UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e
Farmacologia
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA ANGIOTENSINA-(1-7) E DO SEU
RECEPTOR MAS NO CONTROLE DA FUNÇÃO CARDÍACA
UTILIZANDO ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS
Carlos Henrique de Castro
Belo Horizonte
Agosto – 2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e
Farmacologia
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA ANGIOTENSINA-(1-7) E DO SEU
RECEPTOR MAS NO CONTROLE DA FUNÇÃO CARDÍACA
UTILIZANDO ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Fisiologia e Farmacologia
do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais
como requisito parcial à obtenção do
título de Doutor em Ciências, área de
concentração Fisiologia
Orientador: Prof. Dr. Robson Augusto Souza dos Santos
Co-Orientador: Prof. Dr. Alvair Pinto de Almeida
Belo Horizonte
Agosto – 2008
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DEDICATÓRIAS
À Deus,
Por estar sempre ao meu lado, abençoando e iluminando minhas decisões.
À minha esposa Elisandra,
Me acompanhou e me apoiou incondicionalmente desde o início desta jornada.
Amor, compreensão e cumplicidade foram fundamentais para chegarmos juntos
até aqui.
Aos meus pais e minha irmã,
Com dignidade, humildade e respeito me ensinaram o caminho do crescimento
intelectual e professional.
Ao meu sogro e à minha sogra, Luiz e Fátima,
Pelos preciosos conselhos, pessoais e profissionais.
5
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, professor Dr. Robson Augusto Souza dos Santos, os mais
sinceros agradecimentos. Sua confiança e orientação foi capaz de me trilhar para
um imenso crescimento professional.
Ao meu co-orientador, professor Dr. Alvair Pinto de Almeida, foi um grande
responsável por esta conquista. Um grande incentivador e conselheiro.
Ao Departamento de Fisiologia e Biofísica, ICB-UFMG, por ter possibilitado a
realização deste trabalho.
Ao professor Dr. Anderson José Ferreira, pelos conselhos e colaborações que
foram importantes para a realização deste trabalho. Agradeço também pela
grande amizade.
Aos técnicos Elizabeth Dias Bomtempo e José Roberto, pelo empenho,
disposição e amizade.
Aos professores e colegas dos laboratórios de Hipertensão e de Fisiologia
Cardiovascular do Departamento de Fisiologia, ICB, UFMG.
Aos professores e colegas dos laboratórios de Biologia do Desenvolvimento e de
Matriz Extracelular e Desenvolvimento do Coração do Departamento de
Morfologia, ICB, UFMG.
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RESUMO
INTRODUÇÃO: O Sistema Renina-angiotensina (SRA) é um sistema essencial
para a regulação das funções cardiovasculares, além de estar envolvido na
patogênese de várias doenças cardiovasculares. Um importante avanço na
compreensão do SRA foi o reconhecimento da Ang-(1-7) como um peptídeo
biologicamente ativo. A identificação da proteína Mas como receptor da Ang-(1-7)
forneceu uma base molecular importante para a significância biológica deste
peptídeo.
OBJETIVOS: O objetivo deste trabalho foi investigar o papel da Ang-(1-7) e do
seu receptor Mas na função e remodelamento cardíaco e na resistência vascular
coronariana.
MATERIAIS E MÉTODOS: Para avaliar diretamente o papel do receptor Mas e o
efeito do Ang-(1-7) especificamente no coração, nós utilizamos camundongos
com deleção genética para o receptor Mas (KO-Mas) e ratos transgênicos
[TG(hA1-7)L7301] (TG) que superexpressam uma proteína de fusão produtora de
Ang-(1-7) especificamente no coração. A função cardíaca foi avaliada usando a
preparação de coração isolado. Os corações dos camundongos KO-Mas e de
seus controles selvagens [Wild Type (WT)], foram submetidos a 20 minutos de
isquemia global após 30 minutos de estabilização. O fluxo foi reiniciado e os
corações foram reperfundidos por 30 minutos. Em um grupo adicional de
camundongos WT, o antagonista do receptor Mas, A-779, foi acrescentado na
solução de perfusão. Além disso, foi avaliada a participação do receptor Mas no
efeito vasodilatador coronariando da acetilcolina. Após um período de 30 min de
estabilização, os corações foram submetidos à estimulação elétrica (450 bpm) e
perfundidos por 20 min com acetilcolina (10-7 M). Nos corações dos ratos TG e
SD, após um período basal de 20 min, a artéria coronária descendente esquerda
foi ocluída por 15 minutos induzindo uma isquemia regional. A ligadura foi liberada
e os corações foram reperfundidos por mais 30 minutos. Os níveis de Ang-(1-7)
no plasma e coração dos ratos TG e SD foram determinados por
Radioimunoensaio. Hipertrofia e fibrose cardíaca foram induzidas pelo tratamento
com isoproterenol (3 mg/kg i.p. por 7 dias nos ratos e 20 mg/kg s.c. por 5 dias nos
camundongos). A quantificação dos colágenos I e III e fibronectina foi realizada
utilizando a técnica de imunofluorescência e microscopia confocal. Cortes dos
ventrículos esquerdos foram corados com hematoxilina e eosina para análise
morfométrica.
RESULTADOS: Os corações isolados dos camundongos KO-Mas e WT
perfundidos com A-779 apresentaram menor tensão sistólica, +dT/dt, - dT/dt e
frequência cardíaca. Durante a isquemia, os corações WT apresentaram
diminuição na tensão sistólica e aumento da tensão diastólica. Na reperfusão foi
observado um aumento na tensão sistólica e diastólica nos corações WT. A
deleção genética ou o bloqueio do receptor Mas atenuou estas alterações. Os
corações TG apresentaram níveis aumentados de Ang-(1-7) no coração sem
diferenças significativas no plasma. Em condições basais, a tensão sistólica,
+dT/dt e -dT/dt foram maiores nos corações dos ratos TG. Já a frequência
cardíaca foi menor nestes animais. Além disso, os corações isolados dos ratos
TG mostraram menor incidência e duração das arritmias de reperfusão
comparado com SD. O aumento na área de secção transversa dos cardiomiócitos
7
induzido pelo isoproterenol foi significativamente maior nos corações dos
camundongos KO-Mas. Além disso, a deposição de colágeno III induzida por este
mesmo tratamento também foi maior nos corações KO-Mas. O efeito hipertrófico
induzido pelo isoproterenol não foi bloqueado pela superexpressão da Ang-(1-7)
nos ratos TG. Entretanto, os corações destes animais apresentaram menor
deposição de colágeno III e fibronectina. A pressão de perfusão foi maior nos
corações dos camundongos KO-Mas e WT perfundidos com A-779.
Surpreendentemente, o efeito da acetilcolina na resistência coronariana foi
completamente ausente nos corações KO-Mas. A vasodilatação coronariana
induzida pela acetilcolina não foi alterada nos animais KO-AT1, mas foi maior nos
corações KO-AT2. O fluxo coronariano foi menor nos ratos TG, mas aumentou
significativamente durante a reperfusão quando comparado aos ratos SD.
CONCLUSÃO: Estes resultados indicam que o eixo Ang-(1-7)-Mas exerce um
papel essencial na função cardíaca durante a isquemia/reperfusão e na
modulação da função endotelial dos vasos coronarianos. Além disso, este estudo
mostra uma participação cardioprotetora da Ang-(1-7) e do seu receptor Mas no
remodelamento cardíaco.
8
ABSTRACT
BACKGROUND: The renin–angiotensin system (RAS), an important regulator of
cardiovascular functions, plays a major role in the pathogenesis of cardiovascular
diseases. One important advance in the understanding of the RAS was the
recognition that Angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] is a biologically-active product of the
RAS. The recent identification of the G-protein-coupled receptor Mas as an Ang(1-7) receptor has provided evidence for its biological significance.
AIM: The aim of this study was to investigate the role of Ang-(1-7) and its receptor
Mas on cardiac function, remodeling and coronary vascular resistance.
MATERIALS AND METHODS: To directly investigate the role of receptor Mas and
the effects of Ang-(1-7) specifically in the heart we used Mas knockout mice and
transgenic rats [TG(hA1-7)L7301] (TG) which express an Ang-(1-7)-producing
fusion protein in the heart. Cardiac function was examined using isolated heart
preparations. Hearts from Wild Type (WT) and Mas knockout mice (KO-Mas) were
subjected to 20 min of global ischemia after 30 min of stabilization. The flow was
restarted and the hearts were reperfused for 30 min. An additional group of WT
mice was perfused with Ang-(1-7) receptor Mas antagonist A-779. In addition, we
evaluate the influence of receptor Mas on the effect of acetylcholine in the
coronary resistance. Following a stabilization period of 30 min, hearts were
subjected to pacing (450 bpm) and perfused for 20 minutes with acetylcholine (10-7
M). In hearts from SD and transgenic rats, after a basal period of 20 min, local
ischemia was induced by left anterior descending coronary artery occlusion for 15
minutes. The ligature was released and reperfusion was performed for an
additional 30 minutes. Ang-(1-7) level was determined by radioimmunoassay (RIA)
in plasma and heart from transgenic and SD rats. Heart hypertrophy and fibrosis
were induced by isoproterenol (3 mg/kg i.p./day for 7 days in rats and 20 mg/kg
s.c./day for 5 days in mice). Quantification of collagen types I and III, plus
fibronectin was performed using immunofluorescence-labeling techniques and
confocal microscopy. Tissue sections from left ventricle were stained with
hematoxylin–eosin for cell morphometry.
RESULTS: Isolated hearts of KO-Mas and WT treated with A-779 presented a
decreased systolic tension, +dT/dt, -dT/dt, and heart rate. Upon global ischemia
WT hearts showed a significant decrease in systolic tension and an increase in
diastolic tension. During reperfusion an increase in systolic and diastolic tension
was observed in WT mice. Deletion or blockade of Mas markedly attenuated these
changes in isolated hearts. Heterozygous TG presented a significant increase in
cardiac Ang-(1-7) concentration compared with control rats without any significant
change in plasma Ang-(1-7) levels. At basal conditions, hearts from TG rats
showed a higher systolic tension, + dT/dt, and - dT/dt and a lower heart rate. In
addition, isolated hearts from TG rats showed reduced incidence and duration of
reperfusion arrhythmias in comparison with SD rats. Cardiomyocyte crosssectional area was significantly higher in isoproterenol-treated KO-Mas mice when
compared with isoproterenol-treated WT mice. Moreover, KO-Mas mice presented
a significant increase of isoproterenol-induced collagen type III deposition. The
hypertrophic effect induced by isoproterenol treatment was not blocked by the
overexpression of Ang-(1-7) in the heart transgenic rats. However hearts from TG
rats showed a less pronounced deposition of collagen type III and fibronectin
9
induced by isoproterenol treatment than in corresponding controls. Isolated hearts
from Mas-KO and WT treated with A-779 presented an increase in the perfusion
pressure in the baseline period. Strikingly, the effect of acetylcholine on coronary
resistance was blunted in KO-Mas. However, acetylcholine-induced coronary
vasodilation was actually increased in KO-AT2 when compared with WT mice.
Acetylcholine induced a similar coronary vasodilation in KO-AT1 and its control
mice hearts. The coronary flow was decreased in TG rats at basal conditions.
However, it significantly increased during the reperfusion after ischemia when
compared with normal rats.
CONCLUSION: These results indicate that Ang-(1-7)-Mas axis plays a key role in
the cardiac function during ischemia/reperfusion and in the modulation of
endothelial function of coronary vessels. Moreover, this study shows a marked
cardioprotective role of Ang-(1-7) and its receptor Mas in cardiac remodeling.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ilustração do Sistema renina-angiotensina mostrando as vias de
formação de angiotensinas e seus recepores. AP, Aminopeptidases; ECA, Enzima
Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; NEP,
Endopeptidase Neutra; PCP, Prolil-carboxipeptidase; PEP, Prolil-endopeptidase,
AT, Receptor de Angiotensina.
Figura 2. Vias contra-regulatórias do Sistema renina-angiotensina. ECA, Enzima
Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; AT,
Receptor de Angiotensina.
Figura 3. Diagrama esquematizando os protocolos experimentais.
Figura 4. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779
na tensão sistólica (A) e diastólica (B) de corações isolados de camundongos
antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a
técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; # WT vs WT perfundidos com KR contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way
Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni).
Figura 5. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779
na +dT/dt (A) e -dT/dt (B) de corações isolados de camundongos antes, durante e
após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de
Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R
contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way
Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni).
Figura 6. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779
na freqüência cardíaca de corações isolados de camundongos antes, durante e
após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de
Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R
contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way
Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni).
Figura 7. Avaliação dos níveis de Ang-(1-7) nos corações (A) e plasma (B) de
ratos SD e TG. *p<0.05 comparado com os corações de ratos SD. Os valores
estão expressos como média ± EPM (Teste t-student).
Figura 8. Avaliação da tensão sistólica (A) e diastólica (B) em corações isolados
de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de
Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados
em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001
comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como
média ± EPM (Teste t-student).
Figura 9. Avaliação da +dT/dt (A) e –dT/dt (B) em corações isolados de ratos
TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O
11
valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de
5 minutos durante 20 minutos do período basal. *p<0.001 comparado com os
corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste tstudent).
Figura 10. Avaliação da freqüência cardíaca (A) e do trabalho cardíaco (B) em
corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela
técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores
coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. *
p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos
como média ± EPM (Teste t-student).
Figura 11. Avaliação do índice de severidade de arritmias (ISA) (A) e incidências
das arritmias de reperfusão irreversíveis (B) em corações isolados de ratos
TG(hA1-7)L7301 submetidos a oclusão da coronária descendente esquerda. Os
corações foram analisados pela técnica de Langendorff. * p<0.05 comparado com
os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste
t-student).
Figura 12. Efeito da deleção genética do receptor Mas na resposta hipertrófica
induzida por isoproterenol. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ±
EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls).
Figura 13. (A) Imunolocalização de colágeno III em ventrículo esquerdo de
camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. A imagem
inserida no canto superior direito representa o nível de marcação obtido quando o
anticorpo primário não foi usado na incubação (controle negativo). (B)
Quantificação da marcação do colágeno III nos ventrículos esquerdos de
camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os
valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias.
Figura 14. (A) Imunolocalização de colágeno I em ventrículo esquerdo de
camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. (B)
Quantificação da marcação do colágeno I nos ventrículos esquerdos de
camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os
valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias.
Figura 15. (A) Imunolocalização de fibronectina em ventrículo esquerdo de
camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. (B)
Quantificação da marcação de fibronectina nos ventrículos esquerdos de
camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os
valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias.
Figura 16. Avaliação da resposta hipertrófica em ratos TG(hA1-7)L7301 induzida
por isoproterenol. *p<0,01. Os valores estão expressos como média ± EPM (Oneway Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls).
12
Figura 17. (A) Imunolocalização de colágeno III em ventrículo esquerdo de ratos
TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. A imagem inserida
no canto superior direito representa o nível de marcação obtido quando o
anticorpo primário não foi usado na incubação (controle negativo). (B)
Quantificação da marcação de colágeno III nos ventrículos esquerdos de ratos
TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores
estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de
Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias.
Figura 18. (A) Imunolocalização de fibronectina em ventrículo esquerdo de ratos
TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da
marcação de fibronectina nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e
SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos
como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls);
U.A., unidades arbitrárias.
Figura 19. (A) Imunolocalização de colágeno I em ventrículo esquerdo de ratos
TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da
marcação de colágeno I nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e
SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos
como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls);
U.A., unidades arbitrárias.
Figura 20. (A) Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista
A-779 na pressão de perfusão coronariana de corações isolados de
camundongos antes, durante e após isquemia. (B) Curva da pressão de perfusão
no período da reperfusão utilizada para análise do t1/2. As linhas pontilhadas
representam os valores do t1/2 dos animais indicados. Os corações foram
perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #
p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão
expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de
Bonferroni).
Figura 21. Avaliação do efeito vasodilatador da acetilcolina 10-7 mol/L em
corações isolados de camundongos KO-Mas (A), KO-AT2 (B) e KO-AT1 (C). Os
corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05
comparado ao grupo controle. Os valores estão expressos como média ± EPM
(Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni).
Figura 22. Avaliação do fluxo coronariano em corações isolados de ratos
TG(hA1-7)L7301 em condições basais (A) e durante isquemia/reperfusão (B). Os
corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal
foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20
minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os
valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student).
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição da solução de Krebs-Ringer.
