HILDA IRENE GENTIL BASTOS
ESTUDO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS DE
DIFERENTES SOLUÇÕES UTILIZADAS COMO
CONSERVANTES EM AVULSÃO DENTÁRIA:
UMA ANÁLISE IN VITRO
2008
Mestrado em Odontologia
Av. Alfredo Baltazar da Silveira 580 cobertura
22790-710 - Rio de Janeiro, RJ
Tels.: (0xx21) 2199-2200 ramal:2204
HILDA IRENE GENTIL BASTOS
ESTUDO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS DE DIFERENTES SOLUÇÕES
UTILIZADAS COMO CONSERVANTES EM AVULSÃO DENTÁRIA: UMA
ANÁLISE IN VITRO
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia da Universidade Estácio
de Sá visando a obtenção do grau de
Mestre em Odontologia (Endodontia).
ORIENTADOR:
Prof. Dr. Gláucio Diré Feliciano
UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ
RIO DE JANEIRO
2008
DEDICATÓRIA
Este trabalho é dedicado ao meu Deus.
Ao meu Deus e Senhor da minha vida,
a Ti que és meu refúgio em horas difíceis,
sua fidelidade é o meu escudo e sei
que estás comigo em todos os momentos.
A Ti dedico toda a minha vida.
Faça de mim um instrumento para
sua obra e para a sua glória.
Amém.
ii
AGRADECIMENTOS
A Jesus Cristo, único Senhor e Salvador da minha vida.
Aos meus pais, Ricardo e Vera, pelo apoio e pelo amor e por terem
tornado tudo possível.
Ao meu amor, Gustavo, por suportar todas as minhas angústias, pelo
seu carinho e amor incondicional sempre, pelo seu colo e seu abraço nos
momentos que preciso, por me ajudar a caminhar os caminhos do Senhor e por
ser como é.
Ao professor e grande exemplo, Gláucio Diré, por ter sido meu
orientador no sentido real da palavra, a este gênio que tive o prazer de
conhecer agradeço por sempre ter me atendido tão prontamente, por ter feito o
possível e impossível para me ajudar, por ter agido como um anjo em
momentos difíceis e por ter me passado um pouco de seu vasto conhecimento.
Aos meus sogros, Edson e Creyse, e às minhas cunhadas, Louise e
Débora por serem minha segunda família, participando das derrotas e das
vitórias da minha vida me apoiando.
Aos meus parentes especiais que tanto ajudam e participam e
participaram da minha vida (Obrigada Ricardinho, Tia Luzia, Cátia, Tio Valdo,
iii
Vô Benedicto e Vó Irene e In memoriam, Vô Zezé e Vó Hilda, Tia Floripes e
Lucy e os demais).
Aos professores e amigos da Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro, Ronald Bastos Freire, Hélcio Borba, Cleide, Aline, obrigada por terem
tornado possível o meu trabalho e por todo o apoio e material cedido.
Aos colegas do Mestrado por terem se tornado verdadeiros amigos.
A equipe do Mestrado, professores e em especial ao Professor Hélio
Pereira Lopes, grande fonte de conhecimento, e à Angélica, por terem me
ajudado a crescer como profissional.
A Dra. Helena Rosa Campos Rabang por ter me ensinado tanto já na
especialização e participado de modo efetivo na minha formação profissional.
Aos amigos por escutarem os lamentos e comemorarem as vitórias
(Obrigada Meg, Poli e os demais).
iv
ÍNDICE
Resumo:..............................................................................................................vi
Abstract:.............................................................................................................vii
Lista de Figuras:................................................................................................viii
Introdução:.........................................................................................................11
Revisão de Literatura:........................................................................................13
Proposição:........................................................................................................36
Materiais e Métodos:..........................................................................................37
Resultados:........................................................................................................41
Discussão:.........................................................................................................51
Conclusões:.......................................................................................................60
Referências Bibliográficas:................................................................................61
Anexos:..............................................................................................................72
v
RESUMO
O tratamento recomendado em avulsão dentária é o reimplante dentário
imediato e quando isto não for possível, deve-se colocá-lo em uma solução
conservadora capaz de manter a viabilidade das células do ligamento
periodontal e restabelecer a fisiologia do mesmo que é de fundamental
importância para um prognóstico favorável. O meio de conservação ideal deve
ser de fácil disponibilidade no momento do acidente, deve possuir pH e
osmolaridade adequados e deve ainda ser capaz de manter a vitalidade e
correto funcionamento celular com o mínimo de toxicidade bem como ser
capaz de evitar a presença e proliferação de microorganismos. Dentre os
diversos meios que têm sido utilizados com sucesso encontramos a solução
salina balanceada de Hank, o leite e o própolis. O presente trabalho tem como
objetivo avaliar quantitativamente e qualitativamente os efeitos citotóxicos de
soluções conservantes, entre elas o própolis, água de coco, leite de coco,
HBSS, solução fisiológica com antibióticos e leite, utilizadas em casos de
avulsão dentária através da observação microscópica de alterações celulares
sofridas em macrófagos. Neste estudo, a exposição dos macrófagos aos meios
conservantes utilizados para avulsão dentária, possibilitou a partir da análise
em microscopia de luz, avaliar a citotoxicidade, a partir do comportamento
apoptótico das células submetidas aos referentes meios. A partir da análise dos
resultados obtidos, podemos sugerir que o leite de coco pode ser considerado
o melhor meio a ser utilizado como conservante em caso de avulsão dentária.
Palavras-chave: leite de coco, macrófagos, avulsão dentária.
vi
ABSTRACT
In case of dental avulsion the recommended treatment avulsion is an
immediate reimplant. Yet when this is not possible, the tooth must be placed in
a storage media capable of maintaining the viability of the cells of the
periodontal ligament and restore their physiology, what is extremely important
for a favorable prognosis. The ideal storage media should be readily available
at the time of the accident, it must have an adequate pH and osmolality and
should still be able to maintain the vitality and the proper functioning of the cell
with minimal toxicity and be able to avoid the presence and proliferation of
microorganisms. Among the various medias that have been successfully used,
we may find HBSS, milk and propolis. This study aims to assess quantitatively
and qualitatively the cytotoxic effects of storage medias, including propolis,
coconut water, coconut milk, HBSS, saline with antibiotics and milk, used in
cases of tooth avulsion through the microscopic observation of the cellular
changes occurred in macrophages. In this study, the exposure of the
macrophages to the storage medias used in dental avulsion, allowed the
evaluation, through optical microscope, of the citotoxicitty based on the
apoptotic behavior of the cells, that were subjected to these medias. Based on
the analyses of the results, it may me suggested that the coconut milk was
considered the best storage media in case of dental avulsion.
Key words: coconut milk, macrophages, dental avulsion.
vii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Análise gráfica da viabilidade celular diante de soluções
conservantes......................................................................................................44
FIGURA 2 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com água
de coco durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de
Trypan. Observam-se células mortas, degeneradas, presença de
corpos apoptóticos. A coloração azul indica a morte celular. Nikon, aumento de
400 x..................................................................................................................44
FIGURA 3 - : Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com
Própolis durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul
de
Trypan.
Observam-se
células
vivas.
Nikon,
aumento
de
400x...................................................................................................................45
FIGURA 4 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com
Própolis durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Observam-se células vivas juntamente com células
degeneradas. O Própolis acarretou o aumento da célula por provável aumento
da
permeabilidade
da
membrana
celular.
Nikon,
aumento
de
400x...................................................................................................................45
FIGURA 5 - Controle negativo. Observa-se que todas as células apresentamse mortas. Nikon, aumento de 100x.................................................................46
FIGURA 6 - Controle positivo. Observa-se que todas as células apresentam-se
vivas. Nikon, aumento de 100x..........................................................................46
viii
FIGURA 7 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com água
de coco durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Observa-se apoptose. Nikon, aumento de 400x.....................47
FIGURA 8 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com leite
de coco durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Observa-se a presença de monócito. Nikon, aumento de
400x...................................................................................................................47
FIGURA 9 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com leite
de coco durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Observam-se células intactas com boa aparência, monócito
com morfologia adequada, com núcleo em forma de rim. Nikon, aumento de
400x...................................................................................................................48
FIGURA 10 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com
Própolis durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Observa-se necrose, células degeneradas, observa-se
apoptose com fragmentação nuclear. Nikon, aumento de 400x........................48
FIGURA 11 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com
Própolis durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Observa-se alteração citoplasmática; núcleo começando a se
fragmentar; apoptose. Nikon, aumento de 400x................................................49
FIGURA 12 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com
Própolis durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Pode-se perceber necrose da célula. Ocorrem cicatrizes na
ix
célula, o que causa necrose. A necrose estimula o processo inflamatório.
Nikon, aumento de 400x....................................................................................49
FIGURA 13 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com
solução fisiológica durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida
frente ao Azul de Trypan. Observa-se necrose celular e apoptose; figuras de
apoptose (superior esquerdo); estágios diversos de apoptose; estágio
avançado (inferior esquerdo). Nikon, aumento de 400x....................................50
x
INTRODUÇÃO
Com
uma
freqüência
relativamente
pequena
entre
as
injúrias
traumáticas, variando de 1% a 16%, a avulsão dentária é definida como o
completo deslocamento do dente de seu alvéolo e pode ser considerada a pior
destas injúrias traumáticas podendo levar a perda do elemento dentário.
Quedas, colisões, acidentes automobilísticos, esportes e lutas são apenas
alguns exemplos de fatores etiológicos comuns a este tipo de lesão traumática
(ANDREASEN & ANDREASEN, 2001).
O tratamento recomendado neste caso é o reimplante dentário imediato
e quando isto não for possível, deve-se colocá-lo em uma solução
conservadora capaz de manter a viabilidade das células do ligamento
periodontal e restabelecer a fisiologia do mesmo que é de fundamental
importância para um prognóstico favorável (LUSTOSA-PEREIRA et al., 2006).
Tanto o tempo do dente fora do alvéolo quanto o tipo do meio de
conservação utilizados podem afetar o prognóstico a longo prazo do dente
reimplantado. Quanto maior o tempo em que o dente avulsionado permanecer
em meio seco, pior o prognóstico. Por este motivo, os mais diversos meios de
conservação tem sido estudados (ANDREASEN, 1993; CHAMORRO et al.,
2008).
O meio de conservação ideal deve ser de fácil disponibilidade no
momento do acidente, deve possuir pH e osmolaridade adequados e deve
ainda ser capaz de manter a vitalidade e correto funcionamento celular com o
mínimo de toxicidade bem como ser capaz de evitar a presença e proliferação
de microorganismos. Dentre os diversos meios que têm sido utilizados com
11
sucesso encontramos a solução salina balanceada de Hank, o leite e o própolis
(TROPE, 2002; MARTIN & PILEGGI, 2004; LUSTOSA-PEREIRA et.al., 2006).
A manutenção da morfologia celular após a exposição aos meios
conservantes é outro item que deve ser verificado com cuidado. Soluções que
apresentam alto nível de toxicidade podem danificar a regulação e correto
funcionamento celular que irá afetar
diretamente na capacidade
de
regeneração do local traumatizado após o acidente (CHAMORRO et al.; 2008).
Diante destas observações, acredita-se ser oportuno o estudo in vitro de
algumas soluções conservantes comumente utilizadas e outras recentemente
utilizadas e testadas, bem como uma mistura daquelas que obtiveram sucesso
em estudos anteriores para que se possa observar o nível de toxicidade destas
substâncias e sua interferência ou não no correto funcionamento celular o que
pode até mesmo levar à morte da célula.
