PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOLOGIA DE VERTEBRADOS
Morfologia comparativa da estrutura gonadal de seis espécies de peixes
Anostomidae neotropicais.
Fabiano de Andrade Silva
Orientador: Nilo Bazzoli
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Zoologia de Vertebrados da Pontifícia
Universidade Católica de Minas Gerais como prérequisito para obtenção do título de mestre em
Zoologia de Vertebrados.
Belo Horizonte - MG
2011
FICHA CATALOGRÁFICA
Elaborada pela Biblioteca da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais
S586m
Silva, Fabiano de Andrade
Morfologia comparativa da estrutura gonadal de seis espécies de peixes
Anostomidae neotropicais / Fabiano de Andrade Silva. Belo Horizonte, 2011.
27f. : il.
Orientador: Nilo Bazzoli
Dissertação (Mestrado) – Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais.
Programa de Pós-Graduação em Zoologia de Vertebrados
1. Peixes de água doce - Morfologia. 2. Ovários. 3. Testículos. 4. Filogenia. I.
Bazzoli, Nilo. II. Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais. Programa de
Pós-Graduação em Zoologia de Vertebrados. III. Título.
CDU: 597.554
Esta dissertação foi realizada no Laboratório de Ictiologia do Programa de Pós Graduação em
Zoologia de Vertebrados da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, sob orientação
do Professor Dr. Nilo Bazzoli, com o apoio da Estação de Hidrobiologia e Piscicultura de
Três Marias, MG / CODEVASF e das seguintes instituições:
- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES);
- Conselho Nacional de desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);
- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG);
À minha mãe pelo incentivo e persistência
Ao meu avô pelo exemplo de vida
AGRADECIMENTOS
À minha namorada Renata e aos meus amigos pelo apoio.
Aos meus colegas e amigos de mestrado Aline, Gabriel, Natália, Bárbara, Gilberto, Hermano,
Julianna, Marina, Bia e Íris pela força e companheirismo.
À Clédma e Rogério pelas valorosas ajudas.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Zoologia de Vertebrados, em especial ao
Prof. Nilo Bazzoli pelos ensinamentos, apoio e entusiasmo científico.
Aos professores da graduação Humberto Mello e Adriano Paglia pela confiança.
Aos funcionários da Estação de Hidrobiologia e Piscicultura de Três Marias-CODEVASF,
pela disposição.
Às grandes mentes da história da humanidade pela eterna fonte de inspiração.
E a todos que de alguma forma contribuíram para a elaboração deste trabalho.
"O degrau de uma escada não serve simplesmente para
que alguém permaneça em cima dele, destina-se a
sustentar o pé de um homem pelo tempo suficiente para
que ele coloque o outro um pouco mais alto.”
Thomas Huxley
RESUMO
Este estudo apresenta uma análise comparativa da morfologia gonadal de Leporellus vittatus,
Leporinus piau, Leporinus reinhardti, Leporinus taeniatus, Leporinus obtusidens e Schizodon
knerii, espécies da família Anostomidae. Ovários maduros das seis espécies apresentam
coloração acinzentada. Os alvéolos corticais dos ovócitos vitelogênicos das quatro espécies de
Leporinus e Leporellus vittatus são formados por vesículas pequenas enquanto em Schizodon
knerii por vesículas grandes. Os alvéolos corticais dos ovócitos vitelogênicos das seis
espécies estudadas apresentam conteúdo histoquímico similar. A zona pelúcida é formada por
duas camadas em todas as espécies estudadas, sendo mais espessada em S. knerii (11,5 ± 1,8
µm) que em L, vittatus (9,0 ± 0,8 µm) e nas quatro espécies de Leporinus estudadas (3,5 ± 0,6
- 8,7 ± 0,9 µm). As células foliculares são cúbicas (22,3 ± 3,2 µm) no pólo animal e
prismáticas (61,1 ± 9,6 µm) no pólo vegetativo de S. knerii enquanto pavimentosas nas outras
espécies (1,3 ± 0,3 – 1,6 ± 0,3 µm). O IGS de fêmeas maduras de S. knerii foi mais baixo que
nas outras espécies. Entre os machos, o IGS de L. vittatus foi estatisticamente menor que o
das demais espécies analisadas. Os Anostomidae analisados apresentaram morfologia
testicular similar a da maioria dos Characiformes neotropicais, com testículos do tipo
espermatogonial irrestrito e tubular anastomosado. Diferenças fenotípicas nos ovócitos
vitelogênicos de peixes Anostomidae confirmam a posição taxonômica de S. knerii em
relação aos Leporinus e L. vittatus da bacia do rio São Francisco embora a morfologia
gonadal das seis espécies apresentasse algumas semelhanças fenotípicas características da
família Anostomidae.