Tabela 2. Índice de Severidade de Arritmias.
Tabela 3. Coquetel de Inibidores de Proteases.
Tabela 4. Soluções e volumes utilizados para RIE de Ang-(1-7).
Tabela 5. Curva padrão para dosagem de proteína.
Tabela 6. Descrição dos procedimentos realizados para o processo de inclusão
dos tecidos.
Tabela 7. Especificação dos anticorpos utilizados na técnica de imunofluorescência indireta.
Tabela 8. Descrição dos procedimentos para a realização da técnica de
imunofluorescência.
Tabela 9. Descrição dos procedimentos para a realização da coloração dos cortes
histológicos com hematoxilina e eosina.
14
LISTA DE ABREVIATURAS
A-779, antagonista do receptor Mas
ACN, acetonitrila
Ang I, Angiotensina I
Ang II, Angiotensina II
Ang IV, Angiotensina IV
Ang-(1-7), Angiotensina-(1-7)
AP, Aminopeptidases;
AT1, subtipo 1 do receptor de angiotensina II
AT2, subtipo 2 do receptor de angiotensina II
BSA, albumina de soro bovino
DMSO, dimetilsulfóxido
ECA, Enzima Conversora de Angiotensina;
ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2;
EPM, erro pardrão da média
HFBA, ácido heptafluorobutírico
KO-AT1, camundongos com deleção genética do receptor AT1
KO-AT2, camundongos com deleção genética do receptor AT2
KO-Mas, camundongos com deleção genética do receptor Mas
MEC, matriz extracelular
NEP, Endopeptidase Neutra;
PCP, Prolil-carboxipeptidase;
PD 123319, antagonista do receptor AT2
PEP, Prolil-endopeptidase,
15
SD, Sprague Dawley
SRA, Sistema renina-angiotensina
TFA, ácido trifluoracético
TG, rato transgênico
WT, Wild Type, camundongos controles
16
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................... IV
ABSTRACT ...............................................................................................................
VI
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................
VIII
LISTA DE TABELAS .................................................................................................
XI
LISTA DE ABREVEATURAS ....................................................................................
XII
SUMÁRIO................................................................................................................... XIV
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................
18
1.1. Sistema renina-angiotensina ...........................................................................
18
1.2. Receptores do sistema renina-angiotensina ...................................................
29
1.3. SRA e a estrutura cardíaca .............................................................................
32
2. OBJETIVOS ..........................................................................................................
37
2.1. Objetivo geral ..................................................................................................
37
2.2. Objetivos específicos ....................................................................................... 37
3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................
38
3.1. Animais ............................................................................................................ 38
3.2. Preparação dos corações isolados ............................................................................... 38
3.2.1. Protocolos ...............................................................................................
40
A. Isquemia/Reperfusão ..............................................................................................
40
B. Avaliação do efeito vasodilatador da Acetilcolina ...................................
41
3.3. Radioimunoensaio ..............................................................................................
43
3.3.1. Coleta do Coração e Plasma dos Ratos Transgênicos TG(hA1-7)L7301
e SD............................................................................................................
43
17
3.3.2. Homogeneização de tecidos, extração das amostras e dosagens dos
peptídeos .......................................................................................................
44
A. Homogeneização do ventrículo esquerdo ....................................................
44
B. Extração da Ang-(1-7) do plasma e ventrículo esquerdo em colunas Bond
Elut - C18 ...........................................................................................................
44
C. Radioimunoensaio para Angiotensina-(1-7) .................................................
45
3.3.3. Dosagem de Proteínas ................................................................................
47
3.4. Tratamento com isoproterenol .........................................................................
48
3.5.
Processamento
do
material
para
análises
de
morfometria
e
imunofluorescência .........................................................................................
48
3.6. Análise dos colágenos I e III e fibronectina por Imunofluorescência ...............
49
3.6.1. Análise quantitativa de colágenos I e III e fibronectina ..............................
52
3.7. Análise Morfométrica ..........................................................................................
52
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA ..........................................................................................
54
5. RESULTADOS ...........................................................................................................
55
5.1. Efeito da deleção genética do receptor Mas na Contratilidade Cardíaca .......
55
5.2. Avaliação da função cardíaca em ratos transgêncios TG(hA1-7)L7301 que
superexpressam Angiotensina-(1-7) no coração ..........................................
60
5.3. Avaliação da incidência de arritmias de reperfusão em corações isolados de
ratos que superexpressam Ang-(1-7) no coração .........................................
66
5.4. Avaliação da resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em
animais com deleção genética do receptor Mas ............................................
67
5.5. Avaliação da resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em
animais TG(hA1-7)L7301 que superexpressam Angiotensina-(1-7) no
coração ...........................................................................................................
72
18
5.6. Avaliação da participação do receptor Mas e da Angiotensina-(1-7) nos
vasos coronarianos em condições basais e pós-isquêmicas ......................... 77
6. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 83
7. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 98
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 99
19
1. INTRODUÇÃO
1.1. Sistema renina-angiotensina
O Sistema Renina-angiotensina (SRA) é um importante sistema envolovido
na regulação de diferentes funções, especialmente a regulação central e
periférica da pressão arterial e do equilíbrio hidro-eletrolítico, além de estar
envolvido na patogênese de várias doenças cardiovasculares (Morishita et al.,
2000; Oudit et al., 2003). Após as primeiras descobertas sobre o SRA, há mais de
um século, muito se avançou na compreensão de sua fisiologia e fisiopatologia.
Os primeiros estudos relacionados ao SRA foram realizados por Tiegerstedt e
Bergman em 1898, os quais observaram que extratos de rim não purificados
causavam um aumento prolongado na pressão arterial de animais anestesiados
(Tiegerstedt and Bergman, 1898; Inagami, 1998). Eles chamaram a substância
responsável pelo aumento da pressão arterial de renina. Já em 1940, BraunMendes e colaboradores e Page & Helmer, relataram que o peptídeo pressórico
não era a renina, e sim um produto da ação enzimática dessa substância sobre
uma proteína plasmática (Braun-Menendez et al., 1940; Page and Helmer, 1940).
Este produto foi posteriormente denominado angiotensina, resultado da
agregação entre os termos “hipertensina”, originado na Argentina e “angiotonina”,
nos Estados Unidos (Braun-Menendez and Page, 1958). Aproximadamente dez
anos após os trabalhos desses dois grupos de pesquisadores foram identificadas
duas formas de angiotensina, a angiotensina I (Ang I) e a angiotensina II (Ang II),
sendo que a segunda é o resultado da quebra enzimática da primeira. Skeggs e
colaboradores (1956) elucidaram a cascata de formação da angiotensina II,
20
demonstrando tratar-se de um octapeptídeo formado pela enzima conversora de
angiotensina (ECA) (Skeggs et al., 1956). A importância da Ang II e todo o SRA
no controle da homeostasia cardiovascular se tornou ainda mais relevante quando
o grupo de pesquisadores formado por Inagami, Goodfriend e colaboradores
descreveram os receptores da Ang II (apud Inagami, 1998). Desde então
inúmeros estudos utilizando uma série de novos recursos experimentais
permitiram a ampliação dos conhecimentos sobre esse complexo sistema.
O SRA continua a ser amplamente estudado. Nas últimas décadas foram
identificados novos componentes do sistema incluindo o receptor para Ang-(1-7)
(Mas) (Santos et al., 2003), o receptor para pró-renina (Nguyen, 2007) e a Enzima
Conversora de Angiotensina 2 (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000).
Basicamente, a formação dos peptídeos angiotensinérgicos ocorre por meio de
um processo de proteólise limitada, iniciada pela hidrólise do angiotensinogênio
pela aspartil-protease renina. Tanto o decapeptídeo Ang I quanto o octapeptídeo
Ang II, podem sofrer processo de biotransformação dando origem a outros
peptídeos bioativos menores, como por exemplo, a Ang III, Ang IV e
importantemente a Ang-(1-7), a qual será foco deste estudo. Além da enzima
conversora de angiotensina, outras enzimas são capazes formar Ang II, tanto a
partir da Ang I como diretamente do angiotensinogênio (Santos et al., 2000). No
entanto, a real importância dessas diferentes vias para a formação da Ang II ainda
não está totalmente estabelecida. A clivagem da Ang I e Ang II em outras
angiotensinas depende de vias enzimáticas diversas, entre elas, a endopeptidase
neutra, prolil-endopeptidase, prolil-carboxipeptidase e finalmente a ECA2
(Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000), sendo esta última amplamente
estudada a partir dos anos 2000.
21
Outro grande passo para os estudos do SRA ocorreu com o
desenvolvimento de novas técnicas de biologia molecular e bioquímica, onde
diversos componentes do SRA foram identificados em diferentes tecidos. Isto
levou à confirmação da existência do SRA tecidual, exercendo importantes
funções regulatórias parácrinas e/ou autócrinas. Sendo assim, o SRA não é mais
visto somente como um sistema endócrino, mas também como um modulador de
funções teciduais (Dzau, 1988; Lindpaintner et al., 1990; Dzau, 1993; Ruzicka and
Leenen, 1997; Wollert and Drexler, 1999).
O angiotensinogênio é o único precursor conhecido da angiotensina e é
codificado por um único gene. Esta α2-globulina é secretada constitutivamente
pelo fígado, embora possa ser também secretada em baixas concentrações por
outros tecidos (Atlas, 1998). Algumas enzimas clivam o angiotensinogênio para
gerar diretamente a Ang I, mas a principal enzima responsável por esta clivagem
é a renina (Campbell, 2003). Renina é uma aspartil protease, inicialmente
sintetizada como pró-renina. A renina ativa, uma glicoproteína de 340
aminoácidos, é secretada principalmente por células mieloepitelióides da arteríola
glomerular aferente, sendo responsável pela quebra do angiotensinogênio
formando a Ang I. Tanto a pró-renina quanto o angiotensinogênio são expressos
em vários tecidos, mas a queda nos níveis de renina ativa observada após
nefrectomia, mostra que o rim é um dos principais sítios de conversão de prórenina em renina ativa (Atlas, 1998; Campbell, 2003). A ECA, uma dipeptidil
carboxipeptidase, cliva a ligação Phe8 –His9 da Ang II para formar Ang I (Peach,
1977). Duas formas distintas da ECA são encontradas em humanos: a forma
somática, que é encontrada em vários tecidos e uma isoenzima menor, a forma
germinal, encontrada exclusivamente em testículos, a qual apresenta um
22
importante papel na fertilidade. Ambas as formas existem nas superfícies
celulares como ectoenzimas, hidrolisando alguns peptídeos circulantes. A forma
somática é particularmente abundante na superfície endotelial dos pulmões, rins,
intestino, placenta e plexo coróide. Além de atuar sobre a Ang I para formar a Ang
II, ela participa também da degradação de outros peptídeos, como a bradicinina
(Turner and Hooper, 2002).
Uma outra importante enzima, a ECA 2, recentemente caracterizada em
humanos e roedores (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000), é uma enzima
importante na regulação da função cardíaca e também está implicada em
doenças cardiovasculares e renais (Crackower et al., 2002; Burrell et al., 2004;
Danilczyk and Penninger, 2006). Esta enzima é composta de 805 aminoácidos
que tem 42 % de homologia com o domínio catalítico N-terminal da ECA e uma
região hidrofóbica próxima ao C-terminal. Diferentemente da ECA, ECA2 tem
somente um sítio enzimático ativo e funciona mais como carboxipeptidase que
dipeptidil carboxipeptidase. Assim, ela remove um único resíduo (Leu) da Ang I
para gerar Ang-(1-9), um peptídeo com funções ainda desconhecidas. Embora a
ECA2 tenha sido originariamente descrita por sua capacidade de gerar Ang-(1-9)
a partir da Ang I (Donoghue et al., 2000), esta enzima também degrada Ang II
formando Ang-(1-7), atualmente considerado seu principal papel, pois sua
afinidade catalítica para a Ang II é 400 vezes maior que para Ang I (Vickers et al.,
2002).
Isto
mostra
seu
papel
fundamental
na
síntese
de
Ang-(1-7).
Funcionalmente, a ECA2 é distinta da ECA por ser uma carboxipeptidase com
atividade não afetada por inibidores específicos da ECA e possuir diferentes
espectros de substratos, uma vez que a Ang II é um substrato da ECA2, ao
contrário da bradicinina (Coates, 2003). Outras enzimas, como ilustrado na figura
23
1, também são responsáveis pela formação de Ang I, Ang II e outros peptídeos
menores, como Ang-(1-7) e Ang IV.
A Ang II e Ang III eram consideradas por muito tempo como os únicos
fragmentos biologicamente ativos do SRA. Cadeias menores resultantes da
degradação destes peptídeos eram até então considerados fragmentos inativos,
uma vez que nenhuma atividade biológica era atribuída a eles. Entretanto, a
descoberta da existência da Ang-(1-7) (Santos et al., 1988) e de seus efeitos
cardiovasculares e cerebrais (Schiavone et al., 1988; Campagnole-Santos et al.,
1989) levaram a uma nova percepção dos mecanismos pelos quais o SRA regula
a homeostasia cardiovascular. A partir destes estudos, a Ang-(1-7) se tornou alvo
de importantes estudos nas últimas décadas, principalmente por terem sido
observados vários efeitos benéficos e opostos aos efeitos deletérios produzidos
pela Ang II (Ferrario et al., 1997; Santos et al., 2000). Atualmente, várias
evidências apontam para um novo conceito do SRA (Santos and Ferreira, 2007),
que seria formado por duas vias enzimáticas distintas (Figura 2), uma
vasoconstritora/hipertrófica/proliferativa, tendo como principal mediador a Ang II, e
outra vasodilatadora/anti-hipertrófica/anti-proliferativa, mediada principalmente
pela Ang-(1-7) através da ligação em seu receptor acoplado a proteína G Mas
(Santos et al., 2003) e/ou a outro possível subtipo de receptor (Silva et al., 2007).
Atualmente, vários estudos têm apontado o coração e os vasos sanguíneos como
os principais alvos para as ações da Ang-(1-7), as quais incluem alterações
bioquímicas e funcionais levando à vasodilatação e melhora da função cardíaca
(Porsti et al., 1994; Brosnihan et al., 1996; Ferrario et al., 1997; Ferreira et al.,
2002; Sampaio et al., 2003; Castro et al., 2005; Botelho-Santos et al., 2007).
24
Angiotensinogênio
Renina
Tonina
Angiotensina I
ECA2 ?
Angiotensina-(1-9)
Catepsina
ECA
PEP
ECA
NEP
Quimase
NEP
ECA2
Angiotensina IV
AP
Angiotensina II
Angiotensina-(1-7)
PEP PCP
?
AT4
AT1
AT2
Mas
AT1-7
Figura 1. Ilustração do Sistema renina-angiotensina mostrando as vias de
formação das angiotensinas e seus recepores. AP, Aminopeptidases; ECA,
Enzima Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina
2; NEP, Endopeptidase Neutra; PCP, Prolil-carboxipeptidase; PEP, Prolilendopeptidase, AT, Receptor de Angiotensina.
25
Angiotensina I
ECA
ECA2 ?
Angiotensina II
Angiotensina-(1-7)
ECA2
AT1
Vasoconstrição
Disfunção Endotelial
Proliferação/hipertrofia
Fibrose
Aterosclerose
Arritmogênese
Trombose
Mas
Vasodilatação
ñFunção endotelial
òProliferação/hipertrofia
òFibrose
òAterosclerose
Antiarritmogênese
òTrombose
Figura 2. Vias contra-regulatórias do Sistema renina-angiotensina. ECA, Enzima
Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; AT,
Receptor de Angiotensina.
26
A Ang-(1-7) produziu um significante aumento no débito cardíaco e volume
sistólico em ratos anestesiados. Estes efeitos foram atenuados pelo antagonista
do receptor Mas A-779 (Sampaio et al., 2003). Recentemente, foi demonstrado
que a Ang-(1-7) apresenta ação anti-arritmogênica, pois este peptídeo na
concentração de 0,22 nM diminuiu a incidência e a duração das arritmias de
reperfusão em corações isolados de ratos. Este efeito cardioprotetor foi
bloqueado pelo antagonista A-779 e indometacina (Ferreira et al., 2001). Além
disso, nesta mesma concentração, a Ang-(1-7) melhorou a função contrátil pósisquêmica de ratos por mecanismos envolvendo seu receptor e a liberação de
prostaglandinas e bradicinina (Ferreira et al., 2002). Após indução de infarto
agudo do miocárdio em ratos vivos, Loot e colaboradores (2002) mostraram que a
infusão intravenosa de Ang-(1-7) atenuou a deterioração da função cardíaca com
redução de 40% da pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (Loot et al.,
2002). No entanto, alguns efeitos da Ang-(1-7) são dependentes da concentração
utilizada nos experimentos. Neves e colaboradores (1997) mostraram que este
peptídeo, na concentração de 22 nM, promoveu uma facilitação das arritmias de
reperfusão em corações isolados de ratos (Neves et al., 1997). Colaborando com
estes dados, camundongos transgêncos que superexpressam a ECA2 no coração
apresentaram morte súbita devido a arritmias cardíacas (Donoghue et al., 2003).
