Allini Mafra da Costa
ESTUDO CASO-CONTROLE PARA AVALIAR A RELAÇÃO DA INFECÇÃO DO PAPILOMAVÍRUS
HUMANO DO TIPO 16 COM O CARCINOMA ESCAMOCELULAR DO ESÔFAGO
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação do Hospital de Câncer de Barretos Fundação Pio XII para obtenção do Título de
Mestre em Ciências da Saúde.
Área de concentração: Oncologia
Linha de Pesquisa: Epidemiologia do câncer
Nível: Mestrado
Orientador: Prof. Dr. Adhemar Longatto Filho
Coorientador: Prof. Dr. José Humberto
Tavares Guerreiro Fregnani
Barretos, SP
2015
Allini Mafra da Costa
ESTUDO CASO-CONTROLE PARA AVALIAR A RELAÇÃO DA INFECÇÃO DO PAPILOMAVÍRUS
HUMANO DO TIPO 16 COM O CARCINOMA ESCAMOCELULAR DO ESÔFAGO
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação do Hospital de Câncer de Barretos Fundação Pio XII para obtenção do Título de
Mestre em Ciências da Saúde.
Área de concentração: Oncologia
Linha de Pesquisa: Epidemiologia do câncer
Nível: Mestrado
Orientador: Prof. Dr. Adhemar Longatto Filho
Coorientador: Prof. Dr. José Humberto
Tavares Guerreiro Fregnani
Barretos, SP
2015
SUPORTE À PESQUISA POR AGÊNCIA DE FOMENTO
Este estudo está vinculado ao projeto “O papel do Papilomavírus Humano (HPV) como
agente etiológico do câncer esofágico. Um estudo transversal, caso-controle e longitudinal
no Hospital de Câncer de Barretos” e recebeu apoio do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) através de auxílio à pesquisa Universal
14/2012, Faixa C (processo: 482666/2012-9).
As opiniões, hipóteses ou recomendações expressas neste material são de
responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão do CNPq.
Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da PósGraduação do Hospital de Câncer de Barretos - Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento
do Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de Apresentação de Dissertações
e Teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este
trabalho foi realizado em concordância com o Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP),
não havendo nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou
falsificação de dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas
neste material são de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão
da Fundação Pio XII - Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram não ter
qualquer conflito de interesse relacionado a este estudo.
Aos meus pais, Geni Mafra da Costa e Antonio Nunes da Costa, que com muito carinho e
apoio, não mediram esforços para formar a pessoa que hoje sou.
A meu irmão, Guilherme Mafra da Costa, minha grande paixão.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Adhemar Longatto Filho, pela credibilidade que depositou em
mim desde que nos conhecemos. Por toda sabedoria, simpatia e educação. Por todo
incentivo e entusiasmo. A soma destes adjetivos o faz ser uma pessoa fantástica!
Ao meu coorientador, Prof. Dr. José Humberto Tavares Guerreiro Fregnani, professor
nato, que desde meus primeiros passos na vida profissional se mostrou tão interessado a
me ensinar nos detalhes, embasamentos metodológicos em pesquisa científica. Seu amor
pelo que faz contagia todos a sua volta!
Ao Prof. Dr. André Lopes Carvalho, por toda sua competência em visionar nosso Instituto
de Ensino e Pesquisa que cresce e se consolida mais a cada dia que passa. Sem seu
esforço tenho certeza que este estudo e outros tantos não seriam possíveis!
Aos colaboradores dos Departamentos de Endoscopia do Hospital de Câncer de
Barretos e do Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos pelo auxílio durante o
recrutamento dos participantes e coleta de amostra biológica para este estudo.
Ao Departamento de Patologia, em especial ao Dr. Cristovam Scapulatempo Neto.
Aos membros das bancas de acompanhamento e qualificação Dra. Denise Peixoto
Guimarães e Dra. Luisa Lina Villa pelas preciosas sugestões, críticas e correções durante
a elaboração deste estudo, por terem sido tão atenciosas durante nossos encontros por
videoconferências e por terem sido tão pacientes até mesmo quando a tecnologia falhou.
Ao Dr. Edmundo Carvalho Mauad, à Dra. Maria do Rosário Dias de Oliveira Latorre, ao
Dr. Thiago Buosi Silva, à Dra. Cristiane Menezes Sirna Fregnani, à Dra. Stela
Verzinhasse Peres, pelo incentivo no início da minha carreira e por sempre terem sido
minhas fontes de inspiração. Vocês certamente tem um espaço muito importante no meu
coração!
À Dra. Vânia Sammartino Mariano, pós-doutoranda e supervisora responsável pelo estudo
maior do qual este estudo faz parte, pelo apoio incondicional, pela responsabilidade e
carinho para que todas as etapas fossem realizadas nos mínimos detalhes e principalmente
pela sólida amizade construída.
Às irmãs que a pós-graduação me deu, Paula Aguiar Roberta Pastrez e Estela Maria
Silva, pessoas que admiro muito. Não tenho palavras para agradecê-las pela cumplicidade,
ajuda constante e palavras de apoio nos momentos certos. Nossa parceria é sucesso!
À Gabriela Carvalho Fernandes (amiga que enfrentou junto comigo a fase de longas
viagens para a faculdade e que o acaso nos alocou na mesma turma de pós-graduação) e à
Larissa Kuil (colega de trabalho que tive oportunidade de conhecer melhor durante a pósgraduação e que se tornou uma grande amiga), por termos compartilhado os mesmos
momentos de felicidade e de angústias nesta fase e por todos os nossos almoços-terapia às
sextas-feiras regados a catupiry.
À James Chester Crespo Aranibar, pelos inúmeros incentivos e conselhos. Pelo amor,
paciência e companheirismo nesta etapa.
A todos os integrantes do Grupo de Pesquisas em HPV do Hospital de Câncer de
Barretos, em especial ao Dr. Kari Juhani Syrjänen, MsC. Adriana Tarlá Lorenzi, MsC.
Maíra Degiovani Stein, Laura de Lima Nascimento e Nayara Firmino Pereira.
À Brenda Honda Morais, por ter sido tão graciosa e tão rápida a cada solicitação e por me
tratar sempre com muito carinho.
À preciosa amiga Silvana Rodrigues que me acompanha desde o início e que escuta meus
desabafos, dá conselhos e comemora comigo minhas vitórias.
Ao meu grande amigo, inspirador por sua dedicação e crítico incessante, MsC. Cleyton
Zanardo Oliveira (coloquei MsC pra você não reclamar), por todo o carinho para que tem
comigo, suporte nas minhas mais viajantes dúvidas e brigas sem sentido.Todas as nossas
discussões fortalecem ainda mais nossa amizade e nos fazem crescer juntos!
A todos aqueles que foram colaboradores, alunos e pesquisadores no Núcleo de Apoio ao
Pesquisador durante a minha jornada e que me ensinaram lições tanto profissionais quanto
para a vida.
À equipe do Registro Hospitalar de Câncer do Hospital de Câncer de Barretos e Registro
de Câncer de Base Populacional do munícipio de Barretos, em especial à Caroline Usson
Silva, Daniele Ferreira Martins, Kelli Cristina Hoft, Lara Maria Alfinete Fiorindo, Luis
Henrique Golçalves Viana, Marcos Aurélio Alves de Araújo, Renato Augusto Rosário,
Pamella Francielli Silva, Sara Silva Araújo, Dr. Vinicíus de Lima Vazquez e Walmiro
Ferreira Ramos Neto, pessoas a quem devo muito, por terem me acolhido tão bem, por
terem me dado tanto amadurecimento com a oportunidade de conhecer “o outro lado da
moeda” que é a liderança; por terem entendido minhas ausências e angústias em
decorrência da pós-graduação e por terem vibrado comigo a cada conquista.
“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que
ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.”
Arthur Schopenhauer
SUMÁRIO
Lista de figuras
Lista de tabelas
Lista de abreviaturas
Lista de símbolos
Resumo
Abstract
1
1.1
1.2
1.3
INTRODUÇÃO
Aspectos epidemiológicos do câncer de esôfago
Papilomavírus Humano (HPV)
Papilomavírus Humano e o câncer de esôfago
1
1
5
6
2
3.1
3.2
OBJETIVOS
Objetivo geral
Objetivos específicos
9
9
9
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
MATERIAIS E MÉTODOS
Delineamento do estudo
População e definição dos grupos de estudo
Recrutamento dos participantes da pesquisa e entrevista
Variáveis do estudo e definição das exposições
Método endoscópico e coleta de amostra biológica
Detecção do HPV-16
Tamanho amostral
Análise estatística
Considerações éticas
Financiamento da pesquisa
10
10
10
10
12
15
16
19
19
20
20
4
4.1
4.1.2
RESULTADOS
Descrição da população
Descrição das características sociodemográficas
Comparação da prevalência de HPV-16 no esôfago em indíviduos com e sem
CEC de esôfago
Comparação dos indivíduos com e sem presença de DNA de HPV-16 em
relação às características sociodemográficas e os fatores de risco conhecidos
para o câncer de esôfago e para a infecção por HPV
Comparação dos indivíduos com e sem CEC de esôfago em relação às
características sociodemográficas e os fatores de risco conhecidos para o
câncer de esôfago e para a infecção por HPV
21
21
21
4.2
4.3
4.4
22
23
32
5
DISCUSSÃO
45
6
CONCLUSÕES
53
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
45
ANEXOS
Anexo 1 - Carta de aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Anexo 2 - Termo de consentimento livre e esclarecido - Casos
Anexo 3 - Termo de consentimento livre e esclarecido - Controles
Anexo 4 - Instrumento de coleta de dados
Anexo 5 - Instrumento de coleta de dados clínicos
Anexo 6 - Termo de aceitação de apoio financeiro - CNPq
Anexo 7 - Artigo a ser submetido
68
68
70
72
74
78
79
83
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estimativa de Incidência Mundial de Câncer de Esôfago, ambos os sexos
2
Figura 2 - Cálculo de consumo de bebidas alcoólicas
13
Figura 3 - Biópsias endoscópicas do esôfago
16
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Estudos caso-controle que investigaram o DNA do HPV em carcinoma
escamocelular do esôfago.
8
Tabela 2 - Variáveis do estudo.
12
Tabela 3 - Comparação da prevalência de DNA de HPV-16 no esôfago em
indivíduos com e sem câncer de esôfago. Hospital de Câncer de Barretos e
Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
22
Tabela 4 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características
sociodemográficas. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de
Especialidades de Barretos, 2014.
24
Tabela 5 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
ocupação. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de
Especialidades de Barretos, 2014.
25
Tabela 6 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
exposição ao álcool. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de
Especialidades de Barretos, 2014.
26
Tabela 7 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
exposição ativa ao tabaco. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico
de Especialidades de Barretos, 2014.
27
Tabela 8 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
exposição passiva ao tabaco. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório
Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
28
Tabela 9 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
hábitos sexuais. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de
Especialidades de Barretos, 2014.
29
Tabela 10 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
antecedentes de doenças sexualmente transmissíveis auto-referidos. Hospital de
Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
30
Tabela 11 - Comparação entre os indivíduos com e sem a presença de DNA de
HPV-16 e Odds Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às
características de história de câncer na família que podem estar relacionados ao
HPV. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de
Barretos, 2014.
31
Tabela 12 - Caracterização clínica dos casos. Hospital de Câncer de Barretos,
2014.
32
Tabela 13 - Caracterização clínica dos controles. Ambulatório Médico de
Especialidades de Barretos, 2014.
33
Tabela 14 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características
sociodemográficas. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de
Especialidades de Barretos, 2014.
34
Tabela 15 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
ocupação. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de
Especialidades de Barretos, 2014.
36
Tabela 16 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
exposição ao álcool. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de
Especialidades de Barretos, 2014.
38
Tabela 17 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
exposição ativa ao tabaco. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico
de Especialidades de Barretos, 2014.
40
Tabela 18 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
exposição passiva ao tabaco. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório
Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
41
Tabela 19 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
hábitos sexuais. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de
Especialidades de Barretos, 2014 .
42
Tabela 20 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
antecedentes de doenças sexualmente transmissíveis auto-referidas. Hospital de
Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
43
Tabela 21 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds
Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às caracteristicas de
história de câncer na família que podem estar relacionados ao HPV. Hospital de
Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
44
LISTA DE ABREVIATURAS
AME
CE
CEC
CH
CID-O
CMV
CNPq
DNA
EBV
EDA
HCB-FPXII
HE
HIS
HPV
HSV
IHQ
IARC
ISCO
ml
mm
mM
nM
NA
OR
pb
PC
PCR
R$
rpm
TCLE
V
vs
Ambulatório Médico de Especialidades
Câncer de esôfago
Carcinoma escamocelular
Captura Híbrida
Classificação Internacional de Doenças - Oncologia
Citomegalovírus
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Ácido desoxirribonucléico (do inglês: Deoxyribonucleic acid)
Vírus Epstein-Barr
Endoscopia digestiva alta
Hospital de Câncer de Barretos - Fundação Pio XII
Hematoxilina & Eosina
Hibridização in situ
Papilomavírus Humano
Vírus Herpes Simples
Imunohistoquímica
do inglês: International Agency for Research on Cancer
do inglês: International Standard Classification of Occupations
Mililitros
Milímetros
Milimolar
Nanomolar
Não analisado
Razão de chances (do inglês: Odds Ratio)
Pares de base
Primer consenso
Reação por cadeia de polimerase (do inglês: Polymerase Chain Reaction)
Reais
Rotações por minuto
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Volts
Versus
LISTA DE SÍMBOLOS
β
/
ºC
=
µm
µL
x
%
+
Beta
Divisão
Grau Celsius
Igual
Menos ou Negativo
Micra
Microlitro
Multiplicação
Porcentagem
Positivo
RESUMO
Costa AM. Estudo caso-controle para avaliar a relação da infecção do papilomavírus humano
do tipo 16 com o carcinoma escamocelular do esôfago. Dissertação (Mestrado). Barretos:
Hospital de Câncer de Barretos; 2015.
JUSTIFICATIVA: Em 1982, foi publicada pela primeira vez uma possível associação entre o
Papilomavírus Humano (HPV) e câncer de esôfago e atualmente, os resultados ainda são
contraditórios e exigem investigação mais aprofundada. OBJETIVO: Avaliar a relação da infecção
do papilomavírus humano do tipo 16 com o carcinoma escamocelular do esôfago. MATERIAIS E
MÉTODOS: Este é um estudo de caso-controle que incluiu um total de 101 pacientes com
carcinoma escamocelular do esôfago (casos) e 101 controles, pareados por idade e sexo.
Durante a endoscopia, biópsias esofágicas foram coletadas de tecido tumoral e adjacente
normal (casos), esôfago distal e proximal (controles). O DNA foi extraído utilizando o QIAamp
DNA Micro Kit (Qiagen) e o HPV-16 foi detectado por PCR em tempo real utilizando iniciador e
sonda específicos para o HPV-16. Dados sociodemográficos, de estilo de vida e clínicos foram
obtidos através de entrevista. RESULTADOS: Foi observado maior frequência de carcinoma
esofágico no sexo masculino, e a idade média foi de 60 anos (dp= 10,0). A prevalência de HPV-
16 observada em indivíduos com câncer foi de 3,0% e, em indivíduos sem câncer, foi de
20,8%. Foi observado risco aumentado para a infecção do HPV em indivíduos com
escolaridade de nível médio ou superior (OR: 10,6). Foi observado risco aumentado para CEC
de esôfago para consumo de álcool (OR: 3,5), principalmente quando consumo superior à 30
gramas de etanol por mililitro por dia (OR: 4,0) e consumo de destilados (OR 7,14); uso de
tabaco (OR: 2,0), principalmente cigarro de palha (OR: 2,7); e, história de câncer de esôfago
em familiares de primeiro grau (OR: 4,0). As demais avaliações não demonstraram
diferenças estatisticamente significativas. CONCLUSÃO: Nossos resultados sugerem que o
HPV-16 não tem relação com o desenvolvimento do CEC de esôfago. Escolaridade de nível
médio ou superior apresentaram risco aumentado para a infecção pelo HPV-16 no esôfago.
Consumo de álcool, a exposição ativa ao tabaco e história prévia de câncer de esôfago em
familiares de primeiro grau apresentaram risco aumentado para o CEC de esôfago.
PALAVRAS-CHAVE: Papilomavírus Humano; Neoplasias Esofágicas; Fatores de Risco.
ABSTRACT
Costa AM. Case–control study to evaluate the association of the infection of human
papillomavirus type 16 with squamous cell carcinoma of the esophagus. Dissertation
(Master’s degree). Barretos: Barretos Cancer Hospital; 2015.
BACKGROUND: The first publication that associated Human Papillomavírus (HPV) infection
and esophageal cancer was published in 1982. However, the data are still contradictory and
require further investigation. AIM: To evaluate the association between infection of human
papillomavirus type 16 and the esophagus squamous cell carcinoma (ESCC). MATERIAL AND
METHODS: This is a case-control study, that included 101 patients with ESCC (cases) and 101
controls, that have been matched for age and gender. During the endoscopy, esophageal
biopsies were collected from tumor and normal adjacent tissue (cases), distal and proximal
esophagus region (controls). DNA was extracted with QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen) and
the HPV-16 was detected by PCR real time using specific primer to HPV-16.
Sociodemographic data, lifestyle and clinical data were obtained by interview. RESULTS: We
found higher frequency in male, and the average age was 60 years (sd = 10.0). The
prevalence of HPV-16 observed in individuals with cancer was 3.0%, and in individuals
without cancer was 20.8%. We observed increased risk for HPV infection in individuals with
medium or higher education level (OR: 10.6). We observed increased risk for ESCC for
alcohol consumption (OR: 3.5), especially when consumption was higher than 30 grams of
ethanol per milliliter per day (OR: 4.0) and consumption of distillates (OR 7.14); tobacco use
(OR: 2.0), specially hand-rolled cigarettes (OR: 2.7); and esophageal cancer history in firstdegree relatives (OR: 4.0). Other evaluations showed no significant differences.
CONCLUSIONS: Our results suggest that HPV-16 is not associated with the development of
ESCC. High school or college were level of education had showed an increase risk for
infection HPV-16 on esophagus. Drinking, active tobacco exposure and a history of
esophageal cancer in first-degree relatives were at increased risk for ESCC.
