CENTRO UNIVERSITÁRIO FUNDAÇÃO SANTO ANDRÉ
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS
FAFIL
CAMILA ANILE ALVES
IDENTIFICAÇÃO DO GENE BOOROOLA EM OVINOS
POR MEIO DE EXAME DE DNA
SANTO ANDRÉ
2012
CAMILA ANILE ALVES
IDENTIFICAÇÃO DO GENE BOOROOLA EM OVINOS
POR MEIO DE EXAME DE DNA
Relatório
final
apresentado
ao
Programa de Incentivo à Iniciação
Científica do Centro Universitário
Fundação Santo André.
Orientadoras:
Dra. Débora Levy
Profª Ms. Roseli Corazzini
Co-orientadora:
Natalia Novaes Zanetti
Santo André
2012
2
SUMÁRIO
1
Introdução
4
2
Atividades desenvolvidas
7
3
Métodos e materiais utilizados
8
3.1 Local de estudo e análise
8
3.2 Materiais
8
3.3 Procedimentos
8
4
Resultados
11
5
Considerações finais
11
Referências
12
3
1. INTRODUÇÃO
A disputa comercial crescente e constante, que ocorre também na agricultura,
exigiu a melhoria de rebanhos de várias espécies. Uma ferramenta importante nessa
trajetória foi a utilização da tecnologia do melhoramento genético, onde indivíduos
de uma população que possuem uma característica superior aos demais indivíduos,
assim como a fertilidade, são selecionados para a reprodução, originando uma prole
com uma combinação de alelos favoráveis à essa característica. No Brasil, já
existem várias empresas especializadas em aplicar o melhoramento genético nos
rebanhos de diversas espécies com efeito econômico. Para o criador é um ótimo
empreendimento, pois, com o certificado de qualidade do seu animal nas mãos o
valor agregado à ele aumenta.
Gene Booroola
Um dos genes estudados no melhoramento genético dos ovinos é o gene
Booroola (FecB), um gene autossômico dominante encontrado no cromossomo 6
que é análogo ao cromossomo 4 humano, sendo o maior gene da prolificidade
identificado em ovinos, resultante de uma mutação no receptor BMP-1B (WILSON et
al., 2001). Esta mutação é encontrada nos oócitos, em folículos primordiais, células
da granulosa dos folículos e também no corpo lúteo (HOLANDA; ADRIÃO;
WISCHRAL, 2006).
Os primeiros animais observados portadores deste gene foram encontrados
em rebanho da raça Merino, na Austrália. No Brasil, a linhagem foi introduzida pela
Embrapa no final da década de 70 (BETEMPS, 2008).
Nos anos 90, foi realizada uma pesquisa científica, onde o gene Booroola foi
estudado. Esse projeto ocorreu na Austrália, e segundo o pesquisador responsável,
Dr. Colin Earl, uma de suas maiores dificuldades foi identificar animais homozigotos
para o gene. Em 1999, foi desenvolvido, na Nova Zelândia, um marcador para o
gene Booroola, assim, através de técnicas de biologia molecular, é possível
identificar a presença ou não deste gene (DIETRICH, 2008).
4
No Brasil, essa tecnologia foi desenvolvida pela Embrapa Pecuária Sul,
obtendo-se animais mais reprodutivos, principalmente nas raças comerciais ovinas
Corriedale e Texel. Segundo o pesquisador responsável, Dr. Carlos Hoff de Souza, o
uso das ovelhas portadoras do gene Booroola nos rebanhos pode até duplicar o
número de cordeiros desmamados por fêmea acasalada. Também, segundo Wilson
et al. (2001), o gene pode levar ao nascimento de 1-2 cordeiros extra por cada
cópia da mutação FecB. No entanto, o criador deve adotar outros cuidados
necessários em paralelo a essa tecnologia. Dr. Souza esclarece que é importante
que o animal não possua as duas cópias do gene, pois a quantidade de crias por
parto seria excessiva. É necessário realizar planejamento de cruzamentos na
utilização de ovelhas portadoras do gene Booroola, conforme tabela 1 (BETEMPS,
2008).