Estas observações sugerem que a alta concentração de Ang-(1-7) exerce efeitos
deletérios no coração, possivelmente através da ativação da NADPH oxidase
(Oudot
et
al.,
2005).
Recentemente,
Santos
e
colaboradores
(2004)
demonstraram os efeitos benéficos da Ang-(1-7) em ratos transgênicos com
níveis plasmáticos aumentados deste peptídeo (Santos et al., 2004). Medidas de
radiotelemetria mostraram que estes ratos transgênicos apresentaram maior dP/dt
27
nos períodos diurno e noturno. O aumento nos níveis plasmáticos de Ang-(1-7)
também atenuou a hipertrofia cardíaca induzida por isoproterenol e as arritmias
de reperfusão, além de preservar a função cardíaca pós-isquêmica em corações
isolados de ratos. Estes dados mostram importantes efeitos benéficos da Ang-(17) em concentrações similares às fisiológicas.
A Ang-(1-7) apresenta interessantes efeitos na vasculatura coronariana.
Alguns destes efeitos também apresentam variações com relação às doses ou
concentrações e espécies utilizadas (Porsti et al., 1994; Brosnihan et al., 1996;
Almeida et al., 2000; Castro et al., 2005). Em artérias isoladas de cães précontraídas com um análogo de tromboxano A2, o U-46619, a Ang-(1-7) promoveu
vasorrelaxamento de maneira dose-dependente (10 nM – 100 µM). Este efeito foi
completamente bloqueado por um antagonista não seletivo de Ang II, mas não
pelos antagonistas específicos de AT1 (candesartan) ou AT2 (PD 123319), o que
evidenciou a existência de um sítio de ligação específico para Ang-(1-7) nos
vasos coronarianos de cães (Brosnihan et al., 1996) Esta ação vasodilatadora
também foi observada por Porsti e colaboradores (1994). Por outro lado, a Ang(1-7) em altas concentrações (27, 70 e 210 nM) induziu diminuição do fluxo
coronariano em corações isolados de ratos (Neves et al., 1997), mas não
provocou mudanças consistentes na contratilidade cardíaca. Efeitos similares
foram observados em corações de hamsters (Kumagai et al., 1990). A infusão
crônica (8 semanas) de Ang-(1-7) melhorou a função endotelial aórtica e a
perfusão coronariana em ratos submetidos a infarto agudo do miocárdio (Loot et
al., 2002). Este peptídeo também apresenta importante ação potencializadora do
efeito vasodilatador coronariano da bradicinina, como mostrado por estudos em
corações isolados de ratos (Almeida et al., 2000) e em artérias isoladas de cães
28
(Brosnihan et al., 1996). Recentemente, nosso grupo demonstrou um complexo
efeito vascular da Ang-(1-7) em corações isolados de camundongos (Castro et al.,
2005). Neste modelo a Ang-(1-7) induziu vasodilatação na presença do
antagonista do receptor AT1, losartan, sendo este efeito bloqueado pelos
antagonistas dos receptores Mas e AT2 e também pela deleção genética do
receptor Mas, sugerindo existirem possíveis interações entre os receptores
angiotensinérgicos.
O efeito vasodilatador da Ang-(1-7) também foi observado em outros leitos
vasculares, incluindo artérias cerebrais de cães (Feterik et al., 2000), vasculatura
sistêmica de felinos (Osei et al., 1993), arteríolas aferentes renais de coelho (Ren
et al., 2002), anéis de aorta de ratos (le Tran and Forster, 1997), pele de ratos
(Machado et al., 2002) e em vasos mesentéricos de ratos normotensos (Oliveira
et al., 1999) e hipertensos (Fernandes et al., 2001). Diversos estudos têm
documentado que estes efeitos vasodilatadores da Ang-(1-7) são dependentes do
endotélio. Além disso, foi mostrado que as células endoteliais são importantes
sítios de formação (Santos et al., 1992) e metabolismo da Ang-(1-7) (Chappell et
al.,
1998).
A
Ang-(1-7)
pode
estimular
a
produção
de óxido
nítrico,
prostaglandinas ou fatores de relaxamento derivados do endotélio em células
endoteliais (Brosnihan et al., 1996; Muthalif et al., 1998; Heitsch et al., 2001). O
efeito vasodilatador da acetilcolina (efeito dependente do endotélio) foi
completamente abolido em anéis de aorta de camundongos deficientes para o
receptor Mas, confirmando a participação deste receptor na função endotelial
(Santos et al., 2003). Um dos mecanismos responsáveis pela liberação de óxido
nítrico estimulada pela Ang-(1-7) foi recentemente descrito por Sampaio e
colaboradores (2007). Estes pesquisadores observaram que a Ang-(1-7) induz
29
liberação de óxido nítrico em células CHO (Chinese hamsters ovary)
transfectadas com o receptor Mas e células endoteliais humanas através da
estimulação da fosforilação do sítio estimulatório (Ser1177) e inibição do sítio
inibitório (Thr495) da eNOS (endothelial nitric oxide synthase) (Sampaio et al.,
2007). Este efeito foi dependente da via PI3K-AKT. Os dados in vitro estão de
acordo com estudos que mostram a potencialização in vivo dos efeitos
hipotensores da acetilcolina (Faria-Silva et al., 2005) e bradicinina (Paula et al.,
1995) pela Ang-(1-7).
Os poucos resultados obtidos em humanos ainda são contraditórios.
Sasaki e colaboradores (2001) relataram efeito vasodilatador, ao passo que Davie
e McMurray (1999) e Wilsdorf e colaboradores (2001) não observaram alterações
vasculares induzidas pela Ang-(1-7) (Davie and McMurray, 1999; Sasaki et al.,
2001; Wilsdorf et al., 2001). No entanto, estudos têm mostrado que a Ang-(1-7)
tem participação importante nos efeitos hipotensores dos bloqueadores do
receptor AT1 e dos inibidores da ECA (Iyer et al., 1998a; Iyer et al., 1998b;
Collister and Hendel, 2003). Deddish e colaboradores (1998) demonstraram que o
heptapeptídeo Ang-(1-7) é um substrato seletivo para o domínio N e um inibidor
do domínio C da ECA (Deddish et al., 1998). Isso faz com que a ECA se torne
uma importante via de inativação da Ang-(1-7) circulante e possivelmente
tecidual. Assim, o uso de inibidores da ECA leva a um aumento da concentração
sanguínea da Ang-(1-7) por dois motivos: (1) pelo aumento da disponibilidade de
um precursor da Ang-(1-7), uma vez que a ECA é uma enzima responsável pela
degradação da Ang I e (2) pela diminuição da degradação da Ang-(1-7)
diretamente pela ECA, pois ela pode hidrolisar a ligação isoleucina5-histidina6 da
Ang-(1-7), produzindo o pentapeptídeo Ang-(1-5) (Chappell et al., 1998; Ferrario
30
and Iyer, 1998). Esse aumento da concentração plasmática de Ang-(1-7) pode ser
um dos mecanismos responsáveis pelos efeitos benéficos na terapêutica com os
inibidores da ECA, uma vez que o antagonista do receptor Mas, A-779, atenuou
estes efeitos em alguns modelos experimentais (Kucharewicz et al., 2002; Maia et
al., 2004).
As ações vasculares da Ang-(1-7) não estão restritas ao endotélio, pois
também apresenta efeitos antiproliferativos em células musculares lisas
vasculares, sendo a inibição da atividade da cinase ERK1/2 um dos mecanismos
envolvidos neste efeito (Freeman et al., 1996; Zhong et al., 2001; Tallant et al.,
2005).
1.2. Receptores do sistema renina-angiotensina
Existem dois principais subtipos de receptores para a Ang II, os receptores
AT1, com 359 aminoácidos e bloqueados especificamente por bifenilimidazois, tal
como o losartan, e os receptores AT2, os quais possuem 363 aminoácidos e são
bloqueados por tetrahidroimidazopiridinas, como por exemplo, o PD 123319.
Ambos apresentam sete domínios transmembrana e são acoplados à proteína G
(Touyz and Berry, 2002; Campbell, 2003). Em humanos, há somente um único
subtipo de receptor AT1, ao passo que em roedores, dois subtipos foram
identificados, o AT1A e AT1B. O receptor AT1 é responsável pelas principais ações
da Ang II e é predominante no controle de suas ações vasculares (Matsusaka and
Ichikawa, 1997). Na vasculatura, receptores AT1 são expressos principalmente
nas células musculares lisas. Já no coração, estes receptores estão presentes em
31
cardiomiócitos e fibroblastos, responsáveis por mediar efeitos inotrópico e
cronotrópico positivo (Allen et al., 2000).
O subtipo de receptor de Ang II AT2 é altamente expresso nos tecidos
fetais e diminui rapidamente após o nascimento (Nahmias and Strosberg, 1995).
Em adultos, a expressão do receptor AT2 é detectável no pâncreas, coração, rim,
adrenais, miométrio, ovário, cérebro e vasos (Nahmias and Strosberg, 1995). O
receptor AT2 é re-expresso em adultos após injúrias vascular e cardíaca e durante
processos de cicatrização e obstrução renal, sugerindo um papel deste subtipo de
receptor no remodelamento, crescimento e desenvolvimento tecidual (Tsuzuki et
al., 1994). Os papeis funcionais deste receptor ainda são controversos, mas eles
podem antagonizar, em condições fisiológicas, efeitos mediados pelo AT1 inibindo
crescimento celular e por induzir apoptose e vasodilatação (Horiuchi et al., 1997;
Touyz et al., 1999). Por outro lado, estudos de fluxo sanguíneo em humanos
saudáveis mostraram que o receptor AT2 não está envolvido na modulação do
tônus vascular (Phoon and Howes, 2001). Outros estudos sugerem que estes
receptores também contribuem para processos patológicos associados com
hipertrofia cardíaca e inflamação (Mifune et al., 2000; Ichihara et al., 2001). No
entanto, ainda há divergências sobre a participação do receptor AT2 no
remodelamento cardíaco (Lako-Futo et al., 2003).
Desde a descoberta da Ang-(1-7), várias evidências farmacológicas e
fisiológicas apontavam para a existência de um receptor específico para este
peptídeo. Esta hipótese foi fortalecida com a descoberta do antagonista seletivo
da Ang-(1-7), o [7-D-Ala]-Ang-(1-7) (A-779) (Santos et al., 1994) e confirmada
posteriormente por Santos e colaboradores em 2003, os quais identificaram o
protooncongene Mas, um receptor com 325 aminoácidos, acoplado à proteína G e
32
com sete domínios transmembrana (Young et al., 1986), como um receptor
específico para a Ang-(1-7) (Santos et al., 2003). Neste estudo foi observado que
a deleção genética deste receptor aboliu a ligação da Ang-(1-7) em rins de
camundongos. Estes camundongos também perderam completamente a ação
antidiurética após sobrecarga aguda de água e a resposta vasodilatadora da Ang(1-7) em anéis de aorta. Experimentos in vitro mostraram a ligação da Ang-(1-7)
em células CHO transfectadas com receptor Mas. Coletivamente, estes achados
identificaram o Mas como um sítio específico de ligação para a Ang-(1-7). Este
receptor é expresso em diferentes tecidos e células, tais como, testículo, coração,
rim, cérebro, células endoteliais e musculares lisas vasculares e plaquetas
(Metzger et al., 1995; Santos et al., 2003; Becker et al., 2007; Sampaio et al.,
2007; Fraga-Silva et al., 2008). Recentemente, um estudo realizado em aortas de
ratos Sprague-Dawley mostrou que o efeito vasodilatador da Ang-(1-7) foi
mediado por receptores sensíveis ao D-Pro7-Ang-(1-7), mas não por receptores
sensíveis ao A-779, o que sugere a existência de um segundo subtipo de receptor
de Ang-(1-7) (Silva et al., 2007).
Alguns estudos sugerem a existência de interações entre o receptor Mas e
outros receptores, tais como o receptor de bradicinina B2 e o de Ang II, AT2,
podendo ser um mecanismo envolvido no processo de liberação de mediadores
vasodilatadores induzidos pela Ang-(1-7). Por exemplo, a ação vasodilatadora da
Ang-(1-7) pode ser bloqueada pelo antagonista do receptor B2 de bradicinina
(HOE-140) (Brosnihan et al., 1996; Gorelik et al., 1998). Recentemente, um
estudo mostrou uma possível participação da bradicinina na vasodilatação
induzida pela Ang II em vasos mesentéricos pré-contraídos. Nesta preparação, o
antagonista do receptor Mas também atenuou o efeito vasodilatador da Ang II,
33
bem como da bradicinina (Soares de Moura et al., 2004). Além disso, foi sugerido
que a Ang-(1-7) pode modular as alterações induzidas pela Ang II na resistência
vascular (Roks et al., 1999). Outros estudos descreveram ações vasoconstritoras
da Ang-(1-7) em altas concentrações (van Rodijnen et al., 2002), o que pode ser
justificado pela sua fraca afinidade de ligação ao receptor AT1 (Rowe et al., 1995).
Interações entre os receptores Mas e AT1 também foram fortemente evidenciadas
(Castro et al., 2005; Kostenis et al., 2005).
1.3. SRA e a estrutura cardíaca
Além dos mecanismos neuro-humorais, a função cardíaca também é
determinada pela interação coordenada e dinâmica de células contráteis com os
componentes da matriz extracelular (MEC). Esta interação é regulada por sinais
químicos, mecânicos e elétricos entre os componentes celulares e não celulares
do coração (Banerjee et al., 2006). Assim uma disfunção nestes componentes
teciduais e consequentemente na estrutura cardíaca podem levar a uma alteração
na função cardíaca.
A matriz extracelular cardíaca consiste de colágenos intersticiais,
proteoglicanas e glicoproteínas que estão arranjadas em uma rede tridimensional
precisa em associação com miócitos, fibroblastos e capilares. Está claro que a
MEC é uma estrutura dinâmica cuja organização e composições são conhecidas
por modularem vários processos celulares. Eventos que alteram a composição
molecular ou a organização dos componentes da MEC podem levar a sérios
efeitos na função celular (Brilla et al., 1990; Gonzalez et al., 2002). Dentro do
miocárdio, a MEC forma uma elaborada rede que interconecta os cardiomiócitos
34
uns aos outros e com os capilares dentro da parede ventricular (Robinson et al.,
1983). Esta rede intersticial dentro do miocárdio é composta predominantemente
de colágenos fibrilares, os quais são produzidos principalmente por fibroblastos e
miofibroblastos (Weber et al., 1989; Mukherjee and Sen, 1991; Gonzalez et al.,
2002). Dentre os colágenos presentes no coração, o tipo I é predominante
(normalmente acima de 50 %). Ele está associado principalmente às fibras
grossas e confere resistência a deformação. O colágeno tipo III compreende 10 –
45 % dos colágenos fibrilares. Está associado às fibras finas que conferem
elasticidade (Brower et al., 2006). Estes colágenos fibrilares fornecem uma rede
estrutural para os cardiomiócitos e vasos coronários e dá ao tecido cardíaco
propriedades físicas de rigidez e resistência à deformação (Weber, 1989; Burlew
and Weber, 2000). Em adição, o colágeno fibrilar também age como uma ligação
entre os elemento contráteis dos cardiomiócitos adjacentes (Terracio et al., 1991).
O remodelamento cardíaco é um processo pelo qual alterações
moleculares, celulares e intersticiais se manifestam como alterações na estrutura,
arquitetura e função ventricular em resposta, entre outros fatores, a sobrecargas
hemodinâmicas, ativação neuro-humoral e inflamação (Pfeffer and Braunwald,
1990; Cohn et al., 2000; Sutton and Sharpe, 2000). No nível celular, os principais
componentes do remodelamento cardíaco são as alterações nos miócitos, tais
como, hipertrofia e apoptose, proliferação de fibroblastos e a produção e
degradação de proteínas da matriz extracelular (Passeri and Bloch, 2005).
