CAMPUS DE SETE LAGOAS
Camila da Silva Fernandes Souza
Seletividade do Baculovirus spodoptera (SfMNPV) às
espécies de lagartas do milho
Sete Lagoas –MG
Abril/2013
Camila da Silva Fernandes Souza
Monografia apresentada à Universidade
Federal de São João Del Rei, como parte das
exigências do Programa de Graduação do
Bacharelado
Interdisciplinar
em
Biossistemas, para a obtenção do título de
Bacharel em Biossistemas.
Orientador: Marcos Antônio Matiello Fadini
Coorientador: Fernando Hercos Valicente
Sete Lagoas-MG
Abril/2013
DEDICO
Aos meus pais pelo apoio nos estudos por
extrema dedicação e incondicional amor.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente à Deus por nunca me abandonar.
A Universidade Federal de São João Del Rei pela oportunidade de ingressar no
programa de Bacharelado Interdisciplinar em Biossistemas.
A Embrapa Milho e Sorgo por ceder suas dependências para realização do
trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pela bolsa
de iniciação científica.
Ao Doutor Fernando Hercos Valicente pela dedicada orientação, importantes
oportunidades, carinho, apoio, valiosos ensinamentos e ajuda de sempre.
Ao Prof. Marcos Antonio Matiello Fadini pelo apoio, confiança, oportunidade,
disponibilidade e dedicação.
A Profa. Cidália Gabriela Santos Marinho pela presença na banca de
qualificação, contribuindo grandemente com o trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Controle Biológico, da Embrapa Milho e
Sorgo Celso, Osmar, Arthur, Rosane, Thaís, Donald pelas ajudas experimentais
e grandes alegrias no convívio no dia-a-dia de trabalho.
Ao André pela ajuda, apoio, carinho, companhia, exemplo e ajuda de
sempre.
Aos meus amados pais Ronaldo e Wania pelo grandioso apoio e enorme amor.
Aos meus irmãos Raphael, Daniel e Bruno pelo grande apoio, carinho e
paciência.
Ao meu namorado Thiago pelo carinho, apoio, paciência, dedicação e amor.
A todos os meus amigos pelos momentos de descontração, apoio e carinho.
A Vania por contribuir para o meu futuro com importante ensinamento, grande
apoio e carinho.
A toda minha família, tios, tias, primos, primas, avós e agregados pelo apoio e
torcida.
Às minhas grandes amigas Débora, Kelly, Alessandra e Fernanda pela torcida,
carinho, demonstração de verdadeira amizade, apoio e por estarem sempre
presentes em minha vida.
Aos meus amigos do curso de biossistemas Fabrício, Carine e Priscilla pelo
apoio, momentos de descontração, companhia e ajuda nos estudos.
Aos colegas, funcionários, professores e pesquisadores da Universidade Federal
de São João Del Rei e Embrapa Milho e Sorgo.
E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a
realização deste trabalho meus sinceros agradecimentos e reconhecimento.
“A ciência sem consciência
e amor é a ruína do homem.”
Guimarães Rosa
RESUMO
Os baculovírus são um grupo de vírus que possui toxidade para insetos.
Estes vírus são isolados de invertebrados, principalmente lepidópteros e são
específicos. Objetivou-se avaliar a toxidade do Baculovirus spodoptera
(SfMNVP) - 6NR a, lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), a lagarta-daespiga (Helicoverpa zea) e a broca-do-milho (Diatraea saccharalis). Foram
utilizadas como alimento para inoculação do baculovírus folhas de milho
cortadas em discos para lagarta-do-cartucho e para lagarta-da-espiga. Para D.
saccharalis foram utilizados pedaços cortados de cana-de-açúcar. As folhas de
milho e os pedaços de cana foram imersos em solução viral de Baculovirus
spodoptera (SfMNVP) - isolado 6NR em diferentes concentrações. As larvas
foram deixadas em contato com o alimento contaminado por 48 horas. Após este
período elas foram transferidas para dieta artificial, e acondicionadas em sala
aclimatizada em temperatura de 25,0  1ºC, 50,0 ± 10% UR e 8 horas de
fotofase. Após a avaliação da mortalidade das larvas, foi feito acompanhamento
da segunda geração das lagartas sobreviventes. Foram avaliados, para ambas as
gerações, nas três espécies a porcentagem de mortalidade e pupação e o número
de massas de ovos na primeira geração. O baculovírus foi específico para S.
frugiperda e inócuo tanto para H. zea quanto para D. saccharalis na primeira
geração. Na segunda geração o B. spodoptera (SfMNVP) - isolado 6NR foi
inócuo para as três espécies de lagartas. A porcentagem de pupação apresentou
relação inversa à mortalidade para as três pragas nas duas gerações. O número
de massas de ovos foi menor em S. frugiperda e não alterou para D. saccharalis
e maior em H. zea. O B. spodoptera (SfMNVP) - isolado 6NR é seletivo para S.
frugiperda.
Palavras-chave: lagarta-da-espiga, lagarta-do-cartucho, broca-do-milho, vírus
entomopatogênico.
ABSTRACT
The baculovirus are groups of virus which present toxicity to insects.
These virus are isolated from invertebrate, mainly in Lepidoptera and they are
specific. This study had as objective to assess the toxicity of Baculovirus
spodoptera (SfMNPV) 6 NR on the species of insects, fallarmyworm
Spodoptera frugiperda, earworm Helicoverpa zea and Diatraea saccharalis.
Leaves of corn cut in disks were used as food for inoculation of baculovirus for
fallarmyworm and earworm. It was used cut pieces of sugar cane to D.
saccharalis. The leaves of corn and the pieces of sugar cane were emerged into a
viral solution from Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6 NR in different
concentrations. The larvae were left in contact with the contaminated food for 48
hours. After this period they were transferred to an artificial diet, and
conditioned inside an acclimatized room in a temperature of 25.0  1ºC, 50.0 ±
10% UR e 8 hours of photophase. After evaluating the mortality of the larvae it
was done an accompanying of the second generation of the survival larvae.
There were assessed for both generations on three species the percentage of
mortality and pupa phase and the number of the mass of eggs on the first
generation. The results showed that the used baculovirus was specific related to
S. frugiperda and innocuous as to H. zea as to D. saccharalis on the first
generation. On the second generation the B. spodoptera (SfMNPV) – 6NR was
innocuous for the three species of larvae. The percentage of pupa had an inverse
relation to mortality to the three pests in both generations. And the number of
mass of eggs was less in S. frugiperda did not alter for D. saccharalis and more
in H. zea. The B. spodoptera (SfMNPV) – 6NR is selective to S. frugiperda.
Key words: earworm, fallarmyworm, corn borer, entomopathogenie
virus.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 10
2. REFERENCIAL TEÓRICO .......................................................................... 13
2.1. A CULTURA DO MILHO .......................................................................... 13
2.2. CONTROLE BIOLÓGICO ......................................................................... 13
2.3. LAGARTA-DO-CARTUCHO DO MILHO (Spodoptera frugiperda) ........ 14
2.4. LAGARTA-DA-ESPIGA (Helicoverpa zea). ............................................. 16
2.5. BROCA-DO-MILHO (Diatraea saccharalis) ............................................. 17
2.6. Baculovirus spodoptera ............................................................................... 19
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 24
3.1. CRIAÇÃO DE INSETOS ............................................................................ 24
3.2. CONTAGEM DE ESPOROS ...................................................................... 27
3.3. INOCULAÇÃO DO BACULOVÍRUS ....................................................... 28
4. RESULTADOS .............................................................................................. 31
4.1. EFEITOS LETAIS ...................................................................................... 31
4.2. EFEITOS SUBLETAIS ............................................................................... 35
5. DISCUSSÃO .................................................................................................. 37
6. CONCLUSÃO ................................................................................................ 40
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 41
INTRODUÇÃO
O milho é uma gramínea pertencente à família Gramineae/ Poaceae e
um dos cereais mais produzidos do mundo. De acordo com o último
levantamento da companhia Nacional de Abastecimento (Conab, 2012), houve
um destaque na segunda safra de milho que apresenta crescimento de 29,9%
(1,41 milhão de hectares) passando de 6,17 milhões para 7,58 milhões de
hectares. A soma das duas safras de milho totalizaram 72,78 milhões de
toneladas. Uma das principais limitações na produção do milho é a presença de
insetos praga como as lagartas.