KEYWORDS: Human Papillomavírus; Esophageal Neoplasms; Risk Factors.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos epidemiológicos do câncer de esôfago
Atualmente, o câncer de esôfago (CE) apresenta-se como um importante problema de
saúde pública mundial. Segundo estimativas do GLOBOCAN 2012, o CE é o oitavo câncer
mais comum em todo o mundo, representando 3,2% (456.000) do total de casos novos e a
sexta causa mais comum de morte por câncer, representando 4,9% (400.000) do total de
mortes por câncer. Mais de 80% dos casos ocorrem em países em desenvolvimento,
considerando-se em conjunto os adenocarcinomas e os carcinomas de tipo escamocelular
(CEC) 1.
Nos últimos 30 anos, observou-se o aumento na incidência do adenocarcinoma
esofágico nos países desenvolvidos que ultrapassa, atualmente, o CEC em alguns países
2-6
.
Embora o número de casos de CEC tenha se mantido estável nos países desenvolvidos,
continua sendo considerado um importante problema de saúde em muitos locais.
O CE é 2,4 vezes mais comum nos homens em relação às mulheres. Em ambos os sexos
observa-se grandes diferenças na incidência entre as diferentes regiões do mundo, com
taxas ajustadas por idade pela população mundial que variam de 0,2/100.000 na Micronésia
/ Polinésia para 7,8/100.000 na África Oriental em mulheres e de, 0,8/100.000 na África
Ocidental para 17,0/100.000 na Ásia Oriental nos homens. Portanto, podemos considerar
distribuição étnica e geográfica desigual (Figura 1). A variação regional na incidência do CE
permite classificar as áreas como sendo de alto (China, Irã e África do Sul) ou baixo risco
(Europa e América do Norte) 1. Em regiões de alto risco, a taxa de incidência é notavelmente
maior, variando até 500 vezes de uma área para outra e mesmo entre diferentes grupos
étnicos dentro de um mesmo país
7-9
. Estudos epidemiológicos identificaram a China,
Cingapura, Irã, ex-União Soviética, Porto Rico, Chile, Brasil, Suíça, França e África do Sul
como países de alto risco para o CE 8, 9.
2
Fonte: Ferlay et al.1
Figura 1 - Estimativa de Incidência Mundial de Câncer de Esôfago, ambos os
sexos.
No Brasil, o CE situa-se entre os dez tipos de câncer mais incidentes, ocupando a sexta
posição entre os homens e a décima quinta entre as mulheres. Para o ano de 2014, foram
estimados 10.780 casos novos (8.010 em homens e 2.770 em mulheres) com predomínio nas
regiões sul e sudeste e 7.645 mortes (5.923 em homens e 1.722 em mulheres). O tipo
histológico mais frequente é o carcinoma escamocelular, representando 96% dos casos de
CE. As maiores taxas de incidência, para homens e mulheres, encontram-se nas regiões sul e
sudeste 10.
As razões das variações regionais na incidência do CE são pobremente entendidas.
Porém, acredita-se que há interação de diversos fatores de risco, como idade, história
familiar e associação genética, além de muitos fatores extrínsecos. Os dados acumulados até
o momento sugerem fortemente que a etiologia dessa doença pode ser diferente nas áreas
de baixo e alto risco. Em países industrializados, o consumo de álcool e tabaco,
especialmente em combinação, são os principais fatores de risco
11-13
. Em áreas de alta
incidência, considera-se fator de risco para o desenvolvimento da doença a deficiência
nutricional, ingestão de alimentos sólidos e/ou líquidos quentes e agentes infecciosos 7, 14-16.
3
A mucosa do esôfago constitui uma importante porta de entrada para agentes
estranhos ao corpo humano e por isso está exposta a fatores ambientais. Tais agentes,
potencialmente nocivos e associados com o desenvolvimento de CE incluem: microorganismos patogênicos, irritantes químicos, poluentes ambientais e aditivos alimentares 1719
.
Os fatores de risco envolvidos e aqueles suspeitos de estarem envolvidos com o CE
têm sido amplamente estudados 7, 11, 13, 15, 17, 20-22; entretanto, pouco tem sido obtido desde
os clássicos estudos de Wynder et al. 23 e Silber 24, sugerindo associação de alguns agentes
químicos (nitrosaminas, micotoxinas, fumaça de cigarro, ingestão excessiva de álcool e
abuso de ópio), físicos (comida sólida e quente) e deficiência nutricional (particularmente de
vitaminas A, B, C e certos oligoelementos como molibdênio e zinco) com o desenvolvimento
dessa neoplasia 23, 24.
Recentemente, evidências sugerem que certos micro-organismos podem exercer papel
etiológico na carcinogênese esofágica e tal assunto tem recebido crescente atenção 7, 16, 18, 19,
25-27
. De acordo com os estudos, os micro-organismos favorecem o desenvolvimento de
neoplasia maligna por dois mecanismos principais: a) através da produção direta de agentes
cancerígenos ou de promotores de carcinógenos ou, b) por agir diretamente nas células do
hospedeiro 7. Por exemplo, a contaminação e a infecção fúngica produzem nitrosaminas
e/ou precursores, além de micotoxinas. Dentre as micotoxinas, as fumonisinas B1 e B2
constituem uma família identificada e classificada como provável carcinógeno humano 28.
Muitos grãos e outros gêneros alimentícios são comumente contaminados com níveis
detectáveis de fumonisinas produzidas por Fusarium monoliforme e Fusarium proliferatum,
os dois principais fungos associados ao milho no mundo 29. Além disso, estudos in vitro e in
vivo demonstram que extratos de vários fungos isolados de grãos das áreas de alto risco têm
efeito mutagênico e carcinogênico. Acredita-se que Fusarium, Geotrichum, Aspergillus e
outros gêneros de fungos reduzem nitratos a nitritos e decompõem proteínas, o que
aumenta a quantidade de aminas na comida e promove a formação de nitrosaminas 7, 10, 26.
Como já esperado, estudos em áreas de alta incidência da doença (como a China) sugerem
que a ingestão de vegetais em conserva e de alimentos contaminados com bolor esteja
intimamente relacionada com CE 7, 30.
Além de fungos, bactérias também estão associadas ao CE por produzirem
carcinógenos químicos e aumentarem a proliferação celular enquanto estimulam o processo
4
inflamatório. Um exemplo da associação de bactérias com o desenvolvimento de neoplasia
no esôfago é a presença de Helicobacter pylori na grande maioria dos casos de câncer da via
digestiva superior 25, 26.
Dentre os vírus, foi demonstrado que o Vírus Herpes Simples (HSV), o Citomegalovírus
(CMV) e o Vírus Epstein-Barr (EBV) infectam a mucosa esofágica, mas nenhum dado
concreto sobre o efeito na carcinogênese esofagiana foi obtido até o momento. Por outro
lado, importantes evidências relacionam o Papilomavírus Humano (HPV) com CEC de
esôfago, tanto que o número de estudos nessa área tem aumentado constantemente, como
evidenciado em várias revisões 13, 16, 21, 22, 31, 32.
5
1.2. Papilomavírus Humano
O Papilomavírus humano (HPV) pertence a família Papillomaviridae. Os HPVs não
possuem envelope, apresentam DNA (Ácido desoxirribonucleico; do inglês: Deoxyribonucleic
acid) circular de dupla fita com aproximadamente 8 mil pares de bases em seu genoma e
tem tropismo por tecidos de revestimento (tecido cutâneo e mucosa) 33. Este tipo de vírus é
responsável pela infecção sexualmente transmitida mais comum no mundo e a maioria dos
indivíduos com atividade sexual ativa será infectada por esse vírus em algum momento da
vida
34
. Países latino-americanos têm maior incidência de infecção pelo HPV comparados à
Europa e América do Norte 35.
São descritos mais de 150 tipos de HPV atualmente e desses, aproximadamente 40
são capazes de infectar mucosas e aproximadamente 20, estão fortemente associados com o
desenvolvimento de câncer cervical. O potencial oncogênico dos tipos virais para
desenvolvimento do carcinoma cervical é determinado pelo tempo de permanência no
hospedeiro e permite classificá-los em alto (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66,
68, 73 e 82) e baixo (6, 11, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 61, 72, 73 e 81) risco tumorigênico. Dessa
forma, a infecção persistente causada por HPV de alto risco está estreitamente associada à
ocorrência de displasia de alto grau em diferentes sítios anatômicos como, colo uterino,
vulva, ânus, vagina e pênis, sendo considerado o principal fator de risco para o
desenvolvimento de neoplasia nesses órgãos
36
. Entre os HPVs de alto risco, o HPV-16 é o
mais prevalente em neoplasias malignas 37.
Atualmente, é aceito que os tipos oncogênicos de HPV (os de alto risco) são os únicos
fatores etiológicos de carcinoma escamocelular e de adenocarcinoma do colo uterino
12, 38
.
Devido a evidência do potencial oncogênico, particularmente no trato anogenital, houve um
aumentado interesse em se estudar HPV nas últimas décadas
39
. O início dos anos 80
testemunhou uma rápida expansão da pesquisa de HPV não somente relacionado com trato
genital, mas também com outros sítios, resultando em um painel significativamente
ampliado de tumores humanos que podem estar associados com este vírus. Além das lesões
do trato anogenital, o DNA do HPV foi detectado e relacionado com a etiologia de lesões
benignas e malignas de células escamosas do trato respiratório superior (sino-nasal e
laríngeo), olhos, mucosa oral, brônquios e trato digestivo superior (esôfago) 12, 21, 31, 33, 40, 41.
Foi observado em tumores não genitais, que a presença de DNA de HPV é um marcador de
melhor prognóstico 42, 43.
6
1.3 Papilomavírus Humano e o Câncer de esôfago
O epitélio escamoso do esôfago está em continuidade com a mucosa oral. As primeiras
descrições de lesões orais associadas ao HPV 31 foram precedidas por relatos que sugeriram
a participação do vírus no desenvolvimento de lesões benignas
44
e malignas
45
do epitélio
escamoso do esôfago. Essas observações iniciais foram baseadas na descoberta de
similaridades morfológicas entre as lesões de HPV no trato genital (condilomas) e lesões no
esôfago (papilomas) 44, 45.
Após essas observações pioneiras, houve uma rápida expansão da literatura de
diferentes regiões geográficas sobre lesões benignas e malignas do esôfago
16, 22, 46-48
e as
evidências acumuladas sugeriram um possível papel causal de HPV em pelo menos um
subtipo de carcinoma esofágico, o carcinoma escamocelular 13, 17, 20, 21, 30, 33, 49-55.
Embora o primeiro relato da presença de HPV em CEC de esôfago tenha ocorrido há
mais de 30 anos
44
, sua real prevalência ainda é pouco conhecida e seu papel na
carcinogênese é questionável. Ainda que o número de estudos e o interesse no assunto
tenha aumentado nos últimos anos, a literatura mundial é escassa e controversa 56. Dados
acumulados cogitam uma tendência associando HPV e câncer esofágico em áreas de alto
risco, enquanto que em áreas de baixo risco tal associação não foi evidenciada 57.
Estudos desenvolvidos em áreas de alto e baixo risco para o desenvolvimento do
câncer de esôfago na China que avaliaram a infecção pelo HPV, foram reunidos em uma
meta-análise e concluiu-se que o HPV pode estar etiologicamente ligado ao
desenvolvimento do CEC de esôfago (OR: 4,20) 58.
Outra meta-análise realizada em 2013, avaliou 21 estudos do tipo caso-controle que
investigaram o DNA do HPV em CEC de esôfago (Figura 2) 59 dos quais, 2 foram realizados no
Brasil
60, 61
. Concluiu-se que indivíduos infectados por HPV tem 3 vezes a chance de
desenvolver CEC de esôfago 3 em relação àqueles que não foram infectados.
Sabendo-se que a carcinogênese do esôfago é complexa, dependente de diferentes
fatores de risco e, da escassez de relatos que correlacionam a infecção por HPV de alto risco
com o desenvolvimento do carcinoma escamocelular de esôfago, o presente estudo
constitui-se de um estudo caso-controle desenvolvido no Hospital de Câncer de Barretos Fundação Pio XII (HCB-FPXII) e no Ambulatório Médico de Especialidades do município de
Barretos, que teve como objetivo caracterizar os indivíduos sem neoplasia e indivíduos com
CEC de esôfago em relação à presença de DNA de HPV de alto risco do tipo 16
7
(majoritariamente o mais prevalente documentado nos estudos já mencionados) e a fatores
de riscos conhecidos, tanto para o câncer de esôfago bem como para a infecção pelo HPV.
8
Referência
Williamson et al.,1991
63
Cooper et al., 1995
Khurshid et al., 1998
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Lyronis et al., 2005
Li et al., 2001
74
75
Guimaraes et al., 2001
76
60
País
Método de detecção
Tipos detectados
Positivos / Casos (%)
Positivos / Controles (%)
OR (IC 95%)
África do Sul
PCR
vários
6/14 (43)
6/41 (15)
4.38 (1.11–17.18)
África do Sul
HIS
6,11,18,31,33
25/48 (52)
0/2 (0)
Incalculável
Japão
PCR
CP,16,18
17/27 (63)
3/12 (25)
5.1 (1.11–23.37)
Índia
HIS, IHQ
16,18
19/30 (63)
2/10 (20)
6.91 (1.24–38.52)
Iran
PCR
16,18
8/38 (21)
5/38 (13)
1.76 (0.52–5.97)
Austrália
PCR
16,35
8/222 (4)
0/55 (0)
Incalculável
Portugal
PCR
16,18
9/16 (56)
0/10 (0)
Incalculável
Estados Unidos
HIS, IHQ
6,11,16,18,31,33
4/12 (33)
0/12 (0)
Incalculável
Coreia
PCR
16
0/102 (0)
0/40 (0)
Incalculável
Bélgica
PCR
PC
1/21 (2)
0/5 (0)
Incalculável
França
HIS
6,11,16,18,31,33
4/12 (33)
1/24 (4)
11.5 (1.11–118.71)
Reino Unido
HIS
6,11,16,18,31,33
0/4 (0)
0/10 (0)
Incalculável
Brasil
CH
Alto e baixo risco
1/40 (2,5)
1/10 (10)
0.23 (0.01–4.05)
Brasil
PCR
16,18
26/165 (16)
0/26 (0)
Incalculável
Grécia
PCR
1,18, outro
17/30 (56)
6/27 (22)
4.58 (1.44–14.59)
China
PCR
16
2/2 (100)
66/112 (59)
Incalculável
China
PCR
PC
2/32 (6)
4/57 (7)
0.88 (0.15–5.11)
Cao et al., 2005
77
China
PCR, HIS
16,18
207/265 (78)
203/357 (57)
2.71 (1.89–3.88)
Gao et al., 2006
78
China
HIS
--
0/4 (0)
61/475 (13)
Incalculável
China
PCR
16
35/69 (51)
2/32 (6)
15.44 (3.42–69.70)
China
PCR
16,18,58
35/70 (50)
20/60 (33)
2.00 (0.98–4.08)
Liu et al., 2010
79
Zhang et al., 2010
80
OR: Odds Ratio; PC: Primer consenso; CH: Captura Híbrida; IHQ: Imunohistoquimica; HIS: Hibridização in situ; PCR: Reação por Cadeia de Polimerase.
Fonte: Adaptada de Liyanagge et. al., 2013 59
Tabela 1 - Estudos caso-controle que investigaram o DNA do HPV em carcinoma escamocelular do esôfago.
9
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a relação do HPV-16 com o CEC de esôfago.
2.1.1 Objetivos específicos
1- Comparar a prevalência de DNA de HPV-16 no esôfago em indivíduos com e sem
CEC de esôfago.
2- Comparar os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 em relação às características
sociodemográficas e os fatores de risco conhecidos para o CEC de esôfago e para a
infecção pelo HPV.
3- Comparar os indivíduos com e sem CEC de esôfago em relação às características
sociodemográficas e os fatores de risco conhecidos para a infecção do HPV e para o
CEC de esôfago.
10
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Delineamento do estudo
Trata-se de um estudo observacional do tipo caso-controle.
3.2 População e definição dos grupos de estudo
Casos foram definidos como pacientes de ambos os sexos com confirmação
histopatológica de CEC de esôfago (CID-O81 morfologia: 8070-3, topografia: C15). Foi
determinado como critério de inclusão dos casos, pacientes do ambulatório de Cirurgia do
Aparelho Digestivo Alto do HCB-FPXII, com indicação clínica de endoscopia digestiva alta
(EDA), com idade igual ou acima de 18 anos e sem nenhum tratamento prévio para a
neoplasia. Foram excluídos pacientes com dificuldade de entendimento do objetivo da
pesquisa durante a aplicação do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE),
condição clínica desfavorável do paciente para ser submetido aos procedimentos de coleta
de amostra biológica para o estudo durante a EDA, história de neoplasia prévia ou sincrônica
de Cabeça e Pescoço, quantidade de amostra insuficiente para realização dos testes,
qualidade de amostra inapropriada e ausência de neoplasia na amostra analisada.
Controles foram indivíduos sem neoplasia do esôfago que tinham indicação clínica de
EDA por afecção benigna do sistema digestório, examinados no Departamento de
Endoscopia do Ambulatório Médico de Especialidades (AME) de Barretos, pareados por sexo
e idade (com uma diferença de mais ou menos três anos) pela distribuição observada dos
casos (emparelhamento por frequência). O pareamento seguiu a proporção de um controle
para cada caso (1:1). No processo de seleção dos controles, foram excluídos indivíduos com
dificuldade de entendimento do objetivo da pesquisa durante a aplicação do TCLE,
indivíduos com condição clínica desfavorável para coleta de amostra biológica para o estudo
durante a EDA, história de neoplasia prévia de Cabeça e Pescoço e de Esôfago, quantidade
de amostra insuficiente e qualidade de amostra inapropriada.
3.3 Recrutamento dos participantes da pesquisa e entrevista
Os casos foram convidados a participar do estudo na primeira visita clínica ao
ambulatório de Cirurgia do Aparelho Digestivo Alto e no Departamento de Endoscopia do
11
HCB-FPXII. Os controles foram pareados aos casos previamente incluídos e recrutados
aleatoriamente no AME de Barretos no dia da realização do exame.
