UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
CARLA ROZILENE GUIMARÃES SILVA OLIVEIRA
AVALIAÇÃO FETO-PLACENTÁRIA DE CAPRINOS TRANSGÊNICOS
PARA O FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIAS DE
GRANULÓCITOS HUMANO (hG-CSF)
FORTALEZA-CEARÁ
2011
2
CARLA ROZILENE GUIMARÃES SILVA OLIVEIRA
AVALIAÇÃO FETO-PLACENTÁRIA DE CAPRINOS TRANSGÊNICOS
PARA O FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIAS DE GRANULÓCITOS
HUMANO (hG-CSF)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de pequenos
ruminantes.
Orientador: Prof. Dr. Dárcio Ítalo Alves Teixeira.
FORTALEZA-CEARÁ
2011
3
CARLA ROZILENE GUIMARÃES SILVA OLIVEIRA
AVALIAÇÃO FETO-PLACENTÁRIA DE CAPRINOS TRANSGÊNICOS
PARA O FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIAS DE GRANULÓCITOS
HUMANO (hG-CSF)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Aprovada em: 08/12/2011
Conceito: satisfatório
Nota obtida: 9,0
BANCA EXAMINADORA
______________________________
Prof. Dr. Dárcio Ítalo Alves Teixeira
Universidade Estadual do Ceará
Orientador
______________________________
Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva
Universidade Estadual do Ceará
Examinadora
______________________________
Dr. Jorge André Matias Martins
Universidade Federal do Ceará
Examinador
4
Dedico
À minha filha Flávia Oliveira, por ser minha
musa inspiradora para continuar firme nos meus objetivos.
5
“A amizade desenvolve a felicidade e reduz o sofrimento,
duplicando a nossa alegria e dividindo a nossa dor.”
Joseph Addison.
6
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará, por ter disponibilizado o seu espaço para a
realização do meu trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), pelo apoio e
oportunidade para a realização do Mestrado, pela dedicação e organização tanto da
coordenadoria, quanto da secretaria.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela
concessão de bolsa de estudos.
A Deus, por ter me dado a oportunidade de desfrutar as belezas desta vida, pelos
momentos de aprendizado, paciência e saúde, pelo conforto nos momentos de tristeza e pela
força e motivação para seguir lutando e enfrentando todas dificuldades para a conclusão deste
trabalho.
Ao meu pai, Raimundo Carlos e à minha mãe, Thanya Rozilene, pelo apoio, carinho e
educação, pela coragem de largar tudo em busca dos meus objetivos e por todo amor e
encorajamento para que eu conseguisse chegar até aqui.
Ao meu esposo Rodrigo Oliveira, por ser um ótimo marido, um verdadeiro amigo e
um maravilhoso pai, por sempre me dar forças para continuar, apoiando e incentivando as
minhas decisões e pela sua dedicação e seu esforço durante esse período.
À minha filha Flávia Oliveira por ser a minha motivação sempre, por me dar ânimo a
cada dia para continuar com a cabeça erguida e sempre com o sorriso no rosto, mesmo
interrompendo o período de aleitamento materno para frequentar as disciplinas, pela nossa
separação aos nove meses de idade e pela distância, o nosso vínculo não foi afetado e se
mantém forte.
Ao meu Orientador Prof. Dr. Dárcio Ítalo Alves Teixeira pela amizade, confiança e
compreensão, por sua orientação e colaboração para a realização e conclusão deste trabalho e
pelos ensinamentos compartilhados.
Ao prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo Freitas por ter dado toda a assistência, por ter
concedido a estrutura do Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (LFCR) para a
realização do meu projeto e pelos ensinamentos.
À Profa. Dra. Luciana Magalhães Melo pelo incentivo, conselho e apoio, além das
importantes sugestões para a melhoria deste trabalho.
À Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva pelas sugestões e colaboração durante a
minha qualificação.
7
À Dra. Alexsandra Fernandes Pereira pela ajuda durante a seleção do mestrado, pelas
palavras de força, pelos conselhos, por sempre estar disposta a ajudar quando precisamos,
pela amizade e pelas sugestões na minha dissertação.
À M.Sc Joanna Maria Gonçalves de Souza por sua importante contribuição durante os
preparativos do meu experimento, além de sua fundamental ajuda na realização do mesmo,
obrigada pela grande amizade que construímos, pelo companheirismo e pelas importantes
sugestões.
À M.Sc. Raylene Ramos Moura por sempre estar disponível a ajudar e sempre com
boa vontade, por compartilhar os seus conhecimentos com seus colegas de laboratório e por
incentivar a sermos mais responsáveis e firmes em nossas decisões, obrigada por sua amizade,
conselhos e compreensão, isso foi muito importante durante todo o período de mestrado e deu
forças para continuar.
Ao M.Sc. Ribrio Ivan Tavares Pereira Batista pela ajuda durante a execução do
experimento, por sua contribuição durante a minha qualificação, pelos momentos de
descontração, pela confiança em ter deixado eu morar em sua residência durante os últimos
meses e por amizade.
À Iana Sales Campelo pela companhia, amizade, por ser prestativa aos que pedem
ajuda, pelas inúmeras sugestões nos meus “slides” (antes das apresentações) e por ser essa
pessoa maravilhosa, é um exemplo para muita gente.
Aos alunos de iniciação científica Carlos Henrique de Sousa Melo e Antônio Carlos de
Albuquerque Teles Filho (Cacá) pela colaboração no meu experimento. Ao Henrique por sua
amizade, confiança e paciência, por toda ajuda oferecida antes, durante e depois da realização
do meu experimento e pelo seu bom humor, que é contagiante, faz muito bem quem está por
perto. Ao Cacá por também ter tido importante participação para a realização do meu projeto,
pela companhia e pelos momentos de alegria que tornaram esse período mais agradáveis.
À toda equipe do Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (LFCR),
Agostinho Soares de Alcântara Neto, Deisy Johana Diaz Sanchez, Maiara Pinheiro Vieira,
Maria Claudia dos Santos Luciano, Talles Monte de Almeida. Aos novatos Thaíse Cristine
Ferreira de Carvalho, Flávio Carolino de Souza Filho, Tatiana Oliveira Pessoa, Murilo Torres
de Melo Pedrosa e Otávio Bezerra Ferreira Neto, pelos momentos de descontração que
tornam os dias mais agradáveis. A todos aqueles que passaram pelo laboratório: Francisco
Carlos de Sousa, Victor Hugo Vieira Rodrigues, Érica Souza Albuquerque, Jefferson da Silva
Ferreira e Rebeca Frota Freire, obrigada pela ajuda no meu experimento, pelos momentos de
descontração, por todo tempo que passamos juntos, pelo aprendizado e pela amizade e
8
companheirismo. Não poderia deixar de agradecer aos funcionários do LFCR, Antônio César
Camelo, Selmar Alves da Silva e Cícero Maximo do Nascimento, pela colaboração e apoio
durante o meu experimento.
Aos professores do PPGCV pela importante ajuda e pelas orientações durante esse
período e a todos aqueles que de forma direta e indireta colaboraram para que esse trabalho
desse certo. Muito obrigada!
9
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar o desenvolvimento morfológico e morfométrico de
embriões e fetos caprinos transgênicos para o Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos
humano (hG-CSF), através do uso da ultrassonografia em tempo real. Foram utilizadas quatro
cabras não transgênicas (NT) gestantes após fertilização usando um macho transgênico (T)
para o hG-CSF da raça Canindé. Os exames ultrassonográficos foram realizados nos 30, 40
dias (via transretal, transdutor linear, 6,0/8,0 MHz) e nos 50, 60, 90 e 120 dias de gestação
(via transabdominal, transdutor convexo, 3,5/5,0 MHz). As imagens foram gravadas para
posterior mensuração dos parâmetros do diâmetro da vesícula embrionária (DVE), o
comprimento crânio caudal (CCC), os diâmetros do tronco (DT), do abdômen (DA), do
cordão umbilical (DCU) e dos placentomas (DPL) usando um programa computacional
“Image J”, com prévia calibração para cada frequência utilizada. Foram ainda avaliadas a
organogênese e formação esquelética, além da viabilidade embrionária/fetal com a presença
da atividade cardíaca (Frequência Cardíaca Fetal - FCF) e dos movimentos do concepto. Após
o parto, foi realizado o teste de DNA em todas as crias. Os dados estão apresentados de forma
descritiva e expressos como média ± erro padrão para os conceptos transgênicos e não
transgênicos. Após análise de PCR foram identificados quatro caprinos transgênicos (dois
machos e duas fêmeas) e dois machos não transgênicos. Os primeiros parâmetros mensurados
foram o DVE e o CCC nos dias 30, 40, 50 e 60. Com o crescimento dos conceptos, a partir
dos 50 dias foi possível avaliar também o DT, DA, DCU, DPL. Os valores médios de todos os
parâmetros apresentaram um aumento gradativo com o avançar da gestação. Os conceptos
iniciaram sua diferenciação a partir de 40 dias. O coração foi detectado em todos os exames e
diferenciação das câmaras cardíacas a partir dos 50 dias, os compartimentos gástricos, fígado
e rins foram visualizados a partir aos 60 dias. A visualização de várias estruturas ósseas
ocorreu aos 60 dias, com visualização de áreas hiperecóicas formando o crânio, caixa
torácica, coluna vertebral e ossos longos. Em todos os conceptos a FCF diminuiu à medida
que a avançou a gestação, da primeira observação aos 40 dias (T: 215,50 bpm; NT: 239,50
bpm) até a última aos 120 dias (T: 196,25 bpm; NT: 170 bpm). Todos os fetos apresentaram
movimentos em todos os exames ultrassonográficos, mais intenso aos 50 dias de gestação.
Ambos os conceptos caprinos transgênicos e não transgênicos tiveram um crescimento e
morfologia semelhantes e permaneceram viáveis durante todo o período experimental.
Portanto, presença do gene exógeno no genoma desses animais não interferiu no
desenvolvimento embrionário/fetal e placentário.
10
Palavras-chave: Caprinos. Fetometria. hG-CSF. Transgênese. Ultrassonografia.
11
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the morphometric and morphological development
of transgenic goat embryos and fetuses for human Granulocyte Colony Stimulating Factor
(hG-CSF), through the use of ultrasound in real time. Four pregnancies in non-transgenic
goats (NT) were obtained after fertilization using one transgenic (T) male for the hG-CSF.
Ultrasound examinations were performed at 30, 40 days (transrectal via, linear array
transducer 6.0/8.0 MHz) and 50, 60, 90 and 120 days of pregnancy (transabdominal via,
convex transducer, 3.5/5.0 MHz). The images were recorded for later measurement of the
parameters of the diameter of embryonic vesicle (DEV), crown-rump length (CRL), diameter
of the trunk (DT), abdomen (DA), the umbilical cord (DUC) and the placentomes (DPL)
using a computer software Image J with prior calibration for each frequency used. Were also
evaluated as organogenesis and formation of skeletal, and the viability embryo/fetus with
presence of cardiac activity (Fetal Heart Rate - FHR) and the movements of the fetus. After
parturition DNA testing was conducted in all offspring. The data are presented descriptively
and expressed as means ± SEM for transgenic and non-transgenic conceptus. After PCR
analysis four transgenic goats (two males and two females) and two non-transgenic males
were identified. The initial parameters were measured in the DEV and CRL days 30, 40, 50
and 60. With the growth of fetuses, from 50 days could also evaluate the DT, DA, DUC, DPL.
The average values of all parameters showed a gradual increase with advancing gestation. The
conceptus started their differentiation at 40 days. The heart was detected in all examinations
and the heart chambers were assessed at 50 days. Gastric compartments, liver and kidneys
were observed at 60 days. The visualization of various bone structures occurred at 60 days,
with visualization of hyperechoic areas forming the skull, rib cage, spine and long bones. In
all fetuses the FHR decreased as the pregnancy progressed, the first observation at 40 days (T:
215.50 bpm; NT: 239.50 bpm) to the last at 120 days (T: 196.25 bpm; NT: 170 bpm). All
fetuses presented movements in all ultrasound examinations, more intense at 50 days of
gestation. Both transgenic and non-transgenic goat embryos and fetuses had a growth and
morphology similar and remained viable throughout the experimental period. Therefore,
presence of exogenous gene in the genome of these animals did not affect the embryonic/fetal
and placental develop.
Keywords: Fetometry. Goats. hG-CSF. Transgenesis. Ultrasound.
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Casal de fundadores transgênicos para o hG-CSF. (A) Fêmea. (B)
Macho......................................................................................................................
20
Figura 2. Imagem ultrassonográfica de uma gestação dupla (setas) aos 40 dias de
gestação
obtidos
utilizando
um
transdutor
transabdominal
de
5
MHz.........................................................................................................................
22
Figura 3. Imagens típicas observadas por ultrassonografia transretal em tempo real
com um transdutor linear 7,5 MHz. (A) Vesícula embrionária cheia de líquido no
lúmen do útero de uma fêmea caprina aos 22 dias de gestação. (B) Concepto (cabeça a
esquerda)
e
o
cordão
umbilical
aos
34
dias
de
gestação....................................................................................................................
23
Figura 4. Visualização do rúmen (abaixo à esquerda) e do rim (acima à direita) de
ovino
aos
104
dias
de
gestação.
KIL:
Kidney
lenght
(comprimento
renal)........................................................................................................................
26
Figura 5. Aferição da freqüência cardíaca fetal (FCF) utilizando o Modo-M em um
feto caprino aos 90 dias de gestação..................................................................
27
Capítulo 1
Figure 1. Fetometry results. (A) Diameter of embryonic vesicle, and (B) Crown-rump
length of embryos and fetuses of transgenic (T) and non-transgenic (NT) goats on days
30,
40,
50
and
60
of
gestation...................................................................................................................
40
Figure 2. Fetometry results. (A) Diameter of the thorax, (B) Diameter of the abdomen,
(C) Diameter of umbilical cord, and (D) Diameter of placentome of embryos and
fetuses of transgenic (T) and non-transgenic (NT) goats on days 50, 60, 90 and 12
gestation……………...............................................................................................
