INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA – PPG GCBEv Perfil genotóxico e bioacumulação de metais em Hoplias malabaricus (Bloch, 1794) de tributários dos rios Negro e Solimões MAILSON RAFAEL DOS SANTOS FERREIRA MANAUS – AM 2013 MAILSON RAFAEL DOS SANTOS FERREIRA Perfil genotóxico e bioacumulação de metais em Hoplias malabaricus (Bloch, 1794) de tributários dos rios Negro e Solimões ORIENTADORA: Dra. Maria Claudia Gross COORIENTADORA: Dra. Fabíola Xochilt Valdez Domingos Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. Financiamento: CNPq/FAPEAM–PRONEX–A Biogeoquímica de Carbono e Mercúrio na Bacia Amazônica; PPP/FAPEAM – Identificação e mapeamento físico cromossômico de sequências de DNA obtidas de micronúcleos de peixes submetidos a diferentes condições de estresse; Universal/CNPq – Ferramentas para o biomonitoramento do rio Solimões. MANAUS – AM 2013 ii FICHA CATALOGRÁFICA F383 Ferreira, Mailson Rafael dos Santos Perfil genotóxico e bioacumulação de metais em Hoplias malabaricus (Bloch, 1794) de tributários dos rios Negro e Solimões / Mailson Rafael dos Santos Ferreira. --- Manaus : [s.n], 2014. Xviii, 103f. : il. color. Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2014. Orientador : Maria Claudia Gross. Coorientador : Fabíola Xochilt Valdez Domingos. Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva 1. Traíra. 2. Bioacumulação de metais. 3. Genotoxidade. I. Título. CDD 597.0929 Sinopse Peixes do gênero Hoplias (traíras) de tributários dos rios Negro e Solimões estão expostos às variações ambientais naturais ou provocadas por interferência humana. A qualidade destes ambientes e da saúde dos peixes foi avaliada via biomarcadores de genotoxicidade e bioacumulação de metais, mostrando que peixes da dieta alimentar da população ribeirinha amazônica apresentam indícios de alterações no material genético e na estruturação da membrana nuclear, bem como bioacumulação de metais acima de limites estabelecidos para consumo por agências reguladoras. Os metais e as variáveis ambientais parecem interferir na incidência de danos genotóxicos, estando os peixes dos tributários do rio Negro mais afetados quanto a integridade do material genético. Esses riscos podem ser repassados a população humana que diariamente se alimenta desses peixes, absorvendo também os elementos tóxicos que provocam alterações no material genético e na sua qualidade de vida. Palavras-chave: Traíra, micronúcleo, anormalidades nucleares eritrocíticas, variáveis ambientais, Amazônia. iii À minha família. Em especial, aos meus amados pais, Dário e Nazaré, pelo amor dedicado sempre, por fazerem de meus objetivos, suas metas, por vezes abdicarem de seus sonhos em favor dos meus, por me entenderem, apoiarem e esperarem por minha conquista. iv A realização deste projeto foi possível devido: Ao Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (PPG-GCBEv) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA). Ao Laboratório de Citogenética Animal (LACA), da Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Laboratório Temático de Microscopia Óptica e Eletrônica (LTMOE), Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e Laboratório de Biogeoquímica Ambiental Wolfgang Christian Pfeiffer (LABIOGEOQ), da Universidade Federal de Rondônia (UNIR), com auxílio dos quais foram desenvolvidas as partes laboratoriais deste trabalho. Ao projeto CNPq/FAPEAM – PRONEX – A Biogeoquímica de Carbono e Mercúrio na Bacia Amazônica (JAN. DE 2009 / DEZ. DE 2012) pelo financiamento proporcionado e por ter possibilitado as coletas do material biológico em campo, assim como ao projeto “PPP/FAPEAM - Identificação e mapeamento físico cromossômico de sequências de DNA obtidas de micronúcleos de peixes submetidos a diferentes condições de estresse”. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudo durante a realização deste trabalho de mestrado. v AGRADECIMENTOS Ao final desta etapa de trabalho recordo de muitos que me oportunizaram, ajudaram, cruzaram meu caminho e que deixaram marcas. Sem vocês seria muito mais difícil a realização deste. Por isso gostaria de agradecer profundamente: Às minhas incomparáveis orientadoras por sempre estarem presentes e me guiarem nessa jornada, pelas palavras certas nas horas difíceis, pela amizade e carinho. À Maria Claudia, pela confiança, motivação, companheirismo e compreensão. À Fabíola, pelos bons conselhos, dedicação e apoio incondicional nas atividades de laboratório e coletas de campo. Vocês foram meu apoio e sustentação. Mais que orientadoras: duas grandes amigas. Obrigado por me tornarem um melhor profissional. Ao Laboratório de Citogenômica Animal, da UFAM, e Laboratório de Microscopia Ótica e Eletrônica, do INPA, nos quais desenvolvi as análises da minha pesquisa. Ao professor Dr. Bruce Fosberg, coordenador geral do projeto científico ao qual meu trabalho está vinculado e que possibilitou o desenvolvimento desse importante trabalho de biomonitoramento ambiental. A todos os amigos do projeto PRONEX, sem exceção, que junto a mim embarcaram nas inesquecíveis excursões de campo pelos rios da Amazônia. Mesmo com tantas tarefas sempre pudemos contar um com os outros e assim superar as dificuldades que apareceram, sempre com muito companheirismo e empolgação. Em especial aos que me ajudaram nas pescarias e coletas dos tecidos Joãozinho Rocha, Thiago Luis, Márcio Ferreira, Kinny Derzy, Otávio Peleja, Sérgio Oliveira, Altamir “Negão”, Jeane, Lana, além dos pescadores/ribeirinhos que sempre nos ajudaram e nos receberam cordialmente. À Dani Kasper, Dr. Reinaldo Peleja e Dra. Ynglea Goch, João Henrique Amaral (“Minhoca”), colegas da UFRJ e da UNIR, pelas trocas de dados científicos e conversas que colaboraram para o melhor desenvolvimento desse trabalho. vi Ao Eduardo, Dr. Wanderley Bastos, Márcio Miranda, Jane Paiva, e demais colegas da UNIR – Porto Velho/RO, pela essencial contribuição na análise de bioacumulação de metais e por me receberem tão bem durante minha estadia. Ao Laboratório de Ecossistemas Aquáticos, Laboratório de Genética Animal, Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular, do INPA, Laboratório de Biologia Ambiental e Laboratório de Genética e Biodiversidade, da UFOPA, que também contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho em apoio de estrutura, análises e excursões de campo. Aos companheiros do LTMOE (Laboratório Temático de Microscopia Ótica e Eletrônica): Wilson, Jaque, pela ajuda nos últimos meses de mestrado. À família LACA (Laboratório de Citogenômica Animal – UFAM): Ana Carolina, Camila, Carlos, Francijara, Leandra, Marília, Natália, Renan e Thaís. Conviver e trocar experiência com cada um de vocês, além de uma grande alegria, é sempre muito gratificante. À minha grande amiga e parceira Luciana Fé (“Lulu”), que sempre me incentivou, colaborou e se dispôs a ajudar de todas as maneiras possíveis, não medindo esforços para tanto. À minha amiga Brenda Moraes, que sempre se dispôs a colaborar tanto no laboratório quanto nos momentos em que precisei, dando muito apoio e amizade. Aos amigos de pós-graduação: Adriana Tatikawa, Jennifer Ferreira, José Gregório pela força de sempre. À Maysa Matos pela ajuda na confecção do mapa e à Denize Benzaken pela ajuda nos momentos em que precisei. Aos professores do PPG-GCBEv, por tantos conhecimentos repassados, conselhos e oportunidades para novos conhecimentos na área ao qual escolhi embarcar. À banca avaliadora e referees deste trabalho de mestrado pelas imprescindíveis contribuições acrescentadas durante a avaliação do Plano de Trabalho, Aula de Qualificação e Defesa da dissertação: Dra. Christiane Oliveira, Dra. Eliana Feldberb, Dra. Vera Val, Dra. Ynglea Goch, Dr. Wanderley Bastos e Dr. Bruce Forsberg. vii À Dra Sueli Costa, do INPA, e ao Dr. Carlos Edwar, da UFAM, pelos esclarecimentos quanto a utilização dos testes estatísticos usados para este trabalho, pela gentileza de nos atender. Aos colegas da Escola Estadual Nossa Senhora Aparecida que compreenderam e ajudaram para o andamento e término deste trabalho: especialmente ao José Ricardo Nunes de Melo e Marlene Lira. À minha família manauara: Maycon, Bernadete e Lourival. Por tudo que fizeram por mim e fazem até hoje, pelo carinho e amor que me dedicam sempre. São essenciais na minha nova jornada. Em especial, à Minha Família, meus maiores incentivadores. Pelo apoio incondicional, amor e carinho de sempre. Meus amados pais, Dário e Nazaré, meus amados irmãos e irmãs, em especial à Monalise por me auxiliar na reta final no laboratório. E aos demais familiares. Por acreditarem na minha capacidade. E principalmente, ao Meu Deus por me abençoar com a oportunidade de cursar minha pós-graduação, com sabedoria e saúde. “Senhor Tu és o meu refúgio e minha segurança... Posso estender as mãos e segurar em Ti”. É com grande satisfação que dedico este espaço a todas as pessoas que de alguma forma me ajudaram a alcançar mais esta etapa da minha vida e a realização de um sonho, mesmo que não tenham sido citadas. Deixo aqui meus saudosos e sinceros agradecimentos. viii “Jamais considere seus estudos como uma obrigação, mas como uma oportunidade invejável para aprender a conhecer a influência libertadora da beleza do reino do espírito, para seu próprio prazer pessoal e para proveito da comunidade à qual seu futuro trabalho pertencer”. Albert Einstein ix RESUMO A presença de metais na biota e corpos aquáticos representa motivo de preocupação com relação à saúde animal e humana na Amazônia. Apesar da liberação desses compostos por meio de atividades antrópicas nos rios amazônicos, como por mineração e poluição urbana, sua origem natural é também conhecida. O mercúrio, por exemplo, apresenta-se em altas concentrações no solo da bacia do rio Negro. A bioacumulação de metais (Hg, Cu, Zn, Cr, Fe, Mn, Ni, Pb e Co) e efeitos genotóxicos foram avaliados na espécie de peixe carnívora Hoplias malabaricus, uma importante fonte de alimento para as comunidades ribeirinhas amazônicas. Os peixes foram avaliados em duas bacias com diferentes características limnológicas. Tributários do rio Solimões-Amazonas contêm altos níveis de sólidos em suspensão, pH neutro e baixas concentrações de carbono orgânico dissolvido. Rios da bacia Negro apresentam pH ácido e alta concentração de carbono orgânico dissolvido, devido à presença de substâncias húmicas. As concentrações de mercúrio (1 mg/kg) no músculo de peixes ultrapassou a recomendação da legislação brasileira em apenas uma área de amostragem da bacia do rio Negro e as concentrações de cromo (0,1 mg/kg) no músculo de peixes ultrapassou a recomendação da legislação brasileira apenas em duas áreas amostradas da bacia do rio Solimões-Amazonas. A Análise de Componentes Principais (ACP) mostrou as variáveis ambientais: pH, oxigênio dissolvido, temperatura e condutividade elétrica, influenciando na bioacumulação de metais e seus efeitos genotóxicos em H. malabaricus. Peixes de tributários do rio Negro são mais afetados pela ação genotóxica dos metais do que peixes de tributários do rio Solimões-amazonas. Apesar de observada em ambas as bacias, a ocorrência de micronúcleos (MN) e anormalidades nucleares (ANE) foi significativamente maior nos peixes de tributários do rio Negro em comparação com os da bacia do rio Solimões-Amazonas. Para água preta as ANEs se mostraram um melhor biomarcador, enquanto que para a água branca foram os MNs. Portanto, uma vez que danos genotóxicos sofrem influência da bioacumulação dos metais avaliados mesmo em concentrações abaixo dos limites estabelecidos como seguros para consumo de pescado pela ANVISA, a população que se alimenta de traíras está predisposta a absorver os contaminantes acumulados em seus tecidos e pode ser afetada pelos problemas que as afetam. Esses dados contribuem para a discussão das concentrações máximas de metais permitidas em ambientes aquáticos da Amazônia. x Abstract The presence of metals in the biot and water bodies is a cause of concern in animal and human health in the Amazon. Despite of the compounds input towards human activities on amazonian rivers, such as mining and urban pollution, their natural backgrounds are also known. Mercury, for example, is present in high concentrations on soil of the Rio Negro basin. Bioaccumulation of metals (Hg, Cu, Zn, Cr, Fe, Mn, Ni, Pb and Co) and genotoxic effects were evaluated in the amazonian species of carnivorous fish Hoplias malabaricus, an important food source for amazon “ribeirinha” communities. Fishes were evaluated in two basins with different limnological characteristics. SolimõesAmazonas River contains high levels of suspended solids, neutral pH and low concentrations of dissolved organic carbon. Rivers from Negro basin contains acidic pHs and high concentration of dissolved organic carbon due to the presence of humic substances. The concentrations of mercury (1 mg/kg) on fish muscle have been exceeded Brazilian law recommendation only in one sampling area from Negro river basin and the concentrations of chromium (0,1 mg/kg) on fish muscle have been exceeded Brazilian law recommendation only in two sampling areas fish from SolimõesAmazonas river basin. The Principal Component Analysis (PCA) showed environmental variables: pH, dissolved oxygen, temperature and electrical conductivity, influencing on bioaccumulation of metals and their genotoxic effects in Hoplias malabaricus. Fish from Rio Negro tributaries are more affected by genotoxic effects of metals than fish from Rio Solimões-Amazonas tributaries. Nevertheless the occurrence of micronucleus and nuclear abnormalities was observed in both basins, and where significantly higher on fish from Negro river compared to fish from Solimões-Amazonas river basin. ENA proved a better biomarker for black water besides MNs for white water. Therefore, since genotoxic damage are influenced by bioaccumulation of metals evaluated even at concentrations below the limits established as safe for fish consumption by ANVISA, the population who eats Hoplias malabaricus is predisposed to absorb accumulated contaminants in their their tissues and may be affected by the problems that affect them. This data can contribute to the discussion of the maximum concentrations of metals allowed on aquatic environments from Amazon. xi SUMÁRIO 1. Introdução .................................................................................................................. 18 2. Objetivos .................................................................................................................... 26 2.1 Objetivo Geral .........................................................................................................26 2.2 Objetivos específicos ..............................................................................................26 3. Material e Métodos .................................................................................................... 27 3.1 Modelo biológico e coletas ......................................................................................27 3.2 Características físico-químicas da água .................................................................30 3.4 Determinação da bioacumulação de metais ...........................................................30 3.3 Biomarcadores de Genotoxicidade .........................................................................31 3.5. Tratamento estatístico ............................................................................................32 4. Resultados ................................................................................................................. 34 4.1. Caracterização físico-química dos ambientes de coleta ........................................37 4.2. Bioacumulação de metais em músculo de traíras e consumo de pescado ............38 4.2.1. Zinco ...............................................................................................................38 4.2.2. Cobre ..............................................................................................................39 4.2.3. Níquel ..............................................................................................................42 4.2.4. Chumbo ...........................................................................................................42 4.2.5. Manganês........................................................................................................44 4.2.6. Ferro ................................................................................................................44 4.2.7. Cobalto ............................................................................................................44 4.2.8. Cromo .............................................................................................................46 4.2.9. Mercúrio ..........................................................................................................46 5. Discussão ................................................................................................................... 68 6. Conclusões ................................................................................................................ 87 7. Referências ................................................................................................................ 89 xii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Esforço amostral realizado para a coleta de peixes ao longo de tributários do rio Negro durante os períodos de cheia e seca e do rio Solimões durante a seca. .........29 Tabela 2. Número de indivíduos coletados ao longo de tributários do rio Negro durante os períodos de cheia e seca e do rio Solimões durante a seca de acordo com suas classes de tamanho. ........................................................................................................33 Tabela 3. Cargas das coordenadas fatoriais das variáveis sobre os dois fatores principais resultantes da análise de componentes principais dos dados obtidos ao longo de tributários do rio Negro e do rio Solimões (Amazonas). Somente as cargas mais elevadas com valor acima de 0,40 são mostradas na tabela por representarem maior variância. Variáveis: °C (temperatura), ANE (Anormalidades Nucleares Eritrocíticas), Cdv (Condutividade), Co (Cobalto), Cr (Cromo), Cu (Cobre), Fe (Ferro), Hg (Mercúrio), Mn (Manganês), MN (Micronúcleos), Ni (Níquel), Pb (Chumbo), pH, Peso, Zn (Zinco). (Método de extração: Análise de Componentes Principais; rotação: Varimax; 6 casos). 