Palavras chave: Ovários, testículos, peixes Anostomidae, estratégias reprodutivas.
ABSTRACT
This study presents a comparative analysis of the gonadal morphology of Leporellus vittatus,
Leporinus piau, Leporinus reinhardti, Leporinus taeniatus, Leporinus obtusidens e Schizodon
knerii, species of family Anostomidae. Mature ovaries of the six species show a grayish color.
The cortical alveoli of vitellogenic oocytes of the studied species are formed by small vesicles
in the four species of Leporinus and Leporellus vittatus and large vesicles in Schizodon knerii
and have similar histochemical contente in all of them. The zona pellucida is composed of
two layers, being thicker in S. knerii (11.5 ± 1.8 µm) than in L. vittatus (9.0 ± 0.8 µm) and
Leporinus (3.5 ± 0.6 – 8.7 ± 0,9 µm). The follicular cells are cubic (22.3 ± 3.2) in animal pole
and prismatic (61.1 ± 9.6 µm) in vegetative pole of S. knerii while pavement in the other
species (1.3 ± 0.3 – 1.6 ± 0.3 µm). The gonadosomatic index (GSI) of mature females of S.
knerii and mature males of L. vittatus was lower than the GSI of the other analised species.
The Anostomidae analyzed showed similar testicular morphology like of the most neotropical
Characiformes, with tubular espermatogonial unrestricted and anastomosed testis. Phenotypic
differences in the vitellogenic oocytes of Anostomidae fishes confirm the taxonomic position
of S. knerii in relation to Leporinus and L. vittatus from the São Francisco River while the
gonadal morphology of six species showed some phenotypic characteristics similar of that
showed by the family Anostomidae.
Keywords: Ovaries, testis, Anostomidae fishes, reproductive strategies.
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Tabela 1: Biometria de seis espécies de Anostomidae da Bacia do Rio São
Francisco, Minas Gerais, Brasil.........................................................................
17
Tabela 2: Índice gonadossomático de fêmeas maduras (IGS) e diâmetro de
ovócitos vitelogênicos (DO), espessura da zona pelúcida (ZP) e altura das
células foliculares (CF) em micrometros (µm) de cinco espécies de
Anostomidae da Bacia do Rio São Francisco, Minas Gerais, Brasil.................
20
Figura 1: Peixes Anostomidae. – A. Leporinus reinhardti (comprimento
total = 22,5 cm). B. Leporinus piau (22,7 cm). C. Leporinus obtusidens (33,3
cm). D. Leporinus taeniatus (19,5 cm). E. Leporellus vittatus (16,0 cm). F.
Schizodon knerii (28,5 cm)................................................................................
16
Figura 2: Ovários maduros e ovócitos vitelogênicos de Leporinus e
Leporellus vittatus..............................................................................................
18
Figura 3: Ovários maduros e ovócitos vitelogênicos de Schizodon knerii.......
19
Figura 4: Testículos maduros de peixes Anostomidae.....................................
20
SUMÁRIO
Página
Introdução Geral................................................................................................................. 10
Morfologia ovariana......................................................................................................
10
Morfologia testicular.....................................................................................................
10
Ovogênese e Espermatogênese.....................................................................................
10
Rio São Francisco.........................................................................................................
11
Espécies em estudo.......................................................................................................
12
Objetivos............................................................................................................................
13
Objetivos gerais............................................................................................................
13
Objetivos específicos....................................................................................................
13
Artigo a ser publicado........................................................................................................
14
Introdução.....................................................................................................................
14
Material e métodos........................................................................................................
15
Resultados...................................................................................................................... 16
Discussão.......................................................................................................................
21
Agradecimentos.............................................................................................................
23
Referências.........................................................................................................................
23
10
INTRODUÇÃO GERAL
Os peixes, grupo mais numeroso e diversificado dentro dos vertebrados, estão
adaptados a diversos hábitats aquáticos, sendo essa diversidade refletida em suas estratégias
reprodutivas e, consequentemente, em sua morfologia gonadal (Nelson, 2006; Desjardins &
Fernald, 2009).
Morfologia Ovariana
Anatomicamente, ovários de teleósteos podem ser de dois tipos: cistovariano e
gimnovariano. Os ovários cistovarianos têm continuidade com o oviduto, através do qual,
ovócitos alcançam o meio externo. Nos ovários gimnovarianos, ovócitos são liberados
diretamente na cavidade celômica, para depois serem lançados ao meio externo (Redding &
Patiño, 1993). Ovários maduros apresentam coloração e forma variadas dependendo da
espécie (Groove & Wourms, 1991; Núñez & Duponchelle, 2009). Histologicamente, ovários
são revestidos pela túnica albugínea que emite septos para o interior do órgão formando
lamelas ovulígeras que delimitam a cavidade ovariana central e onde se encontram ovogônias
e ovócitos em diferentes fases de desenvolvimento (Bazzoli, 2003).