Foi mostrado que os miofibroblastos cardíacos expressam componentes do
SRA, incluindo angiotensinogênio, renina, ECA, e são capazes de sintetizar
angiotensina (Katwa et al., 1997). Vários estudos mostram mudanças no acúmulo,
composição ou organização de proteínas da MEC durante o desenvolvimento de
35
doenças cardíacas. Muitas dessas alterações estão associadas com a ativação
de sistemas humorais, como por exemplo, o SRA. Vários estudos demonstraram
que componentes local ou circulante deste sistema, estão envolvidos no
desenvolvimento de fibrose miocardial em diferentes patologias cardíacas
(Sadoshima and Izumo, 1993; Ju and Dixon, 1996b; Zhou et al., 1996; Hafizi et
al., 1998; Ichihara et al., 2001; Gonzalez et al., 2002). A fibrose miocardial,
caracterizada por uma elevação na quantidade de colágenos, fibronectina e
outras proteínas de MEC, aparece em modelos animais de hipertrofia e
insuficiência cardíaca relacionados ao SRA (Weber and Brilla, 1991; Boluyt et al.,
1994). A Ang II, principalmente via receptor AT1, pode induzir respostas que
afetam a estrutura e função do coração. Estas respostas incluem a hipertrofia de
cardiomiócitos e acúmulo de tecido fibroso, ambos contribuindo para um
progressivo comprometimento da função cardíaca (Villarreal and Dillmann, 1992;
Ju and Dixon, 1996a; Kawano et al., 2000; Schnee and Hsueh, 2000; Pathak et
al., 2001; Lijnen and Petrov, 2003). Estudos in vitro de fibroblastos cardíacos de
ratos adultos e neonatos mostraram que a angiotensina II estimula a proliferação
de fibroblastos e a síntese de colágenos via receptor AT1 (Crabos et al., 1994;
Zhou et al., 1996). Fielitz e colaboradores (2001) observaram um aumento de
RNA mensageiros para colágenos I e III e fibronectina em miocárdio de pacientes
com doença de válvula aórtica, sendo esta regulação associada com a ativação
do SRA (Fielitz et al., 2001).
A hipertrofia do miócito cardíaco é um importante mecanismo adaptativo
que ocorre em resposta a sobrecarga hemodinâmica e precede a maioria dos
tipos de insuficiência cardíaca (Braunwald and Bristow, 2000; Lorell and
Carabello, 2000). Várias evidências provenientes de estudos clínicos, bem como
36
de modelos experimentais de insuficiência cardíaca e culturas de células mostram
importante participação do SRA no processo de hipertrofia cardíaca (Yamazaki et
al., 1998). A ativação adrenérgica crônica também é responsável por efeitos
deletérios no coração relacionados ao remodelamento cardíaco, incluindo injúrias
e apoptose no miócito cardíaco, função celular e transdução de sinal alterados,
hipertrofia e fibrose cardíaca. Estas disfunções resultam em remodelamento
miocardial progressivo e deterioração da função cardíaca (Murray et al., 2000).
A Ang-(1-7) por sua vez, tem sido considerada um componente importante
na modulação do remodelamento cardíaco. Loot e colaboradores (2002)
observaram que o tratamento crônico com Ang (1-7) atenuou a hipertrofia dos
miócitos de ratos infartados (Loot et al., 2002). Averill e colaboradores (2003)
observaram que o infarto agudo do miocárdio induzido pela oclusão da artéria
coronária esquerda aumentou significativamente a imunorreatividade para Ang-(17) ao redor da área infartada, sugerindo uma participação deste peptídeo na
recuperação das injúrias teciduais (Averill et al., 2003). Iwata e colaboradores
(2005) observaram que Ang-(1-7) pode se ligar a fibroblastos cardíacos e regular
funções celulares que estão envolvidas no remodelamento cardíaco, tais como
diminuição da síntese de colágenos e de processos hipertróficos (Iwata et al.,
2005). Grobe e colaboradores (2005, 2006) observaram que a administração
crônica de Ang-(1-7) em ratos hipertensos atenuou a hipertrofia e fibrose cardíaca
sem modificar as alterações na pressão arterial (Grobe et al., 2006; Grobe et al.,
2007). He e colaboradores (2005) também avaliaram a expressão gênica de
colágenos I e III em ratos hipertensos tratados com Ang-(1-7) e observaram que o
aumento da expressão do RNA mensageiro destes colágenos, induzido pela
hipertensão, no miocárdio ventricular esquerdo foi diminuída pelo tratamento com
37
Ang-(1-7), sugerindo que a Ang-(1-7) pode modular o remodelamento cardíaco
através da inibição da síntese de proteínas da matriz extracelular (He et al.,
2004). Em 2006, Gava demonstrou a importância do receptor Mas na modulação
de proteínas da matriz extracelular no coração (Gava, 2006). Foi observado que
animais knockout para o receptor Mas apresentam expressões aumentadas de
colágeno I, III e fibronectina sugerindo que a interação Ang-(1-7)-Mas, pode
promover importantes efeitos anti-fibróticos no coração.
Nesse estudo nós objetivamos avaliar a participação da Ang-(1-7) e do seu
receptor Mas no controle da função cardíaca e vascular em dois modelos de
animais geneticamente modificados, ou seja, animais com ganho ou perda de
função do eixo Ang-(1-7)/Mas.
38
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Avaliar a participação da Ang-(1-7) via receptor Mas na função cardíaca
utilizando dois modelos de animais geneticamente modificados, sendo um com
ganho e outro com perda de função do eixo Ang-(1-7)/Mas.
2.2. Objetivos específicos
·
Avaliar a função cardíaca em corações isolados de camundongos com
deleção genética do receptor Mas em condições basais e após serem
submetidos à isquemia/reperfusão.
·
Avaliar a função cardíaca em corações isolados de ratos transgênicos que
apresentam níveis elevados de Ang-(1-7) no coração.
·
Avaliar a incidência de arritmias de reperfusão em corações isolados de
ratos que apresentam níveis elevados de Ang-(1-7) no coração.
·
Avaliar a resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em
camundongos com deleção genética do receptor Mas.
·
Avaliar as resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em
ratos que apresentam níveis elevados de Ang-(1-7) no coração.
·
Avaliar o papel do receptor Mas e o efeito do aumento dos níveis de Ang(1-7) nos vasos coronarianos em condições basais e pós-isquêmicas..
39
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos com deleção genética dos receptores Mas
(KO-Mas), AT2 (KO-AT2) ou AT1 (KO-AT1) e seus controles [C57BL/6 (WT) e
FVBN] com idades entre 10 e 14 semanas e ratos transgênicos da linhagem
TG(hA1-7)L7301 que expressam uma proteína de fusão produtora de Ang-(1-7)
no coração e seu controle Sprague Dawley (SD) com idades entre 6 e 7 meses.
Estes animais foram fornecidos pelo biotério de animais transgênicos do
Laboratório de Hipertensão do ICB-UFMG.
3.2. Preparação dos corações isolados
Para a perfusão dos corações isolados de camundongo foi utilizada a
técnica de Langendorff com fluxo constante. O fluxo utilizado foi de 2,0 ml/min a
uma temperatura de 37 ± 1 oC.
Para a perfusão dos corações de ratos foi utilizada a técnica de
Langendorff com pressão constante. Esta pressão era mantida em 65 mmHg
durante todo o experimento e também a uma temperatura de 37 ± 1oC. A
composição da solução nutridora utilizada para a perfusão dos corações isolados
(Solução de Krebs-Ringer) está detalhada na tabela 1.
40
Tabela 1. Composição da solução de Krebs-Ringer.
COMPOSTO
CONCENTRAÇÃO EM mM
NaCl
118,41
KCl
4,69
KH2PO4
1,17
MgSO4 .7H2O
1,17
CaCl2 . 2H2O
2,51
Dextrose anidra (glicose)
11,65
NaHCO3
26,24
Os animais foram sacrificados por decapitação 10 minutos após serem
heparinizados (100 UI em camundongos e 400 UI em ratos). Uma vez exposta a
cavidade torácica, o coração era retirado e colocado em um béquer contendo
solução nutridora oxigenada e em temperatura de aproximadamente 4 ºC. O
resfriamento tem por objetivo diminuir o metabolismo do miocárdio e o consumo
de O2 nos instantes anteriores à canulação do coração. Depois de transferido
para a placa de Petri, os restos de tecido pulmonar e vascular, traquéia e esôfago
que acompanhavam o coração eram removidos. Em seguida, a aorta ascendente
era seccionada na altura de sua primeira ramificação (tronco braquiocefálico),
fixada uma agulha de aço inoxidável conectada ao sistema de perfusão contendo
a solução nutridora. Desta forma, permitia-se que a solução nutridora percorresse
retrogradamente o coto aórtico remanescente promovendo o fechamento da valva
aórtica e consequentemente a perfusão das artérias coronarianas. O tempo do
sacrifício até o início da perfusão era de aproximadamente 3 minutos. Caso o
período de preparação excedesse este tempo o coração era descartado.
41
Um transdutor de força era conectado ao ápice do coração para o registro
da tensão sistólica e diastólica. Para o registro de pressão de perfusão nos
experimentos onde foi utilizada a técnica de fluxo constante, um transdutor de
pressão foi acoplado ao sistema por uma abertura imediatamente acima do
coração. Nos corações isolados de ratos, onde foi utilizada a técnica de pressão
constante, o fluxo era coletado durante 1 minuto em intervalos regulares de 5
minutos. Um eletrodo bipolar era colocado diretamente na superfície do coração
para o registro do eletrocardiograma. Este registro foi utilizado para avaliar a
presença das arritmias de reperfusão. A aquisição dos dados foi realizada através
do Biopac Systems, Inc. (USA). A freqüência cardíaca e as derivadas da tensão
(+dT/dt e -dT/dt) foram calculadas a partir da onda de tensão sistólica.
3.2.1. Protocolos
A. Isquemia/Reperfusão
Após um período basal de 20-30 minutos, os corações isolados de
camundongos foram submetidos à anóxia global por 20 minutos com o
desligamento da bomba de infusão e posteriormente reperfundidos por um
período de 30 minutos (Figura 3 A). Para confirmar o papel do receptor Mas na
função cardíaca, um grupo adicional de camundongos WT foi perfundido com
Krebs-Ringer contendo o antagonista do receptor Mas A-779 (2 nM). A perfusão
deste antagonista foi iniciada no início do período basal e mantido durante todo o
experimento (Figura 3 A).
42
Os corações isolados de ratos foram submetidos à isquemia regional do
ventrículo esquerdo. Após um período basal de 20-30 minutos, a artéria coronária
descendente esquerda era ocluída por 15 minutos. Decorrido este tempo, os
corações eram reperfundidos por 30 minutos (Figura 3 B). As arritmias cardíacas
foram definidas como presença de taquicardia e/ou fibrilação ventricular após a
reperfusão. Para avaliar quantitativamente as arritmias de reperfusão, estas foram
graduadas arbitrariamente de acordo com sua duração e utilizado o “Índice de
Severidade de Arritmias” (Tabela 2), como descrito previamente (Bernauer and
Ernenputsch, 1988; Ferreira et al., 2001; Santos et al., 2004), sendo consideradas
irreversíveis as arritmias com duração de 30 minutos.
Tabela 2. Índice de Severidade de Arritmias.
Duração (min)
Índice (undades arbitrárias)
≤3
2
3a6
4
6 a 10
6
10 a 15
8
15 a 20
10
20 a 25
11
25 a 30
12
B. Avaliação do efeito vasodilatador da Acetilcolina
Para avaliar a possível participação do receptor Mas no efeito
vasodilatador coronariano da acetilcolina, os corações isolados de camundongos
eram mantidos por um período de estabilização de 20 minutos em ritmo sinusal e
posteriormente estimulados por um período adicional de 15 minutos com
43
frequência constante de 420 bpm através da utilização de um estimulador elétrico.
Este procedimento foi adotado para evitar assistolias cardíacas induzidas pela
acetilcolina. Decorrido este tempo, a acetilcolina (10-7 M) era adicionada à solução
nitridora e perfundida por 20 minutos (Figura 3 C).
A
Basal
Anóxia
Reperfusão
20-30 min
20 min
30 min
Basal
Anóxia
Reperfusão
20-30 min
20 min
30 min
A-779
B
Isquemia
Basal
15 min
20-30 min
C
30 min
Acetilcolina (10-7 M)
Basal
20-30 min
Reperfusão
15 min
20 min
Estimulação Elétrica (420 bpm)
Figura 3. Diagrama esquematizando os protocolos experimentais.
44
3.3. Radioimunoensaio
3.3.1. Coleta do Coração e Plasma dos Ratos Transgênicos TG(hA1-7)L7301
e SD
Os ratos foram sacrificados por decapitação, seguindo-se de coleta de
aproximadamente 3 ml de sangue em tubo de polietileno mantido em gelo
contendo coquetel de inibidores de proteases (Tabela 3). Cada tubo continha 420
ml do coquetel (140 ml para 1 ml de sangue). O sangue foi centrifugado por 10 min,
2.500 rpm a 4 ºC, o plasma separado e congelado a -20º C para posterior
extração da Ang-(1-7). O coração foi retirado, separado os átrios e ventrículos,
congelado em nitrogênio líquido e mantidos em temperatura de -80 ºC até o
momento da homogeneização.
Tabela 3. Coquetel de Inibidores de Proteases.
Inibidor enzimático
Volume utilizado por ml
de amostra
Para-hidroximercúrio-benzoato (pOHHgHz), 1 mM
10 ml
Orto-fenantrolina, 30 mM
50 ml
Fenilmetilsulfonil fluorídrico (PMSF), 1 mM
10 ml
Ácido etilenodinitrilotetra-acético (EDTA), 7,5 %
50 ml
Pepstatin A, 1 mM
20 ml
As soluções de pOHHgBz e PMSF foram preparadas no dia da coleta. As
demais soluções foram preparadas nos dias anteriores, sendo a pepstatin A e
orto-fenantrolina conservados em freezer - 20º C e EDTA 7,5% mantido em
geladeira. O coquetel de inibidores de proteases foi preparado imediatamente
antes da coleta do sangue.
45
3.3.2. Homogeneização de tecidos, extração das amostras e dosagens dos
peptídeos.
A. Homogeneização do ventrículo esquerdo.
O ventrículo foi homogeneizado com o auxílio de um homogeneizador
(Turax) utilizando-se 10 ml de solução de etanol ácido (HCl 0,045 N/etanol) na
presença de 1400 ml de coquetel de inibidores de proteases como descrito
anteriormente e 10 ml de BSA 5% em água deionizada. Amostras dos
homogenatos foram retiradas para dosagem de proteínas pelo método de
Bradford
(Bradford,
1976).
Após
homogeneização,
as
amostras
foram
centrifugadas por 30 min a 10.000 rpm à 4º C. O sobrenadante foi vertido para um
tubo de polietileno lavado com BSA 0,1 % para liofilização em centrífuga
evaporadora por 10-12 horas ou até a formação do resíduo. Depois de liofilizado,
o resíduo foi ressuspendido seqüencialmente em 750 ml de água miliq, soluções
de TFA 0,2% e TFA 0,1%. Para a completa dissolução desses resíduos foi
utilizado aparelho de ultra-som (Vibra Cell, Sonics e Materiasl Inc). O
sobrenadante resultante foi transferido para tubo de polietileno lavado com BSA
0,1% e logo após a Ang-(1-7) foi extraída em colunas C18 - Bond Elut.
B. Extração da Ang-(1-7) do plasma e ventrículo esquerdo em colunas Bond
Elut - C18
46
Para a extração da angiotensina do plasma e coração, as colunas Bond
Elut foram pré-ativadas com 10 ml de ACN 99,9%/HFBA 0,1% e 10 ml de HFBA
0,1%. Após pré-ativação, as colunas foram ativadas usando-se: 10 ml de ACN
99,9%/HFBA 0,1%, 10 ml de HFBA 0,1%, 3 ml de BSA 0,1%/HFBA 0,1%, 10 ml
de ACN 10%/HFBA 0,1%, 3 ml de HFBA 0,1%. Após ativação da coluna as
amostras foram aplicadas, seguindo-se de lavagem seqüencial com 20 ml de
HFBA 0,1% e 3 ml de ACN 20%/HFBA 0,1%. Os peptídeos foram eluidos com 3
ml de ACN 99,9%/HFBA 0,1% em tubos de polietileno lavados com BSA 0,1%. As
amostras de plasma antes de serem aplicadas na coluna, foram centrifugadas por
20 min/2.500 rpm/4 ºC.
