CLART STIs B
DETEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO GENÉTICA DE PATOGÉNIOS CAUSADORES DE INFEÇÕES DE
TRANSMISSÃO SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS, STIs
PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
1
CLART STIs B
Amplificação
48 determinações Ref: CS-0213-48
16 determinações Ref: CS-0213-16
CLART STIs B
Deteção
48 determinações Ref: CS-1212-48
16 determinações Ref: CS-1212-16
CLART e CLART-Strip são marcas registadas da GENOMICA
Para mais informações , consultar o web site www.genomica.com
CE
Haemophilus ducreyii é para utilização exclusiva em investigação.
GENOMICA, S.A.U.
Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Spain
Telf: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91
Versão 1
Fevereiro 2013
2
ÍNDICE:
1. QUADRO DE SÍMBOLOS
2. DESCRIÇÃO DO PROTOCOLO
3. COMPONENTES E CONSERVAÇÃO DA EMBALAGEM
3.1. Reagentes de amplificação
3.2. Reagentes de visualização
3.3. Outros componentes
4. MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
4.1. Reagentes e materiais
4.2. Equipamento
5. RECOMENDAÇÕES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULAÇÃO
5.1. Recomendações gerais
5.2. Precauções para a extração e a adição do material extraído no tubo de amplificação
5.3. Precauções para a visualização
6. AMOSTRAS
7. PROTOCOLO DE TRABALHO
7.1. Extração automática do material genético.
7.2. Reação de amplificação
7.3. Visualização do produto amplificado
8. LEITURA DOS RESULTADOS
9. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE FUNCIONAMENTO
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
3
1.-QUADRO DE SÍMBOLOS
Consulte por favor as instruções de utilização
Prazo de validade
Dispositivo para Diagnóstico In Vitro
Lote
25ºC
Conservar à temperatura ambiente
20ºC
8ºC
Conservar entre 4º C e 8º C
4ºC
-18ºC
Conservar entre –30º C e –18º C
- 30ºC
4
2.-DESCRIÇÃO DO PROTOCOLO
O CLART STIs B deteta a presença dos microrganismos causadores de infecções sexualmente
transmissíveis em amostras clínicas (zaragatoas).
Os microrganismos detetados são os seguintes:
•
•
•
•
•
•
Ureaplasma urealyticum y parvum
Mycoplasma hominis
Candida:
o Candida albicans
o Candida glabrata
o Candida parapsilosis
o Candida krusei.
o Candida tropicalis.
o Candida guilliermondii.
o Candida dubliniensis.
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi.
Herpes simples tipo 1 e tipo 2
A deteção é efetuada através da amplificação de um fragmento específico para cada
microrganismo cujo tamanho oscile entre 100 e 550 pares de bases.
Para evitar os falsos negativos, o tubo de PCR contém um controlo interno de amplificação que
assegura o bom funcionamento do tubo, e um controlo de extração do ADN genómico da amostra,
que assegura que o material genético foi isolado durante o processo de extração.
A deteção do produto amplificado por PCR é efetuada através da uma plataforma tecnológica
baseada em microarrays de baixa densidade: CLART® (Clinical Array Technology). A plataforma
baseia-se num principio muito simples e eficiente que consiste em incluir um microarray no fundo
do poço da placa de microtitulação (CLART® Strip-CS) (Figura 1), o que simplifica todo o processo
de hibridização e visualização em relação aos sistemas de microarrays clássicos.
5
Figura 1. Plataforma CLART® Strip-CS em forma de tira de 8 poços.
O sistema de deteção CLART STIs B baseia-se na precipitação de um produto insolúvel
naquelas zonas do microarray onde se produz a hibridização dos produtos amplificados com as
sondas específicas. Durante a PCR, os produtos amplificados são marcados com biotina. Após a
amplificação, estes produtos hibridizam com sondas específicas que estão imobilizadas em locais
conhecidos e concretos do microarray, após o qual são incubados com o conjugado de
estreptavidina-peroxidase. O conjugado liga-se através da estreptavidina com a biotina presente
nos produtos amplificados (que também se encontram ligados às suas sondas específicas) e
atividade peroxidase provoca o aparecimento de um produto insolúvel que na presença do
substrato o-dianisidina, precipita nos locais do microarray onde ocorre a hibridização (Figura 2).