36 Tabela 4. Caracterização físico-química de tributários do rio Negro durante os períodos de cheia e seca e do rio Solimões durante a seca...........................................................38 Tabela 5. Concentração de metais em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários dos rios Negro e Solimões (Amazonas). Hg: mercúrio; Cr: cromo; Cu: cobre; Zn: zinco; Mn: manganês; Fe: ferro; Pb: chumbo; Ni: níquel; Co: cobalto. ......................40 Tabela 6. Frequências médias (%) de eritrócitos normais, micronucleados (MN) e alterações nucleares (ANE) em eritrócitos de Hoplias malabaricus em tributários dos rios Negro e Solimões. ...........................................................................................................54 Tabela 7. Cargas das coordenadas fatoriais das dezesseis variáveis sobre os dois fatores principais resultantes da análise multivariada na análise por bacia dos organismos coletados ao longo de tributários do rio Negro e do rio Solimões (Amazonas). A matriz de carregamento foi adaptada de modo a que as colunas aparecem em ordem decrescente de variância explicada por fatores. Somente as cargas mais elevadas com valor acima de 0,47 foram são mostradas na tabela por representarem maior variância. (Método de extração: Análise de Componentes Principais; rotação: Varimax; 6 casos.) Variáveis: °C (temperatura), ANE (Anormalidades Nucleares Eritrocíticas), Cdv (Condutividade), Co (Cobalto), Cr (Cromo), Cu (Cobre), Fe (Ferro), Hg (Mercúrio), Mn (Manganês), MN (Micronúcleos), Ni (Níquel), Pb (Chumbo), pH, Peso, Zn (Zinco). .......................................................................................................62 xiii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Exemplar de Hoplias malabaricus. Foto: Luís Rodrigues 2010. .......................27 Figura 2. Localidades de coleta dos peixes em tributários dos rios Negro e Solimões, Amazonas. Os pontos pretos mostram as coletas realizadas nos tributários do rio Negro durante a cheia, os pontos alaranjados mostram as coletas realizadas nos tributários do rio Negro em período de seca e os pontos vermelhos mostram os pontos de coleta nos tributários do rio Solimões/Amazonas..............................................................................28 Figura 3. Análise de componentes principais (ACP) dos biomarcadores e variáveis ambientais nos tributários do rio do Negro (círculo azul) e do rio Solimões (círculo verde). Os fatores 1 e 2 mostrados aqui representam 55% de variância dos dados. A variância explicada por cada fator é mostrada na Tabela 3. (Método de extração: Análise de Componentes Principais; rotação: Varimax; 6 casos). ss = rio Solimões no periodo de seca; nc = rio Negro no período de cheia; ns = rio Negro no período de seca. ...............35 Figura 4. Concentração de zinco (A) e cobre (B) em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários dos rios Negro e Solimões (Amazonas). Os círculos sem preenchimento mostram os tributários do rio Solimões e os círculos com preenchimento mostram os tributários do rio Negro. As linhas tracejadas azuis mostram as concentrações máximas estabelecidas para consumo pela legislação brasileira para Zn (50 mg.kg-1) e Cu (3,5 mg.kg-1) – Portaria 685/98 e Decreto 55.871/65 da ANVISA. .....41 Figura 5. Concentração de níquel (A) e chumbo (B) em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários dos rios Negro e Solimões (Amazonas). Os círculos sem preenchimento mostram os tributários do rio Solimões e os círculos com preenchimento mostram os tributários do rio Negro. As linhas tracejadas azuis mostram os valores máximos estabelecidos pra consumo pela legislação brasileira para Ni (5,0 mg.kg-1) e Pb (2,0 mg.kg-1) – Portaria 685/98 e Decreto 55.871/65 da ANVISA. ............43 Figura 6. Concentração de manganês (A), ferro (B) e Cobalto (C) em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários dos rios Negro e Solimões (Amazonas). Os círculos sem preenchimento mostram os tributários do rio Solimões e os círculos com preenchimento mostram os tributários do rio Negro. Para esses metais não há valores máximos estabelecidos pra consumo pela legislação brasileira – Portaria 685/98 e Decreto 55.871/65 da ANVISA. .......................................................................................45 Figura 7. Concentração de cromo (A) e mercúrio (B) em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários dos rios Negro e Solimões (Amazonas). Os círculos sem preenchimento mostram os tributários do rio Solimões e os círculos com preenchimento mostram os tributários do rio Negro. As linhas tracejadas azuis mostram os valores máximos estabelecidos pra consumo pela legislação brasileira para Hg em peixes carnívoros (1,0 mg.kg-1 para peixes carnívoros) e Cr (0.1 mg.kg -1) - Portaria 685/98 e Decreto 55.871/65 da ANVISA. ........................................................................47 xiv Figura 8. Concentração de Mercúrio (Hg) em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários do rio Negro durante os períodos de cheia e seca e do rio Solimões durante a seca (Amazonas). Cada ponto no gráfico representa um indivíduo analisado. A linha azul mostra os valores recomendados pela ANVISA. .............................................48 Figura 9. Bioacumulação de mercúrio por diferentes classes de peso nos tributários do rio Negro (A) e nos tributários do rio Solimões (B). Diferença significativa entre a x b. As linhas azuis mostram os valores recomendados pela ANVISA. ......................................50 Figura 10. Bioacumulação de Cromo em peixes de peso entre 75 a 249g nos tributários do rio Solimões. Nenhum peixe mostrou valores acima dos recomendados pela ANVISA. Diferença significativa entre a x b. Somente tributários com n>3 são mostrados. ...........51 Figura 11. Bioacumulação de Cromo em peixes de peso entre 250 a 499g nos tributários do rio Negro (A) e Solimões (B). Bioacumulação de mercúrio em peixes de peso entre 250 a 499g nos tributários do rio Negro (C) Nenhum peixe mostrou valores acima dos recomendados pela ANVISA. Diferença significativa entre a x b. Somente tributários com n>3 são mostrados. .........................................................................................................52 Figura 12. Danos genotóxicos em Hoplias malabaricus coletados em tributários dos rios Negro e Solimões. Células eritrocíticas normais (A); Célula micronucleada (B); Núcleo em forma de rim (C); Núcleo lobado (D); Núcleo segmentado (E); Núcleo Vacuolado (F). Fotos do autor. .................................................................................................................53 Figura 13. Frequência de ocorrência dos danos genotóxicos (%) observados em eritrócitos de Hoplias malabaricus nos tributários dos rios Negro e Solimões. Núcleos em forma de rim (NR), lobados (NL) segmentados (NS), vacuolados (NV), micronúcleos (MN). ................................................................................................................................57 Figura 14. Frequências (%) de micronucleados (MN) em eritrócitos de Hoplias malabaricus em tributários dos rios Negro (A) e Solimões (B). Diferença significativa entre a x b. Somente tributários com n>3 são mostrados. ...............................................58 Figura 15. Frequências (%) de Anormalidade Nucleares Eritrocíticas (ANE) em eritrócitos de Hoplias malabaricus em tributários dos rios Negro. Diferença significativa entre b x e, b x d, c x d, c x e. Somente tributários com n>3 são mostrados. .....................................59 Figura 16. Frequências (%) de Anormalidade Nucleares Eritrocíticas (ANE) em eritrócitos de Hoplias malabaricus da classe de peso de 250 a 500g em tributários dos rios Negro (A). Diferença significativa entre a x b. Frequência de eritrócitos micronucleados (MN) entre tributários dório Solimões (B). Diferença significativa entre a x b. Somente tributários com n>3 são mostrados. .................................................................................60 Figura 17. Projeção de todas as variáveis avaliadas em Hoplias malabaricus coletadas em tributários do rio Negro (A) e projeção de todas as variáveis avaliadas em Hoplias malabaricus coletadas em tributários do rio Solimões (B). Variáveis: °C (temperatura), ANE (Anormalidades Nucleares Eritrocíticas), Cdv (Condutividade), Co (Cobalto), Cr (Cromo), Cu (Cobre), Fe (Ferro), Hg (Mercúrio), Mn (Manganês), MN (Micronúcleos), Ni xv (Níquel), Pb (Chumbo), pH, Peso, Zn (Zinco). (Método de extração: Análise de Componentes Principais; rotação: Varimax; 6 casos)......................................................63 Figura 18. Análise de componentes principais (ACP) dos biomarcadores e variáveis ambientais nos tributários do rio do Negro (A) e do rio Solimões (B). Os fatores 1 e 2 mostrados aqui representam 66% de variância dos dados para o rio Negro e 78% de variância para o Solimões. Os círculos mostram os agrupamentos formados nos tributários do rio Negro (azul) e do rio Solimões (verde). Os pontos não circulados não se formaram agrupamentos. A variância explicada por cada fator é mostrada na Tabela 7. (Método de extração: Análise de Componentes Principais; rotação: Varimax; 6 casos). ss = rio Solimões no periodo de seca; nc = rio Negro no período de cheia; ns = rio Negro no período de seca. ..............................................................................................................65 Figura 19. Dendograma das variáveis ambientais e biomarcadores observados nas traíras coletadas nos tributários do rio Negro (A) e Solimões (B). Variáveis: ANE (Anormalidades Nucleares Eritrocíticas), Co (Cobalto), Cr (Cromo), Cu (Cobre), Fe (Ferro), Hg (Mercúrio), Mn (Manganês), MN (Micronúcleos), Ni (Níquel), O2 (Oxigênio), Pb (Chumbo), pH, Zn (Zinco). (medida de distância: euclidiana; regra de amalgamação: Linkage Único). ................................................................................................................67 xvi LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACP: Análise de componentes principais ANE: Anormalidades nucleares eritrocíticas ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária Cdv: Condutividade Co: Cobalto COD/DOC: Carbono orgânico dissolvido Cr: Cromo Cu: Cobre DNA: Ácido desoxirribonucléico EN: envelope nuclear Fe: Ferro Hg: Mercúrio Mn: Manganês MN: Micronúcleo Ni: Níquel O2: Oxigênio OD: Oxigênio dissolvido Pb: Chumbo Zn: Zinco WHO: Organização Mundial da Saúde (do inglês: World Health Organization). xvii 1. Introdução Os rios da bacia amazônica apresentam grande variação quanto a sua composição físico-química e formação de diferentes tipos de ambientes. Mostram uma forte relação entre a hidroquímica e o ambiente por onde percolam, sendo suas características físico-químicas, como condutividade e disponibilidade de oxigênio dissolvido, influenciadas por fatores como a vegetação e tipos de rochas (Sioli, 1984 a; b). Estas características vêm sendo utilizadas na classificação das águas superficiais amazônicas em três tipos principais: rios de águas claras, brancas e pretas (Sioli 1950; Sioli, 1984 a; b; Junk et al., 2011). Os dois últimos tipos são encontrados ao longo de toda a bacia hidrográfica amazônica, enquanto que os rios de água clara estão localizados na parte oriental, sendo originados no Planalto Central Brasileiro ou no Planalto Guianense, com águas límpidas e transparentes, cujas características químicas são de transição entre os outros dois tipos (Sioli, 1984a, 1984b; Junk et al., 2011). Os rios de água branca são aqueles de origem andina e sub-andina. Devido aos muitos processos erosivos ao longo de suas margens apresentam águas turvas, barrentas e amareladas, com elevada quantidade de material particulado em suspensão. São típicas dos rios Solimões, Amazonas, Madeira, Purus, Juruá, Japurá, entre outros, os quais formam em suas margens uma planície de aluviões recentes, as várzeas. Possuem pH próximo ao neutro e, comparados aos outros tipos de rios amazônicos, são relativamente ricos em íon cálcio (Ca 2+) e bicarbonato (HCO3-), sendo também classificados como águas carbonatadas (Sioli, 1984a; b; Queiroz et al., 2009; Junk et al., 2011). Os rios de água preta são transparentes, de cor verde escuro a marrom, com alto conteúdo de componentes húmicos e substâncias fúlvicas dissolvidas incompletamente, que juntamente com os altos conteúdos de sódio (Na +) e potássio (K+), acidificam (pH próximo a 4,0) e escurecem as águas provenientes da drenagem dos escudos das Guianas e Brasileiro e da planície da Amazônia Central. As águas pretas têm como principal representante o rio Negro e têm níveis extremamente baixos de nutrientes (Sioli, 1984a; 1984b; Junk et al., 2011). 18 Os rios amazônicos percorrem o interior da floresta e durante os períodos da cheia suas águas extravasam, resultando na imersão de várias áreas de floresta, alagando várzeas e igapós, o que favorece o carreamento de matéria orgânica particulada (Junk, 1997; Borum et al., 2001), oriunda de restos recém-formados de folhas, madeiras, animais e constituintes celulares – origem autóctone – ou originada dos solos via lixiviação e erosão – origem alóctone (Thurman 1985; Hedges et al., 1986; Rocha e Rosa, 2003; Wood et al., 2011), sendo quantificada como carbono orgânico dissolvido (COD ou DOC), o qual funciona como regulador de processos bióticos e abióticos em ecossistemas de água doce (Wood et al., 2011). O DOC, portanto, representa um elemento carreador/bloqueador de metais, uma vez que os compostos metálicos tem afinidade de complexação com substâncias húmicas aquáticas, as quais são ricas em teores de oxigênio (Rosa e Rocha, 2003; Wood et al., 2011). Sendo assim, os rios contribuem na transferência de substâncias dissolvidas, nutrientes e sedimentos entre o canal principal e a planície de inundação e afetam a quantidade de compostos que são transportados a partir do solo para os corpos d'água, estando esses processos associados à influência dos regimes hidrológicos, variações sazonais e processos de erosão e deposição de sedimentos (Junk, 1997; Borum et al., 2001; Rocha e Rosa, 2003). Os corpos aquáticos amazônicos, não diferentes de outros, são receptores finais de contaminantes liberados no ambiente, dentre eles os metais provenientes tanto de fontes naturais por deposição de material particulado atmosférico, lavagem e lixiviação do solo, quanto de atividades humanas por meio de lançamento direto de despejos industriais e urbanos, e isto pode ter reflexos sobre os organismos (Förstner e Wittmann, 1983; Al-Sabti e Metcalfe, 1995). Os metais estão naturalmente disponíveis nos ambientes aquáticos em pequenas concentrações, da ordem de partes por bilhão (ppb) a partes por milhão (ppm). Em concentrações elevadas nos ambientes aquáticos os metais podem causar sérios efeitos nos organismos, inclusive levar à morte peixes e seres fotossintetizantes (Jardim, 1988; Lacerda, 1997; Rocha e Rosa, 2003), pois uma vez alcançando esses ambientes podem se tornar biodisponíveis e serem absorvidos pelos organismos. Uma vez absorvidos podem sofrer bioacumulação, que consiste no aumento dos níveis de determinada substância química nos tecidos dos indivíduos. Este processo bioacumulativo é influenciado pela biodisponibilidade desses compostos 19 metálicos nos sistemas aquáticos, que por sua vez sofre influência de vários fatores, dentre eles a acidez (pH) da água, temperatura e material orgânico dissolvido (Rocha e Rosa, 2003). Além disso, alguns metais podem ainda biomagnificar, ou seja, aumentar seus níveis de acumulação ao longo dos níveis tróficos afetando as espécies de níveis tróficos superiores em maior intensidade (van der Oost et al., 2003; Silva et al., 2003), o que significa que predadores de topo da cadeia alimentar tendem a apresentar concentrações elevadas de compostos metálicos (Castilhos et al., 2000; Borum et al., 2001; Silva et al., 2003). Assim, os níveis de poluentes como os metais em tecidos dos organismos são utilizados para indicar o grau histórico de contaminação das águas em que vivem, bem como conhecer a qualidade ambiental e detectar riscos para a saúde humana quanto ao consumo de organismos potencialmente afetados (Silva et al., 2003). Na bacia amazônica alguns trabalhos utilizando peixes de diferentes níveis tróficos comprovaram que o metal mercúrio (Hg) apresenta elevada capacidade de bioacumulação e biomagnificação na biota aquática, especialmente em peixes de níveis tróficos superiores como traíra e tucunaré, os quais apresentam elevada concentração de mercúrio em seus tecidos (Malm et al., 1997; Forsberg et al., 1999; Castilhos et al., 2000; Fadini e Jardim, 2001; Borum et al., 2001; Roulet et al., 2001; Barbosa et al., 2003; Belger e Forsberg, 2006; Jardim et al., 2010; Beltran-Pedreros et al., 2011). Além disso, outros metais como o Al, Cd e Cr também estão sendo absorvidos por peixes amazônicos e os níveis de concentração de alguns elementos podem causar danos à saúde da população consumidora (Barros et al., 2010). Situações similares podem acontecer para outros compostos e metais nos meios hídricos e nas cadeias tróficas amazônicas. Contudo, alguns metais apresentam função biológica e, portanto, participam obrigatoriamente do metabolismo dos organismos vivos, tendo funções fundamentais como em sistemas enzimáticos e/ou fazendo parte do sistema aceptor/doador de elétrons, sendo chamados de essenciais. Dentre estes estão o Cu, Fe, Mn, Co, Mg, Ni e Zn, os quais são necessários à vida e aceitáveis em concentrações-traço (baixas concentrações), podendo se tornar tóxicos quando em níveis elevados. Outros metais não apresentam funções biológicas conhecidas ou estão ausentes nos sistemas biológicos, chamados de não essenciais. Estes, mesmo em pequenas concentrações 20 nos organismos, apresentam potencial tóxico e tendência à bioacumulação, como é o caso do Hg, Pb, Cd e Ag (Lacerda et al., 1987; Heath, 1995). O Mercúrio é um metal presente em alta concentração nos rios amazônicos tanto com histórico de contaminação por atividades garimpeiras, como nos rios Tapajós e Madeira (Pfeiffer e Lacerda, 1988; Malm et al., 1990; Roulet et al., 1999; Castilhos et al., 2000), como sem influência de garimpo, como os rios da bacia do rio Negro, os quais apresentam concentrações de Hg relativamente altas e associadas à abundância do metal no solo, que é facilmente transferido para a coluna de água por lixiviação, processos de cheia e vazante da bacia, além da atuação da fotoquímica solar (Jardim e Fadini, 1999; Belger e Forsberg, 2006). Porém, nos rios amazônicos, como os rios Negro e Solimões, diversos outros metais se fazem presentes, e sua disponibilidade também está relacionada a parâmetros como pH, condutividade e DOC (Küchler et al., 2000). Análises feitas no rio Tapajós avaliaram a qualidade da água quanto à presença de metais e verificaram que, dentre 20 diferentes elementos (Al, Ag, As, Ba, Be, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, Mg, Mn, Mo, Ni, Pb, Sr, Ti e Zn), os metais Al e Fe se apresentaram em concentrações acima dos limites aceitáveis