C. Radioimunoensaio para Angiotensina-(1-7)
Para a realização do radioimunoensaio e obtenção das concentrações de
Angiotensina-(1-7) foram utilizadas as seguintes soluções:
I - Tampão do ensaio: Tris-HCl 50 mM , BSA 0,1% , Nacl 50 mM, Ázida Sódica
0,02% . Os reagentes foram dissolvidos em 400 ml de H2O deionizada. O pH foi
acertado para 7,5 com HCl 3 N e o volume completado para 500 ml com H2O
deionizada.
II – Tampão II: NaCl 0,9% , BSA 0,1%, Ácido acético glacial 0,03%. Os reagentes
foram dissolvidos em 500 ml de água deionizada. Esta solução foi usada para
reconstituição das amostras e diluição da curva padrão.
III - Anticorpo policlonal (título 1:20.000). Preparado a partir de solução estoque
de reconstituição 1:500, pela dissolução em tampão do ensaio. Este anticorpo
apresenta menos que 0,001% de reatividade cruzada com a Ang I e Ang II,
47
0,001% de reatividade cruzada com Ang-(2-7), Ang-(3-7), 0,08% de reatividade
cruzada com Ang-(4-7) e 0,005% com Ang-(1-5).
IV - 125I Ang-(1-7): marcada, purificada e diluída com tampão do ensaio, para uma
concentração de 6000 cpm para cada 0,1 ml.
V – Curva Padrão: As concentrações de padrão utilizadas foram de 200, 100, 50,
25, 12,5 e 6,25 pg/0,1 ml, diluídos em tampão II utilizando-se balão volumétrico,
preparadas a partir de uma solução estoque de 2 mg/ml.
VI - Suspensão de Carvão: A separação do peptídeo ligado ao anticorpo do
peptídeo livre foi feita pela adição de solução de carvão ativado-dextran após
incubação de 18-22 horas. O carvão ativado e o dextran foram dissolvidos em
tampão do ensaio. A suspensão foi mantida sob agitação constante, em banho de
gelo por 1 hora antes do uso.
Cada ensaio seguiu o seguinte protocolo (Tabela 4):
Tabela 4. Soluções e volumes utilizados para RIE de Ang-(1-7).
Total
Branco
P0 1
Padrão
Amostra
-
100
100
_
_
1300
200
100
100
100
Pontos da curva
_
_
_
100
_
Amostra
_
_
_
_
100
100
100
100
100
100
_
_
100
100
100
1400
400
400
400
400
Soluções (ml)
Tampão II
Tampão do ensaio
125
IAng-(1-7) 2
Anticorpo
Volume final
1
2
Valor de referëncia
Ang-(1-7) radioiodada
48
Após adição das respectivas soluções nos tubos estes foram agitados em vórtex
e incubados por 18-22 horas. Após a incubação foi adicionado 1 ml de suspensão
de carvão em todos os tubos exceto no tubo total e todos foram centrifugados a 4
o
C, 2.500 rpm por 20 min. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido
para um novo tubo e realizada a leitura no contador gama.
3.3.3. Dosagem de Proteínas
A determinação da proteína foi feita com o objetivo de corrigir e padronizar
os resultados da concentração tecidual de Ang-(1-7) por miligrama de proteína.
Foi retirado 100 ml do homogenato para posterior dosagem de proteína. As
amostras foram diluídas quando necessário, sendo usados 10 ml no ensaio que
foram feitos em duplicata. Foram adicionados às amostras, 40 ml de água miliq e
2,5 ml de Comassie Blue. Foi utilizada albumina de soro bovino (BSA) para
construção da curva padrão.
A curva padrão foi realizada de acordo com a tabela abaixo (Tabela 5):
Tabela 5. Curva padrão para dosagem de proteína.
Pontos da Curva
Vol. Proteína
Vol.água
Vol. Comassie Blue
Branco
-
50,0 ml
2,5 ml
2,5 mg
2,5 ml
47,5 ml
2,5 ml
5,0 mg
5,0 ml
45,0 ml
2,5 ml
10,0 mg
10,0 ml
40,0 ml
2,5 ml
20,0 mg
20,0 ml
30,0 ml
2,5 ml
40,0 mg
40,0 ml
10,0 ml
2,5 ml
49
Após adição de Comassie Blue, as amostras foram agitadas e deixadas à
temperatura ambiente por 10 min, e então lidas em espectrofotômetro com
comprimento de onda de 595 nanômetros. Os cálculos foram feitos a partir das
absorbâncias obtidas.
3.4. Tratamento com isoproterenol
Para avaliar a resposta hipertrófica e fibrótica nos animais estudados, foi
utilizado o tratamento com isoproterenol (Sigma, USA). Os camundongos KO-Mas
e WT foram submetidos a injeções s.c. diárias de isoproterenol (20 mg/Kg) ou
salina 0,9 % (0,1 mL) durante 5 dias. Os ratos TG(hA1-7)L7301 e os controles
Sprague-Dawley (SD) foram submetidos a injeções i.p. diárias de isoproterenol (3
mg/Kg) ou salina 0,9 % (0,2 mL) durante 7 dias.
3.5.
Processamento
do
material
para
análises
de
morfometria
e
imunofluorescência
Os corações foram perfundidos com solução de PBS a 4°C para remoção
do sangue da parede ventricular, fixados em metanol 80% / DMSO 20% e
criosubstituido a -80°C durante seis dias. Após este período, os tecidos foram
transferidos para -20°C por 1 dia. Após a fixação e a criosubstituição, os corações
foram submetidos ao processo de inclusão seguindo os procedimentos descritos
na tabela 6.
50
Tabela 6. Descrição dos procedimentos realizados para o processo de inclusão
dos tecidos.
Desidratação:
Álcool absoluto 1 (30 min, temperatura ambiente)
Álcool absoluto 2 (30 min, temperatura ambiente)
Álcool absoluto 3 (30 min, temperatura ambiente)
Diafanização:
Xilol 1 (30 min, temperatura ambiente)
Xilol 2 (30 min, temperatura ambiente)
Infiltração:
Xilol 50% / Paraplast Plus 50% (12 horas, 63ºC)
Paraplast 1 (30 minutos, 63ºC)
Paraplast 2(30 minutos a 63ºC)
Inclusão:
Paraplast (63ºC)
Após a inclusão em paraplast foram realizados cortes histológicos de 7 e 4 µm de
espessura para imunofluorescência e morfometria, respectivamente.
3.6. Análise dos colágenos I e III e fibronectina por Imunofluorescência
A técnica de imunofluorescência indireta foi utilizada para identificar e
quantificar as moléculas de colágenos I e III e fibronectina. Foi realizada a
determinação das diluições ideais dos anticorpos primário e secundário para a
imunofluorescência. Um controle sem o uso dos anticorpos primário e secundário
foi feito para verificar se o tecido possuía autofluorescência. Controles utilizando
somente os anticorpos secundários foram realizados em todos os experimentos e
foram negativos em todos os casos. Os núcleos celulares foram marcados com
iodeto de propídeo em alguns cortes histológicos (pseudocolor azul). As
51
especificações dos anticorpos utilizados e suas diluições encontram-se na tabela
7.
Tabela 7. Especificação dos anticorpos utilizados na técnica de imunofluorescência indireta.
Anticorpo
Especificação
Policlonal, coelho anti
colágeno I humano
Policlonal, coelho anti
Primários
colágeno III humano
Policlonal, coelho anti
fibronectina humano
Diluição
Fonte
1:400
Rockland
1:400
Rockland
1:600
Rockland
Policlonal, burro anti-(IgG de
Secundário
coelho) conjugado com Cy3
ou Cy5
1:400
Jackson Imuno
Research
Após a montagem das lâminas, foram realizados os seguintes procedimentos
para imunofluorescência indireta (Tabela 8):
52
Tabela 8. Descrição dos procedimentos para a realização da técnica de
imunofluorescência.
Desparafinização:
Xilol 1 (10 min, temperatura ambiente)
Xilol 2 (10 min, temperatura ambiente)
Xilol 3 (10 min, temperatura ambiente)
Hidratação:
Álcool absoluto 1 (5 min, temperatura ambiente)
Álcool absoluto 2 (5 min, temperatura ambiente)
Álcool absoluto 3 (5 min, temperatura ambiente)
Álcool 95 % (3 min, temperatura ambiente)
Álcool 70 % (3 min, temperatura ambiente)
Álcool 50 % (3 min, temperatura ambiente)
Álcool 25 % (3 min, temperatura ambiente)
Água (3 min, temperatura ambiente)
PBS3 (10 min, temperatura ambiente)
Etapa de bloqueio4:
60 min, temperatura ambiente.
Incubação anticorpo
Diluição em PBS com BSA 0,1% e Tween 20
primário:
0,01% - overnight, 4ºC.
Lavagem das lâminas:
4 banhos de 5 minutos em PBS.
Incubação anticorpo
Diluição em PBS com BSA 0,1% e Tween 20
secundário:
0,01%, 60 min, temperatura ambiente.
Lavagem das lâminas:
4 banhos de 5 minutos em PBS.
Montagem das lâminas:
Solução de glicerina 90% / TRIS 1M 10% pH 9,0,
25ºC.
Os cortes submetidos à técnica de imunofluorescência foram analisados
em microscopia confocal Zeiss 510Meta.
3
Phosphate-Buffered Saline – Tampão fosfato salino
Solução de Bloqueio: BSA 1 % e Tween 20 0,1% em PBS
4
53
3.6.1. Análise quantitativa de colágenos I e III e fibronectina.
Para a quantificação dos colágenos I e III e fibronectina foi medida a
intensidade de fluorescência no miocárdio dos ventrículos esquerdos dos animais.
Foram capturadas 3 imagens nos ventrículos de camundongos e 4 nos
ventrículos de ratos. As imagens foram analisadas em escala de cinza através do
programa ImageTool 2.04. A intensidade de fluorescência é fornecida através da
unidade “Nível de Cinza”, que varia do valor zero (preto) ao valor 255 (branco).
Quanto mais próximo do valor 255, maior a intensidade fluorescência. Os
parâmetros utilizados do microscópio confocal foram os mesmos para todos os
grupos e controle do anticorpo secundário, tornando o nível de fluorescência
uniforme, confiável e possível de comparação.
3.7. Análise Morfométrica
A hipertrofia cardíaca foi analisada em cortes transversais de ventrículos
esquerdos (4 mm) corados com hematoxilina e eosina, como detalhado na tabela
9. O diâmetro dos miócitos foi avaliado em 2 cortes por animal usando um
micromedidor ocular adaptado ao microscópio de luz (BX 60, Olympus) com 400x
de magnificação. Somente cardiomiócitos cortados longitudinalmente com núcleo
e limites celulares visíveis foram analisados (aproximadamente 30 cardiomiócitos
por corte). O diâmetro de cada miócito foi medido na região correspondente ao
núcleo.
54
Tabela 9. Descrição dos procedimentos para a realização da coloração dos cortes
histológicos com hematoxilina e eosina.
Desparafinização:
Xilol 1 (30 min, temperatura ambiente)
Xilol 2 (15 min, temperatura ambiente)
Xilol 3 (15 min, temperatura ambiente)
Hidratação:
Álcool absoluto 1 (2 min, temperatura ambiente)
Álcool absoluto 2 (2 min, temperatura ambiente)
Álcool absoluto 3 (2 min, temperatura ambiente)
Álcool 90 % (2 min, temperatura ambiente)
Álcool 80 % (2 min, temperatura ambiente)
Álcool 70 % (2 min, temperatura ambiente)
Lavagem das laminas:
Água corrente, 20 min, temperatura ambiente.
Solução de Hematoxilina:
1 min, temperatura ambiente
Lavagem das lâminas:
Água corrente, 20 min, temperatura ambiente.
Solução de eosina:
40 seg, temperatura ambiente
Desidratação:
Álcool 70 % (1 min, temperatura ambiente)
Álcool 80 % (1 min, temperatura ambiente)
Álcool 90 % (1 min, temperatura ambiente)
Álcool 95 % (1 min, temperatura ambiente)
Álcool absoluto 1 (21 min, temperatura ambiente)
Álcool absoluto 2 (1 min, temperatura ambiente)
Álcool absoluto 3 (1 min, temperatura ambiente)
Montagem das lâminas:
Xilol 1 (2 min, temperatura ambiente)
Xilol 2 (2 min, temperatura ambiente)
Xilol 3 (10 min, temperatura ambiente)
55
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados estão expressos com média ± EPM. Para a análise estatística
dos resultados dos corações isolados foram realizados os testes Two way
ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni ou teste t-student não pareado. Este
último também utilizado para análise dos resultados de radioimunoensaio. One
way ANOVA seguido do teste de Newman-Keuls foi usado para análise
morfológica e imunohistoquímica.
56
5. RESULTADOS
5.1. Efeito da deleção genética do receptor Mas na Contratilidade Cardíaca.
Os corações de camundongos com ausência da expressão do receptor
Mas foram submetidos à técnica de Langendorff com fluxo constante para
avaliação da função cardíaca. A contratilidade cardíaca apresentou importantes
diferenças entre os grupos antes, durante e após a isquemia. A tensão sistólica foi
significativamente menor nos corações dos animais KO-Mas no período basal
(1,31 ± 0.18 vs 2,09 ± 0,13 g nos animais WT, p<0,05) e na reperfusão. Durante a
isquemia os corações dos animais WT apresentaram diminuição na tensão
sistólica, alcançando assim valores semelhantes aos observados nos animais KOMas. No entanto, durante a reperfusão a tensão sistólica retornou aos valores
basais nos animais WT, enquanto nos corações KO-Mas permaneceu constante
em todos os períodos. O bloqueio agudo do receptor Mas com seu antagonista A779, induziu uma alteração similar àquelas observadas nos corações dos
comundongos KO-Mas no período basal e na reperfusão (Figura 4 A).
A tensão diastólica foi similar entre os grupos no período basal. No entanto,
ocorreu um significativo aumento nos corações dos camundongos WT comparado
aos animais KO-Mas durante o período isquêmico e pós-isquêmico (0,27 ± 0,01
vs 0,70 ± 0,06 g nos animais WT durante a reperfusão, p<0,05). Os corações WT
perfundidos com o antagonista A-779 tiveram alteração semelhante aos animais
KO-Mas durante a reperfusão (Figura 4 B).
57
A
3.5
*#
Tensão Sistólica (g)
3.0
#
*#
WT, n=8
KO, n=5
WT + A-779, n=3
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Basal
Anóxia
Reperfusão
Tempo(min)
Tensão Diastólica (g)
B
2.0
*#
1.5
*#
WT, n=8
KO, n=5
WT + A-779, n=3
1.0
0.5
0.0
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Basal
Anóxia
Tempo(min)
Reperfusão
Figura 4. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779
na tensão sistólica (A) e diastólica (B) de corações isolados de camundongos
antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a
técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; # WT vs WT perfundidos com KR contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way
Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni).
58
Os corações dos animais KO-Mas apresentaram +dT/dt significativamente
menor nos períodos basal e reperfusão comparados aos camundongos WT
(42,58 ± 3,86 vs 60,96 ± 4,12 g/s nos camundongos WT durante o peíodo basal,
p<0,05) (Figura 5 A). Além disso, a deleção do receptor Mas induziu significante
queda da –dT/dt durante o período basal (42,69 ± 3,47 vs 58,26 ± 3,80 g/s nos
corações WT, p<0,05), porém, não foram observadas diferenças significativas
entre os grupos durante a isquemia ou reperfusão (Figura 5 B). O antagonista A779, de maneira similar à deleção genética do receptor Mas, induziu significativa
queda em ambos os parâmetros, +dT/dt e -dT/dt no período basal.
A 100
*#
+ dT/dt (g/s)
75
*
50
WT, n=8
KO, n=5
WT + A-779, n=3
25
0
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Basal
Anóxia
Tempo(min)
Reperfusão
59
B
100
*#
- dT/dt (g/s)
75
50
WT, n=8
KO, n=4
WT + A-779, n=3
25
0
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Basal
Anóxia
Tempo(min)
Reperfusão
Figura 5. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779
na +dT/dt (A) e -dT/dt (B) de corações isolados de camundongos antes, durante e
após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de
Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R
contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way
Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni).
A frequência cardíaca também foi diferente entre os grupos, sendo menor
nos corações KO-Mas e WT tratados com A-779 comparados ao grupo controle
(242,7 ± 10,26 bpm nos camundongos KO-Mas vs 322,7 ± 10,50 bpm nos animais
WT durante o período basal, p<0,05). No entanto, estas diferenças não ocorreram
durante ou após a isquemia (Figura 6).