Produto marcado
Sondas sobre a array
biotina
Hibridização
Conjugado
Incubação
Com o conjugado
Reação de revelação
Precipitação
do sustrato
Figura 2: Esquema do método de visualização. As sondas, imobilizadas sobre a superfície, capturam os
seus produtos amplificados complementares marcados com biotina. Através da biotina, liga-se ao
conjugado, neste caso estreptavidina-HRP (peroxidase de rábano, HorseRadish Peroxidase). O
substrato o-dianisidina através da ação da HRP, produz um precipitado sobre o local de hibridização.
3.-COMPONENTES E CONSERVAÇÃO DA EMBALAGEM
O dispositivo CLART STIs B contém reagentes suficientes para a análise de 16 ou 48
amostras clínicas. Os reagentes incluídos na embalagem estão agrupados em várias caixas,
6
dependendo da temperatura na qual se devem conservar. Todos os reagentes são estáveis nas
condições indicadas de conservação até ao prazo de validade da embalagem.
3.1. Reagentes de amplificação
São expedidos e conservados a -20º C.
•
Tubos de Amplificação prontos a usar. Contêm 45 µl de mistura de reação.
Descongelar apenas o número preciso de tubos de amplificação que se irão
processar nesse momento e conservar os restantes a -20º C.
São expedidos dois tipos de tubos de amplificação:
-Mix1: Tubo verde. Indicado para amostras de zaragatoas. Amplificação de Candida,
Treponema pallidum, HSV-1, HSV-2, Mycoplasma hominis e Haemophilus ducreyii.
Também inclui a amplificação de um controlo de amplificação e de extração.
-Mix2: Tubo azul. Indicado exclusivamente para amostras de zaragatoas uretrais.
Amplificação de Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum. Também se inclui a
amplificação de um controlo de amplificação e de extração.
As amostras serão analisadas nos dois tubos ou independentemente consoante o tipo de
amostra e a exigência clínica.
Na embalagem do dispositivo inclui-se um indicador adesivo e irreversível de
temperatura; o aparecimento de uma cor vermelha na janela de visualização indica que
em algum momento os produtos ultrapassaram a temperatura de conservação de –20o C
e não devem utilizar-se.
3.2. Reagentes de visualização
O dispositivo de visualização é expedido a 4º C.
ADVERTÊNCIA!: Após receber a embalagem, as tiras CLART® Strips (CS) devem ser
conservadas à temperatura ambiente.
•
•
•
•
•
•
•
Tiras CS (incluindo as sondas específicas). São fornecidas num envelope térmico
selado. Conservar sempre fechado (máx. 25º C), à temperatura ambiente e
protegido da luz.
SH (Solução de Hibridização). Conservar a 4º C
DC (Diluente de Conjugado). Conservar a 4º C.
CJ (Conjugado). Conservar a 4º C.
RE (Solução de Revelação). Conservar a 4º C e protegido da luz.
TL (Tampão de Lavagem). Conservar a 4º C.
Suporte e tampa para tiras de 8 poços.
7
3.3 Outros
utros componentes
Para a captura e posterior processamento da imagem
image são
ão necessários os seguintes
componentes:
•
linical Array Reader): permite a leitura
itura e interpretação
interpretaç automática até 12
Leitor CAR (Clinical
tiras de arrays CS, isto é, até um máximo de 96 amostras. É fabricado e distribuído
pela GENOMICA para ser utilizado exclusivamente com os dispositivos de diagnóstico.
diagn
•
Adaptador metálico que se coloca sobre o suporte do CAR, sobre o qual se junta a
placa antes da leitura.
leitura
•
SAICLART®:: software desenvolvido pela GENOMICA para o processamento de
imagens.
•
Software específico do
d dispositivo CLART STIs B concebido e validado pela
GENOMICA.
CAR
(Clinical Array Reader)
4.
MATERIAIS
IS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
Encontra-se
se abaixo a lista de materiais necessários
necessários mas não fornecidos.
fornecidos
4.1. Reagentes
gentes e materiais
- Água destilada.
destilada
- Luvas descartáveis.
descartáveis
- Pontas
ontas de pipeta com filtro ou pipetas de deslocação
ão positiva.
positiva
- Recipiente com
co gelo picado.
8
- Tubos tipo eppendorf de 1,5 ml autoclavados.
