UNIVERSIDADE FEDERAL DE RORAIMA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS
IOLETE DO NASCIMENTO ARAÚJO MACIEL
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE, CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E BOTÂNICA DE MEL
AMARGO PROVENIENTE DO MUNICÍPIO DO CANTÁ - RR
Boa Vista, RR
2013
IOLETE DO NASCIMENTO ARAÚJO MACIEL
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE, CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E BOTÂNICA DE MEL
AMARGO PROVENIENTE DO MUNICÍPIO DO CANTÁ - RR
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa
de
Recursos
Naturais
da
Universidade Federal de Roraima, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais. Área de
concentração: Bioprospecção.
Orientadora: Profª. Drª. Adriana Flach.
Boa Vista, RR
2013
À Letícia Maria, minha querida filha, pelo
carinho e afeto incondicional. Te amo filha.
AGRADECIMENTOS
A Deus, meu refúgio espiritual.
À Universidade Federal de Roraima, pela oportunidade.
Ao CNPq pelo financiamento.
Ao meu marido, Márcio Ferreira Maciel, por estar sempre ao meu lado com carinho, apoio,
incentivo e compreensão;
À minha filha, Letícia Maria Araújo Maciel, por me receber “todos os dias” com o sorriso
aberto e abraço apertado, que renova as minhas energias e me encoraja a continuar na batalha.
À minha família: mãe, pai, sogro, sogra, irmãos, cunhados, primos, sobrinhos... Pelo incentivo
e apoio.
À minha orientadora, Profª Drª Adriana Flach, pelo exemplo, pelos ensinamentos, dedicação,
paciência e apoio, mas também, por ter me permitido desfrutar de sua amizade.
Ao Profº Drº Luiz Antônio Mendonça Alves da Costa, por sempre estar disposto a colaborar
com suas críticas, sugestões e orientações.
Ao Profº Drº José Silvio Reis da Silva, pela análise melissopalinológica, pelas dicas e
sugestões.
À Drª Andréa Flores, curadora do Museu Integrado de Roraima, pela identificação botânica e
sugestões.
À Profª Drª Maria Lúcia Belém Pinheiro, da Universidade Federal do Amazonas, por ceder
gentilmente, o laboratório de espectrometria de massas; e ao Felipe Moura, doutorando que
me auxiliou no preparo das amostras e análises por ESI/MS/MS e APCI/MS/MS.
Aos professores da banca examinadora, que colaboraram com suas críticas e sugestões.
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais, que
colaboraram com a minha formação, contribuindo com discussões e partilhando
conhecimentos nas aulas ministradas.
Ao Profº Drº Márcio Akira Couceiro e à Profª Drª Flavia Antunes, pelo incentivo na
participação da seleção do mestrado e realização desta pesquisa.
Aos colegas de caminhada “do mestrado”, pelo carinho, apoio e desabafos. Em especial, à
Debora, à Elisangela, à Érica Veras, à Érika Perli, à Mayara, ao Leandro e ao Edmar, que
estiveram mais próximos e compartilharam comigo sua companhia, carinho, ombro amigo e
amizade.
Aos colegas do laboratório de moléculas bioativas, Edneide, Etyene, Gilmar, Iolanda (minha
irmã querida) e Márcia, pela demonstração de carinho, respeito e colaboração no
desenvolvimento
desta
pesquisa,
seja
nas
injeções
no
CG-EM,
nas
análises
espectrofotométricas, no preparo dos extratos ou nas conversas e cafezinhos tão agradáveis.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
Meu sincero “muito obrigada”!
RESUMO
No município do Cantá-RR a produção de mel amargo é atribuída pelos apicultores da região
ao período de floração das plantas do gênero Vochysia. Esta pesquisa tem como objetivo
investigar a existência de marcadores químicos que possam confirmar a origem botânica deste
mel, bem como verificar sua composição química e atividade antioxidante. Para tanto, foram
elaborados extratos de mel amargo por XAD-2, C18, líquido-líquido e mel bruto liofilizado.
Para comparação da constituição foram obtidos também os extratos etanólicos das flores sem
anteras e das anteras das flores (ricos em pólen). Os extratos de mel por XAD-2 e etanólicos
das flores foram fracionados, sendo obtidos extratos hexânico, clorofórmico, acetato de etila e
metanólico. Análises por espectrometria de massas foram realizadas com os diversos extratos
e verificou-se uma grande semelhança entre os espectros. Por meio de padrões autênticos,
foram identificados a crisina e o ácido cafeico nos extratos do mel amargo. Nas análises dos
extratos hexânicos, por meio de cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas
(CG-EM), foram identificados diversos n-alcanos e n-alcenos com tempos de retenção e
índices de retenção idênticos no mel e nas flores. Para determinar a posição da dupla ligação
realizou-se uma derivatização com dimetildissulfeto. Os n-alcenos semelhantes nos extratos
do mel e das flores apresentaram insaturação na posição 1. Análises espectrofotométricas
foram realizadas para quantificar os compostos fenólicos e foram obtidos 94,64 mg ácido
gálico/100g de mel e os flavonoides com 86,23 g quercetina/100g de mel. O mel apresentou
uma coloração branca, com base na escala de Pfund e a atividade antioxidante, um IC 50 de
16,94 mg/mL, determinado por meio do método do DPPH. Este trabalho permitiu confirmar a
origem botânica do mel obtida por melissopalinologia e por dados químicos, além de
caracterizar quimicamente o mel através da quantificação de algumas classes de produtos
naturais e sua atividade antioxidante.
Palavras-chave: Vochysaceae. Fenólicos. Flavonoides. Hidrocarbonetos.
ABSTRACT
The bitter honey production in the city of Cantá-RR has been attribute by beekeepers in the
region to the period of flowering plants of the genus Vochysia. This research aims to
investigate the existence of chemical markers that can confirm the botanical origin of
the honey, as well as verify their chemical composition and antioxidant activity. Thus, we pre
pared extracts of bitter honey by XAD-2, C18, liquid-liquid (dichloromethane)
and lyophilized honey. For comparison of the constitution were also obtained the
extracts ethanol of the flowers without anthers and of the anthers of the flowers, rich in pollen
. The extracts of honey XAD-2 and ethanol flowers were fractionated, obtaining
extracts with hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol. Mass spectrometric
analyzes were performed with the different extracts and there was a great similarity
between the spectra. By using authentic standards, chrysin and caffeic acid were
identified in the extracts of bitter honey. In hexanic extract analyzes, through gas
chromatography coupled to mass spectrometry (GC -MS), several n-alkanes and nalkenes were identified with times of retention and identical retention index in the
honey and in the flowers. To determine the position of the double bond, a derivatization with
dimethuldisulfide was performed. The similar n-alkenes in extracts of honey and
flowers presented unsaturation at position 1. Spectrophotometric analyses were
performed to quantify the phenolic compounds getting to result of 94,64 mg of gallic
acid /100 g of honey and flavonoids with 86,23 g/100g honey. The honey presented a
white coloration, based on the Pfund scale and antioxidant activity one IC50 of 16,94 mg / mL,
determined by means of the DPPH method. This work confirmed the botanical
origin of honey obtained by melissopalynology and chemical data, and also contributed to the
chemical characterization of the honey through quantification of some classes of natural
products and their antioxidant activity.
Key words: Vochysaceae. Phenolics. Flavonoids. Hydrocarbons.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Distribuição da família Vochysaceae.--------------------------------
18
Figura 2 -
Flavonoide ligado a um anel pirrolizidinico.------------------------
20
Figura 3 -
Desenho simplificado de uma fonte de ionização por
eletrospray.---------------------------------------------------------------
23
Estrutura química básica dos flavonoides em relação à origem
biossintética.-------------------------------------------------------------
26
Figura 5 -
Principais classes dos flavonoides.------------------------------------
27
Figura 6 -
Complexo flavonoide-Al+3, em solução metanólica de cloreto de
alumínio. ----------------------------------------------------------------
28
Perfil espectrofotométrico do radical 2-2-difenil-picril-hidrazil
(DPPH). ------------------------------------------------------------------
31
Material botanico coletado contendo folhas, flores (A), frutos
(B), casca e resina (C).--------------------------------------------------
34
Figura 9 -
Padrão utilizado para análise de compostos fenólicos.-------------
40
Figura 10 -
Padrão utilizado para análise de flavonas e flavonóis.-------------
42
Figura 11 -
Padrão utilizado para análise de flavononas e diidroflavonois.---
43
Figura 12 -
(A) Soluções estoque de pinocembrina, KOH e DNP e (B)
sistema de aquecimento da solução estoque de pinocembrina,
solução estoque da amostra e brancos da curva e da amostra.----
44
Figura 13 -
Estrutura básica das antocianinas.-------------------------------------
46
Figura 14 -
Padrão utilizado para análise de carotenoides.----------------------
47
Figura 15 -
Estrutura química do radical 2-2-difenil-picril-hidrazil (DPPH).-
47
Figura 16 -
Soluções estoque de DPPH, mel e 5 diluições da solução de
mel, dispostos da esquerda para direita.------------------------------
48
Espectros de massas por ESI/MS no modo negativo do extrato
da antera, das flores (A); extrato das flores sem antera (B);
extrato do mel por XAD-2 (C); extrato do mel por C18 (D),
extrato líquido-líquido (E) e por último, mel liofilizado (F).------
53
Figura 4 -
Figura 7 Figura 8 -
Figura 17 -
Figura 18 -
(A) Espectro de massas do padrão de crisina, (B) fragmentação
do íon 253 do padrão e (C) fragmentação do íon 253 do extrato
de mel por C18.----------------------------------------------------------
55
Figura 19 -
Proposta de fragmentação do íon 253.--------------------------------
57
Figura 20 -
(A) espectro de massas do extrato de mel (XAD-2) e (B) do
padrão de ácido cafeico, bem como (C) os fragmentos (MS/MS)
característicos do ácido cafeico (padrão) e (D) fragmentos
MS/MS característicos para o ácido cafeico da amostra. ----------
58
(A) Espectro de massas do íon 179 presente nos extratos de mel
por C18 e (B) mel liofilizado.-----------------------------------------
59
Cromatogramas de íons totais dos extratos das flores (EEF-hex)
e do mel (EM-hex).-----------------------------------------------------
62
Figura 23 -
Espectro de massas do hexadecano e fragmentos majoritários. --
62
Figura 24 -
Espectro de massas do hexadeceno e fragmentos majoritários. --
63
Figura 25 -
Espectro de massas do hexadeceno derivatizado apresentando
íons estáveis m/z 243 e 75.---------------------------------------------
66
Mecanismo de fragmentação do hexadeceno apresentando
instauração na posição 2.-----------------------------------------------
67
Espectro de massas de hexadeceno derivatizado apresentando
íons estáveis m/z 257 e 61.---------------------------------------------
67
Mecanismo de fragmentação do hexadeceno apresentando
instauração na posição 1.-----------------------------------------------
68
Cromatogramas de íons totais das anteras das flores (EEAF) e
das flores sem antera (EEF).-------------------------------------------
70
Ensaio da curva padrão, na ordem crescente de concentração de
ácido gálico.--------------------------------------------------------------
74
Curva de calibração do ácido gálico, equação da reta e
coeficiente de correlação (R2).-----------------------------------------
75
Branco (à esquerda) e solução de reação da amostra de mel
(triplicata em azul).------------------------------------------------------
75
Ensaio da curva padrão, na ordem crescente de concentração de
quercetina.----------------------------------------------------------------
79
Curva de calibração da quercetina, equação da reta e coeficiente
de correlação (R2).-------------------------------------------------------
80
Figura 21 Figura 22 -
Figura 26 Figura 27 Figura 28 Figura 29 Figura 30 Figura 31 Figura 32 Figura 33 Figura 34 Figura 35 -
Branco (à esquerda) e solução de reação da amostra de mel
(triplicata à direita).-----------------------------------------------------
80
Ensaio da curva padrão, na ordem decrescente de concentração,
do teor de pinocembrina.-----------------------------------------------
83
Curva de calibração da pinocembrina, equação da reta e
coeficiente de correlação (R2).-----------------------------------------
84
Figura 38 -
Branco (à esquerda) e triplicada da amostra de mel (à direita).---
85
Figura 39 -
Curva de calibração da atividade antioxidante. ---------------------
92
Figura 36 Figura 37 -
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Classificação dos compostos fenólicos de acordo com o
esqueleto básico.------------------------------------------------------
24
Tabela 2 -
Classificação da coloração do mel segundo a escala de Pfund.
29
Tabela 3 -
Análise melissopalinológica de mel amargo. ---------------------
50
Tabela 4 -
Rendimento dos extratos do mel, das flores e da antera das
flores por diferentes tipos de extração. ----------------------------
51
Tabela 5 -
Fracionamento do extrato do mel por XAD-2. -------------------
52
Tabela 6 -
Fracionamento do extrato das flores (EEF). ----------------------
52
Tabela 7 -
Constituintes identificados nos extratos das flores e do mel
amargo.-----------------------------------------------------------------
64
Posição da dupla de alcenos derivatizados dos extratos de mel
e flor, frente à fração hexânica.-------------------------------------
69
Concentração, média e desvio padrão (DP) do ácido gálico,
lidos a λ = 798 nm.----------------------------------------------------
74
Absorbâncias da amostra de mel amargo, média e desvio
padrão.------------------------------------------------------------------
76
Tabela 11 -
Teor de fenólicos totais em equivalente de ácido gálico. -------
77
Tabela 12 -
Concentração, média e desvio padrão (DP) do padrão de
quercetina, lidos a λ = 437 nm.--------------------------------------
79
Tabela 13 -
Absorbâncias do mel e média ± desvio padrão.-------------------
81
Tabela 14 -
Teor de flavonas e flavonóis em equivalente de quercetina.----
82
Tabela 15 -
Concentração, média e desvio padrão (DP) da pinocembrina,
lidos a λ = 493 nm.----------------------------------------------------
84
Tabela 16 -
Absorbâncias do mel, média e desvio padrão. --------------------
85
Tabela 17 -
Teor de flavononas e diidroflavonóis em equivalente de
pinocembrina.----------------------------------------------------------
87
Absorbâncias do mel, média e desvio padrão. --------------------
88
Tabela 8 Tabela 9 Tabela 10 -
Tabela 18 -
Tabela 19 -
Teor de flavonoides totais determinados em miligramas de
flavonoides por 100 g de mel e expressos em média e desvio
padrão.------------------------------------------------------------------
89
Tabela 20 -
Absorbâncias do mel, média e desvio padrão. --------------------
90
Tabela 21 -
Concentração, absorbância, média e desvio padrão do ensaio
da atividade antioxidante.--------------------------------------------
91
ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ABTS
APCI-MS
API
API-MS
BSTFA
CG-EM
CLAE
DMDS
DNP
DPPH
EEAF
EEF
EEF-AcE
EEF-Clor
EEF-Hex
EEF-MeOH
EM-AcE
EM-Clor
EMel-XAD-2
EM-Hex
EM-MeOH
ESI
ESI-MS
ESI-MS/MS
eV
FRAP
HCl
HPLC
I.R.
IRc
IRl
KOH
m/z
MS
MS/MS
Nupenerg
RMN
T.R.
UFAM
UV-visível
Ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfônico
Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry
Atmospheric Pressure Ionization
Atmospheric Pressure Ionization Mass Spectrometry
bis(trimetilsilil)trifluoracetamida
Espectrometria de massas acoplada à cromatografia a gás
Cromatografia líquida de alta eficiência
Dimetildissulfeto
2,4-dinitrofenilidrazina
2,2-difenil-1-picril-hidrazil
Extrato etanólico das anteras das flores
Extrato etanólico das flores sem antera
Extrato etanólico das flores – fração acetato de etila
Extrato etanólico das flores – fração clorofórmica
Extrato etanólico das flores – fração hexânicas
Extrato etanólico das flores – fração metanólica
Extrato de mel – fração acetato de etila
Extrato de mel – fração clorofórmica
Extrato de mel extraído com resina Amberlite XAD-2
Extrato de mel – fração hexânica
Extrato de mel – fração metanólica
Electrospray Ionization
Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry
Elétrons-volt
Ferric Reducing Antioxidant Power
Ácido clorídrico
Hight Performance Liquid Cromatography
Índice de retenção
Índice de retenção calculado
Índice de retenção da literatura
Hidróxido de potássio
Razão entre a massa e a carga de um fragmento
Mass spectrometry
Tandem mass spectrometry
Núcleo de Pesquisas Energéticas
Ressonância magnética nuclear
Tempo de retenção
Universidade Federal do Amazonas
Ultravioleta-visível
SUMÁRIO
1
1.1
1.1.1
1.1.2
1.2
1.2.1
1.3
1.3.1
1.3.2
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.3
1.4.4
1.4.5
2
2.1
2.1.2
3
3.1
3.2
3.2.1
3.3
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.5
3.6
3.6.1
3.7
3.7.1
3.7.2
3.7.3
3.8
3.8.1
3.8.2
3.9
3.9.1
3.9.1.1
INTRODUÇÃO----------------------------------------------------------A APICULTURA NO BRASIL-----------------------------------------Mel -------------------------------------------------------------------------Mel amargo ---------------------------------------------------------------GENERALIDADES DA FAMÍLIA VOCHYSACEAE -------------Particularidades do gênero Vochysia --------------------------------MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DA ORIGEM BOTÂNICA
DE MÉIS ------------------------------------------------------------------Cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas
(CG-EM) ------------------------------------------------------------------Espectrometria de massas com ionização à pressão atmosférica
(API) -----------------------------------------------------------------------CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO MEL -------------------------Compostos fenólicos ----------------------------------------------------Carotenoides -------------------------------------------------------------Flavonoides ---------------------------------------------------------------Determinação da cor do mel ------------------------------------------Atividade antioxidante -------------------------------------------------OBJETIVO ---------------------------------------------------------------OBJETIVO GERAL -----------------------------------------------------Objetivos específicos ----------------------------------------------------MATERIAL E MÉTODOS --------------------------------------------MATERIAIS --------------------------------------------------------------COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MEL ----------------------------Procedimentos para análise polínica de mel -----------------------COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO ---OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DO MEL ---------------------------Extração em fase sólida (SPE) com Amberlite XAD-2 -----------Extração em fase sólida com cartucho C18 ------------------------Preparo do extrato liquido-líquido ----------------------------------OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DAS FLORES --------------------FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS ------------------------------Fracionamento dos extratos de mel e das flores -------------------ESPECTROMETRIA DE MASSAS COM IONIZAÇÃO À
PRESSÃO ATMOSFÉRICA (API) ------------------------------------Preparo das amostras ---------------------------------------------------Espectrometria de massas com ionização por electrospray
(ESI-MS) ------------------------------------------------------------------Espectrometria de massas com ionização química à pressão
atmosférica (APCI-MS) ------------------------------------------------CROMATOGRAFIA
A
GÁS
ACOPLADA
À
ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM) ----------------------Derivatização com BSTFA ---------------------------------------------Derivatização com DMDS/I2 ------------------------------------------ANÁLISES ESPECTROFOTOMÉTRICAS DO MEL -------------Determinação do teor de compostos fenólicos ---------------------Curva de calibração do ácido gálico ------------------------------------
14
15
16
17
18
19
20
22
22
23
24
26
26
28
29
32
32
32
33
33
33
33
34
35
35
35
36
36
37
37
37
37
38
38
38
39
39
39
40
40
3.9.1.2
3.9.2
3.9.2.1
3.9.2.1.1
3.9.2.1.2
3.9.2.2
3.9.2.2.1
3.9.2.2.2
3.9.2.2.3
3.9.2.2.4
3.9.2.2.5
3.9.2.2.6
3.9.2.2.7
3.9.2.3
3.9.3
3.9.4
3.9.5
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.4.1
4.4.2
4.4.3
4.4.4
4.5
4.5.1
4.5.1.1
4.5.2
4.5.2.1
4.5.3
4.5.3.1
4.5.4
4.5.5
4.5.6
4.5.7
4.5.8
5
Doseamento da amostra --------------------------------------------------Determinação do teor de flavonoides --------------------------------Flavonas e flavonóis -----------------------------------------------------Curva de calibração da quercetina --------------------------------------Doseamento da amostra --------------------------------------------------Flavonas e diidroflavonois -----------------------------------------Preparo da solução estoque de 2,4-dinitrofenilidrazina (DNP) ----Preparo da solução estoque de pinocembrina (1 mg/mL) -----------Preparo da solução estoque de KOH a 10% --------------------------Curva de calibração de pinocembrina ----------------------------------Branco da curva de calibração ------------------------------------------Doseamento da amostra --------------------------------------------------Branco da amostra --------------------------------------------------------Antocianinas --------------------------------------------------------------Determinação do teor de Carotenoides -----------------------------Análise da cor ------------------------------------------------------------Atividade antioxidante -------------------------------------------------RESULTADOS E DISCUSSÃO ----------------------------------CARACTERIZAÇÃO DA ORIGEM BOTÂNICA DO MEL -----PREPARO DOS EXTRATOS ------------------------------------------ANÁLISES POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS -------------ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA A GÁS ACOPLADA À
ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM) ----------------------Comparação entre os extratos hexânicos das flores e do mel --Determinação da posição das duplas em alceno por
derivatização com dimetildissulfeto (DMDS) ----------------------Extrato etanólico das flores -------------------------------------------Hidrocarbonetos relacionados às abelhas e aos produtos
apícolas --------------------------------------------------------------------ANÁLISES ESPECTROFOTOMÉTRICAS DO MEL -------------Determinação do teor de compostos fenólicos ---------------------Curva de calibração do ácido gálico -----------------------------------Determinação do teor de flavonoides --------------------------------Curva de calibração de quercetina --------------------------------------Flavononas e diidroflavonois ------------------------------------------Curva de calibração de pinocembrina ----------------------------------Teor de antocianinas ----------------------------------------------------Teor de carotenoides ----------------------------------------------------Análise da cor ------------------------------------------------------------Atividade Antioxidante -------------------------------------------------Interação
entre
os
compostos
analisados
espectrofotometricamente ---------------------------------------------CONCLUSÕES ----------------------------------------------------------REFERÊNCIAS ---------------------------------------------------------APÊNDICES --------------------------------------------------------------
41
41
42
42
42
43
43
43
44
44
45
45
45
45
46
47
47
50
50
51
52
61
61
65
70
72
73
73
74
78
79
83
83
88
89
90
91
93
95
97
108
14
1 INTRODUÇÃO
O mel é um dos principais produtos elaborados pelas abelhas, formado
majoritariamente por açúcares naturais e por uma variedade de compostos secundários, em
menor concentração, que atribuem cores, odores e sabores diversos. Além do mel as abelhas
produzem própolis, geleia real, pólen, cera e apitoxina, contudo, o mel é o produto de maior
interesse para a indústria alimentícia e farmacêutica, por ser uma fonte de alimento com
elevado teor nutritivo e propriedades medicinais (ALVAREZ-SUARES et al., 2010a, VIUDAMARTOS et al., 2008).