60
*#
Freqência Cardíaca
(bpm)
400
300
200
WT, n=8
100
KO, n=5
WT + A-779, n=3
0
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Basal
Anóxia
Tempo(min)
Reperfusão
Figura 6. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779
na freqüência cardíaca de corações isolados de camundongos antes, durante e
após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de
Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R
contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way
Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni).
61
5.2. Avaliação da função cardíaca em ratos transgêncios TG(hA1-7)L7301
que superexpressam Angiotensina-(1-7) no coração.
Com o objetivo de reduzir a possibilidade de alterações não-específicas
devido a introdução do transgene no genoma do rato, foram utilizados ratos
heterozigotos. Para confirmar a superexpressão da Ang-(1-7) nos corações
destes ratos a concentração deste peptídeo foi medida pela técnica de
radioimunoensaio. Os corações dos ratos transgênicos apresentaram maior
concentração de Ang-(1-7) comparado aos de seus controles (17,1 ± 2,1 vs 3,9 ±
1,4 pg/mg de proteína nos ratos SD)(Figura 7 A). No entanto, não foram
encontradas diferenças significativas nos níveis plasmáticos de Ang-(1-7) (66,5 ±
A
pg/mg de proteína
23,2 vs 41,9 ± 11,1 pg/ml nos ratos SD) (Figura 7 B).
25
20
*
15
10
5
0
SD, n=4
TG, n=4
B
pg/mg de proteína
62
150
125
100
75
50
25
0
SD, n=4
TG, n=4
Figura 7. Avaliação dos níveis de Ang-(1-7) nos corações (A) e plasma (B) de
ratos SD e TG. * p<0.05 comparado com os corações de ratos SD. Os valores
estão expressos como média ± EPM (Teste t-student).
A função cardíaca dos animais TG e SD foi avaliada in vitro através da
técnica de Langendorff com pressão constante. Os corações dos animais TG
mostraram maior força de contração, representada pela tensão sistólica,
comparado ao seu controle SD em condições basais (23,54 ± 0,96 vs 19,28 ±
2,45 g nos animais SD no final do período basal) (Figura 8 A). No entanto, a
tensão diastólica não foi diferente entre os grupos (Figura 8 B).
B
Tensão sistólica (g)
A
30
Tensão diastólica (g)
63
1.0
25
20
*
15
10
5
0
SD, n=5
TG, n=7
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
SD, n=5
TG, n=7
Figura 8. Avaliação da tensão sistólica (A) e diastólica (B) em corações isolados
de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de
Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados
em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001
comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como
média ± EPM (Teste t-student).
64
De forma semelhante, outros índices de contratilidade e relaxamento
também foram analisados e apresentaram-se maiores nos animais transgênicos:
+dT/dt (390,8 ± 2,1 vs 323,4 ± 4,4 g/s nos ratos SD, p<0.05) e –dT/dt (418,8 ±
9,25 vs 356,2 ± 4,78 g/s nos ratos SD, p<0.05) (Figura 9 A e B).
500
+dT/dt (g/s)
A
400
*
300
200
SD, n=5
TG, n=7
100
0
500
-dT/dt (g/s)
B
400
*
300
200
100
0
SD, n=5
TG, n=7
Figura 9. Avaliação da +dT/dt (A) e –dT/dt (B) em corações isolados de ratos
TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O
valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de
5 minutos durante 20 minutos do período basal. *p<0.001 comparado com os
corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste tstudent).
65
Os animais que superexpressam Ang-(1-7) nos corações apresentaram
pequena, porém significativa diminuição da freqüência cardíaca, quando
comparado ao seu grupo controle (211,0 ± 3,76 vs 240 ± 4,13 bpm nos coracões
SD, p<0,05) (Figura 10). Sabendo-se que alterações na frequência cardíaca
pedem levar a alterações na tensão sistólica e consequentemente no trabalho
cardíaco, nós calculamos o produto da tensão sistólica com a frequência cardíaca
e, como mostrado na figura 10 B, o trabalho cardíaco dos ratos transgênicos foi
significativamente maior que dos ratos SD, descartando assim, a possibilidade da
força de contração elevada nos animais transgênicos ser decorrente da
frequência cardíaca diminuída.
B
TS x FC (g/bpm)
A
Frequência Cardíaca
(bpm)
66
250
*
200
150
100
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
SD, n=5
TG, n=7
50
0
*
SD, n=5
TG, n=7
Figura 10. Avaliação da freqüência cardíaca (A) e do trabalho cardíaco (B) em
corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela
técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores
coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. *
p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos
como média ± EPM (Teste t-student), TS, tensão sistólica, FC, frequência
cardíaca.
67
5.3. Avaliação da incidência de arritmias de reperfusão em corações
isolados de ratos que superexpressam Ang-(1-7) no coração.
Quando as arritmias de reperfusão foram avaliadas, os animais TG
apresentaram menor duração nas fibrilações e/ou taquicardias ventriculares
(Figura 11 A). Além disso, também foi observada menor incidência de arritmias
B
12.5
*
10.0
Aritmias Irreversíveis
(%)
A
ISA
(Unidades arbitrárias)
irreversíveis, ou seja, com durações de 30 minutos (Figura 11 B).
7.5
5.0
2.5
SD, n=4
TG, n=6
0.0
100
4/4
75
50
2/6
25
0
SD, n=4
TG, n=6
Figura 11. Avaliação do índice de severidade de arritmias (ISA) (A) e incidências
das arritmias de reperfusão irreversíveis (B) em corações isolados de ratos
TG(hA1-7)L7301 submetidos a oclusão da coronária descendente esquerda. Os
corações foram analisados pela técnica de Langendorff. * p<0.05 comparado com
os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste
t-student).
68
5.4. Avaliação da resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol
em animais com deleção genética do receptor Mas.
A avaliação morfométrica dos cardiomiócitos do ventrículo esquerdo dos
animais KO-Mas não mostrou diferença significativa na área de secção cruzada
(mm2) comparado aos cardiomiócitos dos animais WT quando estes animais foram
tratados com veículo. O tratamento com isoproterenol, por sua vez, induziu
significativo aumento na área de secção cruzada (hipertrofia) nos dois grupos de
animais, WT e KO-Mas. No entanto, este tratamento induziu uma resposta
hipertrófica mais acentuada nos cardiomiócitos dos camundongos KO-Mas
quando comparados aos animais WT submetidos ao mesmo tratamento (19,3 ±
0,50 vs 17,8 ± 0,43 nos animais WT, p<0.05) (Figura 12).
Área de secção transversa
(mm2)
*
20
*
*
18
Salina, n= 4
Isoproterenol, n=4
16
14
12
10
0.0
WT
KO
Figura 12. Efeito da deleção genética do receptor Mas na resposta hipertrófica
induzida por isoproterenol. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ±
EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls).
69
A técnica de imunofluorescência foi utilizada para analisar a expressão de
proteínas específicas da MEC (colágenos I e III e fibronectina) no tecido cardíaco
de animais KO-Mas e WT em resposta ao isoproterenol.
Confirmando resultados prévios (Gava, 2006; Santos et al., 2006), as
marcações para os colágenos I e III e fribronectina em tecidos cardíacos de
camundongos KO-Mas foi significativamente maior do que as observadas em
tecidos de corações WT. A expressão do colágeno III ocorreu na MEC do tecido
ao redor dos cardiomiócitos e dos vasos sanguíneos. O tratamento com
isoproterenol não foi capaz de aumentar significativamente a síntese de colágeno
III nos animais controle. No entanto, os animais KO-Mas que já apresentavam
maior marcação para colágeno III em condições basais, apresentaram significante
aumento na expressão desta proteína quando submetidos ao tratamento com
isoproterenol (Figura 13 A e B). Este mesmo tratamento induziu significativo
aumento de colágeno I em ambos os grupos, porém levemente maior nos
corações de camundongos KO-Mas (25,4 %) comparado aos corações de
animais WT (20,6 %) (Figura 14 A e B). O tratamento com isoproterenol não
induziu alterações significativas na deposição de fibronectina em nenhum dos
grupos de animais comparados ao tratamento com salina. Apenas um pequeno
aumento (11,2 %) foi observado nos animais KO-Mas tratados com isoproterenol
comparado ao tratamento com salina (Figura 15 A e 15 B).
70
A
WT
Isoproterenol
Salina
KO
50 µm
Intensidade Relativa de
Fluorescência (U.A.)
B
*
*
150
*
125
100
75
50
25
Salina, n=4
Isoproterenol, n=4
0
WT
KO
Figura 13. (A) Imunolocalização de colágeno III (amarelo) em ventrículo esquerdo
de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. A imagem
inserida no canto superior direito representa o nível de marcação obtido quando o
anticorpo primário não foi usado na incubação (controle negativo). (B)
Quantificação da marcação do colágeno III nos ventrículos esquerdos de
camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os
valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias.
71
A
KO
Isoproterenol
Salina
WT
50 µm
Intensidade Relativa de
Fluorescência (U.A.)
B
*
*
*
150
*
125
100
75
50
Salina, n=4
Isoproterenol, n=4
25
0
WT
KO
Figura 14. (A) Imunolocalização de colágeno I (amarelo) em ventrículo esquerdo
de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. (B)
Quantificação da marcação do colágeno I nos ventrículos esquerdos de
camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os
valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias.
72
A A
KO
Isoproterenol
Salina
WT
50 µm
Intensidade Relativa de
Fluorescência (U.A.)
B
*
75
*
50
25
Salina, n=4
Isoproterenol, n=4
0
WT
Mas KO
Figura 15. (A) Imunolocalização de fibronectina (amarelo) em ventrículo esquerdo
de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. (B)
Quantificação da marcação de fibronectina nos ventrículos esquerdos de
camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os
valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias.
73
5.5. Avaliação da resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol
em animais TG(hA1-7)L7301 que superexpressam Angiotensina-(1-7) no
coração.
O efeito cardioprotetor da superexpressão de Ang-(1-7) no coração foi
avaliado em animais submetidos a tratamentos diários de isoproterenol. Os
cardiomiócitos dos animais TG que superexpressam Ang-(1-7) no coração não
apresentaram diferenças morfométricas significativas em relação ao seu controle.
O tratamento com isoproterenol induziu uma hipertrofia similar nos dois grupos de
Área de secção transversa
(mm2)
animais, SD e TG (18,35 ± 0,30 vs 18,31 ± 0,33 nos animais SD) (Figura 16).
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
*
*
Salina, n=4
Isoproterenol, n=4
SD
TG
Figura 16. Avaliação da resposta hipertrófica em ratos TG(hA1-7)L7301 induzida
por isoproterenol. *p<0,01. Os valores estão expressos como média ± EPM (Oneway Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls).
74
Utiliazando-se a técnica de imunofluorescência, nós não observamos
diferenças significativas na deposição das proteínas de matriz avaliadas entre os
animais tratados com salina. No entanto, a resposta fibrótica ao tratametno com
isoproterenol foi diferente entre os animais. Após sete dias de tratamento, pôdese observar que o isoproterenol induziu aumento de colágeno III nos dois grupos
de animais, porém de forma significativamente menor nos animais que
superexpressam Ang-(1-7) no coração (67,47 ± 2,20 vs 87,90 ± 3,09 unidade
arbitrárias nos ratos SD) (Figura 17 A e B). Este efeito protetor também foi
observado quando os cortes foram incubados com anticorpo para fibronectina
(97,84 ± 2,88 vs 142,7 ± 3,74 unidade arbitrárias nos ratos SD) (Figura 18 A e B).
Entretanto, não foi observada diferença significativa na marcação para o colágeno
do tipo I entre os ratos tratados com isoproterenol (104,0 ± 2,64 vs 101,6 ± 2,00
unidade arbitrárias nos ratos SD) (Figura 19 A e B).
75
TG
SD
Isoproterenol
Salina
A
50 µm
Intensidade Relativa de
Fluorescência (A.U.)
B
*
125
100
*
*
75
50
25
Salina, n=4
Isoproterenol, n=4
0
SD
TG
Figura 17. (A) Imunolocalização de colágeno III (amarelo) em ventrículo esquerdo
de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. Os núcleos
celulares foram marcados com iodeto de propídeo (azul). A imagem inserida no
canto superior direito representa o nível de marcação obtido quando o anticorpo
primário não foi usado na incubação (controle negativo). (B) Quantificação da
marcação de colágeno III nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e
SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos
como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls);
U.A., unidades arbitrárias.
76
A
TG
Isoproterenol
Salina
SD
50 µm
Intensidade Relativa de
Fluorescência (A.U.)
B
*
200
175
150
*
*
125
100
75
50
Salina, n=4
Isoproterenol, n=4
25
0
SD
TG
Figura 18. (A) Imunolocalização de fibronectina em ventrículo esquerdo de ratos
TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. Os núcleos celulares
foram marcados com iodeto de propídeo (azul). (B) Quantificação da marcação de
fibronectina nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados
com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ±
EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades
arbitrárias.
77
SD
TG
Isoproterenol
Salina
A
Intensidade Relativa de
Fluorescência (A.U.)
B
125
50 µm
*
*
100
75
50
25
Salina, n=4
Isoprotererenol, n=4
0
SD
TG
Figura 19. (A) Imunolocalização de colágeno I em ventrículo esquerdo de ratos
TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. Os núcleos celulares
foram marcados com iodeto de propídeo (azul). (B) Quantificação da marcação de
colágeno I nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados
com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ±
EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades
arbitrárias.
78
5.6. Avaliação da participação do receptor Mas e da Angiotensina-(1-7) nos
vasos coronarianos em condições basais e pós-isquêmicas.
Os corações isolados dos camundongos KO-Mas apresentaram maior
pressão de perfusão coronariana (172,1 ± 11,43 vs 132,4 ± 10,97 mmHg, p<0,05)
no período basal (pré-isquemia) comparado aos animais controles, o que
representa um estado de maior constrição coronariana (Figura 20 A). Esta
diferença foi maior com 5 min de reperfusão (138,5 ± 12,01 vs 73,39 ± 8,11 mmHg
nos animais WT) alcançando valores similares ao período basal no final da
reperfusão. Isto demonstra que os animais KO-Mas apresentam mecanismos
vasodilatadores, que podem estar envolvidos na recuperação pós-isquêmica,
prejudicados em relação aos animais WT. Isto foi confirmado quando o t1/2 foi
analisado, ou seja, o tempo gasto para atingir 50 % da pressão de perfusão
máxima após o início da reperfusão (t1/2: 0,76 ± 0,05 vs 4,17 ± 0,42 min nos
animais controles) (Figura 20 B). Este resultado foi similar quando os corações
dos animais WT foram perfundidos com K-R contendo A-779, os quais
apresentaram um significante aumento na pressão de perfusão nos períodos
basal e pós-isquêmico (Figura 20 A).
79
Pressão de Perfusão
(mmHg)
A
250
*#
200
*#
150
100
WT, n=8
KO, n=5
WT + A-779, n=3
50
0
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Basal
B
200
KO
Reperfusão
Oclusão
Tempo(min)
WT
Variação da Pressão
de Perfusão (mmHg)
175
150
125
100
75
WT, n=8
KO, n=5
WT + A-779, n=3
50
25
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 20.0
22.5
25.0
Tempo após inicío da reperfusão (Min)
Figura 20. (A) Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista
A-779 na pressão de perfusão coronariana de corações isolados de
camundongos antes, durante e após isquemia. (B) Curva da pressão de perfusão
no período da reperfusão utilizada para análise do t1/2. As linhas pontilhadas
representam os valores do t1/2 dos animais indicados. Os corações foram
perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #
p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão
expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de
Bonferroni).
80
Visto que o receptor Mas e outros receptores angiotensinérgicos (AT1 e
AT2) apresentam importante envolvimento na modulação da resistência
coronariana (Zhang et al., 2003; Merkus et al., 2006; van Esch et al., 2006), foi
avaliada
e
comparada
a
participação
destes
receptores
na
resposta
vasodilatadora da acetilcolina, uma potente droga cujo efeito vasodilatador é
dependente do endotélio e amplamente utilizada para avaliar a função endotelial.
Surpreendentemente, o efeito vasodilatador da acetilcolina foi completamente
ausente nos animais KO-Mas (Figura 21 A). Por outro lado, a vasodilatação
induzida pela acetilcolina foi maior nos corações dos animais KO-AT2 (Figura 21
B) e similar nos animais KO-AT1 (Figura 21 C) comparado aos respectivos grupos
controles. Estes resultados mostram um papel fundamental do receptor Mas na
modulação da função vascular coronariana em camundongos.