pela legislação brasileira, estando as águas do rio Tapajós comprometidas quanto a sua qualidade, podendo causar problemas sérios à saúde humana e da biota de modo geral (Miranda et al., 2009). O que mostra que rios da Amazônia têm sido afetados com poluição por elementos metálicos. Para detectar e prevenir o impacto de compostos químicos poluentes sobre os ecossistemas aquáticos, variadas estratégias têm sido desenvolvidas, dentre elas o biomonitoramento e o monitoramento ambiental, que via determinação dos níveis de contaminação da água e da biota, permitem o estudo da biodisponibilidade e da bioacumulação de compostos, diagnosticando áreas impactadas (van der Oost et al., 2003). O biomonitoramento pode ser realizado via a utilização de diferentes biomarcadores, definidos como alterações em uma determinada resposta biológica relacionada à exposição de um organismo a poluentes químicos ou ao efeito tóxico destes compostos, podendo ser respostas comportamentais, fisiológicas, bioquímicas e ao nível molecular (Peakall, 1994; van der Oost et al., 2003). Neste contexto, os peixes são organismos chave na aplicação de biomarcadores para biomonitoramento e 21 utilizados amplamente em estudos de ecotoxicologia, uma vez que a absorção de elementos pode se dar por mais vias além da alimentação, tais como difusão simples dos íons metálicos pelos poros das brânquias, pela água ingerida e pela adsorção direta através da pele (Sindayigaya et al., 1994). Além disso, os peixes frequentemente respondem aos contaminantes tóxicos de forma similar aos grandes vertebrados, podendo assim ser usados para investigar substâncias químicas com potencial para causar efeitos à saúde humana (Silva et al., 2003) bem como atuar como organismos "sentinelas" para indicar o potencial de exposição de populações humanas a produtos químicos genotóxicos (Al-Sabti e Metcalfe, 1995). A alimentação é o principal caminho para exposição das populações humanas a agentes químicos e os peixes têm sido reconhecidos como um dos vetores potenciais para a transferência de contaminantes aos humanos (Silva et al., 2003). A principal fonte de proteínas, ácidos graxos e gorduras saturadas da população ribeirinha amazônica é o tecido muscular de peixes. Sendo assim, o acúmulo de compostos poluentes como os metais no organismo pode resultar em alterações biológicas não apenas nos peixes, mas também nas populações humanas (Malm et al., 1995; Bidone et al., 1997; Lebel et al., 1997; Roulet et al., 1998). A introdução de metais nos organismos humanos via cadeia alimentar pode originar várias doenças por apresentarem efeito cumulativo, podendo causar até a morte (Chapman et al., 1996; Rocha e Rosa, 2003). A traíra – Hoplias malabaricus (Bloch, 1794) – é uma espécie de peixe pertencente à família Erythrinidae, ordem Characiformes (Nelson, 1994) e apresenta ampla distribuição geográfica, sendo encontrada em quase todas as bacias hidrográficas, desde a América Central até o rio Colorado, no sul da Argentina, com diferentes áreas de endemismo (Castro e Casatti, 1997; Bertollo et al., 2000; Vicari et al., 2005; Marques, 2011). Na Amazônia pode ser encontrada em rios do Brasil, Suriname, Venezuela, Guiana e outros (Oyakawa, 2003), sendo uma espécie de peixe bastante consumida pelos ribeirinhos e, além disso, apresenta várias características importantes como hábito carnívoro, alta capacidade de bioacumulação de mercúrio, adaptação e sobrevivência em diferentes ambientes (Belger e Forsberg, 2006). Quando adultas, as traíras apresentam um comprimento médio em torno de 50 cm e peso de até 1,5 kg e durante seu primeiro ano de desenvolvimento são onívoros, 22 alimentando-se principalmente de microcrustáceos, algas e insetos aquáticos (Castro e Casatti, 1997). Após alcançarem 12 cm de comprimento se tornam estritamente carnívoros e altamente especializados em piscivoria. Em situações de pouca abundância de presas, as traíras enriquecem a sua dieta com outros ítens, como crustáceos. Habitam preferencialmente ambientes lênticos, possuem comportamento territorialista e hábitos noturnos. Permanecem junto à vegetação durante o dia e se alimentam durante a noite. Os principais fatores que influenciam a ocorrência desta espécie nos ambientes aquáticos são a disponibilidade de predadores e presas, correntes e temperatura (Gillian e Fraser, 2001). A ausência ou baixa disponibilidade de oxigênio não é um fator limitante à ocorrência de H. malabaricus, já que estes peixes conseguem realizar respiração aérea e acredita-se que são capazes de se mover por trechos lodosos entre lagoas (Nelson, 1994). Apesar de sua robustez, as traíras representam um grupo chave para o estudo de variações genéticas, genotoxicidade e biomonitoramento ambiental, estando seu material genético exposto às variações de seu ambiente. Quando em intérfase, o material genético cromatínico está localizado no núcleo das células da maioria dos organismos (eucariontes), sendo delimitado pela membrana ou envelope nuclear (EN) (Burns e Bottino, 1991; Antonin, 2009). A membrana interior interage diretamente com a cromatina, sendo composta pela lâmina nuclear, a qual confere forma e estabilidade ao envelope nuclear, estando ancorada aos complexos de poros nucleares (Antonin, 2009). No início dos processos de divisão celular o EN precisa ser desmontado e a lâmina nuclear se despolimeriza parcialmente. Após o final da anáfase (telófase), o EN é remontado por conta da defosforilação dos componentes membranonucleares e recrutamento gradual dos componentes protéicos da membrana nuclear se reagregando em torno dos cromossomos (Antonin, 2009; Chatel e Fahrenkrog, 2011). Porém, problemas na estruturação e desestruturação do EN podem implicar em alteração da morfologia nuclear. Ainda, esta dinâmica nuclear pode revelar danos no material genético por meio da reestruturação do envelope nuclear em torno de cromatina que não foi incorporada ao núcleo da célula filha durante a divisão celular, em decorrência de danos ocorridos nas células parentais. Estes danos muitas vezes surgem em função da exposição a agentes mutagênicos ambientais, o qual pode induzir o DNA a modificações químicas e ocasionar a formação de fragmentos cromossômicos ou perda de cromossomos inteiros 23 devido à disfunção no aparelho do fuso mitótico, os quais acabam formando micronúcleos (MN) delimitados por membrana e separados do núcleo principal (Heddle, 1973; Schmid, 1975; Albertini et al., 2000; Bombail et al., 2001; Ribeiro et al., 2003). Desta forma, o aumento da frequência de células micronucleadas é um biomarcador de efeitos genotóxicos, que pode refletir a exposição a agentes clastogênicos – que se referem aos eventos de dano diretamente no cromossomo e seus componentes, notadamente no DNA – ou aneugênicos – referentes aos eventos causadores de danos no mecanismo do fuso e outros componentes envolvidos na separação dos cromossomos (Heddle, 1973; Schmid, 1975; Albertini et al., 2000; Fenech, 2000; Bombail et al., 2001; Ribeiro et al., 2003). A determinação da taxa de micronucleação representa uma forma simples e rápida na estimativa da presença de alterações cromossômicas nas células (Martins e Boschini Filho, 2003), consideradas como mutações e que podem ser transmitidas aos descendentes, pois o dano genético se manifesta nas células-filhas (Ribeiro et al., 2003). Apesar de o micronúcleo ser a anormalidade que afeta o núcleo mais estudada e citada na literatura, podem ocorrer outros tipos de anomalias celulares, formadas quando determinada quantidade de material fica levemente atrasada na mitose. Isso faz com que o núcleo resultante não seja oval, mas apresente uma saliência de cromatina (Bombail et al., 2001), as quais são conhecidas como anormalidades nucleares e, quando estudadas em eritrócitos, são chamadas de anormalidades nucleares eritrocíticas (ANE). MN e ANE se enquadram, portanto como biomarcadores de genotoxicidade e representam alterações em nível molecular, como danos no material genético. Podem ser visualizados por meio de anomalias na forma dos núcleos de eritrócitos ou como quebras no DNA que se manifestam como micronúcleos em resposta à presença de poluentes ambientais (Al-Sabti e Metcalfe, 1995). A avaliação da frequência de MN e das ANE tem sido intensamente utilizada em peixes para investigação de efeitos de compostos presentes no ambiente aquático, e sua eficiência tem sido bastante comprovada (Al-Sabti e Metcalfe, 1995; Grisolia e Cordeiro, 2000; Sánchez et al., 2000; Rashed, 2001; Vargas et al., 2001; Shahidul-Islam e Tanaka, 2004; Bolognesi et al., 2006; Bücker et al., 2006; Udroiu, 2006). Esse tipo de avaliação se enquadra como uma das técnicas mais adequadas para identificar respostas integradas à mistura complexa de contaminantes (Bolognesi e Hayashi, 2011) 24 e já foi realizado em algumas espécies de peixes amazônicos, tanto em animais coletados em seu próprio ambiente (Porto et al., 2005) ou submetidos a bioensaios (Bücker et al., 2006; Pretti et al., 2007; Rocha et al., 2009; Groff et al. , 2010; Rocha et al., 2010). Investigações utilizando testes de genotoxicidade utilizando peixes amazônicos têm mostrado eficiência quanto à ação genotóxica de substâncias poluentes sobre a integridade do material genético. Peixes elétricos da espécie Eingenmannia virescens foram expostos ao benzeno (50 ppm) em diferentes tempos de exposição e apesar do teste de MN não mostrar efeitos mutagênicos significativos em eritrócitos, quebras no DNA foram detectadas pelo Ensaio do Cometa sugerindo ação genotóxica e um efeito tempo-dependente (Bücker et al., 2006). Peixes da espécie Prochilodus lineatus (curimbatá) foram utilizados para avaliar os possíveis efeitos genotóxicos e mutagênicos da fração solúvel da gasolina (FSG) via teste Cometa e da ocorrência de alterações eritrocíticas nucleares e os resultados mostraram um efeito genotóxico e mutagênico da gasolina, com um aumento significativo na frequência de ANE nos peixes expostos ao contaminante (Pretti et al., 2007). Esses estudos demonstram que diferentes estímulos ambientais e diferentes compostos, além dos metais, podem causar danos no material genético de peixes, seja na forma de lesões genotóxicas ou de mutações irreparáveis ao nível de cromossomos, mostrando a importância desses organismos como modelos para avaliação e identificação de agentes genotóxicos ou mutagênicos em ambientes aquáticos amazônicos ou de outras regiões. Assim, considerando que nos diferentes ambientes aquáticos amazônicos as características físico-químicas são totalmente distintas, os processos biogeoquímicos e a biodisponibilidade de metais podem ocorrer de forma diferenciada, e estes podem influenciar a bioacumulação de metais e a ocorrência de danos genotóxicos de formas distintas. Desta forma, o presente trabalho avaliou a influência de diferentes ambientes aquáticos amazônicos e da bioacumulação de metais ao longo das bacias dos rios Negro e Solimões do ponto de vista da integridade do material genético de traíras, sendo de extrema importância para a compreensão destes processos em dois ambientes contrastantes e para o estabelecimento de parâmetros comparativos para biomonitoramento e estudos futuros. 25 2. Objetivos 2.1 Objetivo Geral Avaliar a ocorrência de danos genotóxicos e determinar a bioacumulação de metais em Hoplias malabaricus de tributários dos rios Negro e Solimões. 2.2 Objetivos específicos Verificar se há indução de danos genotóxicos em traíras nos diferentes pontos amostrados e validar essa análise como ferramenta de avaliação da qualidade ambiental. Identificar os tipos de anormalidades nucleares com incidência em traíras de cada tributário amostrado. Determinar a concentração dos metais Cobre (Cu), Cobalto (Co), Cromo (Cr), Chumbo (Pb), Ferro (Fe), Manganês (Mn), Mercúrio (Hg), Níquel (Ni) e Zinco (Zn) em músculo de Hoplias malabaricus de tributários amazônicos. Comparar a bioacumulação de metais em H. malabaricus provenientes de cada ambiente. Comparar a bioacumulação de metais em H. malabaricus com os limites estabelecidos pela legislação brasileira para consumo humano. Verificar se as variáveis ambientais: pH, O2, temperatura e condutividade elétrica, apresentam correlações com a bioacumulação de metais. Verificar quais variáveis ambientais estão associadas às alterações genotóxicas. 26 3. Material e Métodos 3.1 Modelo biológico e coletas Foram utilizados peixes da espécie Hoplias malabaricus (figura 1) provenientes de tributários amazônicos ao longo dos rios Negro e Solimões/Amazonas, localizados no estado do Amazonas – Brasil (Figura 2, com autorização do Instituto Chico Mendes/SISBIO 29657-1/2011). Figura 1. Exemplar de Hoplias malabaricus. Foto: Luís Rodrigues, 2010. As coletas na bacia hidrográfica do rio Negro foram realizadas próximo à foz dos rios Teia (n=4), Uneuxi (n=), Jurubaxi (n=7), Preta (n=11), Caurés (n=5), Unini (n=4), igarapé Ariaú (n=13) e lago do Folharal (n=10), localizados entre os municípios de Santa Isabel do Rio Negro (AM) e Manaus (AM), numa extensão de mais de 800 km de percurso pelo leito do rio. Na bacia do rio Solimões/Amazonas as coletas se deram próximo à foz dos rios Juruá (lago Paupixuna) (n=6), Japurá (lago Curupira) (n=6), rio Purus (n=9), rio Madeira (n=6), lago Coari (n=16) e lago Grande Manacapuru (n=13), numa extensão de mais de 1000 km de percurso pelo leito do rio. 27 Figura 2. Localidades de coleta das Hoplias malabaricus em tributários dos rios Negro e Solimões, Amazonas. Os pontos pretos mostram as coletas realizadas nos tributários do rio Negro durante a cheia, os pontos amarelos mostram as coletas realizadas nos tributários do rio Negro em período de seca e os pontos vermelhos mostram os pontos de coleta nos tributários do rio Solimões/Amazonas. O esforço amostral para coletas das Hoplias malabaricus foi distribuído em quatro excursões-cruzeiros do projeto “A Biogeoquímica do Carbono e Mercúrio na Bacia Amazônica” (MERCAM-PRONEX) (Tabela 1). Diferenças no número amostral entre as estações fluviais se deve ao fato de que durante os períodos de enchente as traíras se refugiam em regiões muito afastadas em busca de águas rasas e lênticas como nascente de igarapés, evitando regiões alagadiças, o que dificulta sua captura. Foi realizada uma excursão no período da cheia no rio Solimões, porém nenhuma Hoplias malabaricus foi capturada. 28 Tabela 1. Esforço amostral realizado para a coleta de Hoplias malabaricus ao longo de tributários do rio Negro durante os períodos de cheia e seca e do rio Solimões durante a seca. Período da Excursão Bacia Hidrográfica Período fluvial Peixes analisados Julho/2011 Negro Cheia 28 Novembro/2011 Solimões Seca 68 Maio/2012 Solimões Cheia 0* Setembro/2012 Solimões Seca 07 Dezembro/2012 Negro Seca 77 Total 180 * Nesta excursão foi utilizado o mesmo esforço, porém nenhum peixe foi capturado. As Hoplias malabaricus foram coletados com malhadeiras, tarrafas, linha e anzol, com o auxílio de pescadores locais. Para evitar diferenças na dieta relacionadas ao tamanho, apenas espécimes adultos estritamente carnívoros, ou seja, acima de 15 cm de comprimento, foram amostrados. Após a captura foram mantidas em caixas isotérmicas com água do ambiente da coleta, aerada com bomba de oxigenação. Os animais foram devidamente anestesiados e eutanasiados com a adição de óleo de cravo (Eugenol) 5% na água, diluído em concentração final de 0,05%. Realizada a anotação da biometria (peso, comprimento total e comprimento padrão), fez-se então a coleta de sangue periférico (0,2 ml) e de tecido muscular branco (aproximadamente 3g). Depois de eutanasiados os espécimes foram armazenados em freezer para posterior fixação em formol e confirmação de identificação pela equipe da Coleção de Peixes do INPA, espécimes testemunho foram depositados nesta coleção. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os Princípios Éticos de Experimentação Animal do Conselho Nacional de Experimentação Animal (CONCEA) e sob aprovação da Comissão de Ética em Pesquisa no Uso de Animais (CEUA) n°. 046/2012 do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) (Anexo). 29 3.2 Características físico-químicas da água Os dados físico-químicos da água de cada um dos pontos de amostragem foram aferidos durante as excursões no momento da coleta dos peixes e disponibilizados pelo Laboratório de Ecossistemas Aquáticos, da Coordenação de Dinâmica Ambiental (CEDAM) do INPA. Os valores de pH, condutividade, Oxigênio Dissolvido (OD) e temperatura foram obtidos, respectivamente, com auxílio de pHmetro, condutivímetro e Oxímetro portáteis de campo. 3.4 Determinação da bioacumulação de metais A bioacumulação dos seguintes metais: Cobre (Cu), Zinco (Zn), Ferro (Fe), Manganês (Mn), Níquel (Ni), Chumbo (Pb), Cromo (Cr) e Cobalto (Co) foi realizada em parceria com o Laboratório de Biogeoquímica Ambiental Wolfgang Christian Pfeiffer, da Fundação Universidade Federal de Rondônia – UNIR. Para tanto, as amostras de músculo branco foram agrupadas por ponto de coleta (pool) e pesadas até atingirem 10g (peso úmido) e levadas à estufa para secagem a 105°C por 48h e então levadas para forno mufla para calcinação à temperatura máxima de 400°C por 48h. As amostras foram digeridas quimicamente em chapa de aquecimento a 120°C pós-adição de ácido nítrico (HNO3). Após a secagem foi adicionado ácido clorídrico (HCl) às amostras e estas foram levadas à chapa de aquecimento a 120°C. Os procedimentos foram realizados de acordo com o método de Akan et al. (2012), com as seguintes adaptações: utilização de 8g de tecido, temperatura de 500°C por 4h para calcinação, e ácido perclórico na digestão química ao invés de ácido clorídrico. Após o resfriamento das amostras foi adicionado HCl 0,1 N (Normal) até o máximo de 15 mL. Quando necessário, as amostras foram filtradas utilizando funis de polipropileno e filtros de celulose. Após aproximadamente 12 h, as amostras foram levadas à leitura em espectrofotometria de absorção atômica por chama (Perkin-Elmer, AAS 400). Para controle analítico foram utilizadas amostras de referência certificadas de cada metal avaliado (SS2 – SCP SCIENCE). A bioacumulação do metal Mercúrio (Hg total) de cada animal foi mensurada pelo Laboratório de Biologia Ambiental – UFOPA, que gentilmente cedeu os resultados para 30 uma análise conjunta com os resultados referentes a análise de micronúcleos, ANEs e bioacumulação dos demais metais mensurados. Para tanto, foi pesado entre 15 mg e 45 mg de músculo de cada espécime e acrescentado 3 ml de HN0 3 concentrado e 0,3 ml de HCL 16 N e as amostras foram levadas a um agitador de tubos. Em seguida, as amostras foram aquecidas sobre placa aquecedora durante 4 horas a 121°C com ventilação constante e agitação a cada hora. A concentração de Hg total das amostras foi determinada em Espectrofotômetro de Fluorescência Atômica a Vapor Frio (Pichet et al. 1999). As concentrações de metais observadas nos músculos de traíras são apresentadas e comparadas com os limites máximos estabelecidos pela legislação brasileira – Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA – Portaria 685/98 e Decreto 55.871/65) em mg.kg-1 de tecido de peixe, para identificação dos metais que ultrapassam as concentrações permitidas para o consumo de pescado. 