UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL LUCIANA ELOÍSA DA SILVA CASTRO NÓBREGA AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE EM LESÕES DE LÍQUEN PLANO ORAL E PÊNFIGO VULGAR. Natal/RN 2014 Luciana Eloísa da Silva Castro Nóbrega AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE EM LESÕES DE LÍQUEN PLANO ORAL E PÊNFIGO VULGAR ORAL Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Patologia Oral. ORIENTADOR: Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa Natal/RN 2014 DEDICATÓRIA A DEUS, que sempre me conforta em oração nos momentos mais angustiantes e me abençoa todos os dias. “Não cai uma lágrima de nossos olhos, não tem um suspiro em nossos corações sem uma resposta de DEUS”. (Bv. João XXIII) Aos meus queridos pais, irmãos e sobrinha por todo amor, dedicação e por nunca deixarem de acreditar em mim até nos momentos que nem eu mesma acredito. Amo vocês! Ao meu amor, agora meu marido, José Newton Filho, por me tornar uma mulher plena, realizada e sempre me apoiar em qualquer circunstância. Eu amo você para sempre! Dedico. AGRADECIMENTOS Ao Professor Doutor, Antônio de Lisboa Lopes Costa, meu orientador, por sempre se mostrar interessado nas minhas dúvidas e incertezas, dando-me segurança e orientando-me no intuito de mostrar-me o melhor caminho nessa batalha. Exemplo de amor e dedicação não só para a Patologia Oral, mas para toda a Odontologia, abraçando toda causa em prol do pleno funcionamento da Faculdade de Odontologia da UFRN, tornando esta uma das melhores faculdades da área do Brasil. Esse, sim, sábio Mestre! Eu sou só orgulho e admiração! A toda a minha família, que torce e vibra com cada conquista minha desde os meus primeiros passos. Aos meus queridos amigos, que sentiram minha falta nos momentos que tive que me ausentar, porém sempre entenderam que isso era preciso, torcendo com afinco para a minha felicidade e realização. À coordenadora, Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, por toda a sua dedicação, conhecimentos a mim transmitidos e por coordenar tão brilhantemente o Programa de PósGraduação em Patologia Oral da UFRN. Ser mestre não é apenas lecionar, ensinar não é apenas transmitir o conteúdo programático. Ser mestre é ser orientador, guia e companheiro, é caminhar com o aluno passo a passo. É transmitir a este os segredos da caminhada. Ser mestre é ser exemplo de dedicação, de doação, de dignidade pessoal e de amor. Eu posso afirmar, com muito orgulho, que durante o Mestrado eu tive mestres assim, todos bastante preocupados em nos transmitir o máximo de conhecimento possível, com a melhor qualidade, sem demonstrar desânimo, entendendo os limites de cada um. E é por isso, meus mestres, Profa. Dra. Roseana de Almeida Freitas, Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, Profa. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira, Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, Profa. Dra. Ana Miryam Costa de Medeiros, e Profa. Dra. Patrícia Teixeira, que devo todo o conhecimento adquirido no Mestrado da Patologia Oral para vocês. O meu muito obrigada, hoje e sempre! A todos os meus colegas do Doutorado do Programa da Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN, principalmente Roseane Vasconcelos, que desde o princípio deu-me forças não me deixando desistir do Mestrado em nenhum momento; seu carinho, espontaneidade e amizade me foram essenciais nessa trajetória. A todas as Chuchus, Denise Hélen, Ana Luiza Andrade, Natália Guimarães, Clarissa Demeda e Bárbara Monteiro, sempre tão dispostas a ajudar e ensinar tantas coisas que para mim eram tão desconhecidas. Agradeço em especial e com lágrimas nos olhos a minha querida turma de Mestrado: Alice Helena, que passou tão pouco tempo conosco, mas nos mostrou que tudo era possível; Tiago João, por ser sempre tão “atrevido” e com tanto amor em fazer sempre o melhor; Maria Luiza, por sua dedicação inspiradora e contagiante; Luiz Eduardo, por ser sempre tão correto e perfeccionista; Andreia Do Carmo, por ser tão doce, emotiva e ao mesmo tempo muito sábia; Marcelo Nascimento, pela sua dignidade e hombridade; Thaís Maciel, por ser tão encantadora e batalhadora, Thâmara Manoela, por nos fazer chorar de rir, como todo bom cearense, mesmo nos piores momentos e Viviane Alves, que logo de cara me identifiquei, por ser sempre tão doce e corajosa. Eu não tenho palavras para dizer o quanto sou grata por tudo que passamos juntos, sempre apoiando um ao outro, nunca deixando que o outro desista... Foi lindo! Sem vocês não teria graça alguma! Aos meus queridos amigos, que sentiram minha falta nos momentos que tive que me ausentar, porém sempre entenderam que isso era preciso, torcendo com afinco para a minha felicidade e realização. Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN, Gracinha, Lourdinha, Idelzuite, Sandrinha, Ricardo, Hévio e Patrícia da Clínica de Estomatologia, obrigada pela paciência e disponibilidade em ajudar. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelos auxílios financeiros que possibilitaram a realização deste trabalho. RESUMO RESUMO O Líquen Plano Oral e o Pênfigo Vulgar são doenças imunológicas crônicas mucocutâneas de etiologias desconhecidas que podem acometer a mucosa oral. Tão importante quanto em neoplasias o papel da angiogênese na patogenia das doenças inflamatórias crônicas é de apreciável interesse, podendo ser considerado um marcador da atividade da doença. Ademais, com o estudo do processo angiogênico nessas lesões tem-se a possibilidade de aprimorar o entendimento do mecanismo patogênico nas mesmas. Este trabalho se propôs a avaliar a atividade angiogênica através da expressão imunoistoquímica do anticorpo anti-CD34, utilizando a técnica da MVC, em 26 casos de LPO reticulares, 14 casos de LPO erosivos, 18 casos de PV e em 15 casos de mucosa oral normal. Os resultados deste experimento foram submetidos a testes estatístico não-paramétricos com nível de significância de 5%. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre o número médio de vasos obtidos pela MVC nas lesões. Todavia, foi observado que a mediana dos casos de líquen plano oral foi maior que no grupo de pênfigo vulgar, que por sua vez revelou mediana maior que nos casos de mucosa oral normal (p=0,280). No tocante a contagem microvascular de CD34 em relação à forma clínica dos líquens planos orais (reticular e erosivo), verificou-se uma mediana ligeiramente maior para a forma clínica erosiva. Apesar de os testes estatísticos utilizados não demonstrarem diferença significativa (p=0,720). Ainda que os resultados do presente estudo não permitam a afirmação contundente da participação do processo angiogênico na patogênese e progressão das lesões de líquen plano oral e pênfigo vulgar, sugerimos que este processo está presente em ambas as lesões, porém outros estudos devem ser realizados a fim de que essa hipótese seja fundamentada. Palavras-chaves: Líquen plano oral. Pênfigo vulgar. Doenças autoimunes. Angiogênese. CD34. Imunoistoquímica. ABSTRACT ABSTRACT Oral lichen planus and pemphigus vulgaris are chronic diseases mucous membrane immune of unknown aetiology that can be observed affecting to the oral mucous. A relevant as regards neoplasies the role angiogenesis in the inflammatory chronic disease pathogenesis as it provides a substancial interest can be considered as being an activity diseases marker; besides being through specialised research of this angiogenic process to improve of understanding pathogenic mechanism. This research proposes to assess angiogenic active through of antibody immunohistochemistry expression antiCD34 antibody in 26 OLP of reticular cases, 14 OLP erosives cases, 18 of PV cases and 15 specimens of normal oral mucosa. The result was submitted non-parametric tests of 5% significance level. It is not statistically significant correlacion was seen regarding between average vessels. However, only be effectively observed the median of OLP cases was larger than pemphigus vulgaris in fact proved average larger than oral normal mucosa (p=0,280). Regarding the microvascular count of CD34 concerning clinic form oral lichen planus (reticular and erosion) increased emphasis is more cross-border average for the form erosion clinic. Despite of the statistic tests could not be more effective (p=0,720). Even though, the results of the research is not sufficient to enable to consider of angiogenic process in the pathogenesis and lesions progression of oral lichen planus and pemphigus vulgaris, we suggest this process is present in both forms lesion, however, more studies must be made in the near future in order to prepare a well-founded proposal. Keywords: Oral lichen planus. Pemphigus vulgaris. Autoimmune diseases. Antigens CD34. Angiogenesis. Immunohistochemistry. LISTA DE ILUSTRAÇÕES LISTA DE ILUSTRAÇÕES Quadro 1 - Especificação, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação do anticorpo primário utilizado................................................................ Gráfico 1 - Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão analisada. Natal/RN................................................................................................... Gráfico 2 - 42 Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com a forma clínica de líquen plano oral. Natal/RN, 2014........................................... Figura 1 - 40 Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com o tipo de lesão avaliada. Natal/RN, 2014................................................................ Gráfico 3 - 37 43 Fotomicrografia do espécime de LPO exibindo hiperparaceratinização, epitélio de revestimento atrófico, áreas de perda de nitidez da camada basal, projeções epiteliais e infiltrado inflamatório linfocítico subepitelial (H/E, 200X)........................................................................... Figura 2 - 44 Fotomicrografia do espécime de PV exibindo separação intraepitelial, acima da camada de células basais do epitélio, acantólise, células de Tzanck e um infiltrado leve de células inflamatórias crônicas no tecido conjuntivo (H/E, 200X)............................................................................ Figura 3 - LPO Reticular. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X)..................... Figura 4 - 44 45 LPO Reticular. Marcação imunoistoquímica para o anticorpo antiCD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais em meio ao infiltrado inflamatório linfocítico (LSAB, 100X).................................................... Figura 5 - 45 LPO Erosivo. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação do anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados (LSAB, 100X)......................................................................................................... Figura 6 - LPO Erosivo. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em múltiplos vasos sanguíneos (LSAB, 100X).............................................. Figura 7 - 46 46 Pênfigo Vulgar. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação do anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados e em células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X)........................................... Figura 8 - 47 Pênfigo Vulgar. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais na lâmina própria principalmente em região justaepitelial (LSAB, 100X)........................................................... 47 LISTA DE TABELAS LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular do CD34 de acordo com o tipo de lesão avaliada. Natal/RN, 2014............... Tabela 2 - 41 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para a contagem microvascular entre as lesões de LPO, PV e os espécimes de MON. Natal/RN, 2014............................ Tabela 3 - 42 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística para a contagem microvascular entre os tipos de lesões de líquen plano oral.Natal/RN,2014.................... 