Tabela 1. Planejamento do cruzamento entre animais portadores ou não do gene Booroola. (Nadal,
2011)
Heterozigoto cruzado (x) com animal sem alelo = 25% Heterozigoto + 75% sem alelo;
Heterozigoto x Heterozigoto = 50% Heterozigoto + 25% Homozigoto + 25% sem alelo;
Homozigoto x sem alelo = 50% Heterozigoto + 50% sem alelo;
Homozigoto x Heterozigoto = 50% Homozigoto + 50% Heterozigoto;
Homozigoto x Homozigoto = 100% Homozigoto.
Aplicação do exame e análise
O teste através do exame de DNA para detectar se o animal é portador
heterozigoto
(FecBB/FecB+),
homozigoto
(FecBB/FecBB)
ou
não
portador
(FecB+/FecB+), é realizado por meio da técnica de PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase). Esta, desenvolvida em 1983, amplifica seletivamente seqüências de
DNA. Ela pode ser usada com quantidades mínimas de DNA original, até mesmo
uma única molécula, e permite que seja amplificada um bilhão de vezes em algumas
horas. A reação em cadeia da polimerase revolucionou a biologia molecular e é hoje
uma das técnicas moleculares mais amplamente usadas (PIERCE, 2003). A
visualização dos fragmentos de DNA é realizada utilizando a técnica de eletroforese
em gel de agarose, onde durante a eletroforese, os locais dos filamentos de DNA
que diferem em tamanho por apenas um nucleotídeo podem ser diferenciados. Após
5
esta fase, os locais dos filamentos de DNA no gel são visualizados, por um aparelho
chamado transiluminador, que utiliza luz UV para visualizar o Brometo de Etídio que
é um intercalante de DNA (PIERCE, 2003).
Importância econômica
Atualmente no Brasil, o número de cabeças de ovinos ultrapassa os 17
milhões, estando nas regiões Sul e Nordeste a maior fração deste valor. Apesar do
consumo da carne ovina não ser tão frequente no cotidiano dos brasileiros, a
produção total de carne de cordeiro no Brasil não é o suficiente para suprir a
demanda, quase 60% da carne formalmente consumida no Brasil é importada do
Uruguai.
A ovinocultura tem sendo vista como um bom negócio para os investidores
rurais nos últimos tempos, porém, há a necessidade de um bom planejamento para
a criação destes animais já que as duas regiões que mais produzem carne ovina
apresentam climas adversos. Uma característica benéfica para o criador é o rápido
desenvolvimento reprodutivo dos ovinos, segundo dados do BNDES, a maturidade
sexual nos machos se apresenta aos oito meses e nas fêmeas se apresenta entre o
sexto e o sétimo mês de vida, com um índice de gestações por ano de 1,5, gerando
no máximo três crias por parto, valor que pode ser até duplicado na presença do
gene Booroola. Além da rápida produção dos carneiros, outra característica
importante é o nível nutritivo que esta carne apresenta, contendo altos níveis de
proteína, alta digestibilidade, vitaminas do complexo B, ferro, cálcio e potássio, além
de ser rica em HDL, considerado um bom colesterol, e possuindo baixo nível de
gordura saturada, sendo uma ótima opção de consumo para a população mundial
que nos últimos anos vem procurando uma vida cada vez mais saudável. (Paganoti
e Rodrigues, 2010).
Pensando no aumento do consumo da carne ovina no Brasil, grandes
empresas que produzem alimentos congelados já estão investindo na venda deste
produto em grandes supermercados, facilitando ainda mais para que a carne de
cordeiro esteja mais frequente na mesa dos brasileiros.