A lagarta-do-cartucho Spodoptera frugiperda é a principal praga do
milho no Brasil reduzindo a produção de grãos em até 34% (Carvalho, 1970). A
medida que as lagartas crescem as injúrias aumentam, passando de folhas
raspadas para orifícios maiores, podendo causar injúria às plantas. Podem ainda
injuriar a base da espiga ou mesmo diretamente os grãos leitosos (Cruz et al.,
1995). Em laboratório, S. frugiperda pode ser criada com dieta artificial a base
de feijão carioca, germe de trigo e farelo de soja, em temperatura entre 25 e 28
°C (Busato, 2004). As perdas de milho podem variar de acordo com a fase de
desenvolvimento da planta, com as práticas de cultivo e localização do plantio
próximo a áreas adjacentes que podem apresentar foco da praga (Cruz, 1995).
Diversos inseticidas são registrados para o controle da lagarta-do-cartucho.
Entretanto, o agricultor deve priorizar a seletividade visando a manutenção de
populações de inimigos naturais (Cruz et al., 1995).
A lagarta-da-espiga, Helicoverpa zea é considerada praga chave do
milho nos Estados Unidos, causando maior dano dentre os demais insetos. O
controle é difícil devido ao seu hábito de se instalar dentro da espiga. Portanto, o
controle químico não é eficiente, além de deixar resíduos principalmente para
consumo in natura (Cruz et al., 1995). Uma das principais causas da baixa
10
produção e redução da qualidade dos grãos são as injúrias causadas pela lagartada-espiga que facilita a entrada de micotoxinas e fungos, provocando ocorrência
de grãos ardidos e perda de valor no comércio (Luiz & Magro, 2007). Essa
espécie é importante, por causar injúria direta ao milho, parte a ser
comercializada. Por esse motivo deve ser controlada logo após o início das
posturas (Cruz et al., 1995).
A broca Diatraea saccharalis também é uma praga de grande
importância no milho atacando o colmo. Quando a D. saccharalis está
completamente desenvolvida, constrói uma câmara, alargando a galeria até o
colmo. Através dessas galerias, a broca torna a planta suscetível á queda por
ação do vento, podendo surgir prejuízos indiretos, que talvez sejam os mais
importantes, pois quando a planta cai, a espiga fica em contato direto com o
solo, favorecendo a germinação dos grãos, ocorrência de doenças e ação dos
microrganismos (Cruz et al., 1995).
O controle de pragas de milho é comumente feito com o uso de
inseticidas
organo-sintéticos,
que
podem
impactar
negativamente
o
agroecossistema (Machado, 2009). Devido a esses efeitos negativos, buscam-se
formas alternativas como controle biológico, que pode ser utilizado em
associação com outras táticas de controle. Assim, utilizam-se, com sucesso,
agentes entomopatogênicos, como vírus, fungos, nematóides ou bactérias no
controle microbiológico (Oliveira et al., 2006).
Uma das opções de utilização destes organismos no controle biológico
de lagartas no milho é os baculovírus, que pertencem a um grupo de vírus que
possui patogenicidade aos insetos (Almeida, 2010). Os baculovírus são da
família Baculoviridae, possuem DNA de fita circular e tem grande potencial de
afetar artrópodes e possui os gêneros nucleopoliedrovírus (NPV) e granulovírus
(Gv) os quais atuam no intestino médio dos insetos (Valicente & Tuelher, 2009).
Como essa região do sistema digestivo dos insetos é alcalino, os corpos de
11
inclusão viral são dissolvidos, liberando os virions (nucleocapsídeo mais o
envelope). Quando os baculovírus atingem a hemolinfa e o sistema traqueal do
inseto, se espalham e provocam infecções, causando a ruptura das membranas
celulares. Neste processo o inseto perde a capacidade de se alimentar e se
locomover e ocorre também uma descoloração do corpo do inseto. A
multiplicação e disseminação desse vírus é muito eficiente (Moscardi & Souza,
2002). Esse entomopatógeno eficiente controle da S. frugiperda, promovendo
mortalidade superior à 80% (Valicente & Tuelher, 2009). Além de sua
eficiência, o baculovírus não afeta inimigos naturais, como por exemplo, os
parasitóides (Valicente et al., 1988), o que torna técnica vantajosa frente ao
controle químico.
Neste trabalho, objetivou-se avaliar a toxicidade do Baculovirus
spodoptera isolado 6NR sobre as lagartas de S. frugiperda, H. zea e D.
saccharalis.
12
REFERENCIAL TEÓRICO
A cultura do milho
O milho (Zea mays L.) é uma gramínea muito cultivada em todo o
mundo, e isso se deve ao fato de ser um produto agrícola utilizado na
alimentação humana e animal. Ápos o processo de seleção natural e
domesticação, foi possível produzir uma planta anual, vigorosa e ereta de até
quatro metros de altura e uma maior eficiência na produção de grãos (Magalhães
et al., 2002).
Dentre os fatores que contribuem para redução da produção do milho, o
ataque de pragas é um dos mais importantes. Para o controle dessas, utilizam-se
tradicionalmente inseticidas organo-sintéticos. Esta prática, entretanto, quando
mal utilizada por impactar negativamente o agroecossistema, reduzindo a
população de inimigos naturais ou proporcionando o surgimento de populações
de pragas resistentes. Assim, estimula-se a utilização de métodos de controle
alternativo. Dentre esses, têm-se o controle biológico microbiológico é opção ao
controle químico de pragas por reduzir riscos à saúde humana e ao meio
ambiente (Cruz, 1995).
Controle Biológico
O controle biológico é uma das bases do manejo integrado de pragas e é
definido como “a ação de inimigos naturais sobre uma população de pragas
resultando numa posição geral de equilíbrio mais baixa do que prevaleceria na
ausência destes” (Gravena, 1992). Esse tipo de controle vem sendo cada vez
mais utilizado uma vez que a sociedade está mais consciente, sendo um
importante passo para uma agricultura mais sustentável (Parra et al., 2002).
Existem três tipos de agentes para o controle biológico, os predadores,
os parasitoides e os microrganismos. Tais agentes podem ser empregados em
13
estratégias de controle biológico como: A introdução de inimigos naturais,
chamado (controle biológico clássico); o natural que consiste em favorecer as
populações de inimigos naturais, e (controle biológico aplicado) que é a
multiplicação dos inimigos naturais em laboratório e aplicação no campo
(Gravena, 1992).
A agricultura causa impacto ambiental pela remoção da vegetação nativa
e implementação de outra que exige o fim do processo de sucessão natural
(Machado, 2009). Dentre as pragas, se destacam os insetos, que possuem
sucesso habitacional, vivem praticamente em todos os locais e se adaptam
facilmente às diversidades ambientais. Portanto, há necessidade de controle de
populações de insetos praga de forma eficiente e sustentável. Em busca deste
objetivo, atualmente utilizam-se com sucesso, agentes entomopatogênicos,
sendo eles vírus, fungos, nematoides ou bactérias. Esses indivíduos são os mais
usados nos métodos de controle biológico (Oliveira et al. 2006). Existem alguns
exemplos de sucesso no controle biológico com entomopatógenos como: o
fungo Beauveria bassiana que ataca coleopteros (e.g. moleque-da-bananeira), o
fungo Insectonrum sporothrix que ataca hemípteros (e.g. percevejo-da-renda).
Entre os vírus, além do Baculovirus spodoptera que controla a lagarta-docartucho, tem o vírus Baculovirus anticarsia que controla a lagarta-da-soja, e o
vírus granulose que atua sobre o madorová-da-mandioca. O nematoide
Deladendus siridicola controla a vespa-da-madeira e outro agente de sucesso é a
bactéria Bacillus thuringiensis que atua em lagartas desfolhadoras (Oliveira,
2006).
Lagarta-do-Cartucho (Spodoptera frugiperda)
A lagarta-do-cartucho S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), foi
reconhecida como praga do milho em 1797, na Geórgia, Estados Unidos (Cruz,
1995). Foi primeiramente nomeada Phalaema frugiperda. Desde então, mudou
14
de nome várias vezes, até a denominação atual (Cruz, 1995). A lagarta-docartucho é considerada a principal praga da cultura do milho no Brasil reduzindo
a produção de grãos em até 34% (Carvalho, 1970). Seu controle é feito
essencialmente com inseticidas organo-sintéticos, sendo que existem vários
programas de controle biológico para o controle desta e outras pragas para
minimizar os danos causados ao meio.
