PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS FORENSES
A IMPORTÂNCIA DA ENTOMOLOGIA E DA ANÁLISE DE DNA
PARA A IDENTIFICAÇÃO FORENSE
Vanessa Daldegan Gomes de Lima1
Paulo Roberto Queiroz2
1
Licenciada em Biologia pelo Centro Universitário de Brasília. Aluna da Pós-graduação em Biociências
Forenses pela Pontifícia Universidade Católica de Goiás/IFAR.
2
Orientador: Biólogo; Doutor em Biologia Animal pela Universidade de Brasília – UnB. Professor de
especialização em Biociências Forenses IFAR/PUC-GO. E-mail: [email protected]
RESUMO
Identificações criminais usando o material genético tiveram início em 1985. Técnicas como a amplificação, o
isolamento e a caracterização de material genético retirado do sistema digestório de artrópodes necrófagos e
hematófagos podem auxiliar na identificação da vítima e do suspeito. O objetivo desse trabalho foi descrever as
contribuições da entomologia e da genética para a análise e identificação de vestígios humanos de interesse
forense. Atualmente, os marcadores de maior relevância são o VNTR, STR e o DNA mitocondrial. Os
artrópodes que mais auxiliam no desenvolvimento da Entomologia Forense são os insetos das Ordens Diptera e
Coleoptera. As combinações das técnicas baseadas no DNA com a entomologia podem fornecer estratégias para
a obtenção de perfis de DNA que permitam ser aplicados na identificação humana visando suprir as mais
variadas finalidades forenses.
PALAVRA-CHAVE: Identificação humana; extração de ácidos nucleicos; amplificação de DNA.
ABSTRACT
Criminal identification using genetic material began in 1985. Techniques such as amplification, isolation and
characterization of genetic material taken from the digestive system of hematophagous and scavengers
arthropods may help identify the victim and the suspect. The aim of this study was to describe the contributions
of entomology and genetics for the analysis and identification of human remains of forensic interest. Currently,
the most relevant methods are VNTR, STR and mitochondrial DNA. The most helpful arthropods in the
development of forensic entomology are the insects of the Diptera and Coleoptera orders. The combination of
DNA-based techniques with entomology may provide strategies for obtaining DNA profiles that enable it to be
used for human identification objectives in order to meet several legal purposes.
KEY-WORD: Human identification, extraction of nucleic acids, DNA amplification.
1
INTRODUÇÃO
De acordo com Fachone; Velho (2007) a ciência forense é a classificação dada aos
esforços de geração e transferência de tecnologia e ciência com a finalidade de elucidar
questões relativas ao âmbito do sistema de segurança pública e justiça criminal. Já a perícia
criminal é a busca da verdade real das circunstâncias do crime a partir de evidências materiais
geradas pelo fato delituoso, em função de conhecimento tecnológico e científico comprovado,
com a finalidade de fundamentar os procedimentos legais até o julgamento.
Para qualificar um vestígio como admissível em um processo penal, as provas devem
estar livres de qualquer direito comum ou privilégio constitucional e, portanto, serem
confiáveis. Um perito em genética ou em entomologia, por não terem relação alguma com o
ocorrido, ajudam o julgador a compreender os fatos periciados (HALL, 2012).
Para suprir essa demanda, o serviço de segurança pública juntamente com a ciência,
procuram desenvolver técnicas cada vez mais eficientes e precisas para que o suspeito do
crime seja recolhido do meio social o mais rápido possível (MARIUZZO, 2007).
Com isso, o laudo pericial baseia-se nos conceitos científicos e tecnológicos. Estes são
produzidos por profissionais que trabalham com as técnicas já comentadas e se tornam
imprescindíveis para a justiça criminal e sistema público de segurança deste país
(FACHONE; VELHO, 2007).
Dessa forma, o trabalho colaborativo entre vários ramos das ciências podem ser
aplicados visando a obtenção de dados para a identificação de indivíduos para fins criminais.
Por exemplo, os processos de identificação de indivíduos para fins criminais usando o
material genético tiveram início em 1985 quando Alec Jeffreys, um geneticista britânico,
coletou o sêmen de um criminoso e obteve o perfil de DNA correspondente a partir dessa
amostra (DOLINSKY; PEREIRA, 2007). Essa análise foi feita por meio da metodologia de
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – Polimorfismo no Comprimento de
Fragmentos de Restrição) para a obtenção de perfis genéticos de minissatélites (DNA
fingerprinting). Nos EUA, em novembro de 1987, foram usados pela primeira vez, testes de
DNA para se determinar a culpabilidade criminal. A partir de então, desde o final do século
XX, os estudos na área de genética forense se desenvolveram em escala exponencial, com o
intuito de obter perfis genéticos como uma ferramenta complementar para investigações de
crimes sexuais e violentos (POLÍCIA CIVIL DO DISTRITO FEDERAL, 2011).
Visando complementar dados que possam ser usados na investigação, podem-se
empregar os conceitos da Entomologia Forense, que se amparam em aspectos ecológicos e
empregam informações coletadas de acordo com o estágio de desenvolvimento dos insetos
que colonizam os corpos em decomposição (THYSSEN, 2008). Uma das funções desse ramo
é determinar o intervalo pós-morte. Além disso, o exame de artrópodes recolhidos próximo ou
sobre os cadáveres também pode determinar se o mesmo foi deslocado entre localidades que
possuem entomofaunas diferentes, se o corpo esteve ou não enterrado por um período
determinado de tempo e, até mesmo, indicar traumatismos provocados por armas (GOMES,
2008).
Estudos recentes demonstram a possibilidade de se retirar e estabelecer o perfil de
DNA de origem humana a partir de material extraído do trato digestivo de larvas
decompositoras (GREDILHA; PARADELA; FIGUEIREDO, 2007). Thyssen (2008) descreve
que o uso de técnicas como a amplificação, o isolamento e a caracterização de material
genético retirado do sistema digestório de artrópodes necrófagos e hematófagos podem
auxiliar na identificação da vítima e do suspeito. Atualmente, os métodos de maior relevância
são o RFLP aplicado ao estudo de regiões repetitivas de DNA chamadas de minissatélites
(VNTR – Variable Number of Tandem Repeats – Número Variável de Repetições in Tandem)
e os microssatélites (STR – Short Tandem Repeats – Repetições Curtas in Tandem) revelados
pela reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) (KOCH;
ANDRADE, 2008). Além destas, Thyssen (2008) afirma que o DNAmt (DNA mitocondrial)
revela-se um extraordinário marcador molecular.