Morfologia testicular
Nos testículos de teleósteos a variação de coloração é discreta, quando comparada a
dos ovários, uma vez que eles são geralmente transparentes na fase não reprodutiva e brancoleitosos na fase reprodutiva (Bazzoli, 2003). Os testículos de teleósteos são preenchidos por
túbulos seminíferos com parede formada de cistos delimitados por prolongamentos
citoplasmáticos das células de Sertoli. Dentro de cada cisto, as células espermatogênicas
encontram-se na mesma fase de desenvolvimento (Grier, 1981; Schulz et al., 2009). Os
testículos são classificados em: lobular e tubular anastomosado. Nos testículos do tipo lobular
o epitélio germinativo localiza-se apenas na periferia do órgão (Grier, 1993). Segundo este
mesmo autor, nos testículos do tipo tubular anastomosado os compartimentos germinativos
estão interconectados em toda extensão do testículo.
Ovogênese e Espermatogênese
A ovogênese inicia-se com a proliferação de ovogônias que após divisões mitóticas e
diferenciação originam ovócitos. Baseando-se em mudanças que ocorrem no citoplasma,
núcleo e camadas envoltórias os ovócitos podem ser classificados em quatro estádios de
desenvolvimento: ovócitos perinucleolares iniciais e avançados são pequenos com citoplasma
basófilo, núcleo central, vesiculoso e vários nucléolos periféricos; ovócitos pré-vitelogênicos
caracterizam-se pela presença de vesículas corticais no ooplasma, zona pelúcida evidente
11
células foliculares de alturas variadas; ovócitos vitelogênicos caracterizam-se por
apresentarem ooplasma repleto de glóbulos de vitelo acidófilos, núcleo central ou excêntrico,
alvéolos corticais formados de vesículas no ooplasma periférico, zona pelúcida acidófila com
típicas estriações transversais e número de camadas e espessura variadas, além de células
foliculares pavimentosas, cúbicas ou prismáticas (Bazzoli, 2003). O conteúdo histoquímico
das estruturas ovocitárias também é variado dependendo da espécie (Bazzoli & Godinho,
1994; Martins et al., 2010).
Espermatogênese em peixes é um longo e complexo processo onde as
espermatogônias proliferam-se por mitoses e originam espermatócitos por meioses. Quanto à
distribuição das espermatogônias, os testículos podem ser de dois tipos: espermatogoniais
irrestritos e espermatogoniais restritos. Testículos espermatogoniais irrestritos possuem
espermatogônias em toda extensão do órgão e nos espermatogoniais restritos, as
espermatogônias estão restritas à porção distal dos túbulos seminíferos (Grier, 1981). Na
espermiogênese não ocorrem divisões e as espermátides diferenciam-se em espermatozóides
(Corriero et al., 2009). A espermatogênese pode ser classificada em cística quando ela ocorre
dentro dos cistos que se rompem para liberar espermatozóides no lume dos túbulos
seminíferos ou semi-cística quando os cistos se rompem na fase de espermátide e a maturação
se completa no lume dos túbulos seminíferos (Mattei et al., 1993; Magalhães et al., 2011).
Rio São Francisco
A bacia do rio São Francisco abrange os três grandes biomas do país, Caatinga,
Cerrado e Mata Atlântica e drena os estados de Minas Gerais, Bahia, Pernambuco, Alagoas e
Sergipe, além do Distrito Federal. Esta bacia está dividida em alto, médio, submédio e baixo
São Francisco (Godinho & Godinho, 2003). O Alto São Francisco é a região mais degradada
e compreende a área entre a nascente, na Serra da Canastra e o município de Pirapora (Alves
& Pompeu, 2001).
O reservatório de Três Marias, localizado no alto São Francisco, foi formado em 1961
com os objetivos de: regularização do rio São Francisco, aumento do tirante d'água para a
navegação entre Pirapora e Juazeiro, controle das cheias, obras de irrigação, aumento da
potência da Usina Hidrelétrica de Paulo Afonso e produção de energia (Britski et al., 1988).
O número de pescadores na região do alto São Francisco é de aproximadamente 300 efetivos
no reservatório e 150 no rio São Francisco a jusante da barragem de Três Marias. A produção
de pescado por ano no período de 2000-2002 foi de 650 a 700 mil toneladas capturadas na
região do alto São Francisco (Sato & Sampaio, 2005).
12
Espécies em estudo
Leporellus vittatus (Valenciennes, 1850)
O piau-rola L. vittatus, de biologia reprodutiva pouco estudada, desova em ambientes
lóticos, com ausência de migrações reprodutivas e cuidado parental (Lamas, 1993).