- Grelhas para tubos de 1,5 ml.
- Suporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.
- Solução salina (0.9% NaCl).
4.2. Equipamentos
- Microcentrífuga.
- Termociclador.
- Câmara de fluxo laminar para o laboratorio de extração.
- Três micropipetas ajustáveis entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl para o
laboratório de pre-PCR.
- Uma micropipeta ajustável entre 1-20 µl, para adicionar o material
genético aos tubos de amplificação.
- Três micropipetas ajustáveis entre 1-20 µl , 20-200 µl e 200-1000 µl para o
laboratório de pós-PCR.
- Termobloco com agitação ajustável a 25°C, 30°C e 59º C. Compatível com
placas de 96 poços.
- Vórtex.
- Sistema de vácuo.
5.- RECOMENDAÇÕES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULAÇÃO
Muito importante para evitar contaminações!. Ler cuidadosamente antes de iniciar a
técnica.
5.1. Recomendações gerais
1. A técnica deve efetuar-se em duas áreas separadas fisicamente, para evitar a
contaminação das amostras com o produto anteriormente amplificado. Cada uma das
áreas deve ter o seu próprio material de trabalho identificado (pipetas, pontas, tubos,
grelhas, luvas, etc.) e nunca devem ser utilizadas fora destas áreas.
1. Área pre-PCR: Nesta área é efetuada a preparação das amostras, a extracção
do ADN e a adição do material extraído aos tubos de amplificação. A
manipulação das amostras deve efetuar-se numa câmara de fluxo laminar.
2. Área pós-PCR: Nesta área é efetuada a amplificação e a visualização do
produto amplificado. O material desta área nunca deve entrar em contacto com
a área de extração. Evitar ir para a área de pre-PCR após ter estado a trabalhar
na área de visualização.
2. Utilizar sempre luvas. É aconselhado substituir as luvas com uma determinada
frequência e obrigatoriamente de cada vez que começar a trabalhar nas áreas
9
anteriormente descritas. Deve-se sempre utilizar novas luvas quando se adiciona o ADN
aos tubos de amplificação.
3. Limpar as zonas de trabalho (bancadas de laboratório, câmaras de fluxo laminar,
grelhas, pipetas) em profundidade com lixívia diluída a 10% a seguir a cada
processamento de amostras, e obrigatoriamente desinfetar as áreas de trabalho em caso
de contaminação. É aconselhado limpar o termociclador e o termomixer, antes e depois
da sua utilização, nas mesmas condições.
4. Utilizar sempre pontas com filtro e pipetas de deslocação positiva para evitar
contaminações devidas à micropipeta. Deve ser utilizado um conjunto de pipetas em cada
área.
5. Utilizar material de laboratório autoclavável e descartável.
6. Nunca misturar reagentes de dois tubos diferentes, mesmo que pertençam ao mesmo
lote.
7. Fechar os tubos de reagentes imediatamente após utilização para evitar contaminações.
8. Eliminar a ponta da micropipeta após pipetagem.
9. A GENOMICA não pode ser considerada responsável pelos resultados obtidos com este
dispositivo se forem utilizadas outras amostras que não as indicadas.
5.2. Precauções para a extração e a adição do material extraído aos tubos de
amplificação.
•
•
•
•
Utilizar sempre luvas.
Limpar as superfícies de trabalho das câmaras de fluxo laminar com lixívia diluída a
10%.
Ligar a câmara de fluxo laminar e a luz UV, pelo menos, 20 minutos antes de iniciar
a extração. Apagar a luz UV quando se está a trabalhar dentro da câmara.
A preparação das amostras antes da sua extração, deve efetuar-se dentro da
câmara de fluxo laminar.
5.3 Precauções para a visualização
1. Evite que a ponta da pipeta ou do sistema de vácuo toque no fundo do poço, uma vez
que tal poderá danificar o microarray que se encontra no fundo/poço.
2. Aconselha-se a adicionar todas as soluções às paredes do poço CS, nunca diretamente
ao fundo.
3. É conveniente não adicionar a solução SH até à adição de produtos desneutralizados de
PCR.
10
4. O array não deve permanecer seco.
5. Após a incubação com a solução CJ, é muito importante lavar bem o microarray para
evitar que caíam resíduos deste, os quais podem reagir com a solução RE, produzindo um
precipitado inespecífico que pode levar a falsa interpretação do resultado.
