UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Obtenção e caracterização de nanopartículas de quitosana
Idylla Silva Tavares
_______________________________________
Dissertação de Mestrado
Natal/RN, novembro de 2011
Idylla Silva Tavares
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA
Dissertação apresentada a Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, como parte integrante das
exigências do Programa de Pós-graduação em
Química, para obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. José Luís Cardozo Fonseca
Co-orientadora: Dra Ana Luiza Porpino Fernandes
Caroni
NATAL
2011
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial de Química
Tavares, Idylla Silva.
Obtenção e caracterização de nanopartículas de quitosana / Idylla Silva Tavares. Natal,
RN, 2011
54 f.
Orientador: José Luís Cardozo Fonseca
Co-Orientadora: . Ana Luiza Porpino Fernandes Caroni.
.
Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química.
1. Quitosana – Dissertação. 2. Potencial Zeta – Dissertação. 3. SAXS – Dissertação. 4.
Nanopartículas – Dissertação. 5. Coacervação – Dissertação. I. Fonseca José Luís Cardozo.
II.Caroni, Ana Luiza Porpino Fernandes. III. Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. III. Título.
RN/UFRN/BSE- Química
CDU 547.995(043.3)
A Deus, meus familiares e aos
meus amigos...
companheiros de todas as horas...
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus.
Aos meus pais, familiares e amigos, pelo carinho e apoio.
Ao meu orientador Prof. Dr. José Luis Cardozo Fonseca pela orientação, dedicação e
principalmente pela compreensão e paciência que teve comigo no decorrer desse trabalho.
A minha co-orientadora Dra. Ana Luiza Porpino Fernandes Caroni, que além de me
orientar, me ajudou e incentivou a construir esse trabalho.
Aos meus colegas do Laboratório de Membranas e Colóides (LAMECO) que muito
me ajudaram e ao Núcleo em Pesquisa de Petróleo e Gás (NUPEG) pela permissão ao uso de
seus equipamentos.
Aos meus colegas do Ministério da Saúde pelo companheirismo e compreensão nos
momentos de ausência ao trabalho.
RESUMO
Nanopartículas de quitosana têm sido utilizadas em vários sistemas destinados a
liberação controlada de fármacos. O objetivo desse trabalho foi a obtenção e caracterização de
nanopartículas de quitosana através do método de coacervação/precipitação utilizando o
sulfato de sódio em diferentes concentrações como agente reticulante. A caracterização foi
feita utilizando potencial zeta e espalhamento de pequenos ângulos, SAXS. As dispersões de
quitosana foram obtidas a pH=1 e pH=3. Os resultados do potencial zeta variaram no pH = 1
de +64,8 a +29,27 mV e no pH = 3 de +72,4 a +23,48 mV, indicando que a cadeia de
quitosana fica carregada positivamente em pH ácido e que comportamento das nanopartículas
em termos de carga superficial foi independente do pH. Entretanto, os resultados indicaram
dependência do tamanho de partícula em relação ao pH. Essa diferença em termos de
comportamento foi explicada pela influência dos componentes entálpicos e entrópicos.
Palavras-chave: Quitosana. Potencial Zeta. SAXS. Nanopartículas. Coacervação.
ABSTRACT
Chitosan nanoparticles have been used in several systems for the controlled release of
drugs. The aim of this study was to obtain and characterize chitosan nanoparticles prepared by
the method of coacervation / precipitation using sodium sulfate at different concentrations as
the crosslinking agent. The characterization was done using zeta potential and small angle Xray scattering, SAXS. The dispersions of chitosan were obtained at pH 1 and pH = 3. The
results of zeta potential at pH = 1 ranged from +64.8 to +29.27 mV and for pH = 3 they varied
from +72.4 to +23.48 mV, indicating that the chain of chitosan is positively charged in acidic
pH and the behavior of nanoparticles in terms of surface charge was independent of pH.
However, the results indicated a dependence of particle size in relation to pH. This difference
in behavior was explained by the influence of enthalpic and entropic components.
Keywords: Chitosan. Zeta Potential. SAXS. Nanoparticles. Coacervation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Estrutura básica da quitina e quitosana. Se m ≥ 40%, será quitosana;
se m < 40%, será quitina..................................................................................................
14
Figura 2:
Relação entre pH da solução e solubilidade da quitosana......................
15
Figura 3:
Método de coacervação/precipitação......................................................
21
Figura 4:
Potencial Zeta..........................................................................................
24
Figura 5:
Esquema do SAXS .................................................................................
26
Figura 6:
Raio de Giração em função de I(q) ........................................................
33
Figura 7:
Processo de obtenção das nanopartículas ............................................... 34
Figura 8:
Análise do potencial zeta até 4h: a) Solução de quitosana em pH = 1 e
b) pH=3 ..................................................................................................
Figura 9:
Potencial zeta das 2 soluções de quitosana após 4h................................
36
38
Figura 10: Efeito entálpico e entrópico..................................................................... 39
Figura 11: Raio de Giração representado por Rg....................................................
41
Figura 12: Espalhamento da função de I(q) em função do espalhamento do vetor
q. a) pH 1: quadrado, rsa = 2,0; círculos , rsa = 1,8; triângulo para baixo
rsa = 1,6; triângulo para cima , rsa = 0,08. b) pH 3: quadrado, rsa = 1,0;
círculos , rsa = 0,8; triângulo para baixo rsa = 0,6; triângulo para cima,
rsa = 0,01..................................................................................................
42
Figura 13: Análise do tamanho de partícula pelo SAXS: a) pH = 1 e b) pH= 3......
43
Figura 14: Frasco da esquerda nanopartículas colapsadas (turbidez) e da direita
em solução............................................................................................... 44
Figura 15
Tabela 1:
Comportamento do raio de giração com o aumento da concentração do
Na2SO4 ...................................................................................................
46
Parâmetros do ZetaPlus ..........................................................................
33
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
PLA
Poli (ácido lático)
PLGA
Poli (ácido glicolático)
PCL
Poli(caprolactona)
PEO
Poli (óxido de etileno)
PPO
Poli (óxido de propileno)
TPP
Tripoli (fosfato de sódio)
LISTAS DE SÍM BOLOS
ζ
Potencial Zeta
θ
Metade do ângulo de espalhamento
λ
Comprimento de onda da radiação espalhada
mq
Massa de quitosana purificada
mc
Massa de quitosana constante
TS
Teor de sólidos
mq
Massa de quitosana
xD
Grau de desacetilação
MD
Massa molar da quitosana desacetilada
MA
Massa molar da quitosana acetilada
I(q)
Intensidade de espalhamento
n
Densidade numérica de partículas
q
Vetor de espalhamento
P(q)
Fator de forma da partícula
S(q)
Função de interferência entre partículas
Rg
Raio de giração
α
Fração de grupamentos amino protonados
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ..........................................................................................
12
2
OBJETIVOS ...............................................................................................
13
2.1
OBJETIVOS GERAIS .................................................................................
13
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................
13
3
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................
14
3.1
QUITOSANA ..............................................................................................
14
3.2
AÇÕES FARMACOLÓGICAS DA QUITOSANA ...................................
16
3.3
OBTENÇÃO DE SISTEMAS PARTÍCULADOS DE QUITOSANA .......
19
4
TÉCNICAS .................................................................................................
24
4.1
POTENCIAL ZETA ....................................................................................
24
4.2
SAXS (ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXOS ÂNGULOS).…..
26
5
METODOLOGIA ………………………………………………………..
28
5.1
MATERIAIS ………………………………………………………………
28
5.2
PURIFICAÇÃO DA QUITOSANA ………………………………………
28
5.3
CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA ………………………………..
28
5.4
OBTENÇÃO DE NANOPÁRTÍCULAS DE QUITOSANA ......................
29
5.5
PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE QUITOSANA...................................
29
5.6
PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES DE Na2SO4 .........................................
29
5.7
CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA ....
31
5.7.1
Potencial Zeta …………………………………………………………….
31
5.7.2
SAXS ……………………………………………...……………………….
32
6
RESULTADOS E DISCUSSÃO ………………………………………...
34
6.1
OBTENÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS ………………………………..
34
6.2
ANÁLISE DO POTENCIAL ZETA ……………………………………...
35
6.3
ANÁLISE DO TAMANHO DE PARTÍCULA ...........................................
40
7
CONCLUSÃO ............................................................................................
47
REFERÊNCIAS .........................................................................................
48
12
1 INTRODUÇÃO
A nanotecnologia é frequentemente aplicada na indústria têxtil, agricultura,
eletrônicos, ciências forenses, indústria farmacêutica, dentre outros. Na indústria
farmacêutica, as nanopartículas são utilizadas como sistemas de liberação controlada de
fármacos e no desenvolvimento de tratamentos para uma variedade de doenças, como câncer,
AIDS, diabetes, malária e tuberculose. 1
As nanopartículas podem ser compostas por polímeros naturais, sintéticos ou semisintéticos. Polímeros biodegradáveis têm sido estudados nas últimas duas décadas para a
fabricação de medicamentos por serem estáveis no sangue, por apresentarem baixa toxicidade,
não atuarem como agentes trombogênicos, imunogênicos, inflamatórios e nem como
ativadores de neutrófilos. São veículos adequados para várias substâncias, proteínas,
peptídeos e ácidos nucléicos. Os polímeros naturais não são amplamente utilizados (proteínas
e polissacarídeos), pois variam no grau de pureza e frequentemente requerem reticulação, um
processo de ligação covalente das cadeias poliméricas, o que pode desnaturar o fármaco
incorporado. Consequentemente os polímeros sintéticos, como poli ácido lático (PLA) e poli
(ácido glicolático) (PLGA), têm recebido mais atenção nessa área. Eles são reabsorvidos por
vias naturais e podem ser manipulados para melhorar a liberação do fármaco ou seu tempo de
ação.2-4
Os polímeros mais estudados e aprovados pelo FDA para administração em humanos
são: poli ácido lático (PLA), poli (ácido glicolático) (PLGA), policaprolactona (PCL),
quitosana, gelatina e poli (acril-cianacrilato). 2, 5
A quitosana tem sido extensamente estudada pela indústria farmacêutica por ser um
polímero biodegradável, não ser tóxica, ser carregada positivamente e ter propriedades
mucoadesivas. A quitosana tem sido de muito interesse no encapsulamento de fármacos
devido a sua biocompatibilidade. Os benefícios desse encapsulamento na matriz polimérica
são proteção do fármaco do meio e sua capacidade de liberação controlada.
