Prof. Valmir F. Juliano
QUI624
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
ESPECTROANALÍTICOS - II
Luminescência Molecular
• Três tipos de métodos ópticos relacionados entre
si são conhecidos coletivamente como métodos de
luminescência molecular: Fluorescência molecular;
fosforescência e quimiluminescência.
• A fluorescência e a fosforescência são
similares, no tocante ao processo de excitação,
que é feita por absorção de fótons. Por esse
motivo são frequentemente mencionados pelo
termo mais genérico fotoluminescência.
• A quimiluminescência está baseada no espectro
de emissão de uma espécie excitada que é
formada no decorrer de uma reação química.
Luminescência Molecular
• A medida da intensidade de fotoluminescência ou
quimiluminescência permite a determinação
quantitativa de uma variedade de espécies orgânicas
e inorgânicas importantes em concentrações muito
baixas (traços).
• Atualmente, o número de métodos fluorimétricos é
significativamente maior que o número de
aplicações de procedimento de fosforescência e
quimiluminescência.
• Um dos aspectos mais atraentes dos métodos de
luminescência é a sua sensibilidade intrínseca, com
limites de detecção frequentemente de uma a três
ordens de grandeza menores de a absorção (ppb).
Luminescência Molecular
• Outra vantagem dos métodos fotoluminescentes é
a sua extensa faixa de concentração linear, que, com
frequencia, é significativamente maior que as
encontradas em métodos de absorção.
• Devido à sua alta sensibilidade , os métodos de
luminescência quantitativos estão sujeitos a efeitos
de interferência sérios das matrizes das amostras.
Por essa razão, normalmente, as medições de
luminescência estão associadas com técnicas de
separação da cromatografia e da eletroforese.
• Geralmente os métodos de luminescência
apresentam uma aplicação menos ampla. Muito mais
espécies absorvem radiação UV/Vis do que emitem.
Luminescência Molecular
Teoria da fluorescência e fosforescência
• Ocorrem em sistemas químicos gasosos, líquidos e sólidos
simples, bem como em sistemas complexos.
• Fluorescência de ressonância: lemis = labs. Observada mais
para espécies atômicas que moleculares.
• Fluorescência com deslocamento Stokes: lemis > labs. O
físico Irlandês George Gabriel Stokes, verificou que o fóton
absorvido perdia energia por inúmeras vibrações microscópicas.
• A absorção de fótons ocorre instantaneamente (10-14 a 10-15 s).
• A emissão de fluorescência ocorre em um tempo
significativamente maior (10-9 a 10-7 s, quando e tem valores 103 a
105, e 10-6 a 10-5 s para e bem menores).
• A emissão de fosforescência, por sua vez, ocorre em
tempos muito maiores (10-4 a 10 s ou mais) em virtude da
transição de spin singlete-triplete diferente da transição
singlete-singlete da fluorescência.
Luminescência Molecular
Teoria da fluorescência e fosforescência
a)
b)
c)
Estado fundamental singlete
Estado excitado singlete
Estado excitado triplete
• O estado eletrônico molecular é chamado de singlete
quando os elétrons estão emparelhados e nenhuma separação
de níveis de energia é observada sob efeito de um campo
magnético. A molécula é diamagnética.
• No estado dublete, o que acontece com um radical livre, o
elétron pode ter duas orientações sob campo magnético,
conferindo energias diferentes ao sistema (paramagnetismo).
• O estado triplete pode ser alcançado se o elétron tornar-se
desemparelhado ao ser excitado para um nível de maior
energia. Neste caso também ocorre o paramagnetismo.
Luminescência Molecular
Teoria da fluorescência e fosforescência
• A molécula pode voltar ao seu estado fundamental por uma
combinação de várias etapas mecanísticas, denominados de
processos de desativação:
• Processos radiativos
• Fluorescência.
• Fosforescência.
Sempre ocorrem do menor nível energético vibracional
• Processo não-radiativos
• Relaxação vibracional (10-12 s)
• Colisões entre as moléculas excitadas e as moléculas do solvente
eliminam excesso de energia, atingindo o menor nível vibracional.
• Conversão interna
• Processos intermoleculares pelos quais a molécula passa para um
estado eletrônico de menor energia sem emissão de radiação.
• Conversão externa (extinção por colisão)
• A desativação de um estado eletrônico excitado envolve a
transferência de energia entre a molécula excitada e o solvente
ou outros solutos. Condições que reduzem o número de colisões
(baixa temperatura e alta viscosidade) aumentam a emissão.
Luminescência Molecular
Teoria da fluorescência e fosforescência
Processo não-radiativo
que ocorre quando há
superposição de níveis
de energia
Estados singlete
Processo
não-radiativo
que será
favorecido
se houver
superposição
dos níveis de
energia
Estado triplete
Luminescência Molecular
Efeito da conversão interna:
Quinina
Tanto a absorção em 250 nm
quanto em 350 nm resultam
na emissão em 450 nm.