3.3 Biomarcadores de Genotoxicidade Amostras de sangue periférico foram coletadas de cada animal por punção da veia caudal com auxílio de seringa heparinizada. O sangue coletado foi transferido para lâminas histológicas limpas por meio do método de esfregaço. As extensões sanguíneas foram coradas com Giemsa e tampão fosfato pH 5,6 (Ferraro et al., 2004). A análise microscópica das lâminas foi feita sob aumento de 1000X. Duas lâminas de cada indivíduo foram identificadas por códigos e analisadas de forma cega por um único observador. Imagens dos micronúcleos e anormalidades nucleares eritrocíticas foram capturadas utilizando objetiva de imersão em microscópio Zeiss Axio CAM ERC 5S e câmera digital Canon Power Shot A650 IS. A determinação da frequência de micronúcleos (MN) e das anormalidades nucleares eritrocíticas (ANEs) foi realizada a partir da observação de 2000 eritrócitos periféricos por peixe (Carrasco et al., 1990; Udroiu, 2006). Os micronúcleos foram definidos como corpos redondos ou ovais intracitoplasmáticos não ligados ao núcleo principal, com um diâmetro 1/30-1/3 do núcleo principal e no mesmo plano óptico (Heddle, 1973; Schmid, 1975; Fenech, 2000; Bombail et al., 2001). Foram considerados 31 como ANEs todos os núcleos que não apresentaram a forma oval considerada normal para eritrócitos de peixes. A diferenciação entre as ANEs foi feita de acordo com o método de Carrasco et al. (1990), com as seguintes adaptações: núcleos lobados e segmentados foram separados em duas categorias distintas. As ANE foram então classificadas nas seguintes categorias: 1 – Forma de rim: núcleos com uma pequena invaginação em forma de fenda bem definida, de largura uniforme na membrana nuclear que se estende a uma profundidade apreciável para dentro do núcleo. 2 – Lobado: núcleos que apresentam formato irregular em consequência de evaginações que podem ser visualizadas como pequenas a grandes projeções da membrana nuclear, podendo formar dois ou mais lobos conectados. 3 – Segmentado: núcleos cuja estrutura aparece dividida em duas partes nitidamente separadas e delimitadas pela membrana nuclear. A região compreendida entre os segmentos parece estar destituída de material cromatínico. 4 – Vacuolado: núcleos que apresentam uma região clara destituída de qualquer material cromatínico visível no seu interior. 3.5. Tratamento estatístico Todas as variáveis (dados biométricos dos peixes, biomarcadores e variáveis ambientais) foram utilizadas simultaneamente na interpretação teórica do conjunto de dados obtidos via Análise de Componentes Principais (ACP) e análise de agrupamento (Cluster) para verificar a distribuição dos peixes quanto às variáveis ambientais e quais dessas variáveis se relacionam com a bioacumulação de metais e alterações genotóxicas nos peixes, respectivamente. Para a ACP foram utilizados fatores de carregamento cujos valores estavam acima de 0,4 (Dancey e Reidy, 2006). A primeira ACP teve caráter exploratório e foi feita utilizando dados de todos os tributários amostrados para verificar se haveria diferenciação entre os sistemas de água preta e de água branca. Em seguida foi feita uma ACP para os tributários de água preta e outra 32 para tributários de água branca, bem como uma análise de agrupamentos por ligação simples (Cluster) para verificar quais variáveis estariam interrelacionadas. Para analisar se há diferença nas respostas biológicas nos diferentes tributários amostrados dentro de cada sistema, foi realizada comparação pelo teste de KruskallWallis com comparações múltiplas utilizando correção de Dunn, com significância estatística p<0,05. Este tipo de análise foi aplicado de acordo com Wang e Riffel (2011) que recomendam a utilização de análise não paramétrica quando o conjunto de dados apresenta n<20 indivíduos. Considerando que o tamanho dos peixes representa um dos fatores que influencia a bioacumulação de metais (Belger e Forsberg, 2006), análises de correlação de Pearson foram feitas para verificar relação entre tamanho/peso e bioacumulação de metais. Como somente o mercúrio mostrou correlação, os peixes foram divididos em diferentes classes de tamanho cujas correlações entre peso e bioacumulação fossem ausentes e pudessem ser comparadas pelo teste de Kruskall-Wallis se isolando o efeito do tamanho. A comparação foi feita para os tributários de água preta e para os de água branca por diferentes classes de peso em relação às respostas biológicas. Os peixes foram separados em classes de peso (Tabela 2). Somente os tributários com n>3 foram comparados por classe de tamanho. Tabela 2. Número de indivíduos coletados ao longo de tributários do rio Negro durante os períodos de cheia e seca e do rio Solimões durante a seca de acordo com suas classes de tamanho. Número de indivíduos Classe de peso Bacia do rio Negro Bacia do rio Solimões 75 a 249g 250 a 499g 11 28 23 26 Acima de 500g 20 8 Testes de comparação foram realizadas no SigmaStat 3.5 e a elaboração de gráficos no SigmaPlot 11.0. Como estes programas não fazem análises multivariadas do tipo ACP e Cluster, estas foram realizadas no programa Statistica 10. 33 4. Resultados Para obtenção de um panorama geral foi efetuada primariamente uma análise de componentes principais (ACP) utilizando todas as variáveis obtidas no presente estudo: dados ambientais, biométricos e biológicos (pH, temperatura, condutividade, oxigênio, peso, micronúcleos, anormalidades nucleares eritrocíticas, mercúrio, cromo, cobalto, cobre, ferro, manganês, níquel, chumbo, zinco) e que serão descritas detalhadamente a seguir. Os resultados mostram que a influência das variáveis ambientais sobre as respostas biológicas e a distribuição dos peixes quanto a essas respostas diferem entre os sistemas de água preta e água branca, com clara separação entre os tributários do rio Negro e tributários do rio Solimões (figura 3). A ACP mostrou 55% de variância sendo explicada por dois fatores principais. O fator 1 agrupou as respostas genotóxicas micronúcleo e anormalidades nucleares eritrocíticas com a bioacumulação de zinco, ferro, cromo e cobalto; e com as variáveis ambientais pH, oxigênio dissolvido e condutividade elétrica. O fator 2 agrupou peso, bioacumulação de mercúrio, cobre, manganês, níquel, chumbo e temperatura (tabela 3). 34 Figura 3. Análise de componentes principais (ACP) dos biomarcadores e variáveis ambientais nos tributários do rio do Negro (círculo azul) e do rio Solimões (círculo verde). Os fatores 1 e 2 mostrados aqui representam 55% de variância dos dados. A variância explicada por cada fator é mostrada na Tabela 3. (Método de extração: Análise de Componentes Principais; rotação: Varimax; 6 casos). ss = rio Solimões no periodo de seca; nc = rio Negro no período de cheia; ns = rio Negro no período de seca. 35 Tabela 3. Cargas das coordenadas fatoriais das variáveis sobre os dois fatores principais resultantes da análise de componentes principais dos dados obtidos ao longo de tributários do rio Negro e do rio Solimões (Amazonas). Somente as cargas mais elevadas com valor acima de 0,40 são mostradas na tabela por representarem maior variância. Variáveis: °C (temperatura), ANE (Anormalidades Nucleares Eritrocíticas), Cdv (Condutividade), Co (Cobalto), Cr (Cromo), Cu (Cobre), Fe (Ferro), Hg (Mercúrio), Mn (Manganês), MN (Micronúcleos), Ni (Níquel), Pb (Chumbo), pH, Peso, Zn (Zinco). (Método de extração: Análise de Componentes Principais; rotação: Varimax; 6 casos). Variáveis #1 31.22% Peso #2 23.71% -0.671057 MN 0.665149 ANE 0.702535 Hg -0.604907 Cu -0.736199 Zn 0.877243 Fe 0.608792 Mn -0.883578 Ni -0.869745 Pb -0.793090 Cr -0.719444 Co -0.734050 pH -0.626336 O2 -0.632639 °C Cdv 0.823250 -0.655092 36 4.1. Caracterização físico-química dos ambientes de coleta Analisando os dados limnológicos, observa-se que os tributários do rio Negro se apresentaram com pH mais ácido durante o período de cheia (3,86 – 4,50), enquanto que durante a seca o pH dos tributários apresentou maior variação, com valores que abrangem desde a faixa de acidez até a faixa de neutralidade (4,81 – 7,06). O rio Unini, localizado entre as cidades de Barcelos e Manaus, apresentou pH=7,06, representando o valor mais alto entre os tributários do rio Negro. Por outro lado, as águas dos tributários do rio Solimões apresentaram pH tendendo ao neutro (6,17 – 6,95), exceto no lago Curupira (rio Japurá), onde as águas apresentaram característica ácida, com pH de 4,55 (Tabela 4). A concentração de O2 dissolvido foi variável nos tributários do rio Negro amostrados na seca (1,85 mg/L – 7,86 mg/L), enquanto que na cheia todos os tributários apresentaram valores baixos de O 2 (1,9 mg/L - 2,80 mg/L). Nos tributários do rio Solimões os teores de oxigênio pouco variaram e a maioria dos ambientes apresentou valores entre 5,42 a 7,15 mg/L, sendo maior no rio Madeira (Tabela 4). Os maiores valores de condutividade elétrica foram visualizados nos tributários do rio Solimões durante a seca, com destaque para o lago Grande Manacapuru e para o rio Madeira, com 59,40 e 57,90 µS.cm-1, respectivamente. Contudo, o lago Curupira, no rio Japurá (bacia do Solimões) apresentou valor igual a 10,96 µS.cm-1, sendo este valor muito próximo ao encontrado no lago Folharal (10,74 µS.cm-1) e igarapé Ariaú (10,45 µS.cm-1), ambos afluentes do rio Negro, amostrados durante a seca (Tabela 4). A temperatura superficial da água no rio Solimões esteve entre 25,8°C no lago Curupira e 31,8°C no lago Grande Manacapuru, já nos tributários do rio Negro esteve entre 26,7°C no rio Teia e 33,0°C no igarapé Ariaú (Tabela 4). 37 Tabela 4. Caracterização físico-química de tributários do rio Negro durante os períodos de cheia e seca e do rio Solimões durante a seca. pH O2 superficial (mg/L) Condutividade -1 (µS.cm ) Temperatura superficial (°C) rio Teia 3.86 1.90 24.90 26.7 rio Jurubaxi 4.45 2.10 14.50 27.3 rio Caurés 4.50 2.80 12.64 30.9 rio Uneuxi 5.20 5.10 11.60 32.0 igarapé Ariaú 4.93 7.96 10.45 33.1 rio Preta 4.81 1.85 11.82 28.9 lago Folharal 4.95 3.71 10.74 31.3 rio Unini 7.06 6.13 15.06 32.0 lago Paupixuna 6.17 5.85 29.09 29.6 lago Curupira 4.55 5.42 10.96 25.8 lago Coari 6.50 6.54 20.16 30.2 rio Purus 6.79 5.55 49.60 30.2 lago G. Manacapuru 6.63 6.90 59.40 31.8 rio Madeira 6.95 7.15 57.90 30.5 Solimões Seca 2011 Negro Seca 2012 Negro Cheia 2011 Período Local de coleta 4.2. Bioacumulação de metais em músculo de traíras e consumo de pescado 4.2.1. Zinco A bioacumulação de Zn foi maior nas H. malabaricus dos tributários do rio Negro em relação aos do rio Solimões (p=0,003). Nos peixes dos tributários do rio Negro os valores de bioacumulação ficaram entre 12,84 mg.kg-1 e 7,67 mg.kg-1, com média de 7,98 mg.kg-1, sendo as concentrações similares entre os peixes desses (p>0.400). A média de bioacumulação nos peixes coletados na cheia da água preta foi 8,66 mg.kg-1 e 7,58 mg.kg-1 na seca. Entretanto, houve similaridade na bioacumulação entre períodos sazonais do rio Negro (p= 0.571). Para os tributários do Solimões a média de bioacumulação foi 3,85 mg.kg-1. Na água branca, os valores ficaram entre 2,64 mg.kg-1 e 5,45 mg.kg-1, sendo a bioacumulação de Zn similar entre os tributários do Solimões (p>0.400). O rio Caurés e o lago do Folharal apresentaram valores mais altos do que os demais pontos. O Zn bioacumulado nos dois sistemas aquáticos apresentou 38 concentrações abaixo dos limites recomendáveis para consumo pela legislação brasileira, estabelecidos em 50,0 mg.kg-1. (Tabela 5, Figura 4a). 4.2.2. Cobre A bioacumulação de Cu foi mais elevada nos peixes coletados nos tributários do Solimões do que nos coletados em tributários do rio Negro (p=0,008). A concentração média de cobre para peixes dos tributários do rio Negro foi de 0,15 mg.kg-1, sendo as concentrações nos peixes similares entre os tributários do rio Negro (p>0.400). Por sua vez, peixes de tributários do rio Solimões apresentaram concentração média de 0,22 mg.kg-1 para o Cu, sendo a bioacumulação similar entre os tributários do rio Solimões (p>0.400). Os valores mais altos de Cu em tecido de peixes foram detectados nos tributários a montante do rio Solimões (lago Paupixuna/rio Juruá, lago Curupira/rio Japurá e lago Coari) e os demais tributários apresentaram valores entre 0,11 mg.kg -1 e 0,19 mg.kg-1. O Cu apresentou concentrações abaixo dos limites estabelecidos para consumo pela legislação brasileira (30,0 mg.kg -1) (Tabela 5, Figura 4b). 39 Tabela 5. Concentração de metais em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários dos rios Negro e Solimões (Amazonas). Hg: mercúrio; Cr: cromo; Cu: cobre; Zn: zinco; Mn: manganês; Fe: ferro; Pb: chumbo; Ni: níquel; Co: cobalto. Solimões Seca 2011 Negro Seca 2012 Negro Cheia 2011 Período Zn Cu Concentração de metais (mg.kg-1) Ni Pb Mn Fe Co rio Teia 7,67 0,12 0,35 0,00* 0,15 3,48 0,00* 0,08 1,08 rio Jurubaxi 7,10 0,18 0,32 0,10 0,15 2,86 0,00* 0,05 0,50 rio Caurés 11,20 0,14 0,56 0,51 0,40 6,85 0,00* 0,04 0,61 rio Uneuxi 7,60 0,11 0,32 0,18 0,33 2,92 0,00* 0,03 0,50 Igarapé Ariaú 5,53 0,14 0,24 0,00* 0,21 3,18 0,00* 0,05 0,38 rio Preta 4,26 0,14 0,32 0,47 0,21 2,86 0,00* 0,04 0,33 12,84 0,19 0,58 1,10 0,64 6,43 0,00* 0,04 0,37 rio Unini 7,67 0,15 0,21 0,19 0,35 3,36 0,00* 0,03 0,60 lago Paupixuna 5,45 0,29 0,52 0,92 0,75 3,29 0,15 0,11 0,53 lago Curupira 4,36 0,26 0,49 0,08 0,44 3,37 0,07 0,13 0,36 Lago Coari 2,82 0,21 0,36 0,00* 0,39 3,21 0,03 0,07 0,32 rio Purus 3,82 0,19 0,40 0,38 0,26 3,28 0,06 0,08 0,28 lago G. Manacap. 2,64 0,18 0,43 0,08 0,13 3,15 0,03 0,07 0,32 rio Madeira 4,01 0,17 0,35 0,20 0,32 3,39 0,08 0,09 0,24 50,0 30,0 5,0 2,0 LNE** LNE** LNE** 0,1 1,0 Local de coleta lago Folharal Valores recomendados para ingestão pela ANVISA Cr Hg * Abaixo do limite de detecção. **Limite não estabelecido 40 A B Figura 4. Concentração de zinco (A) e cobre (B) em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários dos rios Negro e Solimões (Amazonas). Os círculos sem preenchimento mostram os tributários do rio Solimões e os círculos com preenchimento mostram os tributários do rio Negro. As linhas -1 -1 tracejadas azuis mostram as concentrações máximas estabelecidas para consumo pela legislação brasileira para Zn (50 mg.kg ) e Cu (3,5 mg.kg ) – Portaria 685/98 e Decreto 55.871/65 da ANVISA. 41 4.2.3. Níquel A bioacumulação de Ni nos peixes avaliados foi similar entre os sistemas de água preta e branca (p=0.227), bem como entre os períodos hidrológicos do rio Negro (p=0.225). A concentração média de níquel foi de 0,36 mg.kg -1 para peixes dos tributários do rio Negro, sendo na cheia 0,41 mg.kg-1 e na seca de 0,33 mg.kg-1, havendo similaridade entre os tributários de água preta (p>0.400). Para os tributários do Solimões a média de bioacumulação de Ni nos peixes foi 0,41 mg.kg-1, sendo similar entre os tributários de água branca (p>0.400). Na água preta, dois tributários do rio Negro amostrados no período de seca apresentaram as menores concentrações de Ni: rio Unini e igarapé Ariaú. Peixes do lago do Folharal apresentaram a maior bioacumulação (0,58 mg.kg-1), seguido pelos peixes do rio Caurés (0,56 mg.kg-1). Os outros pontos do rio Negro apresentaram peixes com bioacumulação entre 0,32 e 0,41 mg.kg-1. Dentre os tributários do rio Solimões, a bioacumulação variou entre 0,35 mg.kg-1 e 0,52 mg.kg-1. As concentrações de Ni foram abaixo dos limites estabelecidos para consumo pela ANVISA (5,0 mg.kg-1) (Figuras 5a). 4.2.4. Chumbo A bioacumulação de Pb foi similar entre os peixes de água preta e de água branca, bem como entre diferentes períodos hidrológicos dos tributários do rio Negro (p=0.847). A bioacumulação média para os tributários de água preta foi de 0.31 mg.kg-1, sendo na cheia 0.20 mg.kg-1 e na seca 0.39 mg.kg-1, com bioacumulação similar entre os tributários (p>0.400). Para os tributários do rio Solimões a média de bioacumulação de Pb nos peixes foi de 0.15 mg.kg-1, sendo similar a concentração observada nos tributários do rio Solimões (p>0.400). O único tributário que apresentou concentração acima de 1,0 mg.kg-1 foi o lago do folharal, no rio Negro , seguido do lago Paupixuna/rio Juruá, de água branca, com 0,92 mg.kg-1. Os demais tributários ficaram com valores entre 0,08 mg.kg-1 (lagos Grande Manacapuru e Curupira/rio Japurá) e 0,51 mg.kg -1 (rio Caurés), não sendo detectado no rio Teia e igarapé Ariaú, do rio Negro, e lago Coari, no rio Solimões. As concentrações de Pb ficaram abaixo dos limites estabelecidos para consumo pela ANVISA (2,0 mg.kg-1) (Figuras 5b). 42 A B Figura 5. Concentração de níquel (A) e chumbo (B) em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários dos rios Negro e Solimões (Amazonas). Os círculos sem preenchimento mostram os tributários do rio Solimões e os círculos com preenchimento mostram os tributários do rio -1 Negro. As linhas tracejadas azuis mostram os valores máximos estabelecidos pra consumo pela legislação brasileira para Ni (5,0 mg.kg ) e Pb (2,0 -1 mg.kg ) – Portaria 685/98 e Decreto 55.871/65 da ANVISA. 43 4.2.5. Manganês O metal Mn apresentou similaridade quanto a sua bioacumulação entre peixes de água preta e água branca, bem como entre cheia e seca dos tributários do rio Negro (p=0.420). A média de bioacumulação de 0,31 mg.kg-1 foi observada para os peixes dos tributários do rio Negro, sendo na cheia 0,23 mg.kg-1 e na seca de 0,35 mg.kg-1. Houve similaridade na bioacumulação de Mn entre os tributários de água preta (p>0.400). Nos tributários do rio Negro a bioacumulação de Mn se apresentou entre 0,15 mg.kg-1 (rios Teia e Jurubaxi) e 0,64 mg.kg -1 (lago do Folharal). Para os tributários de água branca, a média de bioacumulação observada nos peixes foi de 0,31 mg.kg-1, sendo similar entre os tributários do rio Solimões (p>0.400). Na água branca, os valores ficaram entre 0,13 mg.kg-1 (lago Grande Manacapuru) e 0,75 mg.kg -1 (lago Paupixuna/rio Juruá). O Mn não possui limites estabelecidos para consumo pela legislação brasileira (Figura 6a). 4.2.6. Ferro A bioacumulação de Fe foi similar entre água preta e água branca (p=0.620) e entre cheia e seca dos tributários do rio Negro (p=0.667), sendo a bioacumulação média de Fe foi 3,28 mg.kg-1 para os tributários do rio Solimões e 3,99 mg.kg-1 para os tributários do rio Negro, sendo na cheia 4,40 mg.kg-1 e na seca de 3,75 mg.kg-1. Na comparação entre os tributários do rio Negro (p>0.400) e entre os tributários do rio Solimões (p>0.400) houve similaridade. Peixes do rio Caurés e o lago do Folharal apresentaram bioacumulação de Fe acima de 6,0 mg.kg-1 e nos demais tributários a bioacumulação medida pouco variou, ficando entre 2,86 mg.kg-1 e 3, 75 mg.kg-1. O Fe não possui limites estabelecidos para consumo pela legislação brasileira (Figura 6b). 