)
sodium glutamate (GS 5%,)
polyethylene glycol (PG 0,05M)
solução salina (SL 0,86%)
leite em pó desnatado reconstituído
(10%) (LPD 10%).
As soluções foram distribuídas em frascos erlemeyers (50 mL) e
autoclavadas durante 15 min. á120oC
Métodos utilizados
O isolado bacteriano foi cultivado em meio TSB á temperatura de 30oC
durante 24 horas na ausência de luz. Uma suspensão bacteriana foi feita em
solução salina. Agitou-se em vortex e 2mL dessa suspensão, foram
inoculados em 30mL de meio TSB. O material foi incubado 24 horas a 30ºC
na ausência de luz. Após o crescimento diluiu-se 1mL da cultura em solução
salina. Diluições seriadas foram efetuadas para a determinação do número
de UFC inicial. Alíquotas de 2mL da cultura bacteriana foram inoculadas nas
soluções preservantes. Agitou-se em vortex e cada solução inoculada foi
distribuída em 45 ependorfs esterilizados (1mL/ependorf). Os ependorfs,
foram assim distribuídos: 15 mantidos em temperatura ambiente (20ºC á
25ºC), 15 mantidos de 2 á 3,3oC e 15 mantidos á -20ºC.
Avaliou-se, periodicamente em intervalos de 15 dias a viabilidade. Um
ependorf de cada tratamento foi diluído em solução salina, agitado em vortex
e plaqueado 0,1 mL em meio TSA. As placas foram incubadas durante 48
horas a 30ºC no escuro. Após esse período, era feita a contagem do número
de UFC. Foram feitas 3 repetições por tratamento.
Avaliação de patogenicidade
Após três meses, os tratamentos que apresentaram uma boa manutenção
da viabilidade bacteriana foram submetidos a uma avaliação da
patogenicidade em plantas de milho HS200 com 97 dias de idade. Foram
feitas suspensões bacterianas em solução salina. Agitou-se em vortex e 0,1
mL da suspensão foram inoculados em 2mL de meio TSB e incubado
durante 24 horas a 30ºC na ausência de luz.
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As folhas de milho cultivar HS200 foram injuriadas com espoja antes
da inoculação. As culturas bacterianas foram diluídas em solução salina
(1:1), agitadas em vortex e borrifadas nas folhas. As folhas foram
acondicionadas em câmara úmida durante 48 horas. Após o aparecimento
dos sintomas, contou-se o número de lesões resultantes de cada tratamento.
Resultados e Discussão
Alguns tratamentos mostraram-se ineficazes para manter a viabilidade das
bactérias. A avaliação aos 30 dias de preservação os tratamentos GLI (5M)
(temperatura ambiente e 2 á 3,3oC), LAC 7% (-20ºC), água (-20ºC),
inviabilizaram o crescimento bacteriano.
No entanto outros tratamentos apresentaram melhores resultados.
Mesmo depois de 5 meses as células bacterianas se mostraram viáveis
(Tabela 1). Entretanto, a pesquisa ainda não foi concluída, por esse motivo
faltam testes estatísticos. No entanto, nas tabelas abaixo mostra como foi o
desempenho das soluções mais eficientes nas duas primeiras e nas duas
ultimas avaliações realizadas.
Tabela1: Viabilidade de P. ananatis em diferentes soluções e temperaturas
Tratamentos Avaliações
Início
1ª
2ª
9ª
10ª
LPD 10% (20ºC)
SG 5% (2 á
3,3oC)
ÀGUA (20ºC
á 25ºC)
LPD
10%
(20ºC á 25ºC)
FRU 5% (2 á
3,3oC)
GLIC 5% (2 á
3,3oC)
LPD 10% (2 á
3,3oC)
GLIC
5%
(20ºC á 25ºC)
LACT 7% (2 á
3,3oC)
ÀGUA (2 á
3,3oC)
SUCR 10% (2
á 3,3oC)
3,93x105
9,63x108
14,32x1011 1,13X1010
13,53x108
14,19x109
6,84x109
4,74x1011
9,63x108
7,72x108
19x107
19,46x1011 1,13X109
1,29X106
4,63X105
3,45x109
2,73X108
8,86X105
11,91X105
9,63x108
16,83x108
1,45X108
7,02X107
2,64X108
2,16x109
9,76x107
2,56X106
6,93X104
3,83X105
3,25x109
5,26x1011
1,51X108
21,42X106 12,58X106
6,84x109
1,69x108
4,84X107
2,1X107
1,85X107
4,76x108
2,59x108
3,14X107
1,16X106
1,06X106
2,16x109
1,13x105
14,16X108 19,56X106 23,22X106
4X108
29X106
9,02x106
30,73X105
10,84X106 22,80X105
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Na avaliação da patogenicidade, os tratamentos que obtiveram
melhores resultados, comparando-se com o controle, encontram-se na
Tabela 2.
Tratamentos
FRU5% na temperatura 2 á 3,3oC
LAC 7% temperatura ambiente (20ºC á 25ºC)
LAC 7% na temperatura de 2 á 3,3oC
GLI5% em temperatura de 2 á 3,3oC
Água em temperatura ambiente (20ºC á 25ºC)
LPD (10%) em temperatura -20ºC
GLI 5% em temperatura ambiente (20ºC á 25ºC)
Controle (TSB)
Número de lesões
37
30
78
33
35
40
137
15
Conclusões
Podemos concluir que os melhores tratamentos para se manter bactéria
viável para estudos em laboratório são: LPD (10%) (temperatura ambiente,
de 2 á 3,3oC e -20ºC), SG 5% (2 á 3,3oC) , água (temperatura ambiente, 2 á
3,3oC), FRU 5% (2 á 3,3oC), GLIC 5% (temperatura ambiente, 2 á 3,3oC),
LACT 7% (2 á 3,3oC) e SUC 10% (2 á 3,3oC). Estes tratamentos
conseguiram conservar a bactéria por mais de 5 meses, mostrando-se muito
eficazes. O tratamento glicose 5% em temperatura ambiente (20ºC á 25ºC)
mostrou-se muito eficaz também em manter a patogenicidade da bactéria.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq e a Fundação Araucária, pelo suporte
financeiro e pela bolsa.
Referências
Fernandes FT, Oliveira E, 1997. Principais Doenças na Cultura do Milho.
Sete lagoas, MG. Brasil: Embrapa-Circular Técnica, 26. 80p
Paccola-Meirelles, L.D., Ferreira, A.S., Meirelles, W.F., Marriel, I.E., Casela,
C.R., 2001. Detection of a bacterium associated with a leaf spot disease of
maize in Brazil. Journal of Phytopatology, 149: 275-279.
Paccola-Meirelles LD, Casela CR, Ferreira AS, Marriel IE, Meirelles WF,
1999. Detection of a bacterium associated with a leaf spot disease of maize
in Brazil. Fitopatologia Brasileira, v. 24, p.314-315.
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