41
Figure 3. Fetal heart rate of embryos and fetuses of transgenic (T) and non-transgenic
(NT)
goats
on
days
40,
50,
60,
90
and
120
gestation………………...........................................................................................
of
42
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CEUA - Comissão de Ética para o Uso de Animais
CCC - Comprimento crânio caudal
cm - Centímetro
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CQB - Certificado de Qualidade de Biossegurança
CRL - Crown-rump length
CTNbio - Comissão Técnica Nacional de Biossegurança
DA - Diameter of the abdomen (Diâmetro do abdômen)
DBP - Diâmetro biparietal
DCU - Diâmetro do cordão umbilical
DEV - Diameter of embryonic vesicle
DNA - Desoxyribose Nucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico)
DO - Diâmetro orbital
DPL - Diameter of the placentomes (Diâmetro dos placentomas )
DT - Diameter of the trunk (Diâmetro do tronco)
DUC - Diameter of the umbilical cord (Diâmetro do cordão umbilical)
DVE - Diâmetro da vesísula embrionária
FCF - Frequência cardíaca fetal
FHR - Fetal heart rate (Frequência cardíaca fetal)
FUNCAP - Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento
g - Grama (s)
GnRH - Gonadotropin Releasing Hormone (Hormônio liberador de gonadotrofina)
h - Hora
hG-CSF - Human Granulocyte Colony Stimulating Factor (Fator Estimulante de Colônias de
Granulócitos humano
IATF - Inseminação Artificaial em Tempo Fixo
i.m. - Intramuscular
LFCR - Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução
MAP - Acetato de Medroxiprogesterona
mg - Miligrama (s)
MHz - Megahertz
14
mL - Mililítro
mm - Milímetro
NT - Non-transgenic (Não transgênico)
PB - Proteína bruta
PCR - Polymerase chain reaction (Reação em cadeia da polimerase)
T - Transgenic (Transgênico)
TNCS - Transferência Nuclear de Células Somáticas
UECE - Universidade Estadual do Ceará
UI - Unidades internacionais
µg - Micrograma
15
SUMÁRIO
PÁG.
1. INTRODUÇÃO................................................................................................
16
2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................
18
2.1. Transgênese animal....................................................................................
18
2.2. Transgênese caprina...................................................................................
19
2.3. Importância da ultrassonografia em caprinos.............................................
21
2.3.1. Diagnóstico de gestação por ultrassonografia..................................
21
2.3.2. Fetometria.........................................................................................
23
2.3.3. Morfologia embrionária/fetal...........................................................
25
2.3.4. Viabilidade embrionária/fetal...........................................................
27
3. JUSTIFICATIVA.............................................................................................
29
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA...............................................................................
30
5. OBJETIVOS.....................................................................................................
31
5.1. Objetivo Geral............................................................................................
31
5.2. Objetivos Específicos.................................................................................
31
6. CAPÍTULO 1....................................................................................................
32
7. CONCLUSÕES................................................................................................
48
8. PERSPECTIVAS..............................................................................................
49
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................
50
APÊNDICES.........................................................................................................
56
16
1. INTRODUÇÃO
A produção de animais transgênicos nesta década possui um interesse científico, estes
podem ser utilizados para o estudo dos genes e sua regulação, para o melhoramento genético,
pela introdução de novos genes ou modificação da expressão genética endógena que regulam
as características de importância econômica (WHEELER et al., 2003) e para produção de
proteínas recombinantes de interesse farmacêutico (FREITAS et al., 2007). Definimos
animais transgênicos como os que possuem a inserção do gene exógeno em seu genoma e
transmitem de forma estável (WHEELER, 2003; KEEFER, 2004).
As proteínas recombinantes podem ser produzidas na glândula mamária ou no sangue
de animais transgênicos e esta tecnologia tem avançado para a fase de aplicação comercial
(DYCK et al., 2003). A espécie caprina é a mais adequada para produção destas proteínas por
apresentar uma maturidade sexual precoce, menor custo de manutenção entre outras
vantagens comparada a outros biorreatores (BALDASSARRE e KARATZAS, 2004).
O Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (LFCR) em 2008 obteve o
nascimento de dois caprinos fundadores transgênicos para o Fator Estimulante de Colônias de
Granulócitos humano (hG-CSF) (FREITAS et al., 2010).
A utilização de animais transgênicos como biorreatores tem sido questionada quanto à
saúde dos mesmos. Diante disso, muitos estudos têm avaliado a normalidade dos parâmetros
fisiológicos relativos à sanidade e reprodução destes animais (JACKSON et al., 2010).
A obtenção desses caprinos transgênicos fundadores foi realizada pela técnica da
microinjeção de DNA em pró-núcleos de zigotos produzidos in vivo (FREITAS et al., 2010).
Essa técnica está caracterizada pela inserção aleatória no genoma hospedeiro (CLARK et al.,
2000), diante disso vem a importância de acompanhar todas as fases de desenvolvimento dos
animais transgênicos inclusive a sua linhagem (JACKSON et al., 2010), uma das formas seria
o acompanhamento durante o período gestacional por meio da ultrassonografia (LEE et al.,
2005).
A ultrassonografia em modo B em caprinos pode ser utilizada para o diagnóstico de
gestação (GONZÁLEZ et al., 2004), sexagem fetal (SANTOS et al., 2007), observação de
patologias uterinas (LOPES JÚNIOR et al., 2004), além de ser utilizada para mensurar alguns
parâmetros feto-placentários (fetometria), para a estimativa da idade gestacional (LÉGA et al.,
2007), acompanhar o desenvolvimento e a morfologia do concepto juntamente com seus
órgãos (LÉGA et al., 2003) e determinar a viabilidade do concepto durante o período
gestacional (AMER, 2010). Alguns parâmetros utilizados para mensuração são: o diâmetro da
17
vesícula embrionária (DVE) ou saco gestacional, o comprimento crânio caudal (CCC)
(KAREN et al., 2009), o diâmetro biparietal (DBP) (GONZÁLEZ-BULNES et al., 1998;
ABDELGHAFAR et al., 2007), o diâmetro abdominal (DA), o diâmetro do tronco (DT)
(LÉGA et al., 2007), o diâmetro do cordão umbilical (DCU) (LEE et al., 2005) e o diâmetro
dos placentomas (DPL) (DOIZÉ et al., 1997).
Na literatura não foram encontrados trabalhos com acompanhamento ultrassonográfico
de conceptos transgênicos. Além disso, há poucos estudos em pequenos ruminantes referentes
à caracterização morfológica ao longo do período gestacional. Desta forma, é importante o
acompanhamento
de
caprinos
transgênicos
durante
as
diferentes
fases
de
seu
desenvolvimento, iniciando durante o período gestacional, observando aspectos morfológicos
e morfométricos.
18
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Transgênese animal
Os animais transgênicos contêm moléculas de DNA recombinante que foram
introduzidas por meio da intervenção humana intencional (WALL, 1996), estes animais
possuem a inserção do gene exógeno em seu genoma (KEEFER, 2004). Tanto a inserção dos
genes quanto a sua transmissão ocorrem de forma estável (WHEELER, 2003) e todo o
patrimônio genético pode ser transferido aos seus descendentes (FUKAMIZU, 1993).
Na década de 80, foi realizada a primeira tentativa de geração de animais transgênicos,
quando foi realizada a transferência de genes pela microinjeção de uma construção de DNA
(exógeno) em pró-núcleos de zigotos de camundongos (GORDON et al., 1980). Esse método
é mais eficiente em células animais do que os utilizados por bactérias, com células animais
são realizadas modificações pós-traducionais adequadas, gerando atividade biológica plena
(DYCK et al., 2003). Esse método é mais eficiente em células e vem sendo utilizado em
várias espécies até os dias atuais (COLLARES et al., 2007). Por esta técnica foi gerado o
primeiro camundongo transgênico no Brasil (PESQUERO et al., 2002). Mesmo sendo menos
eficiente, a microinjeção tem gerado muitos animais de grande porte para aplicações na
pecuária e na biomedicina (KUES e NIEMANN, 2011). Outra alternativa para gerar animais
transgênicos seria, a transferência de DNA por vetores de lentivirais (EWERLING et al.,
2006) e transferência via espermatozóides (COLLARES et al., 2005), entre outras.
A produção desses animais é de interesse científico, pois podem ser utilizados para o
estudo dos genes e sua regulação, para o melhoramento genético, pela introdução de novos
genes ou modificação da expressão genética endógena que regulam as características de
importância econômica (WHEELER et al., 2003) e para produção de proteínas recombinantes
de interesse farmacêutico (FREITAS et al., 2007).
É possível que animais transgênicos expressem proteínas nas células de determinados
órgãos, utilizando promotores tecido-específicos, o isolamento de proteínas expressas nos
fluidos corporais apresenta vantagens sobre os tecidos, pois estes podem ser constantemente
produzidos e as proteínas são facilmente purificadas, quando comparado aos tecidos
(WHEELER et al., 2003). As proteínas recombinantes podem ser produzidas por exemplo: no
sangue, na urina, no plasma seminal e no leite (COLLARES et al., 2007). Esta tecnologia tem
avançado para a fase de aplicação comercial (DYCK et al., 2003) e tem atraído significativo
interesse por apresentar, como principais vantagens, o baixo custo de produção e proteínas de
19
alta qualidade (PAVLOU e REICHERT, 2004; HOUDEBINE, 2009). Um dos mais
promissores avanços para a produção em larga escala de proteínas recombinantes tem sido a
secreção dessas proteínas no leite de mamíferos transgênicos (COLLARES et al., 2007).
2.2. Transgênese caprina
A espécie caprina é uma ótima opção comparada a outros biorreatores por ser capaz de
produzir vários quilogramas de proteínas recombinantes por ano (BALDASSARRE et al.,
2004), além de apresentar menor custo de manutenção, maturidade sexual mais precoce e com
menor período de gestação comparado com outras espécies. Além disso, uma pequena
quantidade de caprinos transgênicos pode suprir a demanda para a maioria das proteínas
recombinantes requeridas no mercado (BALDASSARRE e KARATZAS, 2004).
O método tradicional para a produção de caprinos transgênicos fundadores envolve a
microinjeção de uma construção de DNA em pró-núcleos de zigotos produzidos in vivo
(EBERT et al., 1991; FREITAS et al., 2007) ou in vitro, a partir da colheita de oócitos guiada
por laparoscopia (COL) (BALDASSARRE et al., 2003). Outro método para obtenção e
propagação de animais transgênicos é a transferência nuclear de células somáticas (TNCS)
(BAGUISI et al., 1999).
Apenas uma proteína recombinante produzida por caprinos transgênicos foi liberada
para uso clínico. A antitrombina III humana (ATryn®), produzida a partir da glândula
mamária de cabras transgênicas, foi o primeiro medicamento aceito para os testes clínicos e
comercialização na Europa em 2006 “European Medicines Agency” (EMA) e nos EUA em
2009, pela “Food and Drug Administration” (FDA), este medicamento pode ser utilizado no
tratamento
de
pacientes
com
resistência
a
heparina
que
foram
submetidos
a
procedimentos cardiopulmonares (KUES e NIEMANN, 2011), previne a formação de
coágulos sanguíneos em pacientes com deficiência da proteína anticoagulante natural
(SCHMIDT, 2006).
Nosso laboratório juntamente com a Universidade Federal do Rio de Janeiro e a
Academia de Ciências da Rússia iniciaram um projeto para obtenção de caprinos transgênicos
produzindo o hG-CSF no leite. Essa parceria resultou no nascimento do primeiro caprino
transgênico da América Latina, um macho da raça Saanen (FREITAS et al., 2007).
No ano de 2008, nasceram dois caprinos fundadores transgênicos para o hG-CSF
(Figura 1), sendo uma fêmea e um macho da Raça Canindé, esses animais foram obtidos pela
técnica da microinjeção de DNA em pró-núcleos de zigotos produzidos in vivo (FREITAS et
20
al.,
., 2010). Estes animais possuem em seu genoma o gene que codifica a proteína do hG-CSF.
O hG-CSF
CSF é importante para a defesa imunitária baseada em neutrófilos, devido ao seu papel
regulatório no crescimento, diferenciação, sobrevivência e ativação de tais células
c
e seus
precursores (BARREDA et al., 2004). Este tem sido utilizado no tratamento de muitas
patologias, assim como no tratamento de pacientes com câncer que requerem altas doses de
quimioterapia, pode ser usada no tratamento de tumores, pela radioterapia
radioterapia e na utilização de
drogas que diminuem a produção de células mielóides (WITTMAN et al., 2006).
Figura 1. Casal
asal de fundadores transgênicos para o hG
hG-CSF. (A) Fêmea. (B) Macho. Fonte:
LFCR.
Uma grande variedade de proteínas recombinantes tem sido produzida por caprinos
transgênicos expressas na glândula mamária e secretadas no leite de cabras transgênicas,
dentre elas: a lisozima (MAGA et al., 2006) e a lactoferrina humana (ZHANG et al., 2008
2008)
Nos últimos anos, o uso de fármacos obtidos a partir de animais transgênicos para
terapia em humanos tem sido questionado. Diante disso, muitos estudos têm considerado ser
relevante avaliar a normalidade dos parâmetros fisiológicos relativos à sanidade e reprodução
destes animais, visando à aplicação bem-sucedida
bem sucedida da transgênese para uso co
comercial
(JACKSON et al., 2010).
A questão da biossegurança e da bioética devem sempre ser consideradas na pesquisa,
na produção e nos estudos dos mecanismos que dirigem a expressão gênica aos tecidos
candidatos a biorreatores. O controle total da expressão gênica e a produção de proteínas
recombinantes em animais transgênicos continuarão avançando, e os produtos gerados serão
constantemente avaliados quanto à sua segurança
seguran e eficiência
iência (COLLARES et al., 2007).