Leporinus piau Fowler, 1941
O piau-gordura L. piau, espécie de porte médio, pode atingir comprimento padrão de
16,9 e 19,3 cm e peso corporal médio de 116 e 182 g respectivamente para machos e fêmeas.
L. piau reproduz-se de novembro a fevereiro com desova total em ambientes lênticos e
ausência de migrações reprodutivas e de cuidado parental. Seus ovos são livres e de cor
cinza/parda (Santos & Barbieri, 1993; Tavares & Godinho, 1994; Rizzo et al., 2002; Borçato
et al., 2004).
Leporinus reinhardti Lütken, 1875
O piau-três-pintas L. reinhardti, de médio porte, é encontrado em toda bacia do rio
São Francisco, realiza migrações reprodutivas e tem desova total. Seus ovos são livres e de
cor cinza/parda (Rizzo et al., 2002; Santos et al., 2007).
Leporinus obtusidens (Valenciennes,1837)
O piau-verdadeiro L. obtusidens é o maior Anostomidae conhecido, com período
reprodutivo de dezembro a janeiro, que realiza migrações reprodutivas, tem desova total em
ambientes lóticos e não possui cuidado parental. Seus ovos são livres, opacos e de cor cinza
claro (Sato et al., 2000; Rizzo et al., 2002; Sato et al., 2003).
Leporinus taeniatus Lütken, 1875
O piau-jeju L. taeniatus, é de porte médio, com período reprodutivo de dezembro a
fevereiro, realiza migrações reprodutivas, tem desova total, não possui cuidado parental e seus
ovos são livres (Rizzo et al., 2002; Santos et al., 2005).
Schizodon knerii (Steindachner, 1875)
O piau-branco S. knerii, espécie endêmica da bacia do São Francisco, reproduz-se de
outubro a abril, é sedentária, não apresenta cuidado parental e os ovos são adesivos e de cor
cinza-parda (Ferreira & Godinho, 1990; Rizzo et al., 2002).
13
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Comparar a morfologia de ovários e testículos maduros de seis espécies de peixes da
família Anostomidae da bacia do rio São Francisco, Minas Gerais.
Objetivos Específicos
- Verificar a existência de dimorfismo sexual entre machos e fêmeas nas espécies estudadas;
- Analisar relações anatômicas, forma e coloração de ovários e testículos maduros;
- Determinar diâmetro, espessura da zona pelúcida e altura das células foliculares dos
ovócitos vitelogênicos;
- Detectar o conteúdo histoquímico, de alvéolos corticais, glóbulos vitelogênicos, zona
pelúcida e células foliculares;
- Comparar, entre as espécies estudadas, os valores médios do IGS de machos e fêmeas
maduras;
- Analisar a morfologia dos testículos quanto ao padrão de distribuição das espermatogônias;
- Comparar a morfologia gonadal das espécies em estudo, correlacionando-as com as
estratégias reprodutivas.
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ARTIGO A SER SUBMETIDO
Morfologia comparativa de ovários e testículos maduros de seis espécies de
peixes Anostomidae neotropicais
Introdução
A morfologia gonadal tem sido utilizada para compreensão da reprodução e relações
filogenéticas dos peixes (Belova, 2008; Martins et al., 2011; Melo et al., 2011), embora não
exista estudos comparando este aspecto em peixes da família Anostomidae. Alguns estudos
mostraram que espécies da mesma família e subfamília de teleósteos geralmente apresentam
um padrão comum de morfologia gonadal (Rizzo et al., 2002; Martins et al., 2011; Melo et
al., 2011). Em revisão, Parenti & Grier (2004) observaram uma rede evolucionária da
morfologia testicular de teleósteos através da organização dos túbulos seminíferos e
distribuição das espermatogônias no epitélio germinal. Na família Apopongidae algumas
características são comuns entre gêneros e espécies próximas contribuindo para o
entendimento da evolução reprodutiva deste grupo (Fishelson & Gon, 2008).
A ordem Characiformes é uma das mais numerosas em famílias e subfamílias dentre
os peixes (Nelson, 2006), sendo a família Anostomidae constituída de aproximadamente 163
espécies compreendidas em 12 gêneros distribuídos por toda região neotropical (Garavello &
Britski, 2003; Reis et al., 2003). Na bacia do rio São Francisco, um dos principais rios do
Brasil em recursos pesqueiros, existem três gêneros de Anostomidae, Leporellus, Leporinus e
Schizodon incluindo espécies de importância comercial na pesca artesanal e esportiva, como
Leporinus obtusidens que pode atingir 40 cm de comprimento padrão (Garavello & Britski,
2003).