12
REVISÃO DE LITERATURA
1) Traumatologia, avulsão e reabsorção dentária
Lesões traumáticas em dentes permanentes anteriores são acidentes
freqüentes que afetam muitas crianças na idade escolar, de 7 a 14 anos de
idade, com intensa atividade física e sem noção de perigo. A maioria dos
traumas, sejam em adultos ou crianças, normalmente são causados por
quedas e colisões ou ainda acidentes automobilísticos, esportes e lutas e 13%
dos escolares examinados na faixa etária de 18 anos já foram expostos a
traumatismos dentários durante a adolescência. Fraturas dentárias parecem
mais comuns na dentição permanente enquanto luxações e especialmente
intrusões
predominam
na
dentição
decídua
(ANDREASEN,
1970;
ANDREASEN, 1985; ANDREASEN & ANDREASEN, 2001; LUSTOSAPEREIRA et al, 2006). Estas lesões podem acometer pequenas partes da
coroa ou até causar o completo deslocamento do dente do seu alvéolo,
caracterizando um caso de avulsão dentária, que danifica tanto os tecidos de
suporte quanto a polpa dentária e que ocorre mais comumente entre 7 e 9 anos
de idade devido a maior elasticidade do osso alveolar que gera uma mínima
resistência às forças extrusivas. O papel do reparo do dente avulsionado após
reimplante irá depender do potencial de reparo de cada componente celular
dos tecidos envolvidos, do procedimento efetuado ao reimplante e de fatores
específicos do indivíduo. A incidência de casos de avulsão varia de 1% a 16%
de todas as injúrias traumáticas à dentição permanente e é considerada a pior
dentre as injúrias dento-alveolares. O dente mais freqüentemente avulsionado
é o incisivo central superior. O tratamento recomendado é o reimplante dentário
13
imediato que é o ato de recolocar o dente avulsionado no seu alvéolo; e
quando isto não for possível, deve-se colocá-lo em uma solução conservadora
capaz de manter a viabilidade das células do ligamento periodontal e
restabelecer a fisiologia do mesmo. Considera-se como reimplante imediato
quando a permanência do dente fora do seu alvéolo é de até 30 minutos.
Sendo assim, o reimplante tardio tem se tornado uma realidade clínica para os
dentistas considerando o momento que o paciente chega ao profissional para
atendimento. Quando o dente avulsionado é imediatamente reimplantado ou
colocado em uma solução capaz de preservar as fibras periodontais presas à
raiz, as chances de sucesso no reimplante aumentam consideravelmente. O
reimplante restaura a estética e a função oclusal logo após a injúria e o dente
reimplantado pode manter sua função por alguns anos (CHO & CHENG, 2002;
MARTIN & PILEGGI, 2004; LUSTOSA-PEREIRA et al., 2006; ÖZAN et. al.,
2007; POI et al., 2007; CHAMORRO et al., 2008). Avulsão, portanto, resulta em
completo deslocamento do dente do alvéolo. Em adição, o suprimento
neurovascular é severamente comprometido, o que usualmente resulta em
perda da vascularização da polpa. A nutrição da polpa é conseguida através de
uma arteríola de 50 µm de diâmetro que penetra através do forame apical. Esta
arteríola é envolta por várias camadas de células musculares que a protegem
de ruptura. Entretanto, qualquer movimento dentário maior que duas vezes o
diâmetro do vaso, pode causar seu rompimento. Isto poderia resultar em
necrose pulpar em ápices abertos e fechados. Após avulsão, o sucesso pósreimplante é dependente do tratamento imediato seguinte à injúria. A
revascularização pulpar é iniciada após quatro dias e geralmente está completa
14
após quatro a cinco semanas em dentes imaturos reimplantados. A
revascularização é rara em dentes maduros que tenham um forame apical
estreito (ANDREASEN, 1993; MARTIN & PILEGGI, 2004; LIN et al., 2007).
Uma das conseqüências da avulsão dentária e posterior reimplante é a
reabsorção radicular e sua ocorrência depende de fatores como período extraalveolar, solução conservadora, contaminação microbiana e estágio da
formação radicular. Em 1925, a American Dental Association definiu
reabsorção como a perda de produtos ou tecidos do próprio corpo. A
reabsorção radicular iniciada por uma área de superfície mineralizada ou
exposta pode ser prolongada por irritação mecânica do tecido, infecção da
dentina e canal radicular e por certas doenças sistêmicas. Junto com estímulo
adicional de células de reabsorção, esta se torna progressiva e pode levar à
destruição da raiz. As maiores seqüelas que levam ao fracasso após
reimplante são a reabsorção radicular inflamatória, anquilose e reabsorção por
substituição. A presença de um ligamento periodontal intacto e viável na
superfície radicular é o fator mais importante para assegurar a cicatrização do
ligamento periodontal sem reabsorção radicular. As reabsorções dentárias
representam o principal fator limitador envolvido na determinação do
prognóstico das transplantações e reimplantações dentárias (TRONSTAD,
1988; ANDREASEN, 1993; KEUM et al., 2003; MARTIN & PILLEGI, 2004;
CONSOLARO, 2005; LUSTOSA PEREIRA et al., 2006; MANFRIN et al., 2007;
ÖZAN, 2007).
Os tecidos mineralizados dos dentes permanentes não são normalmente
reabsorvidos. Eles são protegidos no canal radicular pela pré-dentina e
15
odontoblastos e na superfície radicular pelo pré-cemento e cementoblastos. A
pré-dentina, o pré-cemento e o tecido osteóide ajudam a proteger os tecidos
mineralizados da ação reabsortiva. Nos traumatismos ocorrem deslocamentos
focais de pré-dentina e da camada odontoblástica. Se a pré-dentina ou précemento se tornam mineralizados ou se o pré-cemento é danificado
mecanicamente ou perdido, células multinucleadas irão colonizar a superfície
mineralizada ou desprotegida e a reabsorção vai ocorrer. Este tipo de
reabsorção pode ser referida como reabsorção radicular inflamatória. Esta
pode ocorrer na parede do canal radicular (reabsorção interna) e na superfície
da raiz (reabsorção externa) e pode ser transitória ou progressiva. Assim, em
dentes permanentes humanos não existem reabsorções dentárias normais,
sendo sempre patológicas (TRONSTAD, 1988; CONSOLARO, 2005).
Em dentes que sofreram deslocamento, a reabsorção radicular externa
pode se tornar extensa. Extrusão ou intrusão do dente bem como
subseqüentes procedimentos de reposição, inevitavelmente causarão dano à
raiz resultando em áreas desnudas da superfície da raiz que serão
quimiotáticas para células de reabsorção de tecido duro. A reabsorção radicular
irá seguir-se. Em adição, o deslocamento do dente leva ao rompimento de
vasos sangüíneos no forame apical e à necrose pulpar isquêmica.
Microorganismos irão depois ocupar o canal radicular através da junção
esmalte-dentina e túbulos dentinários expostos e uma infecção se estabelecerá
em um período de 2-3 semanas. Neste momento, a reabsorção radicular
induzida por áreas desnudas da superfície radicular pode ter exposto dentina
radicular tubular. Produtos bacterianos dos canais radiculares infectados irão
16
ocupar as lacunas de reabsorção na superfície radicular através dos túbulos
dentinários
e
sustentar
a
reabsorção
radicular
(TRONSTAD,
1988;
ANDREASEN, 1993; TROPE, 2002). Além disso, em dentes luxados, a
reabsorção radicular é iniciada por trauma mecânico, resultando em remoção
de cementoblastos, pré-cemento e às vezes cemento em áreas da superfície
radicular. Com a perda do cemento, a resposta inflamatória resultará em
reabsorção óssea e radicular. O processo de reabsorção é depois mantido por
estímulo microbiano vindo dos canais radiculares infectados que provê o
estímulo contínuo necessário das células de reabsorção. Após poucas
semanas, a condição pode ser reconhecida radiograficamente como áreas
radiolúcidas perirradiculares, usualmente envolvendo áreas da raiz e do osso
alveolar adjacente. Se isto progredir, o processo de reabsorção poderá destruir
o dente completamente em poucos meses. Em casos de avulsão o dano inicial
à camada de cemento após o trauma é limitado. Entretanto, se as células
remanescentes do ligamento periodontal na raiz permanecerem secas, estas
irão ocasionar uma resposta inflamatória em toda a superfície radicular que
resulta em dano à camada protetora de cemento. A reabsorção inflamatória
pode se desenvolver uma semana após o reimplante e segue um trajeto
progressivo, a menos que seja feito o tratamento endodôntico. Este tipo de
reabsorção está relacionado ao dano associado às camadas mais internas do
ligamento periodontal na superfície radicular e à presença de tecido pulpar
necrótico infectado (ANDREASEN, 1993; TROPE, 2002).
Anquilose dento-alveolar ocorre após extensa necrose do ligamento
periodontal com formação de osso na área desnuda da superfície radicular.
17
Clinicamente, esta condição é vista mais freqüentemente como uma
complicação à injúrias com luxação, especialmente em dentes avulsionados
que estiveram fora da boca por um período longo o suficiente para as células
da superfície radicular secarem e morrerem. Se menos de 20% da superfície
radicular é envolvida, a reversão da anquilose pode ocorrer. Se não, o dente
anquilosado é incorporado no osso alveolar e se tornará parte do processo
normal de remodelação do osso. Conseqüentemente, ele gradualmente será
reabsorvido e substituído por osso, daí o termo reabsorção por substituição
(TRONSTAD, 1988). As células de reabsorção na reabsorção por substituição
são os osteoclastos normalmente envolvidos em remodelação óssea.
Entretanto, a reabsorção por substituição apesar de levar à completa
destruição do dente, não deve ser entendida como um processo de doença.
Isso ocorre como um “erro” pelas células envolvidas na remodelação do osso
não serem capazes de distinguir entre cemento, dentina e osso. Os
osteoclastos irão reabsorver o tecido dentário do mesmo modo como
reabsorvem osso e como não são capazes de formar dentina ou cemento, os
osteoblastos substituem as áreas reabsorvidas da raiz com osso. Se os
cementoblastos continuam a cobrir a superfície radicular danificada, o processo
de cicatrização irá ocorrer e o resultado será favorável. Por outro lado, se
osteoblastos cobrem a superfície radicular, as condições para cicatrização
serão desfavoráveis e ocorrerá anquilose. A anquilose pode ser demonstrada
histologicamente duas semanas após o reimplante
TROPE, 2002).
18
(TRONSTAD,
1988;
Durante a avulsão e subseqüente reimplante ocorre a contusão do
ligamento periodontal com necrose celular resultando em processos de reparo
do ferimento onde o ligamento periodontal necrótico é removido por
macrófagos ou por cemento pela atividade osteoclástica. Esta última levará à
reabsorção de superfície ou inflamatória dependendo do estado da polpa, da
idade do paciente e do estágio de desenvolvimento radicular. A reabsorção
inflamatória pode ser demonstrada histologicamente uma semana após o
reimplante e na raiz é mais comum em dentes imaturos reimplantados e dentes
maduros jovens que em dentes maduros mais velhos. Quando grandes áreas
do ligamento periodontal são traumatizadas, a cicatrização competitiva da
ferida começa entre as células derivadas da medula óssea destinadas a formar
osso e células derivadas do ligamento periodontal programadas para formar as
fibras deste ligamento e cemento. O resultado dessa competição pode ser uma
anquilose de transição ou permanente. A ausência de restos epiteliais de
Malassez no ligamento periodontal ressecado por períodos extra-alveolares
prolongados podem levar à ocorrência de anquilose porque ele é responsável
por manter o espaço periodontal (ANDREASEN, 1993; LUSTOSA-PEREIRA et
al., 2006).