Visando aumentar a dinâmica das atividades forenses que possam elucidar fatos
delituosos, faz-se necessária a complementação dos estudos a respeito da entomofauna
forense e a pesquisa de métodos de identificação por DNA a partir de vestígios biológicos
encontrados em cenas de crime para a identificação rápida de suspeitos. As combinações das
técnicas baseadas em DNA com a entomologia podem fornecer estratégias para a obtenção de
perfis de DNA que permitam ser aplicados na identificação humana visando suprir as
finalidades forenses.
O objetivo deste trabalho foi descrever as contribuições da entomologia e da genética
para a análise e identificação de vestígios humanos de interesse forense.
2
METODOLOGIA
Trata-se de uma revisão bibliográfica baseada em trabalhos científicos que descrevem
assuntos relacionados à Genética e Entomologia visando a sua aplicação forense. Grande
parte das fontes utilizadas foi retirada de bibliotecas virtuais da Ordem dos Advogados do
Brasil (OAB), Sociedade Brasileira de Análises Clínicas (SBAC), Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária (Embrapa), Instituição Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA),
Universidade de Campinas (Unicamp), Universidade de Trás-os-montes e Alto Douro,
Universidade
Estadual
de
São
Paulo
(UNESP),
Universidade
do
Grande
Rio
(UNIGRANRIO), SUNY College of Environmental Science and Forestry, Universidade
Federal do Paraná (UFPR), Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), Universidade de
Coimbra (UC) e bases de dados científicas, tais como, Scielo (http://www.scielo.
org/php/index.php), Bireme (http://new.paho.org/bireme/), Google Acadêmico, bem como no
sítio PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/).
Outra parte das informações foi obtida por meio de periódicos, teses e monografias
disponíveis nas bibliotecas físicas da Universidade de Brasília (UnB) e do Centro
Universitário de Brasília (UniCEUB).
3
DESENVOLVIMENTO
3.1
Genética Forense
A análise de DNA apresenta elevada sensibilidade e poder de discriminação,
oferecendo uma poderosa ferramenta na identificação humana. Tecnicamente e do ponto de
vista da criminalística, o DNA pode ser coletado de praticamente todos os espécimes
biológicos, pois é uma molécula estável em locais frios e secos e se os vestígios são
armazenados nessas condições, as chances dos resultados obtidos serem confiáveis é bastante
razoável (KOCH; ANDRADE, 2008).
A confiabilidade dos exames de DNA é fundamentada nas várias fases de execução do
exame desta molécula, na aplicação rigorosa de procedimentos que garantem a qualidade da
perícia realizada (PARADELA; FIGUEIREDO; SMARRA, 2006) como, por exemplo, a
utilização de toucas, luvas e máscaras cirúrgicas descartáveis no momento da coleta,
manuseio e processamento de resultados; a devida proteção contra a ação de fungos e
bactérias mantendo a amostra protegida do calor e da umidade; a rígida documentação da
cadeia de custódia do material recolhido para evitar a contaminação por deposição de material
biológico (SMOKOVICZ, 2010).
As fontes de provas mais comuns que são coletadas para a prática de testes de DNA
forense são saliva, cabelos com ou sem raízes, sangue e sêmen, porém outros materiais como
urina, bolos fecais, ossos e peças dentárias também podem fornecer resultados para tipagem
de DNA (VAZ, 2008; GAERTNER; BINSFELD, 2011).
3.2.1 Métodos de extração de DNA aplicados na genética forense
Existem diferentes métodos de extração de DNA a partir de vestígios coletados em
cena de crime e que se constituem em material de interesse forense. De forma geral, cada
método de extração de DNA precisa eliminar diversos contaminantes, incluindo lipídios,
proteínas, carboidratos, pigmentos e partículas de solo (CHEMELLO, 2012).
Recentemente Hedman; Ansell; Nordgaard (2010) descreveram o índice de
classificação de perfil de DNA forense (FI - forensic DNA profile index), que tem a função da
avaliar quantitativamente e com imparcialidade os perfis traçados a partir das amostras
coletadas. Este índice é construído usando os dados gerados do PCA (Análise de
Componentes Principais) que combinam as análises da altura do pico total de alelos, o
equilíbrio dos picos alélicos dentro dos loci heterozigóticos (intra-locus ou equilíbrio local) e
o equilíbrio entre marcadores STR (inter-loci ou saldo global) (HEDMAN et al., 2009). Os
laudos periciais elaborados a partir da aplicação desse procedimento tornam-se de elevada
qualidade técnica (HEDMAN; ANSELL; NORDGAARD, 2010).
Soma-se a tudo isso a necessidade de coleta de amostras a partir do cadáver. Isso é
feito pela coleta de cortes histológicos diretamente do cadáver para a formação de um banco
de dados para posteriores análises e comparações com o conteúdo gástrico das larvas
encontradas junto à entomofauna correlacionada ao caso (CAINÉ, 2010).
Mas para o sucesso do emprego dos conceitos apresentados anteriormente é necessário
que se tenham disponíveis métodos de obtenção de DNA com qualidade e quantidade
suficientes para as técnicas moleculares que irão estabelecer os perfis de DNA para
comparação. Dessa forma, serão apresentadas metodologias de obtenção de DNA com a
finalidade de orientar os interessados no assunto na escolha e adoção do melhor método que
seja mais adequado à prática forense de DNA.
Por exemplo, na extração de DNA são empregados vários reagentes, tais como, o
Chelex. O Chelex 100 é um agente quelante usado para purificar compostos em uma amostra
pelo princípio da troca iônica. O seu mecanismo de ação é por meio da sua capacidade em se
ligar a íons derivados de metais de transição. O Chelex é um copolímero de estirenodivinilbenzeno contendo grupos ácidos do tipo iminodiacético (CEO, 1993).