43 LISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE ABREVIATURAS APC Antigen-Presenting Cell – Célula Apresentadora de Antígeno CD Cluster of Diferentiation – Unidade de Diferenciação CD62L L-Selectina CD62E E-Selectina CD62P P-Selectina Dsg Desmogleína ELAM-1 Molécula de Adesão doTipo 1 FvW Fator de Von Willebrand GlyCAM-1 Molécula de Adesão do Tipo 1 que contém Glicano H/E Hematoxilina e Eosina HEV Vênula Especializada de Endotélio Alto HIV Human Immunodeficiency Virus – Vírus da Imunodeficiência Humana Ig Imunoglobulina IL Interleucina INF-γ Interferon gama KDa Kilodalton LP Líquen Plano LPO Líquen Plano Oral MDV Microvessel Density - Microdensidade Vascular MHC Major Histocompatibility Complex – Complexo Principal de Histocompatibilidade MMP Matrix Metalloproteinases – Metaloproteinanses da Matriz mRNA Menseger Ribonucleic Acid – Ácido Ribonucleico Mensageiro MVC Microvessel Count – Contagmem Microvascular MVV Microvessel Volume – Volume Microvascular OMS Organização Mundial da Saúde P53 Proteína 53 PV Pênfigo Vulgar RL Reação Liquenóide Th T Helper – Células T Auxiliares TGF-β Transforming Growth Factor beta – Fator Transformador do Crescimento beta TGFβ-RI Receptor I para o Fator Transformador do Crescimento beta TGFβ-RII Receptor II para o Fator Transformador do Crescimento beta TNF-α Tumor Necrosis Factor alfa – Fator de Necrose Tumoral alfa VEGF Vascular Endothelial Growth Factor – Fator de Crescimento Endotelial SUMÁRIO SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 11 2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 14 2.1 LÍQUEN PLANO ORAL...................................................................................... 14 2.1.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia............................... 14 2.2 19 PÊNFIGO VULGAR............................................................................................ 2.2.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia............................... 19 2.3 ANGIOGÊNESE................................................................................................... 23 2.3.1 Considerações Gerais........................................................................................... 23 2.3.2 Mensuração da Angiogênese................................................................................ 24 2.3.3 O Processo Angiogênico nas Lesões Crônicas Inflamatórias (Líquen Plano Oral e Pênfigo Vulgar)......................................................................................... 26 2.4 BIOMARCADOR ANGIOGÊNICO – CD34..................................................... 28 3 PROPOSIÇÃO..................................................................................................... 31 4 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 33 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS............................................................................... 33 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO................................................................... 33 4.3 POPULAÇÃO........................................................................................................ 33 4.4 AMOSTRA............................................................................................................ 33 4.4.1 Critérios para seleção da amostra....................................................................... 34 4.4.2 Caracterização da amostra.................................................................................. 34 4.5 ESTUDO CLÍNICO E MORFOLÓGICO........................................................... 35 4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO...................................................................... 35 4.6.1 Método Imunoistoquímico................................................................................... 35 4.6.2 Análise do Perfil Imunoistoquímico.................................................................... 37 4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................... 38 5 RESULTADOS..................................................................................................... 40 5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS..................................................................... 40 5.2 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS.......................................................... 41 5.2.1 Análise Quantitativa da Marcação Imunoistoquímica pelo anticorpo anti- 41 CD34....................................................................................................................... 41 5.2.2 Análise Estatística da Contagem de Microvasos Marcados pelo Anticorpo Anti-CD34.............................................................................................................. 42 6 DISCUSSÃO.......................................................................................................... 49 7 CONCLUSÕES...................................................................................................... 57 REFERÊNCIAS.................................................................................................... 59 APNEXOS................................................................................................................. 70 APÊNDICE............................................................................................................. 74 INTRODUÇÃO 11 1 INTRODUÇÃO O Líquen Plano Oral é uma doença imunológica crônica mucocutânea, de etiologia desconhecida e mediada por células T inflamatórias a qual apresenta uma vasta gama de manifestações clínicas, afetando comumente o epitélio escamoso estratificado. Trata-se da doença não infecciosa mais comum da mucosa oral e atinge 1 a 2% da população adulta acima de 40 anos de idade, embora adultos jovens e crianças possam desenvolver a doença (SOUSA; ROSA, 2008). O pênfigo é uma doença autoimune individualizada pela formação de bolhas em pele ou em mucosas, que pode ser subclassificado em seis tipos: vulgar, vegetante, eritematoso, foliáceo, paraneoplásico e o IgA pênfigo. O pênfigo vulgar é o mais comum dos tipos de pênfigo, tratando-se de uma doença crônica mucocutânea autoimune de etiologia desconhecida que inicialmente se manifesta na forma de lesões intraorais, as quais se dispersam para outras membranas mucosas e pele. Essa doença é caracterizada por uma formação de bolhas ou vesículas de diâmetros variáveis que uma vez rompidas originam erosões superficiais irregulares de sintomatologia dolorosa, as quais logo são recobertas por um tipo de pseudomembrana e circundadas por um eritema difuso (AMORMINO; BARBOSA, 2010). É uma doença rara, a qual acomete apenas de 1 a 5 pacientes por milhão/ano (NEVILLE et al., 2009); e dentre as pessoas afetadas a maioria são mulheres adultas com idade entre 40 a 60 anos. As lesões do PV podem incidir qualquer sítio da cavidade oral, sendo que os mais comumente afetados são palato, mucosa jugal e lábios. O diagnóstico é geralmente baseado nas manifestações orais, entretanto é raro o paciente relatar a presença de bolhas ou vesículas intraorais devido à rápida ruptura do teto fino e friável das bolhas. Por isso a confirmação é fornecida por achados histológicos que mostram a presença de bolhas intraepiteliais, acantólise e células de Tzanck (DAGISTAN et al., 2008; NEVILLE et al., 2009; TAMGADGE et al., 2011). A angiogênese consiste no crescimento de novos vasos a partir de uma rede vascular pré-existente, a qual desenvolve um importante papel na progressão do tumor fornecendo nutrientes e fatores de crescimento (MENAKURU et al., 2008; SCARDINA et al., 2009). No líquen plano oral, a angiogênese ocorre provavelmente como uma reação ao efeito da hipóxia na região estromal, onde a reação flogógera ocorre devido ao aumento dos linfócitos proliferantes dessa lesão (SCARDINA et al., 2009). Por outro lado, até os dias atuais, nenhum dado existe a respeito da avaliação da angiogênese no pênfigo vulgar, porém alguns estudos relatam sobre o tratamento dessas lesões usando a Talidomida, uma droga com importantes 12 efeitos anti-angiogênicos comprovados, apesar de se desconhecer por quais mecanismos a Talidomida inibe esse processo. Um das técnicas mais utilizados para se observar a angiogênese é a contagem microvascular (MVC), uma importante ferramenta para quantificar esse processo a qual possui importante potencial para ser usado como um marcador de prognóstico, sendo avaliada quando se lança mão de marcadores de células pan-endoteliais, como o anti-CD34. Destarte, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a angiogênese através da expressão imunoistoquímica do anticorpo monoclonal anti-CD34 em uma série de casos previamente selecionados de líquen plano oral e pênfigo vulgar na tentativa de melhor compreender o papel da angiogênese tanto na patogênese quanto na progressão e autoperpetuação dessas doenças autoimunes crônicas inflamatórias. 13 REVISÃO DE LITERATURA 14 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 LÍQUEN PLANO ORAL 2.1.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia O líquen plano oral é uma doença mucocutânea crônica autoimune, relativamente comum, com prevalências relatadas que variam de 0,5 a 4% (SURGERMAN et al., 2002; EISEN et al., 2005; AL-HASHIMI et al., 2007). É mais comumente observada em pessoas de meia idade, com picos de prevalência entre a quinta e sexta décadas de vida. Além disso, ressalta-se uma forte predileção para o sexo feminino (CARBONE et al., 2009; CARROZZO, THORPE, 2009; FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2011; EBRAHIMI; NYLANDER; VAN DER WAAL, 2011). Também pode ser observado em crianças, embora seja raro (LAEIJENDECKER et al., 2005) Além da mucosa oral, o líquen plano pode acometer pele, mucosa genital, unhas e couro cabeludo (SURGERMAN et al., 2002). Na maioria dos casos, o LP cutâneo é autolimitado e causa prurido, sendo as lesões descritas como pápulas pruriginosas arroxeadas e poligonais, as quais são normalmente encontradas nas superfícies flexoras das extremidades (EISEN et al., 2005; AL-HASHIMI et al., 2007; ANURADHA et al., 2008; CARBONE et al., 2009). No couro cabeludo pode provocar áreas de alopecia e nas unhas podem produzir o adelgaçamento e separação das mesmas (SCULLY; CARROZZO, 2008). O envolvimento da mucosa oral pelo LP é muito comum, podendo ser tanto uma região de apresentação inicial dessa desordem bem como o único local de acometimento (JAAFARI-ASHKAVANDI et al., 2011; ANURADHA et al., 2011). Existem seis formas de apresentação clínica do LPO descritas na literatura, as lesões brancas: reticular, em placa e papular; e as lesões vermelhas: atrófico, erosivo e bolhoso. Algumas variantes podem co-existir em um mesmo paciente. Sensação de queimação e usualmente dor podem acompanhar as lesões de LPO do tipo erosivo, atrófico e bolhoso, enquanto que a forma reticular é geralmente assintomática e os portadores podem nem perceber a presença das lesões (ANDREANSEN, 1968). O tipo mais comum de LPO é a de padrão reticular, podendo se apresentar como pápulas, placas e com um rendilhado entrelaçado de linhas ceratóticas conhecidas como “estrias de Wickham”, as quais se apresentam tipicamente simétricas e bilaterais. Qualquer sítio da mucosa oral pode ser afetado por esse tipo de LPO, embora seja mais frequentemente 15 encontrado na mucosa jugal (EINSEN, 2002; INGAFOU et al., 2006; KALMAR, 2007). A forma erosiva ainda que não seja tão comum quanto a reticular, é mais incômoda para o paciente, pois as lesões são comumente sintomáticas. De forma geral, são difusas, avermelhadas que exibem estrias ceratóticas esbranquiçadas circundando-as. Essas estrias irradiam perifericamente e são usualmente evidentes nas margens das zonas atróficas da lesão (KALMAR, 2007; ANURADHA et al., 2008). Algumas vezes, a atrofia e a ulceração estão confinadas à mucosa gengival, produzindo um padrão de reação chamado “gengivite descamativa”. Todavia, em alguns casos, se o componente erosivo for muito intenso, poderá haver separação do epitélio, resultando em uma forma relativamente rara da doença, conhecida como líquen plano bolhoso (EDWARDS; KELSCH, 2002, NEVILLE et al., 2009). As lesões de LPO atrófico podem apresentar-se como uma mistura de subtipos clínicos de líquen plano. Alternativamente, uma área central de ulceração pode exibir sua superfície coberta por um exudato firinopurulento, circundado por uma área de eritema (SILVERMAN; GORSKY; LOZADA-NUR, 1985). O LPO também pode ocorrer sob a forma de placas esbranquiçadas que se assemelham a leucoplasia oral, cujo aspecto pode variar de ligeiramente elevadas e suaves a levemente irregulares e multifocais. As lesões do tipo placa abrangem apenas 7% dos casos e são mais comuns em fumantes. Além disso, semelhante ao tipo reticular, geralmente é assintomático (ANURADHA et al., 2008). As lesões do tipo papular se apresentam como pequenas pápulas brancas (0,5mm a 1mm) com finas estriações na periferia da lesão e usualmente coexistem com outras lesões de líquen plano. É bastante raro e não é difícil de ser negligenciado no exame clínico devido ao pequeno tamanho da lesão (BRICKER, 1994). Geralmente as lesões de líquen plano podem acometer qualquer região da cavidade oral, mas a mucosa jugal posterior é o local mais comum de acometimento, seguido pelas bordas laterais da língua, gengiva, mucosa labial e vermelhão do lábio inferior, apresentandose como lesões bilaterais, simétricas ou múltiplas. São raras as lesões no palato, lábio superior e assoalho bucal (CARROZZO; THORPE, 2009; ROOPASHREE, et al., 2010; EBRAHIMI; NYLANDER; VAN DER WAAL, 2011). As lesões de LPO persistem por muitos anos com períodos de exacerbação e quiescência. Durante o período de exacerbação a área de eritema e erosão aumentam, com concomitante aumento de dor e sensibilidade. Já no período de quiescência a área de eritema e ulceração diminuem e, consequentemente a dor e a sensibilidade também. A exacerbação do líquen plano tem sido associada a períodos de estresses psicológicos, ansiedade e trauma mecânico (ISMAIL; KUMAR; ZAIN, 2007). 