Considerando que a morfologia gonadal é um importante parâmetro para a
compreensão da biologia reprodutiva, relações filogenéticas e sistemática de peixes o objetivo
do presente trabalho é analisar comparativamente a morfologia de ovários e testículos de seis
espécies de peixes da família Anostomidae da bacia do rio São Francisco, Minas Gerais,
Brasil: Leporellus vittatus (Valenciennes, 1850); Leporinus obtusidens (Valenciennes,1837);
Leporinus piau Fowler, 1941; Leporinus reinhardti Lütken, 1875; Leporinus taeniatus
Lütken, 1875 e Schizodon knerii (Steindachner, 1875).
15
Material e Métodos
Para análise comparativa das gônadas maduras coletaram-se 212 exemplares com
gônadas maduras de seis espécies de Anostomidae (Fig. 1) no rio São Francisco, região de
Três Marias (18 – 20 ° S, 44 – 46 ° W), Estado de Minas Gerais, sudeste do Brasil, de agosto
de 2008 a dezembro de 2010. Os peixes foram capturados com redes de emalhar com malhas
de tamanhos variados. Os exemplares que estavam vivos nas redes foram manuseados de
acordo com o Animal Experimentation Guidelines estabelecido pelo Brazilian College of
Animal Experimentation (COBEA) sendo sacrificados com secção da medula cervical
(Andersen et al., 2008). De cada exemplar obtiveram-se comprimento total (CT) e peso
corporal (PC) (Tabela 1). Após dissecação, as gônadas foram analisadas quanto a relações
anatômicas, forma, coloração e documentadas fotograficamente. Determinou-se também o
peso das gônadas (PG) para calcular o índice gonadossomático (IGS) das fêmeas maduras:
IGS = PG x 100/ PC.
Para análises microscópicas, fragmentos de gônadas foram fixados em líquido de
Bouin por 8-12 horas e submetidos às técnicas histológicas de rotina: inclusão em parafina,
cortes com 3 a 5 µm de espessura e coloração com hematoxilina-eosina (HE).
Ovócitos e células espermatogênicas foram classificados de acordo com Gonçalves et
al. (2006) e Martins et al. (2011) e gônadas foram classificadas em três estádios de maturação
de acordo com Carvalho et al. (2009). Para determinar o conteúdo histoquímico das estruturas
ovocitárias, as seguintes técnicas foram utilizadas (Pearse, 1985): Ácido periódico de Schiff
(PAS) para glicoproteínas neutras e sialomucinas, Alcian blue pH 2,5 (AB pH 2,5) para
glicoconjugados ácidos carboxilados e sulfatados, incluindo sialomucinas, Alcian blue pH 0,5
(AB pH 0,5) para glicoconjugados ácidos sulfatados e hidrólise ácida com HCl 0.1 N (8h a 60
°C) para extração do ácido siálico, seguida de PAS e Alcian blue pH 2,5.
Diâmetro, espessura da zona pelúcida e altura das células foliculares foram
determinados em 50 ovócitos vitelogênicos de cada espécie com auxílio de ocular
micrométrica acoplada a microscópio de luz. Para comparar, entre as espécies analisadas, as
medidas histométricas e o IGS, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de
Dunn com p ≤ 0,05.
16
Figura 1: Fotos das espécies de peixes Anostomidae estudadas – A. Leporinus reinhardti
(comprimento total = 22,5 cm). B. Leporinus piau (22,7 cm). C. Leporinus obtusidens (33,3
cm). D. Leporinus taeniatus (19,5 cm). E. Leporellus vittatus (16,0 cm). F. Schizodon knerii
(28,5 cm).
Resultados
Dados da biometria mostraram que a maior espécie analisada foi o Leporinus piau
tanto em comprimento total, quanto peso corporal, enquanto os menores foram o Leporinus
taeniatus e Leporelus vittatus (Tabela 1).
