AVALIAÇÃO DE DIFERENTES PROCEDIMENTOS PARA EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE
ESFREGAÇOS CORADOS PELO MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN
Evaluation of different methods of DNA extraction from baciloscopic tests
of Ziehl-Neelsen staining
Ismari Perini Furlaneto1, Eveline Bezerra Sousa2, Michele Lima de Brito3,
George Leandro Ferreira Lima3, Maria Luíza Lopes4, Silvia Helena Marques da
Silva5, Karla Valéria Batista Lima6
RESUMO
O Pará é o estado com a maior taxa de incidência de tuberculose (TB) na região
Norte, com 36,3 casos/100 mil habitantes em 2004. A obtenção de DNA de qualidade
a partir de material fixado em lâminas coradas pelo método de Ziehl-Neelsen (ZN)
supriria a falta de amostras representativas para estudos de genotipagem, contribuindo
para melhor entendimento da dinâmica de transmissão da TB. O presente estudo
avaliou quatro diferentes procedimentos para obtenção de DNA de M. tuberculosis a
partir de 196 esfregaços corados pelo método de ZN, que utilizaram xilol e N-acetilL-cisteína (NALC) em conjunto, de forma isolada ou nenhuma destas substâncias, e
ainda dois protocolos de amplificação distintos, um com o adjuvante de PCR glicerol
e outro com betaína. O percentual de amplificação foi superior para as amostras que
foram submetidas ao procedimento que utilizou somente o xilol e ao que não utilizou
nenhuma substância, sendo de 77% e 67%, respectivamente, para o protocolo com
glicerol, e de 98% e de 96% para o protocolo com betaína. A partir dos resultados
obtidos, não é recomendado o uso de xilol ou NALC nos procedimentos de remoção
das amostras e sugere-se a inclusão do adjuvante betaína nas reações, assim como
o uso do DNA extraído de lâminas coradas pelo método de ZN em análises
baseadas em PCR.
PALAVRAS-CHAVE
Mycobacterium tuberculosis, técnicas de amplificação de DNA, PCR
ABSTRACT
Pará is the state with the biggest incidence of tuberculosis (TB) in the North region,
with 36,3 cases per 100.000 inhabitants in 2004. Good quality DNA from Ziehl-Neelsen
1
Farmacêutica. Endereço: Av. Almirante Wandenkolk, 898, apt. 1602. Bairro: Nazaré. 66055-030.
E-mail: [email protected]
2
Farmacêutica.
3
Mestre em Genética e Biologia Molecular. Serviço de Tuberculose. Laboratório Central do Pará.
4
Especialista em Saúde Pública. Chefe da Seção de Bacteriologia e Micologia. Instituto Evandro
Chagas. ecretaria de Vigilância em Saúde. Ministério da Saúde
5
Doutora em Ciências. Pesquisador Colaborador. Seção de Bacteriologia e Micologia. Instituto Evandro Chagas.
6
Doutora em Genética e Biologia Molecular. Responsável pelo Laboratório de Biologia Molecular.
Seção de Bacteriologia e Micologia. Instituto Evandro Chagas.
C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007 –
401
ISMARI PERINI FURLANETO, EVELINE BEZERRA SOUSA, MICHELE LIMA DE BRITO, GEORGE LEANDRO
FERREIRA LIMA, MARIA LUÍZA LOPES, SILVIA HELENA MARQUES DA SILVA, KARLA VALÉRIA BATISTA LIMA
staining slides (ZN) would supply the lack of representative samples for genotyping
studies, contributing for the knowledge of the TB dynamics of transmission. In this
study we evaluated four different procedures for extracting M. tuberculosis DNA from
196 Ziehl-Neelsen stained slides: using xylol and N-acetyl-L-cisteina (NALC) (together,
separately or using none of these substances); and two distinct protocols of amplification,
one with adjuvant of PCR glycerol and another one with betaine. The greatest percentage
of amplification was for the samples that had been submitted to the procedure with
xylol and to the procedure that did not use any substance (77% and 67%, respectively,
for the protocol with glycerol, and of 98% and 96%, respectively, for the protocol with
betaine). Based on the results obtained, it is not recommended the use of xylol or
NALC procedures for removal of samples and it is suggested the inclusion of adjuvant
betaine in reactions, and the use DNA extracted from slides stained by the method of
ZN in analyses based on PCR.
KEY WORDS
Mycobacterium tuberculosis, nucleic acid amplification techniques, PCR
1. INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB) é historicamente um importante problema de saúde
pública no mundo. Tem como principal agente etiológico o Mycobacterium tuberculosis,
também conhecido como bacilo de Koch ou bacilo álcool-ácido resistente (BAAR)
e como característica ser universal e atingir preferencialmente indivíduos
imunossuprimidos e/ou que vivam em condições socioeconômicas desfavoráveis
(Cavalcanti, 2006). Também pode ser causada por outras micobactérias do
Complexo M. tuberculosis (M. bovis bovis, M. microti, M. africanum, M. bovis BCG,
M. pinnipedii, M. canettii) (Palomino et al., 2007).
O Brasil notifica aproximadamente 85 mil novos casos de tuberculose
por ano e cerca de 5-6 mil mortes anuais (Brasil, 2005a). Segundo dados do
SINAN, no ano de 2004 foram confirmados no país 80.905 novos casos de
TB, pulmonar e extrapulmonar, sendo que destes, 7.079 ocorreram na
região Norte, com o Estado do Pará respondendo por 51% (3.619) das
notificações (Brasil, 2005b).