4.2.7. Cobalto A bioacumulação de Co por sua vez, foi detectada somente nos tributários de água branca, sendo maior do que nos tributários do rio Negro (p<0.001), onde não foi detectada a presença de Co nos tecidos de traíras. A concentração média de Co na água branca foi 0,05 mg.kg-1, com concentrações entre 0,03 mg.kg-1 e 0,15 mg.kg-1, ficando o lago Paupixuna/rio Juruá com a maior incidência deste metal. O Co não possui limites estabelecidos para consumo pela legislação brasileira (Figura 6c). 44 A B C Figura 6. Concentração de manganês (A), ferro (B) e Cobalto (C) em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários dos rios Negro e Solimões (Amazonas). Os círculos sem preenchimento mostram os tributários do rio Solimões e os círculos com preenchimento mostram os tributários do rio Negro. Para esses metais não há valores máximos estabelecidos pra consumo pela legislação brasileira – Portaria 685/98 e Decreto 55.871/65 da ANVISA. 45 4.2.8. Cromo Para o Cromo, as Hoplias dos tributários do rio Solimões apresentaram bioacumulação mais acentuada do que os peixes coletados em tributários do rio Negro (p=0,003). A bioacumulação de Cr foi similar na comparação entre os tributários do rio Negro (p>0.400), similarmente ao observado entre os tributários do rio Solimões (p>0.400). A média de bioacumulação de cromo foi de 0,05 mg.kg -1 em Hoplias de tributários do rio Negro, sendo 0,06 mg.kg-1 para o período de cheia e 0,04 mg.kg -1 para o período de seca, e 0,09 mg.kg-1 para tributários do rio Solimões (Figura 7a). Concentrações de Cromo acima dos limites recomendados para consumo pela ANVISA (0,1 mg.kg-1) foram detectadas nas Hoplias do lago Curupira (0,13 mg.kg-1), no rio Japurá e lago Paupixuna (0,11 mg.kg-1), no rio Juruá. Nos outros tributários dessa bacia os valores apresentaram-se próximos a esses limites, em especial no rio Madeira e no rio Purus. Dentre os tributários do rio Negro, o rio Teia também apresentou valores próximos aos limites máximos permissíveis pela Legislação Brasileira. Os menores valores de bioacumulação de Cromo foram observados nos peixes dos rios Uneuxi e Unini, ambos tributários do Negro (figura 7a). 4.2.9. Mercúrio A bioacumulação de Hg foi maior nos tributários do rio Negro em relação aos tributários do rio Solimões (p=0,002). Entre os tributários do rio Negro a bioacumulação de Hg foi similar (Figura 9a), ocorrendo o mesmo entre os tributários do rio Solimões (p>0.400) (Figura 9b). Somente peixes do rio Teia, no alto rio Negro, apresentaram bioacumulação de mercúrio acima do limite indicado pela Legislação Brasileira para consumo de peixes predadores: 1,0 mg.kg-1 (figuras 7b, 8 e 9a). Os demais tributários do rio Negro apresentaram valores entre 0,33 mg.kg -1 e 0,61 mg.kg-1, enquanto que nos tributários do rio Solimões os valores de bioacumulação nos peixes ficaram entre 0,24 mg.kg-1 e 0,53 mg.kg-1, sendo que os tributários de água branca mais a montante do rio Solimões apresentaram valores mais elevados de Hg em relação aos da jusante (figuras 7b). A média geral de bioacumulação de Hg nos peixes foi de 0,54 mg.kg -1 para os tributários do rio Negro, sendo 0,73 mg.kg-1 para o período de cheia e 0,43 mg.kg -1 para o período de seca, e 0,34 mg.kg -1 para os tributários do rio Solimões. A bioacumulação de Hg foi similar entre períodos sazonais dos tributários do rio Negro (p=0.071). 46 A B Figura 7. Concentração de cromo (A) e mercúrio (B) em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários dos rios Negro e Solimões (Amazonas). Os círculos sem preenchimento mostram os tributários do rio Solimões e os círculos com preenchimento mostram os tributários do rio Negro. As linhas tracejadas azuis mostram os valores máximos estabelecidos pra consumo pela legislação brasileira para Hg em peixes carnívoros (1,0 mg.kg-1 para peixes carnívoros) e Cr (0.1 mg.kg-1) - Portaria 685/98 e Decreto 55.871/65 da ANVISA. 47 Como a concentração de Hg foi mensurada por indivíduo, plotou-se a distribuição das concentrações de Hg em cada peixe a fim de compará-las com os limites estabelecidos para consumo de pescado pela ANVISA. É possível visualizar que 3,5% dos peixes apresentaram concentração de Hg acima da faixa permitida pela ANVISA, sendo 2 peixes no rio Teia, 1 no rio Jurubaxi e 1 no rio Unini, todos tributários do rio Negro. 96,5% dos peixes estavam dentro do limite considerado seguro para o consumo humano (109 peixes) (figura 8). Figura 8. Concentração de Mercúrio (Hg) em tecido muscular de traíras coletadas ao longo de tributários do rio Negro durante os períodos de cheia e seca e do rio Solimões durante a seca (Amazonas). Cada ponto no gráfico representa um indivíduo analisado. A linha azul mostra os valores recomendados para consumo pela ANVISA. A linha vermelha mostra os valores recomendados para consumo pela OMS. 48 Numa análise geral, considerando todos os peixes coletados, foi observado que somente a bioacumulação de Hg (dentre todos os metais avaliados) mostrou correlação positiva com o tamanho/peso dos peixes na água preta e na água branca (p<0,001). Comparando as diferentes classes de peso, verificou-se que a bioacumulação de Hg aumenta de acordo com o aumento no tamanho dos peixes. Nos tributários de água preta os peixes acima de 500g apresentaram concentrações maiores do que os peixes de peso entre 75 a 249g e os peixes entre 250 a 500g (p=<0,001) (Figura 9a). Poucos peixes com tamanho acima de 500g da água preta ultrapassaram os limites da ANVISA estabelecidos para mercúrio em peixes. Na água branca os peixes acima de 500g apresentaram concentrações maiores do que os peixes de peso entre 75 a 249g (p=0.003) (Figura 9b). Para os outros metais (Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn) a bioacumulação não aumentou com o aumento de tamanho dos peixes. 49 A B Figura 9. Bioacumulação de mercúrio por diferentes classes de peso nos tributários do rio Negro (A) e nos tributários do rio Solimões (B). Diferença significativa entre a x b. As linhas azuis mostram os valores recomendados pela ANVISA. 50 Entre os peixes de peso entre 75 a 249g, a bioacumulação de todos os metais analisados Co, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Zn foi similar entre tributários de água branca (p>0.05). O Cr por sua vez teve maior bioacumulação no rio Madeira do que no lago Coari (p<0,05) (figura 10). Entre os tributários de água preta não foi feita comparação para esta classe entre tributários pelo fato de apenas uma localidade apresentar n > 3. Figura 10. Bioacumulação de Cromo em peixes de peso entre 75 a 249g nos tributários do rio Solimões. Nenhum peixe mostrou valores acima dos recomendados pela ANVISA. Diferença significativa entre a x b. Somente tributários com n>3 são mostrados. Entre os peixes de peso entre 250 a 499g, a bioacumulação dos metais Co, Cr, Co, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Zn foi similar entre os tributários de água preta (p>0.05) e similar entre tributários de água branca (p>0,05). A bioacumulação de cromo, cujas concentrações ultrapassaram os limites da ANVISA nos lagos Paupixuna e Curupira, apresentou diferença na comparação entre os tributários do rio Negro, sendo maior no rio Jurubaxi e Igarapé Ariaú em relação ao rio Unini (p<0,05) (figura 11a). Entre os tributários do rio Solimões, o rio Purus teve maior bioacumulação de Cromo em relação aos lagos Coari e Grande Manacapuru (figura 11b). A bioacumulação de Hg, cujas concentrações ultrapassaram os limites da ANVISA no rio Teia, apresentou diferença na comparação entre os tributários do rio Negro, sendo maior nos rios Uneuxi e Caurés em relação ao igarapé Ariaú (figura 11c). 51 A B C Figura 11. Bioacumulação de Cromo em peixes de peso entre 250 a 499g nos tributários do rio Negro (A) e Solimões (B). Bioacumulação de mercúrio em peixes de peso entre 250 a 499g nos tributários do rio Negro (C) Nenhum peixe mostrou valores acima dos recomendados pela ANVISA. Diferença significativa entre a x b. Somente tributários com n>3 são mostrados. Entre os peixes de peso acima de 500g a bioacumulação dos metais Co, Cr, Co, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Zn foi similar entre os tributários de água preta (p>0,05) e entre os tributários de água branca (p>0,05). 52 4.3. Biomarcadores de genotoxicidade A análise de esfregaços sanguíneos de Hoplias malabaricus coletados em tributários dos rios Negro e Solimões revelaram que a maior parte das células apresentou morfologia nuclear característica (Figura 12a; Tabela 6), contudo foram observadas células micronucleadas (Figura 12b); núcleos em forma de rim (Figura 12c); núcleos lobados (Figura 12d); núcleos segmentados (Figura 12e) e núcleos vacuolados (Figura 12f). Figura 12. Danos genotóxicos em Hoplias malabaricus coletados em tributários dos rios Negro e Solimões. Células eritrocíticas normais (A); Célula micronucleada (B); Núcleo em forma de rim (C); Núcleo lobado (D); Núcleo segmentado (E); Núcleo Vacuolado (F). Fotos do autor. 53 Houve diferença na frequência das respostas genotóxicas entre os tributários de água preta e água branca (Tabela 6), sendo que as frequências de MNs foram mais expressivas nos tributários do Negro se comparados com os tributários do rio Solimões (p<0,001). As frequências das outras ANEs também foram maiores nos tributários de água preta (p<0,001). Na água preta, as frequências de ANEs e MNs entre os períodos sazonais foram similares, ou seja, seca e cheia nos tributários do Negro (p=1,000). Também houve similaridade na comparação entre todos os tributários deste rio (p=1,000). Na água branca, embora tenha sido observada tendência a maiores alterações nos seguintes pontos de coleta: rio Madeira > lago Grande de Manacapuru > rio Purus > lago Coari > lago Curupira/rio Japurá > lago Paupixuna/rio Juruá, as frequências de danos genotóxicos (ANE e MN) foram similares nos peixes coletados nos tributários do rio Solimões (p=1,000). Tabela 6. Frequências médias (%) de eritrócitos normais, micronucleados (MN) e alterações nucleares (ANE) em eritrócitos de Hoplias malabaricus em tributários dos rios Negro e Solimões. Solimões Seca 2011 Negro Seca 2012 Negro Cheia 2011 Período Local de coleta Células normais ANE MN rio Teia 98,05 1,62 0,33 rio Jurubaxi 98,51 1,03 0,46 rio Caurés 99,21 0,55 0,24 rio Uneuxi 95,24 4,38 0,38 rio Ariaú rio Preta lago Folharal rio Unini lago Paupixuna – rio Juruá lago Curupira – rio Japurá lago Coari rio Purus lago Grande de Manacapuru rio Madeira 97,64 96,45 93,46 97,69 99,36 99,39 98,94 98,51 98,70 98,75 1,86 3,06 5,06 1,98 0,55 0,47 0,85 1,23 1,03 0,78 0,50 0,49 1,48 0,33 0,09 0,14 0,21 0,26 0,27 0,47 54 A alteração nuclear do tipo “núcleo vacuolado” foi observada em grande parte dos tributários do rio Negro, exceto no rio Caurés, na cheia, e rios Ariaú e Preta, na seca (figura 13). Na bacia do Solimões “núcleos vacuolados” foram verificados somente no lago Coari, em baixa proporção (figura 13). A anormalidade nuclear do tipo “núcleo segmentado” não foi detectada no rio Caurés, na cheia dos tributários do rio Negro, bem como nos rios Purus e Madeira, na bacia do Solimões, na seca (figura 13). De maneira geral, a alteração “núcleo segmentado” foi menos frequente (2,8%) e a ocorrência de núcleos vacuolados representou 7,9% de ocorrência dentre os tipos de ANE, sendo verificada com maior frequência na seca do rio Negro em relação ao período de cheia e aos tributários do Solimões. As alterações núcleos em forma de rim, núcleo lobado e micronúcleo foram as mais frequentes, representando em média 31,3%, 30,2% e 27,7%, respectivamente, das alterações genotóxicas observadas. (figura 13). Analisando a frequência de danos genotóxicos por tributário (figura 13), verificou-se que dentre os peixes coletados na bacia do rio Negro, no rio Jurubaxi foram verificados todos os tipos de anormalidades genotóxicas, sendo as mais comumente detectadas os MNs (44,8%), seguidos de núcleos lobados (22,1%) e núcleos em forma de rim (21,4%). Núcleos segmentados (8,3%) e vacuolados (3,4%) foram pouco frequentes. Para o rio Teia, foram mais frequentes os núcleos lobados (39,2%), núcleo em forma de rim (31,5%) e micronúcleos (20,8%), respectivamente. Núcleos segmentados (4,6%) e vacuolados (3,8%) foram menos frequentes. Para o rio Caurés somente foram verificados núcleo lobados (21,8%), núcleos em forma de rim (34,5%) e MNs (43,6%), sendo este último tipo de dano o mais comum para este tributário. Peixes do rio Uneuxi foram os que mais apresentaram anormalidades do tipo núcleo vacuolado (64,8%). As outras anormalidades foram detectadas com menor expressão, em especial o tipo núcleo segmentado (2,7%). No tributário Ariaú, não foram detectados núcleos vacuolados, sendo os núcleos segmentados menos frequentes (1,9%), e os mais frequentes núcleos em forma de rim (39,8%), núcleos lobados (31,5%) e MNs (26,7%), respectivamente. No rio Preta não foram observados, também, núcleos vacuolados. Núcleos segmentados foram menos frequentes (0,9%), e os mais frequentes núcleos em forma de rim (46,3%), núcleos lobados (36,8%) e MNs 55 (16,0%). Para o lago do Folharal verificou-se núcleos em forma de rim (30,4%), MNs (29,2%), núcleos vacuolados (19,6%) e núcleos lobados (18,8%) como os mais frequentes, respectivamente. E para o rio Unini, núcleos em forma de rim (42,8%) e núcleos lobados (31,3%) foram os mais frequentes, seguidos de núcleos vacuolados (19,6%). Núcleos segmentados (2,5) foram poucos frequentes e, neste tributário foi verificada a menor frequência de MN dentre todos os pontos analisados neste trabalho: 1,7% de todos os danos genéticos observados para este tributário (figura 13). Para água branca, o lago Paupixuna apresentou maior incidência os danos: núcleo em forma de rim (43,6%), seguidos de núcleos lobados (37,2%), MNs (16,7%) e núcleo segmentado (2,6%), sendo esse último tipo pouco comum. No lago Curupira, a maior incidência foi de núcleos lobados (48,0%), MNs (32,0%) e núcleos em forma de rim (18,0%), respectivamente. Núcleos vacuolados não foram observados e núcleos segmentados foram pouco frequentes (2,0%). O lago Coari foi o único que apresentou núcleo vacuolado na água branca, embora em pouca frequência: 1,2%. Núcleos lobados (37,1%), núcleos em forma de rim (29,9%), bem como os MNs (24,8%) foram os mais frequentes, respectivamente. Núcleos segmentados ocorreram com frequência baixa de 7,0%. Nos peixes do rio Purus, somente três tipos de anormalidades genotóxicas foram detectadas: núcleo lobado (44,5%), núcleo em forma de rim (33,6%) e MNs (21,9%). O lago Grande Manacapuru apresentou perfil semelhante ao encontrado para o rio Purus, com ocorrência de núcleo lobado (39,5%), núcleo em forma de rim (32,6%) e MNs (26,9%). Entretanto, também apresentou núcleos segmentados, embora em baixíssima frequência (0,9%). No rio Madeira, os peixes apresentaram os MNs como a mais frequente alteração genotóxica (59,3%), sendo esse o tributário que mais apresentou esse tipo de dano. Núcleos em forma de rim (20,7) e núcleos lobados (20,0%) foram também os outros dois únicos tipos de ANE observados para este tributário (figura 13). 56 (%) Figura 13. Frequência de ocorrência dos danos genotóxicos (%) observados em eritrócitos de Hoplias malabaricus nos tributários dos rios Negro e Solimões. Núcleos em forma de rim (NR), lobados (NL) segmentados (NS), vacuolados (NV), micronúcleos (MN). 57 No sistema de água preta, verificou-se diferença na frequência de MN do lago do Folharal em relação aos rios Caurés e Unini (p<0,05). Para os demais pontos as frequências de MN foram similares (figura 14a). Na água branca, houve diferença na frequência de MN entre o rio Madeira e o lago Paupixuna, no rio Juruá (figura 14b). A B Figura 14. Frequências (%) de micronucleados (MN) em eritrócitos de Hoplias malabaricus em tributários dos rios Negro (A) e Solimões (B). Diferença significativa entre a x b. Somente tributários com n>3 são mostrados. 58 Para as frequências de ANE, no sistema de água preta verificou-se diferença na frequência do lago do Folharal em relação aos rios Caurés e Jurubaxi, entre Caurés e Jurubaxi e entre Uneuxi e Jurubaxi (p<0,05) (Figura 15). Para os demais pontos as frequências de MN foram similares. Na água branca, houve similaridade na frequência de ANE entre todos os tributários amostrados (p>0,05). Figura 15. Frequências (%) de Anormalidade Nucleares Eritrocíticas (ANE) em eritrócitos de Hoplias malabaricus em tributários dos rios Negro. Diferença significativa entre b x e, b x d, c x d, c x e. Somente tributários com n>3 são mostrados. Comparando os tributários analisados por diferentes classes de peso, verificouse que para a classe de peso de 75 a 249g houve similaridade na frequência de ANE (p=0,628) e de MN (p=103) entre os tributários de água branca. Os tributários de água preta não foram analisados por conta do n<3. 59 Para a classe de peso de 250 a 499g houve diferença significativa na frequência de ANE (figura 16a). Entre os tributários de água preta (p<0,05) e similaridade entre as frequências de MN (p>0,05). Para os tributários de água branca houve similaridade na frequência de ANE (p=0,115) e para a frequência de MN houve diferença entre o lago Grande Manacapuru e o lago Coari (p<0,05) (figura 16b). Para a classe de peso acima de 500g, a frequência de MN (p=0,164) e ANE (p=0,711) dos peixes de tributários do rio Solimões e a frequência de MN (p=1,000) e ANE (p=0,143) dos peixes de tributários do rio Negro foram similares. Figura 16. Frequências (%) de Anormalidade Nucleares Eritrocíticas (ANE) em eritrócitos de Hoplias malabaricus da classe de peso de 250 a 500g em tributários dos rios Negro (A). Diferença significativa entre a x b. Frequência de eritrócitos micronucleados (MN) entre tributários dório Solimões (B). Diferença significativa entre a x b. Somente tributários com n>3 são mostrados. 