6. Evitar as bolhas da superfície do microarray ao adicionar qualquer solução.
7. Ao visualizar a imagem no leitor, confirmar que aparecem os marcadores de posição e
que não há bolhas de ar ou manchas que interfiram na leitura. Caso contrário, limpar o
fundo do poço com um papel de celulose impregnado de álcool.
6. AMOSTRAS:
O dispositivo CLARTSTIs B foi desenhado e validado para ser utilizado com amostras de
zaragatoas (vaginais, cervicais, uretrais, anais e faríngeas). A GENOMICA não poderá ser
considerada responsável por quaisquer resultados com outro tipo de amostras.
Conservar as amostras a 4º C sempre que se queiram processar num tempo inferior a 48h.
Caso contrário, devem permanecer congeladas a -20º C.
7. PROTOCOLO DE TRABALHO
7.1. Extração automática em NucliSENSTM EasyMag DNA da Biomerieux
•
Para as amostras de zaragatoa, se o meio de conservação for líquido, colher 1 ml para
a extração do ADN. Se for conservado em meio seco, adicionar 1,5 ml de solução
salina (0,9% de cloreto de sódio), agitar vigorosamente num vortex durante 1 minuto.
Colher 1 ml para a extração do ADN e transferi-lo para o extrator.
•
Para cada série de amostras a analisar, incluir um controlo negativo de extração (0,9%
de solução salina) para verificar que as amostras não foram contaminadas durante a
extração, amplificação e visualização; o que poderia levar a um resultado falso
positivo.
•
Efetuar no equipamento EasyMag DNA uma lise interna e extração, em conformidade
com as instruções do fabricante descritas no manual do equipamento de extracção
automática. O volume de eluição deve ser de 25 µl.
Se for utilizado outro sistema de extração, o volume de eluição deve ser otimizado no
intervalo de 20-30 µl.
7.2. Reação de amplificação
Recomendações específicas para a amplificação:
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• Trabalhar na área pre-PCR, utilizando sempre a câmara de fluxo laminar e
seguindo as recomendações do ponto 5.1.
• Adicionar o ADN, utilizando sempre a câmara de fluxo laminar e seguindo as
recomendações do ponto 5.1. Durante o processo manter os tubos separados e em
gelo.
1. Descongelar os tubos de amplificação necessários de acordo com os microrganismos
que se querem detetar.
2. Centrifugar os tubos de amplificação durante uns segundos para que todo o líquido
chegue ao fundo dos tubos (se não tiver adaptadores de microcentrífuga, podem
utilizar-se tubos maiores depois de lhes ter retirado a tampa).
3. Adicionar 5 µl do ADN extraído das amostras ao tubo de amplificação Mix 1 e/ou Mix 2 e
misturar várias vezes com a micropipeta. Deixar os tubos no gelo.
4. Programar no termociclador os seguintes ciclos de temperatura:
1 ciclo
45 ciclos:
1 ciclo
95ºC 15 min
95ºC 30 seg
63ºC 60 seg
72ºC 60 seg
72ºC 10 min
5. Iniciar o programa e colocar os tubos de amplificação no termociclador quando no
bloco tiver excedido os 90º C. Deste modo, minimizam-se as possíveis amplificações
inespecíficas devidas a incubação abaixo da temperatura de hibridização.
7.3. Visualização do produto amplificado em CLART® Strip (CS)
Recomendações específicas antes de iniciar a visualização:
O PROTOCOLO DESCRITO DEVE SER SEMPRE UTILIZADO NA ÁREA PÓS-PCR. NUNCA LEVAR
O PRODUTO AMPLIFICADO PARA A ÁREA DE PRE-PCR.
1. Ligar o CAR (Clinical Arrays Reader) antes de iniciar o processo. A autocalibração do
equipamento leva alguns minutos e é também necessário introduzir o número das
amostras de cada poço no programa antes da leitura.
2. Assegurar-se de que antes de iniciar a hibridização no termomixer das placas atingiu
os 56º C durante, pelo menos, 1 hora.
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3. Aquecer a SH (solução de hibridização) à temperatura ambiente.