O diagnóstico laboratorial da tuberculose pulmonar é fundamentado nos
métodos bacterioscópicos (baciloscopia e cultura), radiológicos (radiologia de
tórax), anátomo-patológicos (histológico e citológico), sorológicos e bioquímicos
(Brasil, 2005a). O diagnóstico definitivo ainda depende da baciloscopia e cultura.
Apesar de ser o padrão para a confirmação diagnóstica da TB, a cultura requer
de quatro a oito semanas para um diagnóstico definitivo, pela própria característica
de replicação lenta do M. tuberculosis (Bollela, 1999).
A baciloscopia pelo método de Ziehl-Neelsen (ZN) é um exame simples, rápido,
econômico e é a mais difundida técnica para o diagnóstico da TB. No entanto,
402
– C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007
AVALIAÇÃO
DNA
ZIEHL-NEELSEN
DE DIFERENTES PROCEDIMENTOS PARA EXTRAÇÃO DE
A PARTIR DE ESFREGAÇOS CORADOS PELO MÉTODO DE
carece de especificidade, podendo ser positiva na presença de qualquer espécie
do gênero Mycobacterium, e de sensibilidade, pois só revela a presença de BAAR
em concentrações superiores a 104 bactérias por mililitro de escarro (Van der
Zanden et al., 1998).
A genotipagem do M. tuberculosis em diversos países mostrou ser um ótimo
instrumento no estudo das relações de clonalidade e dispersão entre cepas de
uma determinada população e os grupos populacionais sob maior risco, principalmente nos casos onde a ligação epidemiológica não é identificada com o traçado
convencional de contatos.
Diversas técnicas de biologia molecular podem ser usadas com este fim, como
as técnicas RFLP – IS6110 (Restriction Fragment Length Polymorphism), MIRU
(Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit) e Spoligotyping (Spacer
Oligonucleotide Typing). Este último apresenta baixa diversidade genética, no
entanto, tem a vantagem de diferenciar os membros do Complexo M. tuberculosis
(Kamerbeek, 1997) e ainda de ser aplicável em DNA obtido de amostras clínicas
diversas (Suffys, 2000), inclusive daqueles provenientes de lâminas de
microscopia (Van der Zanden et al., 1998), sendo normalmente aplicada como
método de triagem.
As técnicas baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR) têm alta
especificidade e sensibilidade e a capacidade de amplificar exponencialmente cópias
de DNA a partir de pequena quantidade de material (Mesquita et al., 2001),
podendo ser capaz de detectar até uma cópia de DNA de qualquer célula (Eisenach
et al., 1990; Barnes, 1993). Esta técnica pode ser utilizada na realização de
estudos de DNA obtidos a partir dos mais diversos materiais, incluindo arquivos
de fontes escassas, como tecidos fixados em formol e embebidos em parafina e
materiais fixados em lâminas coradas pelas técnicas de Ziehl-Neelsen (ZN), de
Papanicolau e de Giemsa (Marchetti et al., 1998; Poljak et al., 2000; Van der
Zanden et al., 2003; Barea et al., 2004), possibilitando, assim, seu uso na realização
de estudos retrospectivos.
Apesar de o Pará apresentar a maior taxa de incidência de tuberculose
pulmonar na região Norte, com 36,3/100 mil habitantes em 2004, não se tem
dados referentes à caracterização genética de cepas de M. tuberculosis. Por outro
lado, o número de culturas micobacterianas desenvolvidas em laboratórios de
referência (Seção de Bacteriologia e Micologia/Instituto Evandro Chagas –
SABMI/IEC, Laboratório Central – LACEN e Hospital Universitário João de
Barros Barreto – HUJBB) não forneceria amostragem representativa para estudos no Estado do Pará.
Desta forma, a obtenção de DNA de qualidade a partir de esfregaços corados
pelo ZN, enviados de todo o estado para supervisão indireta no LACEN-PA,
C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007 –
403
ISMARI PERINI FURLANETO, EVELINE BEZERRA SOUSA, MICHELE LIMA DE BRITO, GEORGE LEANDRO
FERREIRA LIMA, MARIA LUÍZA LOPES, SILVIA HELENA MARQUES DA SILVA, KARLA VALÉRIA BATISTA LIMA
supriria a falta de amostras para estudos de genotipagem, contribuindo para o
entendimento da dinâmica de transmissão da TB pulmonar. Este trabalho propõe
avaliar diferentes procedimentos para obtenção de DNA de M. tuberculosis a partir de esfregaços corados pelo ZN e avaliar a aplicabilidade do mesmo em estudos
que envolvam amplificação de ácidos nucléicos.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Neste estudo, foram desenvolvidos quatro diferentes procedimentos para a
obtenção de DNA de M. tuberculosis, cuja diferença entre eles consistiu no prétratamento empregado para a retirada do material fixado nas lâminas de
baciloscopia coradas pelo método de ZN. Em relação à amplificação do DNA,
foram executados dois protocolos, nos quais a troca do adjuvante de PCR,
acompanhada das alterações nas temperaturas de desnaturação e hibridização,
foi o diferencial entre eles. Todas as amostras de DNA extraídas foram submetidas
aos dois protocolos de PCR.