16 Os aspectos clínicos característicos do líquen plano oral são, na maioria das vezes, suficientes para o diagnóstico correto da doença. Em lesões clássicas é possível fazer o diagnóstico baseado apenas nas características clínicas (ISMAIL; KUMAR; ZAIN, 2007). Ainda assim, a biópsia associada ao exame histopatológico é recomendada para confirmar o diagnóstico clínico e, principalmente, para excluir a presença de atipias epiteliais ou mesmo indícios de malignidade (EISEN et al., 2005). Dentre as desordens que podem se assemelhar tanto clínica quanto histologicamente às lesões de LPO se destacam as reações liquenóides (RL), porém estas reações possuem uma etiologia identificável. Usualmente, ocorrem em regiões da mucosa oral que se encontra em íntimo contato com restaurações de amálgama, restaurações de resina ou próteses dentárias. As RL provavelmente sejam o resultado da hipersensibilidade de contato da mucosa oral com esses materiais dentários (ISMAIL; KUMAR; ZAIN, 2007). Além disso, exposição sistêmica a algumas drogas também podem resultar em lesões de RL. Dentre as drogas mais comumente associadas com o surgimento de tais reações destacam-se anti-hipertensivos, antiinflamatórios não-esteroidais e anti-retrovirais utilizados na terapia do HIV. Certos tipos de alimentos como a canela também podem provocar lesões semelhantes às reações liquenóides, porém com aspectos histopatológicos que podem auxiliar a diferenciar do LPO, como a presença de um infiltrado inflamatório mais profundo e perivascular. Na maioria das vezes a causa das lesões de RL não pode ser identificada, desse modo o diagnóstico de exclusão dessas lesões é considerado “líquen plano oral de causa idiopática” (SUGERMAN et al., 2002). Diferentemente do LPO, a maioria das reações liquenóides regridem após a remoção do agente causador (AL-HASHIMI et al., 2007; SCULLY; CARROZZO, 2008; SCHLOSSER, 2010; MÜLLER, 2011). Atualmente a precisa etiologia do líquen plano oral ainda é incerta. Sabe-se que o estresse é amplamente conhecido por ser um importante fator etiológico para o LPO, porém outros estudos devem ainda ser feitos para comprovar essa hipótese. Ainda não foi determinado se alterações psicológicas observadas em paciente com LPO são fatores etiológicos diretos ou se representam apenas uma consequência do desconforto crônico causado pelas lesões do LPO nesses pacientes. Por si só, este desconforto pode ser o causador do estresse e, parcialmente explicar essa associação. Entretanto, observa-se notadamente que pacientes portadores de LPO apresentam tendência a depressão (CARROZZO; THORPE, 2009). Muitos estudos suportam a evidência do importante papel da desregulação imunológica na etiopatogenia do líquen plano oral, especificamente envolvendo a parte 17 celular do sistema imune. Além disso, sabe-se que ambos os mecanismos antígenos específicos e não específicos estão envolvidos no LPO. Estes mecanismos associados levariam então ao acúmulo de linfócitos T na lâmina própria subjacente ao epitélio, rompimento da membrana basal, migração de linfócitos T intra-epitelial e apoptose dos ceratinócitos, achados característicos do líquen plano (SUGERMAN et al., 2002). A resposta imune específica para o antígeno desconhecido que desencadeia a resposta imune do LPO consiste em três passos: (1) a migração dos linfócitos citotóxicos TCD8+ para o epitélio; (2) a apresentação de antígenos pelos ceratinócitos basais e, (3) a ativação destes linfócitos, que uma vez ativados, destroem os ceratinócitos basais (SUGERMAN et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010). As células basais são os principais alvos de destruição no LPO e o mecanismo do dano causado está relacionado ao processo imune mediado por células, que envolve as células de Langerhans, linfócitos T e macrófagos (ANURADHA et al., 2008). É bem evidente a presença de um infiltrado epitelial de células TCD8+ citotóxicas próximos aos ceratinócitos basais apoptóticos e um infiltrado de células TCD4+ na lâmina própria. Contudo, o fator desencadeante da apoptose e o mecanismo destas respostas imunes ainda permanecem desconhecidos. Sugere-se que os linfócitos TCD8+ presentes nas lesões de LPO podem ser ativados por um antígeno presente nos ceratinócitos basais associados ao MHC de classe I, consequentemente promovendo a apoptose dos ceratinócitos (FAHRI; DUPIN, 2010). As células de Langerhans e os ceratinócitos basais podem apresentar um antígeno associado ao MHC de classe II para as células TCD4+ auxiliares, que secretam IL-2 e INF-γ, e a produção local de INF-γ pode manter a expressão do MHC de classe II pelos ceratinócitos, contribuindo assim para a cronicidade do LPO. Além disso, a expressão antigênica, a coexpressão de CD40 e CD80 e a secreção de IL-12 pelas células que apresentam antígeno (APC’s) via MHC de classe II aos linfócitos TCD4+, podem produzir uma resposta TCD4 + do tipo Th1, com produção de IL-2 e INF-γ (LODI et al., 2005). As quimiocinas, a degranulação de mastócitos, a ativação das metaloproteinases de matriz (MMP’s) e a perda da integridade da membrana basal epitelial são mecanismos não específicos na patogenia do LPO (SUGERMAN et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010). As quimiocinas são citocinas pró-inflamatórias produzidas por várias células, incluindo mastócitos, linfócitos ativados e ceratinócitos basais. Acredita-se que as quimiocinas secretadas pelas células epiteliais lesionais do LPO possam atrair mastócitos e, subsequentemente, estimular sua degranulação. Os mastócitos degranulados liberam TNF-α e quimase, que regulam positivamente a secreção de quimiocinas pelos linfócitos T lesionais do 18 LPO. Esse mecanismo cíclico seria mais uma explicação para a cronicidade do LPO. Além disso, a quimase, que é uma protease dos mastócitos, é uma conhecida ativadora de MMP’s (SUGERMAN et al., 2002; ZHAO et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010). MMP’s atuam produzindo a degradação proteolítica dos componentes da matriz extracelular do tecido conjuntivo e induzindo a perda da integridade da membrana basal, encontrada nas lesões de LPO. A perda desta integridade favorece a morte dos ceratinócitos, que em situação de normalidade, secretam colágeno IV e V, que são essenciais para a manutenção da integridade da membrana basal. Por sua vez, a membrana basal íntegra envia sinais de sobrevivência para os ceratinócitos. Portanto, a membrana basal íntegra é necessária para a sobrevivência dos ceratinócitos e os ceratinócitos são essenciais para a produção normal da membrana basal íntegra (SUGERMAN et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010). Apesar de o líquen plano oral ter sido considerado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma condição cancerizável, esse assunto ainda suscita inúmeras discussões. O potencial maligno das lesões de líquen plano oral ainda permanece controverso e diferentes grupos têm apresentado distintas abordagens e interpretações (MITTAL; SHANKARI; PALASKAR et al., 2012). Sousa et al. (2005) concordam com Eisenberg e Krutchkoff (1992), os quais apontaram para o fato de que muitas das lesões diagnosticadas como LPO seriam na verdade displasias liquenóides, lesões essas de caráter eminentemente pré-maligno. Por outro lado, Tanda et al. (2000) observaram uma hiperexpressão da proteína p53 no LPO, fato confirmado por Valente et al. (2001), que relacionaram essa ocorrência a um risco maior de malignização, uma vez que esse aumento da expressão do p53, via de regra, significa alteração na sua atividade. A transformação maligna em casos de LPO é relatada ocorrer em 0,3 a 3% dos casos sendo mais comum em casos de líquen plano erosivo. Assim o aumento da MDV nos casos de LPO erosivo quando comparado com os casos de LPO reticular pode ser sugerido como um dos fatores que contribuem para o alto potencial de malignidade nas lesões erosivas (MITTAL; SHANKARI; PALASKAR, 2012). Em um estudo retrospectivo no qual foi avaliado a transformação maligna em 23 casos de LPO realizado por Fang e colaboradores (2009), observou-se que os sintomas mais frequentemente encontrados eram a erosão e a dor, concordando com a literatura (VOUTE et al., 1992; MARKOPOULOS et al., 1997; RAJENTHERAN et al., 1999; SILVERMAN, BAHL, 1997; LANFRANCHI-TIZEIRA; AGUAS; SANO, 2003). Sendo a dor severa uma consequência da erosão. Tendo em vista esse e outros estudos que observam a transformação maligna nessas lesões, acredita-se que as lesões de LPO que têm uma maior tendência de 19 sofrer transformação maligna são as do tipo erosivas. Isso é justificado pelo fato de que as formas erosivas deixam a mucosa com uma maior predisposição para sofrer danos por agentes carcinogênicos (VAN DER MEIJ; SHEPMAN; VAN DER WAAL, 2003). 2.2 PÊNFIGO VULGAR 2.2.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia O pênfigo é a designação de um conjunto de entidades patológicas de etiologia autoimune, de incidência rara, caracterizada pela formação de bolhas intraepiteliais na pele e em mucosas (nariz, conjuntiva, genitálias, esôfago, faringe e laringe), sendo encontrada principalmente em pessoas de meia idade e idosos (BLACK; MIGNOGNA; SCULLY, 2005). O epitélio é uma estrutura complexa fazendo-se necessária a presença de uma grande quantidade de moléculas a fim de manter a sua integridade e saúde. O epitélio oral consiste essencialmente em ceratinócitos aderidos uns aos outros por desmossomos e, através de hemidesmossomos estes se aderem à membrana basal epitelial, que também está aderida à lâmina própria subjacente. Desmossomos são proteínas de adesão que funcionam tanto quanto um complexo adesivo como também um sítio de ligação à superfície celular para os filamentos intermediários de queratina do citoesqueleto (BLACK; MIGNOGNA; SCULLY, 2005). No pênfigo, os desmossomos são danificados por anticorpos dirigidos contra os domínios extracelulares das moléculas de adesão celular epitelial do tipo caderina – as desmogleínas (Dsg) provocando depósitos imunes intraepiteliais e perda do contato célulacélula (acantólise), levando a formação de bolhas intraepiteliais (NISHIKAWA et al., 1996). O epitélio oral é muito semelhante à pele, mas difere em alguns aspectos como na constituição dos componentes desmossomais. As moléculas de adesão do tipo caderina Dsg1 e Dsg3 são ambas expressas na pele, porém, no epitélio oral apenas a Dsg3 é expressa (SHIRAKATA et al., 1998). O dano à área intercelular leva à acantólise, que embora típica do pênfigo pode ser observada em outras condições como na doença de Darier, dermatose acantolítica transiente, disqueratoma warty, impetigo, em infecções virais e no carcinoma. Existem diferentes variantes do pênfigo descritas na literatura, apresentando distintos perfis de autoanticorpos e manifestações clínicas. Os quatro tipos principais são: foliáceo, eritematoso, vulgar e vegetante (NEVILLE et al., 2009; CAMACHO-ALONSO; LÓPEZJORNET; BERMEJO-FENOLL, 2005; BLACK; MIGNAGNA; SCULLY 2005), além dos tipos paraneoplásico e IgA pênfigo (TAMGADGE et al., 2011). Usualmente o indivíduo 20 desenvolve uma única variante do pênfigo, embora casos tenham sido descritos de transição para outra variante (ISHII et al., 2000), além de casos em que as manifestações clínicas de uma única variante poder mudar ao longo do tempo (BLACK; MIGNOGNA; SCULLY, 2005). Esta mudança pode estar relacionada às alterações nas proporções dos autoanticorpos contra as desmogleínas 1 e 3 (HARMAN et al., 2001). O pênfigo vulgar é o mais comum dos tipos de pênfigo. Entretanto, sua ocorrência é rara, com incidência estimada na população geral de um a cinco casos por milhão de pessoas diagnosticadas a cada ano (ROBINSON; LOZADA-NUR; FRIEDEN, 1997). Este tipo ocorre raramente antes da terceira década de vida, sendo a média de idade no momento do diagnóstico de 50 anos, embora casos raros possam ser vistos na infância. Afeta ambos os