A resina Chelex é frequentemente usada para a extração de DNA visando utilização na
técnica de PCR. O mecanismo exato de ação do Chelex na preparação de DNA ainda é
incerto. O Chelex, provavelmente, protege o DNA dos efeitos do aquecimento usado para
liberar o DNA das células, por sequestrar íons de metais pesados divalentes das enzimas que
poderiam danificar a estrutura da molécula (WALSH, 1991).
A resina em forma de contas (beads) contendo grupos polares liga-se aos componentes
celulares polares após a lise das células, enquanto o DNA e o RNA permanecem em solução
na fase aquosa acima da fase contendo o Chelex, pois o mesmo é insolúvel em água. Isso
ocorre devido ao fato de que as moléculas de DNA liberadas de células lisadas são
susceptíveis a ação de DNAses. No entanto, as enzimas que degradam o DNA requerem o
cofator Mg+2. Então, baseando-se nesse fato, o reagente Chelex liga-se firmemente a todos os
íons Mg+2 presentes em solução para evitar a degradação do DNA (MORETI, 2009).
Então, a partir dessa habilidade da resina Chelex 100, foram testados dois métodos de
extração de DNA utilizando-se o reagente Chelex 100 e o kit de purificação de DNA QIAamp
DNA minikit® (Qiagen) por Simonato et al. (2007).
Os autores prepararam os cortes de carcinoma epidermóide de assoalho bucal antes da
extração de DNA, fazendo a desparafinização do tecido coletado, pois para cada método de
extração faz-se necessário um preparo específico.
Segundo estes mesmos autores, nos tubos contendo os cortes para purificação com
Chelex 100 foram adicionados 100 µl de solução Tween 20 a 0,5%. Após ocorrer a
homogeneização, houve um aquecimento dos tubos a 90 °C por 10 minutos e, em seguida,
utilizando-se um termociclador, um resfriamento a 55 °C.
Adicionou-se então, 1 µl de proteinase K na concentração de 20 mg/ml.
Posteriormente, os cortes foram colocados a 55 ºC por 3 horas sendo levemente
homogeneizados a cada hora. Terminada esta fase, cada tubo recebeu 100 µl de Chelex 100®
diluído a 5% em solução de Tris 10 mM pH 8,0 e EDTA 1 mM, sendo os mesmos aquecidos
a 99 ºC durante 10 minutos e levemente agitados após o aquecimento.
Em seguida, realizou-se a centrifugação do material durante 15 minutos com uma
rotação de 10.600 rpm, aquecimento por 5 minutos a 45 ºC e adição de 100 µl de clorofórmio.
Novamente durante 15 minutos, colocou-se os tubos para centrifugar a 10.600 rpm. O DNA
presente no sobrenadante foi recuperado e armazenado em tubos limpos a - 20 ºC.
Já para o método de purificação com QIAamp DNA minikit os cortes de carcinoma
epidermóide de assoalho bucal foram preparados com a adição 1.200 µl de xilol e,
posteriormente, agitou-se por 15 segundos. Em seguida, os tubos foram centrifugados a
14.000 rpm durante cinco minutos.
O sobrenadante foi desprezado e adicionado ao sedimento 1.200 µl de etanol.
Novamente, durante 15 segundos os tubos foram agitados e centrifugados a 14.000 rpm por
mais cinco minutos. Realizou-se a repetição deste procedimento e, ao final, os tubos foram
colocados em centrífuga à vácuo com a temperatura mantida a 37 °C durante 15 minutos com
as tampas abertas, para que ocorresse a evaporação do etanol (SIMONATO et al., 2007).
Ainda, o emprego de kits de extração de DNA se mostra como uma alternativa para a
obtenção de DNA de relativa pureza. Por exemplo, Simonato et al. (2007) utilizaram o kit de
extração de DNA QIAamp DNA minikit® (Qiagen) para a obtenção de DNA de amostra
proveniente de carcinoma epidermóide de assoalho bucal.
Aos tubos contendo as amostras foram acrescentados de 180 µl de Buffer ATL (Tissue
Lysis Buffer), além de 20 µl de proteinase K (20 mg/ml). As amostras foram homogeneizadas
e incubadas a 55 ºC por 3 horas sendo levemente agitadas a cada hora. Após esse tempo,
adicionou-se ao tubo 200 µl de Buffer AL, sendo os mesmos aquecidos a 70 °C por 10
minutos para inativação da proteinase residual. A seguir, foram adicionados 200 µl de etanol e
agitados durante 15 segundos, centrifugando por período curto de 1 minuto.
A solução resultante foi movida para o dispositivo da coluna QIAamp DNA minikit® e
centrifugada a 8.000 rpm por um minuto e colocado em um tubo limpo. Adicionou-se então,
500 µl de Buffer AW1 (Wash Buffer 1) ao dispositivo com a coluna, que foram centrifugados
a 8.000 rpm por um minuto. O método de lavagem foi repetido com 500 µl de Buffer AW2
(Wash Buffer 2), acompanhado de centrifugação a 14.000 rpm durante 3 minutos.
O DNA foi eluído adicionando-se 50 µl de Buffer AE, incubando-se a temperatura
ambiente por um minuto e centrifugando-se a 8.000 rpm durante um minuto. Em seguida,
mais 50 µl de Buffer AE foram adicionados à coluna para completar a eluição, incubando-se
por 5 minutos e centrifugando-se a 8.000 rpm por mais 1 minuto. As amostras foram
armazenadas a -20 °C.
Estes autores relatam que a concentração de DNA obtida com o Chelex 100®
apresentou média de 120,62 ng/µl com quociente das leituras das absorbâncias 260/280 entre
0,8 e 1,41. Já com as amostras extraídas com QIAamp DNA minikit® o rendimento médio foi
de apenas 67,38 ng/µl, e quociente entre as leituras variou entre 1,11 e 2,53. Os autores ainda
demonstram que das 35 amostras processadas para a extração do DNA 82,85% foram
positivas quando extraídas com Chelex 100® e 85,7% com QIAamp DNA minikit®.
Ambos os métodos, Chelex 100® e QIAamp DNA minikit®, demonstraram possuir
potencial para uma boa extração de DNA total, sendo que o Chelex 100® apresenta custo mais
baixo que o QIAamp DNA minikit® (SIMONATO et al., 2007).