ESPÉCIMES CLÍNICOS
O tamanho da amostra foi definido por conveniência, incluindo 196 lâminas
com baciloscopia (ZN) positiva para tuberculose, pertencentes a pacientes que
pela primeira vez receberam o diagnóstico de TB pulmonar com os resultados
lâminas positivas para BAAR + (uma cruz), lâminas positivas para BAAR ++
(duas cruzes) e lâminas positivas para BAAR +++ (três cruzes), e 20 lâminas com
baciloscopia negativa para BAAR, pertencentes a pacientes sem TB pulmonar.
Para cada procedimento avaliado, foram utilizadas de 48 a 50 lâminas positivas e
cinco lâminas negativas para BAAR.
As lâminas com baciloscopia positiva utilizadas neste estudo foram provenientes
de duas unidades de referência para o controle da TB pulmonar no Pará, cedidas
pelo Laboratório de Microbiologia do LACEN-PA, e as lâminas com baciloscopia
e cultura negativas foram cedidas pelo Laboratório de Micobactérias da SABMI/
IEC. Todas as lâminas utilizadas no estudo foram preparadas no período
compreendido entre julho de 2005 e junho de 2006 e supervisionadas pelo
Controle de Qualidade das Instituições que as cederam.
CEPA DE REFERÊNCIA E CONTROLES DA PCR
Para cada sessão de amplificação, foram incorporados um controle positivo,
contendo DNA extraído da cepa de referência de M. tuberculosis MT14323 (doada
pela Fiocruz, RJ), e um controle negativo, onde a alíquota da amostra foi substituída
por igual quantidade de água MilliQ autoclavada. Foi utilizada ainda uma reação
contendo o material extraído de lâmina de paciente sem TB pulmonar (baciloscopia
404
– C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007
AVALIAÇÃO
DNA
ZIEHL-NEELSEN
DE DIFERENTES PROCEDIMENTOS PARA EXTRAÇÃO DE
A PARTIR DE ESFREGAÇOS CORADOS PELO MÉTODO DE
e cultura negativas). Estes controles permitiram avaliar as possibilidades de
contaminação durante o preparo da PCR e durante os procedimentos de extração,
além de avaliar a especificidade da técnica utilizada.
PRÉ-TRATAMENTO DAS LÂMINAS
No pré-tratamento das lâminas, utilizou-se xilol e N-acetil-L-cisteína (NALC)
em conjunto, cada uma destas substâncias de forma isolada ou apenas água
(sem xilol, sem NALC). O xilol foi utilizado na lavagem das lâminas a fim de
retirar o óleo mineral (segundo sugerido por Van der Zanden et al., 2003) e a
NALC foi usada para a fluidificação do escarro, que, após raspagem, era
recolhido diretamente para dentro de um microtubo estéril de 1,5 ml, previamente
identificado com o número da amostra.
EXTRAÇÃO DO DNA
O método utilizado neste estudo foi adaptado da técnica descrita por Salazar
et al. (1998) para obtenção de DNA a partir de sangue humano, e consistiu de
centrifugação inicial do escarro a 4.000 rpm, seguida de agitação em termomix
(300 rpm; 35ºC; 2 horas) e nova centrifugação (4000 rpm; 5 min). Após a
centrifugação, o sedimento foi suspenso em 305µL de solução de digestão preparada com 150µL de tampão de lise (300 mM/L Tris-HCl, pH 9.0; 100 mM/L
EDTA; 1,25% de SDS; 20% de sucrose), 150µL de tampão de homogeneização
(Tris-HCl pH 8.0; NaCl 1M; EDTA 0,5M, pH 8.0; 5% de sucrose) e 5µL de
Proteinase K [10mg/mL] e incubado em banho-maria a 56ºC, por pelo menos 4
horas. Após a retirada do banho-maria, foram adicionados ao microtubo 100µL
de NaCl a 5M, seguido de homogeneização por inversão e centrifugação a 12.000
rpm por 5 min, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido para
microtubo estéril e adicionou-se a ele 700µL de etanol absoluto gelado, seguido de
nova agitação por inversão. A amostra foi resfriada a -20ºC por 30 min, seguida de
centrifugação a 12.000 rpm por 5 min a 4ºC e desprezo do etanol por rápida
inversão do microtubo. O sedimento foi suspenso em 1mL de etanol a 70% gelado e
centrifugado novamente a 12.000 rpm por 5 min à temperatura de 4ºC, sendo o
etanol cuidadosamente removido no final desta etapa. O microtubo foi levado à
incubadora, a 37ºC, até que todo etanol fosse evaporado. Por fim, o DNA foi suspenso
em 100µL de água MilliQ autoclavada e incubado a 56ºC por 15 min para hidratação.