4. PREPARAR A SOLUÇÃO DE LAVAGEM ANTES DE CADA ANÁLISE, NÃO REUTILIZAR
SOLUÇÕES PREPARADAS ANTERIORMENTE OU RESÍDUOS.
5. Utilizar uma ponta com filtro diferente para cada poço e substituí-la de cada vez que
adicionar um reagente.
6. No caso de utilizar bombas de vácuo equipadas com pentes de 8 pontas para aspirar
as soluções, eliminar os pentes após cada utilização ou descontaminá-los com uma
solução de lixívia diluída a 10% após cada análise. Garantir que a bomba aspira
adequadamente e que não deixa resíduos no fundo do poço.
7. Aspirar completamente as diferentes soluções dentro dos poços sem tocar na array.
VISUALIZAÇÃO:
1. Desnaturação: Colocar os tubos amplificados no termocilador quando este tiver alcançado
os 95º C e incubar os tubos durante 10 minutos. Não ultrapassar os 10 min para evitar
que os tubos se abram e que possa ocorrer a contaminação.
Retirar os tubos da incubação a 95º C e colocá-los imediatamente num recipiente com
gelo.
2. Preparação da Solução TL diluída:
Para cada tira CS (8 poços no total), preparar 10 ml de solução de lavagem diluída,
adicionando 1 ml de Solução TL a 9 ml de água destilada, agitar suavemente.
3. Pré-lavagem das CS: antes de iniciar a análise é necessário lavar as CS adicionando 200 µl
de Solução TL diluída a cada poço. Misturar 10 a 15 vezes com a pipeta multicanal, tendo
em conta que não se deve tocar na superfície do array. É recomendado efetuar uma
lavagem enquanto as amostras amplificadas estão a ser desnaturadas e mantêm a
solução de lavagem nos poços até as amostras serem adicionadas aos mesmos. Eliminar
a Solução TL diluída com a pipeta ou preferencialmente com a bomba de vácuo.
O array deve ficar isento de resíduos de solução, mas nunca deve ficar seco. Adicionar a
solução seguinte imediatamente.
4. Hibridização: Antes de utilizar a Solução SH, aquecê-la a 56ºC até desaparecerem os
cristais. Após os produtos PCR terem sido desnaturados, adicionar 100 µl de solução SH
(evitar que se forme espuma) a cada poço das CS. Adicionar a cada poço 5 µl de produto
de PCR desnaturado do tubo de amplificação Mix 1 e/ou Mix 2 que se tenha utilizado por
amostra.
Misturar varias vezes para que se misture com a solução de hibridização SH, com cuidado
de não tocar no fundo do poço. Recomenda-se introduzir cada tira de forma independente
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e separada do resto para evitar as contaminações. Incubar a tira coberta com a tampa de
plástico transparente no termomixer de placa tapado durante 1 hora a 56º C, agitando a
550 rpm.
Após esta incubação, retirar a placa e eliminar a Solução SH das CS com a pipeta ou bomba
de vácuo: O array deve ficar isento de soluções. Adicionar a solução seguinte
imediatamente. Deixa-se o termomixer da placa programado a 30º C para posterior
utilização na etapa 6. Pode retirar-se a tampa para que a temperatura baixa mais
rapidamente.
5. Dupla lavagem: adicionar 200 µl de Solução TL diluída a cada poço do CS, misturar 10 a 15
vezes com a pipeta multicanal. Eliminar a Solução TL diluída com pipeta ou
preferencialmente com a bomba de vácuo multicanal sem deixar resíduos. Repetir a
operação. Esta etapa deve efetuar-se com pontas diferentes para cada poço em ambas
as lavagens. Se ao chegar a esta etapa, o termomixer não tiver atingido os 30º C, deixamse os poços com esta solução até que o termomixer atinja a temperatura.
6. Bloqueio e conjugado: é recomendado centrifugar a solução CJ durante 10 segundos antes
de utilizá-la. Em seguida, preparar a solução CJ diluída como segue: Para cada tira CS,
adiciona-se 1 ml de solução DC e 7,5 µl de Solução CJ.
Eliminar a Solução TL diluída sem deixar resíduos de solução e adicionar a cada poço da CS
100 µl de Solução CJ diluída. Incubar durante 15 minutos exatos no termomixer da placa a
30º C, agitando a 550 rpm. Após esta incubação, retirar a placa e eliminar a solução
rapidamente com pipeta ou bomba de vácuo multicanal. (Deixar programado o
termomixer da placa a 25º C para utilização posterior na etapa 8. Pode retirar-se a tampa
para que baixe mais rapidamente a temperatura).