Os indivíduos foram encaminhados a uma sala reservada e orientados a respeito do
objetivo do estudo, dos procedimentos de coleta do material biológico e as informações
necessárias que seriam interrogadas durante a entrevista. Foi dada a garantia de que não
sofreriam prejuízo em seu tratamento ou na conduta médica caso recusassem participar do
estudo e, em caso de aceite, sua identidade e qualquer informação relatada seria mantida
em sigilo. Os indivíduos que concordaram em participar da pesquisa demostraram seu
interesse assinando do TCLE (Anexos 2 e 3) em duas vias, sendo uma via entregue ao mesmo
e a outra retida nos arquivos do estudo. Em seguida, os participantes da pesquisa
responderam um questionário contendo informações sociodemográficas e a respeito de
fatores de risco conhecidos para o aparecimento do CEC de esôfago e também para infecção
pelo HPV (Anexo 4). Todas as entrevistas foram realizadas por dois membros do Grupo de
Pesquisas em HPV do HCB-FPXII previamente treinados.
12
3.4 Variáveis do estudo e definição das exposições
As entrevistas forneceram informações para caracterizar o tempo e o tipo das
exposições. As exposições estudadas referem-se às características sociodemográficas,
ocupação, consumo de álcool, tabaco na sua forma ativa e passiva, hábitos sexuais, infecção
pelo HPV e história de câncer na família.
As variáveis do estudo podem ser observadas na Tabela 1. O instrumento de coleta de
dados (Anexo 4) que se utilizou no estudo apresenta mais variáreis do que aquelas dispostas
na Tabela 1, pois este estudo está vinculado a um estudo maior.
Tabela 2 - Variáveis do estudo.
Grupo de variáveis
Variáveis do estudo
Sociodemográficas
Idade, sexo, estado civil, raça, escolaridade, moradia em zona rural ou urbana
Estilo de vida
álcool (cerveja, vinho, destilados), tabaco (cigarro de filtro, cigarro de palha,
cachimbo, charuto), exposição passiva à fumaça de cigarro, hábitos sexuais
Clínicas
histórico familiar de câncer, infecção por HPV
Para fins de análise estatística, algumas variáveis foram recategorizadas. A variável
raça foi coletada conforme as categorias “Branca”, “Negra”, “Parda ou Mulata”, “Amarela
(Asiático)” e “Indígena” e posteriormente foi dicotomizada em “Branca” e “Não Branca”. A
informação de estado civil foi coletada com as categorias “Solteiro”, “Casado ou Amasiado”,
“Separado ou Divorciado” e “Viúvo” e, posteriormente, dicotomizada em “Casado” e “Não
casado”. Escolaridade foi coletada com as categorias “Analfabeto”, “Sabe ler e escrever”,
“Ensino fundamental incompleto”, “Ensino fundamental completo”, “Ensino médio
incompleto”, “Ensino médio completo”, “Ensino superior incompleto” e “Ensino superior
completo” e, posteriormente, recategoriada em “Analfabeto ou Analfabeto funcional”,
“Ensino fundamental” e “Ensino médio ou Superior”.
A variável ocupação (profissional) foi classificada de acordo com a ISCO82 (International
Standard Classification of Occupations) da Organização Internacional do Trabalho. A ISCO é
13
composta por nove categorias que seguem: ISCO 1, Profissionais técnicos; ISCO 2,
Administrativos e gerentes; ISCO 3, Empregados de escritório; ISCO 4, Trabalhador com
vendas; ISCO 5, Auxiliar de serviços; ISCO 6, Agricultor; ISCO 7, Trabalhadores do transporte
e Produção de Equipamentos; ISCO 8, Aposentado, Doente e Desempregado; ISCO 9, Forças
Armadas.
Para a investigação relacionada ao consumo de álcool e tabaco, o participante da
pesquisa foi interrogado sobre os tipos de bebida ingerida (álcool: cerveja, vinho e
destilados) e tabaco utilizado (cigarro de filtro, cigarro de palha, cachimbo e charuto). Para
ambos hábitos, quando a resposta foi "sim", houve investigação mais detalhada sobre a
idade de início e de término, quantidade e frequência. Foi considerado consumo atual de
bebida alcoólica se o participante de pesquisa referiu ter abandonado o consumo nos
últimos 12 meses.
Para quantificar o consumo de álcool, foi utilizado o cálculo de consumo de bebidas
alcoólicas (grama de etanol por mililitro por dia) que pode ser observado na Figura 2
83
.
Considerou-se teor alcoólico de 5% para cerveja, 12% para vinho e de 40% para destilados.
Quando o participante da pesquisa referisse que consumiu mais de um tipo de bebida
alcolica não simultaneamente, o valor obtido no cálculo foi somado. A variável contínua
“Grama de etanol por mililitro por dia” foi categorizada (ponto de corte: 30 gramas de etanol
por mililitro por dia) 84.
ó0,80365
üê
" /$$$
Figura 2 - Cálculo de consumo de bebidas alcoólicas.
Para estabelecer uma variável que considerasse o valor total de tabaco consumido e
que permitisse a comparação entre os participantes da pesquisa, foi estimado que cada
cigarro (filtro ou palha) teria 1 grama de tabaco, cada charuto 4 gramas e cada cachimbo 3
gramas. Após esta transformação, foi somada a quantidade de gramas consumidas e dividida
por 20 (quantidade de gramas de tabaco existente em um maço de cigarros). Este valor foi
14
multiplicado pelo número de anos de consumo para se obter achegando-se assim média de
maços consumidos por ano 85. A variável contínua “Maços de tabaco consumidos por ano”
foi categorizada (ponto de corte: 40 maços-ano) 86.
A investigação do fumo passivo foi realizada de forma dicotômica (sim e não) e
abordou as seguintes perguntas: "Convive ou conviveu (esteve casado) com fumante?",
"Trabalhou em lugar fechado com fumantes?", "Quando criança, os pais fumavam?".
Os hábitos sexuais foram investigados de acordo com as variáveis: número de
parceiros sexuais na vida, realização de sexo oral ativo alguma vez na vida (sim/não),
frequência com que praticava sexo oral ativo (raramente, frequentemente ou sempre)
gênero do parceiro com quem realizou sexo oral ativo (mulheres, homens ou ambos),
realização de sexo oral passivo alguma vez na vida (sim/não).
A infecção pelo HPV foi investigada no material biológico coletado de acordo com o
protocolo descrito nesta dissertação, definindo-se o resultado como “negativo” e “positivo”.
As informações clínicas foram obtidas em um instrumento de coleta de dados
padronizado (Anexo 5) através dos dados descritos no prontuário médico de cada
participante da pesquisa do grupo “caso”.
15
3.5 Método endoscópico e coleta de amostra biológica
As amostras biológicas para detecção de HPV consistiram de biópsia esofágica (Figura
3). O procedimento para a realização da EDA seguiu a rotina dos Departamentos de
Endoscopia do Hospital de Câncer de Barretos e AME do município de Barretos utilizando
sedação e video-endoscópios flexíveis (Olympus 180, Japão; Fuginon 4400, Japão). Após
rigorosa inspeção visual, foi realizada a coleta das amostras biológicas, de acordo com o
seguinte protocolo:
1) Casos: Biópsias da região não tumoral (tecido normal adjacente), seguidas pela
região tumoral (tecido neoplásico).
2) Controles: Biópsias da região distal seguidas pela região proximal.
Após a coleta, as amostras (casos: normal adjacente e tumoral; controles: distal e
proximal) foram fixadas em formalina e posteriormente incluídas em parafina. O material
biológico coletado foi processado pelo Departamento de Patologia do Hospital de Câncer de
Barretos para diagnóstico histopatológico.
16
A
B
Fonte: Imagens cedidas gentilmente por Dra. Denise Peixoto Guimarães
Figura 3 - Biópsias endoscópicas do esôfago. A: Biópsia de mucosa normal adjacente; B:
Biópsia de mucosa com CEC.
17
3.6 Detecção de HPV-16
Para identificar casos e controles infectados pelo HPV-16, o protocolo de detecção
seguiu as seguintes etapas:
3.6.1 Extração do DNA
O DNA das amostras incluídas em parafina foi extraído à partir de três a cinco cortes
de 10μ cada. Para evitar contaminação das amostras, um bloco vazio de parafina foi cortado
entre cada bloco de paciente. Inicialmente, as lâminas contendo os cortes foram coradas
com Hematoxilina & Eosina (HE, Merck KGaA, GE) de acordo com o protocolo de rotina do
Departamento de Patologia do Hospital de Câncer de Barretos e avaliadas por um
patologista para a seleção microscópica da área de interesse representativa da neoplasia,
livre de necrose ou calcificações, no caso de tecido tumoral e, para os tecidos normais, tanto
adjacente quanto de indivíduos controle, áreas livres de neoplasia, necrose ou calcificações.
As lâminas contendo os cortes foram submetidas à etapa de desparafinização com lavagens
sequenciais em xilol 2 vezes por 5 minutos (Merck KGaA, GE), etanol 1 vez por 1 minuto 100%/ 70%/ 50% (Merck KGaA, GE) e água mili Q 1 vez por 1 minuto. Em seguida, o material
correspondente à área demarcada pelo patologista foi minuciosamente raspado com uma
agulha (40 mm x 120mm) e colocado em tubo de polipropileno de 1,5mL, livre de Rnase e
Dnase (Axygen, USA) contendo tampão ATL e RNA carrier, de acordo com o protocolo de
extração e purificação de DNA utilizando o DNA QIAamp Micro Kit (Qiagen, USA).
Brevemente, as amostras foram submetidas à etapa de digestão enzimática com o tampão
ATL e proteinase K por uma noite à 56ºC e 700 rpm. Posteriormente, proteinase K foi
novamente acrescentada e incubada à 56ºC, 700 rpm por 70 minutos. Após centrifugação, o
material foi incubado a 98ºC, 600 rpm por 20 minutos, o tampão de lise AL foi adicionado e
depois da adição do etanol puro, a solução foi aplicada à coluna QIAamp Mini spin e
submetida à centrifugação a 8.000 rpm/ 1 minuto/ 20ºC. Em seguida a coluna foi lavada com
tampão AW1 e AW2, sequencialmente; o DNA ligado à coluna foi eluído em 30-50µL de água
livre de RNAse e DNAse (Qiagen, USA) e estocado em freezer à -20ºC até o momento do uso.
18
3.6.2 Análise do DNA extraído
A quantidade do DNA extraído das biópsias foi avaliada por espectrometria
(NanoDrop 2000 - ThermoScientific, USA), de acordo com as instruções do fabricante. A
integridade do DNA obtido pelo processamento anteriormente descrito foi confirmada por
PCR convencional para detecção de um fragmento de 110pb do gene da β-globina humana
utilizando
os
iniciadores
PCO3
(5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’)
e
PCO4
(5’-
CAACTTCATCCACGTTCACC-3’). A mistura da PCR foi composta por 20mM de Tris-HCl pH 8,4
(Invitrogen, USA), 50mM de KCl (Invitrogen, USA), 4mM de MgCl2 (Invitrogen, USA), 200µM
de dNTP mix (Invitrogen, USA), 200nM dos iniciadores
87
, 1,25U de Platinum  Taq DNA
Polymerase (Invitrogen, USA) e água DNAse RNAse free (Gibco/BRL, Life Technologies, USA)
para volume final de 25 µL. Como fita molde foram utilizados 5 µL de DNA extraído.
A amplificação em termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf, Germany) foi
realizada segundo o protocolo: 94ºC por 5 minutos, seguido de 40 ciclos, (94ºC por 1 minuto,
55ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto) e extensão final de 72ºC por 10 minutos. Após
reação, a eletroforese em gel de agarose 2,0% com Gel Red (Biotium, Hayward, CA) foi feita
a 90V por 10 minutos e 110V por 70 minutos em Electrophoresis Power Supply-EPS 301 GE.
Após término da corrida, a presença de banda foi avaliada no ImageQuant LAS 4000 mini GE.
Somente as amostras positivas para β-globina foram utilizadas no ensaio de detecção de
HPV.
3.6.3 Detecção de HPV-16 por PCR em tempo real
A reação de PCR em tempo real específica para HPV-16 foi realizada utilizando
TaqMan Universal PCR Master Mix 1x (Applied Biosystems, Inc., EUA), 400nM de cada
iniciador
forward
5’-GATGAAATAGATGGTCCAGC-3’
GCTTTGTACGCACAACCGAAGC-3’
88
e
reverso
5’-
, 200nM da sonda 5’- 6FAM-CAAGCAGAACCGGACAG-
MGBNFQ-3’ e água DNAse RNAse free (Gibco/BRL, Life Technologies, USA) para volume final
de 25µL. Como fita molde, foram utilizados 5µL de DNA extraído de cada amostra. Em todas
as reações de PCR foram adicionados controles positivos (DNA extraído de células SiHa ou
Caski) e negativo (água). Todas as amostras e controles foram testados em duplicata.
19
3.7 Tamanho amostral
O cálculo amostral foi realizado comparando-se proporções de duas amostras
diferentes e baseou-se em dados disponíveis na literatura. Um estudo chinês
89
observou
taxa de infecção do HPV de 31,0% em indivíduos com câncer de esôfago e 6,8% em
indivíduos sem neoplasia. A partir desse pressuposto, considerando 5% de significância, erro
beta de 10% (poder de teste de 90%) e uma diferença entre os grupos de 24,2 pontos
percentuais estimou-se um tamanho amostral de 61 participantes em cada grupo do estudo,
casos e controles. Para assegurar melhor poder do teste, optou-se por uma amostra superior
a calculada, sendo a casuística estimada igual a 101 casos em cada grupo do estudo.
3.8 Análise estatística
Foi realizada a análise descritiva dos dados por meio de frequências absolutas e
relativas para as variáveis qualitativas. Para as variáveis quantitativas foram calculadas as
medidas-resumo (média, desvio padrão e mediana).
Para a comparação entre os grupos descritos no primeiro e segundo objetivos
específicos, utilizou-se o teste exato de Fisher. Para a comparação dos grupos entre as
variáveis numéricas foi utilizado o teste t-student. Para a comparação da prevalência de
acordo com o sítio da biópsia no grupo controle (proximal vs distal) foi utilizado o teste de
McNemar.
As covariáveis associadas à detecção de HPV e ao CEC de esôfago foram analisadas e
os resultados foram expressos como razão de chances (odds ratio - OR) bruta, através da
regressão logistica simples e ajustada pelas covariáveis, através da regressão logistica
múltipla. Os respectivos intervalos com 95% de confiança (IC 95%) também foram
apresentados.
O nível de significância adotado foi de 5%. Para a tabulação e análise estatística foi
utilizado o software IBM® SPSS® Statistics 21.0 para Windows (IBM Corporation, Route 100,
Somers NY 10589).
20
3.9 Considerações éticas
Este estudo integra um projeto de pesquisa maior intitulado “O papel do
Papilomavírus Humano (HPV) como agente etiológico do câncer esofágico. Um estudo
transversal, caso-controle e longitudinal no Hospital de Câncer de Barretos” que foi
submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HCB-FPXII (protocolo 637/2012 Anexo 1).
Todos os voluntários manifestaram a intenção de participar do estudo por meio do
TCLE.
As informações que pudessem identificar os participantes de pesquisa foram mantidas
em sigilo e codificadas no banco de dados para garantir a confidencialidade das informações
e a privacidade. Apenas pessoas diretamente relacionadas ao estudo tiveram acesso direto
ao banco de dados.
Os pesquisadores declararam não possuir conflito de interesse relacionado a este
estudo.
3.10 Financiamento da pesquisa
Este estudo integra um projeto de pesquisa maior intitulado “O papel do
Papilomavírus Humano (HPV) como agente etiológico do câncer esofágico. Um estudo
transversal, caso-controle e longitudinal no Hospital de Câncer de Barretos”, aprovado sob o
fomento CNPq Universal 14/2012 - Faixa C - de R$ 60.000,01 a R$ 120.000,00 (processo:
482666/2012-9). O Termo de aceitação de apoio financeiro encontra-se no Anexo 6.
21
4 RESULTADOS
4.1 Descrição da população
Durante o período compreendido entre fevereiro de 2013 e agosto de 2014 foi
possível compor a casuística deste estudo com 202 indivíduos, dos quais 101 (50,0%) eram
pacientes com câncer de esôfago, denominados como “casos” e 101 (50,0%) eram
indivíduos sem neoplasia, denominados como “controles”. Casos e controles foram
emparelhados (1 caso : 1 controle) por sexo e idade (± 3 anos).
4.1.2 Descrição das características sociodemográficas
A população do estudo apresentou as seguintes características: sexo masculino (n=
160; 79,2%), raça branca (66,3%; n= 128); estado civil casado ou união estável (70,3%; n=
142); baixo grau de instrução escolar (14,9% (n= 30) eram analfabetos ou analfabetos
funcionais e 72,3% (n= 146) possuíam ensino fundamental incompleto ou completo) e
procedentes da região sudeste do país (82,2%; São Paulo= 70,8%; Minas Gerais= 11,4%). A
idade variou de 41 a 83 anos (média= 60,0 anos; dp= 10,0 anos; mediana= 60,0 anos).
Durante a entrevista, 15,3% relataram nunca terem morado em zona rural e apenas 5%
relataram nunca terem morado em zona urbana.
22
4.2 Comparação da prevalência de DNA de HPV-16 no esôfago de indivíduos com e
sem CEC de esôfago
O DNA de HPV-16 foi detectado no esôfago em 3 de 101 indivíduos do grupo “caso”, o
que corresponde a uma prevalência de 3,0% (IC 95%: 1,0 – 8,0). Na região livre de neoplasia
(tecido adjacente normal) todos os testes para a detecção de DNA de HPV-16 foram
negativos (0/101).
Para o grupo “controle”, foi detectado DNA de HPV-16 no esôfago de 21 dos 101
indivíduos, correspondendo a uma prevalência de 20,7% (IC 95%: 14,0 – 29,7). A prevalência
de DNA de HPV-16 na região proximal do esôfago foi de 13,9% (14/101; IC 95%: 8,4 – 21,9) e
na região distal do esôfago foi de 11,9% (12/101; IC 95%: 6,9 – 19,6). Comparou-se a
prevalência de DNA de HPV-16 da região proximal com a da região distal e não foi
encontrada diferença estatisticamente significatica (p= 0,802).
Construiu-se uma variável consensual dicotômica (negativo e positivo) e considerou-se
"DNA de HPV-16 positivo" aqueles indivíduos que apresentaram positividade no teste,
independente da região detectada.
Na comparação entre HPV-16 no esôfago entre indivíduos com e sem câncer de
esôfago, observou-se maior prevalência de DNA de HPV-16 em indivíduos sem câncer controles (p <0,001) (Tabela 3).