Variação da Pressão
de Perfusão (mmHg)
A
Ach
10
5
*
0
-5
-10
-15
WT, n=4
-20
KO Mas, n=4
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20
Tempo (min)
81
Variação da Pressão
de Perfusão (mmHg)
B
Ach
10
WT, n=4
KO AT2, n=4
5
0
-5
-10
*
-15
-20
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20
Tempo (min)
Variação da Pressão
de Perfusão (mmHg)
C
Ach
10
5
WT, n=4
0
KO AT1, n=4
-5
-10
-15
-20
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20
Tempo (min)
Figura 21. Avaliação do efeito vasodilatador da acetilcolina 10-7 mol/L em
corações isolados de camundongos KO-Mas (A), KO-AT2 (B) e KO-AT1 (C). Os
corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05
comparado ao grupo controle. Os valores estão expressos como média ± EPM
(Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni).
82
Os corações dos ratos TG apresentaram, em condições basais, menor
fluxo coronariano comparado aos animais controle (9,36 ± 0,15 vs 15,20 ± 0,30
nos ratos SD, p<0,05) (Figura 22 A). Este efeito coronariano pode ser pelo menos
em parte, resultante da maior força de contração. No entanto, quando estes
animais
foram
submetidos
à
isquemia
do
ventrículo
esquerdo
e
subsequentemente reperfundidos, os corações dos animais TG apresentaram um
aumento significativo do fluxo coronariano em relação ao seu próprio período
basal e também comparado ao grupo controle no período de reperfusão (Figura
22 B).
83
Fluxo Coronariano
(mL/min)
A
20
15
10
*
SD, n=5
TG, n=7
5
0
Fluxo Coronariano (%)
B
200
175
150
125
100
75
50
25
0
*
SD, n=7
TG, n=4
35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85
Reperfusão
Oclusão
Tempo (min)
Figura 22. Avaliação do fluxo coronariano em corações isolados de ratos
TG(hA1-7)L7301 em condições basais (A) e durante isquemia/reperfusão (B). Os
corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal
foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20
minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os
valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student).
84
6. DISCUSSÃO
Neste estudo foi observada a participação fundamental da Ang-(1-7) e do
seu receptor Mas no controle da função cardíaca. Além disso, o eixo Ang-(17)/Mas
se
mostrou
um
componente
essencial
na
cardioproteção
da
isquemia/Reperfusão e no remodelamento cardíaco induzido por isoproterenol.
Para este estudo, nós utilizamos dois tipos de animais geneticamente
modificados, um que apresentava perda da função do eixo Ang-(1-7)/Mas, os
camundongos knockout para o receptor Mas, e outro com ganho da função deste
eixo, os rato transgênicos TG(hA1-7)L7301 que superexpressam a Ang-(1-7) no
tecido cardíaco. Estes ratos possuem uma proteína de fusão produtora de Ang-(17) especificamente no coração (Ferreira, 2004). A superexpressão deste peptídeo
no tecido cardíaco foi confirmada pela técnica de Radioimunoensaio, onde os
níveis de Ang-(1-7) se mostraram 4 vezes maior que os encontrados nos animais
controles. Nós confirmamos também que este aumento foi limitado ao tecido
cardíaco, uma vez que os níveis plasmáticos de Ang-(1-7) não foram diferentes
entre os grupos.
Nos animais KO-Mas, a função cardíaca representada pela tensão
sistólica, +dT/dt e –dT/dt, foi significativamente menor quando comparada com
seu controle. A participação do receptor Mas na função cardíaca foi confirmada
quando os animais WT foram perfundidos com o antagonista A-779, pois a
presença deste na solução de perfusão causou uma significativa diminuição dos
parâmetros relacionados à contratilidade cardíaca, tornando os valores similares
aos encontrados nos animais KO-Mas. A deterioração da função cardíaca nos
animais KO-Mas foi comprovada posteriormente in vivo, quando este animais
85
foram submetidos à ecocardiografia (Santos et al., 2006). Nesta avaliação foi
revelada uma diminuição da fração de encurtamento, da espessura da parede
posterior e septo interventricular na sístole e diástole e da dimensão do ventrículo
esquerdo no final da diástole nos animais KO-Mas. Por outro lado, estes animais
apresentaram maior dimensão do ventrículo esquerdo no final da sístole e uma
marcada disfunção ventricular global mostrada pelo maior índice de performance
miocardial.
Por outro lado, as alterações na função cardíaca encontradas nos ratos
TG(hA1-7)L7301 foram opostas àquelas encontradas nos camundongos KO-Mas.
Estes ratos apresentaram melhor função cardíaca, observada pela maior tensão
sistólica, +dT/dt e –dT/dt.
Prévios trabalhos sugeriram que a Ang-(1-7) pode ser uma moduladora de
canais iônicos (Gironacci et al., 1994; Bevilaqua et al., 2002; Gironacci et al.,
2004). A Ang-(1-7) potencializa a liberação de [3H]Norepinefrina gerada pela
estimulação nervosa em átrio isolado (Gironacci et al., 1994). Na junção neuromuscular, a Ang-(1-7) aumentou a liberação, de forma dose-dependente, de
acetilcolina (Bevilaqua et al., 2002). Desta forma, tendo os canais de cálcio um
papel classicamente conhecido na contratilidade cardíaca (Langer, 1977), Santos
e colaboradores (2006) avaliaram o perfil da corrente de cálcio nos cardiomiócitos
dos animais KO-mas e observaram que a interação Ang-(1-7)-Mas exerce um
papel modulatório importante na corrente de cálcio destas células. Neste estudo
observou-se que o tempo para atingir o pico da corrente de Cálcio do tipo L foi
mais lento nas células dos camundongos KO-Mas, o que poderia prejudicar o
processo de reenchimento do retículo sarcoplasmático, culminando em menor
quantidade de cálcio liberada durante a excitação. Outra causa para a diminuição
86
da função cardíaca nos animais KO-mas pode ser explicada pelo perfil fibrótico
apresentado nos corações destes animais, representado pelo aumento na
expressão dos colágeno I e III e fibronectina. Apesar do efeito anti-hipertensivo da
Ang-(1-7), as alterações nas proteínas de matriz extracelular foram independentes
da pressão arterial, pois os animais KO-Mas não apresentam alterações
significativas da pressão arterial e, além disso, o perfil fibrótico também está
presente nos animais neonatos (Santos et al., 2006). O aumento de colágenos da
MEC no coração, como relatado em doenças cardíacas hipertensivas,
cardiomiopatia isquêmica e cardiomiopatia hipertrófica, levam ao acúmulo de
tecido fibroso e contribui para um comprometimento progressivo da função
cardíaca (Kawano et al., 2000; Schnee and Hsueh, 2000; Pathak et al., 2001;
Gonzalez et al., 2002; Lijnen and Petrov, 2003). O colágeno fibrilar forma uma
ligação entre os elementos contráteis de cardiomiócitos adjacentes. No entanto,
quando há um acúmulo anormal de fibras colágenas, levando à fibrose, a rigidez
miocardial aumenta, comprometendo deste modo, o enchimento diastólico. O
acúmulo contínuo aumenta ainda mais esta rigidez e prejudica o comportamento
contrátil e a atividade elétrica (Diez et al., 2001). Deste modo, o aumento destes
colágenos fibrilares pode explicar, pelo ao menos em parte, a diminuição da
contratilidade encontrada nos animais KO-Mas. Entretanto, a participação direta
do receptor Mas na contratilidade cardíaca deve ser considerada, pois é
improvável que a perfusão aguda do antagonista deste receptor nos corações
isolados dos animais WT promova alguma alteração estrutural suficiente para
induzir as alterações encontradas na função cardíaca. Deve ser ressaltado
também, que a alteração da frequência cardíaca (discutida abaixo) causada pelo
bloqueio do eixo Ang-(1-7)/Mas dificilmente pode ser responsável pelas
87
mudanças observadas na contratilidade cardíaca, visto que, não foram
encontradas diferenças significativas entre os grupos no período pós-isquêmico.
Alguns resultados encontrados pelo nosso grupo (dados não publicados)
mostram a participação do cálcio no aumento da contratilidade cardíaca dos ratos
transgênicos. Este aumento na contratilidade causado pela alta concentração
tecidual de Ang-(1-7) nos corações, também pode ser devido a um possível
aumento na síntese de óxido nítrico. Estudos mostraram que o óxido nítrico é
responsável por diversos efeitos mediados pela Ang-(1-7) (Castro et al., 2005;
Faria-Silva et al., 2005; Rajendran et al., 2005; Sampaio et al., 2007; Fraga-Silva
et al., 2008). O óxido nítrico aumenta a produção de GMP cíclico, que quando
presente em baixas concentrações inibe a atividade da fosfodiesterase III,
prevenindo assim a hidrólise do AMP cíclico e permitindo seu acúmulo na célula
(Kojda et al., 1996). O acúmulo do AMP cíclico ativa a proteína cinase A,
responsável pela abertura dos canais de cálcio dependente de voltagem e dos
receptores de rianodina, levando ao aumento da concentração intracelular de
cálcio e maior contratilidade (Marx et al., 2000).
Outro achado relacionado à função cardíaca foi a menor frequência
cardíaca encontrada nos animais KO-Mas e o efeito bradicárdico do antagonista
A-779. No entanto, curiosamente, os ratos transgênicos também apresentaram
menor frequência cardíaca que seus controles. O efeito do eixo Ang-(1-7)/Mas na
frequência cardíaca ainda é controverso. Santos e colaboradores (2004)
mostraram que ratos transgênicos com níveis aumentados de Ang-(1-7) no
plasma apresentaram maior frequência cardíaca in vivo e ex vivo. Ao contrário, a
Ang-(1-7) infundida durante 7 dias induziu um pequeno, porém significativo efeito
bradicárdico em ratos Wistar (Braga et al., 2002). Uma hipótese plausível para a
88
frequência cardíaca diminuída nos animais transgênicos do nosso estudo seria
possíveis alterações nas correntes iônicas do nodo-sinoatrial e/ou átrioventricular. Diferentemente dos achados encontrados por Santos e colaboradores
(2004), onde os ratos transgênicos da linhagem TGR(A1-7)3292 apresentaram
maior frequência cardíaca in vivo, não foram observadas diferenças significativas
na frequência cardíaca dos camundongos KO-Mas (Santos et al., 2006) ou dos
ratos transgênicos TG(hA1-7)L7301 (dados não publicados), reforçando a
hipótese de uma modulação do receptor Mas na atividade do nodo sino-atrial e
consequentemente na modulação da frequência cardíaca intrínseca. O conteúdo
aumentado de proteínas da matriz extracelular também pode ser um fator
relacionado à menor frequência cardíaca intrínseca nos camundongos KO-Mas.
As espécies de animais, formas de administração e concentrações utilizadas de
Ang-(1-7) podem, ao menos em parte, explicar estas observações divergentes da
frequência cardíaca nos estudos realizados até a presente data.
Nossos dados também mostram que o eixo Ang-(1-7)/Mas está envolvido
na manutenção ou preservação da função cardíaca pós-isquêmica. A menor
tensão sistólica, +dT/dt e –dT/dt observada nos animais KO-Mas e WT
perfundidos com A-779 no período basal permaneceram constantes no período
de reperfusão, ou seja, não foram observadas alterações mecânicas induzidas
pela isquemia/reperfusão nos corações dos camundongos KO-Mas ou WT
perfundidos com A-779. Isto mostra a relevante participação do receptor Mas na
função cardíaca, pois a função contrátil no período basal já está diminuída nestes
animais, o que minimizou uma maior perda proveniente do processo isquêmico,
ou seja, o bloqueio do receptor Mas promove um efeito devastador na função
contrátil,
levando
a
um
fenótipo
onde
as
alterações
induzidas
pela
89
isquemia/reperfusão se tornam dificilmente detectáveis. Nossos achados estão de
acordo com diversos trabalhos que mostram os efeitos protetores da Ang-(1-7) no
coração (Brosnihan et al., 1996; Brosnihan et al., 1998; Ferreira et al., 2001;
Ferreira et al., 2002; Loot et al., 2002; Averill et al., 2003; Zisman et al., 2003;
Santos et al., 2004). A Ang-(1-7), em concentrações picomolares, melhorou a
função cardíaca pós-isquêmica em corações isolados de ratos (Ferreira et al.,
2002). Este efeito foi completamente bloqueado pelo antagonista do receptor
Mas, A-779, sugerindo que as ações da Ang-(1-7) no coração foram mediadas
pelo seu receptor específico. Além disso, este estudo também mostrou a
participação das prostaglandinas nos efeitos benéficos da Ang-(1-7), visto que a
indometacina também bloqueou o efeito anti-arritmogênico e a preservação da
função sistólica induzida pela Ang-(1-7). Em outro estudo, foi observado que a
infusão crônica de Ang-(1-7) preservou a função cardíaca e função endotelial
sistêmica, reduziu a queda da pressão arterial e fluxo coronariano em ratos
submetidos à oclusão da artéria coronária esquerda (Loot et al., 2002). Um
possível mecanismo responsável pelos efeitos benéficos da Ang-(1-7) na função
cardíaca seria a modulação dos níveis cardíacos de Ang II (Mendes et al., 2005),
pois sabe-se que indivíduos portadores de insuficiência cardíaca apresentam
níveis cardíacos aumentados deste peptídeo (Serneri et al., 2001). No entanto, os
resultados obtidos em nosso estudo utilizando animais com deleção genética para
o receptor Mas mostra uma relevante participação direta deste receptor na
modulação da função cardíaca.
Alguns estudos têm sugerido que a recuperação do processo de
isquemia/reperfusão esteja relacionada ao fluxo coronariano (Collard and Gelman,
2001). Desta forma, as alterações encontradas na pressão de perfusão (discutida
90
abaixo) também poderia ser uma possível causa das demais alterações
encontradas nos corações dos animais KO-Mas. Entretanto, não foram
observadas diferenças significativas na pressão de perfusão entre o período basal
e reperfusão de cada grupo. Além disso, estudos prévios mostraram que a Ang(1-7) não alterou o fluxo coronariano em corações isolados de ratos após
reperfusão (Neves et al., 1997; Ferreira et al., 2002). Estes dados sugerem que os
efeitos da Ang-(1-7) na função cardíaca após isquemia/reperfusão são
independentes de alterações no fluxo coronariano e fortalece achados anteriores
(Ferreira et al., 2001; Ferreira et al., 2002; Loot et al., 2002; De Mello et al., 2007)
que mostram que a Ang-(1-7) preserva a função cardíaca pós-isquêmica por
mecanismos diretos envolvendo seu receptor Mas.
O
resultado
encontrado
na
tensão
diastólica
dos
corações
de
camundongos também é uma importante evidência de que o receptor Mas está
envolvido na modulação da homeostasia do cálcio no coração, pois foi observado
em nossos experimentos que o aumento da tensão diastólica nos animais WT foi
inexistente nos animais KO-Mas e WT perfundidos com A-779. Estes achados
estão de acordo com diferentes estudos que demonstram que as injúrias de
isquemia/reperfusão induzem significante aumento do conteúdo intracelular de
cálcio (Daly et al., 1984; Manning and Hearse, 1984; Fukuda et al., 2001). Narita e
colaboradores (1983), utilizando corações isolados de Hamisters, observaram que
o aumento da tensão diastólica pós-isquêmica foi atenuado pela redução na
concentração de cálcio na solução de perfusão e pelo diltiazen, uma antagonista
dos canais lentos de cálcio (tipo L) (Narita et al., 1983). O retículo sarcoplasmático
e o sarcolema dos cardiomiócitos são os principais componentes responsáveis
pela manutenção da homeostasia do cálcio no coração (MacLennan et al., 2002).
91
A despolarização do potencial de ação ativa os canais de cálcio do tipo L
resultando no influxo de cálcio e consequentemente no aumento da concentração
intracelular
de
cálcio
estimulando
a
liberação
deste
íon
do
retículo
sarcoplasmático via receptores de rianodina (Chamberlain et al., 1984). Durante o
processo de relaxamento das células cardíacas, grande parte do cálcio liberado é
sequestrado de volta para o retículo através da SERCA e parte é eliminado da
célula via trocador Na+/Ca2+. Estudos têm mostrado que o processo de
isquemia/reperfusão altera o funcionamento normal do retículo sarcoplasmático,
diminuindo a ativação da SERCA (Osada et al., 1998) e resultando na sobrecarga
intracelular de cálcio. Assim, alterações na fosforilação de proteínas reguladoras
da ativação da SERCA ou do trocador Na+/Ca2+ podem estar envolvidas nas
alterações
encontradas
na
tensão
diastólica
dos
animais WT.