60 Mediante as diferenças evidenciadas nas respostas dos sistemas de água preta e água branca, procedeu-se uma análise de componentes principais para os tributários do rio Negro e outra para os tributários do rio Solimões. Dois fatores principais explicaram as interações entre variáveis ambientais e biológicas (tabela 7). No sistema de água preta, o fator 1 agrupou a maioria das variáveis: Peso, MN, ANE e bioacumulação de Hg, Cu, Zn, Fe, MN, Pb e temperatura e condutividade elétrica. As variáveis bioacumulação de Ni, Cr e Co, pH e O2 dissolvido que ficaram agrupadas no fator 2. No sistema de água branca quase todas as variáveis foram agrupadas no fator 1 (Peso, MN, ANE e bioacumulação de Hg, Cu, Zn, MN, Ni, Cr, Co, pH, O2, temperatura e condutividade elétrica), com exceção da bioacumulação de chumbo e de ferro, que se agruparam no fator 2. Os metais mercúrio e o cromo cujas concentrações estiveram acima dos limites da ANVISA, bem como os demais elementos metálicos, estão relacionados à influência sobre as respostas genotóxicas (ANE e MN). Apesar de mostrar que os metais interferem nas respostas genotóxicas tanto nos peixes de água preta quanto de água branca, quando as variáveis foram plotadas em gráficos de projeção, a ACP evidenciou que no sistema de águas pretas a bioacumulação de metais está mais próxima das respostas genotóxicas do que no sistema de águas brancas. Nos tributários do rio Solimões as características físicoquímicas do ambiente parecem exercer maior bloqueio sobre a ação genotóxica dos metais, enquanto que nos tributários do rio Negro as variáveis limnológicas parecem favorecer a bioacumulação e seus efeitos genotóxicos (Figura 17a, b). 61 Tabela 7. Cargas das coordenadas fatoriais das dezesseis variáveis sobre os dois fatores principais resultantes da análise multivariada na análise por bacia dos organismos coletados ao longo de tributários do rio Negro e do rio Solimões (Amazonas). A matriz de carregamento foi adaptada de modo a que as colunas aparecem em ordem decrescente de variância explicada por fatores. Somente as cargas mais elevadas com valor acima de 0,47 são mostradas na tabela por representarem maior variância. (Método de extração: Análise de Componentes Principais; rotação: Varimax; 6 casos.) Variáveis: °C (temperatura), ANE (Anormalidades Nucleares Eritrocíticas), Cdv (Condutividade), Co (Cobalto), Cr (Cromo), Cu (Cobre), Fe (Ferro), Hg (Mercúrio), Mn (Manganês), MN (Micronúcleos), Ni (Níquel), Pb (Chumbo), pH, Peso, Zn (Zinco). Negro Variáveis Peso #1 41.0% Solimões #2 25.0% #1 61.0% 0.473930 Variáveis Peso 0.950345 MN -0.762252 MN -0.799458 ANE -0.612541 ANE -0.761962 Hg 0.580484 Hg 0.810570 Cu -0.539643 Cu 0.968767 Zn -0.698061 Zn 0.820143 Fe -0.703318 Fe Mn -0.945395 Mn 0.843637 Ni 0.872621 Ni Pb 0.679506 -0.893768 Pb -0.921923 #2 17.0% -0.808478 Cr 0.639440 Cr 0.886439 Co -0.719076 Co 0.729004 pH -0.781572 pH -0.754434 O2 -0.699300 O2 -0.704961 °C 0.666716 °C -0.747393 Cdv 0.473930 Cdv -0.714179 62 A B Figura 17. Projeção de todas as variáveis avaliadas em Hoplias malabaricus coletadas em tributários do rio Negro (A) e projeção de todas as variáveis avaliadas em Hoplias malabaricus coletadas em tributários do rio Solimões (B). Variáveis: °C (temperatura), ANE (Anormalidades Nucleares Eritrocíticas), Cdv (Condutividade), Co (Cobalto), Cr (Cromo), Cu (Cobre), Fe (Ferro), Hg (Mercúrio), Mn (Manganês), MN (Micronúcleos), Ni (Níquel), Pb (Chumbo), pH, Peso, Zn (Zinco). (Método de extração: Análise de Componentes Principais; rotação: Varimax; 6 casos). 63 A partir dos fatores obtidos (tabela 7) foram plotados gráficos para verificar a distribuição dos peixes em relação à análise conjunta das variáveis ambientais, biométricas e biológicas, representada pelos tributários do rio Negro (figura 18a) bem como para os tributários do Solimões (figura 18b). No Negro, os tributários cujas respostas apresentam maiores semelhanças entre si foram os rios Preta, Uneuxi, Unini e igarapé Ariaú, amostrados durante o período de seca. Esses tributários formaram um agrupamento que ficou separado dos demais tributários amostrados: rio Caurés, rio Jurubaxi e rio Teia, amostrados durante período de cheia. O lago do Folharal também ficou claramente separado dos outros pontos amostrados durante período de seca (figura 18a). Na bacia do rio Solimões se observou um agrupamento entre os peixes coletados no lago Coari, lago Grande de Manacapuru, rio Purus e Madeira. Os lagos Paupixuna, no rio Juruá, e Curupira, no rio Japurá, ficaram claramente separados dos demais pontos amostrados (figura 18a). 64 A B Figura 18. Análise de componentes principais (ACP) dos biomarcadores e variáveis ambientais nos tributários do rio do Negro (A) e do rio Solimões (B). Os fatores 1 e 2 mostrados aqui representam 66% de variância dos dados para o rio Negro e 78% de variância para o Solimões. Os círculos mostram os agrupamentos formados nos tributários do rio Negro (azul) e do rio Solimões (verde). Os pontos não circulados não se formaram agrupamentos. A variância explicada por cada fator é mostrada na Tabela 7. (Método de extração: Análise de Componentes Principais; rotação: Varimax; 6 casos). ss = rio Solimões no periodo de seca; nc = rio Negro no período de cheia; ns = rio Negro no período de seca. 65 A análise de agrupamentos demonstrou que os metais Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni e Pb estão relacionados com a ocorrência de micronúcleos nos tributários de ambos os sistemas avaliados (figura 19a, b). Esse agrupamento exerce maior efeito sobre a incidência de MN do que sobre a incidência das demais ANE. Ainda, a incidência de ANE encontra-se mais distante desse agrupamento na água preta (distância<6,5) do que na água branca, na qual as ANEs se encontram bem mais próximas do agrupamento principal de respostas biológicas (distância < 2). As variáveis ambientais, como pH e O2 exercem ação sobre a bioacumulação de metais e respostas genotóxicas em ambas as bacias e a condutividade elétrica não é mostrada nas figuras por estar muito distante e impedir a visualização dos outros agrupamentos. As distâncias de agrupamentos mostram ainda que nos dois sistemas aquáticos a bioacumulação tanto do Zn quanto do Fe exerce menor influência que os demais metais sobre as respostas genotóxicas. As concentrações de zinco exercem influência ainda mais isolada do que as demais variáveis sobre as respostas observadas nos tributários do rio Negro em relação aos tributários do Solimões (figura 19a, b). Todavia, se novas variáveis, como DOC, forem incluídas na análise, todo este panorama pode ser modificado. 66 A B b Figura 19. Dendograma das variáveis ambientais e biomarcadores observados nas traíras coletadas nos tributários do rio Negro (A) e Solimões (B). Variáveis: ANE (Anormalidades Nucleares Eritrocíticas), Co (Cobalto), Cr (Cromo), Cu (Cobre), Fe (Ferro), Hg (Mercúrio), Mn (Manganês), MN (Micronúcleos), Ni (Níquel), O2 (Oxigênio), Pb (Chumbo), pH, Zn (Zinco) (Medida de distância: euclidiana; regra de amalgamação: Linkage Único). 67 5. Discussão A bacia amazônica é constituída por um complexo sistema de drenagem formado por cerca de sete mil tributários que deságuam no rio Solimões/Amazonas e formam um complexo sistema caracterizado por águas claras, pretas e brancas (Sioli, 1950; Santos e Ferreira, 1999; Goulding et al., 2003). Cada um destes tipos de água apresenta características bastante peculiares, as quais podem interferir no processo de biodisponibilidade e influenciar a bioacumulação de metais em organismos vivos (Belger e Forsberg, 2006; Beltran-Pedreros, 2011). Os metais podem chegar aos corpos aquáticos por três vias principais: (1) deposição de material particulado atmosférico, (2) escoamento superficial da água da chuva após lavagem e lixiviação do solo e (3) lançamento direto de despejos industriais e urbanos nos meios hídricos (Föstner e Wittmann, 1983). Na Amazônia, vários sítios de liberação de metais nos ambientes aquáticos estão relacionados à mineração de ouro, de manganês e descargas de efluentes industriais das grandes cidades e de acordo com Siqueira et al. (2006), existe uma associação da matéria orgânica com o níquel, o cobalto e o zinco, indicando que a disponibilidade desses metais pode ser influenciada, em parte, pela presença de moléculas orgânicas nos sistemas amazônicos. Sedimentos superficiais do rio Amazonas podem ser considerados como sítios de ocorrência natural dos elementos metálicos, mesmo quando não há influência de fontes poluidoras na liberação destes para o sistema aquático (Siqueira et al., 2006). Situação similar deve ocorrer em grande parte dos tributários analisados por este trabalho, em especial os do rio Negro, os quais sofrem baixa interferência humana por serem áreas longínquas e de pouca densidade populacional, haja vista que o estado do Amazonas detém um dos mais baixos índices de densidade demográfica do país, com 2,23 habitantes por quilômetro quadrado, conforme dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, Censo 2010). Roulet et al. (1999) mostraram que mais 68 de 97% do Hg acumulado em solos da bacia do Tapajós são oriundos de fontes naturais. Ainda, níveis excepcionalmente elevados de mercúrio (44-212 ng/g) foram detectados nos solos da bacia do rio Negro, com pouca atividade de mineração de ouro (Forsberg et al., 1999) e o mesmo pode estar acontecendo no lago Paupixuna, do rio Juruá, região onde não há histórico de exploração de ouro (PNPO, 1999) e seus peixes apresentaram bioacumulação de Hg e outros metais, como Cr, cujas concentrações no tecido de peixes ultrapassou os limites estabelecidos como seguros pela legislação da ANVISA (1965 e 1998). Interessante ressaltar que o elemento metálico Cobalto foi encontrado apenas em Hoplias malabaricus de tributários do rio Solimões, podendo a bioacumulação deste metal estar relacionada com a formação rochosa dos terrenos por onde percolam seus rios (Maurice-Bourgoin et al., 1999). A ocorrência e a abundância de metais nos rios Solimões, Negro, Purus, Madeira, Trombetas, Tapajós e Amazonas variam de acordo com o terreno por onde percolam os rios amazônicos, sendo os Andes a principal fonte da maioria dos metais transportados ao longo do rio Solimões-Amazonas e seus afluentes de origem andina, nos quais os metais são transportados principalmente em forma de partículas, enquanto que as formas metálicas dissolvidas predominam no rio Negro e seus afluentes, onde muitos metais formam complexos com a matéria orgânica dissolvida (Seyler e Boaventura, 2001). Na Amazônia, apesar das investigações ambientais e a preocupação com a saúde relacionadas ao mercúrio na água, biota e sedimentos estarem mais avançada, outros elementos começam a ganhar mais atenção. A distribuição de vários elementos: Ba, Cd, Co, Cs, Cu, Mn, Mo, Ni, Pb, Sr, U, V e Zn, foi investigada em material dissolvido e suspenso de águas superficiais nos rios Mamoré e Beni, formadores do rio Madeira, na parte boliviana da Amazônia, os quais apresentaram diferenças importantes em sua hidrogeoquímica: tributários andinos do rio Mamoré são caracterizados por altas concentrações de Mn, Sr, Mo, Ba e U, ao passo que os afluentes do Beni apresentam elevadas concentrações de Zn, Cd e Cs. Os autores sugeriram que a maioria dos elementos, mesmo em concentrações mais elevadas, é de origem geológica, exceto os elementos Zn, As, Cd, cujas origens foram relacionadas à exploração de minérios (Maurice-Bourgoin et al., 1999). 69 Vale ressaltar que a elevada concentração de compostos metálicos não é condição única e necessária para causar efeitos nos seres vivos, pois eles precisam estar biodisponíveis. Uma vez que os metais se complexam com a matéria orgânica, eles podem se depositar no fundo dos rios e quando revolvidos por fatores físicos ou invertebrados bentônicos, por exemplo, podem ficar biodisponíveis na coluna d’água e assim entrar na rede trófica (Silva et al., 2006). Dentre as variáveis ambientais que podem interferir nas reações dos agentes tóxicos sobre a biota, influenciando na toxicidade desses compostos, estão o pH, o oxigênio dissolvido (OD), a temperatura, a condutividade, presença de matéria orgânica, entre outros ( EPA, 2007). As características limnológicas avaliadas para este trabalho mostram que os valores de pH observados nos tributários do rio Negro os classificam como águas ácidas, tanto na cheia quanto na seca, o que não difere de informações já descritas para as águas pretas (Sioli 1984a; b; Küchler et al., 2000; Junk et al., 2011). Os baixos níveis de pH encontrados para o rio Teia pode ser um dos motivos, associado ao tamanho dos peixes, para os níveis de Hg no tecido das traíras ter sido mais elevados, ultrapassando os limites estabelecidos pela ANVISA nesse ponto. Entretanto, o presente estudo mostra que o rio Unini apresentou pH da água na faixa da neutralidade, diferindo da descrição feita por Küchler et al. (2000), cujos valores de pH descritos foram de 4,54 (ácido). Como a maioria dos rios da bacia do rio Negro apresentam águas acidificadas em virtude da grande quantidade de ácidos húmicos e fúlvicos advindos da decomposição da matéria orgânica (Sioli, 1984a; 1984b), talvez em períodos de seca, semelhantes ao de coleta no rio Unini para este trabalho, os níveis de material orgânico em decomposição sejam menos elevados. Isso também poderia explicar o motivo desse rio apresentar teores de oxigênio dissolvido (OD) na mesma faixa dos rios de água branca, havendo menor consumo de O 2 pela decomposição de matéria orgânica (Esteves e Furtado, 2011) e ainda ter apresentado, de maneira geral, concentrações intermediárias de bioacumulação de metais em comparação aos outros tributários. Os teores de pH apresentados pelos tributários de água branca em sua maioria não diferiram de descrições anteriores, haja vista que esse tipo de água se caracteriza por apresentar pH variando do ácido ao levemente alcalino, e na maioria das vezes na 70 faixa da neutralidade, em virtude da pouca influência de ácidos húmicos, ao contrário dos rios de água preta (Sioli 1984a; b; Küchler et al., 2000; Junk et al., 2011). No entanto, o lago Curupira, no rio Japurá apresentou águas de teores ácidos, semelhantes aos de ambientes de água preta, conforme descrição de Sioli (1956). Esse lago, apesar de desaguar no rio Japurá, próximo do qual foi realizada a coleta dos peixes, advém de um igarapé cuja nascente pode estar localizada em meio a Amazônia central, podendo ser um tributário de água preta desaguando em um rio de origem andina, haja vista que além do pH, os teores de OD e condutividade elétrica também foram similares aos dos tributários de água preta. A maior condutividade elétrica nos tributários do Solimões está relacionada com a maior presença de íons dissolvidos na água em relação à maioria dos tributários do Negro (Sioli 1984a; b). Vale lembrar também que na água preta as perdas de oxigênio devem estar sendo causadas pelo consumo pela decomposição da matéria orgânica, já que nas condições naturais de um sistema aquático não intensamente poluído, o material mais habitualmente oxidado pelo oxigênio dissolvido na água é a matéria orgânica de origem biológica, como a procedente de plantas mortas e restos de animais (Esteves e Furtado, 2011). Ainda, as variações detectadas nos valores de OD podem estar relacionadas à própria presença de íons metálicos nos tributários analisados, já que oxigênio além de ser consumido pela decomposição da matéria orgânica via oxidação, é também consumido por oxidação química abiótica de substâncias como íons metálicos (Esteves e Furtado, 2011). De maneira geral, temperaturas elevadas tendem a reduzir a concentração de O2 nos ambientes aquáticos, porém para este trabalho, temperaturas mais elevadas pareceram não interferir na concentração de oxigênio, pois tributários com temperaturas altas apresentaram teores mais elevados para alguns tributários. Assim, nesses tributários a temperatura pode não exercer tanta influência em relação à quantidade de OD. Embora em alguns tributários os teores de oxigênio dissolvido tenham sido baixos, vale lembrar que isso não interfere na sobrevivência e ocorrência das trairas, pois elas sobrevivem em situações de hipóxia (Nelson, 1994). Analisadas todas as variáveis, percebeu-se que na água preta, tanto as variáveis ambientais quanto as respostas biológicas agruparam a maioria dos tributários 71 amostrados durante a seca, exceto o lago do Folharal, no qual embora características limnológicas tenham sido similares aos demais tributários desse sistema, os peixes claramente apresentaram mais danos genotóxicos e maior acumulação de zinco, que pela análise de ACP foi agrupado no mesmo fator das ANEs e MNs. Os dados obtidos para rios no período de cheia também ficaram claramente afastados daqueles obtidos para os rios em período de seca, mostrando que períodos sazonais interferem nas respostas e variáveis ambientais, embora não tão acentuada para o presente estudo. No sistema de água branca, o agrupamento dos peixes foi principalmente dos pontos mais a jusante, dos quais o lago Curupira, no rio Japurá, e o lago Paupixuna, no rio Juruá, ficaram separados. Os lagos Paupixuna e Curupira apresentaram maiores bioacumulações de metais, sendo os pontos mais a montante amostrados para o sistema de água branca, bem como os que apresentaram as menores frequência de ANEs e MNs, fatores os quais devem tê-los afastado dos demais pontos na ACP. O lago Curupira apresentou ainda diferenças limnológicas que o mantiveram afastado dos demais pontos de água branca e do lago Paupixuna. Nos dois sistemas aquáticos (água preta e água branca) foi possível detectar tanto por agrupamento de Cluster quanto por análise de componentes principais, que a bioacumulação de metais tende a interferir nas respostas genotóxicas e que a coexposição desses elementos, mesmo estando abaixo dos limites estabelecidos como seguros para consumo pela ANVISA, atuam de forma genotóxica e uma vez que esses ambientes venham a sofrer aumento em sua disponibilidade, pode acentuar sua ação sobre a integridade do material genético da biota aquática amazônica e dos diferentes níveis tróficos. Todavia, nos tributários do rio Negro as variáveis limnológicas como pH, a temperatura e o OD e condutividade favorecem a bioacumulação dos metais e assim sob as condições desse tipo de ambiente a ação dos metais pareceu ser mais acentuada, o que pode explicar a maior frequência de anormalidades nucleares e micronúcleos em eritrócitos de traíras coletadas em águas pretas. Em contrapartida, nos tributários do Solimões as variáveis limnológicas parecem exercer um efeito de proteção contra a ação genotóxica dos metais, fazendo com que a frequência de ANE e MN seja menos agravante nestes rios. De maneira geral, verificou-se que quanto 72 menor acidez apresentar o ambiente aquático, mais reduzida tende a ser a atuação de metais sobre a saúde de determinados organismos. No rio Tibre, na Itália, onde íons de metais potencialmente tóxicos (Zn, Cd, Ni, V, Cu) foram avaliados quanto à sua ação mutagênica em peixes, observou-se que esses elementos não pareceram estar relacionados com a incidência de MN mais elevada em áreas contaminadas por esses metais, mesmo que em elevada concentração, sendo sugerido que o pH com menor acidez, na faixa da neutralidade ou alcalinos, devem manter os metais como elementos não biodisponíveis, reduzindo seus efeitos mutagênicos (Minissi e Lombi, 1997). Apesar de estudos envolvendo efeitos de pH não serem tão consistentes, devido às demais variáveis que podem interferir no processo, altas temperaturas e ambientes anaeróbicos tendem a favorecer a