Luminescência Molecular
Teoria da fluorescência e fosforescência
• A estrutura molecular, assim como o ambiente químico, influenciam a
ocorrência ou não da luminescência de uma molécula. Estes fatores
também determinam a intensidade de emissão, quando esta ocorre.
• Rendimento quântico ou eficiência quântica F:
• É simplesmente a razão do número de moléculas que luminescem pelo
número de moléculas excitadas. A fluoresceína possui uma eficiência
quântica próxima da unidade.
• Tipos de transição
• Dificilmente a fluorescência resulta de absorção de radiação com l
menor que 250 nm, porque tal radiação é suficientemente energética
para promover a desativação dos estados excitados por prédissociação ou dissociação. A emissão fica restrita a transições p*  p
(maior eficiência quântica) e p*  n.
• Estrutura
• Ainda que alguns compostos carbonílicos e alguns com estruturas de
duplas ligações altamente conjugadas fluoresçam, a fluorescência
mais intensa e mais útil é encontrada em compostos com grupos
aromáticos com transições p  p* de baixa energia.
Luminescência Molecular
Fluoresceína
Não apresentam
fluorescência
Apresentam
fluorescência
Luminescência Molecular
Luminescência Molecular
Empiricamente observou-se que a rigidez da estrutura
favorece a fluorescência
Apresenta fraca
fluorescência
Apresenta forte
fluorescência
F = 0,2
F = 1
Luminescência Molecular
Empiricamente observou-se que a rigidez da estrutura
favorece a fluorescência
A rigidez do complexo
formado explica porque o
complexo de zinco com a
8-hidroxiquinolina
apresenta uma
fluorescência muito maior
que a 8-hidroxiquinolina.
Luminescência Molecular
Efeito do solvente e temperatura
• A eficiência quântica diminui com o aumento da
temperatura por causa do aumento da frequência das
colisões ocasionando conversões externas.
• Um decréscimo na viscosidade causa igual efeito.
• A fluorescência é diminuída por solventes contendo
átomos pesados ou por solutos contendo tais átomos em
suas estruturas. Exemplo: CBr4 e CH3CH2I
• Efeitos de pH podem desfavorecer a fluorescência
Apresenta
fluorescência
Não apresenta
fluorescência
Luminescência Molecular
Efeito da concentração na intensidade de fluorescência
• A potência de emissão de fluorescência F é proporcional à
potência radiante do feixe de excitação que é absorvido.
F = K´(Po – P)
• Escrevendo a lei de Beer, P / Po = 10-ebc, onde e é
absortividade molar das moléculas fluorescentes
F = K´(Po - Po 10-ebc) = K´Po(1 - 10-ebc)
• O termo exponencial pode ser expandido e posteriormente
simplificado. Considerando A < 0,05, o resultado passa a ser
F = 2,303K´ebcPo.
• Como eb é constante e é possível manter Po também
constante, o resultado final passa a ser: F = Kc
Luminescência Molecular
Desvios da linearidade
• Quando a concentração da espécie emissora é grande o
suficiente para que a absorbância seja maior que 0,05, a
simplificação do termo exponencial se torna inválida e a
linearidade é perdida. (absorção primária)
• Dois outros fatores também causam desvios negativos da
linearidade:
• Auto-supressão
• Colisões entre moléculas excitadas provocam a transferência de
energia não-radiativa de um modo semelhante à transferência para
moléculas do solvente na conversão externa.
• Absorção secundária (inclui a auto-absorção)
• Ocorre quando lemissão coincide com algum labsorção. O resultado é
a reabsorção da radiação por quaisquer moléculas na solução.
Luminescência Molecular
Fatores que reduzem a intensidade de fluorescência
• Supressão dinâmica
• Também chamada de supressão colisional, necessita do
contato entre as espécies excitadas e o agente
supressor. O mecanismo não é muito bem compreendido.
• A concentração do agente supressor deve ser suficientemente
alta para que haja uma alta probabilidade de colisão entre as
espécies excitada e supressor durante o tempo de vida do estado
excitado.
• A presença de O2 dissolvido, que é paramagnético, geralmente
reduz a intensidade da fluorescência por promover o cruzamento
intersistema. Entretanto, também pode promover a supressão do
estado triplete, reduzindo também a fosforescência.
• A fluorescência do sulfato de quinino é suprimida por altas
concentrações de íons cloreto.
Luminescência Molecular
Fatores que reduzem a intensidade de fluorescência
• Supressão estática
• Neste caso, o supressor forma com o analito fluoróforo
um complexo chamado de complexo escuro.