Porém,
experimentos adicionais são necessários para explicar os resultados encontrados
na tensão diastólica dos corações dos animais KO e WT perfundidos com A-779,
bem como a participação de outros canais iônicos nas ações cardíacas da Ang(1-7).
O papel cardioprotetor do eixo Ang-(1-7)/Mas também foi claramente
observado nas arritmias de reperfusão induzidas pela oclusão e liberação da
artéria descendente esquerda nos corações isolados dos ratos transgênicos.
Estes corações apresentaram menor duração das arritmias de reperfusão e
menor incidência das arritmias irreversíveis. Nossos resultados confirmam os
achados anteriores que mostram a ação anti-arritmogênica da Ang-(1-7) (Ferreira
et al., 2001; Santos et al., 2004). As causas das arritmias de reperfusão são
multifatoriais. Uma destas causas pode ser resultado de uma súbita alteração nas
concentrações iônicas na região isquêmica reperfundida (Yamazaki et al., 1986;
92
Ibuki et al., 1993). Alguns estudos também mostram que a reperfusão gera uma
seqüência ordenada de eventos eletrofisiológicos que podem constituir um
mecanismo importante das arritmias de reperfusão (Ferrier et al., 1985). Ferreira e
colaboradores (2001) demonstraram que o efeito anti-arritmogênico da Ang-(1-7)
foi completamente bloqueado pelo pré-tratamento com indometacina. Realmente,
as prostaglandinas têm importante participação benéfica nas arritmias de
reperfusão por estimular os receptores EP3, induzindo a ativação de correntes
repolarizantes da membrana (Hohlfeld et al., 2000). Recentemente, foi
demonstrado que a Ang-(1-7) promove hiperpolarização e re-estabelecimento da
propagação do impulso em fibras de corações isquêmicos de ratos (De Mello,
2004). Posteriormente este mesmo grupo mostrou que a Ang-(1-7) também é
capaz de induzir hiperpolarização, aumento da velocidade de condução e
diminuição da duração do potencial de ação em cardiomiócitos de hamsters (De
Mello et al., 2007). Em ambos os trabalhos, a ativação da bomba de sódio foi
responsável pelos resultados encontrados, sugerindo que este pode ser um forte
mecanismo envolvido no efeito anti-arritmogênico da Ang-(1-7). No entanto,
sabendo-se que as causas das arritmias de reperfusão são multifatoriais, não se
deve descartar outras possibilidades, como por exemplo, o efeito anti-oxidativo da
Ang-(1-7) (Sampaio et al., 2007).
Em adição a cardioproteção do eixo Ang-(1-7)/Mas nos efeitos deletérios
da isquemia/reperfusão, nossos dados também mostraram que este eixo é um
modulador crítico do remodelamento cardíaco. A hipertrofia dos cardiomiócitos
induzida pelo tratamento diário com o isoproterenol, um agonista β-adrenérgico,
foi significativamente maior nos animais KO-Mas. Além disso, a deposição de
colágeno III também foi superior nos animais que não apresentavam o receptor
93
Mas. Por outro lado, a superexpressão da Ang-(1-7) nos corações dos ratos
transgênicos atenuou o aumento da expressão de colágeno III e fibronectina
induzido pelo isoproterenol, porém falhou em prevenir o desenvolvimento do
processo hipertrófico. Diferentemente dos trabalhos anteriores (Santos et al.,
2004; Santos and Ferreira, 2007), este estudo utilizou uma dose maior de
isoproterenol para induzir hipertrofia cardíaca e possivelmente a quantidade de
Ang-(1-7) presente no tecido cardíaco não foi suficiente para bloquear o efeito
hipertrófico do isoproterenol. Em adição, o aumento plasmático de Ang-(1-7) nos
animais estudados por Santos e colaboradores (2004) poderia agir em outros
órgãos, contribuindo indiretamente para os efeitos anti-hipertróficos, sendo esta
possibilidade improvável no modelo utilizado no presente estudo, uma vez que o
aumento dos níveis de Ang-(1-7) foi limitado ao coração. No entanto, existem
evidências
de
que
os
processos fibróticos
e
hipertróficos
podem
ser
independentes, como mostrado por Lekgabe e colaboradores em 2005 (Lekgabe
et al., 2005).
A participação da Ang-(1-7) e do seu receptor Mas na proteção do
remodelamento cardíaco tem sido mostrado em diferentes estudos, incluindo seus
efeitos anti-fibróticos (Iwata et al., 2005; Grobe et al., 2006; Santos et al., 2006;
Grobe et al., 2007) e anti-hipertróficos (Loot et al., 2002; Santos et al., 2004; Iwata
et al., 2005; Tallant et al., 2005). A infusão crônica de Ang-(1-7) preveniu
significativamente a fibrose cardíaca em dois modelos diferentes de hipertensão,
um induzido pela infusão crônica de Ang II (Grobe et al., 2007) e outro em modelo
de DOCA-salt (Grobe et al., 2006). No entanto o feito anti-hipertrófico da Ang-(17) foi observado somente nos animais tratados com Ang II, sugerindo mais uma
vez uma diferença no mecanismo protetor da Ang-(1-7) entre o desenvolvimento
94
de processos fibróticos e hipertróficos. Em ambos os modelos, a Ang-(1-7)
promoveu seus efeitos independentemente de alterações da pressão arterial, ou
seja, a dose administrada de Ang-(1-7) não inibiu o aumento da pressão arterial
nos ratos tratados com DOCA-salt ou Ang II. Além da Ang-(1-7), o agonista não
peptídico do receptor Mas, AVE 0991, também foi eficaz em prevenir a fibrose e a
hipertrofia
cardíaca
induzida
por
isoproterenol,
efeito
que
também
foi
independente de alterações na pressão arterial (Ferreira et al., 2007).
Existem diversos mecanismos pelos quais a Ang-(1-7) pode agir para
diminuir a deposição de proteínas da matriz extracelular. Uma primeira hipótese
seria a diminuição da pressão arterial, o que diminuiria uma série de eventos
sinalizadores pró-fibróticos dependentes de sobrecarga hemodinâmica. No
entanto, como discutido acima, vários trabalhos (Grobe et al., 2006; Santos et al.,
2006; Grobe et al., 2007) se opõem a esta possibilidade. Segundo, a Ang-(1-7)
poderia inibir diretamente a secreção de colágeno ou ativação de fibroblastos ou
sua diferenciação em miofibroblastos, uma vez que estes efeitos podem ser
encontrados sob estímulo da Ang II (Samuel et al., 2004; Iwata et al., 2005; Olson
et al., 2008; Tsai et al., 2008) e diversos trabalhos têm mostrado que a Ang-(1-7)
apresenta, na maioria das vezes, efeitos opostos aos da Ang II. Terceiro, a Ang(1-7) pode estimular a degradação de colágenos ativando metaloproteinases de
matriz ou inibindo os inibidores teciduais de metaloproteinases de matriz. Esta
hipótese está de acordo com os resultados encontrados por Pan e colaboradores
(2008), onde foi observado que a Ang-(1-7) modulou a expressão de
metaloproteinases e inibidores teciduais de metaloproteinases, apesar deste
efeito ter sido dependente da célula utilizada (Pan et al., 2008). Finalmente, a
Ang-(1-7) poderia estar inibindo as ações de vários fatores pró-fibróticos, tais
95
como Ang II, TGF-β e ou endotelina-1. Como discutido anteriormente, a infusão
crônica de Ang-(1-7) reduz os níveis cardíacos de Ang II (Mendes et al., 2005), o
que colabora com os dados encontrados por Zhang e colaboradores (2007),
mostrando que o receptor AT1 exerce um papel crucial no desenvolvimento da
hipertrofia cardíaca induzida pela estimulação β-adrenérgica (Zhang et al., 2007).
Recentemente, foi mostrado que a Ang-(1-7) inibi a síntese de colágeno,
mensurada pela incorporação de [3H]prolina, e diminuiu a expressão de RNA
mensageiro de diferentes fatores de crescimento, tais como TGF-β e endotelina-1,
além de inibir o crescimento de cardiomiócito estimulado com Ang II (Iwata et al.,
2005). Embora nós não tenhamos realizado experimentos para elucidar os
mecanismos pelos quais a Ang-(1-7) promove seus efeitos anti-fibróticos e antihipertróficos no coração, a interação com o receptor Mas é evidente devido aos
resultados
encontrados
nos
corações
dos
animais
KO-Mas.
Tallant
e
colaboradores (2005) também demonstraram que a transfecção de miócitos
cardíacos com oligonucleotídeos antisense para o receptor Mas bloqueou a ação
inibitória da Ang-(1-7) na fosforilação da cinase ERK1/2 (Tallant et al., 2005), uma
importante proteína envolvida no desenvolvimento do processo hipertrófico, o que
reforça a hipótese de uma ação protetora direta da Ang-(1-7) no remodelamento
cardíaco. É importante ressaltar que a Ang-(1-7) apresenta efeitos seletivos na
modulação da síntese e/ou degradação das proteínas de matriz extracelular,
como observado previamente por Santos e colaboradores (2006) e confirmado
por nossos resultados, pois foi observado em nosso estudo um efeito mais
expressivo da Ang-(1-7) e do receptor Mas no controle da deposição de colágeno
III,
tanto
nos
camundongos
diferentemente do colágeno I.
KO-Mas
quanto
nos
ratos
transgênicos,
96
O eixo Ang-(1-7)/Mas exerce importantes efeitos no controle da resistência
vascular sistêmica (Sampaio et al., 2003; Botelho-Santos et al., 2007; Xu et al.,
2008). A alta pressão de perfusão observada nos corações isolados dos animais
KO-Mas e com a presença de A-779 nos corações dos animais WT está de
acordo com prévios trabalhos mostrando a atividade vasodilatadora da Ang-(1-7)
no leito coronariano (Porsti et al., 1994; Brosnihan et al., 1996; Castro et al.,
2005). Brosnihan e colaboradores (1996) mostraram que este peptídeo promove
vasodilatação em artérias coronarianas de cães. Este efeito foi completamente
bloqueado pelo antagonista não seletivo de angiotensina [Sar1Thr8]-Ang II, mas
não pelos antagonistas específicos dos receptores AT1 ou AT2, sugerindo que a
vasodilatação induzida pela Ang-(1-7) nas artérias coronarianas é mediada por
um receptor diferente de AT1 ou AT2. A pressão de perfusão elevada nos
corações dos animais KO-Mas indica que o receptor Mas tem participação
importante na vasodilatação induzida pela Ang-(1-7) no leito coronariano de
camundongos. Além disso, o antagonista do receptor Mas A-779 aboliu o efeito
potencializador da Ang-(1-7) na resposta vasodilatadora da bradicinina em
corações isolados de ratos (Almeida et al., 2000). Este antagonista também
bloqueou a vasodilatação induzida pela Ang-(1-7) na presença de losartan em
corações isolados de camundongos, efeito que também foi abolido nos corações
isolados de camundongos com deleção genética para o receptor Mas (Castro et
al., 2005). Na maior parte dos estudos realizados para avaliar o efeito vascular da
Ang-(1-7), os inibidores da enzima eNOS foram capazes de bloquear seu efeito
vasodilatador, sugerindo que a liberação de óxido nítrico é um importante
mecanismo envolvido na resposta vasodilatadora da Ang-(1-7) nas artérias
coronarianas. Esta modulação da Ang-(1-7) via receptor Mas na atividade da
97
eNOS foi recentemente confirmada por Sampaio e colaboradores (Sampaio et al.,
2007). Nossos resultados também mostraram uma diferença na cinética do
aumento da pressão de perfusão no início da reperfusão representada pelo t1/2,
sugerindo que o receptor Mas está envolvido no processo de vasodilatação
decorrente da hiperemia reativa pós-isquêmica, processo mediado por dois
principais metabólitos vasodilatadores, a adenosina e o óxido nítrico (Otomo et al.,
1997). Apesar do fluxo coronariano ter sido menor nos corações dos ratos
transgênicos em condições basais, o aumento deste fluxo no período de
reperfusão comparado ao período basal reforçam a hipótese de uma participação
do eixo Ang-(1-7)/Mas nos mecanismos vasodilatadores na recuperação pósisquêmica. O fluxo coronariano menor nos corações dos ratos transgênicos em
condições basais pode ser explicada, em parte pela maior tensão sistólica (Kajiya
et al., 1989; Hiramatsu et al., 1992; Kajiya et al., 2000). No entanto, outras
possibilidades,
tal
como
alterações
na
expressão
de
receptores
angiotensinérgicos, devem ser investigadas para uma melhor compreensão deste
resultado.
Uma vez observado o envolvimento do receptor Mas no controle da
resistência arterial coronariana, nós também avaliamos a participação deste
receptor na resposta vasodilatadora da acetilcolina, um potente vasodilatador
dependente do endotélio. Nossos resultados mostraram que a ausência do
receptor Mas aboliu a vasodilatação coronariana induzida pela acetilcolina. Estes
dados estão de acordo com os resultados mostrados por Faria-Silva e
colaboradores (2005), onde a infusão aguda de Ang-(1-7) ou seu análogo AVE
0991 aumentou significativamente o efeito hipotensor da administração intraarterial de acetilcolina em ratos normotensos. Similarmente, a Ang-(1-7)
98
apresentou uma ação potencializadora da vasodilatação induzida pela acetilcolina
em artérias mesentérias isoladas de camundongos (Peiro et al., 2007). A
participação do receptor Mas e a liberação de óxido nítrico nas ações
vasodilatadoras da Ang-(1-7) foi demonstrada mais uma vez quando estes efeitos
foram completamente bloqueados pelo pré-tratamento com A-779 e L-NAME
(Faria-Silva et al., 2005; Peiro et al., 2007). Outros mecanismos também podem
estar envolvidos na modulação dos efeitos da acetilcolina pela Ang-(1-7), pois o
relaxamento vascular induzido pela acetilcolina é devido a três diferentes fatores:
liberação de óxido nítrico, prostaglandinas e fatores hiperpolarizantes derivados
do endotélio (Feletou and Vanhoutte, 2006). Por outro lado a vasodilatação
coronariana promovida pela acetilcolina foi preservada nos corações de animais
knockout para os receptores AT1 ou AT2, o que mostra um papel essencial do
receptor Mas na preservação da função vasodilatadora do endotélio coronariano.
Sumarizando, nossos resultados mostram um importante papel do eixo
Ang-(1-7)Mas no controle e na preservação da função cardíaca e vascular
coronariana em condições basais e pós-isquêmicas. Nossos dados também
demonstram que a Ang-(1-7), via receptor Mas, modula de forma benéfica o
remodelamento cardíaco, atenuando o desenvolvimento de fibrose e hipertrofia
cardíaca. Isto mostra mais uma vez, que a Ang-(1-7) e seu receptor Mas
apresentam grande potencial terapêutico, podendo ser essenciais para o
desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas.
99
7. CONCLUSÕES
·
Os animais com deleção genética do receptor Mas apresentaram menor
função contrátil
·
Os ratos transgênicos TG(hA1-7)L7301 apresentaram maior função
contrátil e menor incidência de arritmias de reperfusão.
·
Os animais com deleção genética do receptor Mas apresentaram maior
hipertrofia e fibrose quando submetidos ao tratamento com isoproterenol.
·
O aumento dos níveis de Ang-(1-7) no coração não alterou a hipertrofia,
mas inibiu seletivamente a síntese de proteínas de matriz extracelular
induzidas por isoproterenol.
·
Os animais com deleção genética do receptor Mas apresentaram maior
pressão de perfusão coronariana. Além disso, o efeito vasodilatador da
acetilcolina foi ausente nos corações destes animais.
·
O fluxo coronariano foi menor nos corações dos ratos transgênicos
TG(hA1-7)L7301
no
período
pré-isquêmico,
porém
aumentou
significativamente no período pós-isquêmico.
Estes resultados mostram que o eixo Ang-(1-7)/Mas é um componente
essencial no controle e preservação da função cardíaca e na modulação da
função endotelial dos vasos coronarianos. Além disso, este estudo mostra uma
participação
cardioprotetora
remodelamento cardíaco.
da
Ang-(1-7)
e
do
seu
receptor
Mas
no
100
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