Ovários de Leporinus, Leporellus e Schizodon analisados são órgãos pares, alongados,
fusiformes, localizados dorso-lateralmente à bexiga gasosa e cavidade celômica e dorsalmente
ao tubo digestivo. Ovários maduros têm coloração acinzentada, variando de tonalidade
dependendo da espécie (Figs. 2A e 3A). O IGS de fêmeas maduras foi significativamente
menor em S. knerii (Tabela 2). Histologicamente, ovários maduros são repletos de ovócitos
vitelogênicos com diâmetro variando de 586,7 ± 26,5 até 616,6 ± 59,4 µm (Fig. 2B e Tabela
2), com ooplasma preenchido por glóbulos de vitelo esféricos acidófilos (Figs. 2C e 3B) e
alvéolos corticais no ooplasma periférico (Fig. 2F e 3F). O diâmetro das vesículas dos
17
alvéolos corticais variou entre 8,8 ± 2,1 em L. vittatus e 20,3 ± 3,4 em S knerii (Tabela 2). Em
todas espécies estudadas, a zona pelúcida é formada por duas camadas com espessura, nos
ovócitos vitelogênicos, variando de 3,5 ± 0,6 a 11,5 ± 1,8 µm, sendo significativamente mais
espessada em S. knerii (Tabela 2). As células foliculares dos Leporinus e L. vittatus são
pavimentosas com altura variando 1,3 ± 0,3 a 1,6 ± 0,3 µm (Fig. 2D e Tabela 2), enquanto em
S. knerii elas são prismáticas no pólo vegetativo, com altura de 61,1 ± 9,6 µm (Fig. 3C e
Tabela 2) e cúbicas no pólo animal, com altura de 22,3 ± 3,2 µm (Fig. 3D). Glicoproteínas
neutras foram detectadas nas células foliculares, zona pelúcida, alvéolos corticais e glóbulos
de vitelo das seis espécies estudadas devido à reação positiva à técnica do PAS (Figs. 2E e
3E). Glicoconjugados ácidos carboxilados foram detectados nas células foliculares de
Leporinus e L. vittatus (Fig. 2F) e nos alvéolos corticais de todas as espécies estudadas devido
à reação positiva ao AB pH 2,5 (Fig. 2F e 3F), negativa ao AB pH 0,5 e reação inalterada ao
PAS e AB pH 2,5 após hidrólise ácida.
Tabela 1: Biometria de seis espécies de Anostomidae da bacia do rio São Francisco, Minas
Gerais, Brasil.
CT (cm)
PC (g)
Espécies
macho
fêmea
macho
L reinhardti
18,7 ± 2,2
23,4 ± 2,5
87,3 ± 33,5
L. piau
21,4 ± 2.9
24,0 ± 3,3
L. obtusidens
32,2 ± 10,7
L. taeniatus
fêmea
N
macho
fêmea
201,6 ± 68,9
17
38
171,5 ± 77,4
209,7 ± 75,0
11
26
40,9 ± 12,3
550,0 ± 644,7
1255,1 ± 1118,8
14
15
16,1 ± 2,0
19,9 ± 2,9
48,1 ± 23,7
112,6 ± 58,4
17
23
L. vittatus
17,3 ± 1,1
18,2 ± 3,6
56,6 ± 9,4
76,7 ± 46,7
09
13
S. knerii
26,7 ± 3,0
31,0 ± 4,6
242,7 ± 79.3
388,3 ± 141,3
12
17
CT = comprimento total; PC = peso corporal.
Os testículos de Leporinus, L. vittatus e S. knerii são órgãos pares, alongados e
fusiformes, localizados dorso-lateralmente à bexiga gasosa e cavidade celômica e dorsalmente
ao tubo digestivo. Os testículos maduros têm coloração branco-leitosa (Fig. 4A) e o IGS foi
signficativamente mais baixo em L. vittatus do que nas outras espécies estudadas (Tabela 2).
Histologicamente os testículos são constituídos por túbulos seminíferos contendo cistos de
células espermatogênicas (Fig. 4B). A parede dos cistos é formada por prolongamentos
citoplasmáticos das células de Sertoli e em cada cisto células espermatogênicas encontram-se
na mesma fase de desenvolvimento (Fig. 4C). Nos testículos de Leporinus, L. vittatus e S.
knerii as espermatogônias distribuem-se em toda extensão dos túbulos seminíferos, os quais
se conectam formando anastomoses (Fig. 4D) que convergem para o ducto espermático.
18
Figura 2: Ovários maduros e ovócitos vitelogênicos Leporinus e L. vittatus – A. Ovários de
L. obtusidens. B. Ovários maduros repletos de ovócitos vitelogênicos em L. reinhardti, HE,
60X. C. Ovócito vitelogênico de L. reinhardti, HE, 200X. D. Células foliculares
pavimentosas em ovócito vitelogênico de L. vittatus, HE 840X. E. Reação positiva ao PAS
em estruturas ovocitárias de L. piau, 990X. F. Reação positiva ao AB pH 2.5 nos alvéolos
corticais e células foliculares de L. piau, 1000X. FC, Células foliculares; ZP, Zona pelúcida;
CA, Alvéolos corticais; YG, Glóbulos de vitelo; seta, micrópila.
19
Figura 3: Ovários maduros e ovócitos vitelogênicos de S. knerii. – A. Ovários maduros. B.