Técnicas de biologia molecular tem se revelado eficazes para a identificação de
moléculas de DNA humano encontradas no trato digestivo de insetos. Maciel; Arantes (2010)
comentam que a técnica de PCR está associada à finalidade já citada. Liz (2005) relata o uso
do método orgânico com fenol/clorofómio para a extração e do uso de reagentes purificantes
como, por exemplo, o DNA-IQ para posterior amplificação com STR.
A extração de DNA do trato digestivo de insetos, por se tratar de amostras líquidas,
pode também ser efetivada com a utilização do aparelho DNA-IQ System ™, como divulgado
pela
organização
corporativa
Promega
Corporation
em
sua
página
eletrônica
(https://www.promega.com/products/pm/genetic-identity/dna-iq/dna-iq/), que consiste em um
sistema de isolamento de DNA que emprega partículas paramagnéticas e obtém amostras com
elevado grau de pureza para análises por STR (PROMEGA, 2012).
3.2.2 Principais marcadores moleculares usados na análise de DNA forense
Os marcadores mais usados na análise de DNA para finalidades forenses são os
minissatélites (VNTR) e microssatélites (STR) que são constituídos de sequências repetitivas
de DNA. As sequências de bases divergem entre si de acordo com o número de repetições que
podem ser de 1 a 4 bases no STR e de 10 a 100 no VNTR de acordo com o perfil de DNA de
cada indivíduo. Cada número de repetições que pode ser encontrado representa um alelo
diferente. Estes alelos podem ser analisados utilizando-se a reação em cadeia da polimerase
(PCR) no caso dos STR ou utilizando-se sondas de DNA quando se analisa os VNTR
(DOLINSKY; PEREIRA, 2007).
Especificamente para a identificação de indivíduos do sexo masculino, indica-se a
análise dos marcadores moleculares Y-STR. Esses marcadores permitem realizar a análise de
regiões específicas de microssatélites localizadas no cromossomo Y e que são repassadas de
geração em geração como herança paterna e com pouca ou nenhuma alteração. Esses
marcadores são muito úteis no comparativo de linhagens paternas e em estudos populacionais.
Outros marcadores são os mini-STRs que ajudam a revelar informações a partir de amostras
de DNA degradadas que tipicamente resultariam em perfis parciais e perda total de tipificação
a partir de amplificações STR regulares. E, por último, a utilização de regiões STR padrão
que são ideais para a comparação de resultados (MARJANOVIĆ et al., 2009).
Segundo Cainé (2010) os microssatélites representam uma pequena sequência de DNA
repetitiva de 2 a 7 pares de bases (pb) in tandem e que estão dispersas pelo genoma humano
com uma frequência de 1 STR por cada 300 a 500 kilobases. Este mesmo autor afirma que a
análise de um STR não permite a obtenção de resultados em amostras muito degradadas como
aquelas provenientes do trato digestivo larval. Com isso a pesquisa da região controle (Dloop) da molécula do DNA mitocondrial (DNAmt) torna-se mais eficiente.
O DNAmt possui transmissão de origem materna e, assim, a observância da molécula
de DNA mitocondrial também permite a identificação de genes herdados pela mãe. O elevado
número de cópias de DNAmt por célula, torna a amplificação mais efetiva e a sua forma
circular reduz a tendência à degradação (CAINÉ, 2010; CRAVEN et al., 2012). Acumulam
mutações cerca de 10 vezes mais rapidamente que o DNA genômico, as regiões
hipervariáveis evoluem ainda mais rapidamente sendo úteis, portanto, no estudo de
acontecimentos recentes e nas investigações de marcadores espécie-específicos (TORRES;
KOSMANN; ARANTES, 2010).
A principal relevância forense da análise do DNAmt é o fato de existirem milhares de
mitocôndrias em cada célula, o que proporciona uma grande disponibilidade de matéria
disponível para extração e análise, mesmo que a amostra coletada seja pequena ou esteja
degrada (TIDBALL-BINZ, 2009).
Paradela; Figueiredo (2012) afirmam que na análise forense do DNA mitocondrial
rotineiramente são usadas sequências das regiões hipervariáveis (HV) I e II. Seguem relatando
que a investigação das regiões HV–I e II pode fornecer informações complementares para
relacionar o cadáver a determinados familiares, na maioria dos casos. Porém, outra aplicação
do DNAmt é a possibilidade de revelar um conjunto de polimorfismos que possibilita agrupar
amostras de um determinado haplogrupo.
A técnica de PCR (MULLIS; FALOONA, 1987) permite a obtenção in vitro de várias
cópias de uma dada região do DNA mitocondrial. A aquisição de novos segmentos
amplificados segue etapas como a extração do DNA molde, a escolha da região a ser
amplificada, a obtenção do iniciador específico para tal segmento a ser reconhecido, a
amplificação propriamente dita com o uso de um ciclador térmico e a leitura após a
eletroforese e coloração.
O uso da PCR possui vantagens como a identificação de alelos de forma simplificada e
alta sensibilidade que permite o exame partindo de quantidades mínimas de DNA, mesmo em
estágio avançado de degradação do material. Porém, as principais desvantagens desta
metodologia são a limitação de estudos de pequenas regiões nas quais são encontradas poucas
repetições de alelos e a alta suscetibilidade a contaminação (PENA, 2005).
Utilizando-se a eletroforese em gel de agarose os produtos das regiões do DNA
mitocondrial gerados pela técnica de PCR podem ser visualizados, pois esta é uma técnica
competente para separar moléculas de diferentes tamanhos quando se aplica uma diferença de
potencial através de um gel imerso em solução tampão, o que permite a migração das
moléculas de DNA negativamente carregadas em direção ao polo positivo (TORRES;
KOSMANN; ARANTES, 2010).
Fazendo uso de ferramentas da bioinformática, programas e equipamentos cada vez
mais sofisticados tornam possíveis a geração e análise de grandes números de sequências de
DNA e dessa maneira identificar SNPs e indels (inseções e deleções de nucleotídeos)
(SILVA, 2009).
Os SNPs e os indels são as bases genéticas da maior parte das variações alélicas e
podem ser abordados como marcadores bialélicos, havendo extensas aplicações no
mapeamento genético de alta resolução e em testes diagnósticos. Tais marcadores podem ser
identificados explorando os bancos de dados públicos e mais atualmente pelo
ressequenciamento de genomas completos (GUIMARÃES et al., 2009).
