IMMOBILIZATION OF BIOMOLECULES INTO BIODEGRADABLE POLYMERIC BASED
SUBSRTAES FOR SELECTIVE RECRUITMENT AND ADHESION OF CELLS FOR
TISSUE ENGINEERING APPLICATIONS
Abstract
Development of bioactive materials with the ability to stimulate specific cellular responses is a
topic of high interest in the fabrication and development of biomaterials.The proper
presentation of these biochemical regulatory signals within a biomaterial is required for tissue
regeneration. Furthermore, a better understanding of cell-biomolecule-material interactions is a
key step toward the creation of multicellular and hierarchically organized tissues.Therefore the
major focus of the present thesis was on developing new instructive polymeric materials by
immobilized specific biochemical signals. To this end, chitosan films and microparticles were
functionalized with biomolecules of interest yielding biomaterials with specific chemical signals
to modulate cellular performance.An important feature that a material should display for
functionalization with specific biochemical cues it is the availability of chemical groups for
covalent modification. The chemical nature of chitosan provides many possibilities for covalent
modifications which offer several possibilities for derivatization and immobilization of
biologically active species.
In a first study it was pointed out the importance of the covalent immobilization method of
bioactive moieties, namely fibronectin, to enhance the rate of cell adhesion and proliferation on
chitosan substrates.Chitosan membranes were functionalized with fibronectin through
carbodiimide chemistry. Biological results showed that the chemical functionalization
withfibronectin stimulated cell attachment when compared to simple adsorption of the protein.
The functionalization of chitosan substrates with molecules that target a specific cell type could
be a promising strategy to isolate and recruit cells of interest to regenerate a particular
tissue.Additionally microtechnologies offer unprecedented means to generate precise patterns
of surface-tethered biomolecules. In this thesis the spatial control of antibodieswas achieved by
two different strategies: (1)microcontact printing for covalent immobilization using
bis[sulfosuccinimidyl] suberate as a crosslinker; (2) photopatterning by using surfaces
functionalized with photoprotected biotin that upon irradiation through a mask generate well
defined patterns of activated biotin. Such substrates were then used to immobilized
biotinylated antibodies via streptavidin. Different cell types, namely adipose stem cells and
endothelial cells were seeded on the functional surfaces. Results from both experiments
showed that cell attachment and proliferation could be easily manipulated depending on the
immobilized antibody.
Finally moving up to three-dimensional systems, a novel “bottom-up” approach based on the
assembly of functional microparticles was developed. In chapter VII chitosan microparticles
were functionalized anti-human platelet-derived growth factor (PDGF) antibody using
carbodiimide chemistry.The functional particles were then investigated as a method to recruit
specific growth factors from a highly enriched concentrate of growth factors – Platelet Lysates
– an autologous and easily obtained source of bioactive agents capable of providing high
concentrations of several proteins. Results showed that antibody-functionalized particles
allowed selective recruitment of a specific growth factor from a complex mixture. It was
hypothesized that stem cells can crosslink polymeric microparticles, if they contain specific
ligands capable of binding to receptors on the cell surface leading to the formation of stable
and robust three-dimensional structures. In vitro tests revealed that microparticles aggregate
due to cell connecting points, giving rise to 3D constructs.
In chapter VIII chitosan microparticles functionalized with antibodies, were explored as a
method for cell separation and expansion. Results showed that the microparticles could
selectively capture a particular cell type from a mixed cell population. Moreover particles were
also suitable for cell expansion of the target cell type. For clinical applications,
injectable/moldable hydrogels are often needed to fill defects of irregular geometries. To test
the capacity of the functional microparticles as an injectable system, functional microparticles
were seeded with stem cells and injected into a mold with a tubular shape.After three days of
incubation invitro, a robust piece with atubular shape was obtained. The works developed in
chapters VII and VIII reported a novel approach for the production of instructive 3D constructs
based on the assembly offunctionalmicro building blocks. These versatile microgels can be a
promising way to produce injectable system for non-invasive tissue engineering applications
with additional control over cellular function by creating specific microenvironments for cell
growth.
IMOBILIZAÇÃO
DE
BIOMOLÉCULAS
EM
SUBSTRATOS
POLIMÉRICOS
BIODEGRADÁVEIS PARA O RECRUTAMENTO SELETIVO E ADESÃO DE CÉLULAS
PARA APLICAÇÕES EM ENGENHARIA DE TECIDOS
Resumo
O desenvolvimento de materiais biologicamente ativos com a capacidade de estimular
respostas celulares específicas é um tópico de grande interesse na fabricação e no
desenvolvimento de biomateriais . A apresentação adequada desses sinais reguladores
bioquímicos dentro de um biomaterial é necessária para a regeneração de tecidos . Além
disso, uma melhor compreensão das interações célula - biomolécula -material é um passo
fundamental para a criação de tecidos multicelulares e hierarquicamente organizados. O
principal objetivo desta tese consistiuno desenvolvimento de novos materiais poliméricos
instrutivos através da imobilização sinais bioquímicos específicos.