Tabela 3 - Comparação da prevalência de DNA de HPV-16 no esôfago em indivíduos com e
sem câncer de esôfago. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de
Especialidades de Barretos, 2014.
HPV-16
Casos
Controles
N
%
n
%
Negativo
Positivo
98
3
97,0
3,0
80
21
79,2
20,8
Total
101
100
101
100
P
<0,001
23
4.3 Comparação dos indivíduos com e sem presença de DNA de HPV-16 em relação
às características sociodemográficas e os fatores de risco conhecidos para o câncer de
esôfago e para a infecção por HPV
Observou-se presença de DNA de HPV-16 no esôfago de 24 dos 202 indivíduos
estudados, correspondendo a uma prevalência de 11,8% (IC 95%: 8,1 – 17,0). A idade média
dos indivíduos com e sem a presença de DNA de HPV-16 foram estatisticamente similares
(HPV-16 negativo = 60,4 [dp= 10,5] vs HPV-16 positivo = 58,3 [dp= 9,7]; p= 0,323).
A tabela 4 apresenta resultados da comparação dos indivíduos com e sem presença de
DNA de HPV-16 em relação às variáveis sóciodemográficas. As variáveis sexo, raça, estado
civil, zona rural, tempo de moradia em zona rural, zona urbana e tempo de moradia em zona
urbana não apresentaram diferença estatisticamente significativa, no entanto a variável
escolaridade apresentou diferença significativa (p= 0,027). Indivíduos de nível médio ou
superior que apresentaram risco aumentado em 11 vezes (OR bruta) de ter a presença de
DNA de HPV-16 na mucosa esôfagica em relação aos indivíduos analfabetos ou analfabetos
funcionais.
24
Tabela 4 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds Ratio bruta com
intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características sociodemográficas. Hospital de
Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
HPV-16 n
%
Variável
Categoria
HPV-16 +
n
%
B
P
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
Sexo
Feminino
Masculino
37
141
20,8
79,2
5
19
20,8
79,2
1,000
1,00 [0,35 : 2,86]
1
0,96 [0,30 : 3,09]
1
Raça
Branca
Não branca
115
57
66,9
33,1
13
8
61,9
38,1
0,634
1
1,24 [0,48 : 3,16]
1
1,27 [0,49 : 3,27]
Estado civil
Casado
Não casado
122
56
68,5
31,5
20
4
83,3
16,7
0,160
1
0,43 [0,14 : 1,33]
1
0,45 [0,14 : 1,38]
Escolaridade
Analfabeto / A. funcional
Ensino fundamental
Ensino médio / superior
29
130
19
16,3
73,0
10,7
1
16
7
4,2
66,7
29,2
0,027
1
3,56 [0,45 : 28,00]
10,68 [1,21 : 93,92]
1
3,34 [0,42 : 26,39]
10,11 [1,13 : 90,08]
Zona rural
Não
Sim
25
153
14,0
86,0
6
18
25,0
75,0
0,222
1
0,49 [0,17 : 1,35]
1
0,50 [0,18 : 1,40]
Tempo zona rural
≤ 10 anos
> 10 anos
36
117
23,5
76,5
5
13
27,8
72,2
0,771
1
0,80 [0,26 : 2,39]
1
0,79 [0,26 : 2,42]
Zona urbana
Não
Sim
9
169
5,1
94,9
1
23
4,2
95,8
1,000
1
1,22 [0,14 : 10,11]
1
1,08 [0,12 : 9,07]
Tempo zona urbana
≤ 10 anos
> 10 anos
14
155
8,3
91,7
0
23
0,0
100,0
0,382
1
NA
1
NA
178
100
24
100
Total
B
3
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Raça (9).
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
25
A tabela 5 apresenta resultados da comparação dos indivíduos com e sem presença de DNA de HPV-16 em relação às variáveis
características de ocupação. Não se observou diferença estatisticamente significativa na comparação entre indivíduos com e sem DNA de HPV16 de acordo com as características de ocupação.
Tabela 5 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às
características de ocupação. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Variável
Categoria
HPV-16 n
%
HPV-16 +
n
%
Exposição à Inseticida ou Pesticida
Não
Sim
83
94
46,9
53,1
10
11
47,6
52,4
Classificação ISCO
1. Profissionais técnicos
2. Administrativos e gerentes
3. Empregados de escritório
4. Trabalhador com vendas
5. Auxiliar de serviços
6. Agricultor
7. Transporte e produção de equipamentos
8. Aposentado, Doente e Desempregado
9. Forças armadas
4
3
3
1
71
77
16
0
3
2,3
1,7
1,7
0,6
40,1
43,5
8,5
0,0
1,7
0
2
0
0
12
8
1
0
1
0,0
8,3
0,0
0,0
50,0
33,3
4,2
0,0
4,2
Total
178
100
24
100
B
3
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Exposição à Inseticida ou Pesticida (4).
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
B
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
1,000
1
0,97 [0,39 : 2,40]
1
0,92 [0,37 : 2,31]
0,386
NA
2,00 [0,11 : 35,80]
NA
NA
0,50 [0,04 : 5,28]
0,31 [0,29 : 3,35]
0,20 [0,01 : 4,16]
NA
1
NA
1,7 [0,09 : 31,56]
NA
NA
0,48 [0,04 : 5,18]
0,30 [0,02 : 3,39]
0,20 [0,01 : 4,44]
NA
1
P
26
A tabela 6 apresenta resultados da comparação dos indivíduos com e sem presença de
DNA de HPV-16 em relação às variáveis características de exposição ao álcool. Não se
observou diferença estatisticamente significativa entre às variáveis consumo de álcool,
grama etanol por mililitro por dia, cerveja e vinho. Observou-se diferença estatisticamente
significativa para a variável consumo de destilados (p= 0,010). Indivíduos que consumiram
destilados apresentaram menor chance (OR bruta = 0,31; OR ajustada = 0,33) de terem a
presença de DNA de HPV-16 na mucosa esofágica em relação àqueles que nunca
consumiram destilados.
Tabela 6 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de exposição ao álcool.
Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Variável
Categoria
HPV-16 n
%
HPV-16 +
n
%
B
P
2
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
Álcool
Não
Sim
33
145
18,5
81,5
5
19
20,8
79,2
0,783
1
0,86 [0,30 : 2,48]
1
0,49 [0,18 : 1,28]
Álcool
Nunca
1
Presente
Passado
33
79
66
18,5
44,4
37,1
5
12
7
20,8
50,0
29,2
0,778
1
1,00 [0,32 : 3,07]
0,70 [0,20 : 2,37]
1
1,27 [0,39 : 4,17]
0,98 [0,25 : 3,70]
Grama etanol por mililitro por dia
Nunca
33
18,8
≤ 30
112
63,6
> 30
31
17,6
5
16
3
20,8
66,7
12,5
0,902
1
0,94 [0,32 : 2,76]
0,63 [0,14 : 2,76]
1
1,23 [0,39 : 3,93]
0,89 [0,18 : 4,40]
Cerveja
Não
Sim
53
124
29,9
70,1
8
16
33,3
66,7
0,814
1
0,85 [0,34 : 2,11]
1
1,04 [0,39 : 2,71]
Vinho
Não
Sim
108
70
60,7
39,3
16
8
66,7
33,3
0,659
1
0,77 [0,31 : 1,89]
1
0,82 [0,33 : 2,05]
Destilados
Não
Sim
54
124
30,3
69,7
14
10
58,3
41,7
0,010
1
0,31 [0,13 : 0,74]
1
0,33 [0,13 : 0,85]
Total
178
100
24
100
B
2
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Grama etanol por mililitro por dia (2); cerveja (1).
1
Foi considerado o consumo atual de bebida alcoólica se o participante da pesquisa referisse que abandonou o consumo
nos últimos 12 meses.
27
A tabela 7 apresenta resultados da comparação dos indivíduos com e sem presença de
DNA de HPV-16 em relação às variáveis características de exposição ao tabaco. Não se
observou diferença estatisticamente significativa entre às variáveis estudadas à respeito de
consumo de tabaco.
Tabela 7 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de exposição ativa ao
tabaco. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos,
2014.
Variável
Categoria
HPV 16 n
%
HPV 16 +
n
%
B
P
1
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
Tabaco
Não
Sim
42
136
23,6
76,4
9
15
37,5
62,5
0,208
1
0,51 [0,21 : 1,26]
1
0,49 [0,18 : 1,28]
Tabaco
Nunca
1
Presente
Passado
42
78
58
23,6
43,8
32,6
9
5
10
37,5
20,8
41,7
0,075
1
0,29 [0,09 : 0,95]
0,80 [0,30 : 2,15]
1
0,28 [0,08 : 0,94]
0,76 [0,26 : 2,15]
Maços por ano
Nunca
≤ 40
> 40
42
76
60
23,6
42,7
33,7
9
8
7
37,5
33,3
29,2
0,358
1
0,49 [0,17 : 1,36]
0,54 [0,18 : 1,57]
1
0,46 [0,15 : 1,38]
0,51 [0,16 : 1,59]
Cigarro de filtro
Não
Sim
50
128
28,1
71,9
10
14
41,7
58,3
0,233
1
0,54 [0,22 : 1,31]
1
0,52 [0,20 : 1,34]
Cigarro de palha
Não
Sim
83
95
46,6
53,4
14
10
58,3
41,7
0,384
1
0,62 [0,26 : 1,48]
1
0,62 [0,26 : 1,51]
Cachimbo
Não
Sim
178
0
100,0
0,0
24
0
100,0
0,0
NA
1
NA
1
NA
Charuto
Não
Sim
178
0
100,0
0,0
24
0
100,0
0,0
NA
1
NA
1
NA
Total
178
100
24
100
B
1
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool
1
Foi considerado o consumo atual de tabaco se o participante da pesquisa referisse que abandonou o consumo nos últimos
12 meses.
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
28
A tabela 8 apresenta resultados da comparação dos indivíduos com e sem presença de
DNA de HPV-16 em relação às variáveis características de exposição passiva ao tabaco. Não
se observou diferença estatisticamente significativa entre às variáveis estudadas à respeito
da exposição passiva ao tabaco.
Tabela 8 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de exposição passiva ao
tabaco. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos,
2014.
Variável
Categoria
Fumo passivo
Não
Sim
HPV 16 n
%
HPV 16 +
n
%
B
P
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
6
18
25,0
75,0
0,030
1
0,29 [0,10 : 0,85]
1
0,29 [0,10 : 0,86]
16
8
66,7
33,3
0,382
1
0,62 [0,25 : 1,53]
1
0,66 [0,26 : 1,63]
Trabalhou em lugar fechado com fumantes
Não
138
78,0
21
87,5
Sim
39
22,0
3
12,5
0,422
1
0,50 [0,14 : 1,78]
1
0,40 [0,11 : 1,48]
Quando criança, pais fumavam
Não
40
22,7
Sim
136
77,3
7
17
29,2
70,8
0,454
1
0,71 [0,27 : 1,84]
1
0,57 [0,29 : 1,97]
Total
24
100
16
162
9,0
91,0
Conviveu com fumante (casado)
Não
99
55,6
Sim
79
44,4
178
100
3
ORB: Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Trabalhou em lugar fechado com fumantes (1), Quando criança,
pais fumavam (2).
29
A tabela 9 apresenta resultados da comparação dos indivíduos com e sem presença de
DNA de HPV-16 em relação às caracteristicas de hábitos sexuais. Não se observou diferença
estatisticamente significativa entre às variáveis estudadas à respeito do hábitos sexuais.
Tabela 9 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de hábitos sexuais.
Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Variável
Categoria
HPV-16 n
%
HPV-16 +
n
%
B
P
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
Idade da primeira relação sexual (anos)
Até 15
57
32,9
10
> 15 até 17
43
24,9
6
> 17
73
42,2
8
41,7
25,0
33,3
0,674
1,60 [0,59 : 4,31]
1,27 [0,41 : 3,91]
1
1,75 [0,63 : 4,82]
1,19 [0,38 : 3,72]
1
Número de parceiros
1
26
2–5
48
>5
100
14,9
27,6
57,5
7
6
11
29,2
25,0
45,8
0,244
1
0,46 [1,14 : 1,52]
0,40 [0,14 : 1,15]
1
0,45 [0,13 : 1,50]
0,39 [0,13 : 1,16]
Sexo oral ativo
Não
Sim
73,1
26,9
16
8
66,7
33,3
0,477
1
1,36 [0,54 : 3,39]
1
1,28 [0,50 : 3,24]
1,000
1
0,91 [0,13 : 6,37]
0,73 [0,08 : 6,04]
1
0,64 [0,08 : 4,83]
0,52 [0,05 : 4,64]
128
47
Idade da primeira vez que fez sexo oral ativo (anos)
Até 20
18
40,9
3
42,9
>20 até 30
15
34,1
2
28,6
> 30
11
25,0
2
28,6
Frequência (sexo
oral ativo)
Raramente
Frequente/Sempre
5
3
62,5
37,5
0,685
1
1,47 [0,30 : 7,09]
1
1,46 [0,29 : 7,15]
Gênero do parceiro (sexo oral ativo)
Mulher
36
81,8
Homens
7
15,9
Ambos
1
2,3
6
2
0
75,0
25,0
0,0
0,677
1
1,71 [0,28 : 10,3]
NA
1
1,73 [0,28 : 10,69]
NA
Sexo oral - ânus
Não
Sim
157
6
96,3
3,7
18
2
90
10,0
0,213
1
2,9 [0,54 : 15,49]
1
2,32 [0,41 : 12,9]
Sexo oral passivo
Não
Sim
108
67
61,7
38,3
17
7
70,8
29,2
0,501
1
0,66 [0,26 : 1,68]
1
0,59 [0,22 : 1,53]
Total
178
100
24
100
B
32
13
3
71,1
28,9
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Idade da primeira relação sexual (5); Número de parceiros (4);
Sexo oral ativo (3); Idade da primeira vez que fez sexo oral ativo (4); Frequência sexo oral ativo (2); Gênero do parceiro sexo
oral ativo (3); Sexo oral - ânus (19); Sexo oral passivo (3).
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
30
A tabela 10 apresenta resultados da comparação dos indivíduos com e sem presença
de DNA de HPV-16 em relação às caracteristicas de antecedentes de doenças sexualmente
transmissíveis auto-fereridas. Não se observou diferença estatisticamente significativa entre
às variáveis estudadas à respeito de antecedentes de doenças sexualmente transmissíveis
auto-referidas.
Tabela 10 - Comparação entre os indivíduos com e sem DNA de HPV-16 e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de antecedentes de
doenças sexualmente transmissíveis auto-referidos. Hospital de Câncer de Barretos e
Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Variável
Categoria
DST
Não
Sim
HPV-16 n
%
HPV-16 +
n
%
B
P
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
131
46
74,0
24,0
20
4
83,3
16,7
0,452
1
0,57 [0,18 : 1,75]
1
0,59 [0,19 : 1,85]
Verrugas genitais
Não
170
Sim
7
96,0
4,0
24
0
100,0
0,0
1,000
1
NA
1
NA
Herpes genitais
Não
174
Sim
3
98,3
1,7
24
0
100,0
0,0
1,000
1
NA
1
NA
Hepatite B
Não
Sim
172
3
98,3
1,7
24
0
100,0
0,0
1,000
1
NA
1
NA
Hepatite C
Não
Sim
174
1
99,4
0,6
24
0
100,0
0,0
1,000
1
NA
1
NA
HIV
Não
Sim
177
0
100,0
0,0
24
0
100,0
0,0
NA
1
NA
1
NA
HPV (auto-referido)
Não
177
Sim
0
100,0
0,0
24
0
100,0
0,0
NA
1
NA
1
NA
100
24
100
Total
B
178
3
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: DST (1); Verrugas genitais (1); Hepatite B (3); Hepatite C (3); HIV
(1) HPV (1).
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
31
A tabela 11 apresenta resultados da comparação dos indivíduos com e sem presença
de DNA de HPV-16 em relação às caracteristicas de história de câncer na família. Não se
observou diferença estatisticamente significativa entre às variáveis estudadas à respeito de
história de câncer na família.
Tabela 11 - Comparação entre os indivíduos com e sem a presença de DNA de HPV-16 e
Odds Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de
história de câncer na família que podem estar relacionados ao HPV. Hospital de Câncer de
Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Variável
Categoria
HPV-16 n
%
HPV-16 +
n
%
B
P
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
Esôfago (1º grau)
Não
153
Sim
16
90,5
9,5
22
2
91,7
8,3
1,000
1
0,86 [0,18 : 4,04]
1
1,02 [0,21 : 4,88]
Esôfago (2º e 3º grau)
Não
161
Sim
6
96,4
3,6
23
1
95,8
4,2
1,000
1
1,16 [0,13 : 10,13]
1
1,11 [0,12 : 9,92]
Cabeça e pescoço
Não
147
Sim
20
88,0
12,0
22
2
91,7
8,3
1,000
1
0,66 [0,14 : 3,05]
1
0,68 [0,14 : 3,16]
Colo de útero
Não
Sim
160
7
95,8
4,2
22
2
91,7
8,3
0,315
1
2,07 [0,40 : 10,64]
1
2,05 [0,39 : 10,72]
Vulva
Não
Sim
167
0
100
0,0
24
0
100
0,0
NA
1
NA
1
NA
Pênis
Não
Sim
166
1
99,4
0,6
24
0
100,0
0,0
1,000
1
NA
1
NA
Anal
Não
Sim
166
1
99,4
0,6
24
0
100,0
0,0
1,000
1
NA
1
NA
Total
178
100
24
100
B
3
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise:Esôfago (1º grau) (9); Esôfago (2º e 3º grau) (11); Cabeça e
pescoço (11); Colo de útero (11); Vulva (11); Pênis (11) e Anal (11).
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
32
4.4 Comparação dos indivíduos com e sem CEC de esôfago em relação às
características sociodemográficas e os fatores de risco conhecidos para o câncer de
esôfago e para a infecção por HPV
A caracterização dos casos e controles encontra-se nas tabelas 12 e 13,
respectivamente. A localização do tumor mais comum foi o terço médio do esôfago (n= 57;
56,4%), seguido por aqueles tumores que invadiam mais de uma região anatômica (n= 33;
32,7%), terço inferior do esôfago (n= 8; 7,9%) e terço superior do esôfago (n= 3; 3,0%).