Estas técnicas podem ser usadas concomitantemente para analisar a simples variação
no tamanho dos alelos gerados por indels de sequências pequenas do DNA como, por
exemplo, fornecendo informações genotípicas sem a associação a outras técnicas (TORRES;
KOSMANN; ARANTES, 2010). Os indels podem ser identificados e analisados a partir de
adaptações de programas de bioinformática já existentes. Por exemplo, no trabalho de
Thiebaut et al. (2008) sequências de DNA associadas a expressão de genes foram analisadas
no programa Codon Code Aligner. Os resultados de tal sequenciamento foram comparados às
informações contidas em um banco de dados previamente estabelecido utilizando os
aplicativos Blast2sequences do NCBI e ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/
index.html) e verificou-se uma diferença de 269 pares de bases. A comparação indicou a
presença de uma mutação do tipo inserção/deleção (indel).
NISHIMAK et al (1999) utilizaram iniciadores de PCR (Direto: 5' CAT GGG GAA
GCA GAT TTG 3' e reverso: 5' TTA GCT ACC CCC AAG TGT 3') para a região HVI do
DNA mitocondrial humano (16030-16481) para a análise de polimorfismos gerados por
indels para a discriminação entre indivíduos chineses e japoneses. Foram investigados 150
indivíduos japoneses e 120 indivíduos chineses. Das análises realizadas foram identificados
108 tipos de sequências para o grupo japonês e 87 tipos de sequências para os indivíduos
chineses. Os autores observaram que alguns indels eram característicos para os indivíduos
asiáticos quando comparados com o grupo externo composto por caucasianos e que alguns
indels eram relacionados a indivíduos localizados em áreas específicas do leste asiático. Dessa
forma, os autores indicam a relevância do uso da análise de indels em DNA mitocondrial para
a identificação humana com finalidade forense.
3.3
Entomologia forense como fonte de DNA para a análise pela genética forense
A entomologia forense pode ser dividida em três áreas (urbana, produtos armazenados
e médico-legal) a entomologia forense torna-se responsável pelo esclarecimento da
responsabilidade e da sequência de fatos ocorridos em um fato delituoso (THYSSEN, 2008).
Fazendo relação com mortes violentas, a entomologia pode esclarecer a identidade da
vítima, a causa da morte, o local da morte e a cronotanatognose, que se refere ao intervalo
ocorrido entre a morte e o momento em que o corpo foi encontrado. Devido a alta
sensibilidade do sistema olfatório dos insetos estes animais são os primeiros a colonizar os
cadáveres nas cenas de crime (MIRANDA et al., 2006).
A entomofauna decompositora desempenha um importante papel ecológico com
envolvimento direto na entomologia forense com as questões médico-legais. Certos
conhecimentos relacionados com a entomologia forense médico-legal se correlacionam com
os estudos relacionados à taxonomia, biologia e ecologia dos táxons envolvidos nos processos
de decomposição cadavérica de animais e seres humanos (URURAHY, 2008).
A putrefação cadavérica é acelerada pela ação desses artrópodes (LOVE;
HAMILTON, 2011), sendo que cada estágio de decomposição do corpo atrai determinado
grupo de insetos. Fatores como temperatura e umidade do ar exercem influência e podem
modificar dados a respeito dos padrões de sucessão ecológica das espécies colonizadoras do
cadáver. Os registros referentes à distribuição geográfica destes táxons tonam-se então, de
fundamental importância para o IPM (CARVALHO; QUEIROZ, 2010).
De acordo com a distribuição geográfica de espécies específicas de insetos
encontrados junto ao corpo é possível determinar o local original onde o corpo foi depositado
(OLIVEIRA-COSTA, 2003).
Carvalho (2012) afirma que as espécies mais encontradas são Chrysomya albiceps,
espécie extremamente voraz que pode ser encontrada em áreas urbanas ou de mata, demonstra
canibalismo e predação da larva e o adulto desta espécie geralmente chega muito rápido ao
cadáver após a morte; Chrysomya putoria é uma espécie que tem preferência por regiões
úmidas; as larvas geralmente são saprófagas, podendo acarretar miíases, e os adultos são
extremamente ágeis e capazes de encontrar carcaças para oviposição logo após a exibição do
corpo (TORRES; KOSMANN; ARANTES, 2010); Chrysomya megacephala, esta espécie
não faz distinção por ambientes urbanos ou de mata, mas é predominante em cadáveres
encontrados em áreas urbanas, possui grande potencial forense para auxiliar na estimativa do
intervalo pós-morte; Lucilia eximia, prefere o estágio inicial da decomposição, porém seu
tempo de desenvolvimento é maior que o de outros indivíduos da família Calliphoridae;
Hemilucilia segmentaria, tem preferência por estágios avançados de decomposição e
demonstra predominância em ambientes de mata; Hemilucilia semidiaphana, importante
indicadora do local de morte e do IPM; Mesembrinella bellardiana e Cochlyomyia macellaria
quando associados ao cadáver somente são encontrados exemplares adultos; Sarconesia
chlorogaster, é utilizada como indicador de área urbana na região sul do Brasil e Pattonella
(Peckia) intermutans é um sarcofagídeo com comportamento de larviposição e de pioneirismo
nos processos decomposição dos cadáveres (CERIGATTO, 2009).
Sandoval (2011) afirma que é grande o número de espécies que se pode encontrar na
cena do crime. Entretanto é de fundamental importância que se faça a coreta identificação do
animal coletado, pois estes podem ser encontrados apenas por frações corporais, em estágios
imaturos ou pulpários. Para tal identificação tem-se utilizado marcadores moleculares como
alternativas aos estudos de caracteres morfológicos destas entomofaunas.
É muito importante, em determinados casos, provar a correlação das larvas com o
corpo relacionado na investigação pericial, ou seja, é necessário provar que a fauna
encontrada e coletada na cena do crime se alimentou daquele corpo ou, até mesmo, se havia
um corpo no local, se era animal ou humano, se era masculino ou feminino. Todas essas
indagações são comprovadas fazendo-se a análise do DNA coletado a partir da extração de
DNA utilizando-se o conteúdo retirado do trato digestivo das larvas coletadas sobre o cadáver
(CARVALHO, 2012).