7. Tripla Lavagem: adicionar imediatamente 200 µl de Solução TL diluída a cada poço da CS,
misturar 10 a 15 vezes com a pipeta multicanal e eliminar completamente a solução com a
pipeta de vácuo. Repetir a operação mais duas vezes.
É muito importante evitar resíduos da Solução CJ, uma vez que podem reagir com a
Solução RE originando um sinal inespecífico.
8. Revelação com Solução RE: remover a solução TL diluída completamente e adicionar 100
µl de solução RE a cada poço da CS e incubar 10 minutos a 25º C no termomixer sem
agitação.
Advertência! É muito importante utilizar o termomixer sem agitação
9. Eliminar a Solução RE completamente com a pipeta de vácuo. O array deve permanecer
seco.
10. CAR (Clinical Array Reader): Colocar o adaptador no CAR e a placa em cima. Depois da
bandeja estar fechada, a leitura é automaticamente efetuada.
14
8. LEITURA DOS RESULTADOS
O processamento dos dados obtidos a partir de cada uma das análises, efetua-se de forma
automática. O equipamento de leitura e análise irá fornecer um relatório com indicação
dos resultados.
O monitor apresenta um quadro com duas colunas, na coluna da esquerda apresentam-se
as espécies que se encontram caracterizadas no array. Na coluna da direita, o resultado
analítico: positivo, negativo, não conclusivo, sem ADN ou não analisado.
9. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Um dos inconvenientes da deteção por amplificação genómica são os falsos negativos
devidos, a uma qualidade inadequada do ADN extraído da amostra (por colheita
insuficiente da amostra, por degradação do ADN devido a uma conservação incorreta, ou
por perda do ADN da amostra durante a sua extração), ou pela presença de inibidores do
ADN polimerase nas amostras em que se pretende analisar a presença do microrganismo
(hemoglobina, sais, etc).
Com o dispositivo CLART® STIs B eliminaram-se estes falsos negativos adicionando a cada
tubo de amplificação um controlo interno diferente, indicativo da eficiência da reação de
amplificação. Também está incluído em cada tubo um controlo de extracção diferente
para detetar falsos negativos devido a falhas na extração.
Em cada conjunto de análises, um controlo de extração negativo deve ser incluído para
verificar que as amostras não foram contaminadas durante a extracção, amplificação e
visualização; o que poderia provocar um falso positivo.
Cada tubo de amplificação contém os seguintes oligonucleótidos:
Mix 1
• Um par de oligonucleótidos que amplificam um fragmento do gene β-globina
humano como controlo de extração do ADN do paciente.
• Um par de oligonucleótidos que amplificam um plasmídeo modificado incluído no
tubo de amplificação e que se utiliza como controlo da amplificação da reacção de
PCR. Este plasmídeo é diferente do que foi incluído no tubo de mix 2.
• Oligonucleótidos específicos para os alvos dos patogénicos a detetar.
Mix 2:
• Um par de oligonucleótidos que amplificam um fragmento do gene β-actina
humano como controlo de extração do ADN do paciente.
• Um par de oligonucleótidos que amplificam um plasmídeo modificado incluído no
15
tubo de amplificação e que se utiliza como controlo de amplificação da reacção de
PCR. Este plasmídeo é diferente dos incluídos nos tubos de mix 1.
• Oligonucleótidos específicos para os alvos patogénicos a detetar.
O tubo de PCR foi concebido de modo a favorecer a amplificação dos microrganismos em
relação a outros dois controlos (de extracção e amplificação). Entre estes dois controlos, a
amplificação do ADN genómico será efetuada preferencialmente por comparação com o
controlo de reação de amplificação.
Este design deve-se a:
O controlo de extração é necessário para a confirmação de um verdadeiro resultado
negativo, visto que dá a informação da presença do ADN do paciente na amostra, mesmo
que não tenha havido amplificação de nenhum patogénico.
O controlo interno de amplificação só será essencial quando não for encontrada nenhuma
amplificação no tubo, porque irá ajudar a distinguir entre um PCR inibido e uma amostra
onde não está presente o ADN.
