EXTRAÇÃO DE DNA (2)
A EXTRAÇÃO DE DNA
Muitas pesquisas de Biologia Molecular começam com a extração de ácidos nucleicos. A lise celular
libera as moléculas em uma fase aquosa que é separada dos restos celulares por centrifugação. As
proteínas são removidas da fase aquosa por solventes orgânicos (fenol, clorofórmio). O DNA, que
permanece na fase aquosa, é precipitado com etanol e, posteriormente, purificado e suspendido
em um buffer adequado.
A existência de kits comerciais tem mudado a rotina de muitos laboratórios. Nos kits, os solventes
orgânicos são substituídos por filtros que retém o DNA, em condições de concentração salina
elevada. A eluição do DNA retido no filtro ocorre em baixa concentração salina.
A PRÁTICA NO LABORATÓRIO DE ENSINO
Por alguma razão que nos escapa, a extração de DNA é uma atividade que entusiasma a alguns e
decepciona a outros. Provavelmente, as diferenças de opinião tenham mais a ver com a
personalidade dos alunos e suas fantasias que com a atividade em si.
As etapas possíveis no laboratório de ensino são as seguintes:
1.
Trituramento do tecido, para separar as células.
2.
Lise das membranas celulares com detergente, em uma solução salina,
para liberar os ácidos nucleicos e as proteínas.
3.
Digestão das proteínas por ação enzimática de proteases (Opcional).
4.
Precipitação com etanol gelado. O DNA é solúvel em álcool, mas torna-
se insolúvel na presença de sal (NaCl), porque o sódio neutraliza a carga
negativa dos grupos fosfatos. O etanol formará uma camada na superfície por
ser menos denso que a solução aquosa.
5.
Observação de agregados moleculares, de consistência mucoide, na
interface entre a solução aquosa e o álcool.
Os agregados moleculares obtidos são uma mistura em proporção variável de ácidos nucleicos,
proteínas e pectina, um carboidrato presente na lamela intercelular e no vacúolo das células
vegetais.
BIBLIOGRAFIA
MADDEN D. Discovering DNA. Science in School 1: Spring 2006.
http://www.scienceinschool.org.
GENETIC SCIENCE LEARNING CENTER. How to extract DNA from anything living.
http:// learn.genetics.utah.edu
Guia 69
Maria Antonia Malajovich / Guias de atividades
Biotecnologia: ensino e divulgação
http://www.bteduc.bio.br
EXTRAÇÃO DE DNA (2) / PROCEDIMENTO BÁSICO COM ERVILHA
ATIVIDADE PRÁTICA
OBJETIVO
Extrair DNA mediante um procedimento simples.
MATERIAIS
Um pacote de ervilha seca, sal grosso, detergente, água fria, liquidificador, coador, béquer,
amaciante de carne com protease (papaína), etanol gelado, tubos de ensaio e grade (substituíveis
por frascos pequenos ou copos), 1 pipeta ou proveta, vareta de madeira ou agulha de crochet.
O etanol deve ser colocado no congelador, em frasco fechado, pelo
menos um dia antes da realização da prática.
PROCEDIMENTO
As membranas celulares e nucleares das células de ervilha são desagregadas com detergente, em
solução salina, liberando os ácidos nucleicos que precipitam com a adição de etanol gelado.
1. Bater no liquidificador 100 ml de ervilha seca, uma pitada de sal grosso e 200 ml de água fria,
por 15 a 20 segundos.
2. Coar a “sopa de ervilha rala” obtida anteriormente e descartar os restos de ervilha. Continuar o
procedimento com a fração líquida filtrada.
3. Acrescentar 2 colheres, das de sopa, de detergente líquido. Misturar suavemente.
4. Aguardar 5 a 10 minutos. Durante esse tempo colocar em cada tubo, ou em cada frasco, uma
pitada de amaciante de carne.