metilação de Hg, enquanto que processos de demetilação são favorecidos em baixas temperaturas e/ou condições anaeróbicas. Ainda, em ecossistemas com alta concentração de carbono orgânico dissolvido, esses compostos orgânicos podem se ligar com metais e metalóides, tornando-os indisponíveis e reduzindo as taxas de metilação bióticas (EPA, 2007). Assim, o pH menos ácido e a ação de carbono orgânico dissolvido em águas brancas (Küchler et al., 2000), podem estar exercendo nestes tributários um efeito protetor quanto à bioacumulação de metais e sua ação genotóxica, em contraposição ao pH ácido dos tributários de água preta, que ao que parece permite uma maior bioacumulação e ação genotóxica de metais nos peixes, conforme já descrito anteriormente para a bioacumulação de Hg nos peixes de água preta, que aumenta a medida que o pH é mais baixo (Belger e Forsberg, 2006). O rio Teia, por exemplo, apresentou o pH mais ácido e a maior bioacumulação de Hg dentre os tributários analisados pelo presente trabalho. Desta forma, a menor bioacumulação de alguns metais analisados (Cr, Cu, Fe) nas Hopliasdo rio Negro pode estar associada à maior quantidade de COD e substâncias húmicas que os rios dessa bacia apresentam quando comparados aos da bacia do Solimões (Küchler et al., 2000), bem como a biodisponibilidade e capacidade de complexação via suas formas físicoquímicas (Rocha e Rosa, 2003). Em contrapartida, a bioacumulação de outros metais pode ter sido maior na bacia do Solimões por conta da própria formação 73 rochosa por onde esses rios percolam ou ainda por conta de poluição antrópica, já que sabidamente, ao longo desses rios há mais centros urbanos, maior uso de agrotóxicos, em especial ao longo das regiões de várzea, exploração de minério e maior fluxo de embarcações propícias a contaminar esses ambientes aquáticos. Assim, a bioacumulação dos metais analisados pelo presente trabalho pode ser explicada mediante a ocorrência de fontes naturais de contaminação pelo solo e também por poluição antrópica, via descargas de efluentes, derramamentos de contaminantes e deposição do ar. Além disso, a biodisponibilidade desses metais é influenciada pelas variáveis limnológicas, pois valores baixos de pH proporcionam aumento na dissolução de íons metálicos e de sua concentração e biodisponibilidade na água, a matéria orgânica interage com os agentes metálicos, e também influencia na biodisponibilidade dos metais. Contudo, uma vez que as concentrações de carbono orgânico dissolvido não foram inseridas na análise destes dados por não estarem disponíveis para todos os locais amostrados, mudanças podem ocorrer na análise de componentes principais (ACP) e disposição dos resultados quando os mesmos forem adicionados. Isso porque o COD exerce grande influência sobre as respostas obtidas para os ambientes amazônicos, influenciando na biodisponibilidade, bioacumulação e ação, devido a sua capacidade de complexação com metais, o que reduz a sua biodisponibilidade, desempenhando um papel importante no melhoramento da toxicidade dos metais em águas naturais (Wood et al., 2011). Deste modo, os efeitos dos metais podem ser reconfigurados e as concentrações de COD devem ser consideradas para complementação destes resultados obtidos. Ou seja, tanto as condições físicoquímicas da água quanto as atividades antrópicas podem estar interferindo na ação genotóxica desses elementos em rios, lagos e igarapés de água preta e água branca da Amazônia, sendo eles mais agressivos sobre a integridade do material genético nos ambientes de água preta. Isso foi comprovado por meio não só da maior ocorrência de MN e ANE, que inclusive foram maiores nos tributários de água preta, mas também pela relação dos metais e a incidência de genotoxicidade nos ambientes amostrados ao longo dos tributários, em especial os do rio Negro. A ocorrência de danos genotóxicos em peixes da bacia Amazônica relacionada à bioacumulação de metais reflete sérios problemas que 74 podem afetar não só peixes da espécie H. malabaricus, mas toda a população que se alimenta desses peixes, absorvendo os contaminantes acumulados em seus tecidos. Thier et al. (2003), argumentam que o mercúrio e certos compostos organomercuriais exercem efeitos adversos sobre uma subunidade estrutural de microtúbulos envolvidas na organização celular e componente de fibras do fuso mitótico: a tubulina, a qual tem sua polimerização prejudicada pelo Hg, causando a contração dos cromossomos metafásicos e atrasando a divisão da região centromérica e os movimentos anafásicos. Isso poderia explicar o aumento de anormalidades nucleares, em especial na água preta, haja vista que essas anormalidades são formadas a partir do prolongamento da membrana nuclear em torno de cromatina levemente atrasada durante a divisão celular. E mesmo os MN refletem perdas severas de material genético por efeitos clastogênicos, que provocam quebras no material genético, ou efeitos aneugênicos, que refletem danos às fibras do fuso mitótico (Ribeiro et al., 2003). Vale ressaltar ainda que MN e ANE são eventos mutacionais e genotóxicos e podem ocorrer espontaneamente como subprodutos de processos celulares normais ou induzidas por mutágenos. Isso por que falhas no processo de divisão celular ocorrem naturalmente, embora que em frequências reduzidas, pois as células desenvolveram sistemas sofisticados para identificar e reparar DNA danificado, impedindo assim a ocorrência exacerbada de mutações (Silva et al., 2003; Ribeiro et al., 2003). O sistema de reparo na célula corrige, por exemplo, quebras bifilamentares por meio da junção de pontas quebradas, o que deve contribuir para a baixa frequência de ANE e MN em situações normais. MN e ANE podem então ocorrer mediante problemas que afetem o bom funcionamento do sistema de reparo do DNA. Portanto, o aumento da ocorrência de MN é indício de mutagenicidade severa sobre a estrutura do material genético, já que as quebras cromossômicas ou perdas de cromossomos inteiros são potencialmente letais se não reparados, em especial por que fragmentos acêntricos não são herdáveis (Ribeiro et al., 2003). Na bacia do rio Negro, o lago do Folharal apresentou uma maior incidência de ANEs, tanto numa análise geral quanto por diferentes classes de peso, sendo significativamente maior a frequência de ANEs nesse lago do que nos rios Caurés e Jurubaxi, em especial nos peixe de tamanho intermediário (250 a 499g). As variáveis 75 que mostraram ser diferenciadas no lago do Folharal foram a bioacumulação de Zinco e de Ferro. Apesar de serem elementos essenciais, a análise multivariada mostrou Zn e Fe associados aos danos genotóxicos em Hoplias coletados em água preta, com potencial efeito mutagênico na formação de MN e de ANE. O Ferro é um elemento essencial por participar principalmente do transporte de oxigênio dos pulmões até os tecidos, por compor a hemoglobina dos glóbulos vermelhos do sangue e ser componente de diversas enzimas, como as envolvidas no metabolismo energético (Forbes, 2009). O Zn também é importante nas atividades fisiológicas, sendo componente de inúmeras enzimas, participando na divisão celular, na transcrição e expressão gênica, além de atuar em processos fisiológicos, tais como crescimento e desenvolvimento, na morte celular, agir como estabilizador de estruturas de membranas e componentes celulares, além de participar da função imune e desenvolvimento cognitivo (Mafra e Cozzolino, 2004). No entanto esses metais apresentam potencial para exercer efeitos genotóxicos, mesmo abaixo, em todos os tributários, dos limites estabelecidos como seguros pela legislação da ANVISA (1965 e 1998), que estabelece os limites máximos de tolerância para contaminantes inorgânicos em peixes. Em condições experimentais, Tapisso et al. (2009) avaliaram danos ao DNA em camundongos (Mus argelinos spretus) expostos e co-expostos ao zinco (Zn), cádmio (Cd) e chumbo (Pb) via injeções intraperitoneais numa concentração correspondente a 1/10 da a DL50, respectivamente, de 1,5, 21,5, 0,46 e mg/kg de peso corporal. Com apenas uma exceção (Cd + Zn), os resultados mostraram aumento significativo de MN em todos os grupos avaliados, indicando que o zinco, o cádmio e o chumbo induzem à formação de MN. Ainda, o potencial clastogênico é dependente do tempo de exposição e da interação entre os três elementos, confirmando que danos genotóxicos podem resultar da ação simultânea de diversos metais. Investigando a toxicidade da drenagem ácida de mina de carvão, utilizando parâmetros físico-químicos e bioensaios, Macan et al. (2012) constataram que a drenagem apresentou baixo valor de pH e expressiva concentração dos metais ferro e manganês, e uma vez expostas à drenagem ácida de mina de carvão, células do 76 meristema de Allium cepa tiveram aumento dos danos ao DNA detectado via teste do cometa, indicando que o Ferro e o Manganês também exercem ação sobre o material genético e sua ação tóxica é mais acentuada em água mais acidificadas, como as encontradas neste trabalho para os tributários do rio Negro, onde a coexposição a metais parece estar exercendo em potencial ação genotóxica de manganês nos peixes. O mais preocupante é que manganês não tem limites estipulados como seguros pela legislação brasileira. Na bacia do Solimões, de modo geral, o Madeira apresentou maior incidência de MN em relação ao lago Paupixuna, na água branca. O único metal com concentrações diferentes dos demais tributários para o rio Madeira foi o cromo, com diferença significativa entre os peixes de peso entre 75 a 249g. Entretanto, as diferenças de ANE e MN entre os peixes dessa classe de peso foram similares e talvez estejam relacionados ao n, pois somente se comparou a incidência de ANE e MN com o lago Coari. Se os demais tributários tivessem mais peixes para essa classe de tamanho, bem como um n maior nas outras classes, resultados semelhantes poderiam ser obtidos. Na análise por classes de tamanho, somente peixes de peso entre 250 a 500g apresentaram diferença na frequência de MN entre o lago Grande Manacapuru e Lago Coari. De maneira geral, o lago Grande Manacapuru não apresentou bioacumulação mais acentuada de metais em relação ao lago Coari, exceto o chumbo que não foi detectado para este tributário. Sugere-se então que essa maior frequência de danos de MN possa estar sendo provocada por outros agentes mutagênicos e, levando em consideração que os peixes do lago Grande Manacapuru foram coletados nas proximidades da cidade de Manacapuru, no estado do Amazonas, esse ambiente tem sido constantemente contaminado por despejos de resíduos tóxicos além dos metais, advindos do lançamento de esgoto no rio, derramamento de combustíveis e utilização de pesticidas, por exemplo, que são fontes comuns de poluição e genotoxicidade nos grandes centros (Silva et al., 2003). Com base na legislação da ANVISA somente Cr e Hg ultrapassaram os limites de concentração permitidos para o pescado nos espécimes de Hoplias malabaricus 77 analisados pelo presente estudo. Para o Cr os valores encontrados ultrapassaram os limites recomendados pela ANVISA em somente dois tributários avaliados: lagos Paupixuna e lago Curupira. A presença mais elevada de cromo nos tributários do Solimões em relação aos do rio Negro pode ser explicada pelo fato de que águas com pH neutros (em torno de 6,5) e maior concentração de sais podem apresentar maior incidência de monômeros de cromo (Rai et al., 1987; Venkatramreddy et al., 2009), ao passo que ácidos húmicos e fúlvicos altamente influenciados por valores reduzidos de pH aumentam a taxa de redução de cromo (Deng e Stone, 1996). Isso explicaria por que há menor concentração deste metal nos peixes de tributários do rio Negro. Alguns autores têm defendido que a acumulação de cromo em peixes não é um problema grave, uma vez que os peixes são capazes de eliminá-lo de seus organismos (Buhler et al., 1977; Birungi et al., 2007). Contudo, certas espécies demonstram ser tolerantes ao cromo e outras mostram uma maior sensibilidade a esse metal, sendo que a ecotoxicologia de Cr, em especial na sua forma hexavalente tóxica, está ligada à sua persistência no meio ambiente e a capacidade de induzir uma variedade de efeitos adversos em sistemas biológicos, incluindo peixes. Esses efeitos mostram toxicidade em níveis celulares, bioquímicos e genéticos, possuindo propriedades mutagênicas e teratogênicas (Venkatramreddy et al., 2009). Outros efeitos adversos já foram observados, como alteração da atividade respiratória do peixe; depressão na taxa metabólica; decréscimo significativo nos parâmetros hematológicos; diminuição significativa de parâmetros bioquímicos como: glicogênios totais, lipídeos totais e conteúdo de proteína total, refletindo a extensão dos efeitos tóxicos de cromo hexavalente que induz efeitos deletérios cumulativos em vários níveis funcionais em peixes de água doce amplamente consumidos: Labeo rohita, chamada de “carpa indiana” (Vutukuru, 2005). A toxicidade, mutagenicidade e genotoxicidade de Cr têm sido comprovadas em diversos trabalhos por meio de pesquisas em diversos grupos biológicos (Langard, 1990; De Flora et al., 1990; Çavas e Garanko, 2005; Mccarroll et al., 2010; Oliveira et al., 2012). Venkatramreddy et al. (2009) fizeram uma revisão ampla dos efeitos adversos do Cr incluindo sua ação genotóxica e mutagênica, proporcionando uma base para a compreensão do impacto potencial, bem como para o avanço dos 78 conhecimentos da avaliação ecotoxicológica e de risco deste metal. Com isso, sugerimos que estudos sejam efetuados para verificação de quais valências iônicas de cromo são encontradas nos peixes amazônicos, em especial aqueles consumidos pela população local, haja vista que a forma hexavalente (Cr 6+) é incluída nos grupos dos agentes comprovadamente carcinogênicos em animais e em humanos pela International Agency for Research on Cancer (IARC, 1990) e Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR, 2009). O consumo de peixes com níveis de Cromo elevados nos peixes amazônicos é, portanto preocupante do ponto de vista da saúde da população. De acordo com a legislação da ANVISA, poucos peixes do rio Teia, Jurubaxi e Unini estariam impróprios para consumo em relação aos limites estabelecidos para consumo de Hg: 1.0 mg/kg. O mesmo limite de consumo é estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (FAO/WHO, 2006) para ingestão de metilmercúrio. Contudo na região Amazônica, o consumo médio de pescado é muito elevado em relação a outras regiões. Fréry et al. (2001) mostraram que em períodos de abundância, o consumo de pescado na Amazônia pode chegar a até 600g/dia/pessoa. Além do consumo pela população ribeirinha, na região Amazônica o comércio de peixe supre também os centros urbanos e o aumento das cidades tem provocado uma procura cada vez maior por pescado, bem como o aumento de consumo pela população (Ferreira, 1998). Trabalhos recentes realizados na região amazônica também alertam para os riscos de consumo de peixes com altas concentrações de mercúrio. Rabitto et al. (2011) avaliaram os risco do consumo de peixes da espécie de peixe carnívora Cichla monoculus (tucunaré) do reservatório de Samuel, na bacia Amazônica, em Rondônia – Brasil, e verificaram que esta espécie é um importante veículo de exposição humana ao mercúrio, haja visto que esse peixe acumula e biomagnifica esse metal, com concentrações acima do limite seguro recomendado pela EPA/WHO. Neste mesmo ambiente, Silva et al. (2012) investigaram a bioacumulação de Hg em Hoplias malabaricus e cerca de 18% dos peixes avaliados apresentaram níveis de mercúrio no músculo excedendo o limite seguro para ingestão através da alimentação para humanos estabelecidos pela OMS. 79 Além desses, diversos outros trabalhos têm mostrado que peixes carnívoros da região amazônica, dentre eles Hoplias malabaricus tendem a bioacumular Hg, sendo importantes fontes de contaminação para a população humana local (Lacerda et al., 1987; Pfeiffer et al.,1989; Malm et al.,1995; Belger e Forsberg, 2006; Beltran-Pedreros et al., 2011; Rabitto et al., 2011; Silva et al., 2012). Os dados obtidos neste trabalho mostram que realmente há bioacumulação de Hg nesses peixes, sendo que os peixes coletados nos tributários do rio Negro bioacumularam mais Hg do que coletados nos tributários do rio Solimões. A biodisponibilidade e bioacumulação de Hg dependem de vários fatores como carbono orgânico dissolvido, densidade das zonas úmidas, regime alimentar, idade, nível trófico e metabolismo de peixes amazônicos (Belger e Forsberg, 2006; BeltranPedreros et al., 2011). Portanto, a maior bioacumulação de Hg nos peixes amazônicos pode estar sendo influenciada também por esses fatores, além de níveis de pH baixos. Ainda, a presença de solos hidromórficos tem sido descrita como importantes fontes de metilação de Hg em afluentes do rio Negro, em especial nas regiões mais a montante desta Bacia (Zeidemann, 1998; Belger e Forsberg, 2006). Em condições naturais amazônicas, o impacto da contaminação por mercúrio no rio Madeira foi avaliado via análise da incidência de micronúcleos em eritrócitos de três espécies de characiformes amazônicos pertencentes a diferentes níveis tróficos (Prochilodus nigricans – detritívoro, Mylossoma duriventris – onívoro e Hoplias malabaricus – piscívoro) e tendo como referência áreas não poluídas do rio Solimões. A frequência de micronúcleos foi mais alta nos indivíduos coletados no rio Madeira e os efeitos genotóxicos mais fortes foram detectados no peixe piscívoro Hoplias malabaricus, provavelmente refletindo uma interação de fatores ambientais e biológicos que causam a maior biomagnificação do mercúrio e indução de danos genéticos sobre traíras do rio Madeira (Porto et al., 2005). Embora os autores não tenham feito nenhum tipo de análise química na água ou nos tecidos dos peixes, o fator histórico de mineração de ouro no rio Madeira foi considerado como possível agente causador da maior incidência de MN neste rio, que em comparação com as frequências (%) encontradas para o presente estudo, permitiu detectar uma maior incidência de MN em H. malabaricus em relação aos analisados por Porto et al. (2005). 