3.4
Casos associados à entomologia e genética forense para a identificação de
cadáveres
Haskell (2009) cita o caso de um assassino que depositou sua vítima em um estuário
de maré que ficava a 240 km do centro da Bélgica. Foram coletados insetos a partir da grelha
e radiador do carro do suspeito para análise. Os insetos ali identificados eram encontrados
somente a 32 km de distância da costa, eram periódicos e possuíam vida curta como adultos,
em torno de 4 dias. O corpo da mulher havia desaparecido exatamente durante este período de
sobrevida da fase adulta dessa espécie, o que levou à condenação do suspeito.
Tidball-binz (2009) escreveu que foram desenvolvidas várias técnicas para analisar
moléculas de DNA a fim de identificar insetos e DNA humano. Os principais grupos de
insetos estudados para este fim são os mosquitos, piolhos, pulgas e percevejos.
Com o auxílio da genética forense os peritos também são capazes de elucidar a
identificação de suspeitos e/ou vítimas em casos de óbitos (CARVALHO; QUEIROZ, 2010).
Por exemplo, em um episódio de agressão e estupro de uma mulher o criminoso era portador
de piolhos pubianos e sem saber os transmitiu para sua vítima. Os piolhos foram coletados
como prova e deles foram gerados perfis de DNA do criminoso (HASKELL, 2009).
Li et al. (2011) relatam a relevância dos insetos como importante fonte de evidência
de DNA para a identificação de cadáveres em cenas de crime. Entretanto, os autores indicam
o cuidado que o perito deve ter em poder discriminar se o inseto estava colonizando o
cadáver, se é um contaminante presente no ambiente, ou se foi implantado em uma cena de
crime. Isso é crucial para se definir uma evidência por associação.
Dessa forma, os autores realizaram a identificação por DNA mitocondrial e
microssatélites de origem humana a partir do intestino de larvas de Aldrichina grahami
coletadas de várias partes de um cadáver. Após a dissecação das larvas para a remoção do
intestino e coleta do conteúdo gástrico, foi realizada a extração de DNA total e amplificação
por PCR com os iniciadores para a região HV-II do DNA mitocondrial (Direto: L48 5’ CTC
ACG GGA GCT CTC CAT GC 3’ e Reverso: H408 5’ CTG TTA AAA GTG CAT ACC
GCC A 3’). Utilizou-se, também, o kit de análise de STR denominado Applied Biosystems
Identifiler System.
Da análise de DNA mitocondrial foi obtido um produto de amplificação de 200 pb
correlacionado tanto com as amostras de DNA extraídas do cadáver quanto do conteúdo
gástrico do inseto. Além disso, houve congruência de perfis de STR para as regiões D8S1179,
D2S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S37, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA,
TPOX, D18S51, D5S818 e FGA entre o DNA do cadáver e o conteúdo gástrico das larvas.
Das análises obtidas os autores concluíram a possibilidade de se fazer uma associação entre as
evidências de DNA obtidas tanto do cadáver quanto dos insetos que colonizam esse cadáver.
4
CONSIDERAÇÕES FINAIS
É de grande importância o correto manejo das técnicas que evolvem a entomologia e a
genética forense. A concepção de protocolos de coleta, criação e preservação dos insetos traz
uniformidade e precisão às investigações de crimes sexuais e de mortes violentas.
O preparo do material deve ser adequado a cada técnica de amplificação e análise a ser
utilizada e a cadeia de custódia garante o rastreamento das formas de contaminação do
material genético, podendo assim, o pesquisador excluir de suas análises as discrepâncias que
inviabilizam os corretos e seguros resultados que exigem os laudos periciais relativos à
genética forense.
Todas as ciências de utilidades forenses, sozinhas se tornam inúteis, pois é a
interligação existente entre elas que é capaz de refazer os fatos e recontar o caso ocorrido. A
entomologia, com todas as suas peculiaridades, é capaz de afirmar o tempo transcorrido entre
a morte, o local da morte, se a morte foi violenta ou não ou, até mesmo, se realmente havia
um corpo em determinado local.
Contudo, sem a complementação com os dados gerados pelas análises genéticas, a
entomologia forense é incapaz de afirmar se o indivíduo periciado é a pessoa procurada, se há
vestígios de materiais orgânicos diferentes dos da vítima como nos casos, por exemplo, de
estupros seguidos de morte nos quais o agressor deixa seu sêmen no corpo da vítima e os
artrópodes decompositores que se alimentam desse material.
Diante das informações apresentadas nesse trabalho, ressalta-se a importância da
entomologia e da análise de DNA para a identificação forense, assim como, a atividade
multidisciplinar com as demais áreas científicas que atendem aos foros.
5
REFERÊNCIAS
CAINÉ, Laura Sofia Ramos Mendes. Entomologia Forense: Identificação Genética de
Espécies em Portugal. 2010. 98 f. Dissertação (Doutorado) - Curso de Ciências da Saúde,
Ramo de Ciências Biomédicas, Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra,
Coimbra, 2010.
CARVALHO, Elba Correa Teixeira de; QUEIROZ, Paulo Roberto. Descrição das principais
famílias de diptera utilizadas na entomologia forense. 5ª Mostra de Produção Científica da
Pós-graduação Lato Sensu da PUC Goiás, v. 01, p. 47 – 47, 2010.
CARVALHO, Lucila Maria Lopes de. Guia entomologia forense. Supervisor: Cláudio José
Von Zuben, Desenvolvido por: Marcelo Mendes Brandão. Disponível em: <http://www2.ib.
unicamp.br/branco/forense/>. Acesso em: 12 jul. 2012.
CEO, R. N.; KAZEROUNI, M. R. RENGAN, K. Sorption of silver ions by Chelex 100
chelating resin. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, v. 172, n. 1. p.43–48.
1993.
CERIGATTO, Wanderley. Análise Faunística de Dípteros Necrófagos: Ecologia e
Aplicação Forense. 2009. 61 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Biologia Geral e Aplicada,
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Botucatu, SP, 2009.