5. Distribuir a mistura nos tubos ou nos frascos (1/3 da capacidade do recipiente escolhido).
6. Acrescentar um volume equivalente de etanol 950gelado.
Esta etapa é crítica, deve-se inclinar levemente o tubo e,
muito devagar, deixar escorrer o etanol sobre o líquido de
maneira a formar uma segunda camada por cima da
mistura.
7. Aguardar 10 minutos
sem
Etanol
gelado
misturar as camadas e
observar o DNA que precipita na interface das duas e
sobe até a superfície.
8. Retirar o DNA com uma vareta de madeira ou uma agulha
de crochet.
Guia 69
Maria Antonia Malajovich / Guias de atividades
Biotecnologia: ensino e divulgação
http://www.bteduc.bio.br
EXTRAÇÃO DE DNA (2) / PROCEDIMENTO BÁSICO COM ERVILHA
Guia 69
Maria Antonia Malajovich / Guias de atividades
Biotecnologia: ensino e divulgação
http://www.bteduc.bio.br
EXTRAÇÃO DE DNA (2) / PROCEDIMENTO BÁSICO COM ERVILHA
NOSSO COMENTÁRIO
De todos os protocolos analisados e testados, este do Genetic Science Learning Center é o nosso
preferido, porque além de apresentar um procedimento simples, utiliza como fonte de DNA um
material barato, fácil de encontrar em qualquer época do ano.
Os primeiros protocolos de extração de DNA que foram desenvolvidos para serem aplicados em
laboratórios de ensino, utilizavam fígado e timo como fonte de DNA. Com a disseminação da
doença de Creutzfeldt-Jacob (doença da vaca louca), razões de biossegurança invalidaram o uso de
órgãos animais, que foram substituídos por outras fontes, de origem vegetal. Contudo, as células e
tecidos vegetais contém pectina, um polissacarídeo que precipita com etanol, assim como o DNA
em solução salina.
OS AGREGADOS MOLECULARES NÃO SÃO DE PECTINA
Para diferenciar a pectina e o DNA nos agregados moleculares obtidos, investigou-se a presença do
polissacarídeo na ervilha seca. Esta foi triturada e misturada com a quantidade de água prevista no
protocolo. Uma vez coada obteve-se uma “sopa” rala, da qual foram separadas duas alíquotas.
A primeira foi misturada a uma quantidade igual de etanol, agitada e deixada em repouso para
decantar. O teste do álcool para a determinação do teor de pectina deve ser interpretado como a
seguir:

A aparição de um precipitado gelatinoso e firme é sinal de bastante pectina (+++).

Um precipitado mais ou menos gelatinoso, que se rompe por agitação leve, corresponde a um
teor médio (++).

Um precipitado filamentoso granulado corresponde a baixo teor de pectina (+).
Na segunda alíquota, acrescentaram-se o sal e o detergente para completar a extração do DNA
segundo o protocolo.
Os resultados podem ser vistos na Figura 1. A comparação entre ambas as fotos indica que os
filamentos observados na imagem à direita seriam de DNA e não de pectina. A confirmação
dependeria do resultado de um tratamento desses filamentos com DNAse, um teste que está fora
de nossas possibilidades.
Guia 69
Maria Antonia Malajovich / Guias de atividades
Biotecnologia: ensino e divulgação
http://www.bteduc.bio.br
EXTRAÇÃO DE DNA (2) / PROCEDIMENTO BÁSICO COM ERVILHA
Figura 1: Extração de DNA de ervilha seca.
Pectina
Teste de pectina (baixo teor)
DNA
Extração de DNA
A AÇÃO DE DIFERENTES DETERGENTES
Muitos dos protocolos disponíveis recomendam o uso de SDS (dodecilsulfato sódico). Este não é
um detergente usual, de modo que nos experimentos foram utilizados produtos do supermercado.
Comparou-se a eficiência de dois agentes detergentes: o lava louças Limp e o lava roupas Ariel
líquido. Como este último contém enzimas (proteases, lipases e celulases), omitimos a adição de
protease no procedimento correspondente.