sexos igualmente, ainda que alguns autores tenham reportado uma maior prevalência em mulheres. O PV é a forma de pênfigo que afeta com maior frequência a mucosa oral, e na maioria dos casos as lesões orais precedem as manifestações cutâneas. O curso é crônico e o envolvimento sistêmico pode ocorrer se o tratamento adequado não for fornecido (CAMACHO-ALONSO; L[OPEZ-JORNET; BERMEJO-FENOLL, 2005). Embora a etiologia do pênfigo vulgar ainda não esteja esclarecida, sabe-se que um mecanismo autoimune com o envolvimento de autoanticorpos pode alterar as junções epiteliais intercelulares. Segundo Azulay e Azulay (1999), a sede primária da doença seria o cimento intercelular da camada espinhosa de Malpighi, embora não se saiba o motivo pelo qual esse cimento se torne antigênico e induza à produção de autoanticorpos, principalmente do tipo IgG. Esses autoanticorpos, mais especificamente o IgG1 e o IgG4, agem contra as glicoproteínas desmogleína 1 e desmogleína 3, pertencentes à família das cadeínas, as quais estão localizadas nos desmossomos do epitélio da pele, mucosas ou no soro dos paciente afetados. Tais anticorpos promovem a ruptura das pontes intercelulares e, consequentemente as células perdem a sua adesão, o que caracteriza o fenômeno de acantólise, provocando a formação de fendas intraepiteliais. A ligação antígeno-anticorpo induz a ativação de proteinases, dentre elas destaca-se o plasminogênio ativado, que após liberado pelos ceratinócitos transforma-se em plasmina, a qual promove a lise da substância intercelular (WILLIAMS, 1989; HASHIMOTO, 2003; JOLLY et al., 2010). Fatores genéticos também podem estar envolvidos na etiologia do PV, uma vez que certos grupos étnicos - judeus e populações do mediterrâneo – são particularmente suscetíveis ao pênfigo vulgar. A literatura também descreve casos familiares dessa doença (STANLEY, 1993; DELGADO et al., 1996). Estudos mostram que a expressão do antígeno de histocompatibilidade HLA-A26 parece predispor ao desenvolvimento da doença. Contudo, 21 para que o PV possa se desenvolver é necessária à presença de fatores endógenos como defeitos imunológicos, e exógenos como vírus e agentes físicos (CAMACHO-ALONSO; LÓPEZ-JORNET; BERMEJO-FENOLI, 2005; SCULLY; CHALLACOMBE, 2002; JOLLY et al., 2010). Além disso, o pênfigo também pode ser induzido por drogas. Na realidade, qualquer droga que apresentar uma substância contendo um grupamento –til ativo na sua estrutura molecular é considerada capaz de induzir a doença (MUTASIM; PELC; ANHALT, 1993). Alguns agentes conhecidos como indutores do pênfigo vulgar são as sulfonamidas, as penicilinas e as drogas antiepilépticas. Porém, Camacho-Alonso, López-Jornet e BermejoFenoli (2005) reportaram 14 casos de pênfigo vulgar, e afirmaram que nenhum dos pacientes relatou fazer uso de qualquer droga com possível efeito indutor do pênfigo. Tem sido sugerido que membros da família botânica Allium, incluindo cebola, alho e alho-poró podem induzir tais lesões (BRENNER; WOLF, 1994). Com relação às manifestações clínicas, aproximadamente 75% dos casos de PV revelam-se inicialmente na mucosa oral, cujas lesões precedem as cutâneas em um período de até um ano ou mais (ROBINSON; LOZADA-NUR; FRIEDEN, 1997; ENDO et al., 2005). Ao exame físico é observada a formação de bolhas e vesículas de diâmetros variáveis, de ocorrência superficial ou profunda, de conteúdo seroso claro, purulento ou sanguinolento, que uma vez rompidas originam erosões superficiais irregulares, com coloração avermelhada, sintomatologia dolorosa, sendo logo recobertas por um tipo de pseudomembrana e circundadas por um eritema difuso. Todavia, é raro o paciente relatar a presença de bolhas ou vesículas intraorais, e as lesões dificilmente podem ser detectadas pelo exame clínico devido à rápida ruptura do teto fino e friável das bolhas (SCULLY, CHALLACOMBE, 2002; NEVILLE et al., 2009). Tais lesões podem ser localizadas em qualquer região na da cavidade oral, porém são encontradas com maior frequência em áreas mais sujeitas ao trauma friccional, como mucosa jugal, língua, palato e lábio superior (LASKARIS; SKALAVOUNOU; STRATIGOS, 1982). O aumento da salivação e o incômodo ao mastigar, ao engolir e ao falar são as principais queixas dos pacientes com lesões de pênfigo vulgar oral, além de ardor intenso e odor fétido (SCIUBBA, 1996; SCULLY; CHALLACOMBE, 2002). O elemento semiotécnico para um diagnóstico mais simples do pênfigo vulgar é a verificação do sinal de Nikolsky. Este é positivo quando ocorre a formação de uma bolha ao se friccionar o epitélio nas proximidades das lesões já existentes, devido à facilidade de separação das células epiteliais. Embora esse sinal seja de grande valia, não é patognomônico 22 do pênfigo vulgar, podendo ser observado na grande maioria das lesões vesículo-bolhosas (HEAPHY; ALBRECHT; WERTH, 2005; NEVILLE et al., 2009; JOLLY et al., 2010). O diagnóstico geralmente é baseado nas manifestações orais, enquanto a confirmação é fornecida pelos achados histológicos. Os espécimes da biópsia do tecido perilesional caracterizam-se microscopicamente por uma separação intraepitelial (vesícula ou bolha intraepitelial) acima da camada basal das células do epitélio, sendo que esta permanece aderida à lâmina própria subjacente. No espaço vesicular são encontrados, com frequência, grupos de células que apresentam alterações degenerativas tais como tumefações dos núcleos, perda dos desmossomos, formato arredondado ou ovóide e hipercromatismo, sendo denominadas de células de Tzanck, as quais são resultantes da acantólise celular em decorrência do edema pré-vesicular. No tecido conjuntivo podem ser encontrados leucócitos polimorfonucleares e linfócitos em número variados. Ao contrário da maioria das doenças bolhosas, o pênfigo vulgar é caracterizado por escassez de infiltrado inflamatório no líquido da vesícula, exceto nos casos onde existe infecção secundária (WILLIAMS, 1989; WEINBERG; INSLER; CAMPEN, 1997; NEVILLE et al., 2009). A avaliação da imunofluorescência direta do espécime de biópsia de tecido perilesional fresco revela IgG ou IgM e fragmentos de complemento no espaço intercelular, sendo esse método de diagnóstico também considerado essencial, juntamente com o exame histopatológico, para a confirmação do diagnóstico (CALVANICO; ROBLEDO; DIAZ, 1991; BLACK; MIGNOGNA; SCULLY, 2005). O pênfigo vulgar, sendo uma doença autoimune sistêmica, deve ser tratado primeiramente com corticosteroides sistêmicos, visando inibir a produção dos autoanticorpos agressores (CHRYSOMALLIS et al., 1994; ENDO et al., 2005; NEVILLE et al., 2009). De acordo com Lee (2011), a combinação de corticosteroides com drogas imunossupressoras é a linha terapêutica mais usada para tratar o pênfigo vulgar. Esta doença não tem cura, apenas controle. Quanto maior a precocidade do diagnóstico, mais cedo o tratamento poderá ser iniciado, permitindo a administração de doses menores de corticosteroides para controlar a doença, reduzindo, desse modo as reações adversas e melhorando o prognóstico (BLACK; MIGNOGNA; SCULLY, 2005 AMORMINO; BARBOSA, 2010). 23 2.3 ANGIOGÊNESE 2.3.1 Considerações Gerais A formação de novos vasos sanguíneos pode ocorrer pelos processos de vasculogênese ou angiogênese. A vasculogênese consiste no surgimento de vasos sanguíneos de novo a partir de precursores celulares, os quais se diferenciam em células endoteliais, formam lúmens e originam uma rede vascular primitiva. Por sua vez, a angiogênese representa a formação de novos vasos sanguíneos a partir da migração e proliferação de células endoteliais da vasculatura pré-existente (CLAPP et al., 2009; NIKITENKO, 2009; UCUZIAN et al., 2010). O surgimento de novos vasos sanguíneos é um processo altamente complexo e coordenado, envolvendo a atuação de fatores pró e antiangiogênicos. Em adultos, sob condições fisiológicas, a angiogênese ocorre apenas durante processos relacionados ao ciclo, gestação e reparo tecidual. Dessa forma, normalmente, fatores antiangiogênicos mantêm o endotélio em um estado quiescente. Porém, em processos patológicos como artrite reumatoide, psoríase, retinopatia diabética, doença hepática policística, degeneração macular relacionada à idade, asma, aterosclerose e câncer, o delicado balanço entre fatores pró e antiagniogênicos é alterado em favor da formação de novos vasos sanguíneos (LALLA et al., 2003; KYZAS et al., 2005; FABRIS et al., 2006; CLAPP et al., 2009; NIKITENKO, 2009; GORDON; MENDELSON; KATO, 2010). Por sua vez, outras patologias, como isquemias cerebral e cardíaca e doenças neurodegenerativas, estão caracterizadas por angiogênese insuficiente e/ou regressão vascular anormal (CLAPP et al., 2009). A angiogênese in vivo pode ocorrer por dois processos. Um dos processos é a intussuscepção, que envolve a formação de pilares teciduais transluminais no interior dos capilares os quais se fusionam dando origem a novos vasos sanguíneos (MAKANYA; HLUSHCHUK; DJONOV, 2009; RIBATTI; NICO; CRIVELLATO, 2009; GORDON; MENDELSON; KATO, 2010). O outro processo envolve o brotamento de células endoteliais a partir de estruturas vasculares pré-existentes para tecidos circunvizinhos (ADAMS; ALITALO, 2007; UCUZIAN et al., 2010). Por muito tempo acreditou-se que a angiogênese a partir de células endoteliais de vasos pré-existentes fosse o único mecanismo pelo qual novos vasos sanguíneos seriam formados em adultos (RISAU, 1997). No entanto, Asahara et al. (1997) identificaram células presentes na circulação periférica as quais eram mobilizadas a partir da medula óssea e endereçadas à sítios angiogênicos, sugerindo um envolvimento potencial destes tipos celulares 24 na angiogênese. A descoberta destes precursores revolucionou o campo da biologia vascular e impulsionou a identificação de outros tipos celulares capazes de dar origem às células endoteliais. Dessa forma, verificou-se que células-tronco mesenquimais localizadas em diversos órgãos e tecidos como no tecido adiposo, parede de vasos sanguíneos, baço, fígado e intestino podem se diferenciar em células endoteliais, constituindo um verdadeiro pool de precursores endoteliais (ZAMPETAKI; KIRTON; XU, 2008; TILKI et al., 2009) 2.3.2 Mensuração da Angiogênese Diversos métodos podem ser empregados para se mensurar a angiogênese nos tecidos. Estudos in vivo relatam a utilização de métodos não invasivos como a ressonância magnética com contraste aumentado, a tomografia computadorizada com emissão de pósitrons e a tomografia computadorizada com emissão de fóton único (PERINI et al., 2008). Em pesquisas ex vivo, como nos estudos realizados com materiais biológicos provenientes de biópsias, a atividade angiogênica de um tecido pode ser mensurada pela determinação de um índice angiogênico obtido por meio da contagem dos microvasos presentes no espécime (ELGAZZAR; MACLUSKEY; OGDEN, 2005; FREITAS et al., 2005). Neste caso, as técnicas existentes se baseiam na avaliação microscópica dos tecidos com o auxílio de anticorpos capazes de reconhecer epítopos expressos por células endoteliais como o FvW, o CD31, o CD34 e o CD105 (VERMEULEN et al., 2002; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007). Em relação às técnicas de mensuração da angiogênese empregadas na avaliação dos tecidos submetidos ao processamento imunoistoquímico, a análise dos trabalhos existentes na literatura revela que as mais frequentemente utilizadas são a da densidade microvascular (MVD), do volume microvascular (MVV) e da contagem microvascular (MVC) (HANNEN; RIEDIGER, 2004; EL-GAZZAR; MACLUSKEY; OGDEN, 2005; FREITAS et al., 2005; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007; DAVEY et al., 2008). A técnica da MVD foi descrita por Weidner et al. (1991) em um estudo com carcinoma de mama. Sob microscopia de luz, com aumentos de 40x e 100x, são identificadas cinco áreas de maior vascularização no espécime. Em sequência, sob aumento de 200x, são quantificados os microvasos presentes em cada uma dessas áreas. O resultado, designado de MVD alta, consiste no maior número de microvasos em uma dessas áreas. Dessa forma não é estabelecido um valor médio, sendo o resultado apresentado sob a forma de microvasos/mm2. Além de estabelecerem a técnica da MVD, Weidner et al., (1991) explicitaram parâmetros para nortear o processo de quantificação dos microvasos. De acordo com os 25 autores, deveriam ser considerados como um único microvaso as células endoteliais isoladas ou grupos de células endoteliais claramente separadas de microvasos adjacentes ou de outros tipos celulares do tecido conjuntivo. Além disso, grupos de células endoteliais isoladas que poderiam constituir secções distintas de um mesmo microvaso deveriam ser consideradas