80 Tabela 8. Comparação entre a frequência média de MN em Hoplias malabaricus entre os valores encontrados para este trabalho e os encontrado por Porto et al. (2005). Ambos os trabalhos realizados em rios da Amazônia. Porto et al. (2005) Presente trabalho Rio Solimões Rio Madeira Rio Madeira Bacia do Negro – Cheia Bacia do Negro – Seca Bacia do Solimões – Seca 0.006 0.18 0.45 0.34 0.63 0.24 Vale ressaltar que os peixes analisados por Porto et al. (2005) foram coletados no ano de 1991, 21 anos anteriores às coletas deste presente estudo, e a frequência de MN para o rio Madeira mais que dobrou ao longo desses mais de vinte anos. E mesmo com a redução da exploração garimpeira de ouro na parte brasileira deste rio, as respostas genotóxicas aumentaram. Para o presente trabalho foi verificado que a bioacumulação de Hg em associação com outros metais influencia nas respostas genotóxicas, mostrando que outros fatores além do Hg devem estar interferindo nas respostas genotóxicas para este importante rio amazônico, como o cromo, citado acima, bem como a notória ocupação e poluição humana crescente ao longo deste rio e reforçamos a grande importância do contínuo biomonitorando do rio Madeira. Outro trabalho investigou a influência de mercúrio e metilmercúrio em eritrócitos de peixes e verificou-se que compostos exercem ação genotóxica, mas quando os peixes foram expostos juntamente com selênio, as frequências de micronúcleos reduziram, mostrando que o Se parece auxiliar na diminuição da genotoxicidade de compostos mercuriais (Al-Sabti, 1994). Um estudo recente (Lailson-Brito et al., 2012) demonstrou que o metal Se pode ajudar na desmetilação de Hg nos organismos aquáticos por meio da formação de seleneto de mercúrio. Com isso, a concentração de Hg pode ser reduzida nesses organismos caso o Se esteja biodisponível na água e uma vez absorvido, ajudar na eliminação de Hg dos organismos. Sugere-se então que nos próximos trabalhos a análises de bioacumulação de Selênio (Se) também sejam consideradas. 81 Ayllón e Garcia-Vazquez (2000) investigaram a ação genotóxica de Hg por teste de micronúcleo e anormalidades nucleares em duas espécies de peixes e verificaram que Phoxinus phoxinus não sofre ação genotóxica de Hg, enquanto que Poecilia latipinna é sensível ao mercúrio e cádmio, apresentando respostas genotóxicas. Vale ressaltar ainda que a sensibilidade por determinados tipos de metais e os padrões de acumulação de xenobióticos são diferentes para cada espécie de peixe e dependem do balanço entre a taxa de assimilação e as taxas de metabolização e eliminação dos compostos químicos, as quais também podem ser influenciadas pelo meio (Silva et al., 2003), justificando por que diferentes espécies respondem de diferentes formas a ação de determinados contaminantes. A ação genotóxica de metilmercúrio em diferentes concentrações de exposição via trófica (via alimentação contaminada) em Hoplias malabaricus foi testada por Vicari et al. (2012) e, embora não tenham sido observadas diferenças significativas na ocorrência de micronúcleos entre os grupos expostos e grupo controle, a ação genotóxica foi observada via ensaio cometa, os autores sugeriram que os possíveis danos provocados por esse elemento sejam reparáveis. Estudando populações humanas ribeirinhas às margens do rio Tapajós, na Amazônia, Amorim et al. (2000) testaram o mercúrio presente em cabelos como biomarcador de exposição e encontraram uma ação citotóxica do metal, relacionada com eventos clastogênicos e redução da proliferação de linfócitos, medida como o índice mitótico (IM). Pinheiro et al. (2000) avaliaram a exposição humana ao metilmercúrio e ao mercúrio total em comunidades ribeirinhas do rio Tapajós e da região metropolitana de Belém, no estado do Pará, via análises em amostras de cabelo e sugeriram que o mercúrio absorvido via consumo de peixes carnívoros contaminados com o metal, dentre eles as traíras, provoca indícios de intoxicação mercurial nos consumidores humanos via cadeias tróficas. Dessa forma, o potencial efeito genotóxico do mercúrio necessita de maiores investigações, pois diferentes trabalhos vêm mostrando contradições quanto às ações genotóxicas do Hg em diferentes espécies e, para o presente trabalho, o Hg aparece agrupado por análise multivariada, ao grupo de metais causadores de MN e ANE. A bioacumulação dos metais Cu e Pb também estiveram abaixo dos limites estabelecidos pela ANVISA. Apesar de na água preta os peixes apresentarem menor 82 bioacumulação de Cu do que na água branca, nos tributários do rio Negro o Cu mostrou estar relacionado à ocorrência de danos genotóxicos facilitado pelas condições limnológicas, confirmando que em águas cujos teores de pH são baixos a toxicidade de metais como o Cu é mais acentuada (Láuren e McDonald,1987). Ou então o sistema de eliminação deste elemento por parte das traíras tem sido bastante eficaz na água branca, como por meio da metalotioneína (Souza et al., 2009). A análise de micronúcleos também indicou a ocorrência de efeitos genotóxicos e mutagênicos, com aumento significativo de células alteradas, na espécie amazônica Aequidens tetramerus (acará) após exposição a sulfato de cobre na concentração de 7,975 mg.L-1 durante 24 horas, mostrando que esse metal provoca danos no material genético desses animais (Rocha et al., 2010). Por sua vez, embora o chumbo seja um metal altamente tóxico, sua concentração e a de Níquel, assim como de outros elementos estão dentro das medidas permissíveis para consumo pela legislação brasileira, a qual necessita de revisão quanto aos limites para consumo destes metais. Para este trabalho, a ACP mostrou que o chumbo está relacionado com a ocorrência de danos genotóxicos em traíras e em coexposição com outros metais ele se relacionou com os danos genotóxicos. A genotoxicidade do Pb (concentração 5 mg Pb(NO3)2 L−1) foi investigada por meio de bioensaios in vitro (1, 3 e 6h) e in vivo, com exposição hídrica (6, 24 e 96 h) em peixes de água doce Prochilodus lineatus, nos quais a frequência de ANEs (núcleos em forma de rim, núcleo segmentado e núcleos lobado) tiveram aumento significativo após 24 e 96 horas de exposição, indicando que ANE representa um ótimo biomarcador para exposições longas a Pb e os MNs são bons para avaliar exposições de curto prazo. Os resultados do ensaio do cometa em eritrócitos expostos in vitro ao chumbo confirmaram seu efeito genotóxico e demonstraram que as lesões no DNA causada pelo chumbo é tempo/dependente (Monteiro et al., 2011). Ferraro et al. (2004) utilizaram Hoplias malabaricus na avaliação do potencial mutagênico (testes do cometa e MN e aberrações cromossômicas) do chumbo inorgânico (PbII) e tributilteno (TBT), verificando após dois meses de exposição via trófica que tanto TBT como PbII são potencialmente mutagênicos (p <0,01), com frequência média de MN de 0,10%. Ramsdorf et al. (2009), também avaliaram a ação genotóxica do chumbo inorgânico – 83 PbII (por injeção intraperitoneal em 96h de exposição) utilizando H. malabaricus e verificaram ausência de MNs. Contudo, detectaram ocorrência de alterações morfológicas nucleares. Na Amazônia a bioacumulação de outros metais também foi avaliada, tais como Alumínio (Al), Cádmio (Cd) e Cromo (Cr), analisados em três espécies de peixes – piranha (Serrasalmus spp.), branquinha (Potamorhina spp.) e tucunaré (Cichla spp.) – oriundas do rio Gelado, no estado do Pará, onde foram encontradas altas concentrações dos três metais, com valores acima dos limites estabelecidos para consumo nas espécies analisadas (Barros et al., 2010). Contudo, investigações complementares necessitam ser realizadas na região Amazônica a fim de compreender melhor a geoquímica regional, os processos de bioacumulação e efeitos de metais, bem como aliada a aplicação de outros biomarcadores, como os de genotoxicidade utilizada pelo presente trabalho. Investigações desse tipo podem ser utilizadas com eficácia na avaliação dos efeitos da poluição por agentes mutagênicos e genotóxicos, como metais, sendo recomendadas para estudos de biomonitoramento na Amazônia. Testes de MN e ANE em sangue periférico do peixe de água doce Astyanax jacuhiensis foram utilizados como biomarcadores na avaliação da qualidade do ambiente aquático e possíveis efeitos da poluição petroquímica para populações nativas do rio Bom Jardim, no Rio Grande do Sul e mostraram que os locais sujeitos a influência petroquímica estavam sob impacto genotóxico elevado (Lemos et al., 2008). Tal tipo de biomonitoramento, bem como o utilizado por nosso trabalho, são bons indicadores da qualidade ambiental aquática e precisam ser aplicados com maior ênfase na região Norte do Brasil. Sendo estabelecidos como práticas que devem ser adotada na Amazônia para controle e avaliação da qualidade ambiental. Todavia, a genotoxicidade de metais afeta os peixes amazônicos, sendo potencializada pelas diferentes características físicoquímicas, confirmando a eficiência do uso de biomarcadores de genotoxicidade tais como os utilizados em nosso trabalho. Bem como reforçam que os limites estabelecidos pela ANVISA precisam ser revisados por conta da ação genotóxica que esses metais exercem em especial de forma conjunta. Indicam ainda que novos estudos tanto em monitoramento de ambientes 84 naturais como em bioensaios são necessários. Além disso, a abordagem de análise multivariada (AAM) se configura como uma excelente ferramenta para a avaliação de efeitos de contaminantes em ambientes naturais em complementação a outros tipos de análises. Alguns trabalhos de biomonitoramento ambiental já realizaram essa ferramenta, que tem se mostrado eficiente para a análise de danos biológicos provocados por metais em ambientes naturais via diferentes tipos de biomarcadores. Riba et al. (2005) avaliaram a relação entre a bioacumulação dos metais Zn, Cd, Cu e Pb e lesões histológicas em diferentes tecidos de organismos (ostras e mariscos) em três áreas diferentes do sudoeste da Espanha afetados e não afetados por atividades de mineração. Como resultado, detectaram correlações entre a bioacumulação de metais pesados Zn e Cd e lesões histológicas. Investigando os efeitos de contaminantes (substâncias organocloradas, PCB, DDT e metais – Cu, Zn, Cd, Pb, Hg), por um conjunto de biomarcadores de histopatologia, histomorfometria e Imunohistoquímica, Dabrowska et al. (2012) observaram que os biomarcadores histomorfométricos se correlacionaram positivamente com o Hg no músculo, PCB e resíduos DDT. Esses tipos de trabalho e de análise vêm mostrando eficiência dos biomarcadores na avaliação e comparação da qualidade ambiental em diversos ambientes analisados e testes de genotoxicidade podem ser usados para monitoramentos contínuos dos rios amazônicos, em especial aqueles que vêm sofrendo fortes mudanças e impactos em virtude da ação humana, tais como o próprio rio Madeira, que tem sofrido muitas alterações por conta de poluição urbana, curtumes, lixões e construção de usinas Hidrelétricas e a ainda vigente exploração garimpeira em sua parte boliviana, principalmente. Embora a maioria dos metais analisados tenha se apresentado em concentrações abaixo dos limites estabelecidos para consumo humano, quando analisados em conjunto por ACP e Cluster, os resultados mostraram que a coexposição a esses metais exerce influência sobre a indução de efeitos genotóxicos: ANE e MN. Portanto estes resultados evidenciam que os limites estabelecidos na legislação brasileira vigente precisam ser revistos de forma a assegurar maior segurança para o consumo humano de pescado. Faz-se necessário que sejam feitas revisões dos valores estabelecidos para consumo humano pela legislação brasileira, 85 bem como, que sejam estabelecidos na legislação limites apropriados para consumo dos metais que ainda não estão sendo considerados nas normativas nacionais, com especial atenção para a região amazônica e suas particularidades, onde é notório o elevado consumo de pescado, em quantidade bem maior do que noutras regiões do país. Isso por que muitos indivíduos amazônicos têm diariamente sua fonte de alimentação via consumo de peixes e, portanto, estão predispostos a absorver metais bioacumulados em concentrações extremamente elevadas, sendo a ingestão destes um risco diário. São necessários que mais estudos busquem compreender melhor as origens antrópicas dos metais dentro dos sistemas aquáticos amazônicos. O cromo, por exemplo, pode advir do uso deste metal em curtumes; o mercúrio, da sua utilização na amalgamação de ouro na garimpagem e da lixiviação de solos amazônicos, e o manganês do uso de agrotóxicos, por exemplo. Os resultados obtidos pelo presente trabalho mostraram que a ocorrência de ANE e MN foram significativamente maior nos peixes do rio Negro em comparação com peixes da bacia do rio Solimões, o que significa que os peixes de tributários do rio Negro estão sofrendo maior impacto sobre a estabilidade do material genético e morfologia estrutural nuclear quando comparados aos peixes de tributários do rio Solimões. Isso demonstra que mesmo peixes coletados em ambientes com pouca interferência humana estão sofrendo danos em seu DNA, e por mais que a frequência com a qual esteja ocorrendo não tenha implicâncias severas quanto à sobrevivência desses animais, o panorama por esse trabalho observado se estabelece como parâmetro para efeito de comparação com monitoramentos contínuos a serem realizados na Amazônia, a fim de compreendermos melhor sua dinâmica ambiental. Por conta disso, mais estudos de biomonitoramento na região amazônica se fazem necessários para investigar a origem e ação tóxica de metais, bem como de outros contaminantes, sob a influência de diferentes fatores ambientais em diferentes níveis de organização biológica e utilizando diferentes biomarcadores, como os de genotoxicidade (ANE e MN písceos), os quais demonstraram ser eficientes no estudo de biomonitoramento em ambientes aquáticos amazônicos ao detectar que estão havendo perdas genéticas em células somáticas das traíras das bacias do rio Negro e do rio Solimões. 86 6. Conclusões Variáveis ambientais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura e condutividade elétrica influenciam a bioacumulação de metais e seus efeitos genotóxicos em traíras da espécie Hoplias malabaricus. Está havendo indução de danos genotóxicos em traíras dos ambientes amostrados, sendo “micronúcleos”, “núcleo em forma de rim”, “núcleo lobado” “núcleo vacuolado” e “núcleo segmentado” observados em tributários dos rios Negro e Solimões. As frequências dos danos genotóxicos encontrados para este trabalho poderão ser utilizadas para efeitos de comparação em estudos de monitoramentos contínuos, utilizando testes de ANE, MN e de bioacumulação como ferramenta de avaliação da qualidade ambiental. Houve diferença de ANE entre tributários do rio Negro e de MN entre tributários do Solimões, sendo as ANEs um melhor biomarcador para água preta e MN um melhor biomarcador para a água branca. As características limnológicas influenciaram na biodisponibilidade dos metais, sendo os peixes de tributários do rio Negro mais afetados pela ação dos metais do que peixes de tributários do rio Solimões. Dentre os metais avaliados no músculo de traíras somente cromo (Cr) e mercúrio (Hg) apresentaram valores acima dos permissíveis para consumo humano pela Legislação Brasileira. São necessários mais estudos para compreender melhor as origens naturais e antrópicas dos metais, bem como sua ação sobre a biota dentro dos sistemas aquáticos amazônicos sob diferentes condições ambientais. 87 Problemas que afetam peixes da espécie H. malabaricus, podem também atingir a população que se alimenta desses peixes, absorvendo os contaminantes acumulados em seus tecidos. Uma vez que danos genotóxicos sofrem influência da bioacumulação dos metais avaliados mesmo em concentrações abaixo dos limites estabelecidos como seguros para consumo de pescado pela ANVISA, a legislação vigente precisa ser revisada, rediscutida e reformulada. 88 7. Referências Akan, J. C.; Salwa, M.; Yikala, B. S.; Chelube, Z. M. 2012. Study on the distribution of heavy metals in different tissues of fishes from river Benue in Vinikilang, Adamawa State, Nigeria. British Journal of Applied Science and Technology, 2(4): 311–333. Albertini, R.J.; D. Anderson; G.R. Douglas; L. Hagmar; K. Hemmink; F. Merlo; A. T. Natarajan; H. Norppa; D. E. G. Shuker; R. Tice; M.D. Waters; A. Aitio. 2000. IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in humans. Mutation Research, 463: 111–172. Al-Sabti, K.; Metcalfe, C. D. 1995. Fish micronuclei for assessing genotoxicity in water. Mutation Research Genetic Toxicology, 343:121–135. Al-Sabti, K.1994. Micronuclei induced by selenium, mercury, methylmercury and their mixtures in binucleated blocked fish erythrocyte cells, Mutat. Res. 320:157–163. Amorim, M. I. M.; Mergler, D.; BAHIA, M. O.; Dubeau, H.;, Miranda D.; Lebel, J.; Burbano, R. R.; Lucotte, M. 2000. Cytogenetic damage related to low levels of methyl mercury contamination in the Brazilian Amazon. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 72: 4. Antonin, W. 2009. Nuclear Envelope: Membrane Bending for Pore Formation? Current Biology, 19(10): 410–412. ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 1965. Legislação em Vigilância Sanitária. Portaria n° 55871, de 26 de março de 1965: Normas Reguladoras do Emprego de Aditivos para Alimentos. (http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/414d248047458a7d93f3d73fbc4c6735/DE CRETO+N%C2%BA+55.871%2C+DE+26+DE+MAR%C3%87O+DE+1965.pdf?MOD=A JPERES). Acesso: 05/04/2013. 89 ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 1998. Legislação em Vigilância Sanitária. Decreto n° 685, de 27 de agosto de 1998: Limites Máximos de Tolerância para Contaminantes Inorgânicos. Disponível em: (http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/8c494f804745801a8c00dc3fbc4c6735/PO RTARIA+N+%C2%BA+685%2C+DE+27+DE+AGOSTO+DE+1998.pdf?MOD=AJPERE S). Acesso em: 05/04/2013. ATSDR (USA) – Agency for Toxic Substances and Disease Registry. 2009. Toxicological profile for chromium. (http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp.asp?id=62&tid=17). Acesso: 16/05/2013. ATSDR (USA) – Agency for Toxic Substances and Disease Registry. 2010. Chromium. (http://www.atsdr.cdc.gov/substances/toxsubstance.asp?toxid=17). Acesso: 16/05/2013. Ayllon, F.; Garcia-Vazquez, E. 2000. Induction of micronuclei and other nuclear abnormalities in European minnow Phoxinus phoxinus and mollie Poecilia latipinna: An assessment of the fish micronucleus test. Mutation Research, 467:177–186. Barbosa, A.C.; De Souza, J. R.; Dórea, J. G.; Jardim, W. F.; Fadini, P. S. 2003. Mercury biomagnification in a tropical black water, Rio Negro, Brazil. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 45:235–246. Barros, B. C. V.; Pinheiro, S. F.; Palheta, P. D. C.; Silva, C. S. 2010. Determinação de Cd, Cr e Al em tecido de peixes provenientes do Rio Gelado/APA, Floresta de Carajás – PA. Holos environment, 10(2): 195–208. Belger, L.; Forberg, B. R. 2006. Factors controlling Hg levels in two predatory fish species in the Negro River basin, Brazilian Amazon. Science of the total environment, 367: 451–459. Beltran-Pedreros, S.; Zuanon J.; Leite, R. G.; Peleja, J. R. P.; Mendonça, A. B.; Forsberg B. R. 2011. Mercury bioaccumulation in fish of commercial importance from different trophic categories in an Amazon floodplain lake. Neotropical Ichthyology, 9(4): 901–908. Bertollo, L. A. C.; Born, G. G.; Dergam, J. A.; Fenocchio, A. S.; Moