Determinação da concentração
e da pureza do DNA por
espectroscopia UV e gel de
agarose
GeneQuant
Determinação da concentração e da
pureza do DNA
Determinação da concentração
Nanodrop
104,5ng/l = 0,104g/ l
Determinação da concentração do DNA
extraído por espectroscopia
• As amostras de DNA obtidas no laboratório devem
ser avaliadas quanto à sua concentração e à sua
pureza por meio da densidade óptica (DO) em
espectrofotômetro.
• O DNA absorve luz no comprimento de onda de
260 nm e as proteínas, de 280 nm.
• Para leitura no espectrofotômetro as amostras de
DNA são preparadas (diluídas) com água ultrapura:
ex: 10 L de DNA em 490 l de água (diluição
1:50) ou 5 L de DNA em 495 l de água (diluição
1:100) ou de acordo com o volume necessário para
leitura no equipamento.
Determinação da concentração do DNA
extraído
• Para estimar a concentração de DNA, utilizase a seguinte relação: 1 DO 260nm = 50 g de
DNA de dupla fita*.
• A concentração de DNA na amostra pode ser
obtida pelo seguinte cálculo:
Concentração de DNA = leitura da DO260nm x
50 x fator de diluição (usado na leitura).
• *50 g/ml tem DO de 1 a 260 nm
• DNA fita simples: 37g
• RNA fita simples 40 g
Determinação da concentração do DNA
extraído através de gel de agarose
• O DNA pode ser quantificado e analisado quanto à sua
qualidade, por meio da análise em gel de agarose ( gel
de agarose entre 0,8% e 1% )
• Com as amostras de DNA, é aplicada também uma
amostra cuja concentração é conhecida.
• O DNA do bacteriófago Lambda (l) em concentrações
conhecidas de 20, 50, 100 e 200 ng/mL é geralmente
utilizado.
• Após a eletroforese, o gel é corado com brometo de
etídio, visualizado em luz ultravioleta.
• As amostras são comparadas aos padrões,
determinando-se dessa maneira as concentrações
aproximadas de DNA em cada amostra.
Extração de DNA observado em gel de
agarose 1%
Amostras de DNA extraídas de swab oral utilizando NaCl (colunas 1–11) ou
kit comercial (12–17) em gel de agarose 1%. Observar presença de maior concentração de
massa em torno de 12.000pb em ambos os métodos.
Gel de agarose 1% com 3 l de DNA genômico
M
1
2
3
M - Marcador
1, 2 e 3 - amostras
de DNA genômico
Estimativa do grau de pureza
• A relação entre a quantidade de DNA e de
proteína é usada como parâmetro para avaliação
da qualidade do DNA extraído  grau de pureza
=
• OD 260nm /OD280nm Razão = 1,7 – 2,0
• Amostras cujos valores são acima de 2,0  muito
RNA;
• Amostras cujos valores são abaixo de 1,8 
contaminação com proteína
• O DNA pode ser quantificado e analisado quanto
à sua qualidade, por meio da análise em gel de
agarose: entre 0,8% e 1% .