6-8
13
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
O objetivo desse trabalho foi à obtenção e a caracterização de nanopartículas de
quitosana com potencial de utilização em sistemas de liberação controlada de fármacos,
estudando a influência do grau de reticulação iônica dos sistemas particulados obtidos e a
caracterização da dispersão resultante.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Análise do potencial zeta e do tamanho das nanopartículas de quitosana obtidas a
partir da reticulação iônica da quitosana com sulfato de sódio em diferentes
concentrações, de acordo com a razão sulfato/amino, rsa .
 Caracterizar os processos de obtenção das nanopartículas como processos dirigidos
por componentes entálpicos e entrópicos.
14
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 QUITOSANA
A história da quitosana remonta ao século 19, quando Rouget discutia as formas da
desacetilação de um polímero natural denominado quitina em 1859. Durante as últimas duas
décadas, uma grande quantidade de trabalho tem se reportado à quitosana e sua potencial
utilização nas bioaplicações. 9
A quitosana é um polissacarídeo semi-sintético formado por copolímeros de
glucosamina (2-amino-2-desoxi-d-glucose) e N-acetilglucosamina (2-acetamido-2-desoxi-dglucose) unidos por ligações glicosídicas do tipo β(1→4), conforme Figura 1. Após a
purificação, a quitosana apresenta uma rígida estrutura cristalina com ligações de hidrogênio
intra e inter-molecular. A quitosana é conhecida por outros nomes como poliglusam, quitina
desacetilada e poli-d-glucosamina. O termo quitosana se refere a um grande número de
polímeros, os quais diferem do grau de N-desacetilação (40-98%), massa molecular (50 kD –
2.000 kDa) e viscosidade (solução de quitosana 1% dissolvida em ácido acético 1%, <2000
mPaS). 5, 6
Figura1 - Estrutura básica da quitina e quitosana. Se m ≥ 40%, será quitosana; se m < 40%, será quitina.
Fonte: Própria
A quitosana pode ser encontrada na parede celular de alguns fungos como Mucorales
strains, entretanto é mais comumente obtida pela desacetilação parcial da quitina em
condições alcalinas ou por hidrólise enzimática na presença da quitina desacetilase. Seu
principal precursor, a quitina, é o mais abundante polissacarídeo natural depois da celulose, e
por possuir estrutura semelhante a esta, não é digerida pelas enzimas do trato gastrointestinal
humano, apenas pode ser susceptível a hidrólise por enzimas microbianas do cólon. A quitina
15
ocorre na natureza como microfibrilas cristalinas ordenadas formando componentes
estruturais do exoesqueleto de artrópodes ou paredes celulares de fungos e leveduras. 10-12
Apesar de quimicamente semelhantes, quitina e quitosana são diferentes no grau de
desacetilação, o que modifica suas propriedades físico-químicas, biológicas, biomédicas,
dentre outras. Para alguns autores, o termo quitosana significa que o grau de desacetilação é
igual ou maior que 0,5, ou seja, ocorre a predominância de grupos 2-amino-2-desoxi-dglucose, enquanto a quitina contém maior proporção de 2-acetamido-2-desoxi-d-glucose. Para
outros, o grau de desacetilação da quitosana é igual ou maior que 0,7. 5, 13
Essa diferença no grau de desacetilação é facilmente observada na solubilidade. A
quitina é insolúvel em água e na maioria dos solventes orgânicos e a quitosana consegue ser
solúvel em ácidos fracos, como o ácido acético e ácido fórmico. Essa solubilidade em pH
menor que 6,5 ocorre devido à protonação do grupamento amino (NH2) em amínio (NH3+),
que é solúvel. O grau de desacetilação pode ser medido por várias técnicas como
infravermelho e ressonância magnética, para a quitina; e titulações potenciométricas e
condutimétrica, ressonância magnética, infravermelho e ultravioleta para a quitosana. A
Figura 2 mostra a relação entre o pH da solução e a solubilidade da quitosana.14-20
Figura 2- Relação entre pH da solução e solubilidade da quitosana
Fonte: Própria
Diferentes graus de desacetilação influenciam a conformação da molécula de
quitosana em solução aquosa, levando por sua vez, a uma variação na viscosidade. Com alto
grau de desacetilação, a cadeia fica mais expandida, pois ocorre repulsão entre as cargas das
moléculas, aumentando a viscosidade. O contrário acontece quando o grau de desacetilação é
baixo, pois diminui a densidade da carga e o polímero fica mais enovelado. 21
A quitosana é uma base fraca, com pKa que varia de 6,2 a 7,0 e insolúvel em pH
neutro e alcalino. Entretanto, forma sais com ácidos orgânicos ou inorgânicos, pois os grupos
amino do polímero são protonados resultando em um polissacarídeo solúvel carregado
16
positivamente. Seus sais são solúveis em água dependendo do grau de desacetilação e do pH
da solução. Se o percentual de desacetilação for baixo (<40%), são solúveis até pH 9,
enquanto que as com alto grau de desacetilação (>85%) são solúveis apenas até pH 6,5. 6, 22
3.2 AÇÕES FARMACOLÓGICAS DA QUITOSANA
Nos últimos anos, a quitosana tem sido introduzida como material de suplemento
nutricional, especialmente para a perda de peso e “agente redutor de colesterol”. O
mecanismo sugerido tem sido do efeito da quitosana no transporte de lipídios no intestino,
onde ácidos graxos livres, colesterol, sais biliares e outros componentes formam micelas que
compreende etapa essencial no processo de absorção dessas gorduras. Aparentemente a
quitosana carregada positivamente consegue unir os ácidos graxos livres e sais biliares e,
portanto, limitar a absorção desses lipídios. 23
Alguns estudos têm demonstrado que a quitosana tem sido eficaz no tratamento de
hemorragias e utilizada como componente em ataduras. A carga positiva dos grupos amino
interage com as membranas dos eritrócitos e plaquetas carregadas negativamente, ativando a
cascata de coagulação. 5
Desde 1970, estudos reportam a quitina e a quitosana como agentes aceleradores de
cicatrização, por induzirem a formação de fibras de colágeno. Outros estudos também
demonstraram que a quitina aumenta a síntese de colágeno do tipo I, III e IV e que a quitina e
quitosana estimulam a síntese de colágeno medindo a atividade da enzima prolihidroxilase,
atividade necessária para a síntese de colágeno em ratos. 24
Devido ao fato da quitosana ter alta massa molar, carga positiva e demonstrar
habilidade de formar filmes e géis, ela tem sido extensamente utilizada na indústria química,
principalmente como agente floculante na clarificação das águas residuais e agente quelante
de metais pesados para desintoxicação de resíduos nocivos. Os metais pesados que são mais
comumente adsorvidos são Cu²+, Zn²+, Ni²+, Cd²+ e Pb²+. Estudos têm revelado que o Cu²+ é o
metal com maior capacidade de ser adsorvido pela quitosana, enquanto o Ni²+ tem a menor
capacidade de adsorção. Ligações cruzadas ou substituições na cadeia da quitosana levam a
um significativo decréscimo na capacidade de adsorção. Existe a possibilidade de aumentar a
eficiência de adsorção através da complexação da quitosana com agentes que contém grupos
como hidroxila (OH), carboxila (COOH) e amino (NH2). Um exemplo disso é o aumento em
duas vezes, na adsorção do Pb²+ quando a quitosana é ligada a poliacrilamida. 6, 10
17
Uma variedade de outros efeitos podem ser atribuídos a quitosana como ação antiulcerosa, antimicrobiana, antitumoral, protetora renal, “modificação imunológica” e ações
osteogênicas, uso na “engenharia de tecidos” como bio-suporte para permitir o crescimento da
pele e dos ossos. 6
A quitosana tem sido produto de escolha no desenvolvimento de fármacos de liberação
controlada. Sua capacidade de ficar carregada positivamente faz com que tenha característica
mucoadesiva, permitindo um aumento no tempo residual do fármaco no local de absorção. É
um polímero compatível com tecidos vivos, uma vez que não causa reações alérgicas e
rejeição no ser humano. A quitosana é degradada a metabólitos (amino açúcares) que são
completamente absorvidos pelo corpo humano. 25
A incorporação de fármacos nos sistemas particulados pode ser feita durante a
obtenção das partículas ou depois de sua formação, ficando o fármaco adsorvido na matriz ou
na superfície da partícula. Os fármacos hidrossolúveis são geralmente misturados em solução
de quitosana para formar uma mistura homogênea, e em seguida as nanopartículas são
obtidas, enquanto que os lipossolúveis precisam ser incubados em partículas pré-formadas
para que a incorporação ocorra de forma eficiente. Foi incorporarada tetraciclina pelos dois
métodos anteriormente citados. Observou-se que quando o fármaco foi adicionado à solução
de quitosana, apenas 8% do fármaco foi incorporado, enquanto que quando adicionado a
partículas pré-formadas, obteve-se 69% de eficiência.26, 27
Várias aplicações terapêuticas têm se desenvolvidas para a liberação controlada de
fármacos em sistemas nanoparticulados, principalmente, para administração parenteral, oral e
oftálmica. 22, 28
Uma das áreas mais promissoras na utilização das nanopartículas é a administração
parenteral. A biodistribuição das nanopartículas varia de acordo com o tamanho, carga
superficial e hidrofobicidade das partículas administradas. Partículas maiores que 100 nm de
diâmetro são rapidamente removidas pelas células de defesa presentes no fígado, baço,
pulmões e medula óssea; enquanto partículas menores permanecem mais tempo na corrente
sanguínea. Essas células de defesa reconhecem partículas sólidas como corpos estranhos ao
organismo humano e as destrói. Partículas carregadas negativamente são mais rapidamente
eliminadas do que partículas neutras ou de carga positiva. E por último, opsoninas (proteínas
séricas que se ligam ao substrato para que seja eliminado pelo sistema retículoendotelial)
preferem superfícies hidrofóbicas à hidrofílicas. As nanopartículas de quitosana são de
escolha para administração parenteral porque tem capacidade de formar partículas menores
que 100 nm, são carregadas positivamente e apresentam superfícies hidrofílicas. 29
18
A vetorização de fármacos anticancerígenos em nanopartículas de quitosana exibe
uma tendência de se acumular nos tumores devido à propriedade mucoadesiva da quitosana e
pela capacidade de penetração nos vasos tumorais. 30
As nanopartículas oferecem efeito adjuvante na liberação parenteral de vacinas. O seu
tamanho permite que sejam captadas pelas células linfáticas presente nas mucosas iniciando
uma vigorosa resposta imunológica. Existem duas vias de administração para vacinas de
liberação de mucosas, oral e nasal. O principal alvo da liberação oral são os nódulos do tecido
linfático
encontrados
no
intestino,
denominadas
placas
de
Peyer.