Algumas das maiores dificuldades para o aumento da produção da
ovinocultura no Brasil é a falta de organização e comunicação entre os criadores e o
6
abate informal que chega a representar aproximadamente 93% do consumo da
carne do Brasil. (Paganoti e Rodrigues, 2010). Portanto, deve-se investir no
planejamento da criação, no registro dos animais junto às associações de criadores
e na aplicação do melhoramento genético para que o Brasil seja exemplo de animais
de alta qualidade e com alto valor econômico.
2. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
Conforme previsto no cronograma, após a entrega do projeto iniciou-se a
aplicação dos exames nas amostras já identificadas e cadastradas. Em paralelo, o
levantamento bibliográfico continuou sendo realizado, agregando mais informações
técnicas e científicas ao trabalho. O conhecimento de trabalhos semelhantes trouxe
uma visão mais ampla dos alcances do tema deste trabalho, que certamente será
utilizado para a melhoria e o aumento dos rebanhos de ovinos no Brasil.
Para a realização dos exames foram aprendidas diversas técnicas
laboratoriais que possibilitaram obter resultados precisos e em menor tempo. O
manuseio dos equipamentos, a utilização dos reagentes, a preparação de soluções
e o método de leitura dos resultados foram aplicados de acordo com o protocolo
descrito neste relatório.
O relatório parcial foi apresentado com os resultados de quarenta animais que
foram testados e seus dados coletados para uma avaliação percentual.
Posteriormente, sendo concluídos os exames dos cento e onze animais –
número total de amostras - os dados foram coletados de maneira que permitiram a
análise final dos resultados obtidos, alcançando os objetivos deste trabalho.
7
3. MÉTODO E MATERIAIS UTILIZADOS
3.1 Local de estudo e análise
O estudo foi conduzido em amostras já coletadas e identificadas de
propriedade do Laboratório LinkGen Biotecnologia Veterinária. O levantamento
bibliográfico, a realização, e a análise dos exames foram realizados entre o
laboratório colaborador e o Centro Universitário Fundação Santo André.
3.2 Materiais
Os materiais utilizados para o presente estudo incluem: amostras de pelos
de ovinos de propriedade do Laboratório LinkGen, álcool, pinça, lâmina para corte
do pelo, lamparina para esterilização da lâmina, tubos de 0,2 ml, racks,
termociclador, centrífuga, vortex, pipetas, ponteiras, luvas cirúrgicas, avental
branco, fluxo para preparo das amostras, soluções tampões, água ultra pura,
dNTPs, MgCl2, primer sense e anisense, Taq, enzima para digestão AVAII,
freezer e refrigerador para armazenamento das amostras, becker, cuba de
eletroforese, pente, bandeja, tampão TAE (1x e 10X), padrão de peso molecular
(100bp), corante loading buffer (5X), agarose, brometo de etídio, microondas,
transiluminador (VDS), NaOH (0,2 normal), Tris HCl 1M.
3.3 Procedimentos
Com o auxilio da pinça e da lâmina, os pelos foram separados e cortados,
somente na região do bulbo, que é onde está contido o DNA, foram cortados seis
bulbos, estes foram colocados em um tubo de 0,5 ml.
Com os tubos identificados, adicionou-se 3,0μl de NaOH (0,2N), que foram
levados ao termociclador e incubados por vinte minutos à 80 ºC, após esta etapa foi
adicionado 27μl da solução de Tris HCl 1M.
A reação de PCR foi realizada utilizando-se 10 pM de cada primer (Foward,
5‘-CCAGAGGACAATAGCAAAGCAAA-3’
e
Reverse,
5’-
CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACAGGTC -3’), 100 μM de cada dNTPs, 1.5 mM
de MgCl2, 10x de PCR buffer, 2 ul de amostra de DNA e 1 unidade de Taq DNA
8
polimerase em reação de 25 μL. As amostras foram homogeneizadas em vortex, por
quatro segundos e colocadas no termociclador para a PCR, sendo as tempeturas e
tempos: 94ºC por dois minutos, trinta e nove ciclos de 95ºC por vinte segundos,
60ºC por trinta segundos e 72ºC por trinta segundos. Uma extensão final de 72ºC
por cinco minutos e 4ºC até a reação ser retirada do termociclador. Após a etapa da
PCR, as amostras foram digeridas com uma unidade de enzima de restrição AVAII a
37ºC por cinco minutos para a ativação da enzima e 65ºC por dez minutos para a
inativação da enzima . As amostras foram armazenadas em refrigerador.