CHEMELLO, Emiliano. Ciência Forense: exame de ADN. Disponível em: <http://www.qui
mica.net/emiliano/artigos/2007mar_forense4.pdf>. Acesso em: 09 jul. 2012.
CRAVEN, Lyndsey et al. Pronuclear transfer in human embryos to prevent transmission of
mitochondrial DNA disease. Nature International Weekly Journal Of Science, Newcastle,
Uk, p. 82-85. 06 maio 2012.
DOLINSKY, Luciana Cresta; PEREIRA, Lissiane Miranda Campelo Veras. DNA Forense
um artigo de revisão. Saúde & Ambiente em Revista, Duque de Caxias, v. 2, n. 2, p.11-22,
jul-dez. 2007.
FACHONE, Patrícia; VELHO, Léa. CIÊNCIA FORENSE: INTERSEÇÃO JUSTIÇA,
CIÊNCIA E TECNOLOGIA. Revista Tecnologia e Sociedade: PPGTE - Programa de
Pós-Graduação em Tecnologia da UTFPR, Curitiba, PR, n. 4, p.139-161, 2007.
GAERTNER, Carla Joara de Fraga; BINSFELD, Dr. Pedro. Técnicas de Biologia Molecular
aplicadas na Investigação Forense. 6ª Mostra de Produção Científica da Pós-graduação
Lato Sensu s da PUC Goiás, v. 01, p.26-26, 2011.
GOMES, Leonardo. CIÊNCIA FORENSE Polícia técnica tem novas ‘armas’ para investigar
crimes e preparar laudos pericia: Fechando o cerco. Ciência Hoje, Rio de Janeiro, RJ, v. 41,
n. 246, p.63-65, 15 mar. 2008.
GUIMARÃES, Claudia Teixeira et al. Marcadores moleculares e suas aplicações no
melhoramento genético. Biotecnologia: Informe Agropecuário, Belo Horizonte, MG, v. 30, n.
253, p.24-33, nov./dez. 2009.
GREDILHA, Rodrigo; PARADELA, Eduardo Ribeiro; FIGUEIRED, André Luís Dos Santos.
Entomologia forense – insetos aliados da lei. Âmbito Jurídico, Rio Grande, n. 45, 30 set.
2007.
HALL, Robert D. The Forensic Entomologist as Expert Witness. Disponível em: <http://
www.esf.edu/efb/parry/Expert_Testimony.pdf>. Acesso em: 23 abr. 2012.
HASKELL, Neal H.. Forensic Entomology. In: MEDICINE, The American Board Of Legal.
Legal Medicine & Medical Ethics: Education in Medical Schools & Health Sciences
Centers. 7. ed. Severna Park: The American Board of Legal Medicine, 2009. Cap. 69, p. 645654.
HEDMAN, Johannes; ANSELL, Ricky; NORDGAARD, Anders. A ranking index for quality
assessment of forensic DNA profiles forensic DNA profiles. BMC Research Notes,
Bethesda, MD, v. 3, p.290-290, 09 nov. 2010.
HEDMAN, Johannes et al. Improved forensic DNA analysis through the use of alternative
DNA polymerases and statistical modeling of DNA profiles. BioTechniques, v. 47, n. 5 p.
951-958, nov. 2009.
KOCH, Analara; ANDRADE, Fabiana Michelsen de. A UTILIZAÇÃO DE TÉCNICAS DE
BIOLOGIA MOLECULAR NA GENÉTICA FORENSE: UMA REVISÃO. Revista
Brasileira de Análises Clínicas, Rio de Janeiro, RJ, v. 1, n. 40, p.17-23, jan./mar. 2008.
LI, X. et al. Mitochondrial DNA and STR analyses for human DNA from maggots crop
contents: A forensic entomology case from central-southern China. Journal Tropical
Biomedicine, Kuala Lumpur, Malaysia, p. 333-338. 5 Mar. 2011.
LIZ, Gisele Luciane de. O exame de DNA como prova pericial no âmbito criminal:
construção de uma política. 2005. 168 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Gestão de
Políticas Públicas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2005.
LOVE, Jennifer C.; HAMILTON Michelle D.. Introduction to Forensic Anthropology. In:
MOZAYANI, Ashraf ; NOZIGLIA; Carla. The Forensic Laboratory Handbook
Procedures and Practice: Humana Press. 2. ed. New York, NY, USA. 2009. Cap. 19, p.
509- 537.
MACIEL, Camila da Silva; ARANTES, Luciano Chaves. Aplicações das Técnicas de
Biologia Molecular na Entomologia Forense. 5ª Mostra de Produção Científica da Pósgraduação Lato Sensu s da PUC Goiás, v. 1, p. 40 – 40, 2010.
MARIUZZO, Patrícia. Institutos de Perícia usam Biologia Molecular na Investigação Policial.
Ciência e Cultura, Campinas, SP, v. 59, n. 1, p.8-9, 2007.
MARJANOVIĆ, Damir ET al. Identification of Skeletal Remains of Communist Armed
Forces Victims During and After World War II: Combined Y-chromosome Short Tandem
Repeat (STR) and MiniSTR Approach. Croatian Medical Journal, Sarajevo, Bosnia e
Herzegovina, v. 3, n. 50, p.296-304. jun. 2009.
MIRANDA, Guilherme Henrique Braga de et al. Coleta de Amostras de Insetos para fins
forenses. Brasília, DF: Ministério da Justiça, 2006. 15 p.
MORETI, Tiago. IDENTIFICAÇÃO HUMANA: Uma proposta metodológica para
obtenção de DNA de ossos e implementação de banco de dados de frequências alélicas de
STRs autossômicos na população de Santa Catarina. 2009. 142 f. Dissertação (Mestrado) Curso de Biotecnologia, área de concentração em Genômica e Proteômica aplicadas à
Biotecnologia, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal de Santa
Catarina, Florianópolis, SC, 2009.
MOUTINHO, Sofia. À CAÇA DE EVIDÊNCIAS. Ciência Hoje, Rio de Janeiro, RJ, v. 47, n.
281, p.24-31, 16 maio 2011.
MULLIS, K. B.; FALOONA, F. A. Specific Synthesis of DNA in vitro via a Polymerasecatalyzed Chain Reaction. Methods Enzymol., v. 155, p. 335- 350, 1987.