21
Após a obtenção desse casal e a confirmação do transgene no sêmen do macho
fundador, a próxima etapa visou à multiplicação dessa linhagem. Previamente a isso, há a
necessidade da avaliação durante todas as etapas da vida, incluindo a sua linhagem
(JACKSON et al., 2010). Uma das formas seria o acompanhamento durante o período
gestacional, por avaliar o desenvolvimento embrionário/fetal e placentário por meio da
ultrassonografia (LEE et al., 2005).
2.3. Importância da ultrassonografia em caprinos
Nos últimos anos, muitas pesquisas relacionadas com a utilização da ultrassonografia
em modo B em caprinos tem demonstrado interesse, principalmente para o diagnóstico de
gestação (GONZÁLEZ et al., 2004), sexagem fetal (SANTOS et al., 2007), observação de
patologias uterinas, como a hidrometra (LOPES JÚNIOR et al., 2004), além de ser utilizada
para avaliar e mensurar alguns parâmetros embrionários/fetais e placentários, para a
estimativa da idade gestacional (LÉGA et al., 2007). É possível acompanhar o
desenvolvimento e a morfologia do concepto e de seus órgãos (LÉGA et al., 2003) em
caprinos. A viabilidade embrionária/fetal pode ser determinada pela atividade cardíaca e os
movimentos do concepto (AMER, 2010).
2.3.1. Diagnóstico de gestação por ultrassonografia
O diagnóstico de gestação preciso em cabras proporciona informações essenciais para
as práticas eficazes de manejo do rebanho, como por exemplo, seleção de fêmeas não prenhes,
determinação do número de fetos permitindo que os produtores separarem as fêmeas com
gestação simples, dupla (Figura 2) ou tripla para um manejo nutricional diferenciado
(MEDAN et al., 2004).
A ultrassonografia em modo-B em tempo real é uma ferramenta eficiente de
diagnóstico precoce de gestação em cabras. Essa é uma alternativa não invasiva, precisa e
rápida para o diagnóstico da gestação e o estudo do desenvolvimento do concepto (HAIBEL,
1990).
Com a utilização de um transdutor transretal de 7,0 MHz, é possível realizar o
diagnóstico de gestação em cabras egípcias nativas a partir de 16,9 dias após a monta, pela
detecção da vesícula embrionária ou saco gestacional (KAREN et al., 2009). O mesmo
22
exame, realizado com um transdutor na frequência de 5,0 MHz, permite visu
visualizar essas
estruturas 18 dias após a monta em cabras Anglo-Nubianas
Anglo Nubianas (MARTINEZ et al., 1998).
Figura 2. Imagem ultrassonográfica de uma gestação dupla (setas) aos 40 dias de gestação
obtidos utilizando um transdutor transabdominal de 5,0 MHz. Fonte: Medan et al. (2004).
De acordo com Padilla-Rivas
Padilla Rivas et al. (2005), o diagnóstico de gestação deve estar
baseado na presença do concepto, utilizando um transdutor transretal de 7,5 MHz, foi possível
visualizar a vesícula embrionária aos 22 dias em cabras Boer (Figura 3). Por sua vez,
González et al. (2004), trabalhando com cabras leiteiras da raça Canária utilizando
transdutores com a mesma frequência, afirmaram que a detecção do embrião é possível a
partir dos 26 dias depois da monta, com precisão máxima,
máxima mas foram
oram obtidos muitos falsos
negativos durante a fase inicial de gestação. A determinação ecográfica do embrião,
utilizando um transdutor transretal de 7,0 MHz, pode ser realizada a partir de 22,3 dias de
gestação (KAREN et al., 2009), ou com uma frequência
frequência de 6,0 MHz no dia 28 (SUGUNA et
al., 2008). Essas discrepâncias de dados podem ser atribuídas às diferenças entre as raças
caprinas utilizadas (PADILLA-RIVAS
(PADILLA
et al., 2005; KAREN et al., 2009).
Quando as ecografias são realizadas com transdutores transabdominais
transabdominais de 5,0 MHz, as
vesículas embrionárias são visíveis a partir do dia 28 aproximadamente após a monta
(SUGUNA et al., 2008; KAREN et al., 2009). O embrião pode ser visto entre os dias 30,3 e
35 de acordo com Karen et al. (2009) e Suguna et al. (2008), respectivamente. Para a
confirmação da gestação é necessária a detecção do concepto (SUGUNA et al., 2008).
Durante a avaliação em estágios iniciais da gestação, são importantes a observação do
embrião e os batimentos cardíacos
díacos embrionários dentro do saco gestacional (MEDAN et al.,
2004).
23
Figura 3. Imagens típicas observadas por ultrassonografia transretal em tempo real com um
transdutor linear 7,5 MHz. (A) Vesícula embrionária cheia de líquido no lúmen do útero de
uma fêmea caprina aos 22 dias de gestação. (B) Concepto (cabeça a esquerda) e o cordão
umbilical aos 34 dias de gestação. Fonte: Padilla-Rivas
Padilla
et al. ( 2005).
A ultrassonografia transvaginal é pouco difundida, apesar de já ser conhecido que não
provoca aborto, infecção do sistema genital e não propicia desconforto ao animal quando da
manipulação
ulação vaginal (TENÓRIO FILHO et al., 2007). Freitas Neto et al. (2009) verificaram a
viabilidade do exame ultrassonográfico pelas vias transretal, transabdominal e transvaginal
para o diagnóstico de gestação em cabras e ovelhas. O método pela via transret
transretal foi mais
rápido, sendo o menor tempo do diagnóstico em gestações mais avançada, especialmente na
espécie caprina.
2.3.2. Fetometria
As mensurações de algumas estruturas embrionárias ou fetais são importantes para
estimar a idade gestacional, quando não
não se sabe o dia do acasalamento e acompanhar o
crescimento dos conceptos ao longo do período gestacional (DOIZÉ et al., 1997). Os
parâmetros mais utilizados para realizar a fetometria são: o diâmetro da vesícula embrionária
(DVE) ou saco gestacional, o comprimento
comprimento crânio caudal (CCC) (KAREN et al., 2009), o
diâmetro biparietal (DBP) (GONZÁLEZ-BULNES
(GONZÁLEZ BULNES et al., 1998; ABDELGHAFAR et al.,
2007), o diâmetro abdominal (DA), o diâmetro do tronco (DT) (LÉGA et al., 2007), o
diâmetro do cordão umbilical (DCU) (LEE et
et al., 2005) e o diâmetro dos placentomas
(DOIZÉ et al., 1997).
24
Há outros parâmetros como a mensuração do coração (eixos longo e curto do coração),
diâmetro da cabeça (LEE et al., 2005), diâmetro orbital (DO) (LEE et al., 2005; LÉGA et al.,
2007) e mensuração de alguns órgãos, como: diâmetro renal (LÉGA et al., 2007),
comprimento ruminal (GONZÁLEZ-BULNES et al., 1998) e mensuração de algumas
estruturas ósseas, como o fêmur, escápula, metacarpo, pelve, úmero (LÉGA et al., 2007) e
tíbia (LÉGA et al., 2003). A frequência cardíaca fetal foi utilizada para estimar a idade
gestacional, ocorrendo uma redução dos batimentos por minuto ao longo da gestação
(KAREN et al., 2009). Entretanto, este parâmetro sofre influência do sistema nervoso
autônomo e não deve ser considerado como parâmetro único para determinar a idade
gestacional (LÉGA et al., 2007).
A vesícula gestacional ou saco gestacional aparecem como uma estrutura alongada e
anecóica cheia de líquido (MARTINEZ et al., 1998; MEDAN et al., 2004; SUGUNA et al.,
2008). A sua visualização é indicativo dos primeiros sinais de gestação (MEDAN et al.,
2004). O DVE é mensurado no seu diâmetro máximo (MARTINEZ et al., 1998). Por
ultrassonografia transretal, a vesícula embrionária foi visualizada aos 18 dias e a mensuração
foi de 4,1 mm em cabras (MARTINEZ et al., 1998) e aos 21 dias é de 1 cm (PADILLARIVAS et al., 2005).
O CCC tem sido utilizado para a estimativa da idade gestacional em diferentes
espécies (KAREN et al., 2009). Nesse trabalho, o CCC foi significativo e com alta correlação
(r2 = 0,94; P≤0,0001) com a idade gestacional a partir de 25 a 70 dias. Após esse período foi
difícil ser mensurado porque o comprimento do feto (>10 cm) ultrapassou a tela de
visualização. O seu crescimento está descrito por uma equação exponencial. Esses resultados
são semelhantes aos encontrados por Martinez et al. (1998) entre dias 19 e 40 de gestação e
por González-Bulnes et al. (1998) de 19 a 48 dias de gestação. A mensuração é feita do osso
occipital até as primeiras vértebras coccígeas (ABDELGHAFAR et al., 2007).
O DBP é um parâmetro que pode ser mensurado a partir de 30 a 105 dias de gestação,
está altamente (r2 = 0,95; P≤0,0001) correlacionado com a idade gestacional em cabras
egípcias nativas (KAREN et al., 2009). González-Bulnes et al. (1998) também encontraram
uma alta correlação (r2 = 0,96) com a idade gestacional a partir de 32 a 90 dias em ovelhas
Manchega. A partir de 95 dias de gestação a mensuração do DBP fica difícil devido ao
aumento fetal e à compressão da cabeça contra outras partes fetais (ABDELGHAFAR et al.,
2007). Por outro lado, em estudos realizados por Lee et al. (2005) em cabras coreanas pretas
entre os dias 60 e 135 de gestação, a correlação existente entre a idade gestacional e o DBP
foi de r2 = 0,80. A mensuração desse parâmetro é realizada a partir de imagens em que pode
25
ser visualizada a cabeça de forma simétrica, perpendicular ao feixe de ultrassom (LEE et al.,
2005).
O DA pode ser mensurado em um plano transversal e anteroposterior, sendo que em
ambas as mensurações apresentam uma alta correlação (r2 = 0,91; P<0,01) com a idade
gestacional (LÉGA et al., 2007). O DT é um parâmetro altamente correlacionado (r2 = 0,96;
P<0,0001) com a idade gestacional em cabras egípcias nativas entre os dias 40 e 130 de
gestação, o seu crescimento está descrito por uma equação linear (y = 0,8308x – 23,11)
(KAREN et al., 2009). González-Bulnes et al. (1998) encontraram uma correlação semelhante
(r2 = 0,96) entre os dias 62 a 90 de gestação. Léga et al. (2007), acharam resultados próximos
aos mencionados anteriormente (r2 = 0,95; P<0,01).
A mensuração do DCU apresenta uma significativa correlação com a idade gestacional
(r2 = 0,70) (LEE et al., 2005). Uma alta correlação (r2 = 0,93) foi encontrada por Karen et al.
(2009). O cordão umbilical é fácil de ser identificado por ultrasonografia dos dias 30 aos 120
de gestação. Essa diferença pode ser atribuída ao efeito da raça e a diferença no intervalo dos
exames ultrassonográficos.
Os primeiros placentomas são visualizados pela via transretal aos 42 dias de gestação,
após 98 dias fica mais difícil de serem observados. Utilizando a via transabdominal, a
detecção dos placentomas foi aos 50 dias de gestação, o DPL através desta abordagem foi
registrado até o dia 130 de gestação (SUGUNA et al., 2008). Abreu et al. (2007) afirmam que
a mensuração dos placentomas em cabras da raça Serrana, embora bastante acessíveis, não
observaram uma alta correlação com a estimativa gestacional (r2 = 0,81; P<0,001), entre os
dias 47 a 82 dias de gestação. Em ovelhas da raça Ossimi, Ali e Hayder (2007) obtiveram uma
baixa correlação (r2 = 0,38) dos placentomas com a idade gestacional. O DPL mostrou uma
alta correlação (r2 = 0,99; P <0,001) com a idade gestacional em cabras mestiças (SUGUNA
et al., 2008). Doizé et al. (1997), trabalhando com ovinos e caprinos verificaram que o
diâmetro dos placentomas apresentou uma correlação mais significativa com a idade
gestacional para caprinos (r2 = 0,70) do que para ovinos (r2 = 0,15).
2.3.3. Morfologia embrionária/fetal
A utilização da ultrassonografia em modo-B permite o acompanhamento de diversas
modificações que ocorrem durante o desenvolvimento do concepto (LÉGA et al., 2007). Com
a avaliação ultrassonográfica pode-se acompanhar o desenvolvimento embrionário, fetal e
26
placentário dos conceptos (ALI e HAYDER, 2007). A visualização de alguns órgãos e/ou
estruturas depende da idade gestacional que o concepto se encontra (LÉGA et al., 2003).
Ali e Hayder (2007), trabalhando com ovelhas da raça Ossimi, ve
verificaram que a
diferenciação da conformação do concepto pode ser observada aos 38 ± 3,2 dias, com
observação da cabeça, do corpo e da cauda. Léga et al. (2003) identificaram os
compartimentos gástricos a partir dos 55 a 57 dias como uma estrutura anecóica com
invaginações em seu lúmen para a diferenciação dos quarto compartimentos gástricos dos
ruminantes. González-Bulnes
Bulnes et al. (1998) afirmaram que esses compartimentos podem ser
fácilmente monitorados a partir de 50 dias de gestação, com aumento linear do seu diâmetro
até 90 dias. Ali e Hayder (2007) visualizaram os rins pela primeira vez aos 73,2 ± 6,3 dias,
esses autores sugerem utilizar o rúmen para localização do rim esquerdo (Figura 4). Léga et
al. (2003) observaram a bexiga pela primeira vez a partir dos 49 a 51 dias, apresentando um
aspecto anecóico e discretamente repleta. Medan et al. (2004) observaram que o coração foi
definido como uma área anecóica entre as costelas.
Figura 4. Visualização do rúmen (abaixo à esquerda) e do rim (acima à direita)
direita) de feto ovino
aos 104 dias de gestação. KIL: “Kidney lenght” (comprimento renal). Fonte: Ali e Hayder,
2007.