O inseto adulto é uma mariposa com aproximadamente de 3,5 cm de
comprimento, coloração pardo-escura nas asas anteriores e branco-acinzentada
nas posteriores. As posturas são feitas em massa, com média de 150 ovos. O
período para eclosão das larvas é de aproximadamente três dias. As larvas
recém-eclodidas alimentam-se da própria casca do ovo e, posteriormente, as
lagartas se alimentam das partes áreas da planta, provocando o sintoma
conhecido como “folhas raspadas”. O que é um sintoma da presença da lagarta
na cultura. A medida que as lagartas crescem, começam a fazer orifícios nas
folhas, podendo causar severas injúrias às plantas. É comum também o ataque na
base da espiga ou nos grãos leitosos (Cruz et al., 1995).
As perdas no milho podem variar de acordo com a fase de
desenvolvimento da planta, práticas de cultivo, presença da praga em áreas
adjacentes, entre outros (Cruz et al., 1995). Diversos inseticidas são registrados
para o controle da lagarta-do-cartucho. Deve-se, entretanto, preocupar-se com a
sustentabilidade, priorizando a escolha da seletividade para que não afete os
inimigos naturais, tenha alta eficiência e não interfira na saúde humana (Cruz et
al., 1995). A utilização de inimigos naturais também é de grande ajuda no
controle da lagarta-do-cartucho, onde não há a presença dos inimigos naturais a
intensidade dos danos no milho é elevada (Figueiredo et al., 2006). A
produtividade das lavouras pode aumentar em até 75 Kg/ha, em média, nas áreas
onde é liberado o parasitóide Trichogramma pretiosum, inimigo natural da
15
lagarta-do-cartucho (Luiz & Magro, 2007), demostrando a magnitude do dano
causado pelas lagartas.
Lagarta-da-espiga (Helicoverpa zea)
A Lagarta-da-espiga Helicoverpa zea (Lepidopetera: Noctuidae) possui
como hospedeiro, além do milho, outras gramíneas, leguminosas e hortaliças. A
lagarta-da-espiga é uma das mais importantes pragas de milho nos Estados
Unidos (Cruz et al., 1995). O controle é difícil pelo seu hábito de alojar-se
dentro da espiga. Assim, o controle com inseticidas não é eficiente. Por isso, fazse necessário a implementação de métodos de controle que sejam mais efetivos
(Cruz et al., 1995).
O ovo da H. zea mede aproximadamente 1 mm de diâmetro. Após a
eclosão, as lagartas se deslocam para dentro da espiga deixando um
característico orifício, o que facilita a sua identificação na planta (Cruz et al.,
1995). A fêmea pode ovipositar em qualquer parte da planta, mas o faz com
maior frequência no cabelo do milho. Cada fêmea oviposita em média mil ovos
durante seu ciclo. Os ovos são depositados separadamente e geralmente um ou
dois por planta (Cruz et al., 1995).
A lagarta desenvolvida mede aproximadamente 3,5 cm e possui
coloração variável de verde claro, rosa, marrom a levemente escura, com partes
mais claras. As asas anteriores são de coloração amarelo-parda e as asas
posteriores são mais claras, com uma faixa nas extremidades. Na fase do milho
verde, como a lagarta possui comportamento canibal, encontra-se geralmente
uma lagarta por espiga, na ponta desta. O período larval é de 13 a 25 dias e se
aproxima da fase de pupa, as larvas vão para o solo para ocorrência do processo
pupal. Este período necessita de 10 a 15 dias para se completar (Cruz et al.,
1995). Uma das principais causas da baixa produção e baixa qualidade dos grãos
são as injúrias causadas pela lagarta-da-espiga, que facilita a entrada de
16
micotoxinas e fungos, provocando a ocorrência de grãos ardidos, reduzindo
valor no comércio (Luiz & Magro, 2007).
O controle dessa praga deve ser feito após o início das posturas, e a
utilização de cultivares com bom empalhamento, pode diminuir a incidência. O
controle biológico dessa praga pode ser feito através de parasitoides, predadores
e entomopatógenos o que pode proporcionar melhor produção do milho (Cruz et
al. , 1995).
Além do prejuízo direto causado pela lagarta-da-espiga, seu ataque
favorece a infestação de outras pragas importantes, como o caruncho Sitophilus
zeamais e a traça Sitotroga cerealella (Cruz et al., 1995).
Luiz & Magro (2007) verificaram aumento na massa específica e no
peso de mil sementes do milho para aquelas áreas onde foram liberados inimigos
naturais. Atingiram-se valores de 514,6 g e 347,5 g, respectivamente, para massa
específica e peso de 1000 sementes, comparados com os 505,2 g e 327,8 g
obtidos nas áreas de manejo convencional das pragas. Isto mostra aumento na
produtividade, havendo um acréscimo médio de 75 kg/ha. Foi observada
também uma redução de cerca de 40% de incidência de grãos ardidos, nas áreas
onde se utilizou o controle biológico.
Broca-do-milho (Diatraea saccharalis)
O inseto adulto da Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Pyralidae) é uma
mariposa de coloração amarelo-palha de 20 mm de envergadura. Os ovos tem
aspecto de escamas e são colocados nas folhas do milho, inicialmente possuem
coloração amarelo-claro a alaranjado, que escurece quando se aproxima da
eclosão. A eclosão das lagartas ocorre entre quatro a nove dias, sendo que
inicialmente as larvas se alimentam da folha do milho, e depois se deslocam para
a bainha, entrando no colmo, fazendo galerias ascendentes. A fase larval dura
cerca de 70 dias, dependendo da temperatura. As lagartas possuem cabeça
17
marrom e o corpo esbranquiçado com certa transparência, com muitos pontos
escuros. Quando as lagartas estão desenvolvidas, com o consumo do colmo,
causam alargamento da galeria, este comportamento é característico quando se
aproxima do período de pupa que varia de 9 à14 dias (Cruz et al., 1995). A
ocorrência da broca pode ser constatada pela abertura do colmo do milho e da
galeria deixada pela lagarta (Cruz et al. ,1995).
Com o objetivo de implementar o manejo dessa praga utilizando o
controle biológico, trabalhos são realizados primeiro em condições de
laboratório. Por exemplo, D. saccharalis tem melhor eficiência de conversão de
alimento ocorre em temperatura entre 25 e 30 ºC em laboratório com dieta
artificial (Souza et al., 2001). As galerias provocadas por D. saccharalis deixam
a planta mais vulnerável à queda pela ação do vento, o que é um prejuízo
indireto (Cruz et al., 1995).
Guevara (1980) em condições de laboratório, a fim de liberar machos
estéreis no campo para diminuir a copulação das fêmeas de D. saccharalis,
observou que os machos nunca copularam mais de uma vez com mesma fêmea,
somente um macho copulou duas fêmeas diferentes. Nas mesmas condições,
nenhuma fêmea foi copulada mais de uma vez, nem mesmo quando confinada
com até quatro machos. Em condições de campo, as fêmeas podem copular até
quatro vezes. Tornam-se necessários mais estudos, para verificação do número
de cópulas do macho.
Oliveira et al. (2008) confirmaram a eficiência do controle desta praga
utilizando o fungo como agente entomopatogênico. Utilizaram-se fungos
Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae com viabilidade de 95%. A média
da viabilidade larval decresceu significativamente de acordo com a concentração
utilizada. A menor viabilidade foi de 56% com a concentração de 105 conídios
por ml. Em todos os parâmetros verificados obteve-se sucesso, e mesmo quando
18
não houve mortalidade, comprometeu as características da praga com
fecundidade longevidade e viabilidade dos ovos.
Baculovirus spodoptera
Os baculovírus pertencem a um grupo de vírus que possui toxidade para
insetos. Estes vírus são isolados de invertebrados, principalmente lepidópteros e
são bem específicos. Os baculovírus não causam prejuízo à saúde humana nem
ao ambiente, o que torna o seu uso vantajoso (Almeida, 2010). Os baculovírus
são da família Baculoviridae, composta por vírus com DNA de uma fita dupla
circular e possui dois gêneros: nucleopoliedrovírus (NPV) e granulovírus (GV).