PRIMERS
Os primers utilizados neste trabalho foram originalmente descritos por
Eisenach et al. (1990) e amplificam uma seqüência de inserção repetitiva presente
em múltiplas cópias no genoma de micobactérias do Complexo M. tuberculosis,
C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007 –
405
ISMARI PERINI FURLANETO, EVELINE BEZERRA SOUSA, MICHELE LIMA DE BRITO, GEORGE LEANDRO
FERREIRA LIMA, MARIA LUÍZA LOPES, SILVIA HELENA MARQUES DA SILVA, KARLA VALÉRIA BATISTA LIMA
a IS6110, recentemente descrita em uma meta-análise como a seqüência que
produz maior acurácia no diagnóstico de TB (Flores et al., 2005). O produto da
amplificação é formado por fragmentos de 123 pares de base (pb) e a seqüência
dos oligonucleotídeos é: TB 1 (5' – CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG – 3') e TB
2 (5' – CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG – 3').
PROTOCOLO DE AMPLIFICAÇÃO DO DNA
Todas as amostras foram submetidas a um protocolo (ensaio com glicerol),
otimizado no laboratório de Biologia Molecular da SABMI/IEC, onde o mesmo
é utilizado para amplificação de DNA de M. tuberculosis a partir de escarro ou cultura.
Utilizaram-se reagentes do kit da Invitrogen® e, para volume final de 50µL,
2µL do DNA extraído foi acrescentado a 48 µL da mistura de reagentes da PCR
contendo 1,0 U da enzima Platinum Taq-DNA polimerase, 0,2mM de cada
desoxinucleotídeo, tampão 1X, 2,5mM de cloreto de magnésio, 200ng de cada
primer e 5 µL do adjuvante de PCR glicerol.
As amostras foram submetidas aos parâmetros de ciclagem, que consistiram
de uma fase inicial a 94ºC por 10 min, 35 ciclos com 1 min a 94ºC para
desnaturação, 1 min a 62ºC para hibridização e 1 min a 72ºC para extensão do
amplificado, em cada ciclo. Ao final, manteve-se a temperatura em 72ºC por 10
min para a polimerização dos fragmentos incompletos.
Um segundo protocolo foi utilizado, o qual continha todos os reagentes de
PCR descritos no ensaio com glicerol, com exceção do adjuvante de PCR, que foi
substituído pela betaína, na concentração final de 2M na reação. Neste caso, foi
necessário seguir as recomendações de redução da temperatura de desnaturação
para 92-93ºC e a redução de 1-2ºC na temperatura de hibridização, a fim de
compensar alguma diminuição na estabilidade da enzima causada pelo adjuvante
(Hengen, 1997; Stratagene, 2006).
Desta forma, a temperatura de desnaturação foi ajustada para 92ºC e a temperatura de hibridização para 60ºC, permanecendo inalteradas as outras condições.
O amplificado de 123 pb foi separado por eletroforese em gel de agarose a
2%, contendo brometo de etídio (1µg/mL), com tampão de corrida TAE 1X (TrisHCl, 1,0 M; ácido acético glacial 1,0 M; EDTA 0,5 M), analisado em transluminador
de luz ultravioleta e registrado em aparelho de fotodocumentação BioChemi.
ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS
A concordância entre os resultados obtidos por PCR e pela baciloscopia de
escarro foi avaliada por meio do índice Kappa. O teste t pareado foi utilizado
para comparar os resultados observados quando se utilizaram os diferentes
adjuvantes. A análise comparativa entre os métodos de remoção das amostras
406
– C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007
AVALIAÇÃO
DNA
ZIEHL-NEELSEN
DE DIFERENTES PROCEDIMENTOS PARA EXTRAÇÃO DE
A PARTIR DE ESFREGAÇOS CORADOS PELO MÉTODO DE
foi feita utilizando-se o Qui-quadrado partição. Para todos os testes utilizouse o software BioEstat 4.0 (Ayres et al., 2005). Foram aceitos como significativos
valores de p ≤ 0,05.
O projeto foi aprovado pelo CEP/IEC (Instituto Evandro Chagas) em
14 de junho de 2007, Carta 18/2007, protocolo CEP/IEC 0004/07,
CAAE: 0004.0.072.000-07.
3. RESULTADOS
Após obtenção das 196 amostras com baciloscopia positiva e das 20 BAAR
negativas, a PCR para amplificação do fragmento de 123pb da IS6110 foi
realizada de acordo com as condições químicas e térmicas propostas por Eisenach
et al. (1990). No entanto, os índices de positividade para PCR variaram de 52% a
77% após acréscimo do glicerol como adjuvante na reação de amplificação.
Diante dos resultados da PCR, foram avaliados alguns ajustes, como variações
na temperatura e período de tempo para hibridização dos oligonucleotídeos
iniciadores e utilização de outros adjuvantes como dimetil sulfóxido ou
betaína (dados não mostrados). A betaína foi, então, selecionada devido à melhora
observada nos resultados da PCR para o IS6110.