Em Roraima a atividade apícola manejada apresenta-se em contínuo crescimento,
porém essa expansão não está sendo acompanhada de estudos na mesma proporção, visto que
existem poucas informações voltadas aos méis produzidos no estado. Nos municípios de
Cantá e Mucajaí os apicultores têm relatado à ocorrência de mel amargo. Por meio de
observações, os apicultores do município do Cantá, relacionam este tipo de mel à planta
conhecida vernaculamente como “casca-grossa”, devido à produção de mel, de sabor amargo,
no período de floração dessas árvores.
Estudos palinológicos relacionados à identificação botânica dos méis amargos dos
municípios de Mucajaí e Cantá sugerem que são provenientes das plantas do gênero Protium
(MARQUES-SOUZA; KERR, 2003) e da espécie Vochysia guianensis Aubl (SILVA, 2005),
respectivamente. Entretanto, não existem estudos que caracterizem os compostos secundários
e identifiquem possíveis marcadores químicos da origem botânica destes méis.
Essa interação entre as abelhas e as plantas percebida pelos apicultores da região por
meio da produção do mel amargo, está amparada pela ecologia química, ramo da ciência
química que estuda a interação entre os organismos e o meio ambiente, e a variedade de
aromas, cores e secreções que atuam como mediadoras das diferentes interações, como uma
forma de decodificação da linguagem química da vida (FLACH, 2005, PIANARO et al.,
2007, VIDAL, 2012).
Mediante o exposto, este trabalho amparou-se na necessidade de obtenção de dados
consistentes acerca dos constituintes do mel amargo, da atividade antioxidante, bem como da
presença de constituintes que pudessem ser utilizados como marcadores da origem botânica
do mel amargo. Nesse contexto, esta pesquisa abordou uma investigação acerca da
composição do mel amargo do município do Cantá e de compostos que pudessem atuar como
marcadores de origem botânica desse mel, por meio da comparação entre os constituintes do
mel e das flores da Vochysia sp. Assim, devido à escassez de conhecimentos em relação à
15
composição e origem desse produto, esta pesquisa visou auxiliar o banco de informações
científicas acerca deste tipo de mel, bem como proporcionar uma base para novas pesquisas
sobre os méis amargos provenientes do estado de Roraima.
As análises foram realizadas no Laboratório de Biotecnologia e Química Fina, situado
no Departamento de Química, no Laboratório de Cromatografia do Núcleo de Pesquisas
Energéticas (NUPENERG) da Universidade Federal de Roraima e no Laboratório de
Espectrometria Massas da Universidade Federal do Amazonas (UFAM).
Assim sendo, como embasamento teórico, este referencial apresenta um breve relato
acerca da apicultura e da produção de mel no Brasil, com ênfase para a ocorrência de mel
amargo, objeto de estudo deste trabalho. Em seguida, discorre acerca das características gerais
da família Vochysaceae e particularidades do gênero Vochysia, gênero ao qual está associado
o mel amargo do município do Cantá. Além disso, dispõe sobre os métodos de determinação
da origem floral do mel e, por fim, a caracterização das classes de compostos estudadas e a
atividade antioxidante do mel.
1.1 A APICULTURA NO BRASIL
A introdução das abelhas Apis no Brasil foi realizada oficialmente por intermédio do
Decreto nº 72, de 12 de julho de 1839, promulgado pelo então Imperador Dom Pedro II
(Confederação Brasileira de Apicultura, 2011).
Estudos relatam a introdução da abelha europeia Apis mellifera no Sul do Brasil pelos
Padres Jesuítas, com o objetivo de obtenção de cera para a produção de velas, utilizadas em
cultos religiosos; outros afirmam que o Reverendo Antônio Carneiro as trouxe da Europa para
o Rio de Janeiro em 1839. Posteriormente, ocorreram várias introduções devido ao incentivo à
imigração (NOGUEIRA-NETO, 1972).
Em 1956 o geneticista Estevam Kerr levou para o Rio de Janeiro a abelha africana A.
mellifera scutellata. O cruzamento dessas abelhas com as europeias gerou um híbrido mais
resistente e com maior capacidade de produção. Assim, com o manejo dessa nova espécie,
iniciou-se a atividade apicultora (SOUZA, 2011). Popularmente A. mellifera é conhecida
como abelha africanizada e é amplamente difundida no país, estando presente em todos os
estados brasileiros. Em Roraima a existência das abelhas africanizadas data da década de
1970. Em 1976, estudos relataram a presença destes insetos na cidade de Santa Helena de
Uairém, fronteira Brasil-Venezuela (SILVA, 2005).
16
A apicultura é uma atividade manejada, rentável e muito antiga, ocorrendo também na
forma extrativista. Além do mel, a apicultura oferece a própolis, a geleia real, o pólen, a
apitoxina (veneno) e a cera (SEBRAE, 2011).
Estudos revelam que produtos apícolas como o mel e o pólen apresentam
características de alimentos com propriedades bioativas, contribuindo para a prevenção ou
mesmo cura de doenças. E a que a geleia real, a apitoxina e a própolis são consideradas como
fonte para produção de medicamentos e cosméticos enquanto a cera é utilizada na composição
de cosméticos e velas artesanais, com mercado garantido na indústria de medicamentos, têxtil,
e na fabricação de polidores, vernizes e na embalagem de alimentos (SILVA, 2006). Contudo,
a importância das abelhas se dá não somente pelos produtos apícolas, mas pelo importante
papel na polinização das plantas superiores, contribuindo diretamente para a preservação e
manutenção da variabilidade genética das espécies vegetais (SILVA, 2005).
1.1.1 Mel
De acordo com a Legislação Brasileira (Instrução Normativa nº 11, de 20 de outubro
de 2000) entende-se por mel:
O produto alimentício produzido pelas abelhas a partir do néctar das flores ou das
secreções procedentes de partes vivas das plantas ou de excreções de insetos
sugadores de plantas que ficam sobre partes vivas de plantas, que as abelhas
recolhem, transformam, combinam com substâncias específicas próprias,
armazenam e deixam maturar nos favos da colmeia (BRASIL, 2000, p.16).
A utilização do mel pelos humanos remonta à pré-história. Os antigos egípcios
utilizavam na alimentação e em vários tratamentos terapêuticos e nos cultos religiosos de
algumas culturas era oferecido aos deuses em forma de bebida. O mel também foi muito
utilizado como
adoçante natural,
no combate a diversas
doenças
respiratórias,
gastrointestinais e no uso tópico em ferimentos e queimaduras (PARK; ALENCAR;
AGUIAR, 2003).
O mel apresenta-se como uma solução viscosa, supersaturada de açúcares, o que lhe
confere sabor agradável e doce. Silva (2006) reporta-se ao mel como um adoçante natural,
energético, saudável, cicatrizante, antibacteriano e com notável aroma. A presença de certas
substâncias como os compostos fenólicos, vitaminas, aminoácidos, sais minerais, ácidos
orgânicos e algumas enzimas, mesmo que minoritárias, confere ao mel propriedades
17
terapêuticas como atividade antioxidante e cicatrização de ferimentos (BALTRUSAITYTÉ;
VENSKUTONIS; CEKSTERYTE, 2007; GÓMES-CARAVACA et al., 2006).
A maior parte dos méis apícolas produzidos provém do néctar das plantas, uma
solução aquosa de açúcares em concentrações variadas, sendo a composição glicídica do mel
formada basicamente por D-glicose, D-frutose e sacarose (MOREIRA; MARIA, 2001).
Os néctares coletados pelas abelhas e depositados nas colmeias passam por processos
químicos e biológicos realizados no organismo das abelhas pela ação de enzimas como a
invertase, diástase, glicose oxidase, catalase e fosfatase, adicionadas ao néctar no processo de
transferência das plantas para a colmeia, devido à liberação de secreções de glândulas
relacionadas ao aparelho digestivo das abelhas para maturação. E o processo físico que ocorre
por meio da desidratação e concentração dos componentes sólidos do mel (LENGLER, 2011).
A composição do mel apícola varia de acordo com a espécie da planta de onde as abelhas
coletam o néctar, possibilitando a existência de grande variedade de méis (ALVAREZSUAREZ et al., 2010; FEARNLEY et al., 2012).
A produção de mel apícola obtida de floradas silvestres está cada vez mais escassa,
tanto no Brasil como no mundo, devido à diminuição da cobertura vegetal original. Assim, a
apicultura vem sendo adaptada às culturas florestais e agrícolas. Contudo, muitos apicultores
exploram apenas a vegetação existente não modificando a vegetação local, e ao implantar um
apiário, valorizam o mel silvestre, contribuindo para a preservação de espécies de abelhas e de
plantas nativas, diminuindo a degradação antrópica do ambiente (RIBEIRO; SANTOS, 2009).
1.1.2 Mel amargo
O mel apícola geralmente possui sabor doce e agradável ao paladar humano. No
entanto, o mel amargo, eventualmente produzido pelas abelhas Apis, apresenta-se como um
produto diferenciado dos demais tipos de mel devido ao sabor pouco apreciado, sendo na
maioria das vezes um empecilho à comercialização.
Nos Estados Unidos alcaloides pirrolizidínicos característicos de Senecio jacobea L
foram identificados em amostras de méis amargos (DEINZER et al, 1977) e, devido a sua alta
toxidez, a presença dos mesmos tem sido monitorada desde então (WIEDENFELD, 2011).
No Brasil são citados méis amargos provenientes de Hortia brasiliana Vand.
(Rutaceae), planta do Cerrado do Brasil Central, de Mimosa scabrella Benth (Mimosaceae) e
Senecio jacobea L. (Asteraceae), ambas do Sul do Brasil (BARTH, 1989). O mel monofloral
18
da bracatinga (Mimosa scabrella Benth), de ocorrência na região sul do Brasil, rico em
glicose, caracteriza-se pela cor escura, granulação fina e sabor amargo (EMBRAPA, 1988).
Contudo, não existem dados da constituição química e da origem do sabor amargo nos méis
cuja origem botânica é atribuída a estas plantas.
Marques-Souza e Kerr (2003) analisaram palinologicamente uma amostra de mel
amargo do município do Mucajaí/RR e identificaram o pólen do gênero Protium sp.
(Burseraceae) pertencente à planta, de sabor amargo, conhecida vernaculamente como “breu”.
Em 2005, Silva apresentou um estudo acerca da análise polínica em amostras de mel amargo
da Colônia da Confiança, Município de Cantá, Roraima e verificou que o mel amargo
estudado originou-se da espécie V. guianensis Aubl (Vochysaceae). Entretanto, não há na
literatura estudos que comparem a composição química dos méis amargos com a composição
química das plantas que possivelmente originaram estes méis em Roraima.
1.2 GENERALIDADES DA FAMÍLIA VOCHYSACEAE
Grande parte da família Vochysaceae está localizada em regiões da América Central e
América do Sul (figura 1), sendo que apenas os gêneros Erismadelphus e Korupodendron
apresentam ocorrência na África Tropical Ocidental (LITT; CHECK, 2002).
No Brasil, a família Vochysiaceae ocorre em vários ecossistemas, apresentando
diversidade de espécies nas regiões Guiano-Amazônica, Planalto Central e na Floresta
Atlântica (BAUDOUIN; TILLEQUIN; KOCH, 1983; VIANNA, 2006).
Figura 1 – Distribuição da família Vochysaceae.
Fonte: Heywood et al. (2007).
19
Estudos das características anatômicas e fisiológicas demonstraram que a família
Vochysaceae apresenta flores zigomorfas e número de pétalas e estames reduzidos. E por
meio de análises de DNA verificou-se que, a família Vochysaceae, incluída na subclasse
Rosidae, pertence à ordem das Myrtales e incorpora duas tribos (BAUDOUIN; TILLEQUIN;
KOCH, 1983; LITT; CARMO-OLIVEIRA; MORRETES, 2009; CARNEVALE NETO et al.,
2011; STEVENSON, 2003). A tribo Erismeae que é formada pelos gêneros Erismadelphus (3
espécies) e Erisma (20 espécies), e a tribo Vochysieae que é composta pelos gêneros
Callisthene (10 espécies), Qualea (45 espécies), Salvertia (1 espécie), Ruizteranea
(16
espécies), Korupodendron (1 espécie) e Vochysia com 105 espécies (LITT; STEVENSON,
2003).
Atualmente na família Vochysaceae identificaram-se cerca de 90 metabólitos
secundários, sendo a maioria dos compostos isolados ou sintetizados, pertencentes aos
gêneros Qualea e Vochysia. Dentre os compostos isolados ou sintetizados estão incluídos
triterpenos da classe dos lupanos (6), dos ursanos (13) e oleananos (18), derivados de ácido
elárgico (10), flavonoides (36) e uma chalcona, além de outras classes (CARNEVALE NETO
et al., 2011).
Estudos etnofarmacológicos atribuem à família Vochysaceae diversas características,
como antidiarreica, anti-inflamatória e antioxidante, além do combate a cólicas intestinais,
azia, amebíase e infecções gripais (CARNEVALE NETO et al., 2011).
1.2.1 Particularidades do gênero Vochysia
Vochysia é um gênero neotropical que ocupa preferencialmente as regiões de floresta
tropical, subtropical e savanas, sendo ausente nas regiões de clima árido ou semi-árido. No
território brasileiro esse gênero possui aproximadamente 80 espécies distribuídas pela
Floresta Amazônica e ao longo da Floresta Atlântica (VIANNA, 2006).
O gênero possui uma morfologia floral semelhante e as espécies apresentam,
aparentemente, os mesmos tipos polinizadores, sendo as mariposas e abelhas os visitantes
mais comuns, seguidos dos beija-flores e borboletas (SANTOS; AFONÇO; OLIVEIRA,
1997).
Vários pesquisadores dedicam-se ao estudo ao gênero Vochysia. No estado do Paraná
verificou-se a ocorrência de três espécies de Vochysia: V. bifalcata Warm., V. magnifica
Warm. e V. tucanorum Mart. A espécie V. tucanorum Mart., é a que apresenta a maior
20
distribuição no estado, provavelmente por estar presente em áreas de preservação. Indícios
sugerem que o desmatamento ocorrido no século XX afetou a distribuição da família
Vochysiaceae no estado do Paraná. Assim, a espécie V. tucanorum Mart. apresenta ocorrência
em formações secundárias e a V. bifalcata Warm. é a única espécie registrada em locais
originais (NEGRELLE; MOROKAWA; RIBAS, 2007).
A V. cinnamomea é um arbusto de 6 m de altura que ocorre em cerrados abertos na
região de Uberlândia. Seu período de floração estende-se de março a abril, apresentando
inflorescência alongada, podendo atingir até 40 cm de comprimento (SANTOS; AFONÇO;
OLIVEIRA, 1997).
A Vochysia guianensis Aubl ocorre nas florestas, no cerrado e nas proximidades de
montanhas, apresentando floração intensa em alguns anos, no período de setembro à
dezembro (SILVA, 2005). Baudouin, Tillequin e Koch (1983) realizaram estudo fitoquímico
com os frutos de V. guianensis e isolaram a voquisina, um flavonoide ligado a um anel
pirrolizidinico (figura 2). No município do Cantá-RR a ocorrência de mel amargo pode estar
relacionada a presença desta planta nas proximidades dos apiários.
Figura 2 - Flavonoide ligado a um anel pirrolizidinico.
H
OH
N
MeO
O
OH
Voquisina
1.3 MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DA ORIGEM BOTÂNICA DE MÉIS
Os principais métodos utilizados na determinação da origem botânica dos méis são:
melissopalinologia (BARTH, 1989, 2004) e comparação química dos constituintes do mel
com o néctar ou outras partes das plantas, pois apesar do mel ser um produto de origem
21
animal, elaborado pelas abelhas, por meio da coleta de néctar ou exsudatos de plantas ou
ainda da secreção de animais sugadores, grãos de pólen também são encontrados no mel
(MOREIRA; MARIA, 2001).
A presença de pólen no mel pode ser explicada devido ao fato de grãos de pólen
maduros, caírem no néctar da própria flor ou devido à abelha os derrubar ao pousar sobre a
flor durante a coleta do néctar: as abelhas encostam-se às anteras e se impregnam de grãos de
pólen, contaminando o néctar coletado ao depositá-lo nas colmeias. Por este motivo, os grãos
de pólen encontrados no mel são utilizados para identificar e quantificar a origem floral do
mel, em um estudo denominado melissopalinologia. A comparação do pólen das flores com o
encontrado nos méis é realizada por meio da coleta de pólen na flora que circunda as colmeias
ou em palinotecas. Esta técnica tem sido extensivamente utilizada para determinar a origem
botânica de méis. No Brasil, destacam-se os trabalhos da pesquisadora Ortrud Monika Barth,
da Fiocruz, que desde a década de 1970 publica artigos na área palinológica (BARTH, 1989,
2004).
Em Roraima foram identificados pólens de uma série de plantas que constavam em
méis dos municípios do Cantá-RR (SILVA, 2005). Também foram identificados pólens em
méis provenientes de Mucajaí (MARQUEZ-SOUZA; KERR, 2003).
A comparação dos compostos dos méis com os compostos do néctar constituem os
marcadores químicos do mel. Moreira e Maria (2001) relatam a determinação da origem floral
através da comparação de glicídios do mel e do néctar das plantas. A análise dos compostos
secundários apresenta considerável crescimento, devido à evolução das técnicas
microquímicas de extração e análise (CUEVAS-GLORY, et al., 2007). Nas técnicas
microquímicas são empregadas extração em fase sólida ou microextrações para a separação
dos constituintes do mel e do néctar.
Alguns artigos discutem marcadores químicos de méis obtidos de colmeias
introduzidas em grandes extensões de monoculturas e caracterizados como monoflorais.
Alissandrakis (2007) caracterizou 33 amostras de mel cítrico extraído por microextração em
fase sólida (SPME) e analisado por CG-EM. A partir da análise dos constituintes, o autor
definiu constituintes que foram considerados como marcadores da origem do mel. Truchado,
Ferreres e Tomas-Barberan (2009) analisaram tanto os méis quanto néctares por
cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo, acoplado à
espectrometria de massas (CLAE/DAD/EM) para caracterizar constituintes. No entanto, na
análise dos méis de eucalipto os constituintes não estavam presentes no néctar, mas em méis
de laranja o flavonoide esperidina foi encontrado tanto no mel, quanto no néctar. Fearnley et
22
al. (2012) identificaram o ácido trimetoxibenzóico esterificado com maltose como marcador
do mel de Leptosperm scoparium através de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada
à espectrometria de massas com ionização por electrospray (CLAE/ESI/EM) e ressonância
magnética nuclear (RMN).
A extração de constituintes das flores e sua comparação com os constituintes do mel
(ALISSANDRAKIS et al. 2003) e ainda, a caracterização dos isótopos de carbono treze
(JATI, 2007) também têm sido utilizadas para caracterizar a origem de méis
Recentemente, tem sido utilizada mais de uma técnica para caracterização da origem
botânica. Em 2010 Féas et al. utilizaram-se da melissopalinologia e aliada à análise físicoquímica e em 2012 Yang et al. utilizaram-se da análise por melissopalinologia associada às
análises de voláteis do néctar e do mel. Nesse contexto, esta pesquisa fundamentou-se nas
análises por espectrometria de massas por ionização (API) e cromatografia a gás acoplada à
espectrometria de massas (CG-EM), para determinação da origem botânica do mel amargo do
município do Cantá-RR.
1.3.1 Cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG-EM)
Um espectrômetro de massas pode ser compreendido como um instrumento que
contém cinco componentes: o primeiro é formado pela unidade de entrada da amostra,
responsável por receber a amostra em ambiente atmosférico e enviá-la a pressões mais baixas
na região da fonte de íons (segundo componente) e o terceiro compõe-se do analisador de
massas, que separa os íons da amostra com base na razão massa/carga (m/z); em seguida os
íons são contados pelo detector de massas e por fim, os dados são registrados no sistema de
dados (PAVIA et al., 2012).
Na introdução da amostra, o espectrômetro acoplado a cromatógrafo a gás tem sido
bastante versátil, pois possibilita a separação dos componentes de uma amostra complexa e a
determinação individual do espectro de cada componente (PAVIA et al., 2012) e tem sido
amplamente utilizado para a análise de voláteis ou volatilizáveis.