M
supressor
+
L
Molécula
fluorescente
⇌
ML
Complexo nãofluorescente
• Supressão de longo alcance
• Neste tipo de supressão a transferência de energia
ocorre com colisões entre as moléculas. O acoplamento
dipolo-dipolo entre o fluoróforo excitado e o supressor é
responsável pela transferência.
Luminescência Molecular
Fatores que reduzem a intensidade de fluorescência
• Uma vez que a emissão de fluorescência F é diretamente
proporcional à eficiência quântica Ff, se a supressão
depender de um único supressor, após alguma manipulação
nas equações do sistema, obtém-se:
F0
onde F e F são os sinais de fluorescência na presença e
 1  Kq [Sup] ausência doo supressor e K a constante de supressão
q
F
200
14.0000
180
12.0000
160
10.0000
120
8.0000
Fo/F
140
F 100
80
60
y = 209.9462x + 1.0092
R² = 0.9999
6.0000
4.0000
40
2.0000
20
0
0.000
0.010
0.020
0.030
[Cl-]
0.040
0.050
0.060
0.0000
0.000
0.010
0.020
0.030
[Cl-]
0.040
0.050
Supressão da fluorescência do sulfato de quinino por Cl-.
0.060
Luminescência Molecular
Instrumentos para medir fluorescência e fosforescência
• Os componentes dos instrumentos para medir a
fotoluminescência são similares àqueles encontrados nos
fotômetros e espectrofotômetros UV/Vis.
• A fonte de radiação necessita ser mais intensa que
aquelas utilizadas na absorção molecular.
• A maioria dos equipamentos emprega a ótica de duplo
feixe para compensar flutuações na potência da fonte.
• A fluorescência emitida pela amostra se propaga em
todas as direções, mas o ângulo reto em relação ao
feixe incidente é mais conveniente para evitar perdas por
espalhamento na solução e, principalmente, nas paredes
da cubeta.
F = Kc
Luminescência Molecular
Luminescência Molecular
Para refletir e responder:
Seria possível realizar uma medida de fluorescência em um
espectrofotômetro convencional após alguma pequena
modificação?
Luminescência Molecular
Aplicações
• Os métodos de fluorescência e fosforescência são
intrinsecamente aplicáveis a faixas de concentrações mais
baixas que as medidas espectrofotométricas baseadas em
absorbâncias e estão entre as técnicas analíticas mais
sensíveis facilmente disponíveis.
• Essa sensibilidade elevada vem do fato que F aumenta se a
potência da fonte Po aumentar, ou então, pelo fato do sinal
poder ser amplificado posteriormente. A absorbância, por
estar relacionada com Po/P, não se altera com o aumento de
Po, pois o aumento deste causa um aumento proporcional em
P.
• Em contraste a alta sensibilidade, os métodos fotoluminescentes
são menos precisos e exatos que os métodos espectrofotométricos
por um fator de 2 a 5.
Luminescência Molecular
Aplicações
• Muitos íons de metais de transição são paramagnéticos, o
que favorece o cruzamento intersistema ao estado triplete,
desfavorecendo a fluorescência, embora a fosforescência
possa ser observada.
• Os complexos dos metais de transição possuem muitos
níveis de energia pouco espaçados, favorecendo a
desativação por conversão interna e não por fluorescência.
• Complexos de metais que não são de transição, geralmente
incolores e que formam complexos também incolores, são
menos suscetíveis a esses processos de desativação. Estes
não poderiam ser determinados por absorção molecular no
visível. Assim a fluorimetria é complementar à absorção
molecular.
Luminescência Molecular
Aplicações
• Reagentes fluorimétricos
Luminescência Molecular
Aplicações
Luminescência Molecular
Quimiluminescência
A aplicação da quimiluminescência à química analítica é
relativamente recente. O número de reações químicas que
produz quimiluminescência é pequeno, limitando assim o
método.
• A quimiluminescência é produzida quando uma reação
química fornece uma espécie excitada eletronicamente
que emite luz quando retorna ao estado fundamental.
• A bioluminescência é a quimiluminescência que ocorre
em sistemas biológicos. Os exemplos mais conhecido
são os vaga-lumes e as águas-vivas.
• A instrumentação para medidas de quimiluminescência
é notavelmente simples. É necessário um sistema
fechado com apenas um tubo fotomultiplicador.
Luminescência Molecular
Quimiluminescência
• A utilização do luminol para detecção de sangue em uma
cena de crime baseia-se a reação do luminol com H2O2 em
meio alcalino catalisada pelo ferro presente hemoglobina.
• Dentro de certos limites, a intensidade de quimiluminescência do luminol é diretamente proporcional à concentração
do oxidante, do catalisador ou do luminol.