A Figura 2 mostra a extração de DNA realizada satisfatoriamente com os dois produtos. Com Ariel,
o resultado foi más rápido.
Guia 69
Maria Antonia Malajovich / Guias de atividades
Biotecnologia: ensino e divulgação
http://www.bteduc.bio.br
EXTRAÇÃO DE DNA (2) / PROCEDIMENTO BÁSICO COM ERVILHA
Figura 2: Extração de DNA de ervilha seca com diferentes agentes detergentes.
Teste de pectina Extração com o detergente Limp
Extração com Ariel líquido
O TRATAMENTO COM CALOR
Outra recomendação encontrada nos protocolos que circulam na Internet é que a mistura “sopa” +
sal + detergente seja colocada no banho Maria a 55-600C, de modo a inativar as enzimas
presentes e favorecer a liberação do DNA. Em outros protocolos, a temperatura do banho é de
700C. Em todos eles, uma vez transcorridos 15 minutos exatos, a mistura deve ser transferida a
um banho de gelo, para evitar a degradação do DNA. Esfriada a mistura, acrescenta-se a protease.
Os resultados da extração de DNA de ervilha seca com e sem tratamento com calor podem ser
visualizados na Figura 3. O protocolo do GSLC (Genetic Science Learning Center), que não
contempla o tratamento com calor, nos permitiu extrair DNA da ervilha. Acrescentando o
tratamento com calor ao mesmo protocolo, obtiveram-se aglomerados gelatinosos de pectina.
A ervilha contém pectina. Uma extração rápida a temperatura ambiente libera DNA, mas uma
extração mais demorada a uma temperatura alta (600 C) durante 15 minutos provocaria a
gelatinização da pectina, gerando a nuvem turva que se observa nas três repetições do
experimento.
Em função dos resultados anteriores, não vemos nenhuma necessidade de complicar o
procedimento. Para alcançar objetivos didáticos, o tratamento com calor resulta supérfluo.
Guia 69
Maria Antonia Malajovich / Guias de atividades
Biotecnologia: ensino e divulgação
http://www.bteduc.bio.br
EXTRAÇÃO DE DNA (2) / PROCEDIMENTO BÁSICO COM ERVILHA
Figura 3: Extração de DNA de ervilha seca.
Os três frascos à esquerda, correspondem a extrações sem tratamento de calor, os três frascos à
direita a extrações com tratamento de calor.
Sem tratamento de calor
Com tratamento de calor
A OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA
Recomendada em vários protocolos e frequentemente solicitada pelos alunos, a observação
microscópica dos filamentos resulta, obviamente, um fiasco. Nunca falta alguém que acredite poder
ver a dupla hélice e não adianta falar em nanômetros. A decepção permanece.
MEDIDAS DE MASSA SECA
O DNA extraído pode ser colocado a secar em um papel de filtro ou em um pedaço de papel de
alumínio. A massa pode ser calculada como
Massa (papel + DNA) – Massa (papel) = Massa DNA
A menos de contar com uma balança adequada, o procedimento de secagem e pesagem do DNA
não subministra dados interessantes.
Guia 69
Maria Antonia Malajovich / Guias de atividades
Biotecnologia: ensino e divulgação
http://www.bteduc.bio.br
EXTRAÇÃO DE DNA (2) / PROCEDIMENTO BÁSICO COM ERVILHA
COMO MONTAR UM PROJETO
Comparar os resultados da extração de DNA de ervilha com os de outros grãos (lentilha, por
exemplo).
Comparar os resultados da extração de DNA de ervilha seca, de ervilha congelada e de ervilha
enlatada.
Comparar os resultados obtidos com diferentes proteases (suco de abacaxi, líquido para a limpeza
de lentes de contato etc.).
Comparar os resultados obtidos quando se acrescenta a protease junto com o detergente.
Comparar a quantidade de DNA extraído a partir de diferentes fontes.
1
Guia 69
2
3
4
5
Maria Antonia Malajovich / Guias de atividades
Biotecnologia: ensino e divulgação
http://www.bteduc.bio.br