Tumor localmente avançado (T3 e T4) foi observado em 88,7% dos casos, metástase
em linfonodo regional em 62,9% e metástase à distância em 20,0%. Estadiamento TNM
avançado (estádios III e IV) foi observado em 75,8% dos pacientes (n= 72).
Os tumores foram bem diferenciados em 13,4% (n= 13) dos casos, moderadamente
diferenciados em 57,7% (n= 56) e pouco diferenciados em 28,9% (n= 28).
Tabela 12 - Caracterização clínica dos casos. Hospital de Câncer de Barretos, 2014.
Variável
Categoria
n
%
Localização do
tumor (CID-O)
Terço superior do esôfago
Terço médio do esôfago
Terço inferior do esôfago
Tumor invade mais de uma região anatômica
3
57
8
33
3,0
56,4
7,9
32,7
Estadiamento T
T1/T2
T3/T4
10
79
11,3
88,7
Estadiamento N
N0
N positivo
26
44
37,1
62,9
Estadiamento M
M0
M1
76
19
80,0
20,0
Estadiamento
TNM (grupamento)
I
II
III
IV
1
22
52
20
1,1
23,1
54,7
21,1
Grau de
diferenciação
Bem
Moderadamente
Pouco
13
56
28
13,4
57,7
28,9
101
100
Total
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Estadiamento T (12), Estadiamento N (31), Estadiamento M (6),
Estadiamento TNM (6), Grau de diferenciação (4).
33
Refluxo gastroesôfágico foi relatado por 23,7% (n= 23) dos controles no momento da
entrevista.
A avaliação patológica das amostras da região proximal do esôfago detectou 24,8% (n=
25) de esofagite e para a região distal foram detectados 24,8% (n= 25) de esofagite, 2,0% (n=
2) de papilomatose e 1,0% (n= 1) de moníliase.
Tabela 13 - Caracterização clínica dos controles. Ambulatório Médico de Especialidades de
Barretos, 2014.
Variável
Categoria
n
%
Refluxo gastroesofágico
Não
Sim
74
23
76,3
23,7
Mucosa esofágica
Proximal
Normal
Esofagite
76
25
75,2
24,8
Mucosa esofágica
Distal
Normal
Esofagite
Papilomatose
Monilíase
73
25
2
1
72,3
24,8
2,0
1,0
101
100
Total
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Refluxo gastroesofágico (4)
34
A tabela 14 apresenta resultados da comparação entre casos e controles em relação às
variáveis sociodemográficas. As variáveis sexo, raça, escolaridade, estado civil, zona rural,
tempo de moradia em zona rural e tempo de moradia em zona urbana não apresentaram
diferença estatisticamente significativa, no entanto a variável zona rural apresentou (p=
0,019). Observou-se que indivíduos que moraram na zona urbana apresentaram menor
chance (OR bruta e ajustada = 0,01) de desenvolver câncer de esôfago em relação àqueles
que nunca moraram na zona urbana.
Tabela 14 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características sociodemográficas.
Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Variável
Categoria
Caso
n
%
Controle
n
%
Raça
Branca
Não branca
71
29
71,0
29,0
57
36
61,3
38,7
Estado civil
Casado
Não casado
66
35
65,3
34,7
76
25
Escolaridade
Analfabeto / A. funcional
Ensino fundamental
Ensino médio / superior
16
75
10
15,8
74,3
9,9
Zona rural
Não
Sim
11
90
Tempo zona rural
≤ 10 anos
> 10 anos
22
68
B
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
0,172
1
0,64 [0,35 : 1,17]
1
0,59 [0,31 : 1,10]
75,2
24,8
0,166
1
1,61 [0,87 : 2,96]
1
1,66 [0,88 3,13]
14
71
16
13,9
70,3
15,8
0,467
1
1,08 [0,49 : 2,37]
1,82 [0,62 : 5,31]
1
1,16 [0,51 : 2,65]
2,18 [0,72 : 6,63]
10,9
89,1
20
81
19,8
80,2
0,117
1
2,02 [0,91 : 4,47]
1
2,14 [0,95 : 4,85]
24,4
75,6
19
62
23,5
76,5
1,000
1
0,94 [0,46 : 1,91]
1
1,10 [0,53 : 2,26]
P
continua
Total
101
100
101
100
35
Tabela 14 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características sociodemográficas.
Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Caso
n
%
Variável
Categoria
B
Controle
n
%
P
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
continuação
Zona urbana
Não
Sim
9
92
8,9
91,1
1
100
1,0
99,0
0,019
1
0,10 [0,01 : 0,82]
1
0,10 [0,01 : 0,89]
Tempo zona urbana
≤ 10 anos
> 10 anos
7
85
7,6
92,4
7
93
7,0
93,0
1,000
1
0,91 [0,30 : 2,71]
1
0,75 [0,24 : 2,35]
101
100
101
100
Total
B
3
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Raça (9).
36
A tabela 15 apresenta resultados da comparação entre casos e controles em relação às variáveis características de ocupação. Não
observou-se diferença estatisticamente significativa na comparação entre casos e controles e as características de ocupação.
Tabela 15 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds Ratio bruta com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às
características de ocupação. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Caso
Controle
n
%
Variável
Categoria
n
%
Exposição à Inseticida ou Pesticida
Não
Sim
44
56
44,0
56,0
48
48
50,0
50,0
Classificação ISCO
1. Profissionais técnicos
2. Administrativos e gerentes
3. Empregados de escritório
4. Trabalhador com vendas
5. Auxiliar de serviços
6. Agricultor
7. Transporte e produção de equipamentos
8. Aposentado, Doente e Desempregado
9. Forças armadas
2
1
3
0
44
41
7
0
2
2,0
1,0
3,0
0,0
44,0
41,0
7,0
0,0
2,0
2
4
0
1
39
44
9
0
2
2,,0
4,0
0,0
1,0
38,6
43,6
8,9
0,0
2,0
Total
101
100
101
100
B
3
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Exposição à Inseticida ou Pesticida (4).
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
B
P
0,477
0,541
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
1,27 [0,72 : 2,22]
1,27
1
1,23 [0,69 : 2,19]
1,00 [0,63 : 15,98]
0,25 [0,01 : 4,72]
NA
NA
1,12 [0,12 : 8,39]
0,93 [0,12 : 6,92]
0,77 [0,08 : 6,98]
NA
1
1,30 [0,07 : 22,47]
0,27 [0,01 : 5,28]
NA
NA
1,39 [0,18 : 10,50]
1,19 [0,15 : 8,99]
0,84 [0,9 : 7,72]
NA
1
37
A tabela 16 apresenta resultados da comparação entre casos e controles em relação às
variáveis
características
de
de
exposição
ao
álcool.
Apresentaram
diferenças
estatisticamente significativas as variáveis de consumo de álcool, grama etanol por mililitro
por dia e destilados (p= 0,002, p= 0,004 e p< 0,001 respectivamente).
O consumo de álcool aumentou o risco em 3,4 vezes (OR bruta) de desenvolver câncer
de esôfago em relação àqueles que nunca consumiram álcool. Indíviduos que consumiam
álcool apresentaram risco aumentado em 2,7 (OR bruta) vezes de desenvolver câncer de
esôfago em relação àqueles que nunca consumiram bebidas alcoólicas. E, indivíduos que
consumiram álcool no passado apresentaram risco aumentado em 4,7 (OR bruta) vezes de
desenvolver câncer de esôfago em relação àqueles que nunca consumiram bebidas
alcoólicas.
Em relação à quantidade de consumo de etanol, indivíduos que consumiram menos
que 30 gramas de etanol por mililitro por dia, apresentaram risco aumentado em 3,3 vezes
(OR bruta) de desenvolver câncer de esôfago em relação àqueles que nunca consumiram
bebidas alcoólicas. E indivíduos que consumiram mais de 30 gramas de etanol por mililitro
por dia apresentaram risco aumentado em 4 (OR bruta) vezes de desenvolver câncer de
esôfago em relação àqueles que nunca consumiram bebidas alcoólicas.
Consumo de cerveja e vinho não apresentaram diferença significativa, no entanto, o
consumo de bebidas destiladas apresentou uma risco aumentado em 7,1 vezes (OR bruta)
de desenvolver câncer de esôfago em relação àqueles que nunca consumiram bebidas
destiladas.
38
Tabela 16 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de exposição ao álcool.
Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Caso
Controle
n
%
B
2
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
0,002
1
3,49 [1,59 : 7,65]
1
3,03 [1,32 : 6,92]
27,7
45,5
26,7
0,001
1
2,73 [1,19 : 6,28]
4,77 [2,01 : 11,32]
1
2,48 [1,04 : 5,88]
4,18 [1,66 : 10,47]
Grama etanol por mililitro por dia
Nunca
10
10,0
28
≤ 30
70
70,0
58
> 30
20
20,0
14
28,0
58,0
14,0
0,004
1
3,37 [1,51 : 7,53]
4,00 [1,48 : 10,80]
1
2,96 [1,28 : 6,85]
3,40 [1,20 : 9,62]
Cerveja
Não
Sim
27
74
26,7
73,3
34
66
34,0
66,0
0,286
1
1,41 [0,77 : 2,58]
1
1,18 [0,63 : 2,24]
Vinho
Não
Sim
57
44
56,4
43,6
67
34
66,3
33,7
0,193
1
1,52 [0,86 : 2,69]
1
1,43 [0,80 : 2,56]
Destilados
Não
Sim
14
87
13,9
86,1
54
47
53,5
46,5
<0,001
1
7,14 [3,59 : 14,18]
1
7,02 [3,4 : 14,46]
Total
101
100
101
100
Variável
Categoria
n
%
Álcool
Não
Sim
10
91
9,9
90,1
28
73
27,7
72,3
Álcool
Nunca
1
Presente
Passado
10
45
46
9,9
44,6
45,5
28
46
27
B
2
P
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Grama etanol por mililitro por dia (2); cerveja (1).
1
Foi considerado o consumo atual de bebida alcoólica se o participante da pesquisa referisse que abandonou o consumo
nos últimos 12 meses.
39
A tabela 17 apresenta resultados da comparação entre casos e controles em relação às
variáveis características de exposição ativa ao tabaco. Apresentaram diferença
estatisticamente significativa as variáveis de consumo de tabaco, maços-ano e cigarro de
palha (p= 0,050, p= 0,034 e p= 0,001 respectivamente).
A exposição ativa ao tabaco apresentou risco aumentado em 2 vezes (OR bruta) de
desenvolver câncer de esôfago em relação àqueles que nunca foram expostos ativamente ao
tabaco. Indíviduos expostos ativamente ao tabaco no presente tiveram risco aumentado em
2,9 (OR bruta) vezes de desenvolver câncer de esôfago em relação àqueles que nunca
fumaram. Em relação à quantidade maços/anos consumidos, indivíduos que consumiram
mais de 40 maços-ano, apresentaram risco aumentado em 2,6 vezes (OR bruta) de
desenvolver câncer de esôfago em relação àqueles que nunca fumaram.
Cigarro de filtro não apresentou diferença estatisticamente significativa; no entanto,
cigarro de palha apresentou risco aumentado em 2,7 vezes (OR bruta) de desenvolver
câncer de esôfago em relação àqueles que nunca fumaram cigarro de palha.
40
Tabela 17 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de exposição ativa ao
tabaco. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos,
2014.
Caso
Controle
n
%
B
1
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
0,050
1
2,00 [1,04 : 3,38]
1
1,45 [0,71 : 2,93]
31,7
29,7
38,6
0,004
1
2,97 [1,44 : 6,13]
1,25 [0,59 : 2,63]
1
2,15 [0,99 : 4,65]
0,90 [0,41 : 2,00]
32
43
26
31,7
42,6
25,7
0,034
1
1,60 [0,78 : 3,26]
2,65 [1,25 : 5,62]
1
1,15 [0,53 : 2,47]
1,93 [0,87 : 4,28]
23,8
76,2
36
65
35,6
64,4
0,090
1
1,77 [0,96 : 3,28]
1
1,26 [0,64 : 2,47]
36
65
35,6
64,4
61
40
60,4
39,6
0,001
1
2,75 [1,55 : 4,86]
1
2,92 [1,30 : 6,54]
Cachimbo
Não
Sim
101
0
100,0
0,0
101
0
100,0
0,0
NA
1
NA
1
NA
Charuto
Não
Sim
101
0
100,0
0,0
101
0
100,0
0,0
NA
1
NA
1
NA
Total
101
100
101
100
Variável
Categoria
n
%
Tabaco
Não
Sim
19
82
18,8
81,2
32
69
31,7
68,3
Tabaco
Nunca
1
Presente
Passado
19
53
29
18,8
52,5
28,7
32
30
39
Maços por ano
Nunca
≤ 40
> 40
19
41
41
18,8
40,6
40,6
Cigarro de filtro
Não
Sim
24
77
Cigarro de palha
Não
Sim
B
1
P
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool
1
Foi considerado o consumo atual de tabaco se o participante da pesquisa referisse que abandonou o consumo nos
últimos 12 meses
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
41
A tabela 18 apresenta resultados da comparação entre casos e controles em relação às
variáveis características de exposição passiva ao tabaco. Não se observou diferença
estatisticamente significativa entre às variáveis estudadas à respeito da exposição passiva ao
tabaco.
Tabela 18 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de exposição passiva ao
tabaco. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos,
2014.
Caso
Variável
Categoria
n
%
Fumo passivo
Não
Sim
7
94
6,9
93,1
Controle
n
%
B
P
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
15
86
14,9
85,1
0,112
1
2,34 [0,91 : 6,01]
1
2,06 [0,78 : 5,47]
59
42
58,4
41,6
0,776
1
1,12 [0,64 : 1,97]
1
1,09 [0,61 : 1,95]
Trabalhou em lugar fechado com fumantes
Não
77
77,0
82
81,2
Sim
23
23,0
19
18,8
0,492
1
1,28 [0,65 : 2,55]
1
1,29 [0,62 : 2,66]
Quando criança, pais fumavam
Não
22
22,2
Sim
77
77,8
25
76
24,8
75,2
0,740
1
1,15 [0,59 : 2,21]
1
1,12 [0,57 : 2,20]
Total
101
100
Conviveu com fumante (casado)
Não
56
55,4
Sim
45
44,6
101
100
3
ORB: Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Trabalhou em lugar fechado com fumantes (1), Quando criança,
pais fumavam (2).
A tabela 19 apresenta resultados da comparação entre casos e controles em relação às
caracteristicas de hábitos sexuais. Não se observou diferença estatisticamente significativa
entre às variáveis: idade da primeira relação sexual, número de parceiros, idade da primeira
vez que fez sexo oral ativo, frequência (sexo oral ativo), gênero do parceiro (sexo oral ativo),
sexo oral no ânus e sexo oral passivo. Sexo oral ativo apresentou diferença estatisticamente
significativa (p= 0,004). Indivíduos que relataram aterem realizado sexo oral alguma vez na
vida apresentaram menor risco (OR= 0,38) de ter câncer de esôfago em relação à indivíduos
que relataram nunca terem realizado o sexo oral.
42
Tabela 19 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de hábitos sexuais.
Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014 .
Variável
Categoria
Caso
n
%
Controle
N
%
B
P
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
Idade da primeira relação sexual (anos)
Até 15
35
36,1
> 15 até 17
24
24,7
> 17
38
39,2
32
25
43
32,0
25,0
43,0
0,815
1,23 [0,64 : 2,36]
1,08 [0,53 : 2,30]
1
1,08 [0,55 : 2,12]
1,10 [0,52 : 2,31]
1
Número de parceiros
1
2–5
6 – 10
13
25
59
13,4
25,8
60,8
20
29
52
19,8
28,7
51,5
0,361
1
1,32 [0,55 : 3,19]
1,74 [0,79 : 3,85]
1
1,40 [0,56 : 3,52]
1,49 [0,65 : 3,39]
Sexo oral ativo
Não
Sim
80
18
81,6
18,4
64
37
63,4
36,6
0,004
1
0,38 [0,20 : 0,47]
1
0,33 [0,17 : 0,66]
0,309
1
3,38 [0,59 : 19,3]
3,85 [0,64 : 23,05]
1
3,45 [0,54 : 22,00]
4,01 [0,60 : 26,72]
Idade da primeira vez que fez sexo oral ativo (anos)
Até 20
8
47,1
13 38,2
>20 até 30
7
41,2
10 29,4
> 30
2
11,8
11 32,4
Frequência (sexo oral ativo)
Raramente
13
Frequente/Sempre
4
76,5
23,5
24
12
66,7
33,3
0,538
1
0,61 [0,16 : 2,29]
1
0,62 [0,16 : 2,43]
Gênero do parceiro (sexo oral ativo)
Mulher
14
82,4
Homens
3
17,6
Ambos
0
0,0
28
6
1
80,0
17,1
2,9
1,000
1
1,00 [0,21 : 4,60]
NA
1
1,10 [0,22 : 5,43]
NA
Sexo oral - ânus
Não
Sim
92
2
97,9
2,1
83
6
93,3
6,7
0,160
1
0,30 : 0,05 : 1,53]
1
0,29 [0,05 : 1,56]
Sexo oral passivo
Não
Sim
65
33
66,3
33,7
60
41
59,4
40,6
0,379
1
0,74 [0,41 : 1,32]
1
0,73 [0,40 : 1,34]
Total
101
100
101
100
B
3
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: Idade da primeira relação sexual (5); Número de parceiros (4);
Sexo oral ativo (3); Idade da primeira vez que fez sexo oral ativo (4); Frequência sexo oral ativo (2); Gênero do parceiro sexo
oral ativo (3); Sexo oral - ânus (19); Sexo oral passivo (3).
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
43
A tabela 20 apresenta resultados da comparação entre casos e controles em relação às
caracteristicas de antecedentes de doenças sexualmente transmissíveis auto-referidas. Não
se observou diferença estatisticamente significativa entre às variáveis estudadas à respeito
de antecedentes de doenças sexualmente transmissíveis auto-referidas.