Membranas e micropartículas de quitosano foram funcionalizadas com biomoléculas de
específicas de modo a desenvolver materiais que permitem um controlo sobre o desempenho
celular.
Uma característica importante que um material deve exibir de modo a serfuncionalizado com
sinais bioquímicos é a disponibilidade de grupos químicos que permitam modificação. A
natureza química do quitosano oferecevarias possibilidades de modificação covalentepara a
imobilização de espécies biologicamente ativas.
No primeiro trabalho desta tese, foi analisada a importância do método de funcionalizaçãopara
a modificação com fibronectinade modo a aumentar a taxa de adesão e proliferação celular
em substratos de quitosano. Membranas de quitosano foram funcionalizados com
fibronectinapor adsorção ou conjugação usando uma carbodiimida. Os resultados biológicos
mostraram que a funcionalização química com carbodiimidaaumenta a adesão e proliferação
celular quando comparada com a modificação por adsorção.
A funcionalização de substratos de quitosano com moléculas que têm como alvo um tipo
específico de célula pode ser uma estratégia promissora para isolar e recrutar células de
interesse para a regeneração detecidos . Além disso diferentes técnicas de
microfabricaçãopermitem criar padrões bem definidos de biomoléculas em diferentes
substratos.
Nesta tese o controlo espacial de anticorpos foi conseguida usando duas estratégias
diferentes: (1) impressão por microcontato para imobilização covalente utilizando bis
[sulfosuccinimidil] suberato como agente de ligação, (2 ) fotolitografia usando superfícies
funcionalizadas com biotina fotossensível que irradiadas através de uma máscara permitem a
criação de padrões bem definidos de biotina ativada. Esses substratos foram então usados
para imobilização de anticorpos biotiniladosvia estreptavidina.Diferentes tipos de células ,
nomeadamente células estaminais do tecido adiposo e células endoteliais foram cultivadas
sobre as superfícies funcionais . Os resultados de ambas as experiências mostraram que a
ligação de células e proliferação poderia ser facilmente manipulada dependendo do anticorpo
imobilizado .
Numa última fase desta tese foram explorados sistemas tridimensionais, através de uma
abordagem “bottom-up”, que combina o uso de micropartículas funcionais.
No capítulo VII micropartículas de quitosano foram funcionalizadas com um anticorpo. antifator de crescimento derivado de plaquetas humano, usando uma carbodiimide. As partículas
funcionais foram então testadas como um método para o recrutamento de fatores de
crescimento específicos a partir de uma solução enriquecida de múltiplos fatores de
crescimento - Lisados de Plaquetas- uma fonte autóloga e de fácil obtenção de agentes
bioativos,capazes de disponibilizar elevadas concentrações de várias proteínas. Os resultados
mostraram que as partículas funcionalizadas com anticorpo permitem o recrutamento seletivo
de um fator de crescimento específico a partir de uma mistura complexa.
Foi hipotetizado que células estaminais podem reticular micropartículas poliméricas
funcionalizadas com ligandos específicos capazes de se ligarem aos recetores na superfície
celular levando à formação de estruturas tridimensionais. Testes in vitro revelaram que as
micropartículas agregam devido a pontos de ligação celulares , dando origem a estruturas
tridimensionais, estáveis e robustas.
No capítulo VIII micropartículas de quitosano funcionalizadas com anticorpos, foram testadas
para a separação e expansão de células. Os resultados obtidosrevelaram que as
micropartículas permitem capturar seletivamente um tipo de célula de uma população celular
heterogénea. Além disso, as partículas foram também usadas para a expansão das células
isoladas. Para aplicações clínicas,hidrogéis injetáveis/moldáveis são muitas vezes necessários
para preencher defeitos de geometrias irregulares. Para testar a capacidade das
micropartículas funcionais como um sistema injetável, micropartículas funcionais foram
cultivadas com células estaminais e injetadas num molde de forma tubular. Após três dias de
incubação in vitro, foi obtidaumaestrutura sólidade forma tubular. Os trabalhos desenvolvidos
nos capítulos VII e VIII exploraram uma nova abordagem para a produção de estruturas
tridimensionaiscom sinais bioquímicos integrados através da combinação de microblocos
funcionais. Estes microgeisde elevada versatilidadepodem vir a traduzir-se no desenvolvimento
de sistemas de elevado desempenho para a produção de sistema injetáveis para aplicações
em engenharia de tecidos, criando microambientes específicos para o crescimento celular.