1.3.2 Espectrometria de massas com ionização à pressão atmosférica (API)
A espectrometria de massas constitui hoje uma das técnicas instrumentais mais
abrangentes, com aplicações em diversas áreas da química, biologia, ciências médicas e
23
tecnológicas. Apesar de existirem várias estratégias para separação e detecção, a etapa de
ionização é que apresenta o maior número de diferentes estratégias, devido à grande variedade
de tipos de amostras. Uma vez gerados os íons, os processos de separação e detecção podem
ser escolhidos de acordo com características mais ou menos comuns, como sensibilidade,
resolução e precisão de m/z e custo (MORAES; LAGO, 2003).
Tanto a ionização por electrospray (ESI) como a ionização química (APCI) são
técnicas brandas de ionização e ocorrem à pressão atmosférica (NIESSEN, 2003).
A ionização por “electrospray” (ESI) é uma técnica utilizada para estudar
biomoléculas com alto peso molecular, compostos lábeis e não voláteis (figura 3). Nesta
técnica as espécies do analito são ionizadas em solução e transferidas para a fase gasosa como
entidades isoladas, geralmente na forma de moléculas protonadas ou cátions (modo positivo),
ou ainda como moléculas desprotonadas (modo negativo) ou ânions (PAVIA et al., 2012).
Figura 3 - Desenho simplificado de uma fonte de ionização por eletrospray.
Fonte: Sawaya (2006)
1.4 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO MEL
O mel apresenta diversas classes de metabólitos secundários, dentre as quais pode-se
citar: compostos fenólicos, flavonoides, carotenoides, compostos nitrogenados, ácidos graxos
e terpenos, entre outros (GHELDOF; ENGESETH, 2002).
24
1.4.1 Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são produzidos no metabolismo secundário das plantas, sendo
essenciais para seu crescimento, reprodução e pigmentação. Nos alimentos contribuem para a
coloração, adstringência, aroma e estabilidade oxidativa. Sua estrutura básica consiste em
uma hidroxila ligada ao benzeno, mas a estrutura química variável permite a existência de
cerca de cinco mil compostos que estão presentes na forma livre ou ligados a glicosídeos
(NACZK; SHAHIDI, 1995, 2004).
Pode-se definir um composto fenólico como “uma classe de compostos que inclui uma
grande diversidade de estruturas, simples e complexas, que possuem pelo menos um anel
aromático no qual pelo menos um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila”
(SIMÕES et al., 2007, p. 519) e são classificados segundo a tabela 1, abaixo:
Tabela 1 – Classificação dos compostos fenólicos de acordo com o esqueleto básico.
Esqueleto básico
C6
C6-C1
C6-C2
C6-C3
C6-C4
C6-C1-C6
C6-C2-C6
C6-C3-C6
(C6-C3)2
(C6-C3-C6)2
(C6)n
(C6-C3)n
(C6-C1)n
(C6-C3-C6)n
Classe de compostos fenólicos
Fenóis simples, benzoquinonas
Ácidos fenólicos
Acetofenonas e ácidos fenilacéticos
Fenilpropanoides: ácidos cinâmicos e compostos análogos,
fenilpropenos, cumarinas, isocumarinas e cromonas
Naftoquinonas
Xantonas
Estilbenos, antraquinonas
Flavonoides e isoflavonoides
Lignanas
Diflavonoides
Melaninas vegetais
Ligninas
Taninos hidrolisáveis
Taninos condensados
Fonte: Simões et al. (2007).
Khalil et al. (2011) afirmam que os compostos fenólicos estão diretamente
relacionados às propriedades organolépticas do mel (cor, sabor e aroma) e aos efeitos
benéficos à saúde humana, comportando-se como marcadores da origem botânica dos méis,
pois sua composição varia de acordo com a fonte do néctar.
Dentre os compostos bioativos, os fenólicos apresentam-se como um grupo de grande
25
interesse, representando os principais compostos secundários, amplamente difundidos nas
plantas e microrganismos.
A caracterização dos compostos fenólicos é realizada por meio de análises dos
compostos fenólicos totais, pela quantificação individual ou de apenas um grupo de
compostos. Devido à variação da solubilidade dos compostos fenólicos, para realização de
extração utilizam-se diversos solventes, dentre eles o metanol, etanol, acetona, água, acetato
de etila, propanol e diversas combinações (ÂNGELO; JORGE, 2007).
Para
a
quantificação
dos
compostos
fenólicos
existem
várias
técnicas
espectrofotométricas, sendo o método de Folin-Denis muito utilizado para a determinação de
fenólicos totais em vegetais (ÂNGELO; JORGE, 2007) e em méis (LIANDA, 2009).
O método Folin-Ciocalteau foi desenvolvido por Otto Folin e Vintila Ciocalteu em
1927 para a realização da análise de tirosina e, por ser mais sensível aos fenóis e diminuir a
tendência à precipitação, tem substituído o método de Folin-Denis. O reagente de fenol é
preparado a partir da adição de tungstato de sódio e molibidato de sódio a certo volume de
água, seguido da adição de ácido clorídrico, ácido fosfórico, sulfato de lítio e pequena
quantidade de bromo líquido, em procedimento meticuloso (FOLIN; CIOCALTEU, 1927).
Independente do tipo de reagente utilizado a espectrofotometria não é específica, pois
identifica todos os grupos fenólicos presentes no extrato e a quantidade de hidroxilas e os
grupos potencialmente oxidáveis apresentam-se por meio da intensidade da coloração azul
(ÂNGELO; JORGE, 2007).
A cromatografia à gás (CG) e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) são
técnicas utilizadas tanto na separação, quanto na quantificação de compostos fenólicos
(ANGELO; JORGE, 2007; MEDA et al., 2005).
Lianda (2009) ao trabalhar com análise de méis elegeu a CLAE com fase reversa
(octadecil-C18), devido à rapidez e reprodutibilidade da identificação de substâncias
fenólicas, quando acoplada ao detector de arranjo de fotodiodos e identificou ácidos fenólicos
e flavonoides, com base na comparação dos tempos de retenção de padrões, juntamente com
as análises dos respectivos espectros de absorção no UV.
Os ácidos fenólicos caracterizam-se por apresentarem um anel benzênico ligado a um
grupo carboxílico e a um ou mais grupos hidroxilas ou metoxila, atribuindo-lhes propriedade
antioxidante. Apresentam-se distribuídos em dois grupos, os derivados dos ácidos benzoicos e
os derivados dos ácidos cinâmicos (ANGELO; JORGE, 2007; KHALIL et al., 2011,
SOARES, 2002).
26
1.4.2 Carotenoides
Os carotenoides caracterizam-se por apresentarem substâncias com características
funcionais e atividade antioxidante. Pertencem ao grupo de pigmentos responsáveis pela
coloração amarela e vermelha das frutas, sendo utilizados comercialmente como corantes
alimentícios (TAN et al., 1989; UENOJO; JUNIOR; PASTORE, 2007).
1.4.3 Flavonoides
A estrutura química básica dos flavonoides (C6-C3-C6) apresentada na figura 4 é
resultante de duas rotas biossintéticas: a rota do ácido chiquímico, que origina a fenilalanina e
a rota acetato via ácido malônico. O anel A do esqueleto básico dos flavonoides é formado
pela rota do acetato e a via do ácido chiquímico, precursor do ácido cinâmico, é responsável
pela formação do anel aromático B e a ponte de três carbonos. (LIANDA, 2009; ZUANAZZI;
MONTANHA, 2007).
Figura 4 - Estrutura química básica dos flavonoides em relação à origem Biosintética.
O
A
B
C
O
acetato
ácido chiquímico
Fonte: Zuanazzi; Montanha (2007).
De acordo com a substituição no heterocíclo (C) ocorre à formação de importantes
classes de flavonoides, como por exemplo, podem-se citar os flavonóis, as flavonas,
flavononas e antocianinas (figura 5), podendo também estar na forma acíclica como nas
27
chalconas. As substituições nos anéis A e B originam diferentes compostos dentro de cada
classe de flavonoides. Nos méis, os flavonoides incluem flavonas, flavononas e flavonóis
(HOLLMAN; KATAN, 1999; LIANDA, 2009).
Figura 5 – Algumas classes dos flavonoides.
O
O
OH
O
flavonóis
O
flavonas
OH
O
O
H
H
H
O
H
antocianinas
O
flavononas
Fonte: Cook, Sammam (1996).
O alumínio forma complexos estáveis à complexação do cátion alumínio em duas
bandas de absorção (figura 6): A banda II ocorre entre 240-285 nm devido à absorção do anel
“A” (sistema benzoíla), e a banda I ocorre entre 300-450 nm referente à complexação no anel
“B” (sistema cinamoíla). A estabilidade do complexo obtido possibilita a determinação de
agrupamentos de flavonas e flavonóis (GÓMES-CARAVACA et al., 2006; LIANDA, 2009;
TYLKOWSKI, 2010). Para a quantificação dos flavonoides por meio da espectroscopia de
UV-visível utilizam-se várias técnicas descritas na literatura, de acordo com o agrupamento
ou compostos específicos a se quantificar. Por exemplo, com auxílio do reagente cloreto de
alumínio (AlCl3) pode-se quantificar, com maior eficiência, as flavonas e os flavonóis.
28
Figura 6 – Complexo flavonoide-Al+3, em solução metanólica de cloreto de alumínio.
OH
Al3+
O
OH
OH
OH
O
Al 3 +
Fonte: Lianda (2009).
1.4.4 Determinação da cor do mel
A cor do mel está correlacionada com a sua origem floral, processamento e
armazenamento, fatores climáticos durante o fluxo do néctar e a temperatura na qual o mel
amadurece na colmeia. Portanto, a diversidade florística de uma região pode ser identificada
por meio da variabilidade de coloração dos seus méis (LACERDA et al., 2010).
A cor e aparência física são os principais critérios utilizados pelos consumidores na
escolha de um mel. Essa preferência contribui com o aumento do preço dos méis com
coloração mais clara no mercado mundial. Contudo, muitos autores apresentam análises em
que méis com coloração mais escura e sabor acentuado são os produtos de reações entre
substâncias fenólicas, ferro, minerais e da instabilidade da frutose. Dessa maneira, méis com
coloração escurecida possuem o indicativo de maior concentração de minerais, vitaminas B e
C e apresentam pH mais elevado além da presença de cálcio e ferro. Já os méis com
tonalidade mais clara estão diretamente relacionados ao sódio, elemento constituinte das
cinzas dos méis (LACERDA et al., 2010).
No mercado internacional a preferência é por méis com classificação entre extrabranco e âmbar extra-claro (MOURA, 2010). A cor dos méis pode ser determinada por
análises espectrofotométricas, que consistem na leitura da absorbância que é relacionada com
a cor, expressa em milímetros (mm), de acordo com a escala de Pfund (VARGAS, 2006)
descrita na tabela 2.
29
Tabela 2 - Classificação da coloração do mel segundo a escala de Pfund.
Cor do mel
Branco-água
Extra-branco
Branco
Âmbar extra-claro
Âmbar claro
Âmbar
Âmbar escuro
Escala de Pfund (mm)*
0–8
8 – 16,5
16,5 – 34
34 – 50
50 – 85
85 – 114
114 ou mais
Abs 635 nm
0,114 – 0,125
0,125 – 0,148
0,148 – 0,195
0,195 – 0,238
0,238 – 0,333
0,333 – 0,411
0,411 ou mais
Fonte: Vargas (2006)
Pontis (2011) utilizando-se da escala de Pfund classificou os méis de diferentes
regiões do estado de Roraima com valores entre 31,12 e 166,68 mmPfund, referentes às cores
variando entre branco e âmbar escuro.
1.4.5 Atividade antioxidante
A atividade antioxidante dos méis apícolas relacionada aos compostos fenólicos,
flavonoides e carotenoides tem sido bastante estudada, devido ao fato de atuarem em doenças
degenerativas,
cardiovasculares
e
câncer
(BALTRUSAITYTÉ;
VENSKUTONIS;
CEKSTERYTE, 2007; LIANDA, 2009; SOCHA et al., 2011).
Os flavonoides quercetina, apigenina e luteolina se apresentaram como antioxidantes
propícios no combate à proliferação de células carcinógenas. Contudo, a utilização de
antioxidantes polifenólicos derivados de alimentos induz a reações que requer um estudo
minucioso, uma vez que seu mecanismo ainda não é claro (LIANDA, 2009).
Segundo Cook e Samman (1996) a atividade antioxidande dos flavonoides está
diretamente relacionada aos seus arranjos estruturais, onde os mesmos atuam na prevenção da
formação dos radicais livres por meio do sequestro dos íons metálicos. Estes autores
descrevem as seguintes características estruturais como importantes para a atividade
antioxidante dos flavonoides:
a) a presença do grupo hidroxila na posição três do anel C, onde os flavonóis são exemplo de
flavonoides nestas condições;
30
b) a ligação dupla entre os carbonos dois e três do anel C, cuja hidrogenação diminui o efeito
antiperoxidativo;
c) e com relação ao número de grupos hidroxilas, quanto maior seu número nos anéis A e B,
maior a atividade sequestradora de radicais livres.
O valor medicinal dos méis é atribuído, em grande parte, à atividade antioxidante
(ALJADI; KAMARUDDIN, 2004), definida como quaisquer substâncias que presentes em
baixas concentrações em determinado substrato oxidável, diminuem ou inibem a oxidação
desse substrato (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1986).
Assim, devido a grande importância à saúde humana (CHANG et al. 2011), diversos
pesquisadores tem se dedicado ao estudo de méis, e, muitos utilizaram-se do método do
DPPH para determinar a atividade antioxidante (ESTEVINHO et al. 2008; ISLAN, 2012;
LECHEMAN et al. 2010; SANT’ANA et al. 2012).
Em virtude da grande diversidade de compostos, vários ensaios in vitro têm sido
desenvolvidos para determinar a capacidade antioxidante de diversas amostras. Os ensaios
estão baseados em dois tipos: cinética química e transferência de elétrons. Este último
caracteriza-se pelo sequestro dos radicais livres associados à degradação oxidativa (HUANG;
OU; PRIOR, 2005).
Dentre vários ensaios espectrofotométricos, os métodos do DPPH, do sistema beta
caroteno/ácido linoleico, do ABTS e FRAP são os mais utilizados na determinação da
atividade antioxidante in vitro. Nesse estudo foi utilizado o método do DPPH, por ser um
método simples, reprodutível e caracterizado pela redução do radical livre 2,2-difenil-1picrilhidrazila na presença de um antioxidante doador de hidrogênio, reação que pode ser
acompanhada por meio do decaimento na absorbância da amostra analisada (MOLINEUX,
2004, GENOVESE et al., 2008), sendo bastante utilizado devido sua simplicidade e rapidez
(BRAND-WILLIAMS et al., 1995).
A molécula de DPPH (figura 7) é considerada um radical livre estável por apresentar
um elétron desemparelhado que pode se deslocar por toda a sua estrutura, resultando em uma
coloração violeta escura, que é caracterizada por apresentar uma banda de absorção em cerca
de 520 nm quando em solução de etanol ou metanol (LIANDA, 2009, MOLYNEUX, 2004).
31
Figura 7 – Perfil espectrofotométrico do radical 2-2-difenil-picril-hidrazil (DPPH).
Fonte: Passos (2010).
Não existem relatos da atividade antioxidante de méis amargos e este fato motivou a
realização destes experimentos neste trabalho.
32
2 OBJETIVO
Esta dissertação norteou-se pelos seguintes objetivos:
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a existência de marcadores químicos que possam confirmar a origem
botânica do mel amargo proveniente do município do Cantá/RR, bem como verificar sua
composição química e atividade antioxidante.
2.1.2 Objetivos específicos
Caracterizar a origem botânica do mel através da comparação da composição química
dos extratos de mel e de Vochysia sp.;
Determinar o teor de fenólicos, flavonoides, carotenoides e a cor do mel;
Verificar a atividade antioxidante do mel.
33
3 MATERIAL E MÉTODOS
A metodologia de trabalho desta pesquisa está embasada em dois pilares: o primeiro
aborda
a
caracterização
botânica
do
mel
amargo
utilizando-se
das
análises
melissopalinológica e botânica; e análises por espectrometria de massas e cromatográfica. O
segundo pilar aborda a caracterização do mel com base nas análises espectrofotométricas e da
atividade antioxidante do mel.
3.1 MATERIAIS
Os padrões utilizados nas quantificações e nas análises por espectrometria de massas
foram adquiridos de Sigma-Aldrich e os solventes para análise foram destilados para eliminar
contaminantes antes de serem utilizados.
3.2 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MEL
Uma amostra de mel amargo de aproximadamente 20 kg foi obtida de um apiário
localizado na Vila do Vinte, Serra Grande II, município de Cantá-RR (01° 52.879’ N; 060°
35.978’ O) em novembro de 2011. O município está localizado no centro leste do estado de
Roraima, apresenta clima quente e semiúmido, com estação seca de outubro a março e estação
chuvosa de abril a setembro. A precipitação média varia de 1750 a 2000 mm e a média da
temperatura é de 27,5 °C (RORAIMA, 2010).
A identificação melissopalinológica foi realizada pelo biólogo Doutor Silvio José Reis
da Silva, do Museu Integrado de Roraima e professor da Universidade Estadual de Roraima
(UERR). O procedimento de análise inicialmente elaborado por Erdtman em 1960 foi
adaptado por Silva em 1998 e apresenta-se descrito a seguir.
3.2.1 Procedimentos para análise polínica de mel.
Inicialmente homogeneizou-se aproximadamente 50 ml da amostra de mel em água
destilada na proporção de 1:1 em seguida, centrifugou-se a 3000 rpm por 20 min. Após esse
procedimento, descartou-se o sobrenadante e adicionou-se novamente a mistura de água e mel
34
ao centrifugado sem agitação do sedimento, procedendo-se com nova centrifugação a 3000
rpm por 20 min. Este procedimento foi realizado por 5 vezes. Ao precipitado obtido,
adicionou-se água destilada, solubilizando-se o sedimento e procedeu-se com nova
centrifugação a 3000 rpm por 20 min. Posteriormente, descartou-se o sobrenadante e
adicionou-se ao precipitado 5 mL de ácido acético glacial, agitou-se, centrifugou-se a 3000
rpm por 20 min e descartou-se o sobrenadante. Em seguida adicionou-se 5 mL de solução de
acetólise (9 partes de anidrido acético e 1 parte de ácido sulfúrico), ferveu-se em banho-maria
por 2 min, centrifugou-se a 3000 rpm por 20 min e descartou-se o sobrenadante. Ao
precipitado adicionou-se água destilada, agitou-se e centrifugou-se a 3000 rpm por 20 min.
Novamente descartou-se o sobrenadante e adicionou-se ao precipitado 10 mL de água
glicerinada na proporção de 1:1, agitou-se e descartou-se o sobrenadante. Por fim, os tubos
centrifugados foram mantidos emborcados até o momento de montagem e análise das lâminas
(SILVA, 1998).
3.3 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO
O material botânico (galhos contendo folhas, frutos, flores e resina) foi coletado nos
meses de setembro e novembro de 2012 às margens da BR-401, Bairro Santa Cecília,
município do Cantá (figura 8).
Figura 8 – Material botânico coletado contendo folhas, flores (A), frutos (B), casca e resina
(C).
A
B
C
A coleta foi realizada com o auxilio de uma escada e podão. Nesta pesquisa foram
utilizadas apenas as flores, parte da planta em que a abelha coleta o néctar, para comparação
de constituintes. Sendo que, as demais partes coletadas (folhas, frutos, galhos e resina) estão
35
sendo analisadas pelo aluno de Iniciação científica, Gilmar Prado. Parte do material botânico
coletado foi utilizado para a elaboração de duas exsicatas. Estas foram identificadas pela
Doutora Andréia Flores do Museu Integrado de Roraima, local onde uma exsicata está
depositada sob o Tombo “MIRR 10569”. A segunda exsicata está depositada no herbário da
UFRR. As demais flores foram utilizadas para a elaboração dos extratos a serem analisados.
3.4 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DO MEL
Do mel amostrado foram preparados quatro extratos: extratos metanólicos com resina
Amberlite XAD-2 e Sep-pak C18, extrato líquido-líquido diclorometânico e uma porção de
mel in natura preparada por liofilização.
3.4.1 Extração em fase sólida (SPE) com Amberlite XAD-2
No preparo do extrato em fase sólida por XAD-2 foram utilizados 50 g de mel
homogeneizados com 50 mL de água destilada com pH 2, filtrado e reservado. Em seguida,
misturou-se 75 g de Amberlite XAD-2 em 200 mL de metanol e manteve-se por agitação
mecânica por 30 min. Em sequência a resina foi filtrada, lavada com água acidificada com
HCl (pH 2) e água destilada. A seguir a resina foi empacotada em coluna de vidro. E o mel
acidificado e reservado foi depositado na coluna e lavado com 250 mL de água com pH 2 e
em seguida com 250 mL de água destilada. Por fim, adicionou-se 300 mL de metanol e
coletou-se o extrato. Este último foi concentrado em evaporador rotativo, contudo, por ainda
conter água, extrato foi liofilizado e armazenado em dessecador até o momento das análises
(KASSIM et al., 2010; LIANDA, 2009; YAO et al., 2003, 2004)
3.4.2 Extração em fase sólida com C18
Inicialmente acoplou-se o cartucho Sep-Pak C18 (200 mg, Waters) em coluna de
vidro e lavou-se com 10 mL de metanol e em seguida, com 10 mL de água destilada. A
amostra de mel (10 g) foi solubilizada com 50 mL de água destilada e agitada por
aproximadamente 10 minutos. A solução foi filtrada adicionada a coluna e eluída com o
auxílio de uma bomba de vácuo. Na sequência lavou-se a coluna com água destilada (10 mL)
e por último, com metanol (10 mL). O extrato metanólico coletado foi concentrado em
36
evaporador rotativo, liofilizado e armazenado sob vácuo até o momento das análises
(TRUCHADO; FERRERES; TOMAS-BARBERAN, 2009).