Os baculovírus possuem uma estrutura básica com um capsídeo coberto de uma
forma arredondada. O nucleocapsídeo é um “core” cilíndrico de DNA e
proteína, internamente a fita de DNA associa-se com uma proteína básica. Os
nucleocapsídeos são organizados de formas diferentes dentro de cada envelope
protéico, o que faz com que se dividam em dois grupos diferentes de acordo com
a forma. Dentro do gênero nucleopoliedrovírus (NPV) tem os “vírus de simples
nucleocapsídeo” – SNPV, o qual possui somente um capsídeo por envelope, e
nos “vírus de múltiplos nucleocapsídeos” – MNPV, são encontrados vários
nucleocapsídeos por envelope (Valicente & Tuelher, 2009).
Esses vírus produzem dois tipos de fenótipos o “budded vírus” (BVs) e
vírus derivados de corpos de oclusão (ODV). Os corpos proteicos de inclusão do
baculovírus ficam expostos nas folhas pulverizadas, e a lagarta quando se
alimenta, proporciona a entrada dos corpos de inclusão (CPIs) virais no sistema
digestivo.
Como o intestino médio dos insetos é alcalino, os CPIs são dissolvidos
liberando os vírions. Então as membranas se fundem às membranas das
microvilosidades das células epiteliais do intestino médio. Logo, os
19
nucleocapsídeos passam pelo citoplasma da célula e penetram nos poros
nucleares até chegar ao núcleo e liberar o DNA viral, ocorrendo a transcrição
dos genes do vírus e a replicação. Esses nucleocapsídeos que se formaram no
núcleo passam pela membrana nuclear e atravessam a membrana basal da célula,
adquirindo um novo envelope. Quando os BVs chegam à hemolinfa e ao sistema
traqueal do inseto, se espalham e provocam infecções secundárias em outros
tecidos do corpo do inseto. Nas células destes tecidos formam-se BVs e ocorre a
disseminação célula á célula. Quando o estágio da infecção já está avançado,
ocorre a oclusão dos vírions. Os núcleos dessas células tornam-se repletas de
CPIs, liberando esses na hemolinfa do hospedeiro e causando a ruptura das
membranas celulares. Neste processo de infecção, o inseto perde a capacidade
de se alimentar e se locomover, se posicionando nas partes mais altas da planta
onde morre entre cinco e oito dias, com descoloração do corpo (Moscardi &
Souza, 2002).
Nas duas últimas décadas, os baculovírus tem sido exportados para
várias partes do mundo, a fim de controlar diversas pragas, como Spodoptera
exigua (SeNPV), Helicoverpa zea e Heliothis virescens (HzNPV), Orgyia
pseudosugata (OpNPV), entre muitas outras. Para classificação do baculovírus é
necessária a purificação das partículas virais do corpo do inseto. Estes processos
de purificação são realizados em ciclos de centrifugação em alternadas
velocidades para separar os vírus de outras misturas e impurezas. Quando é
necessário um maior grau de pureza, utiliza-se centrifugação em gradiente de
sacarose. Depois das partículas purificadas, é possível fazer a classificação
morfológica, bioquímica, molecular e biológica, cada classificação é feita por
um processo diferente. Através da microscopia eletrônica é possível verificar a
morfologia, que é de acordo com o número de capsídeo por vírion, podendo ser
múltiplo ou simples e pela forma poliédrica ou ovalada. Na análise bioquímica,
podem ser determinadas proteínas estruturais, identificadas através da
20
eletroforese com gel de poliacrilamida, separando as proteínas de acordo com o
tamanho. A técnica de análise por endonuclease de restrição (REN) é usada para
diferenciar ou identificar isolados de baculovírus e caracterizar a variação
genotípica entre eles. Um gene específico pode permitir a identificação de um
isolado viral particular, isto pode servir como monitoramento no campo após a
liberação do vírus. Através de bioensaios pela sua dose letal média (DL50) é
avaliado a patogenicidade do vírus em seu hospedeiro, e o tempo letal médio
(TL50), também é um parâmetro importante para verificar o tempo de ação do
vírus em seu hospedeiro (Souza et al., 2002).
Foram encontrados na Colômbia três baculovírus isolados de
Spodoptera frugiperda NPV003-Córdoba, NPYPP9-Meta e NPV011-Tolima.
Eles foram isolados, identificados e caracterizados como vírus de múltiplos
nucleocapsídeos, contendo de 1 à 8 vírions por nucleocapsídeo. Estes mostraram
a mesma atividade em larvas recém-eclodidas, levando a aproximadamente 95%
de mortalidade (Valderrama et al., 2010). Para a aplicação do baculovírus em
campo é necessário a produção do inseticida biológico em laboratório. Neste
processo utilizam-se lagartas sadias criadas com dieta artificial para serem
utilizadas como hospedeiros. O tamanho das lagartas devem ser uniformes e
com idade entre 5 e 7 dias para uma melhor eficiência na coleta das lagartas
infectadas e mortas para multiplicação do vírus em maior escala. A temperatura
e a umidade devem ser controladas. No caso de S. frugiperda, como é uma
espécie canibal, após o quinto dia as lagartas devem ser separadas e confinadas
em copos plásticos contendo dieta artificial até o término do ciclo da infecção
para realização do processo de produção, que consiste na purificação e obtenção
do produto final que é o pó molhável para aplicação no campo. Uma alternativa
para eficiente produção, é utilização de um hospedeiro alternativo não canibal,
que facilita o processo, reduzindo o tempo de produção (Valicente & Tuelher,
2009).
21
O inseto depois da morte rompe o corpo liberando vários vírus no
ambiente, o que faz com que outro inseto possa também ser infectado após a
ingestão desses. Foi encontrado em Cascavel, PR, um Baculovirus spodoptera
que não rompe o tegumento da lagarta após sua morte, o isolado 6NR. Isto faz
que não tenha a necessidade de congelar as lagartas antes da coleta para
realização do processo de manipulação e produção, o que reduz a mão de obra,
deixando valor do produto final mais baixo (Valicente et al., 2008).
Como a multiplicação e disseminação do vírus são muito eficientes, a
aplicação deste inseticida a base de baculovírus pode ser utilizado no campo em
menor número, comparado ao inseticida químico (Moscardi & Souza, 2002), o
que torna a técnica vantajosa. A determinação do tempo de viabilidade do
produto biológico utilizado é muito importante para que a utilização no campo
seja eficiente. Valicente & Tuelher (2009) avaliaram o tempo de prateleira do
Baculovirus Spodoptera com caolin e zeólita. Após um ano de armazenamento
não houve diminuição da eficiência no controle de S. frugiperda. Os autores
também afirmam ser importante a adição de adjuvantes e proteção contra a luz
ultravioleta para uma melhor eficiência do uso no campo. A adição de
espalhante adesivo garante melhor aderência e cobertura nas folhas. Recomendase a sua aplicação no campo, após 16h para que não tenha uma menor incidência
de radiação solar.
Em experimento realizado para avaliar a interação do Baculovirus
spodoptera em uma alta concentração e os inimigos naturais da S. frugiperda,
foi observado que, após a aplicação do inseticida biológico a porcentagem de
plantas atacadas caiu até 14,5%, e a presença de parasitóides e inimigos naturais
como a tesourinha que preda os ovos foi significativa (Figueiredo et al., 2009).
Bolonheiz et al. (2010) observaram o controle do Baculovirus
spodoptera e um inseticida químico no controle da lagarta-do-cartucho, obtendo
um resultado eficiente em ambos produtos. Mas o inseticida químico houve um
22
controle positivo independente do instar em que a lagarta se encontrava agindo
em menor tempo depois da aplicação. Já o baculovírus houve uma eficiência em
maior tempo depois da aplicação. Os autores concluem que o baculovírus pode
ser utilizado juntamente com inseticidas químicos seletivos em subdosagens,
para uma ação sinérgica e também evitando uma superdosagem de produtos
químicos.
Gomez et al. (1999) avaliaram a viabilidade de isolados geográficos em
diferentes regiões do mundo e observaram que não houve diferença significativa
do tempo letal entre os isolados, mostrando que a região não interfere e sim a
suscetibilidade de cada inseto a determinado baculovírus. Polanczyk & Alves
(2005) concluíram que quanto maior a concentração do vírus, melhor é sua
interação com outros agentes de controle, neste caso utilizando a lagarta-docartucho. Almeida (2010) afirma que mesmo os isolados sendo do mesmo
baculovírus podem apresentar diferentes modos de ação, diferente produção de
corpos de oclusão mesmo submetidos ao mesmo processo de infecção
De acordo com Valicente & Costa (1995) a eficiência na mortalidade
das larvas de S. frugiperda, foi diretamente proporcional com a dosagem do
vírus aplicado no campo, alcançando até 90,7% da mortalidade. Valicente et al.