Ovócito vitelogênico, HE, 170X. C. Detalhe de células foliculares primáticas no pólo
vegetativo, HE, 410X. D. Transição entre células foliculares cúbicas no pólo animal e células
foliculares prismáticas no pólo vegetativo, HE, 370X. E. Reação positiva ao PAS em
estruturas ovocitárias, 950X. F. Reação positiva ao AB pH 2.5 nos alvéolos corticais e ao
PAS nas células foliculares, zona pelúcida e glóbulo de vitelo, 680X. FC, Células foliculares;
ZP, Zona pelúcida; CA, Alvéolos corticais; YG, Glóbulos de vitelo.
20
Figura 4: Testículos maduros de peixes Anostomidae. – A. Testículos de L. piau. B. Túbulos
seminíferos nos testículos de S. knerii, HE, 400X. C. Cistos de células espermatogênicas nos
testículos de L. taeniatus, HE, 900X. D. Testículo tubular anastomosado de S. knerii, HE,
190X. * Anastomoses.
Tabela 2: Índice gonadossomático(IGS) e diâmetro de ovócitos vitelogênicos (DO),
espessura da zona pelúcida (ZP) e altura das células foliculares (CF) em micrometros (µm) de
seis espécies de Anostomidae da bacia do rio São Francisco, Minas Gerais, Brasil.
IGS
Espécies
Estrutura
Macho
Fêmea
a, b
18,7 ± 1,9
DO
a
586,9 ± 34,0
CA
a
9,8 ± 2,8
ZP
a
1,4 ± 0,3a
L reinhardti
1,2 ± 0,2
L. piau
2,7 ± 1.5b
15,8 ± 1,7a
616,6 ± 59,4a
10,0 ± 2,4a
8,3 ± 0,7b
1,3 ± 0,3a
L. obtusidens
1,1 ± 0,3a, b
18,7 ± 1,6a
586,7 ± 26,5a
10,5 ± 2,3a
8,7 ± 0,9b
1,6 ± 0,3a
L. taeniatus
1,7 ± 1,6a, b
17,7 ± 1,3a
600,6 ± 24,5a
10,3 ± 2,2a
8,1 ± 1,1b
1,5 ± 0,3a
L. vittatus
0,4 ± 0,1c
17,9 ± 0,5a
601,4 ± 82,4a
8,8 ± 2,1a
9,0 ± 0,8b
1,3 ± 0,4a
S. knerii
1,0 ± 0,7a
12,7 ± 1,2b
582,8 ± 30,1a
20,3 ± 3,4b
11,5 ± 1,8c
61,1 ± 9,6b
Teste de Kruskal-Wallis seguido de Teste de Dunn. Letras diferentes = p ≤ 0,05.
3,5 ± 0,6
CF
a
21
Discussão
Neste estudo, as fêmeas de todas as espécies são maiores que os machos, dimorfismo
sexual já observado em Characiformes neotropicais (Hojo et al., 2004; Thomé et al., 2005;
Alvarenga et al., 2006; Gonçalves et al., 2006; Carvalho et al., 2009; Honorato-Sampaio et
al., 2009). Marcantes diferenças foram observadas nos ovócitos vitelogênicos entre as
espécies analisadas, porém, semelhanças macroscópicas e microscópicas na morfologia dos
ovários e testículos também foram registradas.
Diferenças no diâmetro dos ovócitos vitelogênicos podem ocorrer entre famílias e
populações de uma mesma espécie devido a variações na expressão gênica (Patiño &
Sullivan, 2002; Kolm & Ahnesjö, 2005). Além disso, geralmente, espécies sedentárias
possuem ovos grandes e adesivos, enquanto espécies migradoras possuem ovos pequenos e
livres (Rizzo et al., 2002; Melo et al., 2011). Entre os Anostomidae estudados, somente S.
knerii tem ovos adesivos (Rizzo et al., 2002), embora não foram observadas diferenças
estatísticas no diâmetro dos ovócitos vitelogênicos de Leporinus, L. vittatus e S. knerii.
A coloração dos ovócitos vitelogênicos de teleósteos é variada entre as espécies,
dependendo da dieta, constituindo parâmetro importante para identificação da prole, seleção
de fêmeas saudáveis e cuidado parental (Blount & Houston, 2000; Lubzens et al., 2010). Os
ovócitos vitelogênicos das espécies analisadas são acinzentados, padrão de coloração
característico das espécies das famílias Anostomidae e Prochilodontidae (Borçato et al., 2004;
Arantes et al., 2011).
A morfologia dos alvéolos corticais constitui importante parâmetro em agrupamento
de peixes (Belova, 2008). No presente estudo, observou-se alvéolos corticais formados de
vesículas grandes em S. knerii e de vesículas pequenas em Leporinus e L. vittatus. Em
teleósteos, o conteúdo dos alvéolos corticais é liberado no espaço perivitelínico no momento
da fertilização, constituindo bloqueio à polispermia participando também do endurecimento
do córion (Hart, 1990). No presente estudo, detectou-se nos alvéolos corticais de Leporinus,
L. vittatus e S. knerii, glicoproteínas neutras e glicoconjugados ácidos carboxilados, sugerindo
que estas espécies podem possuir mecanismo similar de bloqueio à polispermia.