3.4.3 Preparo do extrato líquido-líquido
Primeiramente montou-se o sistema de extração líquido-líquido e em seguida,
transferiu-se em balão de fundo redondo, 500 mL de diclorometano (CH2Cl2) e 250 mL de
diclorometano no corpo extrator conectado ao condensador. No segundo momento, pesou-se
200 g de mel e homogeneizou-se com 300 mL de água destilada por 10 minutos. Após a
homogeneização, filtrou-se e depositou-se delicadamente sobre o diclorometano do corpo
extrator. Após a montagem do sistema e adição da amostra, ligou-se a manta de aquecimento e
regulou-se a temperatura até gotejamento discreto e contínuo. Após 72 horas de extração
contínua desligou-se a manta aquecedora e coletou-se a fase orgânica, secou-se com sulfato
de sódio e concentrou-se em evaporador rotativo (BOUSETA; COLLIN, 1995; PONTIS,
2011).
3.5 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DAS FLORES
As flores foram submetidas à extração a frio em etanol. Para tanto, logo após a coleta,
o material foi limpo (retirada manual de pequenos insetos e sujidades) e em seguida foi
separada, com o auxilio de uma tesoura, a antera das demais partes das flores. As anteras
foram pesadas (massa fresca de 2 g) e em seguida foram imersas em etanol (50 mL) e agitadas
manualmente. Rapidamente filtrou-se e concentrou-se em evaporador rotativo. Este
procedimento foi realizado com o fim de se obter um extrato enriquecido de pólen. O extrato
das anteras das flores foi identificado como extrato etanólico das anteras das flores (EEAF).
As demais partes das flores foram pesadas (massa fresca de 65,96 g) e imersas em etanol (600
mL). Após 24 h a temperatura ambiente, procedeu-se da filtração, secagem com sulfato de
sódio e concentração em evaporador rotativo. Este procedimento foi repetido por cinco vezes,
com o propósito de se obter o máximo de extrato. Em seguida o extrato etanólico das flores
identificado por EEF foi liofilizado e armazenado em dessecador sob vácuo até o momento
das análises.
37
3.6 FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS
Os extratos das flores (EEF) e de mel por XAD-2 foram particionados utilizando-se
solventes orgânicos com polaridade crescente.
3.6.1 Fracionamento dos extratos de mel e das flores.
Para o fracionamento do extrato de mel pesou-se 500 mg de extrato em recipiente
tarado, transferiu-se para um gral de porcelana para maceração com uma pequena porção de
sílica gel. A amostra foi adicionada à coluna cromatográfica empacotada com 18 g de sílica
gel 230-400 mesh. Na sequência procedeu-se o fracionamento com 600 mL de hexano, 600
mL de diclorometano, 750 mL de acetato de etila e 750 mL de metanol. As frações obtidas
foram concentradas em evaporador rotativo e os extratos foram armazenados sob refrigeração
até o momento das análises cromatográficas.
O mesmo procedimento foi realizado para o particionamento do extrato das flores.
3.7 ESPECTROMETRIA DE MASSAS COM IONIZAÇÃO À PRESSÃO ATMOSFÉRICA
(API)
As análises por espectrometria de massas com ionização à pressão atmosférica (API)
foram realizadas no Laboratório de Espectrometria de massas da Universidade Federal do
Amazonas, sob a orientação da Profa. Dra. Maria Lucia Belém Pinheiro. Os espectros de
massas foram adquiridos em um espectrômetro do tipo ion trap (Thermo - LCQ Fleet)
equipado com uma fonte de API (eletrospray ou APCI) programada para operar nos modos
positivo e negativo de aquisição. As informações foram registradas através do modo de
aquisição continua disponível no LCQ Fleet Tune, com faixa monitorada de m/z 100-1000.
3.7.1 Preparo das amostras
Os extratos (1 mg) foram solubilizados com 1 mL de metanol e 1 mL de
diclorometano (para os extratos diclorometano). Do solubilizado foi retirada uma alíquota de
20 µL e diluída em 1 ml de metanol grau HPLC (obtendo-se uma concentração entre 15 e 20
38
ppm) e aplicadas por inserção direta em looping de 5μL, sendo utilizada a seringa do próprio
equipamento como veículo de transporte.
3.7.2 Espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI-MS)
As análises por electrospray foram realizadas de acordo com as seguintes condições
analíticas:
ESI (+): voltagem do spray, 5 kV; gás de bainha, 10 arb; gás auxiliar, 5 arb; gás sweep, 0 arb;
temperatura do capilar, 200 ºC; voltagem do capilar, 40 V; lente do tubo, 115 V; bombeamento
da seringa, 20 μL/min;
ESI (-): voltage do spray, 5 kV; gás de bainha, 10 arb; gás auxiliar, 5 arb; gás sweep 0 arb;
temperatura do capilar,
200 ºC; voltagem do capilar
-40 V; lente do tubo
-115 V;
bombeamento da seringa 20 μL/min;
3.7.3 Espectrometria de massas com ionização química à pressão atmosférica (APCIMS)
As análises por ionização química foram realizadas de acordo com as seguintes
condições analíticas:
APCI (+): voltagem da descarga, 3 kV; temperatura de vaporização, 300 ºC; gás de bainha, 30
arb; gás auxiliar, 10 arb; gás sweep, 0 arb; temperatura do capilar, 200 ºC; voltagem do
capilar , 40 V; lente do tubo, 115 V; bombeamento da seringa, 30 μL/min;
APCI (-): voltagem da descarga, 3 kV; temperatura de vaporização 300 ºC; gás de bainha ,
30 arb; gás auxiliar , 10 arb; gás sweep, 0 arb; temperatura do capilar 200 ºC; voltagem do
capilar , -40 V; lente do tubo , -115 V; bombardeamento da seringa 30 μL/min.
3.8 CROMATOGRAFIA A GÁS ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CGEM).
39
Os ensaios por cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG-EM)
foram realizados no Núcleo de Pesquisas energéticas (NUPENERG), sob a orientação do
Prof. Dr. Luiz Antônio Mendonça Alves da Costa, do Departamento de Química da
Universidade Federal de Roraima. Os extratos foram derivatizados e injetados em um
cromatógrafo a gás da Shimadzu (modelo GC2010), acoplado a um detector de massas do
mesmo fabricante (modelo GCMS-QP2110Plus), operado a 70 eV. O cromatógrafo estava
equipado com coluna capilar de sílica fundida Rtx-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). Como gás
de arraste utilizou-se o hélio. As injeções das amostras foram da ordem de 1 μL a partir de
uma solução 10 mg/mL e as condições gerais de análise foram: temperatura do injetor de
240ºC; modo de injeção: split (10:1) com purga de 3 mL/min; controle de fluxo de gás:
velocidade linear; fluxo de gás de arraste: 1,02 mL/min; temperatura da interface: 310ºC;
temperatura da fonte de íons: 280ºC; e programação do forno: 50ºC - 310ºC (3ºC/min),
mantendo por 20 minutos a temperatura final.
3.8.1 Derivatização com BSTFA
Utilizando-se aproximadamente 10 mg dos extratos preparados, derivatizou-se com
200 µl de piridina e 100 µl de BSTFA (bis(trimetilsilil)trifluoracetamida).
3.8.2 Derivatização com DMDS/I2.
As frações hexânicas de mel (EMel-XAD-2) e das flores sem antera (EEFlor) foram
solubilizadas com éter etílico e tratadas com 200 μL de dimetildissulfeto (DMDS) e 100 μL da
solução de iodo (20 mg de I2 em 2 mL de éter etílico). As misturas reacionais foram mantidas
em capela de exaustão sob agitação contínua e sob refluxo por uma noite a 50°C. Após esse
período, adicionou-se 2 mL da solução aquosa de tiossulfato de sódio (1g de Na2S2O3 em 10
mL de água destilada) e 500 µL de hexano bidestilado para a interrupção da reação (mudança
de cor do vermelho para transparente).
A fase orgânica foi extraída, seca com sulfato de sódio anidro e evaporada em
atmosfera de nitrogênio. As amostras derivatizadas foram analisadas por CG-EM (FRANCIS;
VELAND, 1981).
3.9 ANÁLISES ESPECTROFOTOMÉTRICAS DO MEL
40
As análises espectrofotométricas foram realizadas em espectrofotômetro registrador
UV-Visível da marca Shimadzu, modelo UV-mini 1240, realizadas no Laboratório de
Biotecnologia e Química Fina da Universidade Federal de Roraima.
Antecedendo as quantificações foram realizados ensaios para visualizar o maior pico
de absorbância de cada padrão, mediante a obtenção de um espectro de varredura na região do
UV-Visível.
Na elaboração das curvas de calibração utilizou-se uma sequencia de concentrações
que possibilitou a plotagem das amostras nas referidas curvas. Com esse procedimento
obtiveram-se os dados das equações da reta (Y= A + B.X) e dos coeficientes de correlação
(R2) para então efetuar os cálculos de concentração de cada constituinte quantificado.
3.9.1 Determinação do teor de compostos fenólicos
O teor dos compostos fenólicos foi verificado, de acordo com a metodologia de FolinCiocalteau, utilizando-se o ácido gálico (figura 9) como padrão (FOLIN; CIOCALTEU,
1927).
Figura 9 – Padrão utilizado para análise de compostos fenólicos.
O
OH
HO
OH
OH
ácido gálico
3.9.1.1 Curva de calibração do ácido gálico
Para elaboração da curva padrão foram realizados ensaios com o ácido gálico,
observando-se o comprimento de onda na região do visível e selecionando o comprimento de
41
onda 798 nm. Para a leitura foram preparadas cinco soluções de diferentes concentrações.
Para tanto foram pipetadas alíquotas de 100, 200, 300, 400, 600 e 800 µL a partir da solução
estoque de ácido gálico (0,1 mg/mL), acrescidas de 2000 µL de solução aquosa de carbonato
de sódio (Na2CO3) a 15%, 300 µL do reagente Folin-Ciocalteu e água destilada até o volume
final de 5 mL. Todos os pontos da curva foram elaborados em triplicata.
3.9.1.2 Doseamento da amostra
Sequencialmente, foi elaborada a solução estoque de mel na concentração de 0,1 g/mL
e, a partir dela foram retiradas três alíquotas (500 µL) para elaboração das soluções de reação
depositadas em balão volumétrico, adicionados 300 µL do reagente Folin-Ciocalteu, 2000 µL
da solução aquosa de carbonato de sódio (Na2CO3) a 15% e água destilada até o volume de 5
mL.
O branco constituiu-se de 2000 µL de carbonato de sódio (Na2CO3) a 15%, 300 µL de
reagente de Folin-Ciocalteu e água. As soluções foram preparadas em balão volumétrico,
transferidas para tubos de ensaio e armazenadas ao abrigo da luz por 2 h.
Decorrido o tempo de reação, as soluções foram homogeneizadas em agitador de tubos
e as absorbâncias foram lidas a 798 nm.
3.9.2 Determinação do teor de flavonoides
O teor de flavonoides foi determinado pelo somatório de três metodologias. Para
determinação das antocianinas utilizou-se a metodologia descrita por Francis apud Araújo
(ARAÚJO, 2007). A metodologia de complexação do cloreto de alumínio na determinação
das flavonas e flavonóis (ALVES; KUBOTA, 2013; ESTEVINHO et al., 2012; GÓMEZCARAVACA et al., 2006; KHALIL et al., 2011; TENORE et al., 2012; TYLKOWSKI et al,
2010) e, para a determinação das flavononas e diidroflavonóis foi utilizada a 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNP), um reagente para estes flavonoides (ALVAREZ-SOARES et al., 2010b)
bastante utilizado no estudo da própolis (MIGUEL et al.,2010; TYLKOWSKI et al., 2010;
VALENCIA et al., 2012).
Estas metodologias implantadas no Laboratório de Biotecnologia e Química Fina da
Universidade Federal de Roraima têm sido utilizadas para análises de méis (PONTIS, 2011).
42
3.9.2.1 Flavonas e flavonóis
Para a determinação do teor de flavonas e flavonóis utilizou-se a quercetina (figura 10)
como padrão de quantificação (DOWD, 1959).
Figura 10 – Padrão utilizado para análise de flavonas e flavonóis.
OH
OH
O
HO
OH
OH
O
quercetina
3.9.2.1.1 Curva de calibração da quercetina
Para elaboração da curva de calibração foram realizados ensaios observando-se o
comprimento de onda na região do visível e selecionado o comprimento de onda 437 nm. A
curva de calibração de quercetina foi elaborada mediante os resultados obtidos da leitura
espectrofotométrica dos pontos, em triplicata de 40, 60, 120, 140 e 160 µL de solução estoque
de quercetina (0,1 mg/mL) acrescidos de 3000 µL de AlCl3 a 5% e metanol até o volume de 5
mL.
Para cada ponto da curva de calibração foi elaborado um branco composto da alíquota
de quercetina (40 a 160 µL) e metanol até o volume de 5 mL. Este procedimento foi
necessário para evitar a variação das leituras de cada triplicata da curva padrão.
3.9.2.1.2 Doseamento da amostra
Posteriormente, foram aferidas as absorbâncias da solução aquosa de mel (0,2 g/mL)
expressas em média ± desvio padrão. Para tanto, da solução estoque de mel foram retiradas
43
três alíquotas de 2000 µL e acrescidas de 3000 µL de AlCl3 a 5%, sendo o branco constituído
de 3000 µL de AlCl3 a 5% e metanol.
3.9.2.2 Flavonas e diidroflavonois
O teor de flavonas e diidroflavonois foi determinado por meio da utilização da
pinocembrina (figura 11) como padrão de quantificação (AGARWAL; VEMANARADHYA;
MEHTA, 2012).
Figura 11 – Padrão utilizado para análise de flavononas e diidroflavonois.
O
HO
OH
O
pinocembrina
Previamente foram elaboradas as soluções de DNP, pinocembrina (1mg/mL) e KOH a
10% [metanol/água (7:3)], conforme modo de preparo descrito abaixo.
3.9.2.2.1 Preparo da solução estoque de 2,4-dinitrofenilidrazina (DNP)
Pesou-se 0,5 g do reagente 2.4-dinitrofenilidrazina (DNP), previamente seco a 60 ºC,
em estufa com circulação de ar por 3 horas. Em seguida solubilizou-se o reagente com 1mL
de ácido sulfúrico 96% e pequena quantidade de metanol. Após este procedimento, a solução
foi transferida para um balão volumétrico de 50 mL e completou-se o volume com metanol.
3.9.2.2.2 Preparo da solução estoque de pinocembrina (1 mg/mL)
Pesou-se 0,005 g de pinocembrina, solubilizou-se com metanol, transferiu-se o
solubilizado para balão volumétrico de 5 mL e completou-se o volume com metanol.
44
3.9.2.2.3 Preparo da solução estoque de KOH a 10%
Pesou-se 10 g de KOH e solubilizou-se com solução de metanol/água (7:3), transferiuse o solubilizado para balão volumétrico de 100 mL e completou-se o volume com solução de
metanol/água. Das soluções estoques (figura 12-A) preparadas anteriormente, foram
elaboradas as soluções para a leitura do padrão (pinocembrina) e do mel, bem como os
brancos do padrão (pinocembrina) e do mel (figura 12-B).
Figura 12 - (A) Soluções estoque de pinocembrina, KOH e DNP; (B) sistema de aquecimento
da solução estoque de pinocembrina, solução estoque da amostra e brancos da curva e da
amostra.
B
A
3.9.2.2.4 Curva de calibração de pinocembrina
Primeiramente pipetou-se uma alíquota de 0,4 mL de solução estoque de pinocembrina
(1mg/mL) e misturou-se com 0,8 mL de solução de DNP. A mistura foi mantida sob
aquecimento a 50 °C durante 50 min (figura 11-B). Após resfriamento à temperatura
ambiente, foram adicionados 2,8 mL de KOH a 10% em metanol/água (7:3).
Para elaboração dos pontos da curva de calibração foram realizados ensaios
observando-se o comprimento de onda na região do visível e selecionado o comprimento de
onda 437 nm. Para tanto, foram pipetadas alíquotas de 25, 75, 100, 150 e 200 µL da mistura e
adicionados metanol até atingir o volume final de 5 mL. Em seguida as soluções foram
transferidas para tubos de ensaio, homogeneizadas em agitador de tubos e as absorbâncias
foram medidas.
45
3.9.2.2.5 Branco da curva de calibração
O branco da curva foi preparado misturando-se 0,4 mL de metanol e 0,8 mL de DNP.
A mistura, então, foi mantida sob aquecimento a 50 °C durante 50 min (figura 12-B). Após
resfriamento à temperatura ambiente foram adicionados 2,8 mL de KOH a 10% em
metanol/água (7:3). Após homogeneização pipetaram-se alíquotas de 25, 75, 100, 150 e 200
µL e adicionou-se metanol até o volume de 5 mL. Em seguida centrifugou-se a 2800 rpm
durante 5 minutos e as absorbâncias foram aferidas.
3.9.2.2.6 Doseamento da amostra
Para a amostra de mel foram misturados 0,2 mL de solução estoque de mel (2 g/mL) e
0,4 mL de DNP. A mistura foi mantida sob aquecimento a 50 °C durante 50 min (figura 12B). Após resfriamento à temperatura ambiente, foi adicionado 1,4 mL de KOH a 10% em
metanol/água (7:3). Da mistura resultante foi pipetada uma alíquota de 0,5 mL e adicionado
metanol até o volume de 5 mL.
3.9.2.2.7 Branco da amostra
O branco da amostra foi preparado misturando-se 0,2 mL de metanol e 0,4 mL de
DNP. A mistura foi então mantida sob aquecimento a 50 °C durante 50 min (figura 12-B).
Após o resfriamento à temperatura ambiente foi adicionado 1,4 mL de KOH a 10% em
metanol/água (7:3). Desta mistura, retirou-se uma alíquota de 0,15 mL e adicionou-se metanol
até o volume de 5 mL. Em seguida centrifugou-se a 2800 rpm durante 5 minutos e as
absorbâncias foram aferidas.
3.9.2.3 Antocianinas
Para determinação do teor de antocianinas (figura 13) utilizou-se a metodologia
descrita por Francis apud Araújo (ARAÚJO, 2007).
46
Figura 13 - Estrutura básica das antocianinas.
R1
OH
O
HO
R2
OH
OH
antocianinas
Na determinação do teor de antocianinas preparou-se inicialmente uma solução
extratora composta de 15% de HCl 1,5 N e 85% de etanol a 95%. Na sequência, com o auxílio
do sonicador preparou-se uma solução estoque de mel a 0,5 g/mL em solução extratora. Da
solução estoque de mel foram retiradas três alíquotas (1 mL), que foram depositadas em três
balões de 5 mL e o volume foi aferido com solução extratora. As absorbâncias foram lidas a
515 nm contra um branco composto de solução extratora. Em seguida efetuou-se o teor de
antocianinas mediante utilização da Equação (1):
Equação (1):
Ant (mg/100g) =
[(abs).(fator de diluição)]
98,2
Onde:
Ant = teor de antocianinas expresso em mg/100g
Abs = absorbância da amostra
Fator de diluição = 100 (g/mL) dividido pela concentração de mel (g/mL).
3.9.3 Determinação do teor de Carotenoides
O conteúdo dos carotenoides (figura 14) foi verificado de acordo com metodologia
descrita por Alvarez-Suarez (2010), com algumas adaptações.
47
Figura 14 – Padrão utilizado para análise de carotenoides.
β-caroteno
A amostra de mel (1 g) foi agitada a 500 rpm com 10 mL de hexano-acetona (6:4) por
10 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi retirado e a absorbância medida a
450 nm.
3.9.4 Análise da cor
A cor foi analisada de acordo com a metodologia descrita por Lacerda et al. (2010)
consistindo na medida de absorbância em comprimento de onda de 635 nm de uma solução a
50% de mel em água destilada e centrifugada a 3200 rpm por 5 minutos, contra um branco
composto apenas de água destilada. A cor foi expressa em mm Pfund, de acordo com a
Equação (2):
Equação (2):
Cor = (371,39 x abs 635 nm) -38,70
3.9.5 Atividade antioxidante
A atividade antioxidante do mel amargo foi determinada pelo método de capacidade
sequestrante do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (figura 15).
Figura 15 – Estrutura química do radical 2-2-difenil-picril-hidrazil (DPPH).
48
N
N
NO 2
O 2N
NO 2
2-2-difenil-picril-hidrazil
Para tanto foram utilizadas nesse experimento uma solução metanólica a 1 µM de
DPPH e uma solução estoque de mel com concentração de 100 mg/mL. Para obtenção da
melhor faixa de atividade antioxidante foram realizadas várias diluições a partir da
concentração inicial. Da solução de mel foram elaboradas cinco diluições (figura 16) com as
seguintes concentrações: 6 mg/mL, 8 mg/mL, 10 mg/mL, 12 mg/mL e 14 mg/mL, das quais
foram retiradas alíquotas para o doseamento com DPPH (em triplicata).
Figura 16 - Soluções estoque de DPPH, de mel e 5 diluições da solução de mel dispostos da
esquerda para direita.
Os testes foram realizados em tubos de ensaio com uma mistura de 3,5 mL de solução
padrão de mel e 1,5 mL de DPPH para elaboração da solução de reação da amostra. As
absorbâncias de cada ponto, em triplicata, foram lidas a 515 nm após 30 minutos da reação e
incubação no escuro. O branco foi constituído de 3,5 mL da solução padrão (mel) acrescido
de 1,5 mL de metanol e o controle positivo com 1,5 mL de solução de DPPH e 3,5 mL de
49
metanol. A porcentagem da atividade antioxidante (AA%) foi determinada por meio da
Equação (3) de acordo com Mensor et al., (2001).