como microvasos distintos. Lúmens vasculares, embora geralmente identificáveis, não seriam necessários para definir uma estrutura como um microvaso. Posteriormente, com base na metodologia descrita por Weidner et al., (1991), foi proposta uma avaliação da MVD alta, designada de MVD média (SCHOR et al., 1998a; SCHOR et al., 1998b). Nesta técnica, sob aumento de 200x, são quantificados os microvasos em 10 – 15 campos microscópicos aleatórios. Com os valores obtidos em cada um destes campos é estabelecido o número médio de microvasos do espécime. Na análise MVD média, os resultados são apresentados sob forma de média de microvasos ± desvio padrão. O MVV consiste em uma técnica estereológica para a determinação do volume dos microvasos. Neste processo, sob microscopia de luz (aumento de 200x), com o auxílio de uma ocular contendo um retículo com 100 pontos marcados, são avaliados 15 campos microscópicos aleatórios, perfazendo um total de 1.500 pontos. Em cada um destes campos são quantificados os vasos que coincidem com os pontos do retículo. Ao final, o resultado é expresso em porcentagem de volume (PAZOUKI et al., 1997; SCHOR et al., 1998a). A técnica da MVC foi descrita por Maeda et al., (1995) em um estudo com carcinomas gástricos. Sob microscopia de luz, com aumento de 40x, são identificadas cinco áreas de maior vascularização no espécime. Em sequência, sob aumento de 200x, são quantificados os microvasos presentes em cada uma dessas áreas. Nesta análise, o resultado obtido é apresentado como um número médio de microvasos em cada secção histológica. Além de constituir uma técnica de fácil execução (FREITAS et al., 2005), a MVC se destaca por apresentar relevância prognóstica em diversos tumores (NANASHIMA et al., 2008; NANASHIMA et al., 2009). A MVD em tumores tem sido avaliada pela imunomarcação dos tecidos por anticorpos pan-endoteliais contra antígenos como o CD34, CD31 e fator de Willebrand. Entretanto, sabendo-se que as células endoteliais são altamente heterogêneas, surge um questionamento sobre se um marcador pan-endotelial é um reagente ideal para avaliar a MVD de um tumor. Tomando isso como base, muitos autores relatam que os anticorpos anti-CD105, ao contrário dos marcadores pan-endoteliais, ligam-se preferencialmente às células endoteliais ativadas in vitro e em tecidos participando da angiogênese (WANG et al., 1993; WESTPHAL et al., 1993; WANG et al., 1995; SEON et al., 1997). Além disso, após a imunomarcação em vários 26 tipos histológicos de tumores humanos, o CD105 foi que esteve mais fortemente expresso nas células endoteliais dos vasos sanguíneos tumorais, todavia foi indetectável ou esteve fracamente presente em vasos sanguíneos de tecidos normais (WANG et al., 1993; WANG et al., 1995; DERBYSHIRE; THORPE, 1997). Por outro lado, evidências sugerem que a expressão do CD105 pode refletir a atividade metabólica dos tecidos, não estando necessariamente relacionado à formação de novos vasos sanguíneos (DAVEY et al., 2008). O grau de vascularização (medido quantitativamente pela MDV) tem potencial para ser usado como fator de prognóstico (FIDLER; ELLIS, 1994; FOX; GATTER; HARRIS, 1996). A extensa neovascularização em carcinomas de mama invasivos é um fator preditor de metástase independente tanto para linfonodos axilares quanto para sítios distantes ou ambos (WEIDNER, 1993; GASPARINI; POZZA; HARRIS, 1996; FOX; GATTER; HARRIS, 1996). Subsequentemente, muitos pesquisadores têm demonstrado que a alta microdensidade vascular (MDV) é um fator de prognóstico independente em muitos outros tipos histológicos de tumores humanos, enquanto outros autores têm falhado em encontrar tal relação (KUMAR et al., 1999). 2.3.3 O Processo Angiogênico nas Lesões Crônicas Inflamatórias (Líquen Plano Oral e Pênfigo Vulgar) O processo angiogênico é considerado fundamental em muitos processos fisiológicos e patológicos e, em ambos os tipos o início da resposta angiogênica ocorre com uma ativação das células endoteliais devido à liberação de citocinas como resposta à hipóxia ou à isquemia (SCARDINA et al., 2009). A angiogênese está diretamente relacionada a uma alteração na microcirculação local, que consiste basicamente em um aumento no número de vasos em uma determinada área e uma alteração morfológica dos mesmos, culminando na expressão in vivo da neoformação de vasos sanguíneos (SCARDINA et al., 2007). Além de a angiogênese ter sido atualmente relacionada com a patogenia e atividade de uma série de condições crônicas inflamatórias, incluindo artrite reumatoide, psoríase e osteoartrite; outros dados sugerem que a angiogênese pode desempenhar um papel importante na persistência e cronicidade de algumas lesões do líquen plano oral, podendo, desse modo, ser utilizado como um marcador de atividade da doença (TAO et al., 2007). Uma relação de feedback positivo, em que um estado inflamatório promove a angiogênese e esta facilita a inflamação crônica foi observada em doenças crônicas inflamatórias, bem como em LPO’s (CREAMER et al., 2002). Por esse motivo é necessário 27 elucidar o papel da angiogênese na patogênese da LPO a fim de se melhor compreender o seu mecanismo para que sejam desenvolvidas novas estratégias de tratamento (TAO et al., 2007). O LPO caracteriza-se por uma ciclicidade, com fases de remissão e recrudescência, desse modo, modificações na microcirculação local podem ser associadas a uma maior ou menor intensidade do fenômeno flogógero, e, por conseguinte, a uma maior ou menor atividade da doença (SCARDINA et al., 2007). Dados da literatura indicam que na presença da LPO, os vasos sanguíneos encontram-se dilatados, portanto eles ocupam um espaço relativamente maior, todavia isso não corresponde a um aumento do número dos mesmos (SCARDINA et al., 2007). Entretanto, SCARDINA et al., 2009, afirmam que, no momento, na literatura ainda não há estudo algum satisfatório que compare o fenômeno da angiogênese nas lesões de líquen plano oral. Tal como uma doença autoimune de origem inflamatória e progressão crônica, o líquen plano oral satisfaz todos os pré-requisitos de hipóxia que são essenciais na angiogênese. Macrófagos e outras células do sistema imune produzem o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que estimula a degradação, proliferação e migração das células endoteliais e regula a permeabilidade vascular, importante na iniciação da angiogênese (MITTAL; SHANKARI; PALASKAR, 2012). O VEGF é considerado um dos mediadores mais potentes da angiogênese, uma vez que se trata do fator de maior estimulação específica da célula endotelial. Tem sido demonstrado que as lesões de LPO apresentam um aumento significativo de VEGF quando comparado à mucosa oral normal (TAO et al., 2007). Alguns estudos em pacientes afetados pelo líquen plano oral sugerem que o aumento da densidade de mastócitos na lâmina própria próximo à camada basal do epitélio e o aumento de número de fatores proangiogênicos e angiogênicos, tais como histamina, heparina, VEGF e TGF-β produzidos por essas mesmas células podem influenciar o endotélio vascular de um modo crítico, além de possuir um papel importante na formação da lesão (MICHAILIDOU; MARKOPOULOUS; ANTONIADES, 2008; SCARDINA et al., 2009). Ao mesmo tempo, pesquisas revelaram uma série de citocinas proangiogênicas, incluindo fator de necrose tumoral (TNF), interleuninas 1, 6 e 8 presentes em quantidades significantes nos tecidos da lesão, no sangue periférico e em diferentes fluidos orais de pacientes com LPO (RHODUS et al., 2005). Esses resultados, portanto, indicam que existe angiogênese no microambiente de lesões de LPO, embora alguns estudos ainda considerem necessário o fornecimento de mais evidências para que isso seja estabelecido de fato (MIGNOGNA et al., 2004). Os estudos de Mittal, Shakari e Palaskar (2012) indicam que a angiogênese é significativamente elevada em lesões de LPO quando comparados à mucosa oral normal e 28 também em lesões de LPO erosivo quando comparados com lesões de LPO reticular; o que sugere que a angiogênese é um dos principais fatores que contribuem na progressão do LPO. Cunha et al. (2004) e Lee (2011) observaram em seus respectivos casos clínicos relatados uma significativa remissão das lesões de pênfigo vulgar após o uso oral da talidomida; sendo notado também o retorno das mesmas quando o uso desse medicamento era interrompido. Porém, os mecanismos pelos quais a talidomida age no pênfigo ainda não estão esclarecidos. Especula-se que esse medicamento exerce seus benefícios clínicos no PV através dos efeitos citocinas-moduladores e que agentes imunossupressores podem interferir nesses efeitos da talidomida. Tem sido observado em modelos animais que a talidomida apresenta propriedades antiangiogênicas, porém o mecanismo pelo qual isso acontece é desconhecido (D’AMATO et al., 1994). Uma vez que se observou que essa inibição ocorre apenas após a administração oral da talidomida, surgiu a hipótese de que um metabólito ativo é formado in vivo (MATHEWS; MCCOY, 2003). A talidomida suprime, nos macrófagos, a produção de TNF-α, que é fracamente angiogênico in vivo; e age secundariamente induzindo uma inflamação. Hipotetizou-se, então, que a talidomida inibe diretamente um componente essencial da angiogênese, e não opera através do efeito da produção de TNF-α. (D’AMATO et al., 2004). Somando-se a isso, Kruse et al. (1998), relataram que a talidomida inibiu a angiogênese induzida pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),o qual é um potente mediador da angiogênese (TAO et al., 2007). 2.4 BIOMARCADOR ANGIOGÊNICO – CD34 Ao longo dos anos um grande esforço tem sido feito para encontrar marcadores específicos para células endoteliais angiogênicas. Embora um marcador estritamente específico para a vasculatura tumoral provavelmente não exista, uma variedade de candidatos com viável potencial terapêutico estão ainda sob investigação (BREKKEN; LI; KUMAR, 2002). Estes podem ser categorizadas em marcadores de ativação e proliferação de células endoteliais, marcadores de estresse hipóxico, receptores de fatores de crescimento, antígenos celulares endoteliais indefinidos e proteínas que são expressas em membrana basal recémformada ou remodelada. A pesquisa por esses marcadores é importante, uma vez que estes podem ser usados nos exames de imagem do tumor, no monitoramento e eficácia da terapia angiogênica e na predição da progressão tumoral (BREKKEN; LI; KUMAR, 2002; SANCHEZ-ELSNER et al., 2002). 29 O CD34 é um marcador de células endotelias, caracterizado como uma glicoproteína transmembrana de 105-120 kDa que possui alta especificidade, principalmente para células endoteliais de vasos sanguíneos e precursores de células hematopoiéticas (YOSHIDA et al., 1999; ABBAS; LICHTMAN, 2005). Este imunomarcador atua na adesão célula a célula ao se ligar com domínios existentes nas selectinas, chamadas de CD62L. A adesão e a transmigração leucocitária são reguladas principalmente pela ligação de moléculas de adesão pertencentes aos leucócitos e na superfície endotelial e pelos mediadores químicos (quimiotaxinas e citocinas) que afetam esses processos modulando a expressão na superfície ou a avidez dessas moléculas de adesão. Os receptores de adesão envolvidos pertencem a quatro famílias moleculares como as selectinas, as quais possuem um domínio N-terminal extracelular, compreendendo a Eselectina (CD62E) ou molécula endotelial de adesão de leucócitos tipo 1 (ELAM-1), confinada ao endotélio; a P-selectina (CD62P), presente no endotélio e plaquetas; e por último, a L-selectina (CD62L) ou molécula de adesão de leucócitos tipo 1 (LAM-1), a qual é expressa na maioria dos tipos de leucócitos (ABBAS; LICHTMAN, 2005; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005). A L-selectina serve de receptor de endereçamento para os linfócitos entrarem nos linfonodos ligando-se às vênulas especializadas de endotélio alto (HEV’s). Ela liga, ainda, os neutrófilos às células endoteliais ativadas pelas citocinas nos locais de inflamação. Pelo menos três ligantes das células endoteliais podem ligar-se à L-selectina: a molécula de adesão do tipo 1, que contém glicano (GlyCAM-1), uma proteoglicana encontrada nas HEV’s dos linfonodos; a molécula de adesão celular adressina da mucosa do tipo 1 (MadCAM-1), expressa pelas células endoteliais no tecido linfoide associado às mucosas; e a glicoproteína CD34 (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005). O CD34 é um dos principais ligantes das células endoteliais que podem unir-se às Lselectinas, e segundo a literatura é fortemente expresso em diversas neoplasias como leucemias, além de lesões vasculares, sugerindo, dessa forma, que sua imunomarcação seja utilizada como critério de diagnóstico e prognóstico nessas lesões (HEIMBURG et al., 1999; YOSHIDA et al., 1999; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005). 