Tabela 20 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às características de antecedentes de
doenças sexualmente transmissíveis auto-referidas. Hospital de Câncer de Barretos e
Ambulatório Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Caso
Controle
n
%
0,142
1
0,59 : 0,30 : 1,13]
1
0,48 [0,24 : 0,94]
94,1
5,9
0,118
1
0,16 [0,01 : 1,35]
1
0,12 [0,01 : 1,04]
100
1
99,0
1,0
0,621
1
2,04 [0,18 : 22,87]
1
1,53 [0,13 : 17,31]
99,0
1,0
99
2
98,0
2,0
1,000
1
0,51 [0,04 : 5,72]
1
0,42 [0,03 : 4,76]
98
0
100,0
0,0
100
1
99,0
1,0
1,000
1
NA
1
NA
100
0
100,0
0,0
101
0
100,0
0,0
NA
1
NA
1
NA
100,0
0,0
101
0
100,0
0,0
NA
1
NA
1
NA
100
101
100
%
DST
Não
Sim
80
20
80,0
20,0
71
30
70,3
29,7
Verrugas genitais
Não
99
Sim
1
99,0
1,0
95
6
Herpes genitais
Não
98
Sim
2
98,0
2,0
Hepatite B
Não
Sim
97
1
Hepatite C
Não
Sim
HIV
Não
Sim
HPV (auto-referido)
Não
100
Sim
0
B
3
OR
[IC 95%]
N
Total
B
OR
[IC 95%]
Variável
Categoria
101
3
P
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise: DST (1); Verrugas genitais (1); Hepatite B (3); Hepatite C (3); HIV
(1) HPV (1).
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
44
A tabela 21 apresenta resultados da comparação dentre casos e controles em relação
às caracteristicas de história de câncer na família. Não se observou diferença
estatisticamente significativa entre às variáveis de história de câncer de esôfago (2º e 3º
grau), cabeça e pescoço, colo do útero, vulva, pênis e canal anal; no entanto, indivíduos que
relataram história de câncer de esôfago na familia de primeiro grau apresentaram risco 4
vezes maior de desenvolver câncer de esôfago em relação àqueles que não tinham história
de câncer de esôfago em familiares de primeiro grau.
Tabela 21 - Comparação entre os grupos de estudo (casos e controles) e Odds Ratio bruta
com intervalo de confiança (IC 95%) em relação às caracteristicas de história de câncer na
família que podem estar relacionados ao HPV. Hospital de Câncer de Barretos e Ambulatório
Médico de Especialidades de Barretos, 2014.
Variável
Categoria
Caso
n
Esôfago (1º grau)
Não
81
Sim
14
%
Controle
n
%
B
P
3
OR
[IC 95%]
OR
[IC 95%]
85,3
14,7
94
4
95,9
4,1
0,013
1
4,06 [1,28 : 12,83]
1
3,34 [1,41 : 7,92]
Esôfago (2º e 3º grau)
Não
87
93,5
Sim
6
6,5
97
1
99,0
1,0
0,060
1
6,69 [0,79 : 56,67]
1
5,61 [0,65 : 48,26]
Cabeça e pescoço
Não
80
Sim
13
86,0
14,0
89
9
90,8
9,2
0,367
1
1,60 [0,65 : 3,96]
1
1,72 [0,67 : 4,41]
Colo de útero
Não
88
Sim
5
94,6
5,4
94
4
95,9
4,1
0,742
1
1,33 : 0,34 : 5,13]
1
1,69 [0,40 : 7,09]
Vulva
Não
Sim
93
0
100,0
0,0
98
0
100,0
0,0
NA
1
NA
1
NA
Pênis
Não
Sim
92
1
98,9
1,1
98
0
100,0
0,0
0,487
1
NA
1
NA
Anal
Não
Sim
93
0
100,0
0,0
97
1
99,0
1,0
1,000
1
NA
1
NA
Total
101
100
101
100
B
3
OR : Odds Ratio Bruta | OR : Odds Ratio ajustado por álcool e tabaco
- Casos com valores ignorados foram removidos da análise:Esôfago (1º grau) (9); Esôfago (2º e 3º grau) (11); Cabeça e
pescoço (11); Colo de útero (11); Vulva (11); Pênis (11) e Anal (11).
- NA = Não analisado pela falta de informação suficiente.
45
5 DISCUSSÃO
Nossos resultados sugerem que o HPV do tipo 16 não tem participação na carcinogênese do
CEC de esôfago. Pode-se observar a presença do HPV-16 na mucosa esofágica, porém não
parece ter o mesmo significado causal que no carcinoma da cérvix-uterina, por exemplo. A
diferença mais marcante observada foi a alta prevalência de DNA de HPV-16 entre os
indivíduos sem câncer, que foi sete vezes maior do que a observada entre os indivíduos com
CEC de esôfago. O significado biológico deste resultado está distante de ser entendido pelo
desenho desse estudo. Entretanto, é muito interessante e suscita indagações bastante
estimulantes sobre o comportamento do HPV-16 no tecido esofágico. Diversos fatores de
risco foram avaliados, principalmente aqueles sabiamente conhecidos para a infecção por
HPV, e surpreendentemente, apenas escolaridade de nível médio ou superior foi associada
como um possível fator de risco para a presença de DNA de HPV-16 na mucosa esofágica.
História de sexo oral não foi uma variável discriminatória, o que revela que para casos e
controles, a presença de DNA de HPV-16 pode ser uma constante independente do
significado da eventual lesão. Observou-se que consumo de álcool, exposição ativa ao
tabaco ainda prevalecem como os clássicos fatores de risco para o desenvolvimento do CEC
de esôfago e observou-se que história prévia de câncer de esôfago em familiares de primeiro
grau também pode ser também, um fator de risco.
Este foi um estudo observacional do tipo caso controle, cujo delineamento é utilizado
geralmente para doenças de evolução lenta e permite avaliar vários fatores de risco para
determinado desfecho
90
. Há grandes vantagens em se realizar estudos com esse tipo de
delineamento, pois os resultados podem ser obtidos rapidamente; é de baixo custo quando
comparado a estudos de coorte com coleta prospectiva dos dados; múltiplos fatores de risco
podem ser investigados simultaneamente; o número de participantes em cada grupo pode
ser pequeno e não há necessidade de acompanhamento dos indivíduos. No entanto, estão
sujeitos a críticas pois podem apresentar limitações no que se diz respeito à seleção do
grupo controle e também, a interpretação dos resultados pode ser dificultada pela presença
de fatores de confundimento 91.
Variáveis relacionadas às características sociodemográficas, de ocupação, de exposição
ao álcool e ao tabaco (ativo e passivo), hábitos sexuais, história prévia de doenças
sexualmente transmissíveis e história de câncer na família foram investigadas
46
simultaneamente. Para que a qualidade da informação fosse observada e para evitar vieses
de aferição durante a entrevista, um instrumento padronizado de coleta de dados foi
elaborado e todas as entrevistas foram conduzidas por apenas dois membros previamente
treinados do Grupo de Pesquisas em HPV do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio
XII.
A seleção dos participantes do grupo “caso” ocorreu no ambulatório de Cirurgia do
Aparelho Digestivo Alto e no Departamento de Endoscopia do HCB-FPXII. Por se tratar de
uma instituição especializada exclusivamente em atendimento oncológico, houve a
necessidade de se incluir os participantes do grupo “controle” no Departamento de
Endoscopia do Ambulatório Médico de Especialidades do município de Barretos. Para
balancear esta divergência de centros e para tornar os grupos homogêneos, foi realizado o
pareamento dos participantes da pesquisa por sexo e idade (± 3 anos). Apesar de todo
esforço, somente após análise dos dados, constatou-se aparente diferenças entre
proveniência: urbana (dos controles) vs rural (dos casos). Fato este que pode ter sido fator
de confundimento para algumas variáveis analisadas. Ao que parece, os controles não foram
oriundos da mesma população de onde foram provenientes os casos.
Atualmente, várias técnicas moleculares para a detecção de HPV têm sido utilizadas,
como Captura Híbrida (CH), Hibridização in situ (HIS) e Reação por Cadeia de Polimerase
(PCR). No presente estudo, a PCR em tempo real foi escolhida para realização da detecção
de HPV-16 pois trata-se de uma técnica que possui controles internos individuais para cada
amostra, minimizando resultados falso-negativos. A técnica de PCR em tempo real apresenta
ainda valor preditivo negativo superior a 99% e sensibilidade superior a 90% para detecção
de HPV, além de fornecer resultados de modo quantitativo 92.
Grande quantidade dos estudos publicados sobre a temática, refletem resultados de
coletas retrospectivas de amostras e quase nunca reportam informações relacionadas à
população. O diferencial deste estudo foi a coleta prospectiva das amostras, que permite a
seleção rigorosa da área de biópsia e a amplitude dos fatores que puderam ser avaliados.
O primeiro objetivo específico deste estudo foi comparar a prevalência de DNA de
HPV-16 no esôfago de indíviduos com e sem CEC de esôfago, sendo observada maior
prevalência entre os controles do que nos casos.
No mundo, vários relatos têm descrito desde a inexistência do vírus
prevalências tão altas como 100%
75
57, 70, 73, 78, 93
até
no CEC de esôfago. Em controles há estudos que
47
também relatam a inexistência do vírus
prevalência que chegam a 59%
75
60, 63, 67-71, 73
e outros relatam altas taxas de
. Deve-se levar em consideração que esta variação na
prevalência pode ser explicada por múltiplos fatores, como a diferença metodológica
utilizada, o número dos casos analisados, bem como diferenças ambientais, geográficas e
demográficas das populações avaliadas 21, 52, 94-98
No Brasil, a prevalência de HPV em CEC de esôfago pôde ser observada em quatro
estudos, variando de 0% à 16% 57, 60, 61, 99. Em indivíduos sem câncer, a prevalência pôde ser
avaliada em três estudos, variando de 0% a 10.0% 57, 60, 61. Em 2003, foi publicado o primeiro
estudo realizado no Brasil sobre o tema por Weston e Prolla, que avaliaram 40 indivíduos
com CEC de esôfago e 10 indivíduos controles. A inclusão dos participantes aconteceu em
um hospital localizado na região Sul do país, entre 1999 e 2000. Entre os casos, foram
obtidas amostras biológicas por meio de biópsia endoscópica em 20 casos e por peças
cirúrgicas nos outros 20 casos. Entre os controles, foram obtidas amostras a partir de
biópsias endoscópicas. A técnica utilizada para a detecção do HPV foi a Captura Híbrida e os
resultados foram apresentados para HPV de baixo e alto risco. Houve uma amostra positiva
para DNA de HPV de baixo risco entre os casos, totalizando prevalência de 2,5%; e houve um
controle positivo de DNA de HPV de alto risco, resultando prevalência de 10%. Os autores
concluíram que os achados para HPV de alto risco pareceu ter sido uma descoberta
ocasional 61.
Em 2006, Souto-Damin e colaboradores investigaram retrospectivamente a presença
de DNA de HPV em 175 amostras cirúrgicas de CEC de esôfago e 26 amostras de mucosa
esofágica livre de neoplasia, que foram utilizadas como controle, em um hospital também da
região Sul do país. Foi realizado a PCR convencional utilizando-se o primer consenso
GP5+/GP6+, e primers específicos para os HPVs do tipo 16 e 18. A prevalência de DNA de
HPV observada entre as amostras de CEC de esôfago foi de 16%; enquanto nas amostras
controle foi de 0%. Ainda, entre as amostras positivas, 96% eram do tipo 16 e 4% do tipo 18.
A partir dos resultados obtidos, os autores concluíram que DNA de HPV não ocorre em
controles sem neoplasia e sugeriram que a presença do HPV não é meramente incidental em
CEC de esófago, e que os HPVs, principalmente do tipo 16, pode ser um cofator potencial no
desenvolvimento do fenótipo maligno do esôfago 60.
Herbster e colaboradores avaliaram 264 amostras de pacientes com CEC de esôfago
procedentes de 4 hospitais, sendo 3 deles situados na região Sudeste e 1 situado na região
48
Sul do país, através da utilização da PCR convencional utilizando primer consenso
GP5+/GP6+ e confirmados por imunohistoquímica. Foi observado prevalência global de 13%;
e quando estratificada por região geográfica, a prevalência para a região Sul foi de 23% e a
prevalência observada na região Sudeste foi de 8%. Entre os casos positivos, o HPV-16 foi o
tipo mais prevalente, estando presente em 79% dos casos da região Sul e em 67% nos casos
da Região Sudeste 99.
Prolla e colaboradores, analisaram 189 amostras de três grupos diferentes: 1) 102
amostras de 51 pacientes com CEC de esôfago, sendo um fragmento da mucosa esofágica
normal e um fragmento do tumor; 2) 50 amostras de 37 pacientes com CEC de cabeça e
pescoço; 3) 37 amostras de mucosa esofágica de 37 pacientes com dispepsia não expostos a
tabaco e a álcool. As amostras fixadas em formalina e armazenadas em blocos de parafina, e
foram submetidas à detecção do DNA de HPV foi realizada por PCR convencional utilizando
os primers MY09 / MY11 e GP5+. DNA de HPV foi negativo em todas as amostras testadas.
Os autores concluiram que não há nenhuma evidência que o HPV está envolvido com a
carcinogênese do CEC de esôfago no Sul do Brasil 57.
Os estudos brasileiros têm em comum o fato de terem sido todos retrospectivos, com
técnicas de identificação de HPV distintas e com resultados bastante conflitantes. Não
parece haver em nenhum deles dados que corroborem a premissa do HPV estar de alguma
forma envolvido com a carcionogênese do esôfago, o que suporta, em parte, nossos
achados. Por outro lado, o grupo controle de nosso estudo foi significativamente mais
positivo para HPV do que os demais estudos. A alta sensibilidade do método utilizado e o
rigoroso controle das amostras colhidas prospectivamente podem ser variáveis
determinantes para explicar essas diferenças. É importante enfatizar, contudo, que, no
Brasil, o HPV no contexto do câncer esofágico, não tem a mesmo significado que em outros
países, como a China, por exemplo. No entanto, devemos levar em consideração que para
este estudo, foi testado apenas um subtipo de HPV, o 16, e como proposto em outro estudo,
outros subtipos de alto e baixo risco tumorigênico, podem estar associados ao CEC de
esôfago 89.
A prevalência do HPV observada entre os casos é baixa comparada a dados mundiais
acumulados até o momento, contudo refletem e corroboram com os resultados descritos na
literatura brasileira. Estudos realizados na África do Sul, Índia, Grécia e Japão encontraram
prevalências semelhantes variando entre 15% e 25% 62, 64, 65, 74. Em indivíduos sem neoplasia,
49
no entanto, nota-se maior taxa de prevalência quando comparado apenas aos dados
publicados na literatura brasileira até o momento 57, 60, 61.
Tem sido descritos três formas da infecção pelo HPV: clínica, subclínica e latente. A
forma latente do vírus apenas pode ser diagnosticada por técnicas moleculares, sendo o
DNA do HPV detectado 100. Portanto, espera-se que esta tenha sido a forma encontrada nos
controles neste estudo. Os mecanismos pelo qual o HPV permanece neste estado de latência
ainda permanecem desconhecidos, mas acredita-se que fatores imunológicos sejam
determinantes para esta condição. Com frequência, o HPV pode regredir espontaneamente,
mas, também ainda não há conhecimento a respeito do tempo que o vírus é capaz de
permanecer neste estado, e nem qual a taxa de progressão desta forma de latência para as
demais 101.
Para outros sítios anatômicos, as prevalências de HPV em indivíduos sem doença,
também é bastante variável. A prevalência global estimada de HPV no colo uterino com
resultados citológicos normais é de 11,7%. Este dado foi obtido a partir da avaliação de um
milhão de mulheres incluídas em 194 estudos reunidos em um meta-análise. Quando este
resultado foi estratificado por continentes observou-se maior prevalência de HPV na África
Subsaariana (24%), Europa Oriental (21,4%) e América Latina (16,1%)
102
. A prevalência
mundial de infecção genital causada pelo HPV é de 9 a 13%, segundo dados da Organização
Mundial da Saúde
103
. Já para cabeça e pescoço, a prevalência de HPV em indivíduos sem
câncer é de 5 a 10 vezes menor do que a prevalência no colo uterino
104
. Dados de uma
população americana de indivíduos sem câncer com idade entre 14 e 59 anos detectou
prevalência de 7% para HPV em cabeça e pescoço 105.
O epitélio escamoso do esôfago está diretamente ligado à mucosa oral e devido a
associação entre o HPV e o câncer de orofaringe e cavidade oral, um estudo suéco teve
como hipótese que existiria maior prevalência de HPV na região proximal comparado à
região distal; no entanto, não foi observado associação entre a presença do vírus e a região
anatômica
106
. Um estudo brasileiro observou que tumores HPV positivos apresentaram
maior frequência na região distal (39%) e menor frequência na região proximal (9%) do
esôfago, quando comparado ao HPV ESCCs negativos
99
. No presente estudo avaliou-se a
presença de DNA de HPV-16 na região distal e proximal apenas nos grupo controle, já que
nos casos a localização de interesse era a tumoral, que poderia estar localizada em qualquer
50
região anatômica do esôfago. A prevalência do vírus observada na região proximal foi de
13,9% e na região distal foi de 11,9% e não houve diferença estatística entre as prevalências.
O segundo objetivo específico foi comparar os indivíduos com e sem presença de DNA
de HPV-16 em relação às características sociodemográficas e os fatores de risco conhecidos
para o câncer de esôfago e para a infecção do HPV.
A idade média dos indivíduos positivos e negativos para a infecção pelo HPV não foi
diferente nesse estudo, em que se considerou indivíduos com e sem CEC de esôfago. Este
resultado é semelhante com outro estudo realizado apenas com indivíduos diagnosticados
com CEC de esôfago, procedentes das regiões Sul e Sudeste do Brasil 99.
Uma maior incidência de infecção por HPV na região cervical é observado em
pacientes mais jovens e há uma clara tendência para a redução das taxas de infecção por
HPV com a progressão da idade 107. Zhang e colaboradores (2010), relataram que a infecção
pelo HPV no esôfago foi observada principalmente em pacientes com idade entre 35 e 47
anos em uma população chinesa 98. Em nosso estudo a média de idade obtida em indivíduos
com a infecção pelo HPV foi de 58 anos. Como a maioria dos casos positivos para HPV faziam
parte do grupo controle, este dado pode estar influenciado pelo pareamento que foi
alinhado aos casos.
DNA de HPV-16 foi mais frequente em indivíduos com escolaridade de nível médio ou
superior neste estudo. Não foram encontrados dados na literatura acerca deste ponto.
Entretanto, nossos dados divergem de um estudo caso-controle brasileiro, realizado em
mulheres com e sem a infecção cervical pelo HPV, que concluiu que nível médio ou superior
de escolaridade não está associado à infecção por HPV oncogênico 107.