Equação (3):
AA% = 100 – [(Abs. da amostra – Abs do branco)] x 100
[Abs do controle]
Onde:
Abs
amostra
= absorbância da solução de DPPH e a solução amostra a ser verificada (mel e
padrão)
Abs branco = absorbância da solução da amostra (mel e padrão) e metanol
Abs controle = absorbância da solução de DPPH e metanol
Após a determinação da atividade antioxidante utilizou-se o programa Origin para
plotagem dos valores da atividade antioxidante versus concentrações das soluções e
determinou-se o IC50.
50
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Esta pesquisa é parte integrante do projeto “Avaliação da constituição química de
produtos apícolas e sua atividade biológica no estado de Roraima”, que iniciou suas
atividades em 2005. E esta dissertação se ateve à caracterização da origem botânica do mel
amargo, bem como sua caracterização química. Para tanto, foram realizadas análises
melissopalinológica e elaborados diversos extratos com o fim de compará-los quimicamente.
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA ORIGEM BOTÂNICA DO MEL
Um dos objetivos do projeto de dissertação foi a caracterização da origem botânica do
mel, com a proposta de buscar dados químicos que comprovassem a origem determinada por
melissopalinologia. A análise melissopalinológica da amostra de mel (tabela 3) demonstrou
uma predominância do pólen de Vochysia sp (Vochysaceae).
Tabela 3 – Análise melissopalinológica de mel amargo.
Pólen
Vochysia sp
Ataleia maripa
Mimosa pudica
Poaceae
Indeterminado
Mel amargo
91,2%
2,0%
3,3%
1,3%
2,7%
Paralelamente a este resultado, realizou-se a coleta de flores de Vochysia sp. e foram
elaborados extratos das flores e do mel para comprovação química da hipótese de que mel
amargo é oriundo das plantas deste gênero. Entretanto, devido a grande semelhança entre as
espécies V. guianensis Aubl e V. glaberrima, identificadas durante esta pesquisa, na região do
município do Cantá e por não haver material botânico contendo flores e frutos suficientes para
realizarmos a comparação das espécies, optou-se por não definir em nível de espécie a planta
analisada. Este fator ainda está associado a grande dificuldade de identificação das plantas,
pois a espécie V. glaberrima não se encontra registrada como ocorrente no estado de Roraima.
51
4.2 PREPARO DOS EXTRATOS
Para a obtenção de extratos de mel com características diferentes, foram elaborados os
extratos: líquido–líquido com o solvente diclorometano e os extratos por extração em fase
sólida com a resina Amberlite XAD-2 e com o cartucho de Sep-pak C18 ambos utilizando-se
do metanol como solvente.
Para elaboração dos extratos das flores, inicialmente separou-se as anteras com o
auxílio de uma tesoura, obtendo-se duas amostras: com anteras e as flores sem anteras. A
extração da antera separadamente e de forma rápida com o auxílio de ultrassom foi realizada
para verificar se os constituintes encontrados no mel estão presentes no pólen, já que os
constituintes poderiam ser advindos do pólen e não do néctar da flor. Entretanto, não foi
possível coletar néctar em quantidade significativa para análise de constituintes secundários,
pois a flor é bastante pequena e a produção de néctar é muito reduzida. Logo, como estratégia
de comparação extraiu-se constituintes da flor, técnica já utilizada para caracterizar néctar de
Spathodea campanulatta (FLACH, 2005).
Os extratos foram elaborados com etanol a frio e na tabela 4, estão apresentados os
seus rendimentos.
Tabela 4- Rendimento dos extratos do mel, das flores e da antera das flores por
diferentes tipos de extração.
Tipo de extração
Líquido-líquido
(diclorometano)
XAD-2 (metanol)
C18 (metanol)
Etanólico a frio
Etanólico a frio
Amostra
Mel
Cor
Amarelado
Rendimento %
0,098
Mel
Mel
Flor
Antera da flor
Amarelado
Amarelado
Amarelado
Esbranquiçado
0,167
0,113
12,81
0,715
Como os extratos têm uma composição complexa, optou-se por realizar um
fracionamento do extrato do mel e das flores que foram realizados em coluna cromatográfica
filtrante com sílica gel, utilizando-se e como solvente hexano, clorofórmico, acetato de etila e
metanol. Os dados do fracionamento do extrato de mel encontram-se na tabela 5.
52
Tabela 5 – Fracionamento do extrato do mel por XAD-2.
Fração
EM-hex
EM-clor
EM-AcE
EM-MeOH
Solvente
Hexano
Clorofórmio
Acetato de etila
Metanol
Aspecto
Não observado
Esbranquiçado
Levemente amarelado
Amarelado
Massa obtida (mg)
6,6
146,0
14,6
9,52
Do extrato etanólico das flores sem antera, obteve-se as frações particionadas,
apresentadas na tabela 6. Contudo, o extrato da antera da flor não pôde ser fracionado, pois o
mesmo apresentava uma massa muito pequena. Dessa forma, optou-se apenas em derivatizála e compará-la com os extratos fracionados das flores sem antera e, com os extratos
fracionados das flores e do mel, realizaram-se as análises comparativas utilizando-se a
cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG-EM).
Tabela 6 – Fracionamento do extrato das flores (EEF).
Fração
EEF-hex
EEF-clor
EEF-AcE
EEF-MeOH
Solvente
Hexano
Clorofórmio
Acetato de etila
Metanol
Aspecto
Não observado
Esbranquiçado
Amarelado
Amarelo escuro
Massa obtida (mg)
7,3
106,0
33,0
49,2
Assim, para atingir o objetivo de confirmar quimicamente a origem floral, traçaram-se
duas estratégias, a saber: a primeira estratégia baseou-se na análise direta por espectrometria
de massas pelas técnicas de eletrospray (ESI/MS) e por ionização química (APCI); a segunda
estratégia buscou comparar os constituintes voláteis presentes no mel, nas flores e nas anteras
das flores utilizando-se a cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG-EM).
4.3 ANÁLISES POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
As análises por espectrometria de massas foram realizadas no laboratório de
espectrometria de massas da Central Analítica da Universidade Federal do Amazonas, por
intermédio de cooperação como os professores Maria Lúcia Belém Pinheiro e Afonso Duarte
Leão de Souza e com o auxílio do doutorando Felipe Moura Araújo da Silva.
53
No ensaio foram obtidos perfis de espectros de massas por ESI-MS e APCI-MS nos
modos positivo e negativo dos extratos das anteras, flores e mel. Os perfis obtidos foram
comparados e selecionados íons que estavam presentes em ambos os espectros das amostras.
Após análise e seleção dos íons de interesse, as soluções foram novamente injetadas para
obtenção da respectiva fragmentação (MS/MS).
Após análise dos espectros, foi possível verificar que tanto no ESI quanto no APCI o
modo negativo apresentou uma melhor caracterização das amostras; e para melhor
visualização dos espectros de massas foram selecionadas e ampliadas às faixas de interesse.
Por apresentarem um perfil muito similar, foram abordados apenas os espectros de massas das
análises por ESI-MS no modo negativo.
As análises dos extratos da flor e do mel por ESI/MS demonstraram similaridade
conforme figura 17.
Figura 17 - Espectros de massas por ESI/MS no modo negativo do extrato da antera das flores
(A); extrato das flores sem antera (B); extrato do mel por XAD-2 (C); extrato do mel por C18
(D), extrato líquido-líquido (E) e do mel liofilizado (F).
amostra 2 -monitoramento #1 RT: 0,00 AV: 1
T: ITMS - c ESI Full ms [100,00-1000,00]
NL: 2,64E3
253,27
100
A
90
80
Relative Abundance
70
60
50
40
30
255,28
20
227,30
10
0
179,16
173,21
170
192,21
180
196,93
190
201,16
208,24
200
amostra 3 -monitoramento #1 RT: 0,00 AV: 1
T: ITMS - c ESI Full ms [100,00-1000,00]
215,17
210
225,22
222,19
228,34
220
m/z
230
251,30
241,31
240
256,32
265,23
250
269,18
260
NL: 2,06E2
241,11
100
215,12
B
90
80
Relative Abundance
70
60
191,14
50
203,01
269,22
173,15
243,14
217,20
40
255,15
219,25
30
263,17
205,13
20
251,25
250,24
206,18
227,20
239,09
195,22
186,02
180
259,24
225,10
179,25
10
0
170
262,11
208,97
190
200
210
220
m/z
230
240
250
260
54
amostra 4-monitoramento #1 RT: 0,00 AV: 1 NL: 1,43E2
T: ITMS - c ESI Full ms [100,00-1000,00]
199,29
100
C
90
263,17
80
255,33
Relative Abundance
70
60
179,22
201,25
219,25
50
235,25
40
218,31
30
221,24
253,33
193,12
181,20
241,24
20
257,22
243,19
188,19
173,21
10
213,21
203,26
187,34
225,22
265,30
262,54
250,25
215,22
268,28
229,22
0
170
180
190
200
amostra 5-monitoramento #1 RT: 0,00 AV: 1
T: ITMS - c ESI Full ms [100,00-1000,00]
210
220
m/z
230
240
250
260
270
NL: 7,44E1
219,22
100
D
90
80
255,31
Relative Abundance
70
60
50
179,23
263,24
215,20
40
199,19
220,28
30
269,25
233,24
241,33
221,28
20
187,08
10
256,35
250,23
235,26
261,42
209,19
202,12
185,26
171,28
173,16
227,21
201,21
195,18
245,21
0
170
180
190
200
amostra 6-monitoramento_121121125618 #129
T: ITMS - c ESI Full ms [100,00-1000,00]
210
RT: 2,09
AV: 1
220
m/z
230
240
250
260
NL: 7,30E2
263,19
100
E
90
80
255,31
Relative Abundance
70
60
50
40
199,16
30
201,27
253,26
264,17
20
241,27
181,22
10
187,28
173,31
195,17
219,31
215,28
202,25
227,30
231,24
256,36
239,23
243,12
265,26
267,26
0
170
180
190
amostra 8-monitoramento_121121125618 #1
T: ITMS - c ESI Full ms [100,00-1000,00]
200
RT: 0,00
210
AV: 1
220
m/z
230
240
250
260
270
NL: 1,75E2
269,11
100
F
90
179,07
80
Relative Abundance
70
60
215,05
50
255,36
40
30
217,19
20
239,16
180,13
181,13
10
177,33
191,16
199,22
225,23
209,89
233,13
241,23
242,20
253,31
256,16
267,27
261,20
0
170
180
190
200
210
220
m/z
230
240
250
260
270
55
Observando-se a faixa dos espectros de massas compreendida entre m/z 170 e m/z 270,
percebe-se a existência de íons semelhantes entre os extratos da antera da flor, extrato da flor
sem antera e dos diferentes extratos de mel. Os íons m/z 179, m/z 253, m/z 255 e m/z 269, por
exemplo, estão presentes em vários extratos, com diferentes intensidades. Estes compostos
estão relacionados ao ácido cafeico, que apresenta m/z 179, a crisina com m/z 253, a
pinocembrina com m/z 255 e a com apigenina m/z 269. Contudo, para confirmar esta
semelhança de massa carga comparou-se a fragmentação destes íons com a fragmentação de
seus respectivos padrões.
Portanto, os padrões de ácido cafeico, crisina, pinocembrina e apigenina foram
utilizados para comparação dos compostos referentes aos íons m/z 179, 253, 255 e 269
presentes nos extratos do mel, da antera da flor e da flor sem antera, respectivamente.
Assim, na figura 18 observa-se a comparação entre o padrão crisina (A) e sua
respectiva fragmentação (B), em comparação com a fragmentação do íon 253 do extrato
líquido-líquido de mel.
Figura 18 – Espectro de massas do padrão de crisina (A), fragmentação do íon 253 do padrão
(B) e fragmentação do íon 253 presente na amostra 6, referente ao extrato líquido-líquido de
mel (C).
chrysina #1 RT: 0,00 AV: 1 NL: 7,64E2
T: ITMS - c ESI Full ms [50,00-500,00]
253,07
100
A
90
80
Relative Abundance
70
60
50
40
30
20
10
0
135,14
57,85
50
100
150
179,19
201,01
200
241,00
289,05
283,30 297,30 326,78
250
300
m/z
350
386,93 404,15 447,15
400
450
482,53
500
56
chrysina #76 RT: 0,99 AV: 1 NL: 2,36
F: ITMS - c ESI Full ms2 253,00@cid22,00 [65,00-255,00]
209,08
100
90
B
253,27
80
Relative Abundance
70
60
50
40
30
20
10
0
80
100
120
140
160
m/z
180
200
220
240
amostra 6-monitoramento_121121125618 #230 RT: 3,48 AV: 1 NL: 8,09
F: ITMS - c ESI Full ms2 253,00@cid17,00 [65,00-254,00]
253,41
100
90
C
80
Relative Abundance
70
60
50
209,28
40
30
20
10
0
80
100
120
140
160
m/z
180
200
220
240
Fabre et al. (2001) determinaram a fragmentação de agliconas de flavonoides
utilizando-se da cromatografia liquida de alta eficiência e da espectrometria de massas. As
análises foram realizadas no modo negativo de ionização por terem apresentado resultados
mais eficientes. Assim, os autores apresentaram o íon molecular de 15 agliconas flavonoides
das classes de flavonas, flavonóis e flavanonas, apresentando uma proposta de fragmentação e
abundância relativa.
Com base na proposta de fragmentação da flavona luteolina sugerida por Febre et al.
(2001), foi possível elaborar uma proposta para a crisina, por também pertencer ao grupo das
flavonas (figura 19).
57
Figura 19 - Proposta de fragmentação do íon 253:
-H
-H
H
H
H
H
O
O
HO
CO2
CO
OH
H
-H
H
O
HO
H
CO2
OH
-H
H
O
HO
Flavona: crisina
C15H10O4
254.24
OH
De acordo com a proposta de fragmentação apresentada por Fabre et al., (2001), podese verificar que na rota de fragmentação com eliminação de CO2, pode-se formar o íon m/z
209, que pode ser detectado na fragmentação da crisina (padrão) e na amostra 6 (extrato
líquido-líquido de mel). Os demais fragmentos (m/z 181 e 165) também puderam ser
observados, contudo, por não se tratar de um composto isolado os espectros estavam bastante
contaminados com outros íons fragmentos.
Em relação a sua presença no extrato das anteras e do mel, pode-se supor que o pólen
da planta presente no mel pode ser extraído e assim estar presente nas duas amostras.
Analisando-se o espectro de massas do extrato por XAD-2 do mel, foi possível
verificar a presença do íon 179, característico do ácido cafeico. Assim, para a comparação do
espectro de massas analisado nas mesmas condições, foi possível certificar-se da presença
deste composto no mel amargo.
Abaixo, pode-se observar os espectros (MS) do padrão de ácido cafeico, do extrato de
mel (XAD-2), bem como os fragmentos (MS/MS) característicos para o ácido cafeico
apresentados no padrão e na amostra (figura 20).
58
Figura 20 - Espectro de massas do extrato de mel por XAD-2 (A); Espectro de massas do
padrão de ácido cafeico (B); Fragmentação (MS/MS) do padrão de ácido cafeico (C) e
Fragmentação do íon m/z 179 do extrato XAD-2 (D).
xad(1) #1 RT: 0,00 AV: 1 NL: 5,92E2
T: ITMS - c ESI Full ms [50,00-500,00]
263,18
100
361,21
A
90
328,18
80
Relative Abundance
70
199,20
60
311,30
50
301,29
40
155,39
339,23
30
465,28
179,14
149,23
377,10
385,28
225,33
135,21
89,29
10
493,35
235,28
20
447,04
119,24
62,33
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
m/z
Ac cafei. #1 RT: 0,00 AV: 1 NL: 1,77E3
T: ITMS - c ESI Full ms [70,00-500,00]
179,09
100
90
B
80
Relative Abundance
70
60
50
40
30
20
10
89,27
0
135,12
115,16
160,70
100
150
255,22
217,10
281,30
200
250
358,88
381,04
325,17
300
350
431,04
400
465,25
450
492,93
500
m/z
Ac cafei. #36 RT: 0,41 AV: 1 NL: 4,56E2
F: ITMS - c ESI Full ms2 179,00@cid20,00 [50,00-181,00]
135,12
100
C
90
80
Relative Abundance
70
60
50
40
30
20
10
179,09
0
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
m/z
xad #142 RT: 1,14 AV: 1 NL: 1,95E1
F: ITMS - c ESI Full ms2 179,00@cid20,00 [50,00-181,00]
135,20
100
90
D
80
Relative Abundance
70
60
50
40
30
20
10
179,16
0
50
60
70
80
90
100
110
120
m/z
130
140
150
160
170
180
59
Na figura 21 também é possível observar a presença do íon 179 nos extratos de mel
por C18 (amostra 5) e no extrato liofilizado (amostra 8).
Figura 21 – Espectro de massas do íon 179 presente nos extratos de mel por C18 (A) e no mel
liofilizado (B).
amostra 5-monitoramento #1 RT: 0,00 AV: 1
T: ITMS - c ESI Full ms [100,00-1000,00]
219,22
100
90
NL: 7,44E1
A
80
255,31
361,18
Relative Abundance
70
60
377,13
50
179,23
683,11
263,24
40
653,32
523,31
339,32
703,29
541,21
30
503,25
383,15
397,26
20
549,04
623,20
722,95
888,55
776,96
161,23
963,65
839,16
10
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
m/z
amostra 8-monitoramento_121121125618 #1
T: ITMS - c ESI Full ms [100,00-1000,00]
269,11
100
RT: 0,00
AV: 1
NL: 1,75E2
B
90
683,14
179,07
80
Relative Abundance
70
359,13
60
215,05
50
40
341,17
520,98
431,14
377,16
30
732,26
651,17
20
463,35
283,31
10
0
100
200
300
845,13
813,48
596,42
400
903,41
539,11
161,28
500
600
700
800
930,10
900
1000
m/z
Tendo em vista a realização das análises dos padrões de pinocembrina e apigenina em
condições analíticas diferentes das análises dos extratos, não foi possível avaliar os resultados
frente à comparação da fragmentação dos padrões com os fragmentos dos íons m/z 255 e m/z
269, presentes nos extratos. Apesar destes obstáculos, os íons m/z 255 e m/z 269 podem ser
caracterizados como marcadores da origem botânica do mel.
Nas análises por espectrometria de massas por ESI/MS e comparação com padrões
autênticos, foi possível verificar a presença dos constituintes crisina e ácido cafeico no mel
60
amargo. Contudo, com os dados disponíveis, não foi possível confirmar a origem botânica do
mel.
Esta técnica já foi utilizada para a caracterização da origem botânica da própolis. Em
análises da composição química da própolis, por ESI-MS/MS, Alexandra Sawaya (2006)
identificou mediante comparação com padrões e espectros presentes na literatura, dentre
vários compostos analisados por meio de inserção direta, os íons [M– H]- do ácido p-cumárico
(m/z 163), com os fragmentos m/z 163, 119 e 93, a crisina (m/z 253) com os fragmentos m/z
209, 143 e 119 e a pinocembrina (m/z 255) que apresentou como fragmentos os íons m/z 227,
213, 185, 171, 151, 145 e 107.
McNab et al. (2009) apresentaram resultados de análises por ESI-MS de diversos
flavonoides e citam, dentre outros flavonoides, a crisina, identificada pelo íon [M-H]- m/z 253
e seus respectivos fragmentos m/z 209, 185, 181, 211, 210, 225, 165 e 151. Em estudo
realizado com extratos da própolis por ESI(-)-MS para determinar, além de outros, sua
composição química, Buriol et al. (2009) sugeriram por meio da comparação com padrões, a
identidade de alguns íons observados, como a presença de canferida (m/z 299), do ácido pcumárico (m/z 163), do ácido cafeico (m/z 179) e do ácido 3-prenil-4-diidrocinamoloxicinâmico (m/z 363). Kassim (2010), analisando a atividade anti-inflamatória de méis com o
uso de espectrometria de massas e cromatografia liquida de alta eficiência, quantificou e
identificou vários compostos fenólicos, como o ácido elágico (m/z 303), o ferrulico (m/z 175)
e ainda, a crisina (m/z 253), quercetina (m/z 301) e camferide (m/z 298).
Bertoncelj et al. (2011) identificaram através da cromatografia líquida de alta
eficiência associada a espectrometria de massas, os íons [M– H]- dos flavonoides miricetina
(m/z 317), luteolina (m/z 285), quercetina (m/z 301), naringenina (m/z 271), apigenina (m/z
269), camferol (m/z 285), pinocembrina (m/z 255), crisina (m/z 253) e galangina (m/z 269) em
amostras de mel esloveno, com base em padrões de referência.
Tenore et al. (2012) apresentaram em artigo recente, o MS/MS do ácido gálico (m/z
169), composto pelos fragmentos m/z 125, 81 e 79, do ácido cafeico (m/z 179) com o íon m/z
125, o ácido p-cumárico (m/z 163) composto pelos íons m/z 119 e 93, a crisina (m/z 253) com
os fragmentos m/z 151, 177 e 77 e a pinocembrina (m/z 255), que apresentou os fragmentos
m/z 179, 151 e 77.
Dos flavonoides citados, pode-se observar uma semelhança na fragmentação do íon
m/z 253, obtendo-se os fragmentos m/z 225, 209, 181, 165 e 143 apresentada pelos autores e a
fragmentação obtida na análise dos extratos do mel e das flores, neste trabalho. Podendo-se
observar os íons m/z 225, 209 e 165 na fragmentação obtida com os extratos identificados por
61
amostras 2, 3, 4 e 6 referentes aos extratos etanólico da antera das flores, extrato etanólico das
flores, extrato metanólico por XAD-2 e o extrato líquido-liquido por diclorometano.