• Os métodos de quimiluminescência em geral são altamente
sensíveis porque níveis baixos de luz podem ser detectados
na ausência de ruído. Não há atenuação da radiação em
monocromadores ou filtros. Com isso limites de detecção na
faixa de partes por bilhão (ppb) ou partes por trilhão (ppt)
podem ser alcançados.
Luminescência Molecular
Quimiluminescência
luminol
íon 3-aminoftalato
Luminescência Molecular
Vantagens (em comparação à absorção molecular)
• Muito mais sensível. Alcança facilmente limites de detecção
de ppb. A quimiluminescência pode fornecer limites de
detecção da ordem de ppt.
• Mais seletiva. O fato de absorver um determinado l e
emitir em outro, diminui em muito a probabilidade de existir
na mesma solução outra espécie que faça o mesmo.
• Serve para a determinação de metais que não são de
transição que, em geral, são incolores e tendem a formar
quelatos também incolores e que não poderiam ser
determinados por absorção molecular na região do visível.
Luminescência Molecular
Desvantagens (em comparação à absorção molecular)
• Limitada a um número muito menor de sistemas que
incorporam características estruturais e ambientais que
provocam uma desaceleração dos processos de relaxação ou
desativação não-radiativos. Apesar disso, existem mais de
200 substâncias que podem ser analisadas por esta técnica.
• Espécies orgânicas e bioquímicas – produtos
alimentícios, fármacos, produtos naturais e amostras
clínicas:
• Enzimas e coenzimas, esteróides, vitaminas, etc.
• Pior exatidão e precisão por um fator de 2 a 5.
• Custo maior do equipamento.
• Ao contrário da absorção molecular, não se aplica a
determinação de complexos de metais de transição.
Luminescência Molecular
Para refletir e responder:
Seria possível analisar um analito orgânico aromático com
anéis condensados em uma mistura de compostos orgânicos
através da espectrometria de luminescência molecular? Em
caso positivo, quais seriam as limitações da análise?
Luminescência Molecular
Exercício:
Os volumes de uma solução padrão contendo 1,10 ppm de Zn2+, mostrados
na tabela, foram pipetados para frascos separados, cada um contendo
5,00 mL de uma solução de concentração desconhecida de zinco. Cada
uma foi extraída com 3 alíquotas de 5mL de CCl4 contendo excesso de 8hidroxiquinolina. Os extratos foram então diluídos a 25,00 mL e a fluorescência foi medida com um fluorímetro.
a) Construa a curva de trabalho.
b) Determine a equação linear.
c) Calcule o desvio padrão da inclinação, do intercepto e da regressão.
d) Determine a concentração de zinco na amostra com o respectivo
desvio padrão
s2
s
Volume da
solução
padrão de
Zn2+, mL
Leitura do
fluorímetro
0,00
4,00
8,00
12,00
6,12
11,16
15,68
20,64
m
 ( xi  x)( y  y)
 ( x  x)
sm 
2
 ( x  x)
i
sb  sr
b  y  mx
sr 
 ( y  y)
2
 m 2  ( x  x) 2
N 2
r
s
sx  r
m
2

r
 ( x  x)
x
N  x   x 
2
i
2
i
2
i
1
( y  y) 2
 2
N m  ( xi  x) 2
2
Luminescência Molecular
Exercício - resposta:
a) Curva de trabalho em volume de padrão adicionado.
b) Equação linear.
Volume da
solução
padrão de
Zn2+, mL
Leitura do
fluorímetro
0,00
4,00
8,00
12,00
6,12
11,16
15,68
20,64
Leitura do fluorímetro
25
y = 1.202x + 6.188
R² = 0.9996
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
Volume de solução padrão de Zn2+, mL
c) Desvios-padrão
Regressão: sr = 0,154402
Inclinação: sm = 0,01726
Intercepto: sb = 0,12918
d) Desvio padrão da leitura: sx = 0,17251
sc = 0,17251 x 1,10 / 5 = 0,038 ppm
[Zn2+] = (6,188/1,202) x 1,10 / 5 = 1,13 ppm
12
14
Luminescência Molecular
Exercício - resposta:
a) Curva de trabalho em concentração de padrão adicionado.
b) Equação linear.
[Zn2+], ppm
0,00
0,176
0,352
0,528
Leitura do
fluorímetro
6,12
11,16
15,68
20,64
Leitura do fluorímetro
25
y = 27.318x + 6.188
R² = 0.9996
20
15
10
5
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
[Zn2+], ppm
c) Desvios-padrão
Regressão: sr = 0,154402
Inclinação: sm = 0,39233
Intercepto: sb = 0,12918
d) Desvio padrão da leitura: sx = 0,00759
sc = 0,00759 x 25 / 5 = 0,038 ppm
[Zn2+] = (6,188/27,31) x 25 / 5 = 1,13 ppm
0.5
0.6
Fim da Luminescência
Molecular. O que será que
vem a seguir?