ANDREASEN (1970) estudou a etiologia e patogênese das injúrias
dentais traumáticas através da coleta de dados de 1298 pacientes de um
hospital (908 homens e 390 mulheres). Um total de 3026 dentes traumatizados
foram tratados, incluindo 787 dentes decíduos e 2239 dentes permanentes.
Traumatismos dentários repetidos foram encontrados em 24% dos casos.
Todos os traumas foram classificados de acordo com o tipo de injúria afetando
19
lábios, mucosa oral, estruturas de suporte dentárias e tecidos dentários duros.
O tipo de trauma parece estar relacionado à dentição, com traumas envolvendo
as estruturas dentárias de suporte predominantemente na dentição primária. A
origem do trauma foi distribuída em 9 grupos, de acordo com energia e
resiliência do impacto. A análise estatística revelou diferenças significativas nas
causas das injúrias entre os diferentes grupos de traumas. A relação entre
injúrias nos lábios e injúrias ao dente ou estruturas de suporte foram analisadas
separadamente. Parece através desta análise que o lábio pode atuar
absorvendo o impacto, reduzindo a chance de fratura coronária e aumentando
o risco de luxação e fratura do processo alveolar.
ANDREASEN & RAVN (1972) estudaram a epidemiologia das injúrias
traumáticas na dentição decídua e permanente em uma amostra da população
dinamarquesa que consistia de 487 crianças, sendo 251 meninos e 236
meninas, com idade entre 9 e 17 anos. 30% das crianças sofreram traumas na
dentição decídua, enquanto 22% sofreram traumas na dentição permanente.
Os meninos sofreram traumas mais freqüentemente na dentição permanente
quando comparado com as meninas, enquanto na dentição decídua foi achada
muito pouca diferença. Indivíduos mostrando traumas na dentição decídua não
exibiram uma freqüência significativamente maior de traumas na dentição
permanente quando comparado ao grupo sem história de trauma na dentição
decídua. A incidência anual de traumatismos foi determinada para a população
examinada. Entre os meninos, as maiores incidências ocorreram nas seguintes
faixas etárias: 2-4 anos e 9-10 anos. Nas meninas só foi vista uma alta
incidência no grupo etário de 2-3 anos.
20
ANDERSON et al. (2006) estudaram o grau de conhecimento de
escolares do Kwait, das medidas de emergência a serem tomadas em caso de
avulsão dentária. Ao todo 221 escolares foram entrevistados. Foram avaliados
os conhecimentos sobre princípios dos tratamentos em traumas, avulsão e
reimplante dentário, avulsão de dente permanente e decíduo, limpeza de dente
avulsionado antes do reimplante, período extra-alveolar e meio conservante.
Crianças acima de 10 anos apresentaram um conhecimento maior do manejo
de traumas, mas independente da idade, o sobre avulsão, reimplante, período
extra-alveolar e meio conservante foi baixo. Pode-se concluir a partir deste
estudo que o conhecimento em geral é baixo o que poderia afetar o
prognóstico em casos de traumatismos.
LUSTOSA-PEREIRA et al. (2006) avaliaram a eficácia do alendronato de
sódio em evitar a ocorrência de reabsorção dentária em dentes avulsionados.
Cinqüenta e quatro incisivos centrais superiores direitos de ratos foram
divididos em três grupos com períodos extra-alveolares de 15, 30 e 60 minutos.
O alendronato de sódio foi usado como substância tópica no tratamento da
superfície radicular. Os resultados indicaram que o alendronato de sódio foi
eficaz em reduzir a incidência de reabsorção radicular, mas não da anquilose
dentária. Não houve diferença significante entre os períodos extra-alveolares.
POI et al. (2007) avaliaram as alterações na cicatrização do ligamento
periodontal de dentes reimplantados após o uso de Emdogain®. O incisivo
central de 24 ratos Wistar foram extraídos e deixados a seco por 6 horas. Após
isso, a papila dentária e o órgão do esmalte de cada dente foi seccionada para
remoção pulpar por via retrógrada e o canal foi irrigado com hipoclorito de
21
sódio a 1%. Os dentes foram divididos em dois grupos: no grupo I, a superfície
radicular foi tratada com hipoclorito de sódio a 1% por 10 minutos (trocando a
solução após 5 minutos), enxaguada com solução salina por 10 minutos e
imersa em flúor fosfato de sódio acidulado a 2% por 10 minutos; no grupo II, as
superfícies radiculares foram tratadas do mesmo modo descrito, exceto pela
aplicação de Emdogain® ao invés do fluoreto de sódio. Os dentes foram
obturados com hidróxido de cálcio e reimplantados. Todos os animais
receberam antibioticoterapia. Os ratos foram mortos por overdose anestésica
10 e 60 dias após o reimplante. As peças contendo os dentes reimplantados
foram removidas, fixadas, descalcificadas e embebidas em parafina. Cortes
seriados de 6µ foram obtidos e corados com hematoxicilina e eosina para
análise histológica e histométrica. Observou-se que o uso de flúor fosfato de
sódio acidulado gerou mais áreas de reabsorção por substituição e o uso de
Emdogain® resultou em mais áreas de anquilose e não foi capaz de evitar
anquilose dento-alveolar. Pode-se concluir que nem o flúor fosfato de sódio
acidulado e nem o Emdogain® foram capazes de prevenir a reabsorção
radicular em reimplantes tardios de dentes de ratos.
2) Soluções conservadoras após avulsão
Na maioria dos casos clínicos, antes do reimplante os dentes
avulsionados têm sido armazenados na cavidade bucal ou outros meios, tais
como solução salina ou água de torneira. Uma vez que esses meios de
armazenagem diferem consideravelmente, em especial com relação à
concentração de eletrólito, pode-se presumir que a escolha do meio de
armazenagem possa influenciar a cicatrização pulpar e o desenvolvimento de
22
diferentes tipos de reabsorção radicular. Um meio ideal de armazenamento
seria aquele capaz de preservar a viabilidade e mitogenicidade do ligamento
periodontal danificado de modo a facilitar a nova ocupação da superfície
radicular desnuda prevenindo a reabsorção radicular.
Em
1994,
a
ASSOCIAÇÃO AMERICANA DE ENDODONTISTAS recomendou a solução
salina balanceada de Hank como o meio de escolha para dentes avulsionados.
Foi encontrada uma forte relação entre o armazenamento a seco e o
armazenamento em meios não-fisiológicos como a água de torneira e a
cicatrização periodontal e reabsorção radicular (ANDREASEN, 1993). Parece
que a revascularização pulpar depende das condições de armazenagem. Se os
dentes avulsionados são armazenados úmidos, a revascularização acontece
em aproximadamente um terço dos casos armazenados até três horas. A
revascularização após armazenagem a seco ocorre, de modo geral, em cerca
de metade dos casos, quando o período de armazenagem é menor que cinco
minutos. Depois, a freqüência de revascularização cai para aproximadamente
um terço, no período de seis a vinte minutos e depois continua a diminuir com o
aumento dos períodos em que o dente fica a seco. Além disso, tem sido notado
que a revascularização ocorre unicamente em dentes com um diâmetro apical
do forame que excede a um milímetro (ANDREASEN, 1993; CHAMORRO et
al., 2008).
Tanto o tempo do dente fora do alvéolo quanto o tipo do meio de
conservação utilizados podem afetar o prognóstico a longo prazo do dente
reimplantado. O objetivo do tratamento do paciente que sofreu avulsão dentária
é o reimplante imediato, mas como nem sempre isto é possível, colocar o dente
23
em soluções que preservam a vitalidade das células do ligamento periodontal
ajuda a prevenir a reabsorção radicular inflamatória e a reabsorção por
substituição. O ligamento periodontal remanescente na raiz após injúria, é
dependente de um suprimento de metabólitos vitais, caso contrário a
destruição celular começa. Para preservar o metabolismo celular ótimo, o
suprimento deve ser renovado após 60 minutos do tempo da injúria. Se as
células sobreviverem, elas irão promover a reprodução de novas células as
quais podem se diferenciar e recompor os tecidos de suporte (TROPE, 2002;
MARTIN & PILEGGI, 2004; LIN et al., 2007).
Soluções conservadoras como leite, por exemplo, favorecem o sucesso
do procedimento de reimplante, enquanto deixar o dente em um ambiente seco
compromete o prognóstico significativamente. Dentes reimplantados com 30
minutos apresentam uma taxa de sucesso melhor que aqueles com um período
extra-oral maior e com duas horas à seco, não é encontrada nenhuma célula
do ligamento periodontal vital. Muitos métodos têm sido sugeridos para
preservar a vitalidade das células do ligamento periodontal que variam desde
colocar o dente embaixo da língua do paciente até meios como leite, solução
salina ou mesmo a mais apropriada solução salina balanceada de Hank. A
saliva se mostrou pior que o leite por causa da sua baixa osmolaridade e alto
risco de contaminação bacteriana, apesar de conservar a vitalidade das células
do ligamento periodontal por até 2 horas. Água da torneira, saliva e soro
fisiológico são todos ineficazes em manter a viabilidade das células do
ligamento periodontal. Esses meios não são recomendados pelas suas
propriedades hipotônicas (água de torneira e saliva) e alta incidência de
24
contaminação bacteriana que levam à rápida morte das células do ligamento
periodontal. Alguns estudos têm começado a sugerir o uso do Própolis como
um meio conservador do dente avulsionado (TROPE, 2002; MARTIN &
PILEGGI, 2004; ANDERSON et al., 2006). O Própolis é um produto resinoso da
colméia da abelha com propriedades antibacterianas e anti-inflamatórias, antioxidantes, anti-fúngicas, anti-virais e reparadoras de tecidos, entre outras.
Radicais de oxigênio e tensão de oxigênio modulam atividade de osteoblastos
e osteoclastos. Dano oxidativo pode promover reabsorção da superfície
radicular por efeitos tóxicos nas células do ligamento periodontal danificadas
mecanicamente ou no cemento ou pelo aumento da atividade de reabsorção
das células clásticas. Tem sido sugerido que colocar o dente avulsionado em
um meio contendo um ou mais antioxidantes pode aumentar o sucesso do
reimplante. O própolis tem uma grande capacidade anti-oxidante. Os
componentes mais importantes do própolis são os flavanóides que são
poderosos anti-oxidantes. Antibióticos mostram efeitos favoráveis tanto tópica
quanto sistemicamente em evitar a reabsorção após o reimplante. A Penicilina
diminui a ocorrência de reabsorção e a tetraciclina possui propriedades que
atuam contra a reabsorção em adição aos seus efeitos antimicrobianos. O
tratamento da superfície radicular com solução de fluoreto estanoso a 1% e
tetraciclina também reduz a reabsorção. Como o própolis possui atividade
antimicrobiana, isso faz dele um meio conservador favorável. O leite tem sido
estudado extensivamente e tem ganhado aceitação como um meio capaz de
manter a viabilidade das células do ligamento periodontal provavelmente por
sua osmolaridade fisiológica que não é excessivamente danosa a estas
25
células, pH neutro e presença de nutrientes. Seu conteúdo de gordura afeta
esta viabilidade, sendo o leite com baixo teor de gordura mais apropriado. É um
meio prático e encontrado próximo a maioria dos locais dos acidentes (TROPE,
2002; ANDERSON et al., 2006). A ASSOCIAÇÃO AMERICANA DE
ENDODONTISTAS (1995) aceita o leite como solução conservadora para
transporte de dente avulsionado. A solução salina balanceada de Hank (HBSS)
é a solução salina padrão usada largamente em pesquisa biomédica para
permitir o crescimento de vários tipos celulares. Ela não apresenta toxicidade,
apresenta osmolaridade ideal, o pH é balanceado e contém muitos nutrientes
essenciais, preservando a vitalidade dos fibroblastos por 72 horas. Uma
solução conservadora para transporte dental usando HBSS foi desenvolvida e
comercializada com o nome Save-A-Tooth (Save-A-Tooth Inc., Pottstown, PA,
EUA), mas ainda não se encontra disponível em farmácias ou drogarias no
Brasil. Viaspan é um meio conservador usado no transporte de órgãos mas
possui um tempo de validade de somente alguns meses que juntamente com
seu alto custo tornam seu uso raro. Um recipiente chamado Dentosafe® foi
introduzido e distribuído em escolas da Alemanha e Áustria. (TROPE, 2002;
POHL et al., 2005; MARTIN & PILEGGI, 2004; LUSTOSA-PEREIRA et.al.,
2006; ÖZAN et. al., 2007; LIN et al., 2007).