Buscando-se uma melhor caracterização da origem botânica do mel, foram realizadas
análises por cromatografia à gás acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), cujos
resultados das análises estão dispostas a seguir.
4.4 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA A GÁS ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE
MASSAS (CG-EM)
As análises por CG-EM foram realizadas com as frações do extrato de mel (XAD-2),
com as frações do extrato das flores sem antera e com o extrato da antera das flores (rico em
pólen). E para a comparação entre a constituição dos extratos, principal objetivo deste estudo,
procedeu-se inicialmente a observação dos cromatogramas, seguido das análises dos tempos
de retenção (T.R.), índice de retenção (I.R) e similaridade dos espectros de massas entre os
extratos do mel, das flores e das anteras das flores.
Os espectros de massas dos extratos foram comparados com padrões, com os
espectros de massas da biblioteca computacional Wiley 275, com os espectros da literatura
(ADAMS, 2001), com artigos diversos e por meio do índice de retenção calculado com base
no padrão de n-alcanos (VAN DEN DOOL; KRATZ, 1963).
4.4.1 Comparação entre os extratos hexânicos das flores e do mel
Observando os cromatogramas do extrato das flores (EEF-hex) e do extrato de mel
(EM-hex) a seguir, pode-se perceber uma forte semelhança entre eles (figura 22). Contudo,
uma investigação dos constituintes com base na comparação dos tempos de retenção,
espectros de massas e índices de retenção são fundamentais para o fortalecimento das
análises.
62
Figura 22 – Cromatogramas de íons totais dos extratos das flores (EEF-hex) e do mel (EMhex).
EEF-hex
EM-hex
Nesse sentido, uma investigação detalhada dos espectros de massas permitiu verificar
a presença de uma série de compostos com índices e tempos de retenção semelhantes nos dois
extratos. Estes foram identificados com base nos espectros de massas da literatura Adams
(2001) e por meio da comparação com os tempos de retenção do padrão de n-alcanos (C7 a
C30).
Vários picos apresentaram espectros de massas com o mesmo perfil. O espectro de
massas da figura 23 apresenta este perfil correspondente a hidrocarbonetos saturados, que são
caracterizados por apresentarem fragmentos com diferença de 14 unidades de massa (CH2). O
maior pico do aglomerado relacionado ao fragmento CnH2n+1, seguido dos fragmentos CnH2n e
CnH2n-1 (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007).
Figura 23 - Espectro de massas do hexadecano e fragmentos majoritários.
%
100
C3H7
57
+
50
0
C4H9+
71
43
85
C6H13+
84 99 113 127 141 155 169 183 197
54
50.0
C5H11
75.0
100.0
125.0
150.0
175.0
200.0
226
225.0
63
O hexadecano apresenta massa molecular de 226 Da e um padrão de fragmentação
com 14 unidades de massa entre cada íon. Assim, os íons majoritários C6H13+ (m/z 85), C5H11+
(m/z 71), C4H9+ (m/z 57) e C3H7+ (m/z 43) representam os carbocátions mais estáveis e
caracterizam o padrão de fragmentação previsível para hidrocarbonetos alifáticos saturados.
Dessa forma, com base na análise do padrão de hidrocarbonetos, foi possível comparar
os tempos de retenção do padrão de n-alcanos, com o tempo de retenção dos hidrocarbonetos
presentes nos extratos analisados nas mesmas condições cromatográficas e a comparação dos
espectros de massas permitiu a identificação de uma série de n-alcanos.
Reportando-se à rota biosintética, os hidrocarbonetos são elaborados a partir de ácidos
graxos. Ácidos saturados como o palmítico e insaturados como o oleico são oriundos da rota
biosintética do acetato e apresentam um número par de carbonos. A partir da descarboxilação
dos ácidos graxos saturados, são constituídos os hidrocarbonetos saturados e dos ácidos
insaturados são produzidos os hidrocarbonetos insaturados (SAMUELS; KUNST, 2003,
FLACH, 2005).
Outros compostos apresentaram padrão de fragmentação no espectro de massas
consistente com hidrocarbonetos insaturados, observando-se uma diferenciação com duas
unidades de massas a menos que o n-alcano (figura 24).
Figura 24 - Espectro de massas do hexadeceno e fragmentos majoritários.
%
100
50
0
C3H5+
41 55
57 69 83
97
85 111 125 140 154
C4H7+
50.0
75.0
C5H9+
100.0
125.0
150.0
196
175.0
200.0
224
225.0
A sequência de fragmentação com picos afastados por 14 unidades de massa, forma
um aglomerado onde o maior pico corresponde ao CnH2n-1 característicos de alcenos, sendo os
carbocátions majoritários formados por C5H9+ (m/z 69), o C4H7+ (m/z 55) e o C3H5+ (m/z 41).
64
A presença do íon m/z 41, característico de um cátion alila (SILVERSTEIN; WEBSTER;
KIEMLE, 2007) é indicativo da presença da dupla na posição terminal. No entanto, não é
possível caracterizar a posição da dupla com uma simples análise dos espectros, sendo
necessário para tal a realização de uma derivatização.
Na tabela 7 podemos verificar a composição do mel amargo e das flores como uma
forma de identificar a origem botânica do mel analisado. Observa-se que uma série de alcanos
que estão presentes no mel e no extrato das flores constituem evidências da origem botânica
do mel.
Tabela 7 – Constituintes identificados nos extratos das flores e do mel amargo.
TR*
Mel
Flor
IRC*
Mel
Flor
IRL*
%
Mel
Flor
Composto
1.
14,648 14,611 1201
1200
1200
1,31
1,71
dodecanoa, b
2.
4.
18,868 18,833 1301
22,724 22,695 1393
23,055 23,018 1401
1301
1393
1400
1300
____
1400
2,56
1,01
5,89
2,47
1,06
6,7
tridecanoa, b
tetradeceno
tetradecanoa, b
5.
-------
23,814 -----
1420
1419
-----
2,87
trans-β-cariofileno
6.
-------
26,318 -----
1481
1485
-----
1,8
germacreno D
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
27,104
30,691
30,978
33,354
36,502
37,181
37,954
38,193
27,067
30,656
30,942
33,324
36,468
37,146
37,919
38,159
1500
1593
1600
1664
1752
1772
1795
1802
1499
1592
1599
1663
1751
1771
1794
1801
1500
1590
1600
___
___
___
1790
1800
1,25
2,46
7,62
3,35
1,02
1,01
1,75
3,94
0,93
1,98
11,2
2,44
1,3
1,02
1,43
7,27
15.
42,436 -------
1929
1927
1922
0,64
-----
16.
17.
18.
43,202 43,172 1953
44,755 44,721 2002
50,755 50,723 2201
1953
2001
2200
___
2000
2200
0,54
1,31
1,49
0,72
2,91
0,74
pentadecano a, b
hexadecenoa, b *
hexadecanoa, b
NI
NI
NI
octadecenoa, b*
octadecanoa, b
hexadecanoato
metilaa
NI
eicosanoa, b
docosanoa, b
19.
20.
21.
56,275 ------ 2400
60,623 60,643 2570
63,799 63,765 2700
----2571
2699
2400
___
2700
0,46
1,93
2,06
----1,98
1,04
tetracosanoa
NI
heptacosanoa, b
22.
23.
66,132 66,096 2800
66,802 66,766 2829
2799
2828
2800
___
2,11
6,46
1,33
4,86
octacosanoa, b
NI
3.
de
65
Continua
24.
67,308 67,281 2852
2851
___
0,30
1,04
óleo de siliconed
25.
68,387 68,351 2899
2898
2900
3,68
6,76
nonacosanob
26.
70,564 70,525 3000
2998
3000
2,35
2,15
triacontanoc
27.
72,675 72,642 3097
3095
3100
2,91
8,07
hentriaontanoc
28.
74,717 74,683 3190
3189
3200
1,23
1,09
dotriacontanoc
29.
76,700 76,492 3282
3272 3300
TR* = tempo de retenção.
IR c * = índice de retenção calculado
IRl * = índice de retenção da literatura.
a = identificação por IR e ADAMS.
b = identificação por padrão de hidrocarbonetos.
c = identificação com base no índice de Kováts.
d = contaminação
----- não detectado
NI = não identificado
___ = não disponível
Fonte: autor
1,23
4,75
tritriacontanoc
Na análise dos compostos, também foi verificada uma série de n-alcenos apresentando
tempos de retenção semelhantes, presentes nos extratos do mel e nas flores. Contudo, para
determinação da posição da instauração e certificação de que se tratam dos mesmos
compostos foi realizada a determinação da posição das duplas ligações com base na
derivatização com dimetildissulfeto e as análises estão dispostas a seguir.
4.4.2 Determinação da posição das duplas em alceno por derivatização com
dimetildissulfeto (DMDS)
Para a determinação da posição da dupla ligação, existem diversos métodos descritos
na literatura: transformação em diol, mercuração, ozonólise, divisão oxidativa, metiltiolação,
epoxidação e adição de tetracianoetileno. Dentre os diversos métodos, a metiltiolação é uma
das reações aplicadas na determinação de duplas, pois cada composto com duplas ligações
dará origem a apenas um único produto e com bom rendimento o que possibilita reação com
misturas e pequenas quantidades de amostra. O produto possui ainda uma fragmentação bem
característica em espectrometria de massas (ATTYGALLE, 1998, FLACH, 2005, PIANARO,
2007)
66
A reação de derivatização com dimetilssulfeto (DMDS) em iodo ocorre com a inserção
de grupos -SCH3 nos carbonos da dupla ligação, onde o iodo atua como um agente catalisador.
Os produtos formados quando analisados por EM por impacto eletrônico apresentam um
perfil de fragmentação bastante característico, pois os íons resultantes da clivagem na ligação
entre os carbonos onde os grupos -SCH3 foram inseridos, formam dois fragmentos de alta
intensidade, cujo somatório corresponde ao íon molecular [M]+ permitindo determinar a
posição da dupla ligação.
O procedimento para determinação da posição da dupla ligação em alcenos lineares foi
descrito em 1981 por Francis e Veland. No mesmo ano Francis analisou ésteres e determinou
a posição da instauração com base na derivatização com dimetildissulfeto (DMDS) e
acrescentou que a técnica é simples e pode ser aplicada a compostos de baixa polaridade.
Portanto, com base na observação do espectro os autores citaram a fragmentação
característica da porção referente ao hidrocarboneto, acrescida do íon m/z 61, o que identifica
a estrutura CH3S- e a presença de um íon de grande intensidade correspondente ao composto
derivatizado e clivado na posição da dupla ligação.
A derivatização com dimetildissulfeto tem sido bastante utilizada pelo grupo de
pesquisa da Doutora Anita Jocelyne Marsaioli, da Universidade Estadual de Campinas – São
Paulo. Nesse sentido, pode-se citar: Flach (2005), Pianaro (2007) e Pomini (2009). Assim,
apesar de existirem diversas metodologias para reação de derivatização, a reação de
dimetildissulfeto em iodo apresenta-se satisfatória para determinar a posição da dupla ligação.
(BUSER, 1983, FLACH, 2005).
Dessa forma, utilizou-se da reação de derivatização com dimetildissulfeto (DMDS) e
iodo, para determinação da posição da dupla dos alcenos.
Para o hexadeceno obteve-se dois derivados com íon molecular m/z 318 apresentados
nas figuras 25 e 26. Na figura 25 pode-se observar o espectro de massas do hexadeceno com
dupla ligação na posição 2.
Figura 25 - Espectro de massas do hexadeceno derivatizado apresentando íons estáveis m/z
243 e 75. %
100
43
57 69
75
83 97
243
111
125
0
50.0
75.0
141
165 179 191 207 227
257 271 285
318
100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0
67
O espectro de massas do composto de m/z 318 eluído em 54,397 minutos, com
fragmentos principais de m/z 243 e m/z 75, em menor proporção, apresentou uma
fragmentação característica de alcenos com dupla ligação localizada na posição 2, e
caracteriza o hexadec-2-eno, como pode ser observado no mecanismo de fragmentação
representado na figura 26 .
Figura 26 – Mecanismo de fragmentação do hexadeceno, apresentando instauração na posição
2.
C16H32
224.43
C18H38S2
318.61
H3CSSCH3
SCH3
I2
SCH3
C15H31S
243.47
CH3S
70 eV
SCH3
C3H7S
75.14
Outro espectro de massas de massa molecular 318 foi detectado e pode-se verificar
uma fragmentação com íons majoritários m/z 257 e 61, como pode ser observado no espectro
de massas apresentado na figura 27.
Figura 27 - Espectro de massas de hexadeceno derivatizado apresentando íons estáveis m/z
257 e 61.
%
100
43
57 69
83 97
243
111
125
0
50.0
75.0
141
165 179 191 207 227
257 271 285
318
100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0
68
O espectro de massas de íon molecular m/z 318 eluído com um tempo de retenção
55,82 minutos caracteriza o composto C16H32, com dupla ligação na posição 1, como
observado no mecanismo de fragmentação apresentado na figura 28.
Figura 28 – Mecanismo de fragmentação do hexadeceno apresentando instauração na posição
1.
C16H32
224.43
C18H38S2
318.61
H3CSSCH3
SCH3
I2
SCH3
C16H33S
257.49
SCH3
70 eV
SCH3
C2H5S
61.12
O mesmo procedimento também foi realizado para os demais compostos insaturados e
os respectivos mecanismos estão dispostos nos anexos. Diante das análises dos espectros de
massas dos extratos derivatizados com DMDS, foi possível identificar os alcenos
representados na tabela 8.
Com base na identificação da posição da dupla, observou-se que os alcenos hexadec1-eno, octadec-1-eno, eicos-1-eno e tetracos-1-eno apresentaram um mesmo padrão de
fragmentação e estão presentes tanto no extrato do mel, quanto no extrato das flores
analisadas. É importante acrescentar que todos os alcenos identificados no mel apresentaram
insaturação na posição 1. Já nas flores observou-se a presença de dupla ligação nas posições 1
e 2.
Outra peculiaridade observada nos extratos das flores foi a presença de dois compostos
com a insaturação nas posições 1 e 2. Este fator não foi verificado na análise do mel, onde os
alcenos com dupla na posição 2 podem ter sido transformados em outros compostos por ação
enzimática.
69
Tabela 8 – Posição da dupla de alcenos derivatizados dos extratos de mel e flor, frente à
fração hexânica.
Fórmula
molecular
Massa
molecular do
alceno
C15H40
210
Íons
característicos
Extrato
(m/z)
243 e 61
Flor
Composto
Pentadec-1-eno
224
257 e 61
Flor e mel
Hexadec-1-eno
224
243 e 75
Flor
Hexadec-2-eno
238
271 e 61
Mel
Heptadec-1-eno
252
285 e 61
Flor e mel
Octadec-1-eno
252
271 e 75
Flor
Octadec-2-eno
C20H40
280
313 e 61
Flor e mel
Eicos-1-eno
C22H44
308
341 e 61
Mel
Docos-1-eno
C24H48
336
369 e 61
Flor e mel
Tetracos-1-eno
C16H32
C17H34
C18H36
De acordo com os dados apresentados, foi possível verificar que o mel amargo
proveniente do município do Cantá apresenta uma composição bastante semelhante à
composição das flores analisadas, esta forte semelhança química juntamente com a análise
melissopalinológica indica que este mel é proveniente de Vochysia sp.
Ante as disposições acima apresentadas é importante acrescentar, que esta pesquisa foi
pioneira na identificação e comparação dos constituintes das flores de Vochyia sp. e dos
constituintes presentes no mel amargo, elaborado eventualmente pelas abelhas Apis do
município do Cantá.
Na caracterização de mel de eucalipto, por exemplo, se atribui ao mesmo a presença
do hotrienol, apesar deste constituinte estar presente nos voláteis da maioria dos méis, tendo
sido identificado inclusive em mel silvestre de Roraima (PONTIS, 2011). Em relação a méis
amargos, a literatura relata a presença de alcaloides em méis de senécio cujos constituintes
característicos da planta foram identificados por CLAE/EM (CREWS, 1997).
Em 1998, Silva e Rebouças apresentaram no Boletim do Museu Integrado de Roraima
uma análise palinológica de 56 amostras de mel e compararam com o néctar e/ou pólen de 31
plantas do estado de Roraima. Nas análises, os pesquisadores verificaram a presença de pólen
de Protium sp. e Vochysia guianensis, em méis de sabor amargo, sugerindo a provável origem
deste tipo de mel em Roraima.
70
Em 2003 Marque-Souza e Kerr determinaram, por análise melissoplalinológica a
origem botânica do mel amargo do município do Mucajaí como sendo originário da planta
conhecida vernaculamente com “breu” do gênero Protium sp. Entretanto, em 2005, Silva
determinou utilizando-se da mesma técnica, a origem botânica do mel amargo do município
do Cantá como proveniente de Vochysia guianensis.
Vochysiaceae foi citada como origem botânica de mel proveniente de Cáceres-MT, no
entanto, o trabalho foi resultante apenas de levantamento por questionários aplicados a
apicultores
não
havendo
qualquer
referência
de
mel
ou
qualquer
outro
dado
melissopalinológico ou químico (Silva, 2005).
Desta forma este trabalho possui o maior número de evidências da origem do mel
amargo do município do Cantá e constitui o primeiro trabalho brasileiro onde se somam os
dados químicos e palinológicos para determinar a origem floral de mel.
Para descartar a possibilidades de os constituintes do pólen terem contaminado o mel,
realizou-se uma comparação entre os extratos da antera das flores (rico em pólen) e das flores
sem antera.
4.4.3 Extrato etanólico das flores
Na análise comparativa dos cromatogramas dos extratos da antera (EEAF) e das flores
(EEF) sem antera, pode-se perceber uma diferença significativa no tempo de retenção dos
constituintes (figura 29).
Figura 29 – Cromatogramas de íons totais das anteras das flores (EEAF) e das flores sem
antera (EEF).
EEA
EEF
71
Na antera, os picos de maior intensidade apresentaram tempos de retenção entre 40 e
80 minutos, sendo o majoritário eluído em aproximadamente 70 minutos.
Nas flores sem antera, o tempo de retenção da maioria dos constituintes apresenta-se
entre 20 e 45 minutos, apesar da existência de três sinais representativos na região entre 65 e
80 minutos. Contudo, conferindo-se os tempos de retenção entre os cromatogramas, verificouse, que esses sinais apresentam tempos de retenção distintos.
Em 1997 Oliveira, Prates e Peralba quantificaram e identificaram os n-alcanos
presentes nas ceras de plantas forrageiras. Sendo identificados alcanos de C20 a C37. Destes,
o C29, o C31 e o C33 apresentaram as maiores concentrações com predominância dos
compostos de número ímpar de carbonos em relação aos de números pares.
Vogel e Hadacek (2004) analisaram a composição química de diferentes partes das
flores de Nelumbo nucifera e a classificaram em três grandes grupos de compostos: os
hidrocarbonetos alifáticos, os compostos aromáticos e os terpenoides. Sendo os constituintes
voláteis das pétalas das flores compostos por uma série de n-alcanos (C15-C17), diversos
alcenos, alcadienos e alcatrienos em grande proporção e, nas anteras identificaram 1,4dimetoxibenzeno (94%) e compostos terpênicos (5,4%).
Stafanello et al. (2006) analisaram os compostos voláteis presentes em diversas flores
e verificaram que, dentre os hidrocarbonetos de cadeia longa identificados, o tricosano, o
pentacosano e o heneicosano foram os mais frequentes. Os pesquisadores mencionaram que
os compostos voláteis emitidos pelas flores são um sinal químico para atrair polinizadores e
repelir predadores.
Witkowska-Banaszczak (2013), ao analisar os componentes do óleo essencial das
flores de Trollius europaeus, identificou o ácido hexadecanoico (7,54%), o ácido
tetradecanoico (4,24%), o ácido dodecanoico (3,10%) e os hidrocarbonetos eicosano
(20,03%) e hexadecano (8,63%), além de outros constituintes em menor proporção.
Nesse estudo, a análise da composição do extrato das flores sem antera revelou a
existência de vários hidrocarbonetos alifáticos, em especial n-alcanos (como observados na
tabela anterior).
Nas anteras foram identificados os compostos octadecen-1-ol e o ácido tetradecanoico,
além de diversos constituintes em menor proporção não identificados. Percebe-se, portanto
que, a composição do extrato das flores sem antera é distinto da composição das anteras das
flores.
72
4.4.4 Hidrocarbonetos relacionados às abelhas e aos produtos apícolas
Os hidrocarbonetos são bastante citados nas análises de diversos produtos apícolas e
nos extratos cuticulares das abelhas. As análises envolvem pesquisas voltadas à organização
social das abelhas, à divisão de tarefas, a feromônios associados à comunicação entre os seres
vivos e a relação com o ambiente na identificação de parceiros do grupo, entre vários outros
fatores.
É importante mencionar que os compostos voláteis do mel podem ser originados por
transferência de constituintes voláteis da planta; pela conversão de constituintes da planta pela
abelha; na produção de compostos pelas abelhas; pela produção de compostos durante o
processamento pós-colheita; e, também, pela ação de microrganismos (MOREIRA; MARIA,
2003).
Tan e colaboradores (1989) identificaram nos méis monoflorais da Nova Zelândia,
dentre outros compostos, os hidrocarbonetos (C1 a C33). Destes, os alcanos que apresentaram
maior concentração foram o C23, o C25, o C27 e o C29. Os autores acreditam que a presença
de hidrocarbonetos de alta massa molecular é devido à existência de cera não eliminada
totalmente, no processamento do mel.
Jimenéz et al. (2004) analisaram a qualidade de cera de abelha comercial com base no
padrão de hidrocarbonetos e de ésteres e relataram que a constituição de hidrocarbonetos
saturados e insaturados pode ser utilizada para diferenciar ceras de abelha pura, de cera
adulterada.