Dentre as 50 amostras que receberam o pré-tratamento com xilol e NALC,
52% (26/50) foram positivas na PCR realizada com glicerol e 70% (35/50)
amplificaram quando submetidas ao ensaio com betaína. No procedimento que
contemplou somente o uso de xilol, mostraram-se positivas, na PCR, 77%
(37/48) e 98% (47/48) das amostras, respectivamente, para os ensaios com glicerol
e com betaína. Das 49 amostras que receberam o pré-tratamento somente com
NALC, 53% (26/49) amplificaram após a PCR que utilizou glicerol como adjuvante
e 73% (36/49) mostraram-se positivas na PCR que utilizou a betaína. Em relação
às 49 amostras nas quais se utilizou apenas água para remoção do esfregaço a
partir da lâminas, 67% (33/49) foram positivas na PCR com glicerol e 96%
(47/49) foram positivas no ensaio com betaína.
As análises de concordância entre os resultados obtidos por PCR e pela
baciloscopia de escarro, conforme os diferentes procedimentos de remoção
empregados e o uso de adjuvante glicerol ou betaína, estão demonstradas nas
Tabelas 1 e 2, respectivamente.
Avaliando, pelo teste do Qui-Quadrado partição (resultados não mostrados),
os resultados obtidos entre os quatro diferentes procedimentos de remoção,
observamos que não houve diferença estatística entre o procedimento de
remoção que utilizou somente o xilol e o que utilizou apenas água (sem
xilol e sem NALC), independente do adjuvante usado nas PCR (glicerol
ou betaína) (p>0,05).
C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007 –
407
ISMARI PERINI FURLANETO, EVELINE BEZERRA SOUSA, MICHELE LIMA DE BRITO, GEORGE LEANDRO
FERREIRA LIMA, MARIA LUÍZA LOPES, SILVIA HELENA MARQUES DA SILVA, KARLA VALÉRIA BATISTA LIMA
Porém, quando avaliamos os resultados das amplificações que incluíram a
NALC no procedimento de remoção (uso conjunto com o xilol e uso da NALC
em separado) – em que houve piora nas amplificações –, as diferenças encontradas
entre estes resultados e os demais (uso somente do xilol ou sem nenhuma substância)
foram estatisticamente significantes (p<0,05). Desta forma, o uso de NALC não é
recomendado e o uso de xilol é dispensável durante os procedimentos de remoção.
Tabela 1
Resultados da PCR com o primer IS6110 (123 pb), no ensaio com glicerol, em relação à
baciloscopia de escarro (ZN).
Tabela 2
Resultados da PCR com o primer IS6110 (123 pb), no ensaio com betaína, em relação à
baciloscopia de escarro (ZN).
408
– C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007
AVALIAÇÃO
DNA
ZIEHL-NEELSEN
DE DIFERENTES PROCEDIMENTOS PARA EXTRAÇÃO DE
A PARTIR DE ESFREGAÇOS CORADOS PELO MÉTODO DE
Quanto à diferença nos resultados da amplificação entre os ensaios com
glicerol e com betaína, avaliada pelo teste t pareado, encontramos um valor de
p=0,0012. Desta forma, pode-se sugerir que o aumento na positividade das
amplificações pode ser devido à inclusão da betaína nas reações, pois observamos
que algumas amostras que tiveram fraca amplificação no ensaio com glicerol
apresentaram amplificação satisfatória no ensaio com betaína, da mesma forma,
amostras com baciloscopia positiva e com PCR negativa com glicerol amplificaram quando a betaína foi usada como adjuvante na reação (Figura 1).
Figura 1
Amplificação por PCR de fragmento de 123pb da seqüência de inserção IS6110 em gel de
agarose 2%. Linhas 1 a 7 e MT: ensaio com betaína. Linhas 1’ a 7’ e MT’, ensaio com
glicerol. MT: MT14323 (cepa de referência). Lad: Ladder 1 Kb plus (fragmentos de 100,
200, 300, 400, 500, 650, 850 e 100pb). 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7: amostras.
4. DISCUSSÃO
Apesar de vários artigos discutirem diversas técnicas e marcadores moleculares
para o diagnóstico da tuberculose, poucos detalham sobre os procedimentos
prévios a PCR ou uso de adjuvantes. O isolamento de ácidos nucléicos a partir de
espécimes clínicos em quantidade, pureza e integridade suficientes é uma fase
essencial na prática de biologia molecular. A qualidade do ácido nucléico depende
de muitos fatores e tem grande influência no resultado das técnicas que serão
nele aplicadas (Mesquita et al., 2001).
Neste trabalho, não foi observada diferença significativa entre os procedimentos
de extração quando o xilol foi utilizado para limpeza da lâmina, apesar de
diversos autores relatarem que compostos fenólicos atuam como inibidores da
PCR (revisado por Wilson, 1997; Viljoen et al., 2005). Esta informação é importante,
porque o uso de xilol para remoção do óleo de imersão a partir de lâminas de ZN
ainda é freqüente em unidades laboratoriais no Pará.