BLOMLOF (1981) estudou diferentes tipos de meios conservantes em
casos de avulsão dentária. As células do ligamento periodontal sobreviveram
bem no leite, 50% das células se apresentaram vitais após 12 horas de
exposição, enquanto nenhuma célula viável foi encontrada após 3 horas de
26
armazenamento em saliva. Breve armazenamento em saliva seguido de
armazenamento em leite foi melhor que o armazenamento somente em saliva.
BLOMLOF et al. (1983) avaliaram as condições periodontais após 8
semanas tendo sido expostos dentes de macacos tratados endodonticamente
ao leite e à saliva por 2 ou 6 horas. Os dentes estocados em leite por 2 e 6
horas e os dentes estocados em saliva por 2 horas mostraram um reparo
periodontal quase tão bom quanto os dentes reimplantados imediatamente. Os
dentes estocados em saliva por 6 horas ou deixados à seco mostraram
extensiva reabsorção por substituição. O leite, portanto, pode ser recomendado
como um meio conservante para dentes avulsionados.
MARINO et al. (2000) avaliaram a capacidade do leite longa vida servir
como solução conservante para dentes avulsionados através da manutenção
da viabilidade de células do ligamento periodontal expostas a este meio. As
células foram colocadas em placas com meio de cultura por 24 horas e depois
o meio foi substituído por leite pasteurizado (refrigerado), leite longa vida ou
Save-A-Tooth. As placas foram incubadas a 37ºC por 1, 2, 4 ou 8 horas. Após
8 horas a viabilidade das células do ligamento periodontal no leite pasteurizado
e no leite longa vida foi significantemente maior que no Save-A-Tooth. Não
houve diferença estatística significante entre os leites. Esses resultados
sugerem que o leite longa vida, que tem a vantagem de não necessitar
refrigeração, é tão efetivo quanto o leite pasteurizado e mais efetivo que o
Save-A-Tooth.
SCHWARTZ et al. (2002) examinaram o efeito da temperatura de alguns
meios de conservação de dentes em períodos variáveis de tempo de
27
acondicionamento sobre o ligamento periodontal e reparo pulpar após
reimplante dentário em macacos. Incisivos laterais inferiores com formação
radicular completa foram extraídos e deixados a seco a 22, 4 e -18º; em
solução salina a 37, 22, 4 e -18º; ou em saliva a 37º por 60 ou 120 minutos
antes do reimplante. Os animais foram sacrificados 8 dias após o reimplante e
os 125 dentes reimplantados foram examinados histometricamente. Os
parâmetros histológicos foram: ligamento periodontal normal, reabsorção de
superfície, reabsorção inflamatória, reabsorção por substituição, profundidade
de bolsa periodontal, mudanças periapicais inflamatórias e extensão da
vitalidade pulpar. Acondicionamento em saliva a 37ºC mostrou quantidade
similar de ligamento periodontal normal comparado à solução salina em 60 e
120 minutos. A solução salina por 60 ou 120 minutos não mostrou diferença na
extensão do ligamento periodontal quando o meio foi comparado a 37, 22 e
4ºC. Entretanto, o meio a -18ºC mostrou significante menos perda de ligamento
periodontal que meios em outras temperaturas. O meio seco por 60 minutos
mostrou significante menor reabsorção dentária a 4ºC quando comparada a
22ºC. O meio seco a -18ºC mostrou significante menor perda de ligamento
periodontal que o meio a 4ºC. O tempo em meio seco de 120 minutos, não
mostrou diferença entre 22,4 e -18ºC. Conclui-se que a temperatura (acima de
0ºC) do meio de conservação é de importância somente para o meio seco e em
situações de curtos períodos de tempo extra-alveolares até 60 minutos e não
120 minutos, quando extensa destruição do ligamento periodontal já ocorreu.
Sugere-se que a temperatura de 4ºC pode resultar em menor evaporação do
ligamento periodontal e menos danos às suas células. A cicatrização pulpar em
28
todos os casos foi limitada à entrada do canal e nenhum padrão foi encontrado
entre o meio de conservação, tempo e temperatura.
MARTIN & PILEGGI (2004) realizaram um ensaio com ColagenaseDispase para investigar o potencial de um novo meio de conservação dental , o
Própolis, manter a viabilidade das células do ligamento periodontal em dentes
avulsionados. Setenta dentes recém-extraídos foram divididos em cinco grupos
experimentais e dois grupos controles. Este estudo comparou duas diferentes
concentrações de Própolis (50% e 100%) ao HBSS, soro fisiológico e leite. O
número de células viáveis foi contado com um hemocitômetro e analisado.
Análise
estatística
mostrou
que
os
grupos
do
Própolis
mantiveram
significativamente mais células do ligamento periodontal viáveis quando
comparados ao leite, soro fisiológico ou HBSS mostrando ser uma melhor
alternativa. O Própolis a 100% não foi significativamente diferente do Própolis a
50%, indicando que a concentração não mostrou diferença na toxicidade para
as células do ligamento periodontal. HBSS, soro fisiológico e leite não foram
significativamente diferentes entre si.
POHL et al. (2005) estudaram a cicatrização após avulsão e reimplante.
Foram avaliados 28 dentes permanentes em 24 pacientes. Logo após a
avulsão, 6 dentes foram colocados em um recipiente contendo um meio de
cultura e denominado Dentosafe® por 1-53 horas e o ligamento periodontal não
estava comprometido, 16 dentes foram deixados em situação não-fisiológica
temporariamente e 6 dentes em condições não-fisiológica por longos períodos.
Em 14 dentes, terapia regenerativa anti-reabsorção (TRA) com aplicação local
de glicocorticóides e derivado da matriz de esmalte e administração sistêmica
29
de doxiciclina foi usada. Em todos os dentes foi realizado tratamento
endodôntico extra-oral com inserção de pino via retrógrada. Os dentes foram
observados por cerca de 31 meses. Observou-se que a influência
predominante na cicatrização foi o acondicionamento fisiológico imediato do
dente avulsionado. Logo, para um bom prognóstico, o dente avulsionado deve
ser acondicionado imediatamente em um meio celular compatível. Estes meios
deveriam ser distribuídos em lugares de riscos de acidentes e o TRA só
apresenta potencial de melhorar o prognóstico quando o ligamento periodontal
não está comprometido.
FAGADE (2005) fez uma revisão de literatura com o objetivo estudar os
vários meios utilizados em transplantes e reimplantes. Entre os meios
propostos na literatura encontram-se: Solução salina balanceada de Hank
(HBSS), plasma do próprio paciente, soro fisiológico, água de torneira, saliva e
leite pasteurizado. Os mais favoráveis foram: HBSS, plasma do próprio
paciente, meio de cultura Eagle, leite pasteurizado e soro fisiológico.
ÖZAN et al. (2007) avaliaram a efetividade do própolis como um meio
conservante temporário para a manutenção da viabilidade das células do
ligamento periodontal em dentes avulsionados. Células do ligamento
periodontal foram obtidas de terceiros molares e cultivadas em DMEM. Os
quatro grupos comparados foram: solução de própolis a 10%, solução de
própolis a 20%, leite longa vida com baixo conteúdo de gordura, solução
balanceada de Hank além da água de torneira como controle negativo e DMEM
como controle positivo. As placas foram incubadas a 37ºC por 1, 3, 6, 12 e 24
horas. Os resultados indicaram que o própolis a 10% em 3, 6, 12 e 24 horas foi
30
significativamente melhor que HBSS e leite. Em 1 hora não houve diferença
significativa entre eles. Em 1 hora o própolis a 20% foi pior que o HBSS ao
contrário de 3 e 6 horas. O própolis a 20% foi significativamente melhor que o
HBSS e o leite. Em 12 e 24 horas, o própolis a 20% foi melhor somente que o
HBSS. Quando as soluções de própolis foram comparadas, não houve
diferença significante em 1, 3 e 6 horas. Em 12 e 24 horas o própolis a 10% foi
significativamente melhor que a 20%. Em geral, o própolis a 10% foi o meio
mais efetivo e se concluiu que o mesmo pode ser recomendado como um meio
adequado para transporte do dente avulsionado.
CHAMORRO et al. (2008) investigaram in vitro o grau de apoptose de
células do ligamento periodontal após diferentes condições de armazenamento.
Células de ligamento periodontal humanas foram colocadas em meio de cultura
em placas durante 24 horas. As células foram depois expostas por uma hora
ao leite, solução salina balanceada de Hank (HBSS), solução Soft Wear para
lentes de contato e Gatorade® à temperatura ambiente ou congeladas. O meio
de cultura foi usado como controle negativo. O grau de apoptose foi avaliado
após 24, 48 e 72 horas do tratamento através de imunoflurescência direta.
Foram contadas o número total de células e o número total de células
apoptóticas. Os resultados indicaram que em 24 e 72 horas, o ligamento
periodontal tratado com Gatorade® e com solução para lentes de contato
mostraram as mais altas porcentagens de células apoptóticas quando
comparados com os outros grupos à temperatura ambiente. Finalmente,
células tratadas congeladas mostraram significativamente mais baixos níveis
de apoptose quando comparadas com tratamentos em temperatura ambiente.
31
Como conclusão, os resultados indicaram que apoptose desempenha o papel
principal na morte celular em células tratadas com Gatorade® e soluções para
lentes de contato em comparação com as outras soluções de armazenamento
e que o armazenamento por congelamento pode inibir a morte programada das
células.
GOPIKRISHNA et al. (2008) investigaram o potencial de um novo meio
de conservação após avulsão dentária, a água de coco, em comparação com o
própolis, solução salina balanceada de Hank (HBSS) e leite na manutenção da
viabilidade das células do ligamento periodontal (PDL). Setenta dentes
humanos recém-extraídos foram divididos em 4 grupos experimentais e 2
grupos controles. Os controles positivo e negativo corresponderam a 0 minutos
e 8 horas de tempo em ambiente à seco. Os dentes dos grupos experimentais
foram estocados secos por 30 minutos e depois imersos em um dos 4 meios
(água de coco, própolis, HBSS e leite). Os dentes foram depois tratados com
dispase grau II e colagenase por 30 minutos. O número de células viáveis do
ligamento periodontal foi contado com um hemocitômetro e analisadas. A
análise estatística mostrou que a água de coco apresentou maior quantidade
significativa de células do ligamento periodontais viáveis comparada com
própolis, HBSS ou leite. A água de coco pode, portanto, ser usada como um
meio conservante de transporte para dentes avulsionados.
3) Reações celulares perante determinadas substâncias
A função da célula normal requer um equilíbrio entre as exigências fisiológicas
e as limitações da estrutura celular e da capacidade metabólica; o resultado é
um estado estável ou homeostasia. As células podem alterar seu estado
32
funcional em resposta a um moderado estresse e manter seu estado estável.