(1988) observaram um decréscimo na mortalidade de larvas de S. frugiperda,
quando a infecção com baculovírus foi em lagartas mais velhas. Figueiredo
(2004) observou que na aplicação do baculovírus não diminuiu a ocorrência dos
inimigos naturais de S. frugiperda pela sua seletividade. Já depois da aplicação
de inseticidas químicos, houve uma diminuição da presença dos inimigos
naturais, provando a importância do uso do controle biológico para o equilíbrio
ambiental.
De acordo com os trabalhos citados pode-se constatar que a utilização
do Baculovirus spodoptera constitui uma ferramenta alternativa ao controle de
S. frugiperda.
23
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado na Embrapa Milho e Sorgo, Sete LagoasMG. O baculovírus utilizado foi o isolado 6 NR que foi retirado da lagarta
Spodoptera frugiperda e não rompe o tegumento após a morte. O baculovírus foi
retirado do banco da Embrapa Milho e Sorgo, purificado em gradiente de
sacarose para retirada impurezas e aumento do grau de pureza do vírus.
Criação de inseto
As espécies testadas foram Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea e
Diatraea saccharalis, provenientes da criação do laboratório de controle
biológico, criadas em copos descartáveis de 50 ml com tampa de acrílico.
As lagartas D. saccharalis foram depositadas em placas de petri e
alimentadas com dieta artificial da eclosão até a fase de pupa. Após a
emergência, os adultos foram alojados em gaiolas de PVC contendo papel ofício
para oviposição. Utilizou-se como alimento solução açucarada (açúcar e ácido
ascórbico), com exceção de D. saccharalis. As lagartas foram acondicionadas
em sala aclimatizada em temperatura de 25,0  1ºC, 50,0 ± 10% UR e 8 horas de
fotofase, onde também foram acondicionadas durante o experimento. Para a S.
frugiperda foi usada a dieta artificial de acordo com Parra (1996) (Tabela 1).
24
Tabela 1: Dieta artificial usada na criação de lagartas S. frugiperda (PARRA,1996).
INGREDIENTES
QUANTIDADE
Feijão (carioca)
333,0 g
Ágar Puro
45,0 g
Germe de Trigo
158,4 g
Levedura de Cerveja
101,4 g
Ácido Ascórbico (99%)
10,2 g
Ácido Sórbico (99%)
3,3 g
NIPAGIN (Metil-parahidroxibenzoato)
6,3 g
Formol (Formaldeído 36,0%)
8,3 mL
Sol. Inibidora (Ác. Propiônico 41,8%; Ác. Fosfórico 4,2%; Água 54,0%)
8,3 mL
Água*
2.400,0 mL
* Total de água suficiente para cozinhar o feijão, o ágar e triturar os demais ingredientes da
dieta.
25
Para H. zea, foi utilizada a dieta artificial modificada de Grenne et al.
(1976) ( Tabela 2).
Tabela 2: Dieta artificial utilizada na criação de lagartas H. zea (GRENNE et al.
1976).
INGREDIENTES
Feijão Branco
Farelo de soja
Leite em pó
QUANTIDADE
103,0 g
82,0 g
62,0 g
Ágar Puro
35,0 g
Germe de Trigo
164,0 g
Levedura de Cerveja
103,0 g
Ácido Ascórbico (99%)
9,8 g
Ácido Sórbico (99%)
5,0 g
NIPAGIN (Metil-parahidroxibenzoato)
Solução vitamínica
Tetraciclina
11,6 g
16,0g
0,2 g
Formol (Formaldeído 36,0%)
10,0 mL
Sol. Inibidora (Ác. Propiônico 41,8%; Ác. Fosfórico 4,2%; Água 54,0%)
8,3 mL
Água*
2.400,0 mL
* Total de água suficiente para cozinhar o feijão , o ágar e triturar os demais ingredientes da dieta.
26
Para D. saccharalis, utilizou-se a dieta artificial modificada de Hensley & Hammond
(1968) (Tabela 3)
Tabela 3: Dieta artificial utilizada na criação de lagartas D. saccharalis (HENSLEY &
HAMMOND 1968).
INGREDIENTES
QUANTIDADE
2,0 g
Cloreto de Colina
Ágar Puro
70,0 g
Germe de Trigo
90,0 g
Sacarose (açúcar)
270,0 g
Ácido Ascórbico (99%)
Ácido Sórbico (99%)
4,0 g
3,0 g
Farelo de Soja
400,0 g
NIPAGIN (Metil-parahidroxibenzoato)
23,0 g
Formol (Formaldeído 36,0%)
Solução vitamínica
Vita Gold
Ampicilina (antibiótico)
5,0 mL
30,0 ml
2,0 ml
5,0 ml
Ácido acético
30,0 mL
Água*
3.900,0 mL
* Total de água suficiente para cozinhar o ágar e triturar os demais ingredientes da dieta.
Contagem de esporos
Antes da inoculação, foi realizada contagem de poliedros/ml, em cada
diluição utilizada: 5º Diluição- 10-5, 4º Diluição- 10-4, 3º Diluição- 10-3, 2º
Diluição- 10-2,1º Diluição- 10-1 e testemunha, utilizando 10 ml por concentração.
Para a inoculação foi adicionado 2 gotas de “tween” 20, para cada 10ml, que é
27
um detergente para melhor dispersão da solução viral nas folhas, utilizado como
espalhante adesivo.
A diluição foi seriada 1 para 9, a cada 9 ml de água 1 ml de vírus. A
contagem de poliedros foi feita em microscópio óptico 40x em fase 2, através da
câmara de Neubauer, utilizando 10 microlitros da solução em cada lado da
câmara. A contagem foi realizada nos 4 campos laterais e no campo central, fezse a média dos 2 lados e multiplica pela constante que é 50.000 e então encontrase a concentração de poliedros no isolado em cada diluição. A concentração de
poliedros/ml viáveis utilizados na inoculação para S. frugiperda na quinta
diluição foi 5,0x104, 2,0x105 na quarta diluição, na terceira foi 2,4x106,
1,77x107na segunda e na primeira diluição foi 1,8x108.
Na condução do experimento com a espécie H. zea, as concentrações
utilizadas foram as seguintes em cada diluição:

Quinta diluição: 5,0x104

Quarta diluição: 1,0x105

Terceira diluição: 1,25x106

Segunda diluição: 1,33x107

Primeira diluição: 1,8x108
A concentração de poliedros/ml obtidos na quinta diluição para
inoculação em D. saccharalis na quinta diluição foi 5,0x104, na quarta 2,0x105,
2,4x106 na terceira, 1,22x107 na segunda e 1,26x 108 na primeira diluição.
Inoculação do baculovírus
Para a inoculação do baculovírus em S. frugiperda e H .zea, foram
utilizadas folhas de milho, cortadas em discos e mergulhadas com auxilio de
uma pinça na solução contida com o vírus em cada diluição.
28
As folhas foram transferidas, após retirar-se o excesso, em copos
descartáveis de 50 ml, onde foram acondicionadas lagartas de 6 dias (ideal para
o uso com baculovírus), sendo uma larva por copo (Figura 1).
Figura 1: Larvas de S. frugiperda transferidas para ingestão do baculovírus.
Para as larvas de D. saccharalis, a inoculação foi semelhante, mas como
esta praga em outros experimentos utilizados não se desenvolveu bem em folhas
de milho, foram utilizados pedaços de cana-de-açúcar, umedecidos na solução
viral da mesma forma. As larvas foram acondicionadas em placas de Petri, da
mesma forma como foram criadas (Figura 2).
29
Figura 2. Larvas de D. saccharalis inoculadas para ingestão do
baculovírus.
Para cada concentração continham 4 suportes de isopor que comportam
24 copos cada um, totalizando em 4 repetições com 24 lagartas em cada. Da
mesma forma, as placas de Petri, 4 placas em cada concentração com 24 larvas
em cada placa, totalizando 5 variáveis e a testemunha (água destilada e “tween”
20). Após 2 dias da inoculação, as larvas foram transferidas para se alimentarem
de dieta artificial, utilizadas na criação. Cada praga em sua dieta específica e
recipiente adequado.