Ficou evidente que os procedimentos que contemplaram a pré-lavagem da
lâmina com n-acetil cisteína (NALC) foram os que obtiveram os menores percentuais
de amplificação. A NALC é o fluidificante mais utilizado em laboratórios de
C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007 –
409
ISMARI PERINI FURLANETO, EVELINE BEZERRA SOUSA, MICHELE LIMA DE BRITO, GEORGE LEANDRO
FERREIRA LIMA, MARIA LUÍZA LOPES, SILVIA HELENA MARQUES DA SILVA, KARLA VALÉRIA BATISTA LIMA
primeiro mundo e tem a vantagem de apresentar boa ação mucolítica. No entanto,
a alta afinidade do aminoácido cisteína por metais (Neshich et al., 2002; Neisse,
2006) pode ter interferido na disponibilidade do magnésio, essencial para a
atividade da enzima DNA polimerase.
O percentual de positividade para amplificação do fragmento de 123 pb do
alvo IS6110 obtido neste trabalho (84,2% quando betaína foi usado como
adjuvante) foi um pouco superior ao encontrado por Narayanan et al. (2001), que
obtiveram 80,6% de positividade na PCR utilizando os mesmos primers para a
detecção de M. tuberculosis em amostras de líquido cefalorraquidiano.
Independente do procedimento utilizado para remoção do esfregaço, notouse que a concordância entre os resultados obtidos por baciloscopia e PCR foram
melhores quando a betaína foi usada como adjuvante na reação de amplificação.
Gunisha et al. (2000) obtiveram sensibilidade de 30,0% e especificidade de
95,6% utilizando o mesmo primer para detecção de M. tuberculosis a partir de
espécimes clínicos.
Segundo Rees et al. (1993), Weissensteiner e Lanchburry (1996), Henke et al.
(1997) e Frackman et al. (1998), a adição da betaína melhora substancialmente
o rendimento e a especificidade da amplificação de muitas seqüências
alvo, especialmente aquelas que contêm um número elevado de guanina (G) e
citosina (C). Os primers utilizados neste estudo apresentam 75% de C+G.
A betaína é um osmoprotetor natural e diminui a temperatura de desnaturação
das regiões ricas em G+C a uma temperatura similar à necessária para as regiões
que contêm adenina (A) e Timina (T) (Rees et al., 1993). O uso da betaína tem sido
recomendado devido às suas características de baixa toxicidade, baixo custo e
menor viscosidade que o glicerol, por ser compatível com várias enzimas e ainda
por aumentar a estabilidade das proteínas e proteger a DNA polimerase da
desnaturação térmica (Weissensteiner & Lanchburry, 1996; Santoro et al., 1992).
De acordo com Hengen (1997), a betaína também permite que a PCR supere
baixos níveis de contaminantes que podem co-purificar junto com o DNA,
permitindo, assim, PCR com amostras de DNA de menor qualidade.
Quanto ao insucesso das amplificações (37,8% no ensaio com glicerol e 15,8%
no ensaio com betaína), pode ser devido à presença de contaminantes com ação
inibidora sobre a enzima DNA polimerase, que podem ser componentes do próprio
escarro ou traços de dodecil sulfato de sódio (SDS) (Weekes et al., 1994; Suffys
et al., 2001). O tratamento da distensão durante a coloração de ZN é por si só
altamente agressiva à micobactéria, podendo ocasionar lise bacteriana e degradação
do DNA (Van der Zanden et al., 2003), devido à forte acidez dos reagentes utilizados.
Enfim, não se deve desconsiderar a possibilidade de casos com baciloscopia
positiva decorrente da presença de micobactérias não tuberculosas, portanto,
410
– C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007
AVALIAÇÃO
DNA
ZIEHL-NEELSEN
DE DIFERENTES PROCEDIMENTOS PARA EXTRAÇÃO DE
A PARTIR DE ESFREGAÇOS CORADOS PELO MÉTODO DE
PCR negativo para a seqüência de inserção IS6110. Para eliminar este tipo de
viés, seria necessária a avaliação de baciloscopias com diagnóstico confirmado
por cultura e/ou outras técnicas aplicadas ao diagnóstico da tuberculose.
A partir dos resultados obtidos, recomendamos a utilização da água (sem prétratamento com xilol ou fluidificante NALC) apenas como facilitador para remoção
do escarro a partir das lâminas coradas pelo método de ZN e sugerimos a inclusão
do adjuvante betaína nas reações (acompanhadas das mudanças nas temperaturas
de desnaturação do DNA e hibridização dos primers).
A possibilidade de se obter DNA a partir de lâminas de ZN é uma alternativa
valiosa para suprir a falta de amostras representativas para estudos de
genotipagem e também para resolver o problema do transporte do espécime,
principalmente em locais onde a própria geografia é um empecilho para se ter
acesso a essas amostras.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AYRES, M.; AYRES JR.; M. AYRES, D. L.; SANTOS, A. S. Bioestat 4.0: Aplicações
estatísticas nas áreas das ciências biológicas e médicas. Sociedade Civil Mamirauá,
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico: Brasília,
2005. 272p.
BOLLELA, V. R.; SATO, D. N.; FONSECA, B. A. L. Problemas na padronização da
reação em cadeia da polimerase para diagnóstico da tuberculose pulmonar.