Estresses fisiológicos mais excessivos ou estímulos patológicos adversos
(lesão) resultam em adaptações, lesão reversível ou lesão irreversível e morte
celular. As adaptações ocorrem quando estresses fisiológicos ou patológicos
induzem um novo estado que altera a célula, porém preserva sua viabilidade
em resposta a estímulos externos, como hiperplasia, hipertrofia, atrofia e
metaplasia. A lesão celular reversível denota alterações celulares patológicas
que podem ser restauradas à normalidade se o estímulo for retirado ou se a
causa da lesão não foi grave. A lesão irreversível ocorre quando o estímulo
excede a capacidade da célula se adaptar e denota alterações patológicas
permanentes que causam a morte celular. Existem dois padrões morfológicos e
mecânicos de morte celular: necrose e apoptose (HORTELANO et al., 2001;
AMARANTE-MENDES, 2003; TABAS, 2005; MITCHELL et al., 2006). A
necrose é o tipo de morte celular mais comum, envolve grande edema celular,
desnaturação e coagulação de proteínas, degradação de organelas celulares e
ruptura de células, perda da integridade das membranas plasmáticas,
desorganização citoplasmática e dissolução nuclear. Em geral, um grande
número de células no tecido adjacente é afetado. A apoptose ocorre quando a
célula morre devido à ativação de um programa de “suicídio” controlado
internamente, que envolve um distúrbio orquestrado de componentes celulares;
ocorre uma ruptura mínima do tecido adjacente. Morfologicamente, ocorre a
condensação e a fragmentação da cromatina com degradação do DNA
genômico em fragmentos oligonucleossomais, perda do volume e aumento da
granulosidade celular, manutenção da estrutura das organelas, formação de
33
“pregas” na membrana plasmática e conseqüente fragmentação celular em
corpos apoptóticos. Em diferentes populações celulares, observa-se uma
grande similaridade no fenótipo da apoptose, mesmo em situações fisiológicas
bastante distintas. Este fenótipo é resultante, principalmente, da ação em
cascata de membros de uma família peculiar de cisteíno-aspartato proteases,
denominada Caspases. Estas se dividem em dois grupos, sendo as executoras
responsáveis pela execução do processo em si. Através das Caspases, vão ser
gerados os fragmentos oligonucleossomais característicos da apoptose. As
células podem morrer por apoptose ou mecanismos não-apoptóticos
(HORTELANO et al., 2001; AMARANTE-MENDES, 2003; TABAS, 2005;
MITCHELL et al., 2006). Caso o sinal de estresse seja muito violento, o que
ocorre em geral em situações patológicas, uma dada célula não tem escolha, a
não ser sofrer uma morte necrótica, impossível de ser controlada genética ou
farmacologicamente, e rapidamente perder a integridade de sua membrana
celular, liberando o seu conteúdo citoplasmático e induzindo uma resposta
inflamatória no tecido comprometido. Por outro lado, quando o estresse é mais
ameno, o sinal gerado irá ser analisado pelo conjunto de mitocôndrias, as quais
atuam como um sensor e possuem a responsabilidade de decidir se esta célula
irá continuar a viver ou deverá ser eliminada por mecanismos apoptóticos.
Neste caso, as mitocôndrias sofrem um desacoplamento da cadeia respiratória
o que ocasionará a liberação sobretudo do citocromo c para o citosol, o qual
ativará a cascata de caspases que irão executar o programa de
empacotamento celular conhecido como apoptose. Em certas situações onde
as células apoptóticas não foram eliminadas por fagocitose, pode ocorrer
34
necrose celular chamada necrose secundária ou pós-apoptose. Neste caso, as
membranas das células apoptóticas se rompem com liberação de componentes
intra-celulares, como proteases, que induzem resposta inflamatória e dano
tecidual. Em macrófagos, o fenótipo apoptótico mostra uma seqüência de
alterações em vários parâmetros, como perda de adesão celular e assimetria
da membrana plasmática, desorganização do citoesqueleto e fragmentação
internucleossomal
do
DNA,
juntamente
com
ativação
das
caspases.
Propriedades físico-químicas gerais da célula são modificadas durante a
apoptose (HORTELANO et al., 2001; AMARANTE-MENDES, 2003; TABAS,
2005; MITCHELL et al., 2006).
35
PROPOSIÇÃO
O presente trabalho tem como objetivo avaliar quantitativamente e
qualitativamente os efeitos citotóxicos de soluções conservantes, entre elas o
própolis, água de coco, leite de coco, HBSS, solução fisiológica com
antibióticos e leite, utilizadas em casos de avulsão dentária através da
observação microscópica de alterações celulares sofridas em macrófagos.
36
MATERIAIS E MÉTODOS
1) Preparo do meio de cultura
O presente trabalho foi realizado no laboratório de toxicologia da
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Foram utilizados macrófagos
obtidos de ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus). Os animais utilizados neste
trabalho foram obtidos da empresa Biocampo 2000 Produtos Biológicos Ltda
(Bom Jardim, Rio de Janeiro). Primeiramente foi realizado o preparo do meio
mínimo essencial de Eagle (MEM) cujo pH é 7. Foram pesados 9,60 g de MEM
(GIBCO 145000-083) e colocado em um copo de Erlenmeyer. Foi colocada
água desmineralizada até completar 900 mL. Dissolveu-se com uma barra e
um agitador magnético. Ajustou-se o pH com bicarbonato de sódio e o volume
até 100 mL com água destilada. Foi realizada filtração positiva do meio Eagle
através de membrana estéril de porosidade 0,22 µm. Foram pesados 100 mg
de penicilina G benzatina e 100 mg de sulfato de estreptomicina. Obteve-se no
final 121 mg/l de penicilina e 230 mg/l de estreptomicina (ambos da marca
comercial Sigma-Aldrich, St Louis, USA). Os antibióticos foram adicionados ao
meio de cultura como medida adicional de segurança, de modo a evitar
eventuais contaminações. Foi utilizada uma concentração de 1 ml do antibiótico
para cada 50 ml do meio (concentração de 50 vezes).
2) Obtenção de macrófagos
Após a obtenção do meio de cultura, os animais foram sacrificados por
inalação de vapores de clorofórmio. Após a morte dos animais, foi realizada a
aplicação do meio de cultura no peritônio dos ratos. O edema obtido através
desta manobra atrai macrófagos. Os macrófagos foram aspirados com seringa
37
e transferidos para tubos cônicos estéreis com meio de cultura. Estes tubos
foram condicionados em gelo. Alíquotas do conteúdo foram transferidas para
uma lâmina para observação das células. Para a análise microscópica, foi
usada a lâmina de Neubauer. A contagem foi realizada através de um
hemocitômetro. Ao final obteve-se 25 ml de solução com macrófagos. Foram
observadas 0,8 x 105 células/ml. Foram obtidas 2 x 107 células dos ratos em 5
minutos. Foi adicionado soro fetal bovino a 20%, que contém adesinas que
facilitam a adesão dos macrófagos na placa. Foram colocadas alíquotas do
meio de cultura contendo os macrófagos nos poços das placas para cultivo. As
placas foram colocadas em um dessecador com ambiente de CO2 (água
destilada, bicarbonato de sódio (Na2HCO3) e ácido sulfúrico) criando um
ambiente de anaerobiose. O dessecador (Sciencor® Scientific, São Paulo,
Brasil) foi deixado em estufa a 37ºC. Foram utilizadas 3 microplacas de teste
para cultura celular com 6 orifícios (Zellkultur Testplatte da Biochrom AG,
Berlim, Alemanha).
3) Procedimento experimental
Em uma segunda etapa, partimos para a exposição dos macrófagos aos
meios conservantes utilizados quando da avulsão dentária. Os meios
conservantes utilizados foram: água de coco (1), leite (2), HBSS (3), leite de
coco (4), própolis (5), solução fisiológica contendo antibióticos (6), controle
positivo usou-se o meio de cultura com soro fetal bovino, controle negativo
usou-se o meio de cultura contendo Antimicina A (substância letal).
A água de coco foi obtida de coco fresco quebrando-o com facão. O leite
utilizado no experimento foi da marca Elegê desnatado (Eleva Alimentos S/A,
38
Rio Grande do Sul, Brasil). Como conservante 3 foi empregada a solução
salina balanceada de Hank. O conservante 4 foi o leite de coco comercial(Bom
Coco, Rio de Janeiro, Brasil). O conservante 5 foi o própolis spray (Makrovit,
Rio de Janeiro, Brasil). O conservante 6 consistiu de 10 ml de PBS estéril
(solução salina tamponada) juntamente com 0,2 ml do meio contendo
antibiótico (100 mg de penicilina G benzatina e 100 mg de sulfato de
estreptomicina, ambos da marca comercial Sigma-Aldrich, St Louis, USA). Para
o controle negativo, foi utilizada a Antimicina A (Sigma-Aldrich, St Louis, USA)
que atua inibindo a oxidação celular, inibe o citocromo (complexo I, NADH
desidrogenase) e portanto não há produção de ATP na respiração mitocondrial
dos macrófagos, causando a morte celular. A dose tóxica da Antimicina A
(C20H40N2O4) é de 2 µg/ml e a dose letal é 200DL50.
As placas tiveram seus meios recolhidos e colocados em tubos de
ensaio e os conservantes colocados nos poços numerados de 1 a 6 na própria
placa respectivamente com os seus números pré-estabelecidos. Estas placas
foram numeradas de 1 a 3 na parte superior e de 4 a 6 na parte inferior. Uma
destas placas foi colocada por 30 minutos e a outra por 60 minutos no
dessecador e deixada na estufa a 37ºC. A terceira placa continha os controles
que foram colocados em 3 poços cada um e deixados por 120 minutos.
Passados os tempos respectivos de 30, 60 e 120 minutos, os conservantes
foram recolhidos e as placas lavadas com PBS rapidamente. O Azul de Tripan
(SP Labor, São Paulo, Brasil) a 0,5%, foi adicionado em todos os poços e
deixado por 1 minuto. Os poços foram lavados com água e posteriormente foi
adicionado Metanol (Lab House, Belo Horizonte, Brasil) e
39
Panótico (Lab
House, Belo Horizonte, Brasil) para fixar o corante. Após coradas e fixadas, as
placas foram observadas ao microscópio. Como avaliação foi considerada que
células pouco coradas ou mais claras apresentaram-se vivas e as mais
coradas ou bem azuladas estavam mortas.
40
RESULTADOS
No presente trabalho foi possível obter resultados que permitiram uma
análise
quantitativa
e
qualitativa.
Quantitativamente
obteve-se
uma
determinada porcentagem de células vivas em cada poço da placa a ser
submetido a cada solução. Estes valores foram submetidos ao teste estatístico
não paramétrico Kruskal-Wallis. Após esta análise foi feita uma observação
qualitativa através das imagens obtidas ao microscópio óptico que possibilitou
a observação das alterações celulares de forma direta.
Primeiramente foram observados os 6 poços da placa de 30 minutos.
Observou-se que no intervalo de 30 minutos o poço contendo água de coco
apresentou 17% de células vivas; o poço contendo leite apresentou 69% de
células vivas; o poço contendo a solução de Hank (HBSS) apresentou 40% de
células vivas; o poço contendo leite de coco apresentou 93% de células vivas;
o poço contendo o própolis apresentou 71% de células vivas; e o poço
contendo solução salina com antibióticos apresentou 83% de células vivas
(tabela 1).
Nos primeiros 30 minutos, pôde-se observar que a água de coco
apresentou um resultado insatisfatório com grande número de células mortas,
mostrou características de apoptose, fragmentação de DNA através da
fragmentação nuclear que induz a morte natural (figura 1). O leite preservou a
conformação celular dos macrófagos que se apresentaram intactos e bem
visíveis com uma porcentagem de células vitais razoáveis. A solução de Hank
(HBSS) proporcionou uma quantidade mediana de células vitais. O leite de
coco apresentou um resultado surpreendente, com 93% das células vitais e
41
com conformação celular adequada. O própolis nos primeiros 30 minutos
apresentou quantidade considerável de células vitais e arquitetura celular
adequada com a normalidade (figura 2). A solução salina contendo antibióticos
apresentou nos primeiros 30 minutos uma grande quantidade de células vitais.