NISHIMAKI, Yuko et al. Sequence polymorphism in the mtDNA HV1 region in Japanese
and Chinese. Legal Medicine, Newcastle, Australia, v. 1, n.4, p. 238 – 249, 1999.
OLIVEIRA-COSTA, Janyra. Entomologia Forense - Quando os insetos são vestígios.
Campinas, Sp: Millennium, 2003. 257 p.
PARADELA, Eduardo Ribeiro; FIGUEIREDO, André Luís Dos Santos; SMARRA, André
Luís Soares. A identificação humana por DNA: aplicações e limites. Revista Âmbito
Jurídico, Rio Grande, n. 30, p.1-1, 30 jun. 2006.
PARADELA, Eduardo Ribeiro; FIGUEIREDO, André Luís Dos Santos. As análises forenses
de DNA mitocondrial - Aspectos Gerais. Revista Jurídica Netligis, Aracajú, SE, n. 1, p.1-1,
ago. 2012.
PENA, Sérgio D. J. Segurança Pública: determinação e identidade genética pelo DNA. In:
SEMINÁRIOS TEMÁTICOS PARA A 3ª CONFERÊNCIA NACIONAL DE CIÊNCIA,
TECNOLOGIA E INOVAÇÃO, 3., 2005, Brasília. Parcerias Estratégicas. Brasília, DF:
Ministério da Ciência e Tecnologia, 2005. v. 20, p. 447 - 460.
POLÍCIA CIVIL DO DISTRITO FEDERAL (Brasil). IPDNA. Disponível em: <http://www.
pcdf.df.gov.br/pgUnidadesPoliciais/pgIPDNA.aspx>. Acesso em: 26 set. 2011.
PROMEGA (Org.). DNA IQ™ System. Disponível em: <http://www.promega.com/
products/pm/genetic-identity/dna-iq/dna-iq/>. Acesso em: 23 jul. 2012.
SANDOVAL, Rafael Cedro de Souza. Marcadores Moleculares Como Ferramentas para
a Identificação de Dípteros de Importância Forense (Calliphoridae, Muscidae). 2011. 56
f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Ciências Biológicas (entomologia), Departamento de
Zoologia, Universidade Federal Do Paraná, Curitiba, SC, 2011.
SANTOS, Lorena Cristina; KIPNIS, Ana Paula Junqueira; KIPNIS, André. Métodos
Aplicados à Epidemiologia Molecular do Mycobacterium tuberculosis. Revista de Patologia
Tropical, Goiânia, GO, v. 36, n. 1, p.1-15, 23 abr. 2007.
SANTOS, W.E. et al. Coleopterofauna Associada à Carcaça de Sus Scrofa L. em Mesorregião
do Agreste Paraibano. Anais do IX Congresso de Ecologia do Brasil, São Lourenço, MG,
p.1-03, 13-17 set. 2009. Anual.
SILVA, Danielle Fernandes da. Identificação e validação de marcadores de marcadores
moleculares indel e SNP para lipoxigenase de sementes da soja. 2009. 65 f. Dissertação
(Magister Scientiae) - Curso de Bioquímica Agricola, Departamento de Programa de Pósgraduação, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Mg, 2009.
SIMONATO, Luciana Estevam et al. Avaliação de dois métodos de extração de DNA de
material parafinado para amplificação em PCR. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina
Laboratorial, Rio de Janeiro, RJ, p. 121-127. 20 abr. 2007.
SMOKOVICZ, José. O exame de DNA na prática forense. 2010. 01 f. Artigo Científico
(Graduação) - Departamento de Nead - Núcleo de Educação A Distância, Centro
Universitário Leonardo da Vinci – Uniasselvi, Indaial, SC, 2010. Disponível em:
<http://www.ebah.com.br/content/ABAAABJNoAH/dna-na-pratica-forense-2>. Acesso em:
27 jun. 2012.
THIEBAUT, F. et al. Desenvolvimento de marcador molecular do tipo SNP potencialmente
associado com a resistência do cafeeiro à ferrugem. 54º Congresso Brasileiro de Genética,
Salvador, BA, p. 90-90, 16-19 set. 2008. Anual.
THYSSEN, Patrícia Jacqueline. AS APLICAÇÕES DO DNA NA ENTOMOLOGIA
FORENSE E NO CONTEXTO LEGAL. In: RAIB, 21., 2008, São Paulo, SP. Reunião Anual
do Instituto Biológico. São Paulo: Instituto Biológico, 2008. v. 2, p. 49 - 50.
TIDBALL-BINZ, Morris. PESSOAS DESAPARECIDAS, ANÁLISE DE DNA E
IDENTIFICAÇÃO DE RESTOS MORTAIS: Um guia para as melhores práticas em
conflitos armados e outras situações de violência armada. 2. ed. Genebra, Suíça: Comitê
Internacional da Cruz Vermelha, 2009. 48 p.
TORRES, Michelle da Cunha; KOSMANN, Cecília; ARANTES, Luciano Chaves. O futuro
da entomologia forense: aliança entre taxonomia e biologia molecular. 5ª Mostra de
Produção Científica da Pós-graduação Lato Sensus da PUC Goiás, v. 1, p. 77 – 77, 2010.
URURAHY, Alexandre. Distribuição Temporal de Calliphoridae (Díptera) Associados à
Decomposição de Sus scrofa Linnaeus (Suidae) na Reserva Adolpho Duke, Manaus,
Amazonas. 2008. 87 f. Dissertação (Doutorado) - Curso de Ciências Biológicas, área de
concentração em Entomologia, Programa de Pós-graduação em Biologia Tropical e Recursos
Naturais, Instituição Nacional de Pesquisa da Amazônia, Manaus, AM, 2008.
VAZ, Josiana Adelaide. Metodologias de Detecção de Vestígios Biológicos Forenses. 2008.
135 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Biologia Molecular e Celular, Departamento de
Biologia, Universidade de Aveiro, Aveiro, Portugal, 2008.
WALSH, P.S., METZGER D.A., HIGUCHI, R. Chelex 100 as a Medium for Simple
Extraction of DNA for PCR-Based Typing from Forensic Material. BioTechniques, v. 10, n.
4, p.506–513. 1991.