Os
sistemas
nanoparticulados protegem as vacinas contra degradação enzimática e são captados
efetivamente pelas células de defesa. Em contraste com a administração oral, as vacinas
administradas pela mucosa nasal são transportadas por pequenas distâncias, permanecendo
por apenas quinze minutos, e não são expostas a valores baixos de pH e degradação
enzimática. Entre os polímeros utilizados, a quitosana é o polímero mais recentemente
explorado como carreador de vacinas, pois melhora a resposta imunológica das mucosas
através da ativação das células de defesa e melhora o transporte dos fármacos através das
mucosas. 31
Com relação à administração oral de nanopartículas, as pesquisas têm sido
direcionadas especialmente à: a) diminuição dos efeitos colaterais de certos fármacos,
destacando-se os antiinflamatórios não-esteróides (diclofenaco, indometacina), os quais
causam frequentemente irritação à mucosa gastrintestinal e b) proteção de fármacos
degradáveis no trato gastrointestinal, como peptídeos, proteínas e hormônios, aumentando a
biodisponibilidade dos mesmos. Além da atividade enzimática, a camada mucosa e a barreira
epitelial do trato gastrointestinal são as principais barreiras que impedem a absorção do
fármaco. Uma das maneiras de vencer essa barreira é limitar o tamanho dessas partículas em
500 nm, permitindo assim a passagem pelo mecanismo de endocitose. As propriedades
mucoadesivas da quitosana, ou seja, a interação entre a carga positiva da quitosana e a
negativa do ácido siálico da mucina, substância liberada pelas mucosas, promove um
prolongamento no tempo de contato do fármaco com a superfície absortiva, promovendo
então a sua absorção pelas mucosas. 29, 30
Embora substâncias hidrofóbicas passem com mais facilidade pela barreira epitelial, já
que esta é formada por uma dupla camada lipídica, as substâncias hidrofílicas também
conseguem. A habilidade de melhorar o transporte de substâncias hidrofílicas pela mucosa
epitelial depende da composição química e da massa molar da quitosana. O aumento no grau
de desacetilação e a alta massa aumentam a permeabilidade epitelial. 29
19
Outras mucosas, como a pulmonar e a nasal, são rotas promissoras na liberação de
peptídeos e proteínas uma vez que tem grandes áreas de superfícies e menores degradações
enzimáticas intra e extracelular. Portanto, não é necessária proteção contra degradação
enzimática nessas formulações. Alguns estudos têm demonstrado que a insulina incorporada
às nanopartículas de quitosana, é melhor absorvida em ratos e ovelhas. 29, 32
Outro grande interesse nas nanopartículas de quitosana é a sua administração
oftálmica, visando o controle da liberação, o aumento da biodisponibilidade ocular e/ou a
diminuição dos efeitos colaterais devido à absorção de certos fármacos. Foi investigado o
potencial das nanopartículas de quitosana como veículo para melhorar a liberação de
fármacos na mucosa ocular. O resultado do prolongado tempo de permanência das
nanopartículas ocasiona diminuição da eliminação quando comparada com formulações
convencionais, melhorando assim a biodisponibilidade dos fármacos. Foi incorporada a
ciclosporina A, um agente imunossupressor, nas nanopartículas de quitosana através do
método da gelificação iônica, que será explicado posteriormente. Estudos in vitro
demonstraram uma liberação rápida na primeira hora seguida de uma liberação gradual
durante 24 horas. Os experimentos em coelhos mostraram que após a aplicação tópica, a
concentração da droga nos tecidos externos como córnea e conjuntiva, atingiram os níveis
terapêuticos; enquanto que nas estruturas oculares internas como íris, corpo ciliar e humor
aquoso, e no sangue e no plasma, as concentrações foram insignificantes. Isso indica que as
nanopartículas de quitosana podem ser utilizadas como veículos para melhorar ação de
fármacos para a aplicação extraocular. 30, 33
3.3 OBTENÇÃO DE SISTEMAS PARTICULADOS DE QUITOSANA
Diferentes métodos têm sido utilizados na preparação de sistemas particulados de
quitosana. A seleção do método depende de fatores como a exigência do tamanho da
partícula, estabilidade térmica e química da substância ativa, reprodutibilidade dos perfis
cinéticos, estabilidade e toxicidade do produto final. As preparações das nanopartículas de
quitosana têm sido desenvolvidas baseadas nas tecnologias de obtenção de micropartículas. 25
A gelificação iônica é baseada na interação eletrostática entre o grupamento amino da
quitosana e as cargas negativas do poliânion formando um líquido-gel. É uma técnica simples
e requer pouco tempo. Essa técnica tem sido de interesse pelo fato de formar ligações
eletrostáticas reversíveis evitando possível toxicidade de reagentes ou outros efeitos
indesejáveis. A quitosana é dissolvida em ácido na presença ou ausência de estabilizador, para
20
que ocorra a protonação do grupo amina e à ela, é adicionada gota a gota de uma solução de
poliânion sob agitação constante à temperatura ambiente. Devido a complexação das cargas
opostas, a quitosana sofre gelificação iônica e precipita formando partículas esféricas. O
tamanho e a carga superficial das partículas podem ser modificados pela variação da
concentração da quitosana ou do estabilizador. Apesar de atualmente ser o método mais
descrito na literatura, essa técnica tem uso limitado para liberação controlada de fármacos
pois as partículas apresentam baixa resistência mecânica. 2, 29, 34
Essa técnica foi utilizada preparando uma solução de quitosana dissolvida em ácido
acético 1% junto com copolímero de poli (óxido de etileno), PEO e poli (óxido de propileno),
PPO, e outra contendo tripolifosfato de sódio, TPP. A vantagem dessa técnica é que não
utiliza glutaraldeído, um agente reticulante altamente tóxico, a incorporação do PEO melhora
a compatibilidade sanguínea e é compatível com a adsorção de proteínas. Nanopartículas de
quitosana foram preparadas com tripolifosfato incorporadas com insulina e doxorrubicina
foram incorporadas em nanopartículas complexadas com sulfato de dextrano. 35-37
Complexação polieletrolítica são complexos formados pela neutralização entre a carga
positiva do polímero de quitosana e um outro composto de carga oposta. Estudos de obtenção
de partículas através da complexação polieletrolítica da solução de quitosana em ácido acético
2% com uma solução de poli (ácido metacrílico). Foi observado que o aumento do peso
molecular do poli (ácido metacrílico) aumentou a solubilidade com complexo devido a
presença do grupamento carboxila, e que o aumento da força iônica tem dois efeitos na
formação desses complexos. À baixas concentrações, a formação desses complexos é
favorecida devido a diminuição da densidade das moléculas polieletrolítica (aumento da
densidade da carga de superfície); e à altas concentrações, a formação dos complexos é
inibida pela atração eletrostática entre o COO- e NH3+. 38, 39
A coacervação/precipitação pode ser utilizada por duas técnicas. A primeira utiliza a
propriedade da quitosana de ser insolúvel em pH alcalino. As partículas são produzidas pela
adição de solução alcalina como NaOH, NaOH/metanol ou etanodiamida na solução da
quitosana através de um bico de ar comprimido formando gotículas. O tamanho das partículas
varia com a pressão do ar ou com o diâmetro do bico de pulverização. 40
A segunda técnica, consiste na adição de um sal e solução ácida de quitosana contendo
surfactante, sob agitação constante. Eles prepararam uma solução aquosa de quitosana em
ácido acético contendo polissobato 80 e a essa solução, foi adicionada uma solução de sulfato
de sódio, gota-a-gota, sob agitação constante e ultrasom. A formação das partículas foi
demonstrada pela turbidez, indicando que o ânion sulfato reagiu com a amina protonada da
21
quitosana, precipitando-a, como mostra a Figura 3. O método descrito apresenta vantagens
como simplicidade, uma vez que não utiliza equipamentos complexos, não utiliza solventes
orgânicos, são necessárias poucas etapas de purificação e alta capacidade de incorporação de
fármacos associada a liberação sustentada deles. Estudos com Interleucina Humana 2 (IL-2) e
DNA demonstraram a formação da partícula sem a necessidade de um agente reticulante. 7, 41
Figura 3- Método de coacervação/precipitação
Fonte: Própria
As nanopartículas são formadas espontaneamente depois da adição da solução de
DNA na solução de ácido acético dissolvido, sob agitação mecânica à temperatura ambiente.
O tamanho dos complexos pode variar de 50 a 700 nm. Essa mesma técnica foi utilizada
através da interação eletrostática entre a carga positiva da quitosana e a carga negativa do
sulfato de dextrana, junto com o sulfato de zinco atuando como agente reticulante. 42, 43
Método de emulsificação/difusão do solvente é baseado na miscibilidade parcial do
solvente orgânico em água. Uma emulsão óleo/água é obtida pela injeção de fase orgânica na
solução de quitosana contendo estabilizador sob agitação mecânica, seguida de uma
homogeneização de alta pressão. A emulsão é diluída em grande quantidade de água para
superar a miscibilidade do solvente em água. A precipitação do solvente ocorre como
resultado da difusão do solvente orgânico para água, levando a formação das nanopartículas.
O método é adequado para substâncias hidrofóbicas e apresenta alto percentual de
incorporação. Os maiores inconvenientes desses métodos incluem condições severas de
processamento, como uso de solventes orgânicos, e altas força de cisalhamento durante a
preparação das nanopartículas. 29
O método de emulsão reticulação consiste na ligação cruzada do grupo amino da
quitosana com o grupo funcional aldeído do agente reticulante que pode ser o glutaraldeído ou
22
o formaldeído. A quitosana em solução aquosa é colocada em grande volume de uma fase
oleosa onde será formada a emulsão. O agente reticulante é adicionado e sob agitação as
partículas são formadas. O tamanho da partícula vai depender da extensão da ligação e da
velocidade de agitação. O uso desse método envolve alguns inconvenientes como a
possibilidade de reações químicas com o fármaco e a dificuldade de retirada do agente
reticulante remanescente.