Logo após, foram observados os 6 poços da placa de 60 minutos.
Observou-se que em 60 minutos o poço contendo água de coco apresentou-se
com 34% de células vivas (aumento da amostra em relação aos 30 minutos
provavelmente obtido pelo campo de visualização diferenciado), O poço
contendo leite se apresentou com 64% das células vitais, o poço contendo
HBSS com 37% das células vitais, o poço contendo leite de coco com 90% das
células vitais, o própolis com 37% das células vitais e a solução fisiológica com
antibióticos com 46% das células vitais (tabela 1).
Após 60 minutos, pôde-se observar que a água de coco continuou
apresentando resultado insatisfatório, com apoptose, degeneração celular e
fragmentação de DNA (figura 7). O leite gerou uma pequena diminuição na
quantidade de células (macrófagos) vivas, mas não houve uma alteração
considerável, o padrão celular permaneceu dentro da normalidade. O HBSS
gerou também pequena diminuição na quantidade de células vivas, mas
manteve as mesmas características dos 60 minutos. O leite de coco se
manteve ainda com alta porcentagem de células vivas (90%) e surpreendente
manutenção das características celulares (figuras 8 e 9). O própolis e a solução
fisiológica com antibióticos demonstraram uma queda muito grande na
porcentagem de células vivas o que os torna de pouca utilidade após 60
minutos de exposição (figuras 10, 11, 12 e 13).
42
Tabela 1- Efeito dos diversos conservantes em macrófagos. Porcentagem de
células vitais após cada exposição.
Meios conservantes
30 min
60 min
_____________________________________________________________________
Controle positivo (soro fetalbovino) 100%
100%
Água de coco
17%
34%
Leite
69%
64%
HBSS
40%
37%
Leite de coco
93%
90%
Própolis
71%
37%
Soro fisiológico e antibióticos
83%
46%
0%
0%
Controle negativo (Antimicina A)
A análise estatística mostrou diferença estatística significativa (p<0,05)
somente entre o controle positivo e a água de coco tanto após 30 minutos
quanto após 60 minutos e entre a água de coco e o leite de coco após 30
minutos. Entre os demais intervalos de tempo e as demais substâncias não
houve diferença estatística significativa.
43
viabilidade celular diante de soluções
conservantes
células vivas
120
Série1
100
Série2
80
Série3
60
Série4
40
Série5
20
Série6
0
Série7
1
2
Série8
tempo
Figura 1: Análise gráfica da viabilidade celular diante de soluções
conservantes. Séries: 1- Água de coco; 2- Leite; 3- HBSS; 4- Leite de coco; 5Própolis; 6- Solução salina com antibióticos; 7- Controle positivo; 8- Controle
negativo. Intervalo de tempo 1- 30 minutos e 2- 60 minutos.
Figura 2: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com água de
coco durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul
de Trypan. Observam-se células mortas, degeneradas, presença de corpos
apoptóticos. A coloração azul indica a morte celular. Nikon, aumento de 400 x.
44
Figura 3: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com Própolis
durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de
Trypan. Observam-se células vivas. Nikon, aumento de 400 x.
Figura 4: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com Própolis
durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de
Trypan. Observam-se células vivas juntamente com células degeneradas. O
Própolis acarretou o aumento da célula por provável aumento da
permeabilidade da membrana celular. Nikon, aumento de 400x.
45
Figura 5: Controle negativo. Observa-se que todas as células apresentam-se
mortas. Nikon, aumento de 100x.
Figura 6: Controle positivo. Observam-se que todas as células apresentam-se
vivas. Nikon, aumento de 100x.
46
Figura 7: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com água de
coco durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul
de Trypan. Observa-se apoptose. Nikon, aumento de 400x.
Figura 8: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com leite de
coco durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul
de Trypan. Observa-se a presença de monócito. Nikon, aumento de 400x.
47
Figura 9: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com leite de
coco durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul
de Trypan. Observa-se célula intacta com boa aparência, monócito com
morfologia adequada, com núcleo em forma de rim. Nikon, aumento de 400x.
Figura 10: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com
Própolis durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Observa-se necrose, células degeneradas, observa-se
apoptose com fragmentação nuclear. Nikon, aumento de 400x.
48
Figura 11: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com
Própolis durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Observa-se alteração citoplasmática; núcleo começando a se
fragmentar; apoptose. Nikon, aumento de 400x.
Figura 12: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com
Própolis durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Pode-se perceber necrose da célula. Ocorrem cicatrizes na
célula, o que causa necrose. A necrose estimula o processo inflamatório.
Nikon, aumento de 400x.
49
Figura 13: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com solução
fisiológica durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao
Azul de Trypan. Observa-se necrose celular e apoptose; figuras de apoptose
(superior esquerdo); estágios diversos de apoptose; estágio avançado (inferior
esquerdo). Nikon, aumento de 400x.
50
DISCUSSÃO
No presente estudo foram avaliadas quanto à capacidade de
manutenção da viabilidade celular de macrófagos, seis soluções (água de
coco, leite, HBSS, leite de coco, própolis e solução fisiológica contendo
antibióticos) utilizadas como conservantes após avulsão dentária.
SIM et al. ( 2008) descreveram que a água de coco contém elevados
níveis de ribosídeos zeatínicos capazes de expressar atividade proteolítica
possivelmente relacionada com a esterilidade da mesma. GOPIKRISHNA et al.
(2008) relataram que a água de coco é biologicamente pura e estéril, com rica
presença de aminoácidos, proteínas, vitaminas e minerais e a análise
estatística do trabalho mostrou que a água de coco foi capaz de manter
significativamente mais células do ligamento periodontal viáveis quando
comparado com o própolis, HBSS e leite e que a água de coco pode ser usada
como um meio de transporte adequado para dentes avulsionados. No presente
estudo experimental, entretanto, encontrou-se uma pequena quantidade de
células viáveis quando expostas à solução de água de coco. Nos tempos de 30
e 60 minutos, a quantidade de células viáveis encontradas não foi maior que
34% das amostras dos poços. Houve grande ocorrência de células mortas,
degeneradas e presença de corpos apoptóticos indicando a indução de
apoptose pela água de coco em macrófagos. Este fato contra-indicaria a água
de coco como meio de transporte para dentes avulsionados como descrito por
GOPKRISHNA et al. (2008). Quanto ao fato da água de coco ser
biologicamente pura e estéril, isto poderia ser especulado. Durante sua
manipulação, a água de coco pode ser facilmente contaminada e como descrito
51
por PRABAKARAN et al. (2008) é um meio de fácil proliferação de Bacillus
thuringiensis var. israelensis bem como apresenta uma excelente condição
biológica para o desenvolvimento de outros tipos de microorganismos
contaminantes.
Em outro estudo, ABARA et al. (2007) descreveram o efeito protetor
hepático da água de coco mostrando que a ingestão de leite de coco e água de
coco aumentaram os valores das taxas de proteína e proteína/RNA e um
decréscimo de atividade da alanina e aspartato amino transferase (ALT e AST).
Estes efeitos aumentaram a indução do metabolismo de enzimas resultando
em aumento de depuração e eliminação de cafeína pelo corpo reduzindo o
efeito tóxico no fígado. Em adição, ISMAIL et al. (2007), demonstraram que a
ingestão de água de coco otimizou um melhor equilíbrio hidro-eletrolítico em
comparação com as demais bebidas comerciais. Possivelmente o efeito
depurador poderia estar relacionado com a estimulação das células de Kupffer,
as quais poderiam expressar uma maior produção de óxido nítrico e de
proteína quimiotáxica de monócitos. De acordo com a análise dos resultados
encontrados no presente trabalho, os níveis de apoptose observados parecem
estar relacionados com o aumento da atividade depurativa conforme,
SANDHYA & RAJAMAHAN (2006), descreveram um aumento das taxas de
conversão de colesterol em ácidos biliares e aumento da excreção destes
ácidos e esteróis neutros observados em ratos tratados com água de coco, a
partir de estudos histopatológicos, que revelaram menor acúmulo de gordura
nos tecidos avaliados. Eles observaram que o tratamento com água de coco
resultou em aumento plasmático de L-arginina, nos níveis urinários de nitrito e
52
na atividade da oxido-nítrico sintase. Estes resultados indicam os efeitos
benéficos da água de coco analisando os níveis séricos e os parâmetros
lipídicos tissulares. Conforme sugerido por SOMERS et al. (2008), a
calcineurina está relacionada com a produção da óxido-nítrico sintase induzida,
sabendo-se que a água de coco induz o aumento da síntese protéica e da
taxas proteína/RNA, este fato poderia estar relacionado com o aumento da
atividade da óxido-nítrico sintase juntamente com o nível de L-arginina, que
potencialmente poderiam ser mecanismos considerados responsáveis pelo
efeito apoptótico nos macrófagos isolados conforme observado em nosso
estudo in vitro. HAN et al. (2008) sugerem que o aumento na síntese de óxidonítrico sintase induzida seja um fator indutor de apoptose. De acordo com
BHUSHAN et al. (2007), o triterpenediol (TPD), isolado de Boswellia serrata
induz a um aumento de espécies reativas de oxigênio bem como de óxido
nítrico tanto pela sinalização de cascata extrínseca e intrínseca. NAKAMURA et
al. (2008) relataram que lipopolissacarídeos (LPS) isolados de raízes de
algumas plantas estudadas, de acordo com a concentração dependente,
expressaram potente efeito inibidor na expressão de óxido-nítrico sintase.
Poderia se sugerir que o efeito apoptótico relacionado com a água de coco
seria resultado do balanço de TPD/LPS em relação à expressão da óxidonítrico sintase nos macrófagos estudados.
Quanto ao própolis, HUANG et al. (2007) descreveram que o isolamento
e caracterização da propolina G do própolis Taiwanês demonstrou pela
primeira vez que este componente é um potente indutor de apoptose em
células cancerígenas do cérebro e que este componente e seu extrato
53
mostraram um efeito protetor contra estresse oxidativo em neurônios corticais
de rato. Complementando, INOKUSHI et al. (2006) descreveram que o própolis
brasileiro possui um efeito neuroprotetor contra dano à retina in vitro e in vivo, e
que a inibição do estresse oxidativo induzido pelo própolis pode ser
parcialmente responsável por estes efeitos neuroprotetores.
O própolis é uma substância resinosa usada pelas abelhas para reparo e
manutenção de suas colméias. Ele possui mais de 180 componentes incluindo
flavanóides, ácidos fenólicos e seus ésteres que apresentam efeitos antiinflamatórios, antibacterianos, antivirais, imuno-modulatórios, antioxidantes e
antiproliferativos. O própolis mostrou inibir a divisão celular e a síntese de
proteína, entretanto, o exato mecanismo por trás do efeito anti-tumoral não está
claramente descrito. De acordo com GUNDUZ et al. (2005) o efeito apoptótico
do própolis poderia estar relacionado com a inibição da expressão de
telomerases. HERNANDEZ et al. (2007) sugeriram que amostras de própolis
apresentaram uma forte atividade anti-proliferativa em células cancerígenas.
De acordo com CHEN et al. (2004a) o própolis é rico em propolinas A, B, C, D,
E e F, as quais foram capazes de induzir apoptose em células humanas com
fenótipo de melanoma; este efeito estaria relacionado com os elevados níveis
de propolinas.