Notou-se uma discreta redução do consumo de álcool e de tabaco entre os indivíduos
HPV-16 positivos, mas não houve diferença estatística. Interessantemente, essa redução foi
observada em um outro estudo brasileiro realizado apenas com pacientes portadores de CEC
de esôfago 99. Um estudo Chinês, contudo, observou que em indivíduos com CEC de esôfago
as taxas de infecção por HPV em pacientes que fumavam eram 3,27 vezes maior do que em
pacientes não-fumantes, e que as taxas em pacientes que não consumiam álcool versus
àqueles que consumiam eram semelhantes
98
. O consumo de bebidas destiladas foi
observado neste estudo como fator protetor para a presença de DNA de HPV-16 na mucosa
esofágica, o que parece ser um fator de confundimento, já que os pacientes com CEC de
51
esôfago em sua maioria fazem parte do grupo sem infecção pelo HPV-16 e consomem mais
destilados.
Infecções por HPV estão associadas com o número de parceiros sexuais, o que é
indicativo de transmissão sexual 107. Os hábitos sexuais considerados de risco para a infecção
anogenial do HPV, não mostraram ter relação com a presença de DNA de HPV-16 na mucosa
esofágica.
O terceiro objetivo específico foi comparar os indivíduos com e sem câncer em relação
às características sociodemográficas e os fatores de risco conhecidos para o câncer de
esôfago e para a infecção por HPV.
A respeito da localização de moradia, nosso estudo observou que a zona urbana pode
ter função na proteção do desenvolvimento do CEC de esôfago. Este resultado pode ter sido
influenciado por fatores de confundimento, como hábitos de vida e alimentares, que são
sabidamente desiguais entre zona rural e zona urbana.
O consumo de álcool foi considerado um importante fator de risco para o CEC de
esôfago, principalmente quando observado, isoladamente, o consumo de destilados. A
Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC) classifica o consumo de álcool como
uma causa conhecida do CE
108
e estudos ecológicos e de caso controle clássicos
estabeleceram que o álcool tem um forte papel causal no desenvolvimento do CEC de
esôfago na maioria das regiões do mundo 109-112. Quando usado em quantidades excessivas,
o álcool tem sido, quase que universalmente, associado com um aumento do risco entre 3 e
5 vezes 83, 113. Fato este, que também pode ser observado a partir das avaliações realizadas
nesse estudo. Por mais que não restem dúvidas da importância do álcool no
desenvolvimento do CEC de esôfago, atualmente ainda não se sabe seu exato mecanismo
carcinogênico, pois o próprio álcool não se liga ao DNA, não é mutagênico, e não causa
câncer em animais 114.
O uso do tabaco também foi considerado fator de risco para o CEC de esôfago nesse
estudo, principalmente quando observamos isoladamente o fumo de cigarro de palha.
Podemos observar também o chamado “efeito dose-resposta”, em que o risco aumentou
conforme a quantidade consumida. O risco para CEC de esôfago pode ser aumentado em
cerca de 3 a 7 vezes em fumantes atuais
113, 115-117
e em nosso estudo foi observado este
efeito, já que o risco em fumantes atuais foi de 3 vezes em relação aos que nunca fumaram.
52
A diferença encontrada entre os grupos do estudo para a prática de sexo oral ativo,
pode estar relacionada ao viés de seleção da população controle. Por mais que tenha sido
pareado por sexo e idade a fim da homogenização dos grupos, observa-se notoriamente que
o grupo controle é mais urbanizado, o que, a despeito de potenciais polêmicas, pode ter
refletido diretamente nos hábitos sexuais obtidos neste estudo.
Encontramos risco aumentado em indivíduos que relataram ter história de câncer de
esôfago em familiares de primeiro grau. Este risco pode estar influenciados pelos hábitos de
consumo de álcool e tabaco, que podem ser culturalmente transmitidos por convívio
familiar.
53
6 CONCLUSÕES
1- A prevalência de HPV-16 observada em indivíduos com câncer de esôfago foi de 3,0% e
em indivíduos sem câncer, 20,8%.
2- Na comparação entre indivíduos com e sem infecção pelo HPV-16 pode-se observar
que indivíduos com escolaridade de nível médio ou superior apresentaram risco
aumentado para a infecção pelo HPV-16.
3- Na comparação entre indivíduos com e sem câncer de esôfago pode-se observar que o
consumo de álcool, a exposição ativa ao tabaco e história prévia de câncer de esôfago em
familiares de primeiro grau apresentaram risco aumentado para o CEC de esôfago.
54
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68
ANEXOS
Anexo 1 - Carta de aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa
69
70
Anexo2 -Termo de consentimento livre e esclarecido - Casos
Identificação do paciente
Prezado (a) _____________________________________
Esta pesquisa irá avaliar a presença do Papilomavírus humano (HPV), inflamação e de
uma seleção de moléculas no desenvolvimento do câncer de esôfago. O (A) senhor (a)
não será submetido a algum tipo de exame diferente daquele que o médico solicitou
para diagnóstico do caso. Caso o (a) senhor (a) aceite participar da pesquisa, o (a)
senhor (a) terá que responder um questionário com informações sobre diferentes
aspectos de sua vida que podem contribuir para o entendimento das causas de câncer
de esôfago. Quando a endoscopia for solicitada, além da coleta de fragmentos
tumorais para o diagnóstico da doença, o (a) senhor (a) será submetido a um processo
indolor em que uma escova será utilizada para captar as células da superfície do
esôfago e assim permitir o diagnóstico. Em caso de cirurgia para retirada do tumor
esofágico, será feita uma raspagem na peça retirada para a obtenção de células que
serão analisadas na pesquisa em pauta. Todas as informações serão mantidas em
segredo pelos pesquisadores.Garantia de esclarecimento, liberdade de recusa e
garantia de sigilo:o Senhor/Senhora será esclarecido sobre esta pesquisa em tudo que
desejar. O Senhor/Senhora é livre para recusar participar deste estudo e poderá retirar
o seu consentimento ou interromper a participação a qualquer momento. Isto não
acarretará em qualquer alteração ou prejuízo no tratamento médico no Hospital de
Câncer de Barretos.Sua identidade será mantida em sigilo completo e absoluto, não
sendo revelado o seu nome (ou qualquer informação que possa identificá-lo
publicamente) em hipótese alguma. Uma cópia deste consentimento informado será
enviada aos arquivos do estudo e a outra será de sua posse. Custos da participação,
ressarcimento e indenização por eventuais danos:a participação no estudo não
acarretará custos e não será disponível nenhuma compensação financeira adicional.
Não há indenização monetária para este estudo.
71
DECLARAÇÃO DO PARTICIPANTE OU DO RESPONSÁVEL PELO PARTICIPANTE:
Eu, _____________________________________________________ fui informado dos
objetivos da pesquisa acima, de maneira clara e detalhada e esclareci minhas dúvidas.
Sei que em qualquer momento poderei solicitar novas informações e motivar minha
decisão se assim o desejar.
O (A) __________________________________________________ me explicou o
estudo, respondeu minhas dúvidas e me certificou de que todos os dados desta
pesquisa serão confidenciais.
Declaro que concordo em participar desse estudo. Recebi uma cópia deste termo de
consentimento livre e esclarecido e me foi dada a oportunidade de ler e esclarecer as
todas as minhas dúvidas.Para sugestões, reclamações ou dúvidas, poderei contatar:
17-3321-6600, com Dr. Adhemar Longatto Filho, pesquisadores responsáveis pelo
projeto no Hospital de Barretos (RAMAL 7075 e 7069), ou com o presidente do Comitê
de Ética em Pesquisa do Hospital de Câncer de Barretos (RAMAL 6894).
_______________________________________________________________________
Nome do (a) voluntário (a)
_______________________________________________Data: _____ / _____ / _____
Assinatura do (a) voluntário (a)
_______________________________________________________________________
Nome do Aplicador do Termo de Consentimento
_______________________________________________Data: _____ / _____ / _____
Assinatura do Aplicador do Termo de Consentimento
_______________________________________________________________________
Nome do (a) representante legal (grau de parentesco)
________________________________________________ Data: _____ / ____ /_____
Assinatura do (a) representante legal
Quando esse termo for assinado pelo representante legal, precisará assinar também
uma testemunha.
_______________________________________________________________________
Nome da Testemunha
_______________________________________________Data: _____ / _____ / _____
Assinatura da Testemunha
72
Anexo 3 -Termo de consentimento livre e esclarecido – Controles
Identificação do paciente
Prezado (a) _____________________________________
Esta pesquisa irá avaliar a presença do Papilomavírus humano (HPV), inflamação de
uma seleção de moléculas no desenvolvimento do câncer de esôfago. O (A) senhor (a)
não será submetido a algum tipo de exame diferente daquele que o médico solicitou
para diagnóstico do caso. Caso o (a) senhor (a) aceite participar da pesquisa, o (a)
senhor (a) terá que responder um questionário com informações sobre diferentes
aspectos de sua vida que podem contribuir para o entendimento das causas de câncer
de esôfago. Quando a endoscopia for solicitada, além da coleta de fragmentos para o
diagnóstico da doença, o (a) senhor (a) será submetido a um processo indolor em que
uma escova será utilizada para captar as células da superfície do esôfago e assim
permitir o diagnóstico. Todas as informações serão mantidas em segredo pelos
pesquisadores.Garantia de esclarecimento, liberdade de recusa e garantia de sigilo:o
Senhor/Senhora será esclarecido sobre esta pesquisa em tudo que desejar. O
Senhor/Senhora é livre para recusar participar deste estudo e poderá retirar o seu
consentimento ou interromper a participação a qualquer momento. Isto não
acarretará em qualquer alteração ou prejuízo no tratamento médico no Hospital de
Câncer de Barretos.Sua identidade será mantida em sigilo completo e absoluto, não
sendo revelado o seu nome (ou qualquer informação que possa identificá-lo
publicamente) em hipótese alguma. Uma cópia deste consentimento informado será
enviada aos arquivos do estudo e a outra será de sua posse. Custos da participação,
ressarcimento e indenização por eventuais danos:a participação no estudo não
acarretará custos e não será disponível nenhuma compensação financeira adicional.
Não há indenização monetária para este estudo.
73
DECLARAÇÃO DO PARTICIPANTE OU DO RESPONSÁVEL PELO PARTICIPANTE:
Eu, _____________________________________________________ fui informado dos
objetivos da pesquisa acima, de maneira clara e detalhada e esclareci minhas dúvidas.
Sei que em qualquer momento poderei solicitar novas informações e motivar minha
decisão se assim o desejar.
O (A) __________________________________________________ me explicou o
estudo, respondeu minhas dúvidas e me certificou de que todos os dados desta
pesquisa serão confidenciais.
Declaro que concordo em participar desse estudo. Recebi uma cópia deste termo de
consentimento livre e esclarecido e me foi dada a oportunidade de ler e esclarecer as
todas as minhas dúvidas. Para sugestões, reclamações ou dúvidas, poderei contatar:
17-3321-6600, com Dr. Adhemar Longatto Filho, pesquisadores responsáveis pelo
projeto no Hospital de Barretos (RAMAL 7075 e 7069), ou com o presidente do Comitê
de Ética em Pesquisa do Hospital de Câncer de Barretos (RAMAL 6894).
_______________________________________________________________________
Nome do (a) voluntário (a)
_______________________________________________Data: _____ / _____ / _____
Assinatura do (a) voluntário (a)
_______________________________________________________________________
Nome do Aplicador do Termo de Consentimento
_______________________________________________Data: _____ / _____ / _____
Assinatura do Aplicador do Termo de Consentimento
_______________________________________________________________________
Nome do (a) representante legal (grau de parentesco)
________________________________________________ Data: _____ / ____ /_____
Assinatura do (a) representante legal
Quando esse termo for assinado pelo representante legal, precisará assinar também
uma testemunha.
_______________________________________________________________________
Nome da Testemunha
_______________________________________________Data: _____ / _____ / _____
Assinatura da Testemunha
74
Anexo 4 - Instrumento de coleta de dados
1
Identificação
2
Nome
3
Registro hospitalar
4
Grupo
1- Caso; 2- Controle
INFORMAÇÕES GERAIS
5
6
7
8
Data de nascimento
DD-MM-AAAA
Sexo
1- Feminino; 2- Masculino
Qual a sua raça (cor da pele)?
1- Branco; 2- Negro; 3- Pardo ou Mulato; 4- Amarelo (Asiático); 5-Indígena
Estado civil
1- Solteiro; 2- Casado / Amasiado; 3- Separado / Divorciado; 4-Viúvo
Escolaridade
0- Analfabeto; 1- Sabe ler e escrever;
2- Ensino fundamental incompleto; 3- Ensino fundamental completo;
4- Ensino médio incompleto; 5- Ensino médio completo;
6- Ensino superior incompleto; 7- Ensino superior completo
9
10
Ocupação / Profissão exercida por mais tempo
11
Ocupação / Profissão - Tempo
12
13
14
15
16
ESPECIFICAR
ANOS
Morou/Mora em zona rural
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Se sim, por quanto tempo?
ANOS
Exposição a pesticidas e inseticidas
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Morou/Mora em zona urbana
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Se sim, por quanto tempo?
ANOS
ESTILO DE VIDA
17
18
Álcool
0- Nunca; 1- Sim, ainda bebe (se parou nos últimos 12 meses); 3- Só no passado
Cerveja
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
19
Idade de início
20
Idade que parou
ANOS
ANOS
Unidade
21
22
23
24
1- Copo pequeno – 50 ml; 2- Copo médio – 100 ml;
3- Copo grande – 250 ml½ ou garrafa pequena – 330 ml; 4- Garrafa – 700-750 ml; 5- Garrafa – 1 L
Quantas unidades consome
Por
1- Dia; 2- Semana; 3-Mês; 4-Ano
Vinho
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
25
Idade de início
26
Idade que parou
ANOS
ANOS
Unidade
27
28
29
1- Copo pequeno – 50 ml; 2- Copo médio – 100 ml;
3- Copo grande – 250 ml½ ou garrafa pequena – 330 ml; 4- Garrafa – 700-750 ml; 5- Garrafa – 1 L
Quantas unidades consome
Por
1- Dia; 2- Semana; 3-Mês; 4-Ano
75
30
Cachaça
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
31
Idade de início
32
Idade que parou
ANOS
ANOS
Unidade
33
34
35
36
37
1- Copo pequeno – 50 ml; 2- Copo médio – 100 ml;
3- Copo grande – 250 ml½ ou garrafa pequena – 330 ml;4- Garrafa – 700-750 ml; 5- Garrafa – 1 L
Quantas unidades consome
Por
1- Dia; 2- Semana; 3-Mês; 4-Ano
Tabaco
0- Não; 1- Sim, atualmente, 2- Sim, passado
Cigarro de filtro
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
38
Número por dia
39
Idade de início
40
Idade que parou
41
NÚMERO
ANOS
ANOS
Cigarro de palha
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
42
Número por dia
43
Idade de início
44
Idade que parou
45
NÚMERO
ANOS
ANOS
Cachimbo
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
46
Número por dia
47
Idade de início
48
Idade que parou
49
NÚMERO
ANOS
ANOS
Charuto
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
50
Número por dia
51
Idade de início
52
Idade que parou
NÚMERO
ANOS
ANOS
EXPOSIÇÃO PASSIVA À FUMAÇA DE CIGARRO
53
Você esteve casado (ou vivendo junto) com um fumante?
0- Não; 1- Sim; 2- Não lembra; 99-Ignorado
54
Idade quando cônjuge iniciou
55
Idade quando o cônjuge parou
56
Número de horas que estava exposto durante a semana
57
Número de horas que estava exposto aos fins de semanas
58
Você trabalhou em um lugar fechado onde as pessoas fumassem?
0- Não; 1- Sim; 2- Não lembra; 99-Ignorado
59
Idade quando iniciou o trabalho com fumantes
60
Idade quando parou de trabalhar com fumantes
61
Número de horas/dia que estava exposto
62
Número de horas que fumava em sua presença
76
63
64
65
66
67
68
69
Quando criança, seu pai ou sua mãe fumavam?
0- Não; 1- Sim; 2- Não lembra; 99-Ignorado
Por quanto tempo foi exposto?
ANOS
Pratica atividade física?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Se sim, qual a frequência por semana?
1-7
Quanto tempo por dia?
0- Menos de 30'; 1- pelo menos 30'; 2- pelo menos 60'; 3- não lembra; 99-Ignorado
Faz exposição ao sol entre 10 da manhã e 16 h?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Se sim, usa roupa apropriada e protetor solar?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
HÁBITOS ALIMENTARES E MEDIDAS ANTROPOMÉTRICAS
De maneira geral, com qual frequência você ingere...
Legumes e verduras?
70
0- Nunca; 1- Menos que uma vez por mês; 3- 1-3 vezes por mês; 4- Uma ou duas vezes por semana;
5- Na maioria dos dias, mas não todos os dias; 6- Todos os dias
Folhas e vegetais?
71
0- Nunca; 1- Menos que uma vez por mês; 3- 1-3 vezes por mês; 4- Uma ou duas vezes por semana;
5- Na maioria dos dias, mas não todos os dias; 6- Todos os dias
Frutas frescas?
72
0- Nunca; 1- Menos que uma vez por mês; 3- 1-3 vezes por mês; 4- Uma ou duas vezes por semana;
5- Na maioria dos dias, mas não todos os dias; 6- Todos os dias
Carne vermelha, ovo e leite
73
0- Nunca; 1- Menos que uma vez por mês; 3- 1-3 vezes por mês; 4- Uma ou duas vezes por semana;
5- Na maioria dos dias, mas não todos os dias; 6- Todos os dias
Enlatados?
74
0- Nunca; 1- Menos que uma vez por mês; 3- 1-3 vezes por mês; 4- Uma ou duas vezes por semana;
5- Na maioria dos dias, mas não todos os dias; 6- Todos os dias
Congelados?
75
0- Nunca; 1- Menos que uma vez por mês; 3- 1-3 vezes por mês; 4- Uma ou duas vezes por semana;
5- Na maioria dos dias, mas não todos os dias; 6- Todos os dias
Grãos? (ex. milho)
76
77
0- Nunca; 1- Menos que uma vez por mês; 3- 1-3 vezes por mês; 4- Uma ou duas vezes por semana;
5- Na maioria dos dias, mas não todos os dias; 6- Todos os dias
Bebidas quentes (Ex. Chimarrão, Café, Chá)
0- Nunca; 1- Sim, atualmente; 2- Sim, passado
78
Peso
79
Altura
KILOS
METROS
HISTÓRICO DE HÁBITOS SEXUAIS
80
Você já teve alguma doença sexualmente transmissível, diagnosticada por um médico
ou profissional de saúde?