A partir do quinto dia após a inoculação, as larvas foram avaliadas todos
os dias, e verificada a ocorrência de morte ou fuga, até a formação de pupas para
as que não sofreram infecção. As lagartas que não foram susceptíveis ao vírus
30
foram acompanhadas, até a emergência dos adultos e realizada a segunda
geração, para observação de possível alteração causada pelo baculovírus
passados para os descendentes. Os adultos foram acondicionados em gaiolas de
PVC revestidos por papel ofício, para depositarem os ovos.
As larvas eclodidas foram repicadas em dieta e recipientes de acordo
com cada espécie até a formação de pupas e novos adultos, a fim de observar o
desenvolvimento da segunda geração. A segunda geração foi acompanhada da
mesma forma que o experimento foi conduzido, 4 repetições com 24 lagartas
para cada variável: 5º, 4º, 3º, 2º, 1º diluições e testemunha, em sala aclimatizada
em temperatura de 25,0  1ºC, 50,0 ± 10% UR e 8 horas de fotofase.
Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado (DIC) para a
montagem dos experimentos. Foram ajustados modelos não-lineares aos dados
obtidos, sendo a variável independente (x) a concentração de poliédros
Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6- NR e as variáveis dependentes (y) a
porcentagem mortalidade, porcentagem pupação e número de massa de ovos. Os
modelos foram avaliados quanto à significância de seus parâmetros (Crawley
2007). Utilizou-se o programa estatístico R para o ajuste e avaliação dos
modelos (R Development Core Team, 2011).
RESULTADOS
Efeitos Letais
O Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6- NR aumentou a mortalidade de
Spodoptera frugiperda na primeira geração. Entretanto, foi inócuo à
Helicoverpa zea e Diatraea saccharalis. Em uma relação inversa, já esperada, a
porcentagem de pupação de S. frugiperda foi reduzida pelo baculovírus e não se
alterando para H. zea e D. saccharalis (Figura 1). Este último resultado foi
31
consequência do primeiro. Ou seja, a maior mortalidade de indivíduos leva,
necessariamente, à menor porcentagem de pupação, pelo fato das lagartas
estarem mortas.
Na segunda geração, diferente do que foi observado na primeira, o B.
spodoptera (SfMNPV) 6- NR foi inócuo tanto para S. frugiperda quanto para H.
zea e D. saccharalis . A pupação, por sua vez, tanto para S. frugiperda quanto
para H. zea e D. saccharalis não foi alterada (Figura 2). Este resultado, como o
observado na primeira geração, foi uma correlação entre número de indivíduos
mortos e pupação. Ou seja, quanto menor o número lagartas mortas pelo B.
spodoptera (SfMNPV) 6- NR, maior a chance de se desenvolverem e passarem
para a fase de pupa.
32
B)
Pupação (%)
Mortalidade (%)
A)
100
80
60
40
20
0
0.0e+00
100
80
60
40
20
0
1.0e+08
0.0e+00
Concentração de Baculovirus
C)
)
100
80
60
40
20
0
0.0e+00
Pupação (%)
Mortalidade (%)
Concentração de Baculovirus
0.0e+00
E)
1.0e+08
Concentração de Baculovirus
1.0e+08
Concentração de Baculovirus
Pupação (%)
Mortalidade (%)
Concentração de Baculovirus
0.0e+00
D)
100
80
60
40
20
0
1.0e+08
100
80
60
40
20
0
1.0e+08
F))
100
80
60
40
20
0
0.0e+00
1.0e+08
Concentração de Baculovirus
Figura 1. Mortalidade de lagartas de A) Spodoptera frugiperda, C) Helicoverpa
zea e E) Diatraea saccharalis e pupação de lagartas de B) Spodoptera
frugiperda, D) Helicoverpa zea e F) Diatraea saccharalis da primeira geração
expostas a concentrações de Baculovirus spodoptera (SfNPV) 6- NR. Sete
lagoas, MG, 2012.
33
0.0e+00
5.0e+07
1.0e+08
Pupação (%)
Mortalidade (%)
A)
)
100
80
60
40
20
0
B)
100
80
60
40
20
0
1.5e+08
0.0e+00
C)
)
100
80
60
40
20
0
0.0e+00
5.0e+07
1.0e+08
D)
))
0.0e+00
E)
5.0e+07
1.0e+08
1.5e+08
Concentração de Baculovirus
5.0e+07
1.0e+08
1.5e+08
Concentração de Baculovirus
Pupação (%)
Mortalidade (%)
Concentração de Baculovirus
0.0e+00
1.5e+08
100
80
60
40
20
0
1.5e+08
100
80
60
40
20
0
1.0e+08
Concentração de Baculovirus
Pupação (%)
Mortalidade (%)
Concentração de Baculovirus
5.0e+07
F)
100
80
60
40
20
0
0.0e+00
5.0e+07
1.0e+08
1.5e+08
Concentração de Baculovirus
Figura 2. Mortalidade de lagartas de A) Spodoptera frugiperda, B) Helicoverpa
zea e C) Diatraea saccharalis
e pupação de lagartas de B) Spodoptera
frugiperda, D) Helicoverpa zea e F) Diatraea saccharalis da segunda geração
expostas a concentrações de Baculovirus spodoptera (SfNPV) 6 -NR. Sete
lagoas, MG, 2012.
34
Efeitos subletais
O Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6- NR reduziu o número de
massas de ovos de S. frugiperda e não afetou o número de massas de D.
saccharalis. Inesperadamente, o B. spodoptera (SfMNPV) 6- NR aumentou o
número de massas de ovos de H. zea (Figura 3).
35
Número de massas de ovos
60
50
40
30
20
10
0
A)
)
0.0e+00 5.0e+07 1.0e+08 1.5e+08
Número de massas de ovos
Concentração de Baculovirus
60
50
40
30
20
10
0
B)
0.0e+00 5.0e+07 1.0e+08 1.5e+08
Número de massas de ovos
Concentração de Baculovirus
60
50
40
30
20
10
0
C)
0.0e+00 5.0e+07 1.0e+08 1.5e+08
Concentração de Baculovirus
Figura 3. Número de massas de ovos de mariposas de A) Spodoptera frugiperda,
B) Helicoverpa zea e C) Diatraea saccharalis da primeira geração expostas a
concentrações de Baculovirus spodoptera (SfNPV) 6- NR. Sete lagoas, MG,
2012.
36
DISCUSSÃO
Os resultados confirmam a especificidade do Baculovirus spodoptera
(SfMNPV) 6- NR, para a lagarta-do-cartucho, assim como outros baculovírus
isolados de artrópodes são específicos. Na primeira geração o baculovírus foi
eficiente para Spodoptera frugiperda, apresentando efeito letal. Foi possível
observar também que a mortalidade aumentou com a concentração chegando á
100% na concentração mais elevada. A medida que a concentração diminuía, a
mortalidade era reduzida, pelo fato de conter menor quantidade de poliedros.
Este fato é relevante, pois a partir da ingestão dos poliedros é que a matriz
proteica do intestino médio é dissolvida, e partir disto são liberados os vírions,
onde as partículas infectivas irão penetrar na célula ocasionando a morte.
Os baculovírus estão em um grande grupo entre insetos específicos,
como por exemplo, o Baculovirus anticarsia que é eficiente contra a lagarta-dasoja Anticarsia gemmatalis (AGMNPV) (Castro et al., 1999). Com o uso do
B.anticarsia (AGMNPV) para o controle de A. gemmatalis, Nohatto et al.
(2010), obtiveram eficiência de 55,26% contra a lagarta-da-soja. Sujiiet al.
(2002), obtiveram taxa de mortalidade superior á 76% no controle da lagarta da
soja utilizando o B. gemmatalis. Com a pulverização do Baculovirus erinnyis em
mandioca para o controle de Erinnyis ello, não atingiu o nível de dano,
mostrando ser um eficiente auxiliar no controle do mandarová da mandioca
(Aguiar et al., 2010). Foram encontrados vírus da família Baculoviridae em
Perigonia lusca, em folhas de erva mate e foi comprovada a patogenicidade com
os sintomas típicos da ação do baculovírus. (Alves et al., 2001). Este fato pode
ser estendido para o controle desta lagarta na erva mate e provavelmente
também seja específico para esta espécie no seu controle. Portanto, estes
resultados mostram que outros baculovírus isolados de artrópodes são também
específicos para espécie em que foram isolados.