CHEN et al. (2004b) demonstraram que duas prenilflavononas, a
propolina A e B induziram apoptose em células melanômicas humanas bem
como significante inibição da atividade da xantina oxidase. O isolamento e a
caracterização da propolina C do própolis de abelha permitiu se avaliar que
este composto é um excelente indutor de apoptose em células melanômicas
54
humanas. ONCAG et al. (2006) revelaram que o própolis apresenta uma
excelente atividade antibacteriana, sugerindo que o mesmo possa ser usado
como medicação intra-canal alternativa.
SABIR et al. (2005) sugeriram que o capeamento pulpar direto com
flavonóides do própolis em ratos podem retardar a inflamação pulpar e
estimular a formação de dentina reparadora.
De acordo com HAYACIBARA et al. (2005) os componentes
cariostáticos do própolis tipo 3 e 12 são apolares e H-fr é a fração de escolha
para identificar novos agentes anti-cariogênicos.
BOTUSHANOV et al. (2001) descreveram que o própolis é uma
substância produzida pelas abelhas com pronunciado efeito anti-inflamatório. É
um ingrediente para muitas drogas e adicionado às pastas de dente como um
componente profilático para doenças periodontais onde estas pastas de dentes
mostraram uma excelente remoção de placa, efeito inibidor e anti-inflamatório
da placa. Artepillina C possui atividade antibacteriana e quando aplicada em
células tumorais malignas de humanos e camundongos in vitro e in vivo,
artepillina C exibiu um efeito citotóxico e o crescimento das células tumorais foi
claramente inibido. Os efeitos citotóxicos da artepillina C foram mais
documentados em carcinomas e melanomas. Apoptose, paralização de
mitoses e necrose foram identificadas através de observação histológica após
injeção intra-tumoral de artepillina C. Foi indicado por KIMOTO et al. (1998)
que a artepillina C ativou o sistema imune e possui direta atividade antitumoral. Ela é um ingrediente ativo do própolis brasileiro e quando aplicada às
células leucêmicas humanas in vitro exibiu potente efeito citotóxico e induziu
55
marcados níveis de apoptose em todas as células. Os maiores efeitos
ocorreram nas células T. Houve indução nas células de formação de corpos
apoptóticos e fragmentação do DNA. A síntese de DNA nas células leucêmicas
foi
claramente
inibida
e
a
desintegração
celular
foi
confirmada
microscopicamente. Os resultados sugerem que artepellina C, um ingrediente
ativo do própolis brasileiro apresenta efeitos anti-leucêmicos.
Pinocenbrim é o flavonóide mais abundante no própolis e tem sido
comprovado apresentar propriedades anti-oxidantes, anti-bacterianas e antiinflamatórias. De acordo com GAO et al. (2008), Pinocembrim poderia também
regular a expressão de protína p53 e inibir a liberação do citocromo c da
mitocôndria para o citosol.
AVCI et al. (2007) verificaram os efeitos apoptóticos e citotóxico do
CAPE (caffeic acid phenethyl ester). CHEN et al. (2007) sugeriram que
propolina A e propolina B podem ativar apoptose mitocôndria-mediada, sendo
potentes anti-oxidantes.
MISHIMA et al. (2005) documentaram que extrato de própolis brasileiro
inibiu o crescimento de células leucêmicas humanas, o que foi em parte
atribuído à indução de apoptose associada à diferenciação granulocítica.
GOPIKRISHNA et al. (2008) demonstraram uma grande quantidade de
células do ligamento periodontal viáveis após exposição ao própolis por 30
minutos. No presente trabalho apesar da análise quantitativa no mesmo
intervalo de tempo nos indicar resultados semelhantes, a análise qualitativa já
indica ocorrência de apoptose.
56
ÖZAN et al. (2007) testaram a capacidade do própolis na manutenção
da vitalidade das células do ligamento periodontal em diferentes intervalos de
tempo encontrando uma alta taxa de células viáveis até 3 horas após
exposição o que não condiz com o presente trabalho.
MARTIN & PILEGGI (2004) demonstraram uma significante maior
capacidade de manutenção da viabilidade das células do ligamento periodontal
quando expostas ao própolis ao se comparar com leite, solução salina ou
HBSS tendo sido o tempo de exposição de 45 minutos.
No presente trabalho, embora inicialmente (nos primeiros 30 minutos), a
análise quantitativa de apoptose não tenha sido significativa, a análise
morfológica qualitativa indica a capacidade do própolis induzir apoptose em
macrófagos. Após 60 minutos a quantidade de células mortas como
conseqüência da apoptose aumentou drasticamente.
Quanto ao leite, ele é aceito pela Associação Americana de
Endodontistas (1995) como meio de transporte para dentes avulsionados.
ÖZAN et al. (2007) concordam com trabalhos anteriores que indicam o
leite como meio adequado de manutenção da viabilidade das células do
ligamento periodontal, sendo indicado o leite com baixo teor de gordura.
MARTIN & PILEGGI (2004) obtiveram resultados semelhantes a
trabalhos anteriores com o leite como meio de transporte para dentes
avulsionados, não apresentando diferença estatística significante com relação
ao HBSS.
MARINO et al. (2000) demonstraram que o leite longa vida, que tem a
vantagem de não requerer refrigeração, é tão efetivo quanto o leite
57
pasteurizado e mais efetivo que o meio Save-A-Tooth como meio de transporte
de dentes avulsionados na manutenção da viabilidade das células do ligamento
periodontal. Em estudo semelhante, PEARSON et al. (2003) comparando
alguns tipos comerciais e diferentes formulações de leite quanto à capacidade
de manutenção da viabilidade das células do ligamento periodontal, concluíram
que o Enfamil, uma formulação para bebês rica em suplementos, se mostrou
mais efetivo que as demais formulações pelo menos após 4 horas de
exposição.
BLOMLOF et al. (1980) demonstraram que o leite é capaz de promover
melhor conservação do ligamento periodontal que a saliva ou a solução salina
em macacos. Novamente BLOMLOF (1981) demonstrou que as células do
ligamento periodontal em humanos sobreviveram adequadamente em leite,
com 50% das células vitais após 12 horas de armazenamento e a combinação
de breve armazenamento em saliva e subseqüente armazenamento em leite,
foi melhor que somente em saliva. BLOMLOF et al. (1983) demonstraram que
após exposição do ligamento periodontal ao leite por 2 ou 6 horas este sofreu
um adequado reparo semelhante aos que foram submetidos ao reimplante
imediato. RAM & COHENCA (2003) atentam para o fato do leite ser um meio
recomendado e fácil de ser achado em qualquer local.
No presente trabalho, o grupo tratado com o leite apresentou uma
quantidade significativa de células vitais em 30 minutos e este resultado se
manteve após 60 minutos o que indica que o leite é um meio estável na
manutenção da vitalidade celular com uma variação de tempo de exposição,
além disso, a conformação celular se apresentou adequada de um modo geral.
58
Quanto à solução salina (ou soro fisiológico), RAM & COHENCA (2003)
indicam que esta seria a terceira opção após a solução salina balanceada de
Hank (HBSS) e o leite, mas não é tão facilmente encontrado como o leite. De
acordo com MARTIN & PILEGGI (2004) a solução salina demonstrou piores
resultados que o própolis.
De acordo com TANOMARU et al. (2003) a solução salina não interferiu
na atividade inflamatória demonstrando que não houve indução de apoptose,
diferentemente do observado no presente estudo.
Quanto à solução salina balanceada de Hank (HBSS), KHADEMI et al.
(2008) demonstraram que tanto o ovo quanto o HBSS apresentaram melhores
resultados na manutenção das células do ligamento periodontal que o leite e a
água, o que diferiu do presente trabalho pois a quantidade de macrófagos vitais
foi maior após exposição ao leite que ao HBSS tanto após 30 quanto após 60
minutos.
Quanto ao leite de coco, de acordo com NNELI & WOYIKE (2008), foi
relatado que o leite de coco exerceu um efeito citoprotetor maior em
comparação com a água de coco, em nível de mucosa gástrica de ratos, em
nosso estudo, pudemos observar que, de fato, o grupo de células tratado com
o extrato de leite de coco apresentou uma maior viabilidade ao longo dos
diferentes tempos de tratamento quando comparado com o grupo tratado com
a água de coco.
De acordo com PRYARDARSHANI & CHANDRIKA (2007), o leite de
coco apresenta carotenóides, os quais exibem efeito anti-oxidante e exercem
uma possível atividade anti-apoptótica.
59
CONCLUSÕES
De acordo com a metodologia empregada neste trabalho, podemos
sugerir, com base nos resultados obtidos, que com relação à análise
quantitativa, houve diferença significante somente entre o grupo controle
positivo e o grupo de células expostas à água de coco tanto após 30 como
após 60 minutos e entre o grupo de células expostas à água de coco e ao leite
de coco após 30 minutos. Com relação à análise qualitativa, o grupo de células
exposto à água de coco apresentou apoptose e grande quantidade de células
mortas; o grupo de células expostas ao própolis e à solução fisiológica com
antibióticos apresentaram uma grande quantidade de células com vitalidade
nos primeiros 30 minutos porém em 60 minutos demonstraram um grande
declínio na quantidade de células vitais, o que as torna de pouca utilidade nos
casos que necessitam de períodos mais longos de conservação; o leite embora
tenha mantido menor quantidade de células vitais que as duas últimas
soluções, em 60 minutos manteve os mesmos padrões, se mostrando mais
estável. O grupo exposto à solução salina balanceada de Hank apresentou
níveis baixos de células vitais em ambos os intervalos e o leite de coco foi a
melhor solução em 30 e 60 minutos tanto na manutenção da vitalidade celular
quanto na manutenção da conformação celular.
60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abara AE, Obochi GO, Obi-Abang M, Malu SP, Ekam VS, Uboh FE, Edu FE
(2007). Effect of caffeine-coconut products interactions on induction of
microsomal drug-metabolizing enzymes in Wistar Albino rats. Niger J Physiol
Sci; 22(1-2):75-81.
Amarante-Mendes, GP (2003). Apoptose: Programa molecular de morte
celular. Einstein, 1: 15-18.
American Association of Endodontists (1995). Recommended guidelines for the
treatment of the avulsed permanent tooth. Chicago, I.L: American Association
of Endodontists.
Anderson L, Al-Asfour A, Al-Jame Q (2006). Knowledge of first-aid measures of
avulsion and replantation of teeth: an interview of 221 Kuwaiti schoolchildren.
Endod Dent Traumatol; 22: 57-65.
Andreasen JO (1993). Atlas de reimplante e transplante de dentes. 1ª ed.
Editora Panamericana; 40-125.
Andreasen JO (1985). Challenges in clinical dental traumatology. Endod Dent
Traumatol, 1: 45-55.
61
Andreasen JO (1970). Etiology and pathogenesis of traumatic dental injuries.
Scand J Dent Res, 78: 329-342.
Andreasen JO, Andreasen FM (2001). Texto e atlas colorido de traumatismo
dental. 3ª ed. Editora Artmed; 383-419.
Andreasen JO, Ravn JJ (1972). Epidemiology of traumatic dental injuries to
primary and permanent teeth in Danish population sample. Int. J. Surg, 1: 235239.
Avci CB, Sahin F, Gunduz C, Selvi N, Aydin HH, Oktem G, Topcuoglu N,
Saydam G (2007). Protein phosphatase 2A (PP2A) has a potential role in
CAPE-induced apoptosis of CCRF-CEM cells via effecting human telomerase
reverse transcriptase activity. Hematology; 12(6):519-25.