0- Não; 1- Sim; 2- Não sabe; 3- Não quer responder; 99-Ignorado
81
82
83
84
85
86
87
88
Verrugas genitais?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Herpes genital?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Hepatite B?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Hepatite C?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
HIV?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
HPV?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Em toda a sua vida, você já teve relação sexual (vaginal, ou oral, ou anal) com alguém?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Qual a idade da sua primeira relação sexual?
ANOS
77
89
90
91
92
93
94
95
Em toda a sua vida, com quantas pessoas você teve relação sexual?
1- 2-5; 2- 6-10; 3- 11-20; 4- 21-50; 5- 51-100; 6- Mais de 100; 99-Ignorado
Você já fez sexo colocando sua boca nos genitais do(a) parceiro(a) (sexo oral ativo)?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Quantos anos você tinha quando fez sexo oral em alguém pela primeira vez?
ANOS
Com que frequência você faz ou fazia sexo oral no(a) parceiro(a)?
0- Nunca; 1- Raramente; 2- Frequentemente; 3- Sempre; 99-Ignorado
Qual era o sexo das pessoas em quem você fez sexo oral?
1- Mulheres; 2- Homens; 3- Homens e Mulheres; 88- Não se aplica; 99-Ignorado
Você já fez sexo colocando sua boca no ânus do parceiro?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Você já fez sexo colocando seus genitais na boca do parceiro (sexo oral passivo)?
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
HISTÓRICO DE CÂNCER NA FAMÍLIA
96
97
98
99
100
101
102
História de câncer de esôfago em famíliares de 1º Grau (Pais, Irmãos e Filhos)
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
História de câncer cabeça e pescoço na família
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
História de câncer de esôfago na família
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
História de câncer de colo de útero na família
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
História de câncer de vulva na família
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
História de câncer de pênis na família
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
História de câncer anal na família
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
COMORBIDADES
103
104
105
106
Chagas
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Se sim, megaesôfago chagásico
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Refluxo gastresofágico
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
Esôfago de Barret
0- Não; 1- Sim; 99-Ignorado
78
Anexo 5 - Instrumento de coleta de dados clínicos
DADOS CLÍNICOS
1
2
3
4
5
6
Data do diagnóstico
DD-MM-AAAA
Grau histológico
1- Bem diferenciado; 2- Moderadamente diferenciado; 3- Pouco diferenciado; 99- Ignorado
Estadiamento T
0- T0; 1- T1; 2- T2; 3- T3; 4- T4; 99- Tx
Estadiamento N
0- N0; 1- N1; 99- Nx
Estadiamento M
0- M0; 1- M1; 2- M1a; 3- M1b; 99- Mx
Estadiamento TNM agrupado
0- 0; 1- I; 2- IIA; 3- IIB; 4- III; 5- IV; 6- IVA; 7- IVB; 99-Ignorado
79
Anexo 6 - Termo de aceitação de apoio financeiro – CNPq
80
81
82
83
Anexo 7 - Artigo a ser submetido
Prevalence of HPV-16 DNA in normal esophagus: is HPV a esophagean cancer risk
factor? A cross-sectional study from southeastern of Brazil
Allini Mafra da Costa1,2
Kari Juhani Syrjänen5
Paula Roberta Aguiar Pastrez3
Vânia Sammartino Mariano3
Said Adala Zemi Neto4
José Humberto Tavares Guerreiro Fregnani5
Adhemar Longatto-Filho3,6,7,8,9, 10*
1
Hospital-based Cancer Registry, Barretos Cancer Hospital, 14784-400 Barretos, São
Paulo, Brazil
2
Population-based Cancer Registry, 14784-400 Barretos, São Paulo, Brazil
3
Molecular Oncology Research Center, Barretos Cancer Hospital, 14784-400 Barretos,
São Paulo, Brazil
4
Department of Endoscopy, Ambulatório Médico de Especialidades, 14780-000
Barretos, São Paulo, Brazil
5
Institute of Education and Research, Barretos Cancer Hospital, 14784-400 Barretos,
São Paulo, Brazil
6
Department od Clinical Research - Biohit Oyj, Finland
7
Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), School of Health Sciences,
University of Minho, 4710-057 Braga, Portugal
8
ICVS/3B’s - PT Government Associate Laboratory, 4710-057 Braga/Guimarães,
Portugal
9
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia do HPV (INCT-HPV), 1221-020 Sao Paulo,
Brazil
10
Laboratory of Medical Investigation (LIM-14), School of Medicine, University of Sao
Paulo, 1246-903 Sao Paulo, Brazil.
*Corresponding author:
Adhemar Longatto Filho, M.Sc., PhD, PMIAC, Laboratory of Medical Investigation (LIM)
14, Faculty of Medicine University São Paulo, Av. Dr. Arnaldo, 455 - Cerqueira César
1246-903, Sao Paulo, Brazil, Phone: + 55 11 3061-7413, FAX: + 55 11 3061-7413
84
Abstract
Background: The first publication that associated HPV related-alterations in esophagean
epithelia was published in 1982. However, the data at that time required further
investigation to confirm this hypothesis.
Methods: A total of 106 patients were enrolled in this study. During the endoscopy,
esophageal biopsies were collected from distal and proximal esophagus region. DNA was
extracted with QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen) and the HPV-16, the most prevalent HPV
type identified in esophagus, was detected by PCR real time using specific primer and
probe. Sociodemographic data, lifestyle and clinical data were obtained by interview.
Results: HPV-16 was detected in the esophagous of 21 out of 101 patients, what
corresponds a prevalence rate of 20.8% (95%CI: 12.9 – 31.8). The risk factors associated
with HPV-16 DNA infection in the normal esophagus were not associated, however, to the
esophagean risk factors frequently reported.
Conclusions: The presence of HPV-16 DNA in esophageal tissue of patients without
malignant neoplasia showed a high rate prevalence, the infection was observed in 2 to 10
individuals.
Keywords: Human Papillomavirus, HPV-16, Esophagous, Esophagean cancer risk factors.
85
Introduction
The human papillomavirus (HPV) belongs to the Papillomaviridae family, and
has a well-docummented tropism for squamous and mucosal tissue
(1)
. HPV is a very
high prevalent sexually transmitted infection and is related to the cervical cancer
development
(2)
. Nowadays over 150 HPV types are described, and from these
approximately 20 are strongly associated with the development of cervical cancer.
Among the high-risk HPV, HPV-16 is the most prevalent and most relevantly associated
cancer development
(3)
. Thus, persistent infection by high-risk HPV is is a key event
closely associated with the occurrence of high-grade dysplasia in different anatomical
sites as the cervix, vulva, anus, vagina and penis, and is considered a risk factor for the
development of malignancy in these tissues
(4)
. Besides the anogenital tract lesions,
HPV DNA was also detected and related as the etiologic agent of benign and malignant
squamous lesions of upper respiratory tract (sino-nasal and laryngeal), eyes, oral
mucosa, bronchi and upper digestive tract (esophagus) (1, 5-9).
The squamous epithelium of the esophagus is continuous with the oral mucosa
and the first descriptions of oral HPV lesions (7) were preceded by preliminary reports
that have suggested the involvement of the virus in the development of benign (10) and
malignant
(11)
neoplasias of the squamous epithelium of the esophagus. Evidences of
these associations have emerged from a variety of techniques including HPV DNA
detection in tumor tissues of the esophagus and serological methods to examine the
association between HPV exposure and risk to develop esophageal cancer
(6)
, but the
prevalence of HPV in normal esophageal tissue is still disputable. The data available are
controversial; some figures showed low prevalences of HPV in normal esophagous
such as 0%, and other described rates as higher as 59%
(12-33)
studies showed prevalence rates ranging from 0% to 10.0%
. In Brazil, a triplet of
(24, 26, 33)
. However, data
about HPV infeccion in normal esophagous is scarce worldwide.
The aim of this study was to evaluate the presence of HPV-16 DNA in esophageal
tissue of patients without malignant neoplasia and correlate these frequencies with
clinical pathological and sociodemographic data.
86
MATERIALS AND METHODS
This is a cross-section study. One hundred and six patients who had clinical
indication for endoscopy for benign disease of the digestive system were examined in
the Department of Endoscopy of the Medical Specialties Ambulatory in Barretos (SP),
Brazil.
Endoscopic examination and sample collection
The procedure for conducting the Digestive Endoscopy followed the routine of
the Department of Endoscopy of Ambulatory Medical Specialties of Barretos, using
sedation and flexible video endoscopes (Olympus 180, Japan; Fuginon 4400, Japan).
The collection of biological samples was prospectively performed first in the distal
region and after in the proximal region of the esophagous. Samples were fixed in
formalin and embedded in paraffin. The biological material was processed by the
Department of Pathology, Cancer Hospital of Barretos for histopathological diagnosis.
HPV identification methodology
The DNA from the paraffin embedded blocks was extracted using the DNA
QIAamp Micro Kit (Qiagen, USA) according to the manufacture’s instructions. DNA
quantification was made via NanoDrop 2000 – ThermoScientific and the integrity of
DNA was confirmed by conventional PCR for detection of a fragment of 110pb of
human β-globin gene using the PCO3 (ACACAACTGTGTTCACTAGC 5'-3') and PCO4
(CAACTTCATCCACGTTCACC 5'-3') primers. Only β-globin positive samples were used in
the assay for detection of HPV.
Real-time PCR was performed using TaqMan Universal PCR Master Mix 1x
(Applied
Biosystems,
Inc.,
GATGAAATAGATGGTCCAGC-3’)
EUA),
and
400nm
reverse
of
each
forward
(5’-
(5’-GCTTTGTACGCACAACCGAAGC-3’)
primers, 200nM of the probe 5’- 6FAM-CAAGCAGAACCGGACAG-MGBNFQ-3’ and
87
DNAse RNAse free water (Gibco/BRL, Life Technologies, USA) to final volume of 25μL.
As standard template it was used 5 μL of DNA extracted from each sample. Were
added negative (water) and positive (DNA extracted from cell Caski) controls in all realtime PCR reactions specific for HPV-16. All samples and controls were tested in
duplicate.
Statistical analyses
Fisher's exact test were used to compare the propotions of group with HPV-16+
versus HPV-16-. To compare the prevalence of samples was used McNemar test. The
significance level was 0.05 (5%). For tabulation and statistical analysis was used IBM®
SPSS® Statistics 20.0.1 software for Windows (IBM Corporation, Route 100, Somers NY
10589).
Ethics
This study was approved by the local committee of ethics with register number
134 471. All patients with limited understanding of the research objective during the
consent, patients with unfavorable clinical conditions for sampling biopsies during
endoscopy, previous history of any malingnant neoplasia, and inadequate quality of
sample were excluded. The patients were referred to a private room and informed
about the purpose of the study, procedures for biological sampling and the necessary
information requested on the data collection instrument. Patients who agreed to
participate signed the Informed Consent document. Then participants answered a
questionnaire with sociodemographic information and on the known risk factors for
the HPV infection and esophageal cancer. All interviews were conducted by previously
trained members of the HPV Research Group of Barretos Cancer Hospital - Pio XII
Foundation. The interviews provided information to characterize the duration and type
of exposure.
88
RESULTS
The characterization of the study population is depited in table 1. The groups are
statistically similar with respect to age (HPV16- = 57.3 [dp= 9.5] and frequency of
positive HPV16 test = 60.6 [dp= 9.7] - p= 0.165); there was a mean difference of 3.325
years (95%CI: -8.037 – 1.386) when the age of the HPV16+ group were subtracted
HPV16- group.
HPV-16 was detected in the esophagous of 21 out of 106 patients, what
corresponds a global prevalence rate of 19.8% (95%CI: 13.3 – 28.4). When we evaluate
the prevalence in each anatomic site, the prevalence of HPV-16 DNA in proximal
esophagous was 13.2% (14/106 - 95%CI: 8.0 – 20.9) and in distal esophagous was
11.3% (12/106 - 95%CI: 6.6 – 18.7). We compared the prevalence of HPV-16 DNA
proximal to the distal region and there was not statistical difference (p = 0.804).
None of the patients self-reported previous diagnoses of HIV or genital HPV
during the interview.
In the univatiate analysis none of the sociodemographic, clinical ans lifestyle
variables evaluated were significant (Tables 1 and 2). Table 1 showed similar
characteristics between patients of the group HPV-16 positive and HPV-16 negative.
No significant differences were observerd among all variables analsed. Similarly, Table
2 also did not showed significant differences among several esophagean risk factors of
the patients between the group HPV-16 positive and HPV-16 negative, including
alcohol and/or tabacco consumption.
89
Table 1 - Characterization of the study population according to the presence of HPV-16
DNA.
Variable
Category
HPV-16 n*
(%)
HPV-16 +
n*
%
Sex
Female
Male
21
64
24,7
75,3
5
16
23,8
76,2
1,000
Race
White
Non-white
48
29
62,3
37,7
11
7
61,1
38,9
1,000
Education
Illiterate
Basic education
High school / Graduate
14
60
11
16,5
70,6
12,9
1
14
6
4,8
66,7
28,6
0,149
Lived in rural areas
No
Yes
16
69
18,8
81,2
5
16
23,8
76,2
0,559
Lived in urban areas
No
Yes
1
84
1,2
98,8
0
21
0,0
100,0
1,000
Body mass index
Malnourished
Eutrophic
Overweight / Obese
4
26
45
5,3
34,7
60,0
0
3
16
0,0
15,8
84,2
0,144
Gastroesophageal reflux
No
Yes
58
23
71,6
28,4
17
4
81,0
19,0
0,579
85
100
21
100
Total
* Cases with missing values were excluded from analysis
P
90
Table 2 - Characterization of the population lifestyle according to the presence of HPV16 DNA.
Variable
Category
HPV 16 n*
%
HPV 16 +
n*
%
Exposure inceticide / pesticide
No
Yes
41
44
48,2
51,8
9
9
50,0
50,0
1,000
Alcohol
Never drank
1
Present
Past
26
39
20
30,6
45,9
23,5
5
9
7
23,8
42,9
33,3
0,669
Gram ethanol per mililiter per day
Never drank
≤ 30
> 30
26
46
12
31,0
54,8
14,3
5
13
3
23,8
61,9
14,3
0,889
Tobacco
Never smoked
1
Present
Past
26
26
33
30,6
30,6
38,8
9
4
9
42,9
19,0
38,1
0,461
Pack-years
Never smoked
≤ 40
> 40
26
9
21
30,6
44,7
24,7
9
7
5
42,9
33,3
23,8
0,527
Alcohol and Tobacco
Never
Drink and Smoke
Drink or Smoke
17
50
18
20,0
58,8
21,2
4
11
6
19,0
52,4
28,6
0,753
Hot drinks
No
Yes
6
79
7,1
92,9
4
17
19,0
81,0
0,107
Age first intercourse
≤15 years old
>15 - ≤17 years old
>17 years old
25
21
38
29,8
25,0
45,2
9
5
7
42,9
23,8
33,3
0,474
Partner number
1
2–5
>5
18
25
42
21,2
29,4
49,4
6
5
10
28,6
23,8
47,6
0,734
Active oral sex
No
Yes
53
32
62,4
37,6
13
8
61,9
38,1
1,000
Age first time active oral sex
≤20 years old
>20 - ≤30 years old
> 30 years old
11
10
9
36,7
33,3
30,0
3
2
2
42,9
28,6
28,6
1,000
Frequency active oral sex
Rarely
Often / Always
22
9
71,0
29,0
5
3
62,5
37,5
0,682
85
100
21
100
Total
P
* Cases with missing values were excluded from analysis
1
This study considered current consumption of alcohol and tobacco if the research participant referring to abandoned
consumption in the last 12 months.
91
Discussion
The results herein obtained demonstrated a high prevalence of HPV-16 in normal
esophagus from patients submitted to endoscopic examination due to other clinical
conditions than malignancy suspection. Almost 20% of the patients have showed HPV16 positivity which is comparable to the frequencies of this virus in uterine cerix of
women of high HPV prevalent regions
(34)
. The comparison of HPV-16 positivity with
socio-demographic data and other variables studied did not show any significant
difrences, which corroborated that the conventional risk factors for esophagean cancer
development are not associated to the HPV-16 status. We limited the investigation of
HPV for HPV-16 type because in the previous reports this virus was significntly more
prevalent type in normal and malignant esophagean tissues (35).
We opted to design a cross-section study with patients without malignant
neoplasia to evaluate the prevalence of HPV-16 DNA because this type of study
permits to establish the prevalence and evaluate the relation with other events
(exposure and other variables of interest) at a determined time
(36)
. Also, in order to
avoid biases, we implamented a rigorous selection of survey participants. A
standardized instrument to collect data were drawn and all interviews were conducted
by two members of this study previously trained. The colection of the samples were
prospective, with a stringent control; first, distal region followed by proximal region
were sampled to get a better representation of the esophagus.
The real time PCR specific for HPV-16 was chosen because is a technique that has
individual internal control for each sample whilst minimizing false-negative results;
additionally PCR has a high negative predictive value of greater than 99% and more
than 90% sensitivity for detection of HPV; and provides results quantitatively, as well
(37)
.
The prevalence of HPV-16 DNA in esophagus of patients without malignant
neoplasia found in this study was higher when compared to others Brazilian studies (24,
26, 33)
that varied from 0 t0 10%. The association between HPV and oropharynx and oral
cavity cancer is strong, and a Swedish study had hypothesized a higher prevalence of
HPV in the proximal region compared the distal region of the esophagus; however, the
study did not observe association between the presence of the virus and anatomical
92
region
(38)
. In the current study the prevalence of HPV were 13.2% in the proximal
region and 11.3% in the distal region, without statisticlal significance as well.
Other studies that evaluated HPV-16 DNA in esophageal reported as limitation
the lack of information on sociodemografic characteristics, consumption of hot drinks,
alcohol, tobacco and history of sexual habits
(33)
, which in this study is a strong
differential. The presence of HPV-16 DNA in esophageal tissue of patients without
malignant neoplasia showed a high rate; the infection was observed in 2 to 10
individuals. This study did not associated the presence of HPV-16 with the other risk
factors associated to the esophagean cancer such as alcohol and tabacco consumption.
93
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