Esse método foi utilizado na preparação de microesferas de
quitosana adsorvida com pentazocina. Os parâmetros de formulação como liberação do
fármaco, concentração do polímero, velocidade de agitação durante a reticulação e a fase
oleosa, foram modificados para melhorar o desempenho do fármaco. Estudos in vivo
indicaram uma melhora na biodisponibilidade da pentazocina. Outros fármacos como
diclofenaco sódico, fenobarbital e 5-fluoruracil também já foram incorporados por esse
método. 24, 44, 45
Um novo método de coalescência foi desenvolvido utilizando a combinação dos
métodos de emulsão-reticulação e de precipitação. Nesse método, ao invés da reticulação das
gotas, a precipitação é induzida permitindo a coalescência das gotas de quitosana com as
gotas de NaOH. Primeiramente são preparadas duas emulsões estáveis, uma contendo solução
aquosa de quitosana e fármaco e outra de solução aquosa quitosana com NaOH. As duas são
misturadas sob alta velocidade de agitação. As gotas de cada uma das emulsões colidem, se
agregam e formam partículas pequenas.46
O método da microemulsão é baseado na formação de nanopartículas de quitosana no
núcleo das micelas reversas e subseqüente reticulação com glutaraldeído. Nesse método, o
surfactante foi dissolvido no n-hexano. Em seguida a quitosana em solução de ácido acético
junto com o glutaraldeído são adicionados na mistura do surfactante/hexano sob agitação
constante à temperatura ambiente. Nanopartículas são formadas na presença do surfactante. O
sistema foi agitado por um tempo para que o processo de reticulação fosse completo, para que
o grupo amino livre da quitosana conjugasse com o glutaraldeído. O solvente orgânico é então
removido por evaporação sob pressão reduzida. O excesso do surfactante foi precipitado com
o cloreto de cálcio (CaCl2) e removido por centrifugação. A suspensão das nanopartículas foi
dialisada antes da liofilização. Essa técnica oferece estreito tamanho de distribuição menor
que 100 nm e o tamanho das nanopartículas pode ser controlado pela variação da
concentração do glutaraldeído. 29
A microemulsão reversa é uma combinação dos métodos de gelificação iônica e
reticulação obtendo tamanhos uniformes de nanopartículas consideravelmente menores que
esses métodos obteriam isoladamente. O material utilizado foi água, Triton X-100 (surfactante
23
não-iônico), octanol (co-surfactante) e ciclohexano (fase oleosa). Esse processo é constituído
pela quitosana solubilizada em água formando gotículas dispersas em uma fase contínua de
óleo estabilizadas por surfactantes. Essas gotículas atuam como microreatores na formação de
partículas ultrafinas, inibem a excessiva agregação das nanopartículas e formam um meio de
reação confinada que controla a forma e o tamanho delas. 29
No método de peneiramento as partículas são preparadas pela dissolução da quitosana
em solução de ácido acético a 4% formando uma espessa massa gelatinosa que é então
reticulada pela adição de glutaraldeído. Essa massa passa por uma peneira formando as
partículas que são lavadas com NaOH 0,1 N para remover o excesso de glutaraldeído e são
secas por 12 horas em uma estufa a 40ºC. 25
A formação de sistemas particulados de quitosana também pode ocorrer por uma
técnica conhecida por spray-drying. Ela se baseia na secagem de partículas por um fluxo de ar
quente. É bastante conhecida por produzir pó, grânulos ou aglomerados a partir da mistura de
soluções ou suspensões de drogas e excipientes. A quitosana dissolvida em ácido acético é
adicionada a substância a ser incorporada e o agente reticulante. Em seguida é introduzido um
fluxo de ar quente formando pequenas gotas. O tamanho das partículas depende da vazão do
bico, da pressão, temperatura do ar e extensão da ligação. Substâncias como cimetidina,
metoclopramida, vitamina D2 e ampicilina já foram incorporadas por essa técnica.
25, 47, 48
24
4. TÉCNICAS
4.1 POTENCIAL ZETA
Quase todos os materiais macroscópicos ou particulados em contato com um líquido
adquirem uma carga elétrica em sua superfície. Essa carga pode aparecer pela dissociação de
grupos ionogênicos na superfície da partícula ou pela adsorção diferencial de íons da solução
na superfície da partícula. Assim, forma-se uma dupla camada elétrica na interface da
partícula com o líquido. Essa dupla camada divide-se em uma região interna, fortemente
ligada a superfície da partícula e uma externa onde a distribuição de íons é determinada pelo
equilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento térmico. Em um campo elétrico, cada
partícula e os íons mais fortemente ligados, se movem como uma unidade, e o potencial
medido entre essa unidade e o meio circundante, local chamado de plano de cisalhamento, é
denominado potencial zeta. Seu valor está intimamente relacionado com a estabilidade da
suspensão e com a morfologia da superfície das partículas e é representado pela letra grega ζ.
A figura 4 ilustra o esquema do potencial zeta. 49
Figura 4-Potencial Zeta
Fonte: Collois Applications – Zeta Potential60
O potencial zeta de nanopartículas depende principalmente da natureza química do
polímero, do estabilizador e em alguns casos do pH do meio. Estudos sugerem que ele não
apresenta dependência com a natureza da substância ativa, com a concentração do polímero
ou do estabilizador.50
25
Um exemplo da influência da natureza do polímero é quando nanopartículas são
preparadas a partir de polímeros de poliéster ou derivados de metacrilatos, usando
estabilizantes não-iônicos. Neste caso, valores negativos de potencial zeta são obtidos devido
a presença de grupos carboxila na parte terminal do polímero. Do mesmo modo, valores
positivos de potencial zeta são obtidos quando polímeros catiônicos e estabilizantes nãoiônicos são utilizados 50
Por outro lado, a interferência da natureza do estabilizador ocorre quando
nanopartículas são preparadas com polímeros carregados negativamente e estabilizantes
aniônicos. Neste caso, o potencial zeta adquire valores mais altos quando comparado aos nãoiônicos. O mesmo vale para os de carga positiva. Esse comportamento é devido à adsorção do
estabilizador na superfície das nanopartículas. 50
E por último, o potencial zeta pode depender do pH da dispersão independentemente
da natureza do estabilizador. A literatura não reporta valores específicos, pois na maioria das
vezes, ocorreu uma diluição da dispersão em água. No caso da quitosana, em alguns casos,
valores mais baixos de pH tornam a molécula mais protonada, ou seja, com maiores valores
de potencial zeta. 30
O potencial zeta está diretamente ligado à estabilidade dos colóides. Em módulo, um
valor de potencial zeta relativamente alto (em torno de 30 mV) é importante para uma boa
estabilidade físico-química da suspensão coloidal, pois grandes forças repulsivas tendem a
evitar a agregação em função das colisões ocasionais com partículas adjacentes. Variações na
concentração de sais, de íons (pH) e surfactante, podem variar o valor do potencial zeta. 35
A identificação do potencial zeta é útil na associação de fármacos às nanopartículas.
Um exemplo disso foi a determinação do potencial zeta de nanoesferas de poli(cianoacrilato
de butila) para inferir sobre o mecanismo de interação do fármaco, sulfato de amicacina com
o polímero. Foi verificado que quando esse fármaco era adicionado as nanopartículas de
forma crescente, a redução, em módulo, do potencial zeta foi concordante com o aumento da
taxa de associação do fármaco. Os autores sugeriram a ocorrência de uma interação
eletrostática entre o fármaco e o polímero. 28
4.2 SAXS (ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXO ÂNGULO)
O SAXS é um método analítico que consiste no espalhamento elástico dos raios-X
(comprimento de onda 0,1... 0,2 nm) através de uma amostra, medindo a variação da
distribuição da densidade eletrônica. São registradas pequenas variações angulares (0,1-10°),
26
as quais determinam a estrutura de sistemas particulados através da média do tamanho das
partículas ou de sua forma, do tamanho de poros, da distribuição e da razão entre superfície e
volume. Diferentemente de outros métodos que usam raios-X, o espalhamento a baixo ângulo
é útil para a determinação estrutural em baixa resolução para sistemas que não apresentem
ordem cristalina de longo alcance. 51
O SAXS mede a intensidade do espalhamento versus o vetor de espalhamento, q, que
é definido pela Equação 1:
q
4

sen
Eq. 1
onde θ é a metade do ângulo em que a radiação é espalhada e λ é o comprimento de onda da
radiação incidente.
Os componentes básicos do SAXS são: fonte de raios-X, sistema de colimação,
amostra, beam stop (anteparo para o feixe) e sistema de detecção. 52
A fonte irradia a amostra e o detector mede a radiação proveniente da amostra em um
determinado intervalo de ângulos, como mostra a Figura 5.52
Figura 5- Esquema do SAXS
Fonte: X-ray-Lab 61
O sistema de colimação faz com que o feixe de raios-X seja convergido a apenas um
ponto ou uma linha, definindo a posição do ângulo zero. Se não existir esse direcionamento,
27
fica difícil distinguir entre a variação angular do espalhamento padrão da amostra e o feixe de
raios-X emitido.
52
O beam stop impede que a luz incida diretamente sobre detector, o que poderia ofuscar
o espalhamento da amostra que é relativamente fraco ou causar a destruição do detector. Essa
barreira pode ser constituída por materiais densos como chumbo ou tungstênio, que bloqueia
completamente a passagem do feixe; ou pode ser feita por um material transparente que
atenua a intensidade do feixe ficando segura para o detector. 52
Os materiais a serem analisados por esse equipamento podem ser sólidos ou líquidos e
eles podem conter domínios sólidos, líquidos ou gasosos (assim chamadas partículas) do
mesmo ou de outro material em qualquer combinação. Não apenas partículas, como também
lamelas e materiais com estrutura fractal. 51
O SAXS é um método exato, não destrutivo e normalmente requer o mínimo de
amostra. Essa metodologia pode ser aplicada a análise de colóides, metais, cimentos, óleos,
polímeros plásticos, proteínas e na indústria farmacêutica. 52
28
5. METODOLOGIA
5.1. MATERIAIS
A quitosana (Polymar Ltda., Brasil) usada neste trabalho apresenta grau de
desacetilação médio de 88% (xD = 0,88) e massa molar média (Mv = 2,9 x 105 Daltons) foi
determinada pelo método de viscometria, utilizando a equação de Mark-Howink-Sakurada. O
ácido acético, HAc (P. A., Cromato Produtos Químicos Ltda., Brasil), o ácido clorídrico,
HCl (P. A., Cromato Produtos Químicos Ltda., Brasil), o sulfato de sódio, Na2 SO4
(Cromoline Química Fina, LTDA, Brasil), e o hidróxido de sódio, NaOH (Cromoline
Química Fina, LTDA, Brasil), foram usados como recebidos. Em todos os experimentos, a
água utilizada sofreu dupla destilação e imediata utilização. 53
5.2. PURIFICAÇÃO DA QUITOSANA
As nanopartículas foram formadas a partir de quitosana (Polymar, Ltda, Brasil), a qual
sofreu um processo de purificação. Inicialmente neste processo, uma massa de quitosana foi
dissolvida em solução de ácido acético 20 g L-1 sob agitação, durante 24 horas, a uma
temperatura ambiente de (25 ± 2) ºC. Após este período, a solução foi filtrada com o objetivo
de eliminar resíduos sólidos derivados do processo de obtenção da quitosana (principalmente
impurezas e quitina insuficientemente desacetilada). Este procedimento foi realizado em duas
etapas: na primeira, foi utilizado um filtro com tela de nylon; e na segunda etapa, um filtro
Millex Millipore® com diâmetro de poros de 41 µm. À solução filtrada, um volume de
solução aquosa de NaOH 50 g L-1, foi adicionado lentamente e sob agitação, provocando a
precipitação de toda a quitosana. O precipitado foi separado do sobrenadante por filtração
(filtro com tela de nylon) e, então, lavado com água (destilada e bidestilada) várias vezes até
pH neutro. Em seguida, foi submetido a uma secagem em estufa com circulação forçada de ar
a uma temperatura em torno de 40 ºC, obtendo-se a quitosana utilizada neste trabalho.