30 PROPOSIÇÃO 31 3 PROPOSIÇÃO Este trabalho teve como objetivo avaliar o processo angiogênico por meio da contagem microvascular (MVC), com o auxílio do marcador imunoistoquímico CD34 em uma série de casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar na tentativa de melhor compreender o papel da angiogênese tanto na patogênese quanto na progressão dessas doenças autoimunes crônicas inflamatórias. 32 MATERIAIS E MÉTODOS 33 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS A presente pesquisa foi registrada na Plataforma Brasil e submetida a análise do seu conteúdo pelo Comité de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN). 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO O presente estudo caracterizou-se como uma pesquisa descritiva, comparativa e retrospectiva constituída pela observação, análise e registro dos índices angiogênicos obtidos a partir da apreciação quantitativa dos vasos sanguíneos imunomarcados pelo anticorpo antiCD34 em uma série de casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar previamente selecionados. 4.3 POPULAÇÃO Todos os casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar diagnosticados e arquivados no Setor de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). 4.4 AMOSTRA A amostra foi intencional, já que foram selecionados todos os casos diagnosticados como LPO e PV, arquivados no serviço anteriormente referenciado, de acordo com a quantidade e a qualidade do material disponível nos blocos de parafinas existentes, que deveriam ser suficientes para o estudo morfológico e imunoistoquímico. Neste estudo foram incluídos 73 espécimes teciduais orais, sendo selecionados 40 casos de LPO, dos quais 26 foram classificados como reticulares e 14 casos eram lesões erosivas, além de 18 casos de PV e 15 espécimes de mucosa oral normal. 34 4.4.1 Critérios para seleção da amostra 4.4.1.1Critérios de inclusão Foram incluídos na amostra: Lâminas coradas em hematoxilina-eosina (HE), que tiveram diagnóstico histopatológico de líquen plano oral reticular e erosivo e, pênfigo vulgar; Casos cujos blocos em parafina apresentaram quantidade suficiente de material para realização do estudo imunoistoquímico; Casos cujas fichas apresentaram todos os dados necessários para a realização do estudo clínico. 4.4.1.2 Critérios de exclusão Foram excluídos da amostra aqueles casos que não satisfizeram os critérios de inclusão acima. 4.4.2 Caracterização da amostra Neste estudo foram incluídos 73 espécimes teciduais orais emblocados em parafina que foram divididos em três grupos: grupo I, grupo II e grupo III. O grupo I, o grupo controle, consistiu em 15 casos de mucosa oral normal (retirado de cirurgia peridontal); o grupo II foi constituído por 40 casos diagnosticados como líquen plano oral. Esse grupo foi ainda subdividido em dois grupos: grupo IIA e grupo IIB. O grupo IIA conteve 26 casos diagnosticados como líquen plano oral reticular e o grupo IIB, 14 casos diagnosticados como líquen plano oral erosivo. Já o grupo III foi constituído por 18 casos diagnosticados como pênfigo vulgar. Estes casos foram obtidos de blocos de casos previamente diagnosticados dos arquivos do Setor de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). 35 4.5 ESTUDO CLÍNICO E MORFOLÓGICO A partir de fichas clínicas de requisições de biópsias arquivadas no Laboratório de Anatomia Patológica do Departamento de Odontologia da UFRN, foram obtidas as características clínicas das lesões, para que assim as lesões de LPO fossem classificadas como LPO Reticular ou LPO Erosivo. As lesões de LPO foram consideradas reticulares quando foram descritas nas fichas clínicas dos pacientes como: assintomáticas, com linhas brancas entrelaçadas ou como pápulas e as erosivas como lesões eritematosas, ulceradas e com sintomatologia associada (apresentando dor e/ou ardor), conforme Neville et al. (2009) e Carrozzo e Thorpe (2009). Os espécimes foram analisados sob microscopia de luz, através da análise de cortes histológicos de 5μm de espessura, corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina. Em seguida foi efetuada uma análise descritiva das características anátomo-patológicas inerentes a cada lesão, onde foram selecionados apenas os casos que apresentaram aspectos morfológicos padrões de líquen plano oral e pênfigo vulgar. 4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO 4.6.1 Método Imunoistoquímico Os espécimes fixados em formol a 10% e emblocados em parafina foram submetidos a cortes histológicos de 3µm de espessura, que foram estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas e desengorduradas, preparadas com adesivo à base de Organosilano (3aminopropyltrietoxy-silano, Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). Na técnica imunoistoquímica foi empregado o complexo Avidina Biotina (Kit LSAB + HRP, DAKO CYTOMATION, Carpinteria, CA, USA), utilizando o imunomarcador anti- CD34, seguindo os seguintes passos laboratoriais descritos abaixo: o Xilol I (30 minutos), estufa 59°C – Desparafinização; o Xilol II (20 minutos), temperatura ambiente (TA) – Desparafinização; o Etanol absoluto, I, II e III (05 minutos cada) – TA; o Etanol 95° (5 minutos) – TA; o Etanol 80° (5 minutos) – TA; 36 o Remoção de pigmento formólico com hidróxido de amônia a 10% em etanol a 95% (10 minutos) – TA; o Lavagem das lâminas em água corrente (10 minutos); o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada); o Recuperação antigênica (Quadro 1); o Lavagem em água corrente (10 minutos); o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada); o Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 10 volumes (duas trocas 15 minutos cada); o Lavagem em água corrente (10 minutos); o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada); o Passagem em TRIS HCl (Tris (hydroxymethyl) aminomethane Hydrochlride) pH 7,4 (duas trocas de 5 minutos cada); o Incubação sem solução de BSA (albumina sérica bovina) a 1% e soro fetal bovino (SFB) a 5% em TRIS HCl pH 7,4 por 60 minutos, para bloquear a reação do anticorpo primário com proteínas inespecíficas teciduais; o Retirar o excesso da solução dos cortes; o Incubação dos anticorpos conforme a determinação do fabricante (Quadro 1); o Passagem solução de Tween 20 a 1% em TRIS HCl pH 7,4 (duas trocas de 5 minutos cada); o Incubação por 30 min nos reagentes do Kit LSAB (Dako Cytomation + and LSAB® + Systems) para o anticorpo anti-CD34; o Passagem em TRIS HCl pH 7,4 (duas trocas de 5 minutos cada); o Incubação por 3 minutos em solução de di-aminobenzida (DAB) na concentração de 30 mg em 10 ml de TRIS HCl pH 7,4 ativada por peróxido de hidrogênio 10 volumes para revelação; o Lavagem em água corrente (10 minutos); o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada); o Contracoloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA; o Lavagem em água corrente (10 minutos); o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada); o Desidratação em etanol em cadeia crescente em 80° ao etanol absoluto (3 minutos cada); o Diafanização em xilol (3 passagens de 10 minutos); 37 o Montagem da lâmina em resina Permount® (Ficher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) para observação em microscópio de luz. Quadro 1 - Especificação, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação do anticorpo primário utilizado. Anticorpo Especificidade Diluição Clone Recuperação Incubação Antigênica Células CD34 endoteliais, (QBEnd 101) precursores das Dako células Corporation hematopoiéticas. 1:100 Citrato Ph 6.0 Overnight Pascal, 30 min 4°C PPGO, 2014 4.6.2 Análise do Perfil Imunoistoquímico As lâminas coradas pela técnica da imunoistoquímica com anticorpo anti-CD34 foram analisadas sob microscopia de luz (OLYMPUS BX41) quantitativamente através do índice angiogênico, por um examinador previamente treinado. O índice angiogênico foi delimitado empregando-se a técnica da contagem microvascular (MVC), de acordo com a metodologia de Maeda et al. (1995) modificada, em que foram selecionadas, de forma criteriosa e subjetiva, cinco áreas bem significativas da lesão e com maior número de vasos (densidade microvascular) sob aumento de 40x (x4 objetiva, x10 ocular). Em seguida, através do aumento de 100x (x10 objetiva, x10 ocular) foram quantificados manualmente, com o auxílio do programa ImageJ (Image Processing and Analysis in Java), objetivando evitar a recontagem de estruturas. Desse modo, o resultado foi expresso pelo número médio de vasos nestas áreas em cada amostra das lesões, para posterior comparação. Durante o procedimento, qualquer célula ou grupo celular endotelial imunomaracado positivamente separados dos microvasos adjacentes e de outros constituintes do tecido conjuntivo, assim como os vasos contendo lúmen, foram considerados como vaso unitário. Foram contados como vasos, ainda, estruturas ramificadas e com descontinuidade na sua conformação. 38 4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA Com o intuito de testar as hipóteses propostas no presente estudo, os resultados obtidos foram submetidos a testes apropriados. Os dados obtidos foram digitados em planilha eletrônica no programa Excel (Microsoft Office 2013® for Windows) e posteriormente exportados para o programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS versão 20.0; Inc., Chicago, IL, USA), no qual foi inicialmente realizada a análise descritiva e em seguida os testes estatísticos descritos abaixo. Para comparar o índice angiogênico determinado pela contagem microvascular (MVC) entre os diferentes tipos de lesões, categorizadas nos grupos líquen plano oral, pênfigo vulgar e mucosa oral normal, fez-se uso do teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Enquanto para comparação da MVC entre a forma erosiva e reticular dos casos de líquen plano oral, realizou-se o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. O nível de significância adotado para todos os testes realizados foi de 5%. 39 RESULTADOS 40 5 RESULTADOS 5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS No presente estudo, foram utilizados 40 casos de líquen plano oral, destes, 14 eram do tipo erosivo e 26 do tipo reticular, 18 casos de pênfigo vulgar e 15 casos de mucosa oral normal (Gráfico 1). Gráfico 1 - Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão analisada. Natal, RN-2014. 20,5% 54,8% 24,7% Líquen Plano Oral Pênfigo Vulgar Mucosa Oral Normal PPGO, 2014 Ao exame histopatológico, os casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar, sob microscopia de luz, em cortes de 5µm de espessura, corados pela técnica da Hematoxilina e Eosina, revelaram para os diagnósticos histológicos as características inerentes às referidas lesões. Nas lesões de líquen plano analisadas constatou-se a presença de perda de nitidez da camada basal acompanhada pelo intenso infiltrado inflamatório predominantemente linfocítico, disposto em faixa, imediatamente subjacente ao epitélio, além da presença de corpos colóides eosinofílicos na interface epitélio/tecido conjuntivo (Corpos de Civatte), cristas epiteliais ausentes, hiperplásicas ou em forma de “dentes de serra”, variações da espessura da camada espinhosa e graus variáveis de orto ou paraceratose. 41 No que concerne aos espécimes de pênfigo vulgar, pôde-se observar a existência de separação intraepitelial, acima da camada de células basais do epitélio evidenciando-se a presença de acantólise (separação das células da camada espinhosa do epitélio) e a presença de células soltas, de forma arredondada, na camada espinhosa, chamadas de células de Tzanck, além de um infiltrado leve a moderado de células inflamatórias crônicas no tecido conjuntivo. 5.2 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS A reatividade celular observada nos casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar foi restrita ao citoplasma das células endoteliais de revestimento e aos grupamentos de células endoteliais proliferantes sem lúmen, sendo representada pela coloração acastanhada independente da intensidade da imunomarcação. Foi ainda observado que o anticorpo anti-CD34 reagiu imunopositivamente em 100% da amostra analisada. 