Esta
afirmação é corroborada pelas análises de Bazzoli & Godinho (1994) que estudaram a
morfologia e o conteúdo dos alvéolos corticais de 102 espécies de teleósteos neotropicais de
água doce e concluíram que espécies de mesma família apresentam o mesmo conteúdo
histoquímico dos alvéolos corticais e similar mecanismo de bloqueio à polispermia.
A zona pelúcida dos ovócitos vitelogênicos das espécies estudadas têm duas camadas
de glicoproteínas neutras, conteúdo comum à zona pelúcida de vertebrados (Lubzens et al.,
2010). Em teleósteos, a camada externa da zona pelúcida é responsável pelas interações entre
22
o ovo e o ambiente (Rizzo et al., 2002). As glicoproteínas neutras da zona pelúcida dos
peixes possuem propriedades bactericidas e são responsáveis pelo enrijecimento da camada
externa após a liberação do ovócito no ambiente (Hart, 1990; Lubzens et al., 2010). A
espessura da zona pelúcida também está relacionada ao local de desova e pode refletir
adaptações a diferentes condições ecológicas (Riehl, 1996; Santos et al., 2006). Espécies com
ovos adesivos tendem a possuir IGS mais baixo e zona pelúcida mais espessa em relação às
espécies com ovos livres (Sato et al., 2003; Melo et al., 2011). No presente estudo, S. knerii,
cujos ovos são adesivos (Rizzo et al., 2002), apresentou estatisticamente IGS mais baixo e
zona pelúcida mais espessa que os Leporinus, cujos ovos são livres (Rizzo et al., 2002). Pelo
fato de L. vittatus possuir IGS e espessura da zona pelúcida dos ovócitos vitelogênicos
estatisticamente similar a L. piau, L. obtusidens e L. taeniatus sugere-se que a espécie também
deve possuir ovos livres.
As células foliculares dos ovócitos vitelogênicos de S. knerii mostraram-se
estatisticamente mais altas que aquelas de Leporinus e L. vittatus, provavelmente devido a
adesividade de seus ovos. Esta suposição é reforçada por estudos ultraestruturais que
mostraram nas espécies cujos ovos são adesivos, células foliculares com grande quantidade de
organelas que sintetizam mucosubstâncias que são transferidas para a zona pelúcida para
promover a adesividade dos ovos ao substrato (Andrade et al., 2001; Rizzo et al., 2002;
Santos et al., 2006). Nos ovócitos vitelogênicos de S. knerii observaram-se células foliculares
cúbicas no pólo animal e prismáticas no pólo vegetativo, similar ao observado em alguns
Cichlidae (Normando et al., 2009; Martins et al., 2011). As células cúbicas sintetizam
proteínas que são importantes para o funcionamento da região micropilar enquanto as células
prismáticas estão envolvidas na secreção de substâncias relacionadas com a adesividade dos
ovos (Rizzo et al., 2002).
A morfologia dos testículos das seis espécies analisadas mostrou padrão similar ao da
maioria dos Characiformes neotropicais (Gonçalves et al., 2006; Carvalho et al., 2009;
Martins et al., 2010; Arantes et al., 2011; Martins et al., 2011). Os Anostomidae estudados
apresentaram espermatogônias distribuídas ao longo de todo testículo, sendo classificados, de
acordo com Grier (1981), como testículos espermatogonias irrestritos, organização testicular
que permite a produção potencial de células germinativas (Schulz & Miura, 2002). Nas
espécies estudadas, os túbulos seminíferos se conectaram caracterizando testículos do tipo
tubular anastomosado, plesiomorfia morfológica apresentada pelos peixes ósseos (Parenti &
Grier, 2004). Neste tipo de testículo, os túbulos seminíferos se anastomosam em toda
extensão gonadal, diferente dos neoteleósteos que possuem anastomoses apenas nos túbulos
seminíferos localizados na região central dos testículos (Parenti & Grier, 2004).
23
O presente estudo mostrou diferenças fenotípicas nos ovócitos vitelogênicos de peixes
Anostomidae que confirmam a posição taxonômica de S. knerii em relação aos Leporinus e L.
vittatus. A morfologia gonadal das espécies analisadas mostrou ainda algumas semelhanças
fenotípicas que são características da família Anostomidae.
Agradecimentos
Os autores agradecem a CEMIG-GT/ CODEVASF pela parceria e ao CNPq, CAPES e
FAPEMIG pelo suporte financeiro.
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