Os membros podem ser identificados ainda sem muita evidência de calcificação aos 34
a 36 dias de gestação (LÉGA et al., 2003). O início da calcificação das estruturas ósseas
ocorre aos 40 dias, com a visualização
visualização total aos 60 dias, pela identificação do crânio, das
costelas, da coluna vertebral e dos ossos longos (LÉGA et al., 2003). Suguna et al. (2008)
27
verificaram em cabras mestiças que o crânio, a caixa torácica e coluna vertebral foram
visualizados em um período próximo (56 dias) e foram detectadas até 130 dias.
2.3.4. Viabilidade embrionária/fetal
A ultrassonografia transretal modo
modo-B
B foi mais eficiente para o diagnóstico de gestação
precoce e a confirmação da viabilidade do concepto, pela presença dos batimentos cardíacos
(MEDAN et al., 2004). Amer (2010) afirma que a viabilidade embrionária/fetal pode
p
ser
determinada pela presença dos batimentos cardíacos e os movimentos do concepto. A
observação desses parâmetros são uma evidência conclusiva da presença de um feto vivo. A
frequência cardíaca fetal pode ser aferida utilizando o modo-M
modo M (Figura 5) a ppartir de 25 dias
de gestação (KAREN et al., 2009) ou pela técnica do cron
cronômetro
ômetro (MARTINEZ et al., 1998).
Esse parâmetro além de determinar a viabilidade fetal, permite avaliar o aspecto fisiológico da
funçãoo cardíaca (LÉGA et al., 2007).
Figura 5. Aferição
ição da frequência cardíaca fetal (FCF) utilizando o Modo
Modo-M em um feto
caprino aos 90 dias de gestação. Fonte: LFCR.
Em alguns casos, a morte fetal ocorre em um estágio avançado de gestação. Esta
caracteriza-se
se pela falta de movimento fetal ou batimentos cardíacos, que também está
associada à falta de estruturas definidas ou líquido fetal circundante (PADILLA
(PADILLA-RIVAS et al.,
2005). Medan et al. (2004) após utilização da ultrassonografia repetidas vezes não observaram
em seu trabalho nenhum caso de mortalidade
mortalidade embrionária. Mesmo com a repetição e
28
exposição dos fetos às ondas ultrassonográficas em dois diferentes comprimentos de onda (3,5
e 7,5 MHz), não provocou nenhuma morte fetal ou aborto e todas as crias nascidas estavam
morfologicamente normais e viáveis (PADILLA-RIVAS et al., 2005).
Assim a ultrassonografia é um método eficaz e seguro para avaliação do
desenvolvimento fetal de animais transgênicos.
29
3. JUSTIFICATIVA
A espécie caprina quando comparada com outras espécies, produz uma quantidade
adequada de leite, apresentam menores custos de investimento, tem maturidade sexual
precoce e um menor período de gestação. As cabras têm sido utilizadas como modelo para a
produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico, sendo está uma alternativa
para a produção destas proteínas para a terapia em humanos.
A formação de um rebanho transgênico caprino favorece a produção dessas proteínas
em larga escala e há necessidade da multiplicação dos caprinos transgênicos e avaliação
desses animais e de suas linhagens durante todas as fases de sua vida.
O uso da ultrassonografia seria uma alternativa para avaliação no início do seu
desenvolvimento, durante o período gestacional, permitindo acompanhar o crescimento dos
conceptos transgênicos, assim como caracterizar a sua morfologia e de seus órgãos e
determinar a viabilidade durante o período gestacional, como forma de verificar a saúde e o
bem-estar desses animais.
30
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
Os embriões/fetos caprinos transgênicos para o hG-CSF da raça Canindé apresentam
um crescimento gestacional similar aos de caprinos não transgênicos da mesma raça.
31
5. OBJETIVOS
5.1. Objetivo Geral
• Avaliar o desenvolvimento morfológico e morfométrico de embriões/fetos caprinos
transgênicos para o hG-CSF.
5.2. Objetivos Específicos
•
Avaliar o desenvolvimento placentário dos embriões/fetos caprinos transgênicos e
não transgênicos.
•
Comparar parâmetros de mensuração embrionário/fetal entre caprinos transgênicos e
não transgênicos.
•
Verificar a frequência dos batimentos cardíacos fetais em diversas idades
gestacionais entre os embriões/fetos caprinos transgênicos e não transgênicos.
•
Avaliar a conformação e a diferenciação dos conceptos caprinos transgênicos e não
transgênicos.
•
Predizer o número de fetos viáveis e comparar o crescimento dos embriões/fetos
caprinos transgênicos e não transgênicos.
32
6. CAPÍTULO 1
Avaliação ultrassonográfica de embriões e fetos caprinos transgênicos para o hG-CSF
(Ultrasonography evaluation of transgenic goat embryos and fetuses for hG-CSF)
Periódico: Journal of Veterinary Science (Submetido em outubro de 2011)
Fator de Impacto: 1,153
Qualis: B1 - Área: Medicina Veterinária
33
Resumo
O objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento de embriões e fetos caprinos
transgênicos para o Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos humano (hG-CSF) por
meio da ultrassonografia. Quatro gestações de cabras não-transgênica (NT) foram obtidas
após a fertilização (inseminação artificial em tempo fixo/monta natural) usando o macho
transgênico (T) para o hG-CSF. Exames ultrassonográficos foram realizadas aos 30, 40 (via
transretal), 50, 60, 90 e 120 dias de gestação (via transabdominal). Alguns parâmetros foram
observados, tais como morfologia, a organogênese e formação do esqueleto de fetos, a
viabilidade com a atividade cardíaca e movimentos fetais. Foram realizadas mensurações do
comprimento crânio caudal (CCC), o diâmetro da vesícula embrionária (DEV), do tórax (DT),
do abdômen (DA), do cordão umbilical (DCU) e dos placentomas (DPL). Os dados estão
expressos em média ± SEM. Foram identificados quatro caprinos transgênicos e dois não
transgênicos. Os conceptos começaram sua diferenciação aos 40 dias. O coração foi detectado
em todos os exames e as câmaras cardíacas foram avaliadas os 50 dias. Os compartimentos
gástricos, o fígado e os rins foram visualizados aos 60 dias, mesmo período em que todas as
estruturas ósseas foram visualizadas. Os valores médios de todos os parâmetros avaliados
tiveram um aumento gradual com a avançar da gestação. Ambos os embriões e fetos caprinos
transgênicos e não transgênicos tiveram um crescimento semelhante e permaneceram viáveis
durante todo o período experimental.
34
Ultrasonography evaluation of transgenic goat embryos and fetuses for hG-CSF
Carla Rozilene Guimarães Silva Oliveira, Ribrio Ivan Tavares Pereira Batista, Joanna Maria
Gonçalves de Souza, Carlos Henrique de Sousa Melo, Antônio Carlos de Albuquerque Teles
Filho, Alexsandra Fernandes Pereira, Luciana Magalhães Melo, Vicente José de Figueirêdo
Freitas, Dárcio Ítalo Alves Teixeira*
Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (LFCR), Faculdade de Veterinária,
Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE 60.740-903, Brazil
*Corresponding author:
Dárcio Ítalo Alves Teixeira
Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução
Universidade Estadual do Ceará - Faculdade de Veterinária
Av. Dedé Brasil, 1700, Campus Itaperi - Fortaleza, CE, 60.740-903, Brazil
Tel.: +55 85 3101 9861
E-mail address: [email protected] (D.I.A. Teixeira)
Abstract
The objective of this study was to evaluate the development of transgenic goat embryos and
fetuses for human Granulocyte Colony Stimulating Factor (hG-CSF) by ultrasonography.
Four pregnancies in non-transgenic goats (NT) were obtained after fertilization (fixed-time
artificial insemination/natural mating) using the transgenic (T) male for the hG-CSF.
Ultrasound examinations were carried out at 30, 40 (transrectal via), 50, 60, 90 and 120 days
of pregnancy (transabdominal via). Some parameters were observed such as morphology,
organogenesis and formation of skeletal, viability with cardiac activity and fetuses
movements. Measurements were taken of the crown-rump length (CRL), diameter of
embryonic vesicle (DEV), thorax (DT), abdomen (DA), umbilical cord (DUC) and
placentomes (DPL). The data are expressed as mean ± SEM. Four transgenic and two nontransgenic goats were identified. The conceptus started their differentiation at 40 days. The
heart was detected in all examinations and the heart chambers were assessed at 50 days.
Gastric compartments, liver, kidneys were observed at 60 days, the same period that all bony
structures were visualized. Average values of all evaluated parameters had a gradual increase
35
with advancing gestation. Both transgenic and non-transgenic goat embryos and fetuses had a
similar growth and remained viable throughout the experimental period.
Keywords: caprine, fetal morphology, hG-CSF, transgenesis, ultrasound
Introduction
The market for the production of therapeutic proteins is booming [23]
and transgenic goats have
been recently generated for this purpose [5]. Goats have certain advantages when compared to
cattle such as, a shorter gestation period, higher prolificacy and a lower cost requirement to
maintain a herd [9]. The transgenic animal has been an outstanding advance in biotechnology
[13]. A project to obtain transgenic goats producing human Granulocyte Colony Stimulating
Factor (hG-CSF) in milk was initiated in our laboratory. In 2006, the first transgenic goat in
Latin America was born [10], a Saanen male. In 2008, two transgenic founders of the Canindé
breed, one male and one female, were also obtained for the same protein [11]. This protein is
important for immune defense based on neutrophils, due to its regulatory role in growth,
differentiation, survival and activation of these cells and their precursors [6]. However, the
use of animals as bioreactors has been questioned when used in regard to human health.
Therefore, many studies have evaluated the normality of physiological parameters related to
health and reproduction of these animals [14].
Ultrasound has become an essential tool to assess the development and growth of fetal
organs and parts (head, eyes, stomach, bones, heart and bladder) of sheep, without affecting
pregnancy [21]. The optimal time for observation of fetal structures is important to evaluate
fetal morphology reflecting the integrity of the structures examined and allowing early
diagnosis of disease or congenital defects that may occur [17]. In addition, it is possible to
obtain more detailed information of the fetuses`s different parameters, such as fetometry, to
estimate gestational age [16], evaluation of somatic movements and fetal heart rate to assess
fetal viability [18]. Therefore, the objective of this study was to evaluate the morphometric
and morphological development of transgenic goat embryos and fetuses for hG-CSF by using
real-time ultrasound in different gestational ages.
36
Material and methods
Bioethics
The experiment was approved by the Committee of Ethics in the Use of Animals of
the State University of Ceará (CEUA/UECE, no. 10244447-1/24) and by Brazil’s National
Technical Committee of Biosafety (CTNBio, Biosafety Quality Certificate - CQB, no.
0228/06).
Location and experimental animals
The experiment was conducted from May to October of 2010 in the Laboratory of
Physiology and Control of Reproduction, located in the State University of Ceará, FortalezaCE, Brazil, at 3° 47'38" S and 38° 33'29" W latitude and longitude, respectively. All animals
were maintained in a semi-intensive system, having access once a day to pasture consisting of
Tifton (Cynodon dactylon), receiving supplementation with commercial concentrate
(minimum of 18% crude protein) and hay (Tifton) once a day, associated with the supply of
protein salt and water ad libitum.
Non-transgenic (NT) Canindé goats were submitted to an estrous synchronization
treatment and were either, artificially inseminated or mated, using in both cases the Canindé
transgenic male (T) for hG-CSF. Four pregnancies were obtained for a total of two females
and four males. The day of conception was considered as day zero (D0) of pregnancy.
Ultrasonographic examinations
All goats were transrectally and transabdominally examined. The transrectal via was
used at 30 and 40 days of pregnancy. The transabdominal via was used at 50, 60, 90 and 120
days of pregnancy. Transrectal exams were conducted with does in a standing position, using
the Falco 100 apparatus (Pie-Medical, Netherlands) a real-time, B mode ultrasound scanner,
equipped with a 6.0/8.0 MHz linear array transducer. After the manual removal of feces, a
solution of carboxymethylcellulose gel was applied in the rectum, using a 10 mL syringe. The
transducer was carefully inserted in the rectum in order to locate the full bladder on the
monitor screen. Cranial to the bladder, the transducer was rotated in two directions, clockwise
and counterclockwise to evaluate the entire reproductive tract.
The transabdominal exam was performed using a dual frequency convex transducer of
3.5/5.0 MHz. The animals were restrained in standing position and the transducer was placed
on the hairless area of the ventral abdominal wall just above the udder. In both approaches
37
(transrectal and transabdominal) sonographic images of embryonic vesicles, characterized as
anechoic structures of circular or elliptical shape containing the embryo/fetus [20], were
recorded and transferred to a computer for later detailed examination.
Embryonic/fetal morphology
During each ultrasound examination the development of transgenic and nontransgenic, embryos/fetuses was evaluated by its morphological characterization and
formation of bone structures. In order to characterize fetal morphology the conceptus
development was assessed by the organogenic differentiation and formation of the head, body
and limbs [17].
Observations were made to detect the presence of an anatomical head and eyes with
the visualization of their orbits. In the body, the chest was observed to detect the heart and
check the development of its chambers. In the abdominal cavity, the gestational period was
determined by the observations and evaluation of the organ’s mofology, as with fetal gastric
compartments [12,17], kidneys [3], liver, and bladder [17]. The formation of bone structures
was determined and recorded by an increased echogenicity in those areas that formed the
structures could be formed. The exam period was considered as the time of ossification in the
gestational age examined. The formations of skull, orbits, ribs, vertebral column and long
bones were evaluated [20,25].