5.3. CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA PURIFICADA
A caracterização da quitosana purificada foi feita através da análise do teor de sólidos.
O conteúdo de sólidos foi determinado através da pesagem exata de uma massa de quitosana
29
purificada (mqp). Em seguida, esse material foi levado a uma estufa a 100 - 105 C até ser
alcançada uma massa constante (mc). O teor de sólidos (TS) foi calculado de acordo com a
seguinte equação:
TS  100.
mc
mqp
Eq. 2
5.4 PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA
As nanopartículas foram obtidas através da adição de um volume fixo de solução de
Na2SO4 ( VNa SO = 100 mL em diferentes concentrações) à um volume fixo de solução de
2
4
quitosana (V = 100 mL e concentração fixa de 2,5 g L-1), durante 4 horas, sob agitação
constante. Essa obtenção ocorreu de acordo com a metodologia originária do método de
coacervação/precipitação, que resultou na precipitação da quitosana na forma de
nanopartículas através da reticulação iônica do SO42- com o grupamento amino protonado,
NH3+, presente na cadeia de quitosana. Essa metodologia foi descrita no Capítulo 3.
5.5 PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE QUITOSANA
Foram preparadas duas soluções com quitosana utilizando-se ácido acético 20 g L-1
(pH = 3) e ácido clorídrico 1,8 g L-1 (pH = 1), ambas sob agitação constante, durante 24 horas,
a fim de se obter soluções com concentração de 2,5 g L-1.
5.6 PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES DE Na2SO4
As soluções de Na2SO4 foram preparadas com água bidestilada e suas concentrações
determinadas de acordo com a razão entre os ânions sulfato originados do Na 2SO4 e os grupos
amino da quitosana. Essa razão foi definida como rsa :
rsa 
nSO4
nNH 2

V Na2 SO4 .CNa2 SO4
M Na2 SO4 .nNH 2
Eq.3
onde nNH2 é o número de mols de grupamentos amino na solução de quitosana e M Na SO é a
2
4
massa molar da solução de sulfato de sódio. O parâmetro rsa foi controlado pela variação da
30
concentração da solução de Na2SO4, CNa SO . Para isso, a relação entre essa concentração e os
2
4
parâmetros relacionados precisam ser explicadas.
O número de mols de grupamento amino por massa de quitosana é dado pela equação:
nNH 2 nNH 2
xD


mq
CqVq
xD.M d  (1  xD) M a
Eq.4
onde C q é a concentração da solução de quitosana e Vq é o seu volume; xD é o grau de
desacetilação da quitosana, M d = 161,1558 g mol-1 é a massa molar da unidade desacetilada e
Ma = 203,1925 g mol-1 da unidade acetilada.
Substituindo as equações e reorganizando seus termos, temos que:
CNa2 SO4 
CqVq M Na2 SO4
VNa2 SO4
.
xD
.rsa
xD.M d  (1  xD) M a
Eq. 5
Substituindo os valores de M Na SO , VNa SO , xD , C q , Vq , M d , M a resulta em
2
4
2
4
C Na SO ( g.L1 )  1,88.rsa
2
4
Eq. 6
Os valores de rsa variam de acordo com o ácido em que foi dissolvida a quitosana.
Para as soluções de quitosana em pH = 1 foram preparadas soluções de Na2SO4 nas razões
de: 0,2, 0,4, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 e 2,0 enquanto as solubilizadas em pH = 3 foram
preparadas nas razões de: 0,01, 0,02, 0,04, 0,08, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0.
Em virtude das concentrações das soluções de Na2SO4 serem muito baixas, preparouse uma solução padrão de Na2SO4 0,5 g L-1, para que fosse diluída e então preparada a
solução na concentração desejada. Utilizou-se a equação abaixo para calcular o volume
necessário de solução padrão de Na2SO4, sabendo que o volume final era de 0,1 L.
VNa2 SO4 ( padrão ) 
CNa2 SO4 .V final
CNa2 SO4 ( final )
VNa2 SO4  C Na2 SO4 .2
Eq.7
Eq. 8
31
O volume a ser diluído pode se calculado substituindo Eq 6 em 8,
VNa2 SO4  3, 76.rsa
Eq. 9
Entretanto, esse volume a ser diluído ainda é baixo, de difícil medição. Para facilitar
essa diluição e sabendo que a densidade da solução padrão de Na 2SO4 é de aproximadamente
1 mg/mL, o volume foi convertido em massa. A solução padrão de Na 2SO4 foi então pesada e
seu volume completado com água bidestilada até 0,1L.
5.7 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA
5.7.1 Potencial Zeta
O potencial zeta é uma ferramenta importante e útil indicador da carga da partícula. As
medidas de potencial zeta foram realizadas usando um equipamento ZetaPlus (Brookhaven
Instruments Corporation, EUA).
O potencial zeta não pode ser medido diretamente sendo necessário algum tipo de
medida indireta. Nesse caso foi utilizada a mobilidade eletroforética, na qual a dispersão de
quitosana foi introduzida em uma cuba com dois eletrodos de cargas opostas e a ela foi
aplicado um potencial elétrico. As partículas com cargas elétricas se moveram na direção do
eletrodo de carga contrária, diretamente proporcional à quantidade da carga e a intensidade do
campo elétrico. 30
Os parâmetros utilizados para análise do potencial zeta estão demonstrados conforme
Tabela 1.
Tabela 1- Parâmetros do ZetaPlus
Volume (mL)
1 a 1,5
Ciclos x minuto
5x3
Material da cubeta
Plástico
Temperatura (°C)
25
pH
1e3
Fonte: Própria
32
A carga da partícula medida pelo potencial zeta foi analisada em duplicata variando
três parâmetros:

Concentração do sal – A solução do sal Na2SO4 foi preparada em 10 concentrações
diferentes de acordo com a razão sulfato/amino, rsa, para cada uma das duas soluções
de quitosana preparadas.

pH – O pH da solução de quitosana foi de 1 e 3.

Tempo – As análises de potencial zeta foram feitas nos tempo 0h, 1h, 2h, 3h e 4h. O
tempo de contagem foi a partir da mistura da solução de quitosana com a solução do
sulfato de sódio sob agitação constante.
5.7.2 SAXS
A análise estrutural das nanopartículas de quitosana foi feita pela técnica de
espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). A leitura no equipamento foi feita em
duplicata, 4h após a mistura da solução de quitosana com a de sulfato de sódio.
O tamanho da nanopartícula foi determinado variando-se apenas a concentração de sal
e pH.
Para as medidas de SAXS utilizou-se uma câmera conectada a um gerador de raios X,
de comprimento de onda de 0,1542 nm. Este gerador foi operado a uma voltagem de 40 kV e
uma corrente de 50 mA. As amostras foram fechadas a vácuo em um capilar de quartzo. As
medidas de intensidade de espalhamento foram realizadas em uma placa de imagem (IP) com
sistema de detecção de ciclone (Perkin Elmer, EUA) e convertidas através do software
SAXSquant 3.50 (Anton Paar GmbH, Áustria) para intensidade unidimensional.
Os
experimentos foram realizados aplicando uma exposição ao feixe por um período de tempo de
30 minutos para todas as amostras. Também foram realizados ensaios em branco nas duas
soluções de quitosana para determinação das curvas experimentais de espalhamento. A
distância entre a amostra e o detector foi fixada em 700 mm, o que permitiu realizar os
experimentos com ângulo de espalhamento que foi descrito pela Equação 1, citada na Página
28.
A partir do vetor de espalhamento q, obtém-se a intensidade de espalhamento I(q).
A.Guinier mostrou que a intensidade espalhada na vizinhança do feixe direto, I(q) está
relacionada com o raio de giração, Rg, segundo a aproximação conhecida por lei de Guinier:
33
I ( q )  I 0 exp(
ln I ( q )
q 2 RG 2
)
3
Eq.9
q2 2
 ln I 0  RG
3
Eq. 10
A figura 6 ilustra o raio de giração, Rg, em função a intensidade de espalhamento,
I(q).
Figura 6 - Raio de Giração em função de I(q)
Fonte: Própria
34
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 OBTENÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS
O processo
de
obtenção de
nanopartículas
foi
baseado no método
de
coavervação/precipitação. Essa técnica consiste na reticulação iônica entre grupamentos
amino protonados da quitosana com o ânion sulfato. A quitosana foi dissolvida em meio ácido
para poder ser solubilizada em água devido à protonação do grupamento amino. O ânion ao
entrar em contato com a carga positiva do polímero forma uma ligação iônica, neutralizando a
carga e obtendo assim a nanopartícula que uma vez formada precipita, como mostra Figura 7.
7
Figura 7- Processo de obtenção das nanopartículas
a)
b)
Fonte: Própria
35
A solubilidade da quitosana dependente da presença de outros íons em solução. Na
presença de acetato, lactato ou glutamato, a quitosana apresenta boa solubilidade enquanto na
presença de fosfato, polifosfato e sulfato, a solubilidade diminui. O sulfato forma um derivado
pouco solúvel por isso é possível a formação de nanopartículas.7
Neste trabalho, a quitosana foi utilizada na concentração de 2,5 g L-1. Altas
concentrações de quitosana não são utilizadas porque aumentam a viscosidade da solução e
consequentemente dificultam a distribuição homogênea do sulfato de sódio, podendo levar a
formação de aglomerados. Como a quitosana foi purificada e durante esse processo houve
várias lavagens, e por isso foi necessário calcular o teor de sólidos. A média do teor de sólidos
foi de 85%. 7
6.2 ANÁLISE DO POTENCIAL ZETA
Antes de realizar os experimentos em termos de razão sulfato/amino, rsa , foi
determinado se o sistema estava termodinamicamente equilibrado. Essa determinação foi feita
através da análise do potencial zeta, nas condições descritas no item 5.7.1, como mostra a
Figura 8.