Após a digestão, foi preparado gel de agarose em um becker contendo 194g
de agarose em pó e 50ml de TAE 1X. A solução foi colocada no microondas por dois
minutos e foi adicionados 2μl de brometo de etídio. Posteriormente, a solução foi
despejada em uma bandeja, o pente inserido e esperou-se a gelificação por trinta
minutos.
As amostras foram preparadas utilizando-se 3μl de loading buffer e foram
aplicadas nos poços do gel de agarose, também foi adicionado em um dos poços do
gel 4μl do padrão de peso molecular de 100pb. O gel foi colocado na cuba de
eletroforese com a solução tampão TAE 20X.
O tempo de corrida do gel foi de trinta e cinco minutos. Após a corrida, o gel
foi retirado da cuba e segue para a etapa da análise.
A leitura dos resultados é realizada por meio das bandas que aparecem no
gel quando este é submetido à luz UV. Comparou-se as bandas correspondentes às
amostras com as bandas do padrão de peso molecular, interpretando-as da seguinte
maneira:
120bp
Não portador
FecB+/FecB+
90bp e 120bp
Heterozigoto
FecBB/FecB+
90bp
Portador homozigoto
FecBB/ FecBB
9
100bp
SR
SR
B+
++
SR
B+
B+
++
B+
B+
++
++
Análise dos resultados após PCR e digestão das amostras no gel de agarose:
100bp
Figura 1 - Análise para identificação do gene Booroola. Considerando que B+ representa
B
+
heterozigoto para o gene (FecB /FecB ) e ++ representa indivíduo não portador do gene
+
+
(FecB /FecB ).
O levantamento da freqüência com que o gene aparece nos animais
estudados foi realizado em amostras previamente identificadas e cadastradas,
descrevendo esta freqüência em valores percentuais.
A pesquisa referente à importância econômica da carne de ovinos no Brasil
foi realizada a partir de levantamento bibliográfico com materiais produzidos para o
próprio criador de ovinos e pesquisas e estudos científicos.
10
4. RESULTADOS
A partir dos resultados analisados e das informações obtidas pode-se
registrar os dados de cento e onze amostras que resultaram em cinquenta e oito
animais que não possuem o gene Booroola (FecB+/FecB+), cinquenta e três animais
que se apresentaram heterozigotos para a mutação (FecBB/FecB+) e nenhum animal
homozigoto para o gene Booroola (FecBB/ FecBB), assim, os animais não portadores
do gene Booroola representam 52,25% e os animais heterozigotos para o gene
representam 47,74% das amostras analisadas, números que se apresentam muito
próximos aos números do relatório parcial apresentado anteriormente, na qual vinte
e um animais não apresentaram o gene Booroola (52,5%) e dezenove animais se
apresentaram heterozigotos (47,5%).
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A ovinocultura brasileira necessita de mais atenção por parte do governo, dos
consumidores e principalmente dos criadores dos ovinos. É preciso que haja
organização entre criadores e associações, planejamento para que a produção
aumente e o preço da carne diminua e investimento para a popularização da carne
de cordeiro e para tecnologias que melhoram o rebanho. O gene Booroola pode
colaborar muito com o melhoramento genético dos ovinos e com o aumento da
produção, diminuindo o alto índice de importação deste tipo de carne e o índice de
abatimentos clandestinos, tornando a economia da ovinocultura mais significante
para o Brasil, podendo até mesmo estar próximo das produções da carne bovina e
suína. Sendo assim, a identificação do gene Booroola nos ovinos por meio do
exame de DNA é indispensável para que tais melhorias de fato ocorram.
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