Ultrasonographic fetometry
The evaluation of ultrasonographic fetometry was performed with the measurement of
parameters such as the diameter of embryonic vesicle (DEV), crown-rump length (CRL),
diameter of thorax (DT), diameter of abdomen (DA), diameter of umbilical cord (DUC) and
diameter of placentomes (DPL). For DEV, the embryonic vesicle was measured in its
maximal diameter [19]. The CRL was measured as a straight line from the most upper part of
the skull to the tail (end of the sacrum or first coccygeal vertebra) [1]. The DT was
determined by the side view (ventral-dorsal) as the distance between the sternum and thoracic
vertebrae through the heart, being the largest measured transverse from the abdomen to the
junction of the umbilical vein [16]. The DA was defined by the distance between the ends of
the trunk, in the lateral view, measured from the last rib to the level of the umbilical cord [18].
The DUC was determined by measuring the insertion site of the umbilical cord in the body
[16]. As pregnancy progressed, the DPL was measured in C-shaped or O-shaped gray images,
38
depending on the imaging of the section against in uterine fluid. We used the average
diameter of four placentomes located in different areas in the uterus [16].
By the use of recorded images, all variables were evaluated and measured by the
Image J (National Institutes of Health, United States of America) software, with prior
calibration for each frequency. For images captured at a frequency of 6.0 and 8.0 MHz, it was
established that 5 mm would correspond to 10.00 and 21.00 pixels, respectively. For the
frequencies of 3.5 and 5.0 MHz, it was established that 10 mm consisted of 13.00 and 16.00
pixels, respectively.
Embryo/fetal viability
Embryonic/fetal viability was evaluated to characterize their normal development
during pregnancy. There are two parameters indicative of viability: cardiac activity and fetal
movements [4]. For the cardiac activity, it was initially observed the embryonic/fetal heart
rate measured by the use of M-mode [8]. The embryonic/fetal movements were evaluated
during all examinations with their intensity varying according to the gestational age.
Detection of the hG-CSF transgene
A fragment of ear tissue was collected for DNA extraction two weeks after offspring
birth. Analysis of the exogenous gene was performed by conventional PCR method [10]. Just
after obtaining these results, the images previously obtained by ultrasound were allocated into
sonograms of non-transgenic and transgenic goats.
Results
During all sonographic evaluations transgenic and non-transgenic embryos/fetuses
showed a similar and progressive development. Concepts images had a normal echogenicity
for the age evaluated. As the fetuses developed, it was possible to evaluate the formation and
differentiation of some of its organs.
Detection of the hG-CSF transgene
After PCR, four transgenic goats (two males and two females) and two non-transgenic
males were identified.
Embryonic and fetal morphology
39
At 30 days, embryos had a rounded shape, without differentiation of cranial and
caudal regions. The onset of differentiation of these regions occurred after 40 days. At this
time, the head was observed, and with the onset of mineralization, the body was present with
a rib cage, spine and members. The conformation of non-transgenic and transgenic fetuses
remained similar and within normal limits throughout the study period.
At the abdominal cavity, the gastric compartments were visualized at 60 days as an
anechoic chamber at the cranial cavity of the abdomen. The liver showed an area between the
chest and abdomen with homogeneous echogenicity also at 60 days. The kidneys were located
using the rumen as a reference. The bladder was identified in the caudal part of abdomen. All
the organs both in non-transgenic and transgenic fetuses had normal echogenicity and
development during the study period.
In the chest, the heart development and its cardiac chambers were observed at 30 and
40 days of gestation as a small anechoic area showing intense movements. After the initial 50
days the heart chambers could be assessed with more details and four well-defined anechoic
areas were identified. The members were seen as small hyperechoic points at 40 days and
later on its development occurred by the formation of long bones.
The bony structures were identified as hyperechoic areas. The beginning of the
calcification began at 40 days with the mineralization of the skull and spine. At the same
period the face and the eyes were also observed. During the calcification of fetal bones with
50 days of pregnancy it was possible to clearly observe the orbits, ribs and long bones. The
two orbits were circular hypoechoic areas in the upper region of the skull. At 60 days all bony
structures were fully visualized.
Ultrasonographic fetometry
In transgenic and non-transgenic embryos/fetuses fetometry, all parameters measured
were within the normal range in the various gestational ages. The initial parameters measured
were DEV and CRL at days 30, 40, 50 and 60. The embryonic vesicle was characterized by a
circular area filled with anechoic fluid. Both DEV and CRL showed a progressive growth
(Fig. 1). However, due to fetus growth, it was not possible to identify and measure the
transverse plane of these parameters after this period.
40
Fig. 1. Fetometry results. (A) Diameter of embryonic vesicle,
vesicle, and (B) Crown
Crown-rump length of
embryos and fetuses of transgenic (T) and non-transgenic
non transgenic (NT) goats on days 30, 40, 50 and
60 of gestation.
Other parameters to monitor fetal growth during the second trimester of gestation were
evaluated. After the initial 50 days it was also possible to assess the DT, DA, DUC and DPL.
As expected, throughout pregnancy the fetuses grew. The DT, DA and DUC of the transgenic
and non-transgenic
transgenic fetuses are shown in Fig. 2A-C.
2A C. An increase with the advance of
pregnancy wass observed. The placentomes were not seen on days 30 and 40 (transrectal) but
were present at 50, 60, 90 and 120 days of pregnancy (transabdominal probe) (Fig. 2D). In
more advanced periods (120 days) there were greater numbers of placentomes, making the
observation
bservation of fetuses more difficult.
41
Fig. 2. Fetometry results. (A) Diameter of the thorax, (B) Diameter of the abdomen, (C)
Diameter of umbilical cord, and (D) Diameter of placentome of embryos and fetuses of
transgenic (T) and non-transgenic
transgenic (NT) goats on days 50, 60, 90 and 120 of gestation.
Viability of embryo/fetal
During the evaluation of embryo/fetal viability it was possible to assess fetal heart rate
(Fig. 3) and therefore to record it. At Day 30, the fetal heartbeat was detected, but its heart rate
was measured only after 40 days after fertilization. With the
the advance of gestation, there was a
decrease in the heartbeat up to the last sonographic evaluation made. Heart rate and fetal heart
rate were important for evaluation of fetal viability. All fetuses presented movements in all
ultrasound examinations. In the
he beginning of the pregnancy (30 days) these movements were
very discrete. At 40 days they were more frequent and even more intense at 50 days of
gestation. At 120 days the fetal movements compromised the fetal heart rate measurement.
42
Fetal heart rate (bpm)
300
250
200
150
FHR T
100
FHR NT
FHR
50
0
40
50
60
90
Days of gestation
120
Fig. 3. Fetal heart rate of embryos and fetuses of transgenic (T) and non-transgenic (NT)
goats on days 40, 50, 60, 90 and 120 of gestation. FHR: Karen et al. (2009).
Discussion
This is the first study that evaluates the embryonic/fetal development of transgenic
goats for hG-CSF by the use of real-time ultrasound evaluation. At 30 days after fertilization,
pregnancy diagnosis was carried out and the embryos were seen surrounded by the embryonic
vesicle with the presence of heartbeats. Martinez et al. [19], also used this technique to detect
pregnancy rate in Anglo-Nubian goats in the same period. Medan et al. [20] evaluated Shiba
goats daily and reported pregnancy more precocious, with the gestational sacs at 20 days and
embryos at 24 days of gestation.
The differentiation of the conceptus conformation in our study was observed at 40
days, similar to that reported by Ali and Hayder [3] in Ossimi ewes, who observed the head,
body and tail at 38 days of pregnancy. For Ali and Hayder [3] the accessibility of different
fetal organs and parts by ultrasonic exams depended on the day of pregnancy.
The anechoic cavity of the stomach could be visualized at 60 days of gestation. The
results are similar to those reported by Lega et al. [17] that identified the gastric
compartments from 55 to 57 days as an anechoic structure with invaginations in the lumen for
the differentiation of the four compartments of the ruminant stomach. Gonzalez-Bulnes et al.
[12] indicated that these compartments can be easily monitored after 50 days of gestation,
with a linear increase in diameter of up to 90 days. Other organs like liver, kidneys and
bladder, could be seen in the same period. Ali and Hayder [3] noticed the kidneys for the first
time at 73 days. Lega et al. [17] observed the bladder for the first time from 49 to 51 days,
43
showing an anechoic appearance and discreetly packed. These slight differences could be
related to the evaluated breed in each study.
In the present study we observed the heart as an anechoic area between the ribs,
divided by hyperechoic lines forming the four heart chambers. This is in agreement to what
was reported by Medan et al. [20].
The members were initially visualized at 40 days. This period is close to that was
previously reported, from 34 to 36 days of gestation [17]. The beginning of calcification of
the bone structure occurred at 40 days, with its increase at 60 days, first identifying the skull,
ribs and then the spine and long bones as previously described by Lega et al. [17]. Suguna et
al. [25] determined in cross-bred goats that the skull, rib cage and spine were seen for the first
time with 56 days and were detected up to 130 days. However, images were distorted and thus
were not measured. According to Medan et al. [20] after two months these structures and the
long bones could be clearly noted.
In our experiment we evaluated the time when it was possible to visualize the orbits
(50 days). Our results were similar to those found by Lega et al. [17] who determined it at 52
days. Lee et al. [16] working with Korean goats measured fetal orbits from 60 to 135 days of
gestation.
After 60 days, both the CRL and the DVE could not be completely visualized in the
monitor and thus measured, due to the fetus’ large size. The same time period was previously
observed in Ossimi sheep [3] or in Egyptian native goats [15]. In Santa Ines sheep embryonic
vesicle diameter was 25.6 mm (35 days) and 44.4 mm (45 days) [24]. Chalhoub et al. [7]
evaluated the average CRL of sheep fetuses and obtained results similar to ours at 30 (13.3
mm) and 40 days (33.1 mm) of pregnancy. Amer [4] reported a diameter of 36 mm (40 days)
in dairy goats. These values were also similar to those found by Abdelghafar et al. [1]
working with Saanen goats, at 53 (71.6 mm) and 60 days (94.7 mm).
Mean DT of transgenic goat fetuses was close to that earlier described by Lega et al.
[18] using Saanen goats. The mean values of DA were similar to those observed by Abreu et
al. [2] in Serrana goats on days 54 and 61 of gestation and Lega et al. [18] in 90 and 120 days
of gestation. Mean DCU of non-transgenic and transgenic goat fetuses were similar to those
reported by Lee et al. [16].
The placentomes were not detected at days 30 and 40. However, Ali and Hayder [3]
first identified them at 37 days as small areas slightly elevated on the surface of the
endometrium and with advancing pregnancy they became more echogenic and brighter.
Suguna et al. [25] first detected them at 42 days and suggested that the second month of
44
pregnancy is the best time to find these structures. Similarly, in our study after 50 days of
gestation it was possible to detect and measure them. Suguna et al. [25] determined similar
diameter (10 mm) as ours (9.96 mm). The diameter of the placentomes in this study grew
close to that found by Abreu et al. [2] with 54 and 61 days of gestation and Lega et al. [18] at
90 and 120 days of gestation.
The cardiac activity was within the normal range for all fetuses. In this study the fetal
heartbeat was detected at day 30 and fetal heart rate was measured at 40 days. Fetal heart rate
decreased as pregnancy progressed, the first observation at 40 days (T: 215.50 bpm; NT:
239.50 bpm) and the last at 120 days (T: 196.25 bpm; NT: 170 bpm). Lega et al. [17] reported
that it was only possible to measure it after 37 days of gestation, using a mechanical sector
transducer and/or linear with frequency of 5.0 MHz and the values ranged from 208 to 226
bpm after this period. Some authors have detected about 22 to 24 days of gestation [20,22].
The decrease in fetal heart rate was also observed by Karen et al. [15] and Suguna et al. [25].
The ultrasound exams allowed the identification of the heart rate and fetal movements, which
are reliable parameters to check fetus viability [4]. Thus, all transgenic and non-transgenic
goat fetuses were viable throughout the gestational period.
The transgenic goat embryos and fetuses for human Granulocyte Colony Stimulating
Factor (hG-CSF) remained viable and showed growth similar to the non-transgenic ones
during pregnancy. Therefore, the integration of exogenous gene in the genome of these
animals does not compromise embryo or fetal development during the period evaluated.
Acknowledgments
The authors are grateful to the Laboratory of Physiology and Control of Reproduction
(LFCR), for taking the space, equipment and animals. We also thank the LFCR staff for
helping during our experiment. C.R.G.S. Oliveira is a recipient of a grant from the Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brazil). This research was
supported by grants from CNPq, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) and Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento (FUNCAP).
45
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48
7. CONCLUSÕES
Com a utilização da ultrassonografia, foi possível avaliar que os conceptos caprinos
transgênicos para o hG-CSF permaneceram viáveis e apresentaram um crescimento similar
aos não transgênicos durante o período gestacional. Assim, a presença do gene exógeno no
genoma desses animais não comprometeu o desenvolvimento embrionário/fetal durante o
período avaliado.
49
8. PERSPECTIVAS
Após a observação da normalidade no crescimento e na viabilidade dos conceptos
transgênicos para o hG-CSF durante o período gestacional, são necessários outros
experimentos para avaliar o desenvolvimento e o bem-estar dessa linhagem, acompanhando
durante os diversos momentos da vida desses animais, como no nascimento, na puberdade e
na fase adulta.
50
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55
ZHANG, J.; LIN, L.; YINFENG, C.; XUJUN, X.; JUAN, C.; YOUBING, W. B.; HUIQING,
Y.; GUOHUA, Y.; SIGUO, L.; AIMIN, Z.; JIANQUAN, C.; GUOXIANG C. Expression of
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APÊNDICES
1.1.APÊNDICE A
56
RESUMO PUBLICADO: Anais do XXI Congresso Brasileiro de Zootecnia (Meio de
divulgação-digital), 2011.