36
Figura 8 - Análise do potencial zeta até 4h
a) Solução de quitosana em pH =1
54
54
54
54
27
27
27
27
(mV)
54
4h
3h
2h
1h
0h
27
0
0
0
1
2
0
0
1
2
0
0
1
0
2
0
1
2
0
1
2
rsa
b) Solução de quitosana em pH=3
2h
1h
0h
54
54
54
54
27
27
27
27
(mV)
54
4h
3h
27
0
0
0
1
2
0
0
1
2
0
0
1
2
rsa
Fonte: Própria
0
0
1
2
0
1
2
37
O potencial zeta das nanopartículas de quitosana apresentou resultados positivos. No
pH = 1 variou de 64,8 a 29,27 mV e no pH = 3 de 72,4 a 23,48 mV. Esse valor positivo se
deve a cadeia de quitosana que fica positiva pela protonação do ácido e por sua vez as
nanopartículas formadas continuam com essa carga, embora íons sulfatos tenham sido
utilizados como precipitante. Isso indica que apenas parte dos grupamentos amino foram
neutralizados durante a formação das nanopartículas, e os remanescentes foram responsáveis
pelo potencial zeta positivo. 7
Nanopartículas de quitosana foram obtidas reticuladas com tripolifosfato (TPP)
adsorvidas com gentamicina e ácido salicílico. Eles prepararam a solução de quitosana com
ácido acético e o potencial zeta encontrado foi de 42,18 mV, o qual diminuiu a medida que a
razão entre o sal e a quitosana aumentou. Eles explicaram que isso ocorreu devido a
diminuição da quantidade de grupamentos amino residuais. Também foram obtidas
nanopartículas de quitosana de maneira semelhante e o potencial zeta encontrado foi de 49,3
mV, devido a presença de grupamentos amino protonados na superfície das nanopartículas. 54,
55
De acordo com a Figura 8, após 4h, observou-se que os valores do potencial zeta das
duas soluções diminuíram à medida que rsa aumentou. Isso acontece porque o ânion sulfato
tem duas cargas negativas e reticula com dois grupamentos amino da cadeia de quitosana
formando a nanopartícula, como já mostrado na Figura 7. Quanto maior for a quantidade
desse ânion em solução, menor será a quantidade de cargas positivas na superfície da partícula
e consequentemente menor será o valor do potencial zeta.
A Figura 9 mostra a dependência entre o potencial zeta e a razão de sulfato/amino, rsa ,
para as dispersões em equilíbrio.
38
Figura 9- Potencial zeta das duas soluções de quitosana após 4h
pH = 1
pH = 3
(mV)
54
27
0
0
1
rsa
Fonte: Própria
A diminuição do potencial zeta com o aumento da concentração de sulfato indica a
formação das nanopartículas pelo mecanismo de reticulação iônica e essa reticulação é regida
pela diminuição da energia livre de Gibbs:
G  H  T S
que tem dois componentes:
Eq. 11
39

Componente entálpico (ΔH): íons sulfato divalentes interagem eletronicamente com
NH3+ da quitosana, resultando na aproximação das cargas positivas, diminuindo a
entalpia do sistema, de acordo com a Figura 10.

Componente entrópico (ΔS): Cada NH3+ da cadeia de quitosana apresenta uma
atmosfera iônica ao redor formada por contra-íons monovalentes carregados
negativamente oriundos do ácido utilizado para protonar a quitosana. Esses contraíons tem sua mobilidade restrita, embora a pressão osmótica leve parte deles para fora
do novelo. A Figura 10 mostra a reação que ocorre quando é adicionado um íon
sulfato no sistema, substituindo dois contra-íons que vão para solução aumentando a
entropia.
Outro fator que também aumenta a entropia do sistema é o efeito
hidrofóbico. Os novelos macromoleculares apresentam regiões apolares responsáveis
pela repulsão das moléculas de água. Essa repulsão faz com que as moléculas fiquem
organizadas ao redor da cadeia. Quando as regiões apolares se aproximam, liberam as
moléculas de água para o sistema, aumentando a entropia. 56
Figura 10 - Efeito entálpico e entrópico
Fonte: Própria
40
6.3 ANÁLISE DO TAMANHO DE PARTÍCULA (SAXS)
As nanopartículas de quitosana foram obtidas pelas interações eletrostáticas dos NH 3+
presentes na cadeia de quitosana com as cargas negativas do ânion sulfato, SO 4-2. Essa
interação pode ser afetada por suaves variações nas condições de temperatura e pH. O
tamanho da nanopartícula pode ser controlado pela variação da massa molar da quitosana, da
razão sal/quitosana, e do pH. 57
A molécula de quitosana apresenta ampla variação na sua massa molar que vai de 50
kD a 2000 KD, e sabe-se que moléculas com alta massa molar, produzem nanopartículas
maiores, quando comparadas com as de baixa massa molar. Alguns estudos tem demonstrado
que qualquer influência no meio que altere o tamanho da massa molar da quitosana irá alterar
o tamanho da nanopartícula. 58
Tsai et al (2011) observaram que fatores como ultrasonicação, alto tempo de radiação
e aumento na temperatura da solução, levaram a uma diminuição na massa molar da quitosana
acarretando formação de nanopartículas menores. Eles observaram também que quando a
solução de quitosana era mais concentrada, as nanopartículas obtidas tinham tamanhos
maiores, quando comparadas a soluções mais diluídas. 58
O tamanho que um polímero assume em solução diluída é denominado volume
hidrodinâmico e os principais parâmetros que o definem são a distância entre os extremos da
cadeia para polímeros lineares e o raio de giração, Rg. Para a análise do tamanho de partícula
variou-se a razão sal/quitosana e o pH da solução. Através do espalhamento de luz, o volume
hidrodinâmico das nanopartículas que foi convertido em raio de giração. O raio de giração
corresponde à distância entre o centro de gravidade e a superfície da esfera em que se
encontra o novelo, como mostra Figura 11.
41
Figura 11- Raio de Giração representado por RG
59
Fonte: Característica de Polímeros
Com relação à variação da concentração de sulfato de sódio, Na2SO4, os resultados
demonstraram que nas duas soluções de quitosana, a medida que rsa aumenta, o tamanho das
nanopartículas diminui. Essa diminuição no tamanho da partícula se deve ao fato de que com
o aumento da razão do sal, aumenta-se a quantidade de ânion sulfato na solução, o qual reage
com a carga positiva da quitosana neutralizando-a. Essa neutralização impede a repulsão entre
as cargas positivas da quitosana, diminuindo o volume hidrodinâmico da nanopartícula.
Os dados do espalhamento de luz de algumas amostras se encontram na Figura 12 que
mostra a relação entre a intensidade de espalhamento I(q) e o módulo do vetor de
espalhamento, q. É observado que com o aumento de rsa, o espalhamento se torna mais
intenso, evidenciando a importância da reticulação iônica no processo de formação das
nanopartículas.
42
Figura 12- Espalhamento da função de I(q) em função do espalhamento do vetor q. a) pH = 1: quadrado,
rsa = 2,0; círculos , rsa = 1,8; triângulo para cima rsa a = 1,6; triângulo para baixo, rsa = 0,08. b) pH =
3: quadrado, rsa = 1,0; círculos, rsa = 0,8; triângulo para cima, rsa = 0,6; triângulo para baixo, rsa =
0,01.
Fonte: Própria
De fato, o aumento de I(q) é mais pronunciado quando q → 0 e o melhor parâmetro
que expressa as dimensões das nanopartículas é o raio de giração, que pode ser calculado dos
dados da região de Guinier ( qRG << 1) usando a equação de Guinier, que foi mostrada pela
Equação 11 da Página 35.
Os resultados da equação estão exibidos na Figura 13. As curvas em ambos os casos
podem ser descritas por duas regiões:

Região de baixa rsa : nessa região, as dimensões das nanopartículas decrescem com o
aumento da razão sulfato/amino, rsa, em consequência do aumento da blindagem
eletrostática
43

Região de alta rsa : nessa região, as nanopartículas atingem sua dimensão mínima que
colapsam. Partículas secundárias são formadas e por terem dimensões maiores, o raio
de giração aumenta drasticamente.
Figura 13- Raio de giração em função de rsa : a) pH = 1 e b) pH = 3
Fonte: Própria
A variação do pH de 1 para 3, também levou a diminuição do tamanho das
nanopartículas ainda que de forma pouco significativa. Também observaram esse
comportamento quando submeteram uma solução de quitosana a diferentes valores de pH.
Esse fenômeno é devido as propriedades catiônicas da quitosana. Em baixos valores de pH, a
molécula de quitosana se torna mais expandida devido a alta protonação da cadeia levando a
um aumento no volume hidrodinâmico nas nanopartículas. O contrário acontece quando o
valor do pH aumenta, a molécula de quitosana encolhe devido a baixa protonação ou forma
mais interações intramoleculares, diminuindo assim o volume hidrodinâmico na
nanopartícula. 58
44
Em ambas as soluções de quitosana, observou-se uma turvação em alguns valores de
rsa em que o RG apresentou uma estranha descontinuidade, indicando colapso das
nanopartículas nesses valores. Essa turvação aconteceu para valores diferentes de acordo com
pH, podendo ser visualizada de acordo com a Figura 14.
Figura 14- Frasco da esquerda nanopartículas precipitaram e da direita estão em solução
Fonte: Própria
A explicação para que a turvação das soluções ocorra em razões diferentes, é dada
tendo em mente o equilíbrio que ocorre nos grupamentos aminos da cadeia de quitosana:
Chit  NH 3
Chit  NH 2  H 
Eq. 12
neste caso, a constante de equilíbrio (assumindo comportamento de solução ideal) será, como
mostra a Equação 13:
KA 
Chit  NH 2   H  
Chit  NH 3 

(1   )  H  

,
Eq. 13
onde  é a fração de grupamentos amino que estão protonados. Rearranjando a Equação 13,
tem-se a Equação 14:
45
 H  

.
K A   H  
Eq. 14
Como já citado, os pHs utilizados foram 1 e 3. O pKa da quitosana está em torno de 66,5, então K A << [H+], portanto α ≈ 1 e independente do pH. Como consequência, a diferença
em termos de formação de nanopartículas para os dois casos não pode ser explicada pela
diferença em termos de componente entálpico, que seria explicado pela alta possibilidade de
interações eletrostáticas para o componente mais protonado. Além disso, o comportamento
similar para os dois sistemas em termos de potencial zeta confirma esse ponto de vista.