Flach (2005) analisou o comportamento de colônias de abelhas sem ferrão puras e
invadidas e observou que houve alteração na concentração de hidrocarbonetos, dentre outros
constituintes, de ceras produzidas por operárias de colônias invadidas, em relação às ceras
produzidas por operárias de colônias puras.
Em 2007, Pianaro et al. analisaram os constituintes presentes nos betumes das colônias
de abelhas M. scutellaris e M. rufiventris preservadas de invasores e os constituintes de M.
scutellaris invadida e concluíram que, apesar da constituição do betume das abelhas ser
formada por n-alcanos (C14 a C33) e n-9-alcenos (C23 a C33), entre outros compostos, houve
uma significativa mudança na concentração destes constituintes no betume das abelhas
invadidas.
No trabalho de Nunes et al. (2009), foram identificados o nonadecano, o eicosano, o
heptacosano e o nonacosano em extratos cuticulares de abelhas sem ferrão e, no sudeste
73
asiático Leonhardt Bluthgen e Schmitt (2010) identificaram o heptacosano e o nonacosano em
extratos cuticulares de meliponíneos,.
Em 2011, Alissandrakis et al. investigaram a combinação de compostos presentes nos
méis de eucalipto em méis de castanha, comparando com os constituintes presentes nos
extratos das flores, com o intuito de identificar possíveis marcadores botânicos. Dentre vários
constituintes, os pesquisadores observaram diversos hidrocarbonetos alifáticos saturados.
Nascimento e Nascimento (2012) identificaram uma série de n-alcanos, n-alcenos e nalcadienos ao analisarem a composição de hidrocarbonetos cuticulares em quatro colônias de
abelhas sem ferrão Melipona asilvai E verificaram que a combinação de hidrocarbonetos está
associada à identificação das abelhas da mesma espécie.
Como um dos objetivos do projeto foi caracterizar quimicamente o mel amargo, foi
realizada a quantificação de algumas classes de compostos, por meio de análises
espectrofotométricas e a bioprospecção da atividade antioxidante.
4.5 ANÁLISES ESPECTROFOTOMÉTRICAS DO MEL
As análises espectrofotométricas do mel foram realizadas em triplicata e abrangeram
os compostos fenólicos, flavonoides, carotenoides, análise da cor e a atividade antioxidante.
Para fins didáticos serão apresentados todos os procedimentos e cálculos efetuados.
4.5.1 Determinação do teor de compostos fenólicos
Os compostos fenólicos foram quantificados pelo método de Folin-Ciocalteu (FOLIN;
CIOCALTEU, 1927), reagente que na presença de compostos fenólicos, em meio alcalino,
oxida os fenolatos, reduzindo os ácidos de fosfomolibdato-fosfotungstato a óxidos de
tungstênio e molibdênio, formando um complexo cuja coloração é azul, com intensidade de
cor que varia de acordo com a quantidade de hidroxilas oxidáveis (ÂNGELO; JORGE, 2007,
SEREN; BESTER, 2012).
O método Folin-Ciocalteu tem sido bastante utilizado na quantificação de compostos
fenólicos (ALVAREZ-SUAREZ et al., 2010b, ALVES; KUBOTA, 2013, CHANG et al.,
2011, ESTEVINHO et al., 2012, GÓMEZ-CARAVACA et al., 2006, JASICKA-MISIAK et
al., 2012, KHALIL et al., 2011, MARGHITAS et al., 2009), apesar de, originalmente, ter sido
desenvolvido para análise da tirosina e do triptofano (FOLIN; CIOCALTEU, 1927).
74
4.5.1.1 Curva de calibração do ácido gálico
O ensaio da curva padrão, demonstrada por meio das soluções na figura 30 apresenta
as cinco concentrações de ácido gálico em ordem crescente.
Figura 30 – Ensaio da curva padrão, na ordem crescente de concentração de ácido gálico.
0,002
0,004
0,008
0,012
0,014
mg/mL
mg/mL
mg/mL
mg/mL
mg/mL
A partir destas soluções, foram obtidas as absorbâncias a 789 mn cujos resultados
obtidos estão expressos na tabela 9.
Tabela 9 – Concentração, média e desvio padrão (DP) do ácido gálico, lidos a λ = 798 nm.
Concentração
A
A
A
Média
Desvio Padrão
0,002
mg/mL
0,048
0,042
0,040
0,043
4,16x10-3
0,004
mg/mL
0,071
0,072
0,078
0,073
3,78x10-3
0,008
mg/mL
0,149
0,148
0,149
0,149
5,77x10-4
0,012
mg/mL
0,218
0,217
0,220
0,218
1,52x10-3
0,016
mg/mL
0,301
0,306
0,300
0,302
3,21x10-3
A partir das concentrações de ácido gálico e da média das absorbâncias, elaborou-se
no programa Origin a curva de calibração (figura 31), obtendo-se a equação da reta e o
coeficiente de correlação (R2).
75
Figura 31 – Curva de calibração do ácido gálico, equação da reta e coeficiente de correlação
(R2).
0,30
Curva de calibração - ácido gálico
[23/06/2013 11:09 "/Graph1" (2456466)]
Linear Regression for Data1_B:
Y=A+B*X
Absorbância a 798 nm
0,25
0,20
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
0,0018 0,00436
B
18,47561
0,44265
------------------------------------------------------------
0,15
0,10
R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99914
0,00507
5
<0.0001
0,05
0,00
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0,016
0,018
Concentração de ácido gálico em mg/mL
Em seguida, foi realizada a análise em triplicata, da reação com a amostra de mel
amargo e seu respectivo branco, segundo o método Folin-Ciocalteu (figura 32).
Figura 32 - Branco (à esquerda) e solução de reação da amostra de mel (triplicata em azul).
branco
triplicata de mel
Os resultados das absorbâncias, média e desvio padrão da amostra de mel amargo
estão expressos na tabela 10.
76
Tabela 10 – Absorbâncias da amostra de mel amargo, média e desvio padrão.
Mel amargo
(0,1 g/mL)
Leitura UV – VIS
A. (798 nm)
1ª
2ª
0,175
0,177
Média
3ª
0,178
Abs ± DP
0,176 ± 1,5x10-3
A partir da equação da reta (Y = 0,0018 + 18,47561.X), calculou-se, para cada
absorbância, a concentração de compostos fenólicos totais no mel amargo, expressos em mg
de ácido gálico/mL de solução (Cálculo 1).
Cálculo 1: Concentração de ácido gálico em mg/mL:
Para Abs = 0,175:
Y=
A +B . X
0,175 =
0,0018 + 18,47561 X
X=
0,00937mg/mL
De posse das concentrações determinou-se a massa de compostos fenólicos presentes
no volume final da solução de reação (Cálculo 2):
Cálculo 2: Massa de compostos fenólicos presente em 5 mL de solução:
C=
m/V
m=
0,00937 mg/mL x 5 mL
m=
0,04687 mg
Em seguida, determinou-se a quantidade de mel presente na alíquota pipetada (Cálculo 3):
Cálculo 3: Massa de mel presente na alíquota pipetada (0,5 ml):
C=
m/V
m=
0,1 g/mL x 0,5 mL
m=
0,05 g
O teor encontrado foi convertido em mg de ácido gálico/100 g de mel e expresso como
média e desvio padrão (Cálculo 4):
77
Cálculo 4: Concentração de compostos fenólicos presentes em 100 g de mel amargo:
Compostos fenólicos
Massa de mel
0,04687 mg
0,05 g
X=
100 g
X=
93,78 mg
Os cálculos acima apresentados foram realizados para cada absorbância e os
resultados, apresentados como média e desvio padrão do teor de compostos fenólicos totais,
expressos em equivalente de ácido gálico (mg/100 g de mel) na tabela 11.
Tabela 11 - Teor de fenólicos totais em equivalente de ácido gálico.
Mel amargo
(0,1 g/mL)
Teor de Fenóis Totais
Equivalentes de ácido gálico (mg/100g de mel)
Média ± DS
94,6400 ± 0,8240
Na amostra de mel amargo analisada, o teor de fenólicos totais foi de 94,64 mg por
100 g de mel. E a concentração de fenólicos nessa amostra apresentou um teor mais elevado
em relação aos resultados das análises de cinco amostras de méis do município do Cantá-RR
(PONTIS, 2011), onde os valores de fenólicos totais variaram entre 27,4 e 53,5 mg de ácido
gálico por 100 g de mel, embora não tenha sido citada a presença de mel amargo em suas
análises.
Oliveira et al. (2012) compararam o perfil de compostos fenólicos e flavonoides por
HPLC, em méis de A. melifera, Melipona fasciculata e M. flavolineata provenientes de
quatro municípios do nordeste paraense. O perfil mostrou que o ácido gálico encontra-se em
grande proporção nas diversas amostras analisadas, sendo, muitas vezes, o constituinte
fenólico majoritário.
Em 2009, Lianda analisou por meio do reagente Folin-Denis, quatro méis silvestres e
cinco méis de laranjeiras do Rio de Janeiro, obtendo teores de fenólicos entre 42,8 e 78,2
mg/100g de mel para méis silvestres e 35,7 a 53,2 mg/100g de mel para os méis de laranjeira,
respectivamente.
Alvarez-Soares et al. (2010b) estudaram diversas propriedades de méis cubanos
monoflorais, dentre elas o conteúdo de compostos fenólicos totais. De acordo com os
78
resultados, o mel de linho, classificado como âmbar, apresentou o maior teor de compostos
fenólicos (59,58 mg/ 100g de mel). Por outro lado, méis de mangrove preto, classificado
como branco e videira de natal, como mel extra-branco, apresentaram os menores teores de
compostos fenólicos, compondo valores de 23,36 e 21,3 mg em equivalente de ácido gálico
por 100 g de mel, respectivamente.
Chang et al. (2011) determinaram o teor de compostos fenólicos em 16 méis de várias
fontes florais e os resultados obtidos variaram de 100,8 mg a 60,5 mg de equivalente em ácido
gálico por 100 g de mel.
Khalil et al. (2011) investigaram o conteúdo de compostos fenólicos em méis da
Malásia, de diferentes origens florais, utilizando a mesma metodologia descrita nesse estudo,
obtendo concentrações de 1,52 mg para méis tropicais da ilha do Boréu, 1,85 mg para o mel
“B” e em três amostras de méis de Tualang (2,88 a 4,22 mg de ácido gálico por 100 g de mel).
Contudo, os teores obtidos ficaram abaixo de teor de fenólicos presentes no mel de Manuka,
utilizado como referência padrão (5,26 mg em equivalente de ácido gálico por 100 g de mel).
Khalil acrescenta que a variação do teor de fenólicos pode estar associada às diferentes
origens florais e às condições de armazenamento.
Jasicka-Misiak et al. (2012) analisaram 15 méis de urze e os resultados obtidos
variaram de 59,9 mg a 76,2 mg em equivalente de ácido gálico por 100g de mel. Sendo que
dentre as quinze amostras, oito apresentaram teores de compostos fenólicos acima de 70,0
mg/100g de mel.
Não foram encontrados dados, na literatura, que quantifiquem o teor de fenólicos em
méis amargos.
4.5.2 Determinação do teor de flavonoides
O teor de flavonoides foi verificado mediante as metodologias de complexação com
cloreto de alumínio para as flavonas e flavonóis (ALVES; KUBOTA, 2013, KHALIL et al.,
2011, TYLKOWSKI et al, 2010); por 2,4-dinitrofenil-hidrazina na quantificação das flavonas
e diidroflavonóis (MIGUEL et al., 2010, TYLKOWSKI et al., 2010); e para antocianinas o
teor foi verificado por meio da leitura de solução em três comprimentos de onda e cálculo do
teor através de fórmula.
79
4.5.2.1 Curva de calibração de quercetina
O ensaio da curva padrão, demonstrada por meio das soluções, na figura 33, apresenta
as cinco concentrações de quercetina em ordem crescente.
Figura 33 - Ensaio da curva padrão, na ordem crescente de concentração de quercetina.
0,0008
0,0012
0,0024
0,0028
0,0032
mg/mL
mg/mL
mg/mL
mg/mL
mg/mL
Os resultados das leituras de cada triplicata estão expressos na tabela 12 e indicam a
média e o desvio padrão (DP) das absorbâncias de cada concentração do padrão.
Tabela 12 - Concentração, média e desvio padrão (DP) do padrão de quercetina, lidos a λ =
437 nm.
Concentração
A
A
A
Média das A
Desvio padrão
0,0008
mg/ml
0,064
0,065
0,063
0,064
0,010
0,0012
mg/ml
0,109
0,109
0,104
0,107
0,003
0,0024
mg/ml
0,220
0,222
0,230
0,224
0,005
0,0028
mg/ml
0,274
0,271
0,274
0,273
0,002
0,0032
mg/ml
0,319
0,318
0,309
0,315
0,005
A partir da média e desvio padrão, foi elaborada a curva padrão, obtendo-se por
intermédio desta a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2) apresentados na figura
34.
80
Figura 34 – Curva de calibração da quercetina, equação da reta e coeficiente de correlação
(R2).
0,35
Curva de calibração - quercetina
[23/06/2013 11:02 "/Graph1" (2456466)]
Linear Regression for Data1_B:
Y=A+B*X
Absorbância a 437 nm
0,30
0,25
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
-0,01924
0,00423
B
103,76866
1,85569
------------------------------------------------------------
0,20
0,15
R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99952
0,00384
5
<0.0001
------------------------------------------------------------
0,10
0,05
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
0,0025
0,0030
0,0035
Concentração de quercetina em mg/mL
Na sequencia, foram elaboradas a triplicata e o branco da amostra (figura 35) para a
determinação de flavonas e flavonóis.
Figura 35 – Branco (à esquerda) e solução de reação da amostra de mel (triplicata à direita).
Branco
triplicata de mel
Os resultados das absorbâncias, média e desvio padrão da amostra de mel amargo
estão expressos na tabela 13.
81
Tabela 13 – Absorbâncias do mel e média ± desvio padrão.
Mel amargo
(0,2 g/mL)
Leitura UV – VIS
Abs. (437 nm)
1ª
2ª
3ª
0,178
0,179
0,180
Média
Abs ± DP
0,179 ± 0,001
Com o apoio da equação da reta (Y = - 0,01924 + 103,76866.X), foram efetuados os
cálculos de concentração de flavonas e flavonóis (para cada absorbância aferida), expressos
em miligrama de quercetina por mililitro de solução. O procedimento matemático do ensaio
está descrito abaixo:
Cálculo 5: Concentração de quercetina em mg/mL:
Para Abs = 0,178:
Y=
A + B.X
0,178 =
- 0,01924 + 103,76866X
X=
0,0019 mg/mL
Nesse ensaio, a concentração de quercetina foi de 0,0019 mg/mL. Logo, conhecendose a concentração quercetina por mililitro de solução, determinou-se o teor de quercetina
presente no ensaio (5 mL), de acordo com o cálculo a seguir:
Cálculo 6: Massa de quercetina presente em 5 mL de solução:
C=
m/V
m=
0,019 mg/mL 5mL
m=
0,0095 mg de quercetina
Em seguida, estimou-se a quantidade de mel de concentração 0,2 g/mL presente na
alíquota pipetada (2 mL), mediante o cálculo de concentração descrito abaixo:
Cálculo 7: Massa de mel presente na alíquota pipetada (0,5 ml):
C=
m/V
m=
0,2 g/mL. 2 mL
m=
0,4 g de mel
82
Por último, foi determinado o teor de quercetina em 100 mg de mel amargo (Cálculo 8):
Cálculo 8: Concentração de quercetina presente em 100 g de mel amargo:
Quercetina
Massa de mel
0,0095 mg
0,4 g
X=
100 g
X=
2,375 mg
Após realização dos cálculos de 5 a 8, determinou-se o teor de flavonas e flavonóis.
Os resultados estão representados em média e desvio padrão expressos em equivalente de
quercetina (mg/100 g de mel), descritos na tabela 14, abaixo:
Tabela 14 - Teor de flavonas e flavonóis em equivalente de quercetina.
Mel amargo
(0,2 g/mL)
Teor de flavonas e flavonóis
Equivalente de quercetina (mg/100g de mel)
Média ± DP
2,3875 ± 0,0125
A análise de flavonas e flavonóis, pelo método descrito, mostrou a presença de 2,38
mg desses flavonoides em equivalente de quercetina por 100 g de mel. Valores semelhantes
foram encontrados por Pontis (2011) ao analisar dez amostras de mel do estado de Roraima,
das quais, cinco amostras foram oriundas do município do Cantá. Nestas análises, Pontis
obteve valores com teores de flavonas e flavonóis entre 0,30 e 4,86 mg em equivalente de
quercetina por 100 g de mel, porém não foi citada a ocorrência de mel amargo.
Duarte (2009) analisou diversos méis produzidos por abelhas A. mellifera e
determinou uma concentração de flavonas e flavonóis bem acima do determinado nesse
estudo. Os resultados obtidos oscilaram entre 11,69 e 49,50 mg em equivalentes de quercetina
por 100 g de mel.
Chang et al. (2011) com a mesma metodologia e utilizando a rutina como padrão
observou uma variação de flavonoides de 2,30 e 0,60 mg em equivalente de rutina por 100
mel de gramas de mel.
Alvarez-Soares et al. (2010b) obtiveram teores de flavonoides oscilando entre 2,52 e
1,09 mg em equivalente de catequina por 100 g de mel. Khalil et al., 2011, investigando méis
da Malásia verificaram uma variação na concentração do conteúdo de flavonoides de acordo
com a origem, obtendo valores entre 1,15 mg para mel tropical, proveniente da ilha de
83
Bornéu, e 2,53 mg para os méis de Tualang, ambos em equivalente de catequinas por 100 g
de mel. Tais teores ficaram abaixo do teor de fenólicos do mel de Manuka (3,45 mg), utilizado
como teor padrão no experimento.
Em 2012, Estevinho et al. avaliaram a qualidade dos méis orgânicos produzidos em
Portugal, por meio da sua composição química e microbiológica. Nos méis analisados, todos
os parâmetros verificados estão dentro do padrão determinado pela Legislação vigente. E
quanto ao teor de flavonoides, a concentração determinada está entre 49,4 e 56,3 mg em
equivalente de catequina por 100g de mel.
Nesse contexto pode-se perceber que o teor de flavonas e flavonóis quantificado nesse
estudo encontra-se dentro dos valores citados por diversos pesquisadores. Contudo, em suas
pesquisas não foi relatada a presença de mel amargo.
4.5.3 Flavononas e diidroflavonois
O teor de flavonas e diidroflavonóis foi determinado de acordo com Tylkowski et al.
(2010) e Miguel et al. (2010).
4.5.3.1 Curva de calibração de pinocembrina
O ensaio da curva padrão na ordem decrescente de concentração do teor de
pinocembrina, está exposto na figura 36.
Figura 36 - Ensaio da curva padrão na ordem decrescente de concentração, do teor de
pinocembrina.
0,004
0,003
0,002
0,0015
0,0005
mg/mL
mg/mL
mg/mL
mg/mL
mg/mL
84
As leituras dos pontos da curva de calibração de pinocembrina, expressos na tabela 15
indicam a média e o desvio padrão (SD) das absorbâncias.
Tabela 15 – Concentração, média e desvio padrão (DP) da pinocembrina, lidos a λ = 493 nm.
Concentração
Abs
Abs
Abs
Média das abs
DP
0,0005
mg/ml
0,063
0,069
0,068
0,066
0,003
0,0015
mg/ml
0,227
0,228
0,225
0,226
0,001
0,002
mg/ml
0,300
0,305
0,301
0,302
0,003
0,003
mg/ml
0,454
0,440
0,440
0,444
0,008
0,004
mg/ml
0,565
0,574
0,612
0,583
0,024
A partir das médias das absorbâncias e das concentrações dos pontos da curva de
calibração, foi elaborada a curva de calibração de pinocembrina e obtiveram-se, mediante a
curva, os dados da equação da reta e o coeficiente de correlação (R2), apresentados na figura
37.
Figura 37 – Curva de calibração da pinocembrina, equação da reta e coeficiente de correlação
(R2).
0,6
Curva de calibração - pinocembrina
[23/06/2013 10:47 "/Graph1" (2456466)]
Linear Regression for Data1_B:
Y=A+B*X
Absorbância a 493 nm
0,5
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
5,89041E-4
0,00722
B
147,09589
2,87671
------------------------------------------------------------
0,4
0,3
0,2
R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99943
0,00777
5
<0.0001
------------------------------------------------------------
0,1
0,0
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030 0,0035 0,0040 0,0045
Concentração de pinocembrina em mg/mL
Em seguida elaborou-se a triplicata de mel e seu respectivo branco (figura 38),
aferindo-se as respectivas absorbâncias.
85
Figura 38 – Branco (à esquerda) e triplicada da amostra de mel (à direita).
branco
triplicata de mel
As médias e o desvio padrão, bem como o teor de flavononas e diidroflavonois
expressos em equivalente de pinocembrina por 100 g de mel estão dispostos na tabela 16.
Tabela 16 – Absorbâncias do mel, média e desvio padrão.
Mel amargo
(0,2 g/mL)
1ª
0,242
Leitura UV – VIS
A. (437 nm)
2ª
0,246
Média
3ª
0,245
Abs ± DP
0,2440 ± 0,002
Para determinação da concentração das flavonas e diidroflavonois, primeiramente
calculou-se a concentração de pinocembrina por meio da equação da reta (Y= 0,00058+
147,09589 X), utilizando-se para valores de “Y” as absorbâncias do mel (0,242; 0,246; 0245).
O cálculo 9 exemplifica a determinação da concentração de pinocembrina no ensaio.