Avaliação do crescimento embrionário de caprinos transgênicos para o hG-CSF por
meio da ultrassonografia em tempo real
OLIVEIRA, C. R. G. S.; BATISTA, R. I. T. P.; SOUZA, J. M. G.; MELO, C. H. S.; MELO,
L. M.; PEREIRA, A. F.; FREITAS, V. J. F.; TEIXEIRA, D. Í. A.
Resumo: Para aplicação da transgênese a nível comercial torna-se relevante a avaliação da
normalidade dos parâmetros fisiológicos de animais transgênicos. O objetivo deste estudo foi
comparar os parâmetros embrionários de caprinos transgênicos ou não até os 40 dias de
gestação. Foram utilizados um macho transgênico para o Fator Estimulante de Colônias de
Granulócitos humano (hG-CSF) e 17 cabras não transgênicas, submetidas à sincronização do
estro para Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) e repasse com Monta Natural
Controlada (MNC). A taxa de gestação aos 30 dias foi de 50,0%. Quatro caprinos
transgênicos (2 machos e 2 fêmeas) e 2 machos não transgênicos foram obtidos. Exames
ultrassonográficos foram realizados aos 30 e 40 dias após a primeira IATF ou MNC,
utilizando um transdutor linear bifrequencial (6/8 MHz) para mensurar o diâmetro da vesícula
embrionária (DVE) e o comprimento crânio caudal (CCC) dos embriões. Não houve diferença
significativa no DVE aos 30 e 40 dias, para caprinos transgênicos (34,09 ± 1,94; 45,81 ±
4,60 mm) ou não transgênicos (34,02 ± 4,45; 47,34 ± 4,63 mm), respectivamente. O CCC
também foi semelhante (P>0,05) aos 30 e 40 dias de gestação para os transgênicos (14,84 ±
0,71; 29,37 ± 0,79 mm) ou não transgênicos (14,52 ± 0,86; 23,98 ± 2,49 mm),
respectivamente. Os caprinos transgênicos e não transgênicos apresentam crescimento similar
até os 40 dias da fase embrionária.
Palavras–chave: Canindé. Comprimento crânio caudal. Mensuração fetal. Transgênese.
Vesícula embrionária.
Evaluation of embryonic grow of transgenic goats for hG-CSF through the use of real
time ultrasound
57
Abstract: For the commercial use of transgenesis it is important to assess the normality of
physiological parameters in transgenic animals. The aim of this study was to compare
embryonic parameters up to 40 days of pregnancy. A transgenic male for human Granulocyte
Colony Stimulating Factor (hG-CSF) and 17 non-transgenic does were used. Females were
submitted to estrous synchronization treatment to perform timed artificial insemination (TAI)
and later with controlled natural breeding (CNB). Pregnancy rate at 30 days was 50.0%. Four
transgenic goats (two males and two females) and two non-transgenic males were obtained.
Ultrasound examinations were performed at 30 and 40 days after the first TAI or CNB, using
a bifrequencial linear transducer (6/8 MHz) in order to measure the embryonic vesicle
diameter and crown-rump-length. There was no significant difference on the embryonic
vesicle at 30 and 40 days between transgenic (34.09±1.94; 45.81±4.60 mm) and nontransgenic (34.02 ± 4.45; 47.34 ± 4.63 mm) goats, respectively. The crown-rump-length was
also similar (P>0.05) at 30 and 40 days between transgenic (14.84 ± 0.71; 29.37 ± 0.79 mm)
and non-transgenic (14.52 ± 0.86; 23.98 ± 2.49 mm) goats, respectively. The transgenic and
non-transgenic goats have similar growth to 40 days of embryonic fase.
Keywords:
Canindé.
Crown-rump-length.
Embryonic
vesicle.
Fetal
measurement.
Transgenesis.
Introdução
Nos últimos anos, os caprinos vêm sendo utilizados como modelo para a produção de
proteínas recombinantes de origem humana. Neste contexto, a transgênese animal tem
ocupado um papel de destaque nos avanços da biotecnologia (Houdebine, 2005). Um exemplo
disso é a recente obtenção de caprinos da raça Canindé que produzem o
Fator Estimulante de Colônias de
Granulócitos humano (hG-CSF) por Freitas et al. (2010). Para se garantir o uso destes animais
como biorreatores, a avaliação de sua sanidade torna-se imprescindível. Diante disso, muitos
estudos têm avaliado parâmetros fisiológicos relativos à sanidade e reprodução destes
animais. Este estudo tem como objetivo comparar o diâmetro da vesícula embrionária (DVE)
e o comprimento crânio caudal (CCC) de embriões caprinos transgênicos com não
transgênicos até 40 dias, utilizando a ultrassonografia em tempo real.
Material e Métodos
58
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética de Uso de Animais da Universidade
Estadual do Ceará (CEUA/UECE, n° 10244447-1/24). Utilizou-se um macho da raça Canindé
transgênico (T) para o hG-CSF como doador de sêmen para Inseminação Artificial em Tempo
Fixo (IATF) e Monta Natural Controlada (MNC) e 17 cabras não transgênicas (NT) da
mesma raça. As cabras receberam esponjas intravaginais contendo 60 mg de acetato de
medroxiprogesterona (Progespon®, Schering Plough, São Paulo, Brasil) por 10 dias. No
oitavo dia, administrou-se 75 µg cloprostenol (Prolise®, Arsa S.R.L, Buenos Aires, Argentina)
i.m. e 200 UI de gonadotrofina coriônica equina (Novormon®, Schering Plough, São Paulo,
Brasil) i.m. Às 24 h após a retirada da esponja, as fêmeas receberam 100 µg de GnRH
(Fertagyl®, Boxmeer, Holanda) i.m. As cabras foram divididas aleatoriamente em quatro
grupos para distribuição das ultrassonografias: Grupo 1 (n=5), Grupo 2 (n=4), Grupo 3 (n=4)
e Grupo 4 (n=4). O intervalo para o início da sincronização de um grupo ao outro foi de três
dias. Foi realizada a detecção do estro duas vezes ao dia (08:00 e 18:00 h), com início 12 h
após a retirada da esponja. As fêmeas foram inseminadas artificialmente por via transcervical,
com sêmen a fresco, envasado em palhetas de 0,25 mL na concentração de 100x106
espermatozóides por dose. A primeira e a segunda IATF ocorreram no período de 30 e 50 h
respectivamente, após a retirada da esponja. A detecção de estro foi novamente realizada em
todas as fêmeas não gestantes aos 30 dias após a IATF, a fim de serem acasaladas com o
macho transgênico. O dia da primeira IATF e o da MNC foram considerados o dia zero (D0)
da gestação. Os exames ultrassonográficos foram realizados por via transretal, aos 30 e 40
dias após a primeira IATF e MNC, utilizando um equipamento de ultrassonografia Falco 100®
(Pie Medical, Maastricht, Holanda), acoplado a um transdutor linear (6/8 MHz). As imagens
foram gravadas para posterior mensuração do diâmetro da vesícula embrionária (DVE) e o
comprimento crânio caudal (CCC). O DVE foi mensurado no seu eixo transversal maior. O
CCC foi determinado por uma linha traçada da parte anterior do crânio (osso occipital) até a
cauda (primeira vértebra coccígea). Após o parto, os transgênicos foram detectados pela
técnica de PCR. A partir da obtenção dos resultados, as imagens foram divididas em
sonogramas de animais transgênicos e não-transgênicos. Os dados estão apresentados em
média ± erro padrão, as médias foram comparadas pelo teste χ2.
Resultados e Discussão
59
A
maior
parte
das
cabras
(15/17)
apresentou
comportamento
de
estro.
Independentemente da ocorrência de estro, todas as fêmeas foram submetidas à IATF.
Durante o processo de detecção de estro para encaminhar as fêmeas à MNC, três cabras
apresentaram ciclo estral curto, em média de sete dias. Estes três animais foram retirados do
experimento. A taxa de gestação total aos 30 dias foi de 50,0% (7/14), considerando a IATF e
MNC. Em duas fêmeas ocorreu reabsorção embrionária e uma cabra foi retirada da análise
dos dados por possuir gestação tripla e dificultar na diferenciação de cada feto. Das quatro
cabras restantes, duas apresentaram gestações duplas e duas gestações simples. A duração da
gestação foi de 148,0 ± 1,4 dias. Após a técnica de PCR foram identificados quatro caprinos
transgênicos (dois machos e duas fêmeas) e dois machos não transgênicos. Durante a
avaliação dos sonogramas, observou-se que as imagens dos embriões apresentaram uma
ecogenicidade normal para a idade avaliada. Não houve diferença significativa no diâmetro da
vesícula embrionária aos 30 e 40 dias, para caprinos transgênicos (34,09 ± 1,94; 45,81 ±
4,60 mm) ou não transgênicos (34,02 ± 4,45; 47,34 ± 4,63 mm), respectivamente (Figura 1).
Ramos et al. (2007) mensuraram esse parâmetro em seus eixos horizontais e verticais, os
valores correspondentes aos 35 e 45 dias são de 25,60 ± 3,10 e 44,4 ± 5,80, respectivamente.
Em nosso trabalho mensuramos o seu eixo transversal maior. O comprimento crânio caudal
também foi semelhante (P>0,05) aos 30 e 40 dias de gestação para os transgênicos (14,84 ±
0,71; 29,37 ± 0,79 mm) ou não transgênicos (14,52 ± 0,86; 23,98 ± 2,49 mm),
respectivamente (Figura 2). Esses valores foram próximos aos encontrados por Chalhoub et
al. (2001), onde 13,3 ± 1,86 e 33,1 ± 4,45 mm correspondem a 30 e 40 dias após a
fecundação, respectivamente. Amer (2010) relatou que o comprimento crânio caudal aos 40
dias foi de 35,90 ± 1,60 mm. As pequenas diferenças nas mensurações podem ser devido às
diferentes raças.
Diâmetro da Vesícula
Embrionária (mm)
50
40
30
T
20
NT
10
0
30
40
Dias de Gestação
60
Figura 1 Diâmetro da vesícula embrionária (mm) fetal dos caprinos transgênicos (T) e não
Comprimento Crânio Caudal
(mm)
transgênicos (NT) nos dias 30 e 40 de gestação.
50
40
30
20
T
10
NT
0
30
40
Dias de Gestação
Figura 2 Comprimento Crânio Caudal (mm) fetal dos caprinos transgênicos (T) e não
transgênicos (NT) nos dias 30 e 40 de gestação.
Conclusões
Os embriões caprinos transgênicos para o Fator Estimulante de Colônias de
Granulócitos humano apresentaram o crescimento similar aos dos não transgênicos durante o
período embrionário. Isso mostra que a integração do gene exógeno no genoma desses
animais não interferem seu desenvolvimento embrionário.
Literatura citada
AMER, H. A. Ultrasonographic assessment of early pregnancy diagnosis, fetometry and sex
determination in goats. Animal Reproduction Science, v. 117, p. 226-231, 2010.
CHALHOUB, M.; LOPES, M. D.; PRESTES, N. C.; RIBEIRO FILHO, A. L. Perfil ultrasonográfico do crescimento embrionário/fetal ovino do 21º ao 41º dia de gestação. Revista
Brasileira de Saúde e Produção Animal, v. 2, p. 65-68, 2001.
FREITAS, V. J. F.; TEIXEIRA, D. Í. A.; MELO, L. M.; LOPES JÚNIOR, E. S.; MOURA, R.
R.; PEREIRA, A. F.; SOUSA, F. C.; ALMEIRA, K. C.; AVELAR, S. R. G.; CAJAZEIRAS,
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61
HOUDEBINE, L. M. Use of transgenic animals to improve human health and animal
production. Reproduction in Domestic Animals, v. 40, p. 269-281, 2005.
RAMOS, A. K. M.; NEVES, J. P.; Mc MANUS, C.; LUCCI, C. M.; CARNEIRO, H. C. R.;
AMARAL, R. S. Avaliação dos parâmetros ecográficos de desenvolvimento gestacional de
ovinos da raça Santa Inês. Ciência Animal Brasileira, v. 8, p. 537-543, 2007.
1.2.APÊNDICE B
RESUMO PUBLICADO: Anais da 48ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia
(Meio de divulgação-digital), 2011.
Fetometria e batimentos cardíacos fetais entre os dias 50 e 120 de gestação em caprinos
transgênicos para o hG-CSF
OLIVEIRA, C. R. G. S.; TELES FILHO, A. C. A.; MELO, L. M.; PEREIRA, A. F.;
FREITAS, V. J. F.; TEIXEIRA, D. Í. A.
Resumo: Objetivo deste trabalho foi avaliar a fetometria e os batimentos cardíacos fetais
entre os dias 50 e 120 de gestação. Com a obtenção de quatro gestações de cabras não
transgênicas (NT) a partir da fecundação (IATF e monta natural controlada) com o macho
transgênico (T) para o hG-CSF, foram realizados exames ultrassonográficos das gestações,
com um equipamento de ultrassonografia Falco 100® (Pie Medical, Maastricht, Holanda),
acoplado a um transdutor convexo (3,5/5,0 MHz). Foi considerado o D0 o dia da primeira
IATF ou da monta natural controlada. Os exames ultrassonográficos foram realizados por via
transabdominal, nos dias 50, 60, 90 e 120 dias de gestação. As imagens foram gravadas para
posterior avaliação do desenvolvimento fetal e mensuração do diâmetro do tórax (DT),
diâmetro do abdome (DA), diâmetro do cordão umbilical (DCU), diâmetro dos placentomas
(PLAC) e os batimentos cardíacos fetais (BCF). Foi verificada a normalidade do crescimento
e a diferenciação de alguns órgãos, assim como a formação esquelética. Em todos os
parâmetros avaliados, os fetos caprinos transgênicos e não transgênicos apresentaram um
desenvolvimento dentro da normalidade nas diversas idades gestacionais. Os valores médios
do DT, DA, DCU e diâmetro dos placentomas apresentaram um aumento gradativo com o
avançar da gestação. A atividade cardíaca foi normal para todos os fetos. Os batimentos
cardíacos fetais diminuíram à medida que avançou a gestação, da primeira observação (T:
213,75 bpm; NT: 241,50 bpm) até a última (T: 196,25 bpm; NT: 170 bpm). Os fetos caprinos
62
transgênicos para o hG-CSF permaneceram viáveis e com um crescimento similar aos dos não
transgênicos, durante o período avaliado.