A explicação para o colapso das nanopartículas serem em razões diferentes é, portanto,
a variação do componente entrópico. A alta quantidade de contra-íons é a chave para
interpretar essa variação: o sistema com mais baixo pH é também o que contém maior
quantidade de contra-íons, que minimizam o aumento da entropia devido ao espalhamento de
contra-íons na fase aquosa, como consequência do colapso das nanopartículas. Em virtude
disso, o colapso no sistema de pH 1 ocorre em altos valores de rsa.
A Figura 15 resume o comportamento do raio de giração das nanopartículas. A medida
que vai aumentando a concentração de NaaSO4 em solução, o raio de giração diminui
indicando que o efeito polieletrolítico está aproximando as cadeias e diminuindo o volume
hidrodinâmico da cadeia de quitosana. Com o aumento da quantidade de ânions em solução,
as nanopartículas colapsam formando agregados com dimensões maiores que podem ser
observados tanto na turvação da solução quanto no tamanho do raio de giração.
46
Figura 15- Comportamento do raio de giração com o aumento da concentração de Na 2SO4
Fonte: Própria
47
7 CONCLUSÃO
O processo de obtenção de nanopartículas pelo método de coacervação/precipitação
foi caracterizado pela análise da carga superficial e do tamanho das nanopartículas formadas,
variando o pH e a concentração do agente reticulante. Os valores da carga superficial e do
tamanho de partícula foram dependentes da concentração do agente, entretanto apenas o
tamanho dependeu do pH. Esse processo foi dividido em duas etapas: a) uma vez o íon
polivalente adicionado, ocorreu a contração da cadeia de quitosana devido ao efeito
polieletrolítico e b) a contração das cadeias atingiu uma dimensão mínima e à medida que foi
adicionado o íon polivalente, resultou em colapso dos complexos solubilizados. Esse colapso
foi comprovado pela descontinuidade do Rg determinado pelo SAXS e pelo desenvolvimento
de turbidez. Todos os processos de coacervação foram favorecidos pela entropia do sistema.
48
REFERÊNCIAS
1.
FARAJI, A.H.; P. WIPF. Nanoparticles in cellular drug delivery. Bioorganic &
Medicinal Chemistry, v. 17, n. 8, p. 2950-2962,2009. Disponível em: <Go to
ISI>://000265044500001. Acesso em: 16 maio 2011.
2.
KUMARI, A.; S.K. YADAV; S.C. YADAV. Biodegradable polymeric nanoparticles
based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 75, n. 1, p.
1-18, 2010. Disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TFS4X60T8J-2/2/1046ba161f98919e6168a3f2daf38251. Acesso em: 10 jan. 2011.
3.
HANS, M.L.; A.M. LOWMAN. Biodegradable nanoparticles for drug delivery and
targeting. Current Opinion in Solid State and Materials Science, v. 6, n. 4, p. 319327,2002. Disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6VS546X8YVD-2/2/c5e29cf5a949d1ff9a421d652dbd9c3d. Acesso em: 22 dez 2010.
4.
WILSON, B., et al.. Chitosan nanoparticles as a new delivery system for the antiAlzheimer drug tacrine. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, v. 6,
n. 1, p. 144-152,2010. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B7MDB-4W91PW51/2/1e28bfc9ab4aa54361f07b157c5e6ce8. Acesso em: 07 jan. 2011.
5.
BALDRICK, P. The safety of chitosan as a pharmaceutical excipient. Regulatory
Toxicology and Pharmacology, v. 56, n. 3, p. 290-299, 2010. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6WPT-4XB1TC73/2/0fe915ae10287bfb6e234aaa352468f4. Acesso em: 04 jan. 2011.
6.
ILLUM, L. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharmaceutical
Research, v. 15, n. 9, p. 1326-1331,1998. Disponível em: <Go to
ISI>://000075853800002. Acesso em: 05 dez. 2010.
7.
BERTHOLD, A.; K. CREMER; J. KREUTER. Preparation and characterization of
chitosan microspheres as drug carrier for prednisolone sodium phosphate as model for
anti-inflammatory drugs. Journal of Controlled Release, v. 39, n. 1, p. 17-25,1996.
Disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T3D-3VXJGTT3/2/cec085e80be435a23a141826cd531f28. Acesso em: 05 dez 2010.
8.
HARRIS, R., ET AL. Chitosan nanoparticles and microspheres for the encapsulation
of natural antioxidants extracted from Ilex paraguariensis. Carbohydrate Polymers,
v. 84, n. 2, p. 803-806, 2010. Disponível em: <Go to ISI>://000288298300018. Acesso
em: 02 mar. 2011.
9.
DODANE, V.; V.D. VILIVALAM. Pharmaceutical applications of chitosan.
Pharmaceutical Science & Technology Today, v. 1, n. 6, p. 246-253,1998.
Disponível em: <Go to ISI>://000080230100004. Acesso em: 27 abr 2011.
10.
WU, F.C.; TSENG , R.L.; JUANG R.S. A review and experimental verification of
using chitosan and its derivatives as adsorbents for selected heavy metals. Journal of
Environmental Management, v. 91, n. 4, p. 798-806, 2010. Disponível em:
49
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6WJ7-4XPBSNX2/2/1cc4d4a36f615173673dc5b2ca75930f. Acesso em: 23 abr. 2011.
11.
JAYAKUMAR, R. et al. Biomedical applications of chitin and chitosan based
nanomaterials--A short review. Carbohydrate Polymers, v. 82, n. 2, p. 227-232,
2010. Disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TFD-5009P7B2/2/617cefb7e111f63a73eea68157060ac3. Acesso em: 23 abr. 2011.
12.
SABOKTAKIN, M.R. et al. Synthesis and characterization of biodegradable chitosan
beads as nano-carriers for local delivery of satranidazole. Carbohydrate Polymers, v.
81, n. 3, p. 726-731,2010. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TFD-4YRHCT92/2/7088da55e393a4210a307794d4333c80. Acesso em: 08 maio 2011.
13.
GUINESI, L.S.; CAVALHEIRO, É.T.G. The use of DSC curves to determine the
acetylation degree of chitin/chitosan samples. Thermochimica Acta, v. 444, n. 2, p.
128-133, 2006. Disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6THV4JRVFRD-3/2/8ce3d0d9e74d5e474fd2248269002e54. Acesso em: 09 nov. 2010.
14.
SAHOO, S. et al. Synthesis of chitosan-polycaprolactone blend for control delivery of
ofloxacin drug. Carbohydrate Polymers, v. 79, n. 1, p. 106-113,2010. Disponível
em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TFD-4WV15R04/2/097082309afb6bb7216a76f731036e36. Acesso em: 12 dez. 2010.
15.
BAXTER, A. et al. Improved method for IR determination of degree of n-acetylation
of chitosan. International Journal of Biological Macromolecules, v. 14, n. 3, p.
166-169,1992. Disponível em: <Go to ISI>://A1992HW55200007. Acesso em: 12 dez
2010.
16.
BRUGNEROTTO, J. et al. An infrared investigation in relation with chitin and
chitosan characterization. Polymer, v. 42, n. 8, p. 3569-3580,2001. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TXW-423YK3M10/2/efaa52928d3e46cbcf1ce8cb57211f62. Acesso em: 12 dez. 2010.
17.
DUNG, P.L. et al. Water soluble derivatives obtained by controlled chemical
modifications of chitosan. Carbohydrate Polymers, v. 24, n. 3, p. 209-214,1994.
Disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TFD-48G7C3C2D/2/c6e6d3693828423194a059e490e7368c. Acesso em: 12 dez. 2010.
18.
MIYA, M. et al. IR Spectroscopic determination of CONH content in highly
deacylated chitosan. International Journal of Biological Macromolecules, v. 2, n. 5,
p. 323-324,1980. Disponível em: <Go to ISI>://A1980KP90300013. Acesso em: 12
dez. 2010.
19.
MUZZARELLI, R.A.; ROCCHETTI , A. R. Determination of the degree of
acetylation of chitosans by 1ST derivated ultraviolet spectrophotometry.
Carbohydrate Polymers, v. 5, n. 6, p. 461-472,1985. Disponível em: <Go to
ISI>://A1985ATW4500005. Acesso em: 12 dez. 2010.
50
20.
TOLAIMATE, A. et al. On the influence of deacetylation process on the
physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin. Polymer, v. 41, n. 7, p.
2463-2469,2000. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TXW-3Y21FS2G/2/19981751be89754f3df7072a73bcd3a3. Acesso em: 12 dez .2010.
21.
ERRINGTON, N. et al. Hydrodinamic characterization of chitosans varyng in degree
of acetylation. International Journal of Biological Macromolecules, v. 15, n. 2, p.
113-117,1993. Disponível em: <Go to ISI>://A1993KW71100008. Acesso em: 11
abr. 2011.
22.
HEJAZI, R. AND AMIJI , M. Chitosan-based gastrointestinal delivery systems.
Journal of Controlled Release, v. 89, n. 2, p. 151-165,2003. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T3D-48CT09D2/2/bab398c592998423fc953c77354945c6. Acesso em: 03 jan. 2011.
23.
SUGANO, M. et al. A novel use of chitosan as a hypocholesterolemic agent in rats.
American Journal of Clinical Nutrition, v. 33, n. 4, p. 787-793,1980. Disponível
em: <Go to ISI>://A1980JN35500015. Acesso em: 01 nov. 2010.
24.
KOJIMA, K. et al. Effects of chitin and chitosan on collagen synthesis in wound
healing. Journal of Veterinary Medical Science, v. 66, n. 12, p. 1595-1598,2004.
Disponível em: <Go to ISI>://000225986700021. Acesso em: 15 dez. 2010.
25.
Agnihotri, S.A., N.N. Mallikarjuna, and T.M. Aminabhavi, Recent advances on
chitosan-based micro- and nanoparticles in drug delivery. Journal of Controlled
Release, v. 100, n. 1, p. 5-28, 2004. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T3D-4DF48XT1/2/5630831d023c35b90c02749b1adc90b0. Acesso em: 02 out. 2010.
26.
HEJAZI, R.; AMIJI , M. Stomach-specific anti-H-pylori therapy. 1: preparation and
characterization of tetracyline-loaded chitosan microspheres. International Journal
of Pharmaceutics, v. 235, n. 1-2, p. 87-94, 2002. Disponível em: <Go to
ISI>://000174725200009. Acesso em: 09 mar. 2011.