Revista de Saúde Pública. São Paulo, v. 33, n. 3. p. 281 - 286, 1999.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia de Vigilância
Epidemiológica. 6. ed. Brasília: Ministério da Saúde, 2005a. 816p.
______. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Dados e
indicadores selecionados 2005. Publicação periódica editada pelo Departamento de
Análise de Situação em Saúde. Brasília: Ministério da Saúde, v. 3, n. 3, 2005b.
BAREA, J. A.; PARDINI, M. I. M. C.; GUSHIKEN, T. Extração de DNA de materiais de
arquivo e fontes escassa para utilização em reação de polimerização em cadeia
(PCR). Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. v. 26, n. 4, p. 274 - 281, 2004.
BARNES, P. F.; BARROWS, S. A. Tuberculosis in the 1990s. Annual International
Medicine. v. 119. n. 5. p. 400 - 410, 1993.
CAVALCANTI, V. Tuberculose: diagnóstico precoce ainda é essencial na luta contra a doença.
Ministério da Saúde. Sistema Nacional de Auditoria. 2006. Disponível em:
< http://sna.saude.gov.br/?id=2875>. Acesso em: 27 mar. 2006.
C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007 –
411
ISMARI PERINI FURLANETO, EVELINE BEZERRA SOUSA, MICHELE LIMA DE BRITO, GEORGE LEANDRO
FERREIRA LIMA, MARIA LUÍZA LOPES, SILVIA HELENA MARQUES DA SILVA, KARLA VALÉRIA BATISTA LIMA
EISENACH, K. D.; CAVE, M. D.; BATES, J. H.; CRAWFORD, J. T. Polymerase chain
reaction amplification of a repetitive DNA sequence specific for Mycobacterium
tuberculosis. Journal of Infectious Diseases. v. 161, n. 5, p. 977 - 981, 1990.
FLORES, L. L.; MADHUKAR, P.; COLFORD, J. M. In-house nucleic acid amplification
tests for the detection of Mycobcterium tuberculosis in sputum specimens: meta-analysis
and meta-regression. BioMed Central Microbiology. v. 55, n. 5, p. 1 - 10, 2005.
FRACKMAN, S.; KOBS, G.; SIMPSON, D. Betaine and DMSO: enhancing agents for
PCR. Promega Notes. n. 65, p. 27 - 30, 1998.
GONZALEZ, J. V.; VILLEGA SILVA, R.; LÓPEZ SÁNCHEZ, S. J.; SHOR, A. F.
Citomegalovirus: diseminación de la infección en relación con los avances científicos
y cambios sociales. Revista Mexicana de Pediatria. v. 55, n. 1, p. 19 - 27, 1988.
GUNISHA, P.; MADHAVAN, H. N.; JAYANTHI, U. Polymerase Chain Reaction using
IS6110 primer to detect Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. Indian
Journal Pathology Microbiology, v. 43, n. 4, p. 395 - 402, 2000.
HENGEN, P. N. Optimizing multiplex and LA-PCR with betaine. Trends
Biochemistry Sciences, v. 22, n. 6, p. 225 - 226, 1997.
HENKE, W.; HERDEL, K.; JUNG, K. Betaine improves the PCR amplification of
GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Research. v. 25, n. 19, p. 3957 - 3958, 1997.
KAMERBEEK, J.; SCHOULS, L.; KOLK, A.; VAN AGTERVELD, M.; VAN SOOLINGEN, D.;
KUIJPER, S.; BUNSCHOTEN, A.; MOLHUIZEN, H.; SHAW, R.; GOYAL, M.; VAN
EMBDEN, J. Simultaneous detection and strains differentiation of Mycobacterium
tuberculosis for diagnosis and epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. n. 35, n. 4,
p. 907 - 914, 1997.
MARCHETTI, G.; GORI, A.; CATOZZI, L. Evaluation of PCR in detection of
Mycobacterium tuberculosis from formalin-fixed, parffin-embedded tissues:
comparison of four amplification assays. Journal of Clinical Microbiology. v. 36,
n. 6, p. 1512 - 1517, 1998.
MESQUITA, R. A.; ANZAI, E. K.; OLIVEIRA, R. N; NUNES. F. D. Avaliação de três
métodos de extração de DNA de material parafinado para amplificação de
DNA genômico pela técnica da PCR. Pesquisa Odontológica Brasileira. São Paulo,
v. 15, n. 4, p. 314-319, 2001.
NARAYANAN, S.; PARANDAMAN, V.; NARAYANAM, P. R. Evaluation of PCR using
TRC4 and IS6110 primers in detection of tuberculous meningitis. Journal of
Clinical Microbiology. v. 39, n. 5, p. 2006 - 2008, 2001.
412
– C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007
AVALIAÇÃO
DNA
ZIEHL-NEELSEN
DE DIFERENTES PROCEDIMENTOS PARA EXTRAÇÃO DE
A PARTIR DE ESFREGAÇOS CORADOS PELO MÉTODO DE
NEISSE, F. Efeito do peróxido de carbamida e dos metais presentes no amálgama dental sobre a
atividade da -ala-D hepática (E.C.:4.2.1.24), e os níveis de peroxidação lipídica em ratos.