Palavras-chave: Feto. Transgênese. Ultrassonografia.
Fetometria and fetal heart rate between 50 and 120 days of gestation in transgenic goats
with hG-CSF
Abstract: This study aimed to evaluate the fetometry and fetal heart rate between 50 and 120
days of gestation. With the acquisition of four pregnancies in goats non-transgenic (NT) from
fertilization (TAI and controlled natural mating) with the male transgenic (T) for the hG-CSF
was conducted ultrasound examinations of pregnant does with an ultrasound machine Falco®
100 (Pie Medical, Maastricht, Netherlands) coupled to a transducer (3.5/5.0 MHz). D0 was
considered the first day of TAI or controlled natural mating. The ultrasound examinations
were performed by transabdominal ultrasound on days 50, 60, 90 and 120 days of gestation.
Images were recorded for further evaluation of fetal development and measurement of the
diameter of the thorax (DT), abdominal diameter (AD), the umbilical cord diameter (UCD),
diameter of placentomes (PLAC) and the fetal heart rate (FHR). It was verified the normal
growth and differentiation of some organs, as well as the complete formation of the skeleton.
In all parameters, fetuses and transgenic non-transgenic goats were within normal
development in the various gestational ages. The average values of DT, AD, UCD and
diameter of placentomes showed a gradual increase with advancing gestation. The cardiac
activity was normal in all fetuses. Fetal heart rate decreased as pregnancy progressed, the first
observation (T: 213.75 bpm; NT: 241.50 bpm) until the last (T: 196.25 bpm; NT: 170 bpm).
Fetuses transgenic goats with hG-CSF and remained viable with a growth similar to those of
non-transgenic, during the study period.
Keywords: Fetus. Transgenesis. Ultrasonography.
Introdução
Após a recente obtenção de caprinos da raça Canindé, transgênicos para o Fator
Estimulante de Colônias de Granulócitos humano (hG-CSF) (Freitas et al., 2010), é necessária
a avaliação dos aspectos sanitários e reprodutivos e do bem-estar desses animais, quando se
63
pretende utilizá-los futuramente com biorreatores (Jackson et al., 2010). Com isso, objetivo
desse trabalho foi avaliar o comprimento fetal e os batimentos cardíacos fetais de caprinos
transgênicos no terço final da gestação, utilizando a ultrassonografia em tempo real.
Material e Métodos
O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética de Uso de Animais da
Universidade Estadual do Ceará (CEUA/UECE, n° 10244447-1/24). Com a obtenção de
quatro gestações de cabras não transgênicas (NT) a partir da fecundação com o macho
transgênico (T) para o hG-CSF. Foi iniciado um controle ultrassonográfico das gestações,
utilizando um equipamento de ultrassonografia Falco 100® (Pie Medical, Maastricht,
Holanda), acoplado a um transdutor convexo bifrequencial (3,5/5,0 MHz). Os exames
ultrassonográficos foram realizados por via transabdominal, nos dias 50, 60, 90 e 120 de
gestação, sendo considerado o dia da primeira IATF ou da MNC como dia zero (D0). As
imagens foram gravadas para posterior avaliação do desenvolvimento fetal, com observação
da atividade cardíaca e das características anatômicas do feto, além da formação do esqueleto.
Foi realizada a mensuração do diâmetro do tórax (DT), diâmetro do abdome (DA), diâmetro
do cordão umbilical (DCU), diâmetro dos placentomas (PLAC). Por meio das imagens, todas
as variáveis formam mensuradas utilizando o programa Image J, mediante prévia calibração.
A cada exame foi considerada a média do diâmetro de quatro placentomas localizados em
diferentes áreas do útero. A atividade cardíaca foi caracterizada pela observação de pequenos
focos de ecos tremulando rapidamente no feto. A freqüência cardíaca fetal foi avaliada
durante todos os exames ultrassonográficos. Após o parto, os transgênicos foram detectados
pela técnica de PCR. A partir da obtenção dos resultados, as imagens foram divididas em
sonogramas de animais transgênicos e não-transgênicos. Os dados estão apresentados em
média ± erro padrão.
Resultados e Discussão
Durante todas as avaliações ultrassonográficas foi observado que os fetos caprinos
transgênicos assim como os não transgênicos, apresentaram um desenvolvimento normal e
progressivo. Foi possível avaliar a diferenciação dos órgãos. O esqueleto fetal estava em
formação na primeira avaliação e à medida que se desenvolviam a mineralização das
estruturas aumentava até sua total formação. Após a técnica de PCR foram identificados
64
quatro caprinos transgênicos (dois machos e duas fêmeas) e dois machos não transgênicos.
Em todos os parâmetros avaliados, foi observado que os fetos caprinos transgênicos e não
transgênicos apresentaram-se dentro da normalidade nas diversas idades gestacionais (50, 60,
90 e 120). Podemos observar na Figura 1 que os valores médios do DT, DA, DCU (Figura
1A) e diâmetro dos placentomas (Figura 1B), para os fetos caprinos transgênicos
apresentaram um aumento gradativo sendo similares aos fetos não transgênicos. Os valores
médios do diâmetro do abdome, para fetos caprinos transgênicos como observado por Abreu
et al. (2007), nos dias 54 e 61 de gestação e por Léga et al. (2007) nos dias 90 e 120 de
gestação apresentavam-se dentro da normalidade. As médias do diâmetro do tórax dos fetos
caprinos transgênicos foram próximas às encontradas por Léga et al. (2007) e as médias do
diâmetro do cordão umbilical foram similares as mensuradas por Lee et al. (2005).
O diâmetro dos placentomas apresentaram um crescimento homólogo ao encontrado
por Abreu et al. (2007) com 54 e 61 dias de gestação e por Léga et al. (2007) nos dias 90 e
120 de gestação. A atividade cardíaca foi normal para todos os fetos. As médias do batimento
cardíaco fetal em nosso estudo diminuíram à medida que se aproximou o momento do parto,
variando de 213,75 e 241,50 batimentos por minuto (bpm) para os fetos caprinos transgênicos
e não transgênicos, respectivamente, na primeira avaliação. Na última observação a média foi
de 196,25 bpm para os transgênicos e 170,00 bpm para os não transgênicos, estando dentro da
normalidade (Karen et al., 2009).
Figura 1. Fetometria (A) e diâmetro dos placentomas (B) dos fetos caprinos transgênicos (T) e
não transgênicos (NT) nos dias 50, 60, 90 e 120 de gestação. Onde: DA, diâmetro do abdome,
DT, diâmetro do tórax, DCU, diâmetro do cordão umbilical e PLAC, diâmetro dos
placentomas.
Conclusões
65
Os fetos caprinos transgênicos para o hG-CSF permaneceram viáveis e com um
crescimento similar aos dos não transgênicos, durante o terço final da gestação. Contudo,
integração do gene exógeno no genoma desses animais não interferem no desenvolvimento
fetal e a utilização da ecografia mostrou ser uma ferramenta útil para avaliação desses
animais, durante o período gestacional.
Literatura citada
ABREU, D.; ALMEIDA, J. C.; SILVA, S.; AZEVEDO, J.; FONTE, P.; SIMÕES, J.
Estimativa da idade fetal por ultra-sonografia em cabras da raça Serrana. Revista electrónica
de Veterinaria, v. 8, p. 1-6, 2007.
FREITAS, V. J. F.; TEIXEIRA, D. Í. A.; MELO, L. M.; LOPES JÚNIOR, E. S.; MOURA, R.
R.; PEREIRA, A. F.; SOUSA, F. C.; ALMEIRA, K. C.; AVELAR, S. R. G.; CAJAZEIRAS,
J. B.; DIAS, L. P. B.; DVORYANCHIKOV, G. A.; ANDREEVA, L. E.; SEROVA, I. A.;
SEROV, O. L. Generation of transgenic naturalized goats producing human granulocytecolony stimulating factor (hG-CSF) in Brazil. Abstracts from the UC Davis Transgenic
Animal Research Conference VII In: Transgenic Animal Research, v. 19, p. 146.
JACKSON, K. A.; BERG, J. M.; MURRAY, J. D.; MAGA, E. A. Evaluating the fitness of
human lysozyme transgenic dairy goats: growth and reproductive traits. Transgenic
Research, v. 19, n. 6, p. 977-986, 2010.
KAREN, A. M.; FATTOUH, E. M.; ABU-ZEID, S. S. Estimation of gestational age in
Egyptian native goats by ultrasonographic fetometry. Animal Reproduction Science, v. 114,
p. 167-174, 2009.
LEE, Y.; LEE, O.; CHO, J. SHIN, H.; CHOI, Y.; SHIM, Y.; CHOI, W.; SHIN, H.; LEE, D.;
LEE, G.; SHIN, S. Ultrasonic Measurement of Fetal Paramenters for Estimation of
Gestational Age in Korean Black Goats. The Journal of Veterinary Medical Science, v. 67,
p. 497-502, 2005.
LÉGA, E.; TONIOLLO, G. H.; OLIVEIRA, J. A.; RESENDE, K. T.; RODRIGUES, V.
Determinação da idade fetal por meio da técnica ultra-sonográfica de fetometria e de
morfologia fetal em cabras. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.
59, p. 851-856, 2007.
1.3. APÊNDICE C
RESUMO PUBLICADO: Anais da XXV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Tecnologia de Embriões (Acta Scientiae Veterinariae), pág. 458, 2011.
66
Perfil ultrassonográfico do crescimento embrionário/fetal de caprinos transgênicos para
o hG-CSF
TEIXEIRA, D. Í. A.; OLIVEIRA, C. R. G. S.; MELO, C. H. S.; TELES FILHO, A. C. A.;
BATISTA, R. I. T. P.; SOUZA, J. M. G.; PEREIRA, A. F.; MELO, L. M.; FREITAS, V. J. F.
Caprinos transgênicos devem ser avaliados quanto ao seu desenvolvimento embrionário/fetal,
podendo ser usada como ferramenta a ultrassonografia em tempo real. O objetivo do estudo
foi avaliar o desenvolvimento morfológico e morfométrico de embriões e fetos caprinos
transgênicos para o fator estimulante de colônias de granulócito humano (hG-CSF). O projeto
foi aprovado pelo comitê de ética e biossegurança da UECE. Foram utilizadas quatro cabras
não transgênicas gestantes após acasalamento com o macho transgênico da raça Canindé.
Exames ultrassonográficos (Falco 100®, Pie Medical, Maastricht, Holanda) foram realizados
aos 30 e 40 dias (via transretal, transdutor linear, 6,0/8,0 MHz) e aos 50, 60, 90 e 120 dias de
gestação (via transabdominal, transdutor convexo, 3,5/5,0 MHz). As imagens foram gravadas
para posterior avaliação do desenvolvimento gestacional e parâmetros embrionários e fetais,
como frequência cardíaca (FC), movimentos do concepto, diâmetro da vesícula embrionária
(DVE), comprimento crânio caudal (CCC), diâmetro do tórax (DT), do abdome (DA), do
cordão umbilical (DCU) e dos placentomas (PLAC). As imagens foram mensuradas pelo
programa Image J (National Institutes of Health, Millersville, EUA), com prévia calibração
para cada frequência. Foram ainda avaliados os aspectos morfológicos, como formação do
esqueleto e coração. Quatro caprinos transgênicos (dois machos e duas fêmeas) além de dois
machos não transgênicos foram obtidos após análise de PCR. A partir deste momento, foram
separados os sonogramas dos animais transgênicos e não transgênicos. Em todos os conceptos
a FC decresceu ao longo da gestação. Os movimentos dos conceptos estiveram presentes em
todos os exames, sendo mais discretos no início e mais evidentes a partir de 50 dias de
gestação. O DVE e o CCC foram avaliados nos dias 30, 40, 50 e 60. Foi observado que os
conceptos cresceram gradualmente, sendo necessária a avaliação de outros parâmetros para
acompanhar o crescimento na fase final. A partir dos 50 dias foi possível avaliar também o
DT, DA, DCU, PLAC. Ao longo da gestação, os conceptos cresceram conforme o esperado,
com um maior desenvolvimento no seu terço final. A formação total das estruturas ósseas se
deu aos 60 dias, com áreas hiperecóicas formando o crânio, caixa torácica, coluna vertebral e
ossos longos. Aos 30 e 40 dias de gestação, o coração apareceu como uma pequena área
67
anecóica e com movimentos intensos. A partir dos 50 dias já foi possível avaliar as câmaras
cardíacas, consistindo em quatro áreas anecóicas bem delimitadas. Os embriões e fetos
caprinos transgênicos apresentaram um desenvolvimento morfológico similar aos não
transgênicos e permaneceram viáveis durante o período avaliado.
Palavras-chave: Caprino. hG-CSF. Transgênese.
Ultrasonographic profile of embryonic/fetal growth of transgenic goats for hG-CSF
Transgenic goats should be evaluated by their embryonic/fetal growth, what could be done by
real time ultrasonography. The aim of the study was to evaluate the morphological and
morphometric development of transgenic goat embryos and fetuses for human Granulocyte
Colony Stimulating Factor (hG-CSF). The project was approved by the ethics committee and
biosafety of UECE. Four non-transgenic goats pregnant after mated by the transgenic Canindé
male were used. Ultrasonographic exams (Falco 100®, Pie Medical, Maastricht, Netherlands)
were performed at 30 and 40 days (transrectal via, linear array transducer, 6.0/8.0 MHz) and
at 50, 60, 90 and 120 days of pregnancy (transabdominal via, convex transducer, 3.5/5.0
MHz). Images were recorded for posterior evaluation of gestational development and
embryonary and fetal parameters such as Heart Rate (HR), conceptus movement, Embryonic
Vesicle Diameter (EVD), Crown-Rump Length (CRL), Diameter of Thorax (DT), Abdome
(DA), Umbilical Cord (DUC) and Placentomes (DP). Images were measured by the Image J
software (National Institutes of Health, Millersville, EUA), with prior calibration for each
frequency. Morphological aspects such as formation of skeleton and heart were also assessed.