5.2.1 Análise Quantitativa da Marcação Imunoistoquímica pelo anticorpo anti-CD34. O número médio dos vasos sanguíneos determinados pela contagem microvascular (MVC) nos espécimes de líquen plano oral, pênfigo vulgar e mucosa oral normal imunomarcados para CD34 encontram-se na Tabela 1. Tabela 1 - Índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular do CD34 de acordo com o tipo de lesão avaliada. Natal, RN-2014. LESÃO Índices Angiogênicos Erosivo 72,80 54,40 106,00 96,80 83,50 72,60 57,40 75,80 55,00 110,80 138,75 60,80 45,00 91,40 Reticular 94,00 75,60 128,20 75,20 66,00 73,40 87,40 72,40 66,80 41,00 60,80 157,20 65,00 97,00 LPO 65,60 94,20 40,00 73,80 46,20 58,40 58,00 78,60 88,00 82,20 62,00 57,60 63,00 118,60 71,00 96,60 47,20 39,60 66,60 99,60 65,00 34,50 109,80 61,20 56,20 63,00 PV 64,80 41,00 118,00 83,20 68,60 43,80 80,60 88,40 128,00 51,60 37,00 37,60 101,40 50,60 55,20 76,80 83,60 31,50 MON 44,75 Legenda: LPO, líquen plano oral; PV, pênfigo vulgar; MON, mucosa oral normal. Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. 42 5.2.2 Análise Estatística da Contagem de Microvasos Marcados pelo Anticorpo AntiCD34 Ao comparar a MVC entre diferentes lesões, observou-se que a mediana dos casos de líquen plano oral foi maior que no grupo de pênfigo vulgar, que por sua vez revelou mediana maior que nos casos de mucosa oral normal. O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis demonstrou que essas diferenças não foram estatisticamente significativas (p=0,280) (Tabela 2) (Gráfico 2). Tabela 2 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para a contagem microvascular entre as lesões de LPO, PV e os espécimes de MON. Natal, RN-2014. Lesão LPO PV MON n 40 18 15 Mediana 73,10 64,90 55,20 Q25-Q75 59,00-90,55 53,95-97,35 43,80-83,60 Média dos postos 40,15 35,78 30,07 p(1) 0,280 Legenda: LPO, líquen plano oral; PV, pênfigo vulgar; MON, mucosa oral normal. (1): Teste Kruskal-Wallis. PPGO, 2014 Gráfico 2 - Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com o tipo de lesão avaliada. Natal, RN-2014. PPGO, 2014 No tocante a contagem microvascular de CD34 em relação à forma clínica dos líquens planos orais, verificou-se uma mediana ligeiramente maior para a forma clínica erosiva. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney demonstrou que esta diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,720) (Tabela 3) (Gráfico 3). 43 Tabela 3 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística para a contagem microvascular entre os tipos de líquen plano oral. Natal, RN2014. LPO n Mediana Q25-Q75 Erosivo Reticular 14 26 74,30 72,90 56,80-99,10 60,20-87,55 Média dos postos 21,46 19,98 Soma dos postos 300,50 519,50 U p(1) 168,50 0,720 Legenda: LPO, líquen plano oral. (1): Teste Mann-Whitney. Fonte: ????? Gráfico 3 - Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com a forma clínica de líquen plano oral. Natal, RN-2014. PPGO, 2014 44 Figura 1 - Fotomicrografia do espécime de LPO exibindo hiperparaceratinização, epitélio de revestimento atrófico, áreas de perda de nitidez da camada basal, projeções epiteliais e infiltrado inflamatório linfocítico subepitelial (H/E, 100X). PPGO, 2014 Figura 2 - Fotomicrografia do espécime de PV exibindo separação intraepitelial, acima da camada de células basais do epitélio, acantólise, células de Tzanck e um infiltrado leve de células inflamatórias crônicas no tecido conjuntivo (H/E, 100X). PPGO, 2014 45 Figura 3 - LPO Reticular. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X).Fon PPGO, 2014 Figura 4 - LPO Reticular. Marcação imunoistoquímica para o anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais em meio ao infiltrado inflamatório linfocítico (LSAB, 100X). PPGO, 2104 46 Figura 5 - LPO Erosivo. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação do anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados (LSAB, 100X). PPGO, 2014 Figura 6 - LPO Erosivo. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em múltiplos vasos sanguíneos (LSAB, 100X). PPGO, 2014 47 Figura 7 - Pênfigo Vulgar. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação do anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados e em células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X). PPGO, 2014 Figura 8 - Pênfigo Vulgar. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais na lâmina própria principalmente em região justaepitelial (LSAB, 100X). PPGO, 2014 48 DISCUSSÃO 49 6 DISCUSSÃO O líquen plano oral é uma doença inflamatória crônica e imunomediada, na qual são reconhecidas seis formas clínicas: reticular, papular, placa, atrófica, bolhosa e erosiva (EDWARDS; KELSCH, 2002; AL-HASHIMI et al., 2007; CARBONE et al., 2009; NICO FERNANDES; LOURENÇO, 2011). No entanto, a maioria dos autores consideram apenas duas formas principais de apresentação clínica da doença: a reticular e a atrófica/erosiva, sendo esta divisão utilizada em muitos estudos (KARATSAIDIS et al., 2003; SEOANE et al., 2004; BRANT; VASCONCELOS; RODRIGUES, 2008; CHARAZINSKA-CAREWICZ et al., 2008; LÓPEZ-JORNET; CAMACHO-ALONSO; MOLINA-MIÑANO, 2009). Esta classificação foi utilizada no presente estudo devido, principalmente, ao comportamento biológico diferente como se apresentam, que ressalta a importância de estudálas separadamente. Alguns autores sugerem, ainda, que as formas clínicas reticular e erosiva do LPO devam ser consideradas entidades distintas (KARATSAIDIS et al., 2003; XIA et al., 2005; LÓPEZ-JORNET; CAMACHO-ALONSO; MOLINA-MIÑANO, 2009; FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2011). Em relação aos achados morfológicos verificados nos casos de LPO analisados neste estudo, todos estão em concordância com as citações de Sousa et al. (2009), Anuradha et al. (2011), Fernández-González et al. (2011) e Navas-Alfaro et al. (2011), onde verificaram a presença de hiperceratose, ausência de displasia, presença de projeções em “dentes de serra”, sinais de degeneração da camada basal, presença de ceratinócitos apoptóticos, além de ocasional acantose e hiperplasia. Podendo-se observar, ainda em região justaepitelial um denso infiltrado inflamatório linfocítico. O pênfigo vulgar é o mais comum dos tipos de pênfigo, qualificada como uma doença crônica, autoimune, mucocutânea, que inicialmente se manifesta na forma de lesões intraorais, espalhando-se consequentemente para outras membranas mucosas e pele. É caracterizada clinicamente pela formação de bolhas intraepiteliais resultante do colapso da adesão celular entre as células epiteliais ( DAGISTAN et al., 2008). O elemento semiotécnico para um diagnóstico mais simples do pênfigo vulgar é a verificação do sinal de Nikolsky. Este é positivo quando ocorre a formação de uma bolha ao se friccionar o epitélio nas proximidades das lesões já existentes, devido à facilidade de separação das células epiteliais. Embora seja de grande valia, toda a literatura concorda que este sinal não é patognomônico do pênfigo vulgar, uma vez podendo ser observado na grande 50 maioria das lesões vesículo-bolhosas ( HEAPHY; ALBRECHT; WERTH, 2005; NEVILLE et al., 2009; JOLLY et al., 2010). No que concerne aos achados histológicos do pênfigo vulgar pode ser observada separação intraepitelial (vesícula ou bolha intraepitelial) acima da camada basal das células do epitélio, sendo que esta permanece aderida à lâmina própria subjacente. No espaço vesicular são encontrados, com frequência, grupos de células que apresentam alterações degenerativas tais como tumefações dos núcleos, perda dos desmossomos, formato arredondado ou ovóide e hipercromatismo, sendo denominadas de células de Tzanck, as quais são resultantes da acantólise celular em decorrência do edema peri vesicular. Além disso, no tecido conjuntivo podem ser encontrados leucócitos polimorfonucleares e linfócitos em número variados. Essas características observadas nos espécimes de pênfigo vulgar analisadas neste estudo são condizentes com os descritos na literatura (WILLIAMS, 1989; WEINBERG; INSLER; CAMPEN, 1997; NEVILLE et al., 2009). A angiogênese representa um ciclo de um processo vital que leva a formação de vasos sanguíneos a partir de uma estrutura vascular pré-existente. Exceções fisiológicas em que este processo ocorre sob forte regulação são encontradas no sistema reprodutivo feminino e durante o processo de cicatrização de feridas. Por sua vez, a angiogênese não regulada adequadamente pode resultar em diferentes patologias, tais como a artrite reumatoide, a retinopatia diabética, a psoríase e o hemangioma juvenis. Além disso, sabe-se que o crescimento tumoral também é dependente da angiogênese, uma vez que este necessita de uma extensa rede de capilares sanguíneos para que sejam fornecidos ao tumor nutrientes e oxigênio necessário para a sua sobrevivência e desenvolvimento. Desse modo, todo sistema orgânico pode envolver doenças em que a angiogênese é um importante componente. (HYDER; STANCEL, 1999; LIEKENS; DE CLERCQ; NEYTE, 2001). Muitos estudos científicos (JAKOBSON; CLAESSON-WELSH, 2008) têm mostrado a importância da angiogênese nos mecanismos crônicos inflamatórios, bem como tem-se verificado a presença de neoangiogênese em patologias que apresentam essas características, como aquelas doenças já citadas anteriormente. Sabe-se que a angiogênese tem um importante papel nas doenças crônicas inflamatórias, não apenas causando a geminação de novos vasos sanguíneos, que permite uma melhor oxigenação e uma maior contribuição dos metabólitos para a proliferação tecidual, mas também um notável aumento do complexo sistema de feed-back e turnover das células envolvidas no processo inflamatório (MONACO et al., 2004). Além disso, foi estudado por Monaco et al. (2004), durante a iniciação e progressão da aterosclerose e artrite reumatoide, 51 que o CD40L nos sítios inflamatórios estimula os fibroblastos e monócitos/macrófagos a produzirem VEGF, levando a angiogênese, a qual promove a manutenção do processo crônico inflamatório. Como verificado na revisão de literatura deste estudo, a angiogênese pode ser avaliada quantitativamente através de várias metodologias por meio da avaliação microscópica da vascularização tumoral, lançando-se mão de anticorpos específicos para as células endoteliais, como VEGF, CD31, CD34, CD44, CD105 e o fator von Willebrand (DUFF et al., 2003; ABBAS; LICHTMAN, 2005; MINHAJAT et al., 2006; LIORCA et al., 2007; NETTO et al., 2008). Contudo, os autores são conflitantes na escolha do marcador imunoistoquímico que oferece melhores resultados na avaliação da angiogênese. De um lado, alguns pesquisadores como Martone et al. (2005), Chien et al. (2006), Chuang et al. (2006), Kyzas, Agnantis e Stefanou (2006), Taskiran et al. (2006), Nikiteas et al. (2007), Soares et al. (2007) e Netto et al. (2008) o CD105 é um excelente anticorpo para avaliação da angiogênese. Por outro lado, Traweek et al. (1991), Costa e Guinee (2000), Lopez-Graniel et al. (2001), Di Carlo et al. (2002), Teo et al. (2003), Guttman et al. (2004) e Ascani et al. (2005), recomendam para análise da vascularização o CD34. Desse modo, no estudo realizado, optou-se em avaliar de forma comparativa a expressão imunoistoquímica do marcador CD34 em lesões de LPO reticular, LPO erosiva e pênfigo vulgar, lesões estas produzidas por doenças automimunes, crônicas inflamatórias, de mesmo nome, que mostram sinais e sintomas na mucosa oral nos portadores dessas doenças. De acordo com Vermeulen et al. (2002), Freitas et al. (2005) e Souza, Freitas e Miranda (2007) a quantificação de vasos sanguíneos em secções histológicas pode ser útil como indicador de prognóstico em lesões de cabeça e pescoço. No entanto, a mesma pode ser influenciada por vários fatores, incluindo o tipo de fixador utilizado, o pré-tratamento dos espécimes antes da marcação, o método de quantificação empregado e o anticorpo selecionado. Schor et al. (1998a) afirmaram que o pré-tratamento das secções histológicas é a variável que mais exerce influência na estimativa da vascularização em espécimes teciduais. Estes pesquisadores demonstraram, através de um estudo comparativo entre diferentes metodologias destinadas à quantificação da angiogênese, que a variação no tipo de tratamento dos espécimes teciduais (digestão enzimática e aquecimento) produzia diferentes valores de índices angiogênicos colocando em questão o resultado da pesquisa. Perante estas observações, no presente estudo, buscou-se seguir a reprodutibilidade das técnicas conforme as determinações do fabricante do anticorpo utilizado (BOURNE, 1983), ressaltando-se, dessa 52 forma, a necessidade de se padronizar um protocolo para a determinação da angiogênese, pois variações na metodologia poderiam ocasionar falhas na técnica de coloração e na obtenção do índice angiogênico (DUFF et al., 2003; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007). Devido às diferentes recomendações de técnicas destinadas à quantificação da angiogênese (WEIDNER et al, 1991; PAZOUKI et al., 1997; MAEDA et al., 1995) inicialmente foi realizada uma pequena avaliação da MVD, MVC e MVV