37
As espécies Helicoverpa zea e Diatraea saccharalis ao morrerem não
apresentaram sintomas característicos da ação dos baculovírus, cabendo isto
apenas a S. frugiperda. O fato do B. spodoptera (SfMNPV)- 6 NR ter sido
inócuo às outras espécies em estudo, pode ser explicado pelo fato desta
especificidade. As partículas infectivas entram nas células do intestino médio
através de receptores específicos. Então é possível que a H. zea e D. saccharalis
não possuem estes receptores para que ocorra a infecção. Isto explica a
inocuidade do B. spodoptera (SfMNPV)- 6 NR nestas espécies. Quanto à
pupação, foi observado o efeito inverso ao da mortalidade, pois as larvas que
não morreram, chegaram à fase de pupa, porque não foram susceptíveis ao
Baculovirus spodoptera (SfMNPV)- 6 NR. Por isso, as larvas de S. frugiperda
tiveram a pupação reduzida, uma vez que a mortalidade aumentou, e as larvas
que foram tolerantes ficaram em menor número para alcançarem a fase de pupa.
O mesmo foi para H. zea e D. saccharalis, não alterando a porcentagem de
pupação, pois a mortalidade foi baixa, restando às larvas não susceptíveis para
chegarem à fase de pupa.
O efeito inócuo nas três espécies testadas na segunda geração pode ser
explicado, pelo fato de nos parentais o vírus não conseguir gerar o ciclo
infeccioso, portanto não houve toxidade e consequentemente não foram
transmitidos aos descendentes na segunda geração. Para S. frugiperda, na
concentração maior foi tóxico a 100 % da população na primeira geração.
Portanto, não foi possível observar uma possível influência na segunda geração.
Nas outras concentrações utilizadas, a lagarta-do-cartucho pode ter criado uma
resposta imunológica, contra a infecção e isto foi transferido para sua segunda
geração. Mas para H. zea e D. saccharalis como não foi inócuo nem mesmo na
primeira geração, esperava-se que também não seria na segunda. Uma vez que
os parentais não transferem para segunda geração o que não possuem, neste caso
a suscetibilidade ao baculovírus utilizado. Portanto, o estudo dos hemócitos é
38
importante para a compreensão das interações entre hospedeiro e patógeno, já
que o conhecimento das respostas imunológicas que estão presentes na
hemolinfa dos insetos pode fornecer informações valiosas para o estudo de
novas formas de controle biológico (Silva, 2002). A não alteração na pupação
para as três espécies na segunda geração, é explicado pelo fato da mortalidade
ter sido baixa. Então foi possível as larvas tolerantes ao vírus passarem para fase
pupal. A pupação é inversa à mortalidade como já foi justificado na segunda
geração.
Nos efeitos subletais, em relação o número de massas de ovos, pode ser
explicado, pelo fato da mortalidade ter sido maior em S. frugiperda. Portanto,
restou menor número de larvas por isso estas copularam menos e ovipositaram
menor número de massas de ovos. Para D. saccharalis o número de massas de
ovos não foi alterado, porque se manteve constante de acordo com o número de
larvas sobreviventes, do mesmo modo que chegaram à fase pupal. Mas, para H.
zea houve um aumento no número de massas de ovos, isto pode ser explicado,
talvez por uma característica da espécie de colocar os ovos individualmente. O
que ocasiona maior número de reboleiras na contagem, pois há uma dificuldade
de amostrar os ovos para uma contagem homogênea então pode haver uma
superestimação.
Para melhor explicação da especificidade do baculovírus é necessário
trabalhos de caracterização de enzimas digestivas (proteases) que compõe o
sistema digestivo a fim de entender as estratégias de controle realizadas no
intestino, sua ação em pH alcalino, e possível resistência em cada espécie (Reis,
2009). Uma hipótese para explicar os resultados é a diferença nas enzimas
digestivas chamadas proteases, que interfere na ação do baculovírus no intestino.
Morris & Miller (1992) sugeriram que as diferenças específicas que impedem a
infecção dos baculovírus são particulares de cada linhagem celular. Para uma
melhor compreensão da especificidade do baculovírus é necessário um estudo
39
biomolecular das células ou da hemolinfa dos insetos, para caracterizar as
linhagens celulares como permissivas ou não permissivas para replicação viral.
Outra hipótese explicativa pode ser que além das espécies H. zea e D.
saccharalis não possuírem os receptores específicos necessários para que as
partículas infectivas entrem nas células, elas também não possuam os genes
essenciais à replicação do DNA do baculovírus, ou os sítios de ação necessários.
Portanto um sequenciamento dos genes poderá mostrar e confirmar a
especificidade do B. spodoptera (SfMNPV)- 6 NR.
Por ser altamente específico o baculovírus é um excelente agente de
controle a ser utilizado no manejo integrado de pragas, priorizando a presença
dos inimigos naturais não alvos e a preservação do meio ambiente. Por isso seria
interessante ampliar a especificidade do baculovírus para que estenda sua
patogenicidade a outras espécies de interesse. Deve-se atentar, entretanto, para
responsabilidade ambiental de preservação das outras espécies desejadas como
os inimigos naturais. Baculovírus recombinantes têm sido construídos, como
uma maneira de melhorar a virulência dos baculovírus com a inserção de genes
de hormônios e /ou proteases no genoma dos baculovírus contra seus
hospedeiros. A introdução dos genes das proteases ScathL e queratinase no
genoma do baculovírus Autografha californica multiple núcleo polyhedrovirus
(AcMNPV) é capaz de aumentar a virulência do baculovírus contra a lagarta-docartucho, demonstrando um tempo de morte reduzido (Gramkow, 2010).
Portanto esta técnica pode ser uma alternativa para aumentar a propriedade
bioinseticida do B. spodoptera (SfMNPV) 6 NR.
CONCLUSÃO
O Baculovirus spodoptera (SfMNPV) 6 NR possui toxicidade contra
Spodoptera frugiperda, mas é inócuo tanto para Helicoverpa zea quanto para
Diatraea saccharalis.
40
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGUIAR, E.B.; LORENZI, J O.;MONTEIRO, D.A.; BICUDO, S.J.
Monitoramento do mandarová da mandioca (Erinnyis ello L. 1758) para o
controle com baculovirus (Baculovirus erinnyis). Revista TrópicaCiências Agrárias e Biológicas, v.4, p. 55, 2010.
ALMEIDA, A.F. Estratégias de produção in vitro de bioenceticida viral:
Influências do isolado, da cinética e do modo de operação. 2010. 133p Tese
(Doutorado) - Universidade Federal de Rio Grande Do Norte, Natal.
ALVES, L.F.A.; BRANCALHÃO, R.M.C.; SANTANA. D.L.Q. Ocorrência de
Baculovírus em lagartas Pirigonia lusca (Fabr. Lep., Sphingidae) no Brasil.
Neotropical entomology, v.30, p.493-494, 2001.
BOLONBHEIZ, H.; OLIVEIRA, N.C. DE.; BALAN, M.G.; Eficiência de
Baculovirus spodoptera e lufenuron no controle de diferentes instares e
densidades populacionais da lagarta-do-cartucho em milho. Campo Digit@l,
v.5, p.8-13, 2010.
BUSATO, G.R.; GRÜTZMACHER, A.D.; Garcia, M.S.; GIOLO, F.P.;
NÖRNBERG, S.D. Consumo e utilização de alimento por Spodoptera
frugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) em duas temperaturasCiência e Agrotecnoçogia., Lavras, v. 28, p. 1278-1283, 2004.
CARVALHO, R.P.L. Danos, flutuação populacional, controle e
comportamento de Spodoptera frugiperda (Smith, 1797) e susceptibilidade
de diferentes genótipos de milho em condições de campo. 1970. 170p Tese
(Doutorado) - ESALQ/USP, Piracicaba.
CASTRO, M.E.B.; SOUZA. M.L.de.; SIHLER, W.; RODRIGUES, J.C.M.;
RIBEIRO, B.M. Biologia molecular de baculovírus e seu uso no controle
biológico de pragas no Brasil. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 34, p.
1733-1761, 1999.
CONAB - COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO.
Acompanhamento de safra brasileira: grãos Safra 2011/2012, 2012. 30p.
(Décimo primeiro levantamento) Disponível em:
http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/12_09_06_09_18_33_bol
etim_graos_-_setembro_2012.pdf. Acesso em: 03 fev. 2013.