Four transgenic goats (two males and two females) besides two non-transgenic males were
obtained after PCR analysis. After this moment, transgenic and non-transgenic sonograms
were separated. In all conceptus the HR decreased during pregnancy. The movements of fetus
were present in all exams, being less intense in the beginning and more evident after 50 days
of pregnancy. EVD and CRL were evaluated at 30, 40, 50 and 60 days. It was observed that
conceptus gradually grew, and the evaluation of other parameters was necessary to better
follow the growth in the final stage. After the 50 initial days it was also possible to evaluate
the DT, DA, DUC and DP. During the pregnancy, all fetuses grew as expected, with a higher
development on the final third of pregnancy. Bone structures development occurred at 60
days, with hiperechoic areas forming the skull, thorax, spine and long bones. At 30 and 40
days of pregnancy, the heart appeared as a small anechoic area and with intense movements.
68
After 50 days it was already possible to evaluate the cardiac chambers, consisting in four
anechoic well defined areas. Transgenic goats embryo and fetuses showed a morphologic
development similar to the non-transgenic ones and remained viable during all period
evaluated.
Keyword: Transgenic. Goat. hG-CSF.
1.4. APÊNDICE D
RESUMO PUBLICADO: Anais da XXV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Tecnologia de Embriões (Acta Scientiae Veterinariae), pág. 434, 2011.
Constituição de uma linhagem caprina transgênica para o hG-CSF a partir de macho
fundador e detecção da idade à puberdade em F1
BATISTA, R. I. T. P; SOUZA, J. M. G.; OLIVEIRA, C. R. G. S.; ALMEIDA, T. M.;
VIEIRA, M. P.; MELO, C. H. S.; ALBUQUERQUE, E. S.; LUCIANO, M. C. S.; FELIX, J.
B.; MELO, L. M.; PEREIRA, A. F.; TEIXEIRA, D. Í. A.; FREITAS, V. J. F.
A crescente demanda mundial pelo Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos humano
(hG-CSF) estimulou nosso laboratório a produzir caprinos transgênicos com este gene (Freitas
et al., 2010; Transgenic Res., 19, 146). A partir do nascimento dos fundadores, obtidos por
microinjeção pró-nuclear, a meta iminente foi à constituição de um rebanho transgênico para
a produção da proteína em escala comercial. Os objetivos deste estudo foram: a) obter
caprinos transgênicos a partir do macho fundador e b) determinar a idade à puberdade da
progênie (F1). Para tanto, sete fêmeas da raça Canindé, não transgênicas, foram fecundadas
pelo macho transgênico fundador. A caracterização de F1, quanto à presença do gene
exógeno, foi realizada por PCR convencional. Todos os animais receberam aleitamento
natural e suplementação com concentrado comercial e feno de Tifton até os três meses de
idade (desmame). A partir deste período, a detecção da puberdade foi realizada em machos e
fêmeas. Nos machos, o comportamento sexual foi avaliado semanalmente, utilizando uma
fêmea em estro, até o aparecimento do primeiro ejaculado contendo espermatozóides. Já nas
fêmeas foram realizadas colheitas semanais de soro sanguíneo para dosagem de progesterona
(P4). Nasceram um total de 12 crias, com uma taxa de transmissão do gene exógeno de 50,0%
69
(6/12), sendo a mesma proporção entre os sexos (três fêmeas e três machos). Quanto aos
animais não transgênicos nascidos, 66,7% (4/6) eram machos. Ao total, cinco crias
procedentes de duas gestações (uma tripla e outra dupla) nasceram mortos, destes, apenas um
era transgênico. As crias vivas permanecem saudáveis até o presente momento. Ambos os
machos transgênicos apresentaram espermatozóides móveis no ejaculado pela primeira vez
aos 144 dias de idade, quando pesavam 17,2 e 15,8 kg, o que representa 42,2 e 38,7% do peso
de macho Canindé adulto, respectivamente. Nos machos não transgênicos, o mesmo ocorreu
aos 119, 119 e 165 pesando 15,8, 12,6 e 13,6 kg, respectivamente. As fêmeas transgênicas
apresentaram níveis séricos de P4 >1 ng/mL (sugestivo de ovulação) aos 119 e 150 dias de
idade, estando com 48% (14,9 kg) e 58% (17,9 kg) do peso de uma cabra adulta da mesma
raça, respectivamente. Esses resultados são compatíveis com a média de idade à puberdade
das raças naturalizadas do Nordeste Brasileiro. Além disso, são indicativos de que a presença
do gene exógeno em F1, transmitida a partir do macho transgênico por herança Mendeliana,
não compromete a idade à puberdade, tanto em machos quanto em fêmeas.
Estudos
adicionais com um maior número de animais nascidos nessa linhagem, bem como a
verificação da fertilidade, são ainda necessários.
Palavras-chave: Caprinos. Puberdade. Transgênese.
Establishment of a hG-CSF transgenic goat line originated from a male founder and
detection of age at puberty in F1
The growing worldwide demand for human Granulocyte Colony Stimulating Factor (hGCSF) stimulated our laboratory to produce transgenic goats harboring this gene (Freitas et al.,
2010; Transgenic Res., 19, 146). From the birth of founders, obtained by pronuclear
microinjection, the imminent aim was the establishment of a transgenic herd for a commercial
scale production of the protein. The objectives of this study were: a) to obtain transgenic goats
from a male founder and b) to determine the age at puberty of the progeny (F1). For this,
seven non-transgenic Canindé females were fertilized by the transgenic founder male. The
characterization of F1, for the presence of foreign gene was performed by conventional PCR.
All animals received breastfeeding and supplementation with commercial concentrate and
Tifton hay until three months of age (weaning). Thereafter, the detection of puberty was
performed on both males and females. In males, sexual behavior was evaluated weekly, using
a female in estrus until the onset of the first ejaculate containing spermatozoa. In females,
70
blood samples were taken weekly to determine serum progesterone (P4). A total of 12 kids
were born, with a foreign gene transmission rate of 50.0% (6/12) and the same ratio sex (three
females and three males). Concerning the non-transgenic animals born, 66.7% (4/6) were
males. In total, five kids from two pregnancies (one triple and one double) were stillborn, one
of which was transgenic. The offspring born live remain healthy until now. Both transgenic
males had motile spermatozoa in the ejaculate for the first time at 144 days of age, with 17.2
and 15.8 kg, corresponding to 42.2 and 38.7% of the adult weight of an adult Canindé male,
respectively. Concerning the three non-transgenic males, the same found occurred at 119, 119
and 165 days, with 15.8, 12.6 and 13.6 kg, respectively. The transgenic females showed
serum levels of P4 > 1 ng/mL (suggestive of ovulation) at 119 and 150 days of age, being
48% (14.9 kg) and 58% (17.9 kg) of the adult weight of an adult Canindé female,
respectively. These results are consistent with the average age at puberty of naturalized breeds
in Northeast Brazil. Moreover, indicate that the presence of foreign gene in F1, transmitted
from the transgenic male thorough Mendelian inheritance, does not compromise the age at
puberty in both males and females. Additional studies with a greater number of animals born
in this line, as well as verification of fertility, are still needed.
Keyword: Goats. Puberty. Transgenesis.
1.5. APÊNDICE E
RESUMO PUBLICADO: Anais da XV Semana Universitária da Universidade Estadual do
Ceará (Meio de divulgação-digital), 2010.
Avaliação feto-placentária de animais transgênicos para o hG-CSF
OLIVEIRA, C. R. G. S.; BATISTA, R. I. T. P.; TELES FILHO, A. C. A.; MELO, C. H. S.;
MELO, L. M.; FREITAS, V. J. F.; TEIXEIRA, D. Í. A.
Atualmente, os caprinos estão sendo estão sendo utilizados como modelo para produção de proteínas
recombinante humana. Um exemplo é a recente obtenção da fêmea caprina da Raça Canindé que produz o
Fator
Estimulante de Colônias de Granulócitos humano (hG-CSF), o uso destes animais como
biorreatores sido questionada, quanto à saúde dos mesmos. Diante disso, muitos estudos têm
avaliado a normalidade dos parâmetros fisiológicos relativos à sanidade e reprodução destes
71
animais. Este trabalho tem como objetivo avaliar o desenvolvimento morfológico e
morfométrico de caprinos transgênicos para o hG-CSF, através do uso da ultrassonografia em
tempo real. Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética de Uso de Animais da
Universidade Estadual do Ceará (CEUA/UECE, n° 10244447-1/24). Um macho da raça
Canindé, transgênico para o hG-CSF será utilizado como doador de sêmen para Inseminação
Artificial em Tempo Fixo (IATF). Dezessete cabras adultas da raça Canindé serão submetidas
à sincronização do estro com o uso de esponjas intravaginais impregnadas com 60 mg de
acetato de medroxiprogesterona (MAP, Progespon, Syntex, Buenos Aires, Argentina), por 10
dias, associado a uma injeção i.m. de 75 µg cloprostenol (Prolise, Buenos Aires, Argentina) e
de 200 UI de Gonadotrofina Coriônica Eqüina - eCG (Novormon, Buenos Aires, Argentina)
por via i.m., no oitavo dia de tratamento progestágeno. Vinte e quatro horas após a retirada da
esponja receberão um injeção i.m. de 100 µg de GnRH (Fertagyl, Boxmeer, Holanda). As
fêmeas serão
divididas
aleatoriamente
em quatro
grupos para
distribuição
das
ultrassonografias, no Grupo 1 (n=5), Grupo 2 (n=4), Grupo 3 (n=4) e Grupo 4 (n=4). O
intervalo para o início da sincronização de um grupo a outro será de 3 dias. Mesmo utilizando
IATF será feita a detecção do início do estro, com monitoração três vezes ao dia (6:00, 12:00
e 18:00 h), com início 12 h após a retirada da esponja. As fêmeas serão inseminadas
artificialmente, com sêmen a fresco, envasado em palhetas de 0,25 ml na concentração de
200x106 espermatozóides por dose. A primeira e a segunda IATF ocorrerão no período de 30
e 50h respectivamente, após a retirada da esponja. O dia da primeira IATF será considerado o
dia zero (D0) da gestação. Após a parição as crias serão submetidas ao teste de DNA para
detecção dos animais transgênicos. A partir da obtenção dos resultados, as imagens obtidas
anteriormente serão divididas em sonogramas de animais transgênicos e não-transgênicos. Os
exames ultrassonográficos serão realizados a partir do 20° dia após a primeira IATF até o
período de 120 dias de gestação, utilizando o equipamento de ultrassonografia Falco 100,
acoplado a um transdutor linear (6/8 MHz) e um convexo (3,5 MHz). Serão determinadas a
sexagem fetal e a frequência cardíaca fetal em tempo real. Nas imagens gravadas, o diâmetro
da vesícula embrionária (DVE) e o comprimento crânio-caudal (CCC), o diâmetro biparietal
(DBP), do tórax (DT), do abdome (DA) e dos placentomas do embrião/feto serão mensurados
usando um software computacional.
Palavras-chave: Caprinos. hG-CSF. Ultrassonografia.
1.6. APÊNDICE F
72
RESUMO PUBLICADO: Anais da XV Semana Universitária da Universidade Estadual do
Ceará (Meio de divulgação-digital), 2010.
Constituição e caracterização de uma linhagem caprina transgênica para o hG-CSF a
partir de macho fundador: resultados preliminares
BATISTA, R. I. T. P.; OLIVEIRA, C. R. G. S.; MELO, C. H. S.; SOUZA, J. M. G.; MELO,
L. M.; TEIXEIRA, D. Í. A.; FREITAS, V. J. F.
A principal perspectiva após a obtenção do macho caprino transgênico fundador para Fator
Estimulante de Colônias de Granulócitos humano (hG-CSF) por nosso grupo é a
caracterização da linhagem transgênica e posterior constituição de um rebanho para a
produção desta proteína recombinante em escala comercial (CQB n.0228/06). Assim, a
presente proposta (aprovado pelo CEUA-UECE, n.09172814-2) objetiva constituir uma
linhagem caprina transgênica para secreção do hG-CSF no leite, a partir de um macho
fundador previamente obtido através de microinjeção pró-nuclear de DNA, bem como a
caracterização genotípica e fenotípica da linhagem. Para tanto, 14 fêmeas não transgênicas da
raça Canindé tiveram o estro sincronizado pelo uso de um tratamento hormonal baseado em
esponjas intravaginais por 11 dias associadas a injeções de cloprostenol e eCG no oitavo dia.
As fêmeas em estro foram inseminadas com o sêmen a fresco do macho transgênico fundador.
Para as fêmeas que retornaram ao estro foi utilizada a monta natural como método de
fecundação usando o mesmo macho transgênico. O diagnóstico de gestação e contagem do
número de fetos foi realizado por ultrassonografia (Falco 100, Piemedical, Holanda) aos 40
dias pós-estro. A estratégia convencional revelou uma taxa de 57,1% (8/14) de gestação aos
40 dias após a fecundação. Uma média de 1,3 fetos foi observada pelo exame
ultrassonográfico, compatível com os resultados previamente relatados para a raça Canindé.
Esses resultados preliminares sugerem que a presença do gene exógeno no macho transgênico
obtido no LFCR, não afeta as características reprodutivas do animal. A execução das etapas
pendentes do presente projeto culminará a aquisição de maiores conhecimentos acerca dessa
linhagem transgênica caprina e permitirá o adequado manejo reprodutivo do macho fundador.
Adicionalmente, facilitará as futuras estimativas acerca do número de gestações necessárias
para formação de um rebanho transgênico para produção de hG-CSF em escala preparativa,
visando produção do medicamento.
73
Palavras-chave: Inseminação artificial. Monta natural. Ultrassonografia.