Há duas possibilidades que podem levar a um resultado INVÁLIDO:
•
Não se processou o Mix.
•
Ausência de amplificação: Pode dever-se a:
o
Presença de inibidores na amostra, em cujo caso se deverá repetir todo o
processo desde a extração.
o
Falha no tubo de amplificação, em cujo caso se deverá repetir todo o proceso
desde a amplificação
Existem duas possibilidades que dão lugar a um resultado NÃO CONCLUSIVO, em cujo
caso se deverá repetir todo o processo desde a visualização:
•
Nos casos em que as réplicas de uma sonda do array sejam muito distintas entre si.
•
Quando a intensidade do sinal de absorvência não normalizada se encontre no limite
de deteção da técnica, cujo intervalo foi estabelecido pelo programa para cada tipo de
microrganismo.
10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE FUNCIONAMENTO
10.1 Controlo de interferências conhecidas:
16
Um dos inconvenientes da deteção por amplificação genómica são os falsos negativos
devidos a, uma qualidade inadequada do ADN extraído (por quantidade insuficiente da
amostra, degradação do ADN, perda do ADN, conservação incorreta), ou à presença de
inibidores do ADN polimerase nas amostras a processar (álcool, sais, etc.). Para evitar
estas interferências, devem seguir-se as indicações dos pontos 5, 6 e 7 deste folheto
informativo.
10.2 Especificações técnicas:
Parâmetros Analíticos:
•
Sensibilidade analítica. A sensibilidade analítica determinou-se através da
amplificação de diluições em série do ADN de plasmídeos recombinantes para
cada um dos microrganismos detetados no dispositivo. Cada um destes continha
o produto amplificado (incluindo a parte complementar às sondas específicas de
deteção) do ADN genómico de estirpes tipo de coleção. A visualização efetuou-se
em CS e deu os seguintes resultados (Quadro 1):
Microrganismo
Cópias/5 ul
Candida krusei
Ureaplasma urealyticum
Candida albicans
Candida glabrata
105
103
HSV-1
HSV-2
Mycoplasma hominis
Ureaplasma parvum
Treponema pallidum
102
10
Quadro 1. Relação do número de cópias de plasmídeo recombinante necessárias para obter uma
sensibilidade de 100% na deteção da cada um dos microrganismos.
•
Especificidade analítica. Foram efetuadas experiências de especificidade com
todos os plasmídeos recombinantes, observando-se que não se produz deteção
inespecífica de outros microrganismos diferentes dos que se querem determinar.
Assim, considera-se que a técnica alcança uma especificidade analítica de 100%.
Parâmetros de utilidade diagnóstica:
Para determinar os parâmetros diagnósticos do dispositivo, realizou-se uma avaliação
comparativa da técnica CLART STIs B com as técnicas de referência de cultura e/ou
PCR. Para esta avaliação, colaborou-se com os seguintes laboratórios:
•
Departamento de Microbiologia, Hospital Universitario Germans Trias i Pujol,
Badalona, Espanha.
17
•
•
•
•
Centro Médico OpenHouse, Madrid, Espanha.
Hospital Monte Naranco, Oviedo, Espanha.
Centro Sanitario Sandoval, Madrid, Espanha.
Hospital Virgen de la Macarena, Sevilha, Espanha.
A presença de cada um dos microrganismos que foram detetados com o dispositivo foi
analisada a partir de material genético de amostras colhidas com zaragatoas. Foi analisado
um total de 277 zaragatoas com a mix1 e 18 zaragatoas com a mix2. Os microrganismos
analisados aparecem descritos na Tabela 2.
Para cada amostra, o resultado foi considerado verdadeiro quando houve concordância
entre a técnica de referência e CLART® STIs B. As discordâncias entre ambas as técnicas,
resolveram-se da seguinte forma:
- Resultado positivo pela técnica de referência e negativo por CLART® STIs B: a técnica
de referência foi considerada com os dados corretos e considerada falsa negativa
para CLART® STIs B.
- Resultado negativo pela técnica de referencia e positivo por CLART® STIs B: a
discrepância será discutida por Nested-PCR específica e sequenciação. O resultado
obtido é o que se considera como verdadeiro.