CRAWLEY, M.J. The R book. Chichester: J. Wiley, 2007. 942p.
41
CRUZ, I. A lagarta-do-cartucho na cultura do milho. 1995. 45p Circular
Técnica 21(Embrapa/Cnpms) - Sete Lagoas, MG.
CRUZ, I. WAQUIL, J.M.; VIANA, P.A.; VALICENTE, F.H. Pragas:
Diagnóstico e controle. 1995. 14p Arquivo do agrônomo nº 2
(Embrapa/Cnpms) – Sete Lagoas, MG.
FIGUEIREDO, M.L.C. Interação de inseticidas e controle biológico natural
na redução dos danos de Spodoptera frugiperda (J.E.Smith, 1797)
(Lepidoptera: Noctuidae) na cultura do milho (Zea mays). 2004. 205p Tese
(Doutorado) –Universidade Federal de São Carlos, São Carlos (SP).
FIGUEIREDO, M.L.C.; DIAS, A.M.P.M.; CRUZ, I. Relação entre a lagarta-docartucho e seus agentes de controle biológico natural na produção de milho.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.41, p.1693-1698, 2006.
FIGUEIREDO, M.L.C.; CRUZ, I.; DIAS, A.M.P.M.; SILVA, R.B. Interaction
between baculovirus spodoptera and natural enemies on the suppression of
Spodoptera frugiperda (J. E. smith) (Lepidoptera: Noctuidae) in maize. Revista
Brasileira de Milho e Sorgo, v.8, p.207-222, 2009.
GOMEZ, S.A.; MOSCARDI, F.; GÓMEZ, D.R.S. Suscetibilidade de
Spodoptera frugiperda a isolados geográficos de um vírus de poliedrose nuclear.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.34, p.1539-1544, 1999.
GRANCOW, A.W. Patologia dos baculovírus: Efeito da ação de enzimas
heterólogas e análise da resposta transcricional do hospedeiro durante a
infecção viral. 2010. 146p Tese (Doutorado)- Universidade de Brasília, Brasília
(MG).
GRAVENA, S. Controle Biológico no manejo integrado de pragas. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, v.27, p.281-299, 1992.
GREENE, G.L.; LEPPLA, N.C.; DICKERSON, W.A. Velvetbean caterpillar: a
rearing procedure and artificial medium. Journal of Economic Entomology,
Lanham, v. 69, n. 4, p. 487-488, 1976.
GUEVARA, L.A.C. Frequência de cópula da Diatraea saccharalis (Fabr; 1974)
(Lepidoptera: Crambidae) em condições de campo e laboratório. Agropecuária
técnica, v.1, p.24-31, 1980.
42
HENSLEY, S.D.; HAMMOND, A.H. Laboratory techniques for rearing the
sugarcane borer on an artificial diet. J. Economic Entomology, Lanham, v. 61,
p. 1742-1743, 1968.
LUIZ, C.B.F.; MAGRO, S.R. Controle biológico das pragas da espiga, sobre
parâmetros qualitativos e quantitativos na cultura do milho de safrinha em
Ubiratã/PR. Campo Digital., Campo Mourão, v.2, p.13-21, 2007.
MACHADO, R.C.M. Interação inseto-planta e suas implicações no manejo
integrado de pragas. 2009. 53p Dissertação (Pós-graduação latu sensu) Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.
MORRIS, T.D.; MILLER, L.K. Promoter influence on baculovirus-mediated
gene expression in permissive and nonpermissive insect cell lines. Journal of
Virology, v.66, p.7397-7405, 1992.
MOSCARDI, F.; SOUZA, M.L. Baculovírus para o controle de pragas. Revista
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, v. 24, p. 21-29, 2002.
NOHATTO, M.J.; HENNIGEN, F.J.; GARCIA, F.R.M. Avaliação de diferentes
concentrações de Baculovirus anticarsia (AGMNPV) no controle de Anticarsia
gemmatalis (LEPIDOPTERA, NOCTUIDAE) em lavoura de soja. Revista de
Ciências Ambientais, v.4, p.65-76, 2010.
OLIVEIRA, A.M.; MARACAJÁ, P.B.; FILHO, E.T.D.; LINHARES, P.C.F.
Controle biológico de pragas em cultivos comerciais como alternativa ao uso de
agrotóxicos. Revista Verde,v.1, p.01-09, 2006.
OLIVEIRA, M.A.P.; MARQUES, E.J.; TEIXEIRA, V.W.; BARROS, R. Efeito
de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok.
sobre características biológicas de Diatraea saccharalis F. (Lepidoptera:
Crambidae). Acta Scientiarum. Biological. Sciences, v.30, p.220-224, 2008.
PARRA, J.R.P.; PATERNIANI, E.; FILHO, NETO, R.M. Importância da
agricultura para o Brasil. Revista Parcerias Estratégicas, v.4, p.11-31, 2002.
Parra, J.R.P. Técnicas de criação de insetos para programas de controle
biológico. Piracicaba: FEALQ, 1996. 137p. 3.ed.
POLANCZYK, R.A.; ALVES, S.B. Interação entre Bacillus thuringiensis e
outros entomopatógenos no controle de Spodoptera frugiperda. Manejo
integrado de plagas y Agroecologia, v.74, p.24-33, 2005.
43
R DEVELOPMENT CORE TEAM. R: a language and environment for
statistical computing. Vienna: R Foundation for Statistical Computing, 2011.
REIS, D.T.C. Purificação de caracterização de proteases digestivas
Tripsina-Like do intestino da lagarta da soja envolvidas no mecanismo de
interação planta-inseto. 2009, 106p Tese (Doutorado) - Universidade Federal
de Viçosa, Viçosa, (MG).
SILVA. C.C.A.da. Aspectos do sistema imunológico dos insetos. Revista
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, v. 24, p. 68-72, 2002.
SOUZA, A.M.L.; ÁVILA, C.J.; PARRA, J.P. Consumo e Utilização de
Alimento por Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera: Pyralidae), Heliothis
virescens(Fabr.) e Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae)
em Duas Temperaturas. Neotropical Entomology, v.30, p.11-17, 2001.
SOUZA, M.L.; CASTRO, M.E.B.; SILHER, W.; RIBEIRO, Z.M.A.;
MOSCARDI, F. Caracterização de Baculovírus Utilizados no controle de
pragas. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, v. 24, p.17-20,
2002.
SUJII, E.R.; PIRES, C.S.S.; SCHMIDT, F.G.V.; ARMANDO, M.S.; BORGES,
M.M.; CARNEIRO, R.G.; VALLE, J.C.V. Controle Biológico de insetos- praga
na soja orgânica do Distrito Federal. Cadernos de Ciência e Tecnologia, v.19,
p. 299-312, 2002.
VALDERRAMA, J.A.G.; AGUDELO, E.J.G, CUBILLOS, G.P.B.; PRADO,
A.M.C.; RIVERO, L.F.V. Isolation, identification and characterization of native
nucleopolyhedrovirus of Spodoptera frugiperda in Colômbia. Revista Facultad
Nacional de Agronomía, Medellín, v.63, p.5511-5520, 2010.
VALICENTE, F.H.; COSTA, E.F.C. Controle da lagartado cartucho,
Spodoptera frugiperda (J.E. smith), com o Baculovirus spodoptera, aplicado
viaágua de irrigação. Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, v. 24, p.
61-67, 1995.
VALlCENTE, F.H.; PEIXOT0.M.J.V.V.D.; PAIVA, E.; KITAJIMAS, E.W.
Identificação e purificação de um vírus-de-granulose em lagartas-do-cartuchodo-milho. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.23, p.291-296, 1988.
44
VALICENTE, F.H.; TUELHER, E.S. Controle da lagarta-do-cartucho,
Spodoptera frugiperda, com o Baculovirus spodoptera. 2009. 14.p Circular
técnica 114 (Embrapa/Cnpms) - Sete Lagoas,MG.
VALICENTE, F.H.; TUELHER, E.S.; PAIVA, C.E.C.; GUIMARÃES, M.R.F.;
MACEDO, C.V.; WOLFF, J.L.C. A new baculovirusisolatethat does not cause
theliquefactionoftheintegument in Spodoptera frugiperda dead larvae. Revista
Brasileira de Milho e Sorgo, v.7, p. 77-82, 2008.
45