e verificou-se que a MVC foi o método de obtenção do índice angiogênico mais simples, efetivo e de fácil aplicabilidade encontrado para a análise da angiogênese de tumores de cabeça e pescoço (MAEDA et al., 1995; FRIDMAN et al., 2000; FREITAS et al., 2005; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007). Assim sendo, em relação ao método de contagem de microvasos, Jacquemier et al. (1998) tentando estabelecer parâmetros comparativos de agressividade e sensibilidade terapêutica em pacientes portadores de câncer de mama entre a determinação da MVC, utilizando o anticorpo anti-CD31, e Erenoglu et al. (2000 buscando uma correlação e dados clínicos patológicos do carcinoma gástrico, por intermédio da marcação do anticorpo antifator VIII; certificaram que a MVC tem grande valor de prognóstico, especialmente na indicação de pacientes com alto índice de recidiva e com necessidade de terapia pósoperatória complementar. No entanto, Fridman et al. (1998) sugerem que essa técnica deve ser bem mais estudada e otimizada antes de ser utilizada na rotina para a determinação prognóstica nos mais variados tipos de cânceres humanos. Ressaltou-se, neste estudo, que a expressão imunoistoquímica do anticorpo anti-CD34 nas lesões de LPO e PV foi restrita ao citoplasma das células endoteliais de revestimento e aos grupamentos de células endoteliais as quais não formavam lúmen sendo, dessa forma, equivalente com os trabalhos que afirmam que o anticorpo CD34 possui afinidade por epítopos específicos de células endoteliais (MARTONE et al., 2005; SOARES et al., 2007; YANG et al., 2006; NETTO et al., 2008). De acordo com Kyzas, Agnantis e Stefanou (2006), poucos estudos existem sobre a marcação do anticorpo CD-34 em vasos linfáticos, no entanto, nesta pesquisa, é possível que dentre os vasos imunomarcados existam alguns do tipo linfático, porém de pouca significância na avaliação da angiogênese. Durante a análise dos resultados verificou-se, de forma cautelosa, a morfologia dos componentes celulares imunomarcados, evitando, desse modo, erro na contagem microvascular, podendo-se afirmar que a maior parte da marcação ocorreu no endotélio vascular dos espécimes estudados. 53 Verificou-se ainda que o CD34 reagiu preferencialmente com 100% dos casos de LPO - reticular e erosivo e de PV, demonstrando que este marcador apresenta alta sensibilidade de imunomarcação, fato verificado em diversas condições tumorais, conforme observado por Traweek et al. (1991) em angiossarcomas, sarcoma de Kaposi e hemangioendotelioma epitelioóide; Guttman et al. (2004) em carcinoma epidermóide de língua e Yang et al. (2006) em carcinoma hepatocelular. Somando-se a isso, de acordo com Heimburg et al. (1999), Yoshida et al. (1999) e Di Carlo et al. (2002), o CD34 é o anticorpo de eleição na avaliação da angiogênese. Tais afirmações não são similares aos achados de Saad et al. (2004), em um estudo realizado em câncer colorretal, que recomendam o uso do anticorpo CD105 como marcador endotelial ideal para a mensuração da angiogênese, bem como valor preditor de metástase em comparação com os marcadores pan-endoteliais. Entretanto, nesta pesquisa, apesar de não ter sido lançado mão de outro marcador para possível comparação, os espécimes submetidos à marcação com CD34, exibiram um padrão de marcação uniforme e de fácil interpretação. No estudo de Tao et al. (2007), no qual o anticorpo anti-CD34 foi utilizado para auxilar na determinação da microdensidade vascular em casos de LPO, observou-se uma alta marcação citoplasmática no endotélio vascular de todos os espécimes por esse marcador. Além disso, foi ressaltado que a MVD no grupo dos pacientes com LPO foi significativamente elevada em relação aos grupos controles. Ao que diz respeito às lesões de LPO, os resultados deste estudo não foram concordantes com as poucas pesquisas que avaliam a angiogênese nessas lesões, uma vez que pôde-se observar ausência de diferença estatística significativa na determinação das médias da contagem microvascular (MVC), entre as lesões de LPO reticular e os espécimes de mucosa oral normal e entre as lesões de LPO erosivo e os espécimes de mucosa oral normal. Contudo, quando comparamos a mediana da MVC, nesta pesquisa, entre as lesões de LPO e os espécimes de mucosa oral normal ressalva-se que esta mostrou-se maior nos casos de LPO dos que nos espécimes de mucosa oral normal; e que a mediana nas lesões de LPO erosivo foi ligeiramente maior do que nos casos de LPO reticular. Estes resultados são contrários aos encontrados no estudo de Scardina et al. (2009), o qual observou uma maior expressão de CD34 em amostras de LPO (54,3%), bem como de outros marcadores como o VEGF (64,2%), VCAM-1 (32,5%) e ICAM-1 (29,7%), levando-os a concluir que o número de vasos sanguíneos em biópsias de pacientes com LPO estava significativamente elevado (média ± DP: 21,27 ± 4,85) quando comparado com indivíduos saudáveis (média ± DP: 4,74 ± 0,97). 54 Nossos resultados também foram discordantes dos encontrados na pesquisa de Mittal, Shankari e Palaskar (2012), uma vez que também avaliando o índice angiogênico (MDV) com o auxílio do imunomarcador CD34, os mesmos observaram diferença estatística significativa entre as lesões de LPO (97,24 ± 42,887) e o grupo controle (44,47 ± 9,942). Por sua vez, os resultados do estudo de Khalili, Eshghyar e Asgari (2013) também foram diferentes dos nossos encontrados, o qual mostrou que utilizando a imunomarcação do CD34 e CD105, a MDV em amostras de LPO foi significativamente maior do que nos casos de mucosa oral normal (6,05 ± 0,86). Quanto à expressão do CD34 entre lesões de LPO reticular e erosivo, nossa pesquisa não encontrou diferença estatisticamente significativa entre ambas as lesões na avaliação da MVC. Este resultado discordou dos encontrados por Mittal, Shankari e Palaskar (2012) e Khalili, Eshghyar e Asgari (2013), uma vez que estes pesquisadores certificaram-se que as lesões de LPO erosivo - (129,71 ± 49,253), (31,8 ± 5,39) apresentavam um maior índice angiogênico quando comparadas com as lesões de LPO reticular – (84,61 ± 33,724). Ambos os estudos concluem com seus respectivos resultados que a angiogênese seria um dos principais fatores que contribuem na patogênese e progressão do líquen plano oral. No que concerne às lesões de pênfigo vulgar, os resultados do nosso estudo não mostraram diferença estatística significativa quando comparamos a MVC nas lesões de PV com os espécimes de mucosa oral normal. Entretanto, quando observamos as medianas em ambos os casos, podemos perceber que esta é ligeiramente maior nos casos de PV do que nos espécimes de mucosa oral normal. Do mesmo modo, não observamos, em nossos resultados, diferença estatisticamente significativa entre as lesões de PV e os casos de LPO reticular, nem mesmo entre as lesões de PV e os casos de LPO erosivo. Contudo, podemos observar que a mediana da MVC das lesões de PV é ligeiramente menor do que nos espécimes de LPO, tanto nas lesões reticulares quanto nas erosivas. Como este foi o primeiro estudo que tentou avaliar a angiogênese nessas lesões não podemos comparar nossos resultados para se chegar a uma conclusão sobre essa questão. Contudo, Cunha et al. (2004) e Lee (2011) relataram em seus respectivos casos clínicos uma significativa remissão das lesões de pênfigo vulgar após a administração oral da talidomida; sendo notado também o retorno das mesmas quando o uso desse medicamento era interrompido. Porém, os mecanismos pelos quais a talidomida age no pênfigo ainda não estão esclarecidos. Estes pesquisadores especularam que tal medicamento exerce seus benefícios clínicos no PV através dos efeitos citocinas-moduladores e que agentes imunossupressores podem interferir nesses efeitos da talidomida. 55 Adicionalmente, D’amato et al. (1994) observaram em modelos animais que a talidomida apresenta propriedades antiangiogênicas, porém o mecanismo pelo qual isso acontece é desconhecido. Mathews e McCoy (2003) observaram que essa inibição ocorria apenas após a administração oral da talidomida, sugerindo a hipótese de que um metabólito ativo é formado in vivo. Sabendo que a talidomida suprime nos macrófagos a produção de TNF-α, que é fracamente angiogênico in vivo; e age secundariamente induzindo uma inflamação, D’amato et al. (2004) hipotetizaram, então, que a talidomida inibia diretamente um componente essencial da angiogênese e não agia através do efeito da produção de TNF-α. Somando-se a isso, Kruse et al. (1998), relataram que a talidomida inibe a angiogênese induzida pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),o qual é um potente mediador da angiogênese (TAO et al., 2007). Diante dos estudos supracitados, acreditamos que por o PV ser uma doença crônica autoimune inflamatória, assim como o LPO, e por apresentarem remissão da doença após o uso da talidomida, uma droga com possíveis propriedades antiangiogênicas; estas lesões supostamente poderiam apresentar um índice angiogênico significativamente maior do que os casos de mucosa oral normal. No entanto, diante dos nossos resultados, podemos concluir que apesar de estas lesões terem apresentado leve aumento do número de vasos sanguíneos em relação ao grupo controle a insignificância estatística, de fato, nos impede de afirmar que existe angiogênese nas lesões de pênfigo vulgar pertencentes a amostra desta pesquisa. Isto posto, destacamos que o papel exato da angiogênese nas lesões crônicas inflamatórias, aqui estudadas, e sua relação com a progressão e o desenvolvimento destas ainda necessita ser esclarecido, com o objetivo de que o processo angiogênico possa ser mais um parâmetro seguro a ser utilizado como ferramenta na identificação do potencial biológico e como adjuvante nas técnicas terapêuticas disponíveis. 56 CONCLUSÕES 57 7 CONCLUSÕES Os resultados encontrados no presente estudo permitem concluir que: Foram encontrados maiores índices angiogênicos, medidos por intermédio do imunomarcador CD34 no grupo de LPO (reticular e erosivo) quando comparados aos espécimes de mucosa oral normal. Assim como os índices angiogênicos nas lesões de LPO erosivo apresentaram-se ligeiramente superiores aos encontrados nas lesões reticulares. Os achados encontrados nesta pesquisa, associados aos dados relatados na literatura, sugerem uma possível participação do processo angiogênico na patogênese e progressão das lesões de líquen plano oral. Não foram encontradas diferenças dos índices angiogênicos, quantificados através da imunomarcação do CD34, entre as lesões de PV e os espécimes de mucosa oral normal. Porém, pôde-se perceber um ligeiro aumento no número de vasos nas lesões de PV em relação aos espécimes de mucosa oral normal. Uma ligeira diminuição do número de vasos sanguíneos foi observada em lesões de PV quando comparadas com as lesões de LPO (tanto as erosivas quanto as reticulares), apesar de não terem sido encontradas diferenças dos índices angiogênicos entre ambas as lesões. Estes resultados sugerem uma possível presença do processo angiogênico nessas lesões. No entanto, este foi o primeiro estudo com a finalidade de avaliar a angiogênese em lesões de pênfigo vulgar, nos impossibilitando de concluir que este processo, de fato, possui papel importante na patogênese e progressão dessas lesões. Sugerimos, portanto, que outros estudos sejam realizados a fim de que essa hipótese seja fundamentada. 58 REFERÊNCIAS 59 REFERÊNCIAS ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. Imunologia Celular e Molecular. 5 ed. Rio de Janeiro: Elsevier Editora, 2005. ADAMS, R.H; ALITALO, K. Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis . Nat Rev Cell Biol. v.8, p.464-78, 2007. AL-HASHIMI, I. et al. Oral lichen planus and ora lichenoid lesions: diagnostic and therapeutic considerations. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 103, p. e1-12, 2007. Supplement S25. AMORMINO, S. A. F.; BARBOSA, A. A. M. Pênfigo Vulgar: revisão de literatura e relato de caso. Revista Periodontia, v. 20, n. 2, p. 47-52, 2010. ANDREASEN, J. O. Oral lichen planus: 1. 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ÍNDICES ANGIOGÊNICOS LÍQUEN PLANO EROSIVO CAMPOS CASO 1 2 3 4 CAMPOS 5 N° CASO 1 2 3 4 5 N° Médio Médio de de Vasos Vasos 01 08 02 09 03 10 04 11 05 12 06 13 07 14 72 Ficha de avaliação dos índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular (MVC) em Líquen Plano Oral Reticular de acordo com a expressão imunoistoquímica do anticorpo CD34. ÍNDICES ANGIOGÊNICOS LÍQUEN PLANO RETICULAR CAMPOS CASO 1 2 3 4 CAMPOS 5 N° CASO 1 2 3 4 5 N° Médio Médio de de Vasos Vasos 01 14 02 15 03 16 04 17 05 18 06 19 07 20 08 21 09 22 10 23 11 24 12 25 13 26 73 ANEXOS 74 ANEXOS