Quadro 2. Parâmetros de diagnóstico de sensibilidade e especificidade para o dispositivo CLART®
STIs B para amostras de zaragatoas
N amostras Mix 1
= 277*
Mycoplasma
hominis
Candida albicans
Candida glabrata
Candida
parapsilosis
Total Candida
Treponema
pallidum
Trichomonas
vaginalis
HSV-1
HSV-2
VP
VN
FP
FN
Sensibilidade
(%)
Especificidade
(%)
VPP
(%)
VPN
(%)
53
223
0
1
98.1
100
100
99.6
**
100
30
171
246
0
0
6
**
1
94.3
96.8
100
100
100
100
96.6
99.6
6
271
0
0
100
100
100
100
**
95.1
100
100
95
136
134
0
5
272
0
0
100
100
100
100
53
223
0
1
98.1
100
100
99.6
258
266
0
0
**
1
0
94.7
100
100
100
100
100
99.6
100
VN
FP
FN
Sensibilidade
(%)
Especificidade
(%)
VPP
(%)
VPN
(%)
16
0
0
100
100
100
100
11
0
0
100
100
100
100
18
11
N amostras Mix 2
VP
= 18**
Ureaplasma
2
urealyticum
Ureaplasma
7
parvum
VP: Verdadeiro positivo
VN: Verdadeiro negativo
7
18
FP: Falso positivo
FN: Falso negativo
VPP: Valor preditivo positivo
VPN: Valor preditivo negativo
* O número de amostras analisadas não coincide com o número de microrganismos analisados, visto que
nestas 277 (Mix 1) ou 18 (Mix 2) havia algumas amostras negativas, amostras com mono-infeção e amostras
com co-infeção.
** Não foi possível confirmar a presença do microrganismo na amostra com Nested-PCR e/ou PCR
específica.
NOTA: Devido à fraca prevalência não se contaram amostras positivas para os seguintes
microrganismos: Candia krusei, Candida tropicalis, Candida guilliermondii, Candida dubliniensis e
Haemophilus ducreyii. Por essa razão, não foi possível identificar a sensibilidade diagnóstica do
dispositivo para estes patogénicos.
No caso de Candida krusei, foi dada evidência de sensibilidade analítica.
Para as Cândidas (C. tropicalis, C. guillermondii e C. dubliniensis) foram testados os oligos e sondas
com ADNs obtidos de uma única amostra positiva, confirmando-se a correta determinação.
No caso de Haemophilus ducreyii, não se pôde analisar os parâmetros de diagnóstico, dada a
impossibilidade de conseguir um ADN deste microrganismo.
Especificidade diagnóstica.
A técnica foi validade com amostras de zaragatoas tanto negativas como positivas para outros
microrganismos não contemplados no dispositivo, e os resultados demonstraram não haver
reação cruzada.
Repetibilidade e reprodutibilidade diagnóstica.
A reprodutibilidade e repetibilidade diagnóstica foi processada desde a extração da amostra até à
visualização em CS.
%
95.1
97.1
Repetibilidade (n=41)
Reprodutibilidade (n=46)
19
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. “Gardnerella, Trichomonas vaginalis, Candida, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma
hominis and Ureaplasma urealyticum in the genital discharge of symptomatic fertile and
asymptomatic infertile women”. Erminia Casari, Antonella Ferrario, Emanuela Morenghi,
Alessandro Montanelli. New Microbiologica, 33, 69-76, 2010.
2. “Global strategy for the prevention and control of sexually transmitted infections: 2006 2015 : breaking the chain of transmission”. WHO
3. “Sexually Transmitted Diseases in the United States, 2008 National Surveillance Data for
Chlamydia, Gonorrhea, and Syphilis” CDC.
4. “Persistent increase in the incidence of acute male urethritis diagnosed in general
practices in France”. Véronique Massari, Yves Dorléans and Antoine Flahault. British
Journal of General Practice 2006; 56: 110–114.
5. “Mycoplasma genitalium presence, resistance and epidemiology in Greenland” Dionne C.
Gesink, Gert Mulvad, Ruth Montgomery-Andersen, Upaluk Poppel, Stephan MontgomeryAndersen, Aka Binzer, Lee Vernich, Gillian Frosst, Flemming Stenz, Elizabeth Rink, Ove
Rosing Olsen, Anders Koch and Jørgen Skov Jensen. Int J Circumpolar Health 2012, 71:
18203
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