27.
KUMBAR, S.G.; KULKARNI , A.R.;AMINABHAVI, T.M. Crosslinked chitosan
microspheres for encapsulation of diclofenac sodium: effect of crosslinking agent.
Journal of Microencapsulation, v. 19, n. 2, p. 173-180, 2002. Disponível em: <Go to
ISI>://000173475400004. Acesso em: 08 mar. 2011.
28.
ALONSO, M.J., et al. Approaches to improve the association of amikacin sulfato to
poly(alkylcyanoacrylate) nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics, v.
68, n. 1-3, p. 69-76, 2004. Disponível em: <Go to ISI>://A1991EY64400009. Acesso
em: 02 fev. 2011.
29.
TIYABOONCHAI, W. Chitosan nanoparticles: a promissing system for drug delivery.
Naresuan University Journal 2003, v. 11, n. 3, p. 51-66, 2003. Disponível em:
Acesso em: 12 jan. 2011.
51
30.
SCHAFFAZICK, S.R. et al. Physicochemical characterization and stability of the
polymeric nanoparticle systems for drug administration. Quimica Nova, v. 26, n. 5, p.
726-737, 2003. Disponível em: <Go to ISI>://000185471500017. Acesso em: 27 jan.
2011.
31.
ILLUM, L. et al., Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines. Advanced
Drug Delivery Reviews, v. 51, n. 1-3, p. 81-96, 2001. Disponível em: <Go to
ISI>://000171156200007. Acesso em: 21 jan. 2011.
32.
FERNANDEZ-URRUSUNO, R., et al. Enhancement of nasal absorption of insulin
using chitosan nanoparticles. Pharmaceutical Research, v. 16, n. 10, p. 1576-1581,
1999. Disponível em: <Go to ISI>://000083350400013. Acesso em: 24 fev. 2011.
33.
DE CAMPOS, A.M.; SÁNCHEZ A.; ALONSO M.J. Chitosan nanoparticles: a new
vehicle for the improvement of the delivery of drugs to the ocular surface. Application
to cyclosporin A. International Journal of Pharmaceutics, v. 224, n. 1-2, p. 159168, 2001. Disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T7W43J1FCP-H/2/9acc76f727e9c4b590affa795537c122. Acesso em: 19 dez. 2010.
34.
FISHBEIN, I. et al. Nanoparticulate delivery system of a tyrphostin for the treatment
of restenosis. Journal of Controlled Release, v. 65, n. 1-2, p. 221-229, 2000.
Disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T3D-3YN926SP/2/d31c182f467f4f2eae22404f42eaf525. Acesso em: 05 fev. 2011.
35.
CALVO, P. et al. Chitosan and chitosan ethylene oxide propylene oxide block
copolymer nanoparticles as novel carriers for proteins and vaccines. Pharmaceutical
Research, v. 14, n. 10, p. 1431-1436, 1997. Disponível em: <Go to
ISI>://A1997YD50200019. Acesso em: 08 jan. 2011.
36.
JANES, K.A. et al. Chitosan nanoparticles as delivery systems for doxorubicin.
Journal of Controlled Release, v. 73, n. 2-3, p. 255-267, 2001. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T3D-438BNXRC/2/d8ad5e4d077123aedcdcd96cd19a5362. Acesso em: 08 jan. 2011.
37.
PAN, Y., et al. Bioadhesive polysaccharide in protein delivery system: chitosan
nanoparticles improve the intestinal absorption of insulin in vivo. International
Journal of Pharmaceutics, v. 249, n. 1-2, p. 139-147, 2002. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T7W-472870Y4/2/f8e45976d189ce2e27d77828ce0620ec. Acesso em: 08 jan. 2011.
38.
VASCONCELOS, C.L, et al. Adsorption of bovine serum albumin on templatepolumerized chitosan/poly(methacrylic acid) complexes. Langmuir, v. 23, n. p. 76877694, 2007. Disponível em: Acesso em: 14 jan. 2011.
39.
VASCONCELOS, C.L, et al. Effect of molecular weight and ionic strength on the
formation of polyeletrolyte complexes based on poly(methacrylic acid) and chitosan. .
Biomacromolecules, v. 7, n. p. 1245-1252, 2006. Disponível em: Acesso em: 13 fev.
2011.
52
40.
NISHIMURA, K. et al. Effect of multiporous microspheres derived from chitin and
partially deacetylated chitin on the activation of mouse peritoneal macrophages.
Vaccine, v. 5, n. 2, p. 136-140, 1987 Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TD4-476VD3WD/2/c6a233a38281c77c8282c234b81e7801. Acesso em: 12 jan. 2011.
41.
MAO, H,Q. et al. Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: synthesis,
characterization and transfection efficiency. Journal of Controlled Release, v. 70, n.
3, p. 399-421, 2001. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T3D-42BSN96G/2/f36efcec26d1b92193161b7bd7903cb1. Acesso em: 12 jan. 2011.
42.
ERBACHER, P. et al. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery:
Biophysical characteristics and transfection ability. Pharmaceutical Research, v. 15,
n. 9, p. 1332-1339,1998. Disponível em: <Go to ISI>://000075853800003. Acesso em:
15 jan 2011.
43.
TIYABOONCHAI, W.; LIMPEANCHOB, N. Formulation and characterization of
amphotericin B-chitosan-dextran sulfate nanoparticles. International Journal of
Pharmaceutics, v. 329, n. 1-2, p. 142-149, 2007. Disponível em: <Go to
ISI>://000243773700019. Acesso em: 15 jan. 2011.
44.
SANKAR, C., et al. Chitosan based pentazocine microspheres for intranasal systemic
delivery: development and biopharmaceutical evaluation. Pharmazie, v. 56, n. 3, p.
223-226, 2001. Disponível em: <Go to ISI>://000167366700007. Acesso em: 16 jan.
2011.
45.
SOPPIMATH, K.S., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery
devices. Journal of Controlled Release, v. 70, n. 1-2, p. 1-20, 2001. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T3D-428FJSV1/2/603507925b902be8dfe429b0554e5f01. Acesso em: 27 jan. 2011.
46.
TOKUMITSU, H.; ICHIKAWA, H.; FUKUMORI, Y. Chitosan-gadopentetic acid
complex nanoparticles for gadolinium neutron-capture therapy of cancer: Preparation
by novel emulsion-droplet coalescence technique and characterization.
Pharmaceutical Research, v. 16, n. 12, p. 1830-1835, 1999. Disponível em: <Go to
ISI>://000084675300009. Acesso em: 17 jan. 2011.
47.
GIUNCHEDI, P., et al. Preparation and characterization of ampicillin loaded
methylpyrrolidinone chitosan and chitosan microspheres. Biomaterials, v. 19, n. 1-3,
p. 157-161, 1998. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TWB-3T3T1CVP/2/b118ec2350f449f5fb260b78a2b693f2. Acesso em: 20 jan. 2011.
48.
HE, P.; DAVIS ,S.S.; ILLUM, L. Chitosan microspheres prepared by spray drying.
International Journal of Pharmaceutics, v. 187, n. 1, p. 53-65, 1999. Disponível
em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T7W-3XGFSR43/2/9ff7fd303e716c415ed7f4acb7328fe9. Acesso em: 20 jan. 2011.
53
49.
XU, R. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential
measurement. Particuology, v. 6, n. 2, p. 112-115, 2008. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674200108000357. Acesso em: 25
fev. 2011
50.
MORA-HUERTAS, C.E. Polymer-based nanocapsules for drug delivery.
International Journal of Pharmaceutics, v. 385, n. 1-2, p. 113-142, 2010.
Disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6T7W-4XFFJND6/2/92cb55bc73a6a4fbaca9308eb28ef9df. Acesso em: 25 fev 2011
51.
BLAZEK, J.; E.P. GILBERT. Application of small-angle X-ray and neutron scattering
techniques to the characterisation of starch structure: A review. Carbohydrate
Polymers, v. 85, n. 2, p. 281-293,2011. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0144861711001597. Acesso em: 01
jun. 2011.
52.
SCHNABLEGGER, H. Gettin acquainted with the principles - A practical guide to
SAXS. 75. ed. Austria: Anton Paar ed, 2006. v. I
53.
dos Santos, Z.M., et al., Determination of deacetylation degree of chitosan: a
comparison between conductometric titration and CHN elemental analysis.
Carbohydrate Research, v. 344, n. 18, p. 2591-2595,2009. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TFF-4X3N44C3/2/2fe5f3fe2d57102b48507c9a56b6aca2. Acesso em: 08 jun.2011
54.
ALISHAHI, A., et al. Chitosan nanoparticle to carry vitamin C through the
gastrointestinal tract and induce the non-specific immunity system of rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). Carbohydrate Polymers, v. 86, n. 1, p. 142-146, 2011.
Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0144861711002827. Acesso em: 15
jun. 2011.
55.
JI, J., et al., Preparation, characterization and in vitro release of chitosan nanoparticles
loaded with gentamicin and salicylic acid. Carbohydrate Polymers, v. 85, n. 4, p.
803-808, 2011. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0144861711002360. Acesso em: 15
jun.2011
56.
GUCHT, J., et al. Polyelectrolyte complexes: Bulk phases and colloidal systems.
Journal of Colloid and Interface Science, v. 361, n. 2, p. 407-422, 2011. Disponível
em: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021979711006795. Acesso
em: 02 fev.2011
57.
MORRIS, G.A., et al. The effect of prolonged storage at different temperatures on the
particle size distribution of tripolyphosphate (TPP) - chitosan nanoparticles.
Carbohydrate Polymers, v. 84, n. 4, p. 1430-1434, 2011. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0144861711000786. Acesso em: 02
fev.2011
54
58.
TSAI, M.-L., et al. The storage stability of chitosan/tripolyphosphate nanoparticles in
a phosphate buffer. Carbohydrate Polymers, v. 84, n. 2, p. 756-761,2011. Disponível
em: http://www.sciencedirect.com/science/article/B6TFD-4YYRMR99/2/118e67dee3f875000ca24badc5889797. Acesso em: 05 jun.2011.
59.
LUCAS, E. Caracterização de polímeros - Determinação de peso molecular e
análise térmica.1. ed. Rio de Janeiro: E-papers, 2001. v. 1, P.366.
60.
COLLOIDS Aplication: Zeta Potential.
Disponível em: http://www.horiba.com/us/scientific/products/particlescharacterization/applications/colloids/. Acesso em: 03 set. 2011
61.
X-RAY LAB. Disponível em: http://www.ipfdd.de/X-ray-Lab.197.0.htm. Acesso em:
03 set. 2011.