Bhushan S, Kumar A, Malik F, Andotra SS, Sethi VK, Kaur IP, Taneja SC, Qazi
GN, Singh JA (2007). Triterpenediol from Boswellia serrata induces apoptosis
through both the intrinsic and extrinsic apoptotic pathways in human leukemia
HL-60 cells. Apoptosis; 12(10):1911-26.
Blomlof, L (1981). Storage of human periodontal ligament cells in combination
of different media. J Dent Res; 60(11): 1904-1906.
62
Blomlof L, Lindskog S, Andersson L, Hedstrom KG, Hammarstrom L (1983).
Storage of experimentally avulsed teeth in milk prior to replantation. J Dent Res;
62(8): 912-916.
Blomlof L, Lindskog S, Hedstrom KG, Hammarstrom L (1980). Vitality of
periodontal ligament cells after storage of monkey teeth in milk or saliva.
Scandinavian J Dent Res; 88: 441-445.
Botushanov PI, Grigorov GI, Aleksandrov GA (2001). A clinical study of a
silicate toothpaste with extract from propolis. Folia Med (Plovdiv);43(1-2):28-30.
Chamorro MM, Regan JD, Operrman LA, Kramer PR (2008). Effetc of storage
media on human periodontal ligament cell apoptosis. Dent Traumatol; 24:11-16.
Chen CN, Weng MS, Wu CL, Lin JK (2004a). Comparison of radical scavenging
activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by
Taiwanese Propolis from different sources. Evid Based Complement Alternat
Med; 1(2):175-185.
Chen CN, Wu CL, Lin JK (2007). Apoptosis of human melanoma cells induced
by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwenese propolis.
Cancer Lett; 245(1-2):218-31.
63
Chen CN, Wu CL, Lin JK (2004b). Propolin C from propolis induces apoptosis
through activating caspases, bid and cytochrome c release in human melanoma
cells. Biochem Pharmacol.; 67(1):53-66.
Cho S, Cheng AC (2002). Replantation of an avulsed incisor after prolonged dry
storage: a case report. J Can Dent Assoc, 68 (5): 297-300.
Consolaro A (2005). Reabsorções dentárias nas especialidades clínicas. 2ª ed.
Editora Dental Press; 1-53.
Fagade OO (2005). Extra-alveolar storage media for tooth autotransplants and
replants. The Int J Dent Science, 2; 2: 1-9.
Gao M, Zhang WC, Liu QS, Hu JJ, Liu GT, Du GH (2008). Pinocembrin
prevents glutamate-induced apoptosis in SH-SY5Y neuronal cells via decrease
of bax/bcl-2 ratio. Eur J Pharmacol Jun 24. [Epub ahead of print]
Gopikrishna V, Baweja P, Venkateshbabu N, Thomas T, Kandaswamy D
(2008). Comparison of Coconut water, Propolis, HBSS, and Milk on PDL cell
survival. J Endod, 34: 587-589.
64
Gunduz C, Biray C, Kosova B, Yilmaz B, Eroglu Z, Sahin F, Omay SB, Cogulu
O (2005). Evaluation of Manisa propolis effect on leukemia cell line by
telomerase activity. Leuk Res; 29(11):1343-6.
Han W, Fu S, Wei N, Xie B, Li W, Yang S, Li Y, Liang Z, Huo H (2008). Nitric
oxide overproduction derived from inducible nitric oxide synthase increases
cardiomyocyte apoptosis in human atrial fibrillation. Int J Cardiol; Jun 26. [Epub
ahead of print]
Hayacibara MF, Koo H, Rosalen PL, Duarte S, Franco EM, Bowen WH, Ikegaki
M, Cury JA (2005). In vitro and in vivo effects of isolated fractions of brazilian
propolis on caries development. J Ethnopharmacol;101(1-3):110-5.
Hernandez J, Goycoolea FM, Quintero J, Acosta A, Castañeda M, Dominguez
Z, Robles R, Vazquez-Moreno L, Velazquez EF, Astiazaran H, Lugo E,
Velazquez
C
(2007).
Sonoran
propolis:
chemical
composition
and
antiproliferative activity on cancer cell lines. Planta Med; 73(14):1469-74.
Hortelano S, García-Martín ML, Cerdán S, Castrillo A, Alvarez AM, Boscá L
(2001). Intracellular water motion decreases in apoptotic macrophages after
caspase activation. Cell Death & Differentiation, 10:1022-1028.
65
Huang WJ, Huang CH, Wu CL, Lin JK, Chen YW, Lin CL, Chuang SE, Huang
CY, Chen CN (2007). Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese
propolis, induces caspase-dependent apoptosis in brain cancer cells. J Agric
Food Chem; 55(18):7366-76.
Inokuchi Y, Shimazawa M, Nakajima Y, Suemori S, Mishima S, Hara H (2006).
Brazilian green propolis protects against retinal damage in vitro and in vivo.
Evid Based Complement Alternat Med; 3(1):71-7.
Ismail I, Singh R, Sirisinghe RG (2007). Rehydration with sodium-enriched
coconut water after exercise-induced dehydration. Southeast Asian J Trop Med
Public Health; 38(4):769-85.
Keum K, Kwon O, Spängberg LS, Kim C, Kim J, Cho M, Lee S (2003). Effect of
dexamethasone on root resorption after delayed replantation of rat tooth. J
Endod; 29: 810-813.
Khademi AA, Atbaee A, Razavi SM, Shabanian M (2008). Periodontal healing
of replanted dog teeth stored in milk and egg albumen. Dent Traumatol;
24(5):510-4.
66
Kimoto T, Arai S, Kohguchi M, Aga M, Nomura Y, Micallef MJ, Kurimoto M, Mito
K (1998). Apoptosis and suppression of tumor growth by artepillin C extracted
from Brazilian propolis. Cancer Detect Prev; 22(6):506-15.
Lin S, Zuckerman O, Fuss Z, Ashkenazi M (2007). New emphasis in the
treatment of dental trauma: avulsion and luxation. Endod Dent Traumatol; 23:
297-303.
Lustosa-Pereira A, Garcia RB, de Moraes IG, Bernardineli N, Bramante CM,
Bortoluzzi EA (2006). Evaluation of the topical effect of alendronate on the root
surface of extracted and replanted teeth. Microscopic analysison rats’ teeth.
Endod Dent Traumatol; 22:30-35.
Manfrin TM, Boaventura RS, Poi WR, Panzarini SR, Sonoda CK, Sundefeld
MLMM (2007). Analysis of procedures used in tooth avulsion by 100 dental
surgeons. Endod Dent Traumatol; 23:203-210.
Marino TG, West LA, Liewehr FR, Mailhot JM, BuxtonTB, Runner RR,
McPherson IIIJC (2000). Determination of periodontal ligament cell viability in
long shelf-life milk. J Endod; 26:699-702.
Martin MP, Pileggi R (2004). A quantitative analysis of Propolis: a promising
new storage media following avulsion. Endod Dent Traumatol; 20: 80-85.
67
Mishima S, Inoh Y, Narita Y, Ohta S, Sakamoto T, Araki Y, Suzuki KM, Akao
Y, Nozawa Y (2005). Identification of caffeoylquinic acid derivatives from
Brazilian propolis as constituents involved in induction of granulocytic
differentiation of HL-60 cells. Bioorg Med Chem; 13(20):5814-8.
Mitchell RN, Kumar V, Abbas AK, Fausto N (2006). Fundamentos de Patologia.
7ª ed. Editora Elsevier.
Nakamura T, Kodama N, Kumamoto T, Higuchi Y, Chaichantipyuth C, Ueno K,
Ishikawa T, Yano S (2008). Inhibitory effect of the extracts from Thai medicinal
plants on iNOS expression in mouse macrophage RAW 264.7.Nat Med (Tokyo);
Jul 15. [Epub ahead of print].
Nneli RO, Woyike OA (2008). Antiulcerogenic effects of coconut (Cocos
nucifera) extract in rats. Phytother Res; 22(7) 970-2.
Oncag O, Cogulu D, Uzel A, Sorkun K (2006). Efficacy of propolis as an
intracanal medicament against Enterococcus faecalis. Gen Dent; 54(5):319-22.
Özan F, Polat ZA, Er K, Özan U, Deger O (2007). Effect of Propolis on survival
of periodontal ligament cells: new storage media for avulsed teeth. J Endod; 33:
570-573.
68
Pearson RM, Liewehr FR, West LA, Patton WR, McPherson JC, Runner RR
(2003). Human periodontal ligament cell viability in milk and milk substitutes. J
Endod 29: 184-186.
Pohl Y, Fillippi A, Kirschner H (2005). Results after replantation of avulsed
permanent teeth. II. Periodontal healing and the role of physiologic storage and
antiresorptive-regenerative therapy. Endod Dent Traumatol; 21: 93-101.
Poi WR, Carvalho RM, Panzarini SR, Sonoda CK, Manfrin TM, Rodrigues TS
(2007). Influence of enamel matrix derivate (Emdogain®) and sodium fluoride on
the healing process in delayed tooth replantation: histologic and histometric
analysis in rats. Endod Dent Traumatol; 23: 35-41.
Prabakaran G, Hoti SL, Manonmani AM, Balaraman K (2008). Coconut water
as a cheap source for the production of delta endotoxin of Bacillus thuringiensis
var. israelensis, a mosquito control agent. Acta Trop; 105(1):35-8.
Priyadarshani AM, Chandrika UG (2007). Content and in vitro accessibility of
pro-vitamin A carotenoids from Sri Lankan cooked non-leafy vegetables and
their estimated contribution to vitamin A requirement. Int J Food Sci Nutr; 58(8):
659-67.
69
Ram D, Cohenca N (2003). Therapeutic protocols for avulsed permanent teeth:
review and clinical update. Pediatr Dent; 26:251-255.
Sabir A, Tabbu CR, Agustiono P, Sosroseno W (2005). Histological analysis of
rat dental pulp tissue capped with propolis. J Oral Sci; 47(3):135-8.
Sandhya, VG, Rajamohan, T (2006). Beneficial effects of coconut water feeding
on lipid metabolism in cholesterol-fed rats. J Med Food.; 9(3):400-7.
Schwartz O, Andreasen FM, Andreasen JO (2002). Effects of temperature,
storage time and media on periodontal and pulpal healing after replantation of
incisors in monkeys. Endod Dent Traumatol; 18: 190-195.
Sim GE, Goh CJ, Loh CS (2008). Induction of in vitro flowering in Dendrobium
Madame Thong-In (Orchidaceae) seedlings is associated with increase in
endogenous
N(6)-(Delta(2)-isopentenyl)-adenine
(iP)
and
N(6)-Delta(2)-
isopentenyl)-adenosine (iPA) levels. Plant Cell Rep; 27(8):1281-9.
Somers JR, Beck PL, Lees-Miller JP, Roach D, Li Y, Loken S, Zhan S,
Semeniuk L, Duff HJ (2008). iNOS in Cardiac Myocytes Plays a Critical Role in
70
Death in a Murine Model of Hypertrophy Induced by Calcineurin. Am J Physiol
Heart Circ Physiol Jul 11.
Tabas I (2005). Conseqüences and therapeutic implications of macrophage
apoptosis in atherosclerosis. The importance of lesion stage and phagocytic
efficiency. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2005; 25: 22552264.
Tanomaru JM, Leonardo MR, Tanomaru Filho M, Bonetti Filho I, Silva LA
(2003). Effect of different irrigation solutions and calcium hidroxide on bacterial
LPS. Int Endod J, 36 (11): 733-9.
Tronstad L (1988). Root resorption- etiology, terminology and clinical
manifestations. Endod Dent Traumatol; 4: 241-252.
Trope M (2002). Root resorption due to dental trauma. Endod Topics; 1: 79100.
71