Cálculo 9 – Concentração de pinocembrina em mg/mL
Para Abs = 0,242:
Y=
0,242 =
X=
A + B.X
0,00058+ 147,09589X
0,00164 mg/mL
86
Da solução estoque de mel (0,2 g/mL) retirou-se uma alíquota de 0,2 mL e adicionouse 1,4 mL de KOH e 0,4 mL de DNP, produzindo uma solução de reação de 2 mL.
Sequencialmente determinou-se a massa de mel presente na alíquota pipetada (Cálculo 10).
Cálculo 10: Massa de mel presente na solução de reação.
C=
m/V
m=
0,2 g/mL x 0,2 mL
m=
0,04 g de mel
Da solução de reação retiraram-se três alíquotas (triplicata) de 0,5 mL, que foram
depositadas em balões volumétricos de 5 mL, tendo seus volumes completados com metanol,
compondo uma solução com massa de 0,01 g de mel (Cálculo 11).
Cálculo 11: Massa de mel presente na alíquota pipetada.
C=
m/V
m=
0,2 g/mL x 0,5 mL
m=
0,01 g de mel
Pode-se concluir que, se na alíquota de mel (0,5 g) existe 0,01 g de mel e 0,00828 mg
de pinocembrina, em 100 g de mel existe uma concentração de 82,8 mg de pinocembrina. A
equação matemática está apresentada no cálculo 12, abaixo.
Cálculo 12: Concentração de pinocembrina presente em 100 g de mel.
Pinocembrina
Massa de mel
0,00828 mg
0,01 g
X=
100 g
X=
82,8 mg
A tabela 17 apresenta o teor de flavonas e diidroflavonois em equivalente de
pinocembrina por 100 g de mel.
87
Tabela 17 - Teor de flavononas e diidroflavonóis em equivalente de pinocembrina.
Mel amargo
(0,1 g/mL)
Teor de flavononas e diidroflavonóis (mg/100 g de mel)
Média ± DS
82,7300 ±0,7000
No que diz respeito ao teor de flavonas e diidroflavonois, o ensaio obteve 82,73 mg
em equivalentes de pinocembrina por 100 g de mel. Na literatura poucos trabalhos citam
análises colorimétricas para a determinação de flavonas e diidroflavonois em méis. Destes,
pode-se citar Pontis (2011) ao apresentar a análise colorimétrica de dez méis do estado de
Roraima, onde consta, dentre outros, a composição de flavonas e diidroflavonois em
equivalente de pinocembrina, com teores variando entre 17,06 e 26,06 mg por 100g de mel.
Contudo, existem vários estudos relacionados a estes compostos na própolis. Por
exemplo, Valencia et al. (2012) analisaram o efeito sazonal na composição química e
biológica da própolis, incluindo o teor de flavonas e flavonóis, utilizando o reagente cloreto
de alumínio e o teor de flavononas e diidroflavonois, por meio do reagente DNP. A pesquisa
revelou nas quatro amostras analisadas, dentre outros compostos, a presença de pinocembrina
e pinobancsina. Ficou evidente ainda, que o teor de flavonoides e fenólicos é bem maior no
outono e no verão, do que no inverno.
No mel, o estudo das flavonas e diidroflavonois está baseado na utilização da
cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE), tanto para quantificá-los como para
identificá-los. Martos et al. (2000) nas análises com méis de eucalipto oriundos da Itália,
Portugal e Espanha, quantificou por meio da CLAE, dentre outros compostos, os flavonoides
pinobancsina (3,5,7 – triidroflavonona) e pinocembrina (5,7-diidroflavonona), acrescentando
que o teor de flavonoides nos méis é bastante variado, devido à possível contaminação de
própolis na colmeia.
Muitos pesquisadores quantificaram diversos compostos presentes no mel utilizandose desse recurso. Dentre eles, pode-se citar: Ferreres et al. (1996), Martos et al. (1997),
Gheldof; Wang; Engeseth, (2002), Yao et al. (2003, 2004), Gómes-Caravaca et al. (2006),
Pyrzynska; Biesaga (2009), Iurlina et al. (2009), Bertoncelj et al. (2011), Jésicka Misiack et
al. (2012) e Biesaga; Pyrzynska (2013).
Chang et al. (2002) realizou um estudo com própolis oriundas do Brasil, Inglaterra,
Itália e Nova Zelândia, no qual foram utilizados dois métodos colorimétricos com o uso do
reagente cloreto de alumínio na quantificação de flavonas e flavonóis e do reagente 2,4-
88
dinitrofenil-hidrazina, na quantificação dos flavononas e diidroflavonois. No ensaio, os
pesquisadores obtiveram a pinocembrina como flavonona mais abundante. Contudo, devido à
falta do reagente comercial “padrão”, os pesquisadores utilizaram a naringenina nas
quantificações das flavonas e diidroflavonois, e para as flavonas e flavonóis, utilizaram a
quercetina como padrão. Com base nos resultados (2,82 – 7,83 g em equivalente de quercetina
e 7,13 – 21,84 g em equivalente de naringenina), os pesquisadores sugeriram que sejam
utilizadas as duas metodologias para quantificação real do conteúdo de flavonoides totais,
fortalecendo o procedimento realizado nesta pesquisa.
4.5.4 Teor de antocianinas
O teor de antocianinas foi analisado em triplicata, com a concentração de 0,1 g/mL de
mel e determinado de acordo com o Cálculo 9.
Cálculo 9: Concentração de mel na alíquota pipetada:
C1.V1 = C2.V2
0,5g/mL. 1 mL =
C2 =
C2 x 5
0,1 g/mL
Após leitura a 515 nm, obtiveram-se as absorbâncias apresentadas na tabela 18.
Tabela 18 – Absorbâncias do mel, média e desvio padrão.
Mel amargo
(0,1 g/mL)
Leitura UV – VIS
A (515 nm)
1ª
2ª
3ª
0,110
0,111
0,110
Média
Abs ± DP
0,110 ± 0,006
De posse das absorbâncias, determinou-se o teor de antocianinas em 100g de mel por
meio do cálculo 10, abaixo:
Cálculo 10: Concentração de antocianinas presente em 100 g de mel.
89
Antocianinas (mg/100g) = [(abs).(fator de diluição)]
98,2
Antocianinas = [0,110. 1000]
98,2
Antocianinas = 1,12 mg/100 g de mel
Onde o fator de diluição foi determinado pela equação apresentada no cálculo 11, abaixo:
Cálculo 11: Fator de diluição do mel:
Fator = 100/concentração de mel
Fator = 100/0,1
Fator = 1000
Portanto, o teor de antocianinas no ensaio foi de 1,12 mg por 100 g de mel. Entretanto,
na literatura não foi possível localizar análises do teor de antocianinas para comparação de
resultados.
Por fim, o teor de flavonoides totais obtido pelo somatório do teor de flavonas e
flavonóis, flavononas e diidroflavonois, bem como o teor das antocianinas, está registrado por
meio da média e desvio padrão na tabela 19, a seguir.
Tabela 19 - Teor de flavonoides totais determinados em miligramas de flavonoides por 100 g
de mel e expressos em média e desvio padrão.
Teor de flavonoides totais
mg/100g de mel expressos em Média ± Desvio padrão
Flavonas e flavonóis
2,3875 ± 0,0125
Flavononas e diidroflavonois
82,7300 ± 0,7000
Antocianinas
1,1200 ± 0,0050
Flavonoides totais
86,2375 ± 0,7175
4.5.5 Teor de carotenoides
Quanto à quantificação de carotenoides, utilizou-se a metodologia empregada por
Alvarez-Suarez (2010b), mas não foi possível determiná-lo, provavelmente porque o teor de
carotenoides na amostra analisada estava abaixo do nível de detecção do equipamento
utilizado. Neste método os autores acima citados observaram o conteúdo de carotenoides de
90
5,57 mg, 4,89 mg e 1,17 mg, em equivalente de beta caroteno por kg de mel e verificou que
em méis de coloração extra-branco não foi possível determinar o conteúdo de beta caroteno,
concluindo que a cor do mel está diretamente relacionada ao teor de carotenoides.
4.5.6 Análise da cor
Atinente à cor do mel realizou-se análise colorimétrica de acordo com a metodologia
descrita por Lacerda et al (2010). Os resultados das leituras a 635 nm estão expressos na
tabela 20.
Tabela 20 – Absorbâncias do mel, média e desvio padrão.
Mel amargo
(1 g/mL)
1ª
0,163
Leitura UV – VIS
A (635 nm)
2ª
0,156
Média
3ª
0,161
Abs ± DP
0,160 ± 0,004
Após a análise determinou-se a cor do mel mediante utilização da equação apresentada
no cálculo 13, a seguir:
Cálculo 13: Determinação da cor do mel, em mm de Pfund.
Cor =
(371,39 x Abs635 nm) – 38,70
Cor =
(371, 39 x 0,160) – 38,70
Cor =
20,7224 mm
De acordo com a classificação dos méis apresentada na escala de Pfund (tabela
apresentada no referencial teórico, página 29), as absorbâncias entre 0,148 e 0,195
correspondem a valores entre 16,4 e 34 mm e apresentam coloração branca. Nesse contexto,
verificou-se que a cor do mel analisado é branca.
Duarte (2009) detectou para méis de A. mellifera cores oscilando entre 23,3 e 108 mm
de Pfund, equivalentes às cores branca e âmbar. ALVES et al. (2005) declara que méis com
coloração mais clara, no mercado mundial, apresentam preços mais elevados, uma vez que
estes são mais apreciados pelos consumidores.
91
4.5.7 Atividade Antioxidante
Para determinação da atividade antioxidante do mel amargo, inicialmente elaborou-se
a triplicata referente ao controle e a absorbância lida a 515 nm. Em seguida, foram elaborados
os pontos (em triplicata) do branco, da amostra e a partir das leituras verificou-se o percentual
antioxidante (tabela 21).
Tabela 21 – Concentração, absorbância, média e desvio padrão do ensaio da atividade
antioxidante.
Doseamento da amostra com DPPH
Concentração
6 mg/Ml
8 mg/mL
10 mg/mL
12 mg/mL
14 mg/mL
0,185
0,175
0,164
0,156
0,145
Absorbância
0,185
0,176
0,166
0,156
0,145
0,185
0,175
0,166
0,156
0,146
Média ± DP
0,185 ± 0,0
0,175 ± 0,0006
0,165 ± 0,001
0,156 ± 0,00
0,145 ± 0,0006
%AA
23,93%
28,63%
33,33%
38,03%
43,16%
Absorbâncias do branco
0,007
0,008
0,009
0,011
0,012
0,007
0,008
0,010
0,011
0,012
0,007
0,008
0,010
0,011
0,012
0,007 ± 0,0
0,008 ± 0,0
0,009 ± 0,0005
0,011 ± 0,0
0,012 ± 0,0
Absorbâncias do controle – DPPH
0,236
0,234
0,234
0,234 ± 0,001
Após determinar o percentual da atividade antioxidante, obteve-se por meio da
plotagem dos dados que relacionam o percentual antioxidante e a concentração de cada
diluição preparada, no programa Origin, a curva de calibração (figura 39) da atividade
antioxidante, o coeficiente de correlação (R2 = 99984) e a equação da reta (Y= 9,486A +
2,393B.X).
92
Figura 39 - Curva de calibração da atividade antioxidante.
Curva de calibração
45
[22/09/2012 16:37 "/Graph1" (2456192)]
Linear Regression for Data1_B:
Y=A+B*X
atividade antioxidante (%)
40
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
9,486 0,258
B
2,393 0,02483
------------------------------------------------------------
35
30
R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99984
0,15701
5
<0.0001
------------------------------------------------------------
25
20
6
8
10
12
14
Concentração da solução de mel (mg/mL)
Com apoio da equação da reta determinou-se a concentração que captura 50% dos
radicais livres do DPPH (IC 50), na qual, quanto menor o seu valor, maior o poder antioxidante
das substâncias presentes na amostra (Cálculo 14).
Cálculo 14: Determinação da concentração inibitória (IC50).
Y=
A + B.X
50 = 9,486 + 2,393 X
x = 16,94 mg/mL
Com base nos cálculos efetuados verificou-se que, a atividade antioxidante do mel
amargo apresentou uma concentração inibitória de 16,94 mg/mL. O resultado obtido ficou
abaixo dos valores obtidos por Pontis (2011), que analisou dez amostras de méis do estado de
Roraima e obteve resultados mais significativos, com IC50 de 3,17 a 8,79.
Contudo, no estado do Pará, Oliveira et al. (2012) compararam a atividade
antioxidante de méis de três diferentes espécies de abelhas e verificaram que, os méis de
coloração mais escura apresentaram tanto o teor de compostos fenólicos mais elevados, como
uma melhor atividade antioxidante, sendo que os méis de A. melífera apresentaram os
melhores resultados para a atividade antioxidante, com o IC50 entre 8,87 e 41, 76.
Valores semelhantes foram obtidos por Lianda (2009) onde a mesma analisando méis
do Rio de Janeiro obteve índices entre 10,81 e 19,74 mg/mL, para méis silvestres; e 29,85 a
52,64 mg/mL para méis de laranjeira.
93
Sant’Ana et al. (2012) analisaram 21 amostras de mel oriundas do Rio de Janeiro e de
Minas Gerais e determinaram a atividade antioxidante por três diferentes métodos. No que
concerne ao método do radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), obtiveram valores de
EC50 variando entre 10,19 e 404,64 mg/mL
Estevinho et al. (2008) analisaram méis de Portugal, comparando méis claros e escuros
por meio de ensaio com DPPH e verificaram que os méis de coloração clara apresentaram
68,17 mg/mL e os méis de coloração escura 24,27 mg/mL.
Em 2010, Lachman et al. analisaram méis de várias fontes florais e determinaram para
o método do DPPH, utilizando o ácido ascórbico como equivalente, a concentração variando
entre 44,19 e 9,87 mg/100g de mel.
Em 2012, Islan et al. analisaram oito amostras de mel de diferentes áreas de
Bangladesh e verificaram que, a atividade antioxidante pelo método de DPPH variou entre
33,6 e 97,5 % apresentando uma boa correlação entre os compostos fenólicos (0,869) e
flavonoides (0,786).
4.5.8 Interação entre os compostos analisados espectrofotometricamente
O conteúdo de compostos fenólicos e flavonoides, bem como a capacidade
antioxidante dos méis variam de acordo com a origem floral e condições ambientais nas quais
a planta está inserida (AL-MAMARY et al., 2002). Sendo que, a vegetação de climas
tropicais, com elevada exposição à luz solar, apresenta maior concentração de compostos
fenólicos (SPAYD et al., 2002).
Em 2010, Kalil, Sulaiman e Boukraa apresentaram uma revisão acerca das
propriedades antioxidantes do mel e concluíram que, a ação antioxidante dos méis ocorre
devido à presença de diversos compostos como o ácido caféico, crisina, galangina,
pinocembrina, pinobancsina, acacetina, quercetina e canferol, pois estes apresentam
predominância nos méis estudados. E ainda, que a combinação destes compostos apresentam
uma ação farmacológica promissora na prevenção de câncer, doenças cardiovasculares,
doenças infecciosas, prevenção do envelhecimento e conservação de alimentos.
É importante ressaltar, que os compostos fenólicos e flavonoides são considerados
marcadores com potencialidade para a determinação da origem botânica, contribuindo com a
cor e sabor, como também para diversos benefícios à saúde humana (CHANG et al., 2011,
JASICKA-MISIAK et al., 2012).
94
Ademais, méis de coloração branca geralmente apresentam teores de compostos
fenólicos e carotenoides abaixo da concentração destas substancias nos méis de coloração
escura, apesar da nossa pesquisa indicar teores de fenólicos elevados no mel analisado.
Diante dos resultados apresentados pode-se observar que nos méis existe uma grande
variação na ação antioxidante e no teor de compostos fenólicos e flavonoides. E que tal
diversidade pode estar atrelada à variedade de espécies vegetais.
Portanto, a análise de compostos secundários da amostra de mel amargo obtida no
município no Cantá-RR, apresentou uma concentração média de compostos secundários e
ação antioxidante em relação aos méis de diversas regiões do país.
95
5 CONCLUSÕES
Reportando-se aos objetivos propostos neste trabalho conclui-se que:
Esta pesquisa constitui o primeiro trabalho brasileiro de identificação da origem
botânica do mel amargo agregando dados melissopalinológicos e análises químicas.
A identificação melissopalinológica apresentou um teor de 91,2% de pólen de
Vochysia sp. sendo compatível com as análises químicas realizadas.
Logo, define-se o mel amargo, oriundo do município do Cantá (Vila do 20), como mel
de Vochysia sp.
As análises dos extratos das flores sem antera, das anteras das flores e dos diferentes
extratos do mel, por CG-EM foram bastante eficientes. Na fração hexânica do mel e das
flores, foi possível verificar a presença de diversos hidrocarbonetos, sendo identificados nalcanos de C12 a C33 e n-alcenos C16, C18, C20 e C24 caracterizando os marcadores
químicos de identificação botânica do mel amargo. Já no extrato das anteras (rico em pólen)
foi possível verificar uma diferença na composição, sendo identificados os compostos
octadecen-1-ol e o ácido tetradecanoico, fortalecendo a premissa de que os constituintes
presentes no mel são provenientes do néctar da flor e não do pólen.
Para a identificação da posição da dupla dos n-alcenos foi necessário a realização de
uma derivatização, sendo utilizada, para tanto a derivatização por DMDS. Assim, foi possível
detectar os compostos: pentadec-1-eno, hexadec-1-eno, hexadec-2-eno, heptadec-1-eno,
octadec-1-eno, octadec-2-eno, eico-1-eno, docos-1-eno, tetracos-2-eno. Destes, os compostos
que apresentaram posição “1”, estiveram presentes tanto no mel quanto nas flores, já os
compostos com posição “2”, da dupla ligação, apresentaram-se apenas nas flores.
Com a reação de DMDS foi possível verificar, também, a presença dos compostos
hexadecen-1-eno e hexadecen-2-eno e os compostos octadecen-1-eno e octacen-2-eno,
isômeros não detectados antes da reação. Comprovando-se a presença de n-alcenos com a
dupla ligação na posição 1, para os compostos presentes no mel e nas flores e n-alcenos com
dupla na posição 2, apenas nas flores.
Nas análises por espectrometria de massas com ionização por electrospray foi possível
verificar um perfil de similaridade entre os extratos etanólico das flores sem antera e os
extratos do mel por XAD-2, C18, liquido-líquido (diclorometano) e do mel liofilizado.
Utilizando-se de padrões autênticos foram identificados os compostos crisina (m/z
253) e ácido cafeico (m/z 179) nos extratos; e os compostos de m/z 255 e m/z 269 (não
96
identificados) podem ser considerados marcadores característicos da origem botânica deste
tipo de mel, pois estão presentes tanto nos extratos de mel quanto no extrato das flores.
Contudo, sugerem-se novas análises com o propósito de identificar o íon m/z 255 e o m/z 269
além de outros constituintes ainda não elucidados.
De acordo com as análises espectrofotométricas verificou-se que os compostos
fenólicos apresentaram-se em maior concentração, com teor de 94, 64mg/100g de mel em
equivalentes de ácido gálico.
Os flavonoides, quantificados com base no somatório de três metodologias
apresentaram teor de 86,23 mg/100g de mel, correspondentes à 2,38 mg/100g de mel em
equivalente de quercetina, para o teor de flavonas e flavonóis; 82,73mg/100g de mel em
equivalentes de pinocembrina no teor de flavononas e diidroflavonois e 1,12 mg/100g de mel
de antocianinas, mas não foi possível determinar o teor de carotenoides por meio da
metodologia utilizada.
Atinente à cor do mel amargo, com valores entre 16,4 e 34 mm de acordo com a escala
de Pfund, corresponde à coloração branca.
Em relação à atividade antioxidante, com base no método do DPPH, o mel apresentou
uma concentração inibitória (IC50) de 16,94 mg/mL, esta concentração está na média de
concentrações inibitórias de diferentes méis do país.
Por fim, sugere-se que sejam realizadas análises químicas e biológicas necessárias,
tanto da planta quanto do mel, com o fim de complementar os dados obtidos e enriquecer os
dados científicos, pouco explorados, da região Norte.
97
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108
APÊNDICES
Espectros de massas de alcenos derivatizados com DMDS.
a) C17H34 – heptadec-1-eno
%
100
50
57 69
83 97
43
271
111
0
50.0
75.0
100.0
125 141 163
125.0
150.0
175.0
191 205
200.0
233
225.0
262 285
250.0
275.0
332
300.0
325.0
SCH3
271
61
SCH3
b) C18H36 - octadec-1-eno
%
100
50
285
43 6169 83 97
0
50.0
75.0
100.0
125 139 153 169 187 207
125.0
150.0
175.0
200.0
225.0
250 269
300 325 346
250.0
300.0
275.0
325.0
350.0
SCH3
285
61
SCH3
c) C18H36-octadec-2-eno
%
57
100
43
71
97
271
119
139 155
0
50.0
75.0
183
207
299
237 255
327 346
100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0
271
SCH3
75
SCH3
109
d) C20H40 – heicos-1-eno
%
100
313
57
43 69 83 111
125 139 155
50
0
50
100
207
150
200
250
374
327
281
300
313
350
SCH3
61
SCH3
e) C22H44 - docos-1-eno
%
57
100
43
50
71
341
97
111
0
50
135 155 177 207
100
150
200
253 281
250
300
355
402
350
400
SCH3
61
341
SCH3
f) C24H48 - tetracos-1-eno
%
100
369
57
50
43
83 97
119
145
155
0
100
207
191 221
200
253
281
430
327 355
300
400
369
SCH3
61
SCH3