2006. 97p. Dissertação (Mestrado em Bioquímica Toxicológica). Universidade
Federal de Santa Maria, Santa Maria.
NESHICH, G.; GUELFI, A.; MOLINA, S. M. G. Determinação da estrutura e estudo
da função da metalotioneína de Synechococcus com ferramentas da
bioinformática. Embrapa. Comunicado Técnico. São Paulo, n. 43. p. 1 - 6, 2002.
PALOMINO, J. C.; LEÃO, S. C.; RITACCO, V. Tuberculosis 2007. From basic science to
patient care. Disponível em: <http://www.tuberculosisTextbook.com>. Acesso
em. 19 out. 2007
POLJAK, M.; SEME, K.; GALE, N. Rapid extraction of DNA from archival clinical
specimens: our experiences. Pflügers Archives European Journal Physiology. v. 439, n. 7,
p. R042-R044, jan. 2000.
REES, W. A.; YAGER, T. D.; KORTE, J. Betaine can eliminate the base pair
composition dependence of DNA meeting. Biochemistry. v. 32, n. 1, p. 137 - 140, 1993.
SALAZAR, L. A.; HIRATA, M. H.; CAVALLI, S. A.; MACHADO, M. O.; HIRATA, R. D.
C. Optimized Procedure for DNA Isolation from fresh and cryopreserved
clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. v. 44,
p. 1748-1750, 1998.
SANTORO, M. M.; LIU, Y.; KHAN, S.M.A.; HOU, L.X.; BOLEN, D.W. Increased
thermal stability of proteins in the presence of naturally occurring osmolytes.
Biochemistry. n. 31, p. 5278 - 5283, 1992.
STRATAGENE. PCR guidelines and optimization. Technical tools. Nucleic Acid
Analysis. Disponível em: <https://www.stratagene.com/pdf/mobio/
Nucleic%20Acids_ PCR% 20Guidelines%20&%20Optimization.pdf>. Acesso
em. 14 nov. 2006.
SUFFYS, P. N.; ARAUJO, M. E. I.; ROSSETTI, M. L. R.; ZAHA, A.; BARROSO, E. W.;
BARRETO, A. M. W.; CAMPOS, E.; VAN SOOLINGEN, D.; KREMER, K.; HEERSMA, H.;
DEGRAVE, W. M. Usefulness of IS6110-restriction fragment length
polymorphism typing of Brazilian strain of Mycobacterium tuberculosis and
comparison with an international fingerprint database. Research in Microbiology.
v. 151, n. 5, p. 343 - 351, 2000.
SUFFYS P. N.; VANDERBORGHT, P. R.; SANTOS, P. B. Inhibition of the polymerase
chain reaction by sputum samples from tuberculosis patients after processing
C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007 –
413
ISMARI PERINI FURLANETO, EVELINE BEZERRA SOUSA, MICHELE LIMA DE BRITO, GEORGE LEANDRO
FERREIRA LIMA, MARIA LUÍZA LOPES, SILVIA HELENA MARQUES DA SILVA, KARLA VALÉRIA BATISTA LIMA
using a silica-guanidiniumthiocyanate DNA isolation procedure. Memórias do
Instituto Oswaldo Cruz. v. 96, n. 8, p. 1137 - 1139, 2001.
VAN DER ZANDEN, A. G. M.; HOENTJEN, A. H.; HEILMANN, F. G.; WELTEVREDEN,
E. F.; SCHOULS, L. M.; VAN EMBDEN, J. D. Simultaneous detection and strain
differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex in paraffin wax
embedded tissues and in stained microscopic preparations. Molecular Pathology.
v. 51, n. 4, p. 209 - 214, 1998.
VAN DER ZANDEN, A. G. M.; TE KOPPELE-VIJE, E. M.; VIJAYA BHANU, N.; VAN
SOOLINGEN, D.; SCHOULS, L. M. Use of DNA extracts from Ziehl-NeelsenStained slides for molecular detection of rifampin resistance and spoligotyping
of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. v. 41, n. 3,
p. 1101 - 1108, 2003.
VILJOEN, G. J.; NEL, L. H.; CROWTHER, J. R. Molecular diagnostic PCR handbook.
Netherlands: SpringerLink, 2005. cap. 4, 307p.
WEEKES, K. M.; PEARSE, M. J.; SIEVERS, A.; ROSS, B. C.; D’APICE, A. J. The
diagnostic use of the polymerase chain reaction for the detection of
Mycobacterium tuberculosis. Pathology. v. 26. n. 4, p. 482 - 486, 1994.
WEISSENSTEINER, T.; LANCHBURRY, J. S. Strategy for controlling preferential
amplification and avoid false negatives in PCR typing. BioTechniques. v. 21, n. 6,
p. 1102 - 1108, 1996.
WILSON, I. G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and
Environmental Microbiology. v. 63, n. 10, p. 3741 - 3751, 1997.
414
– C A D . S A Ú D E C O L E T ., R I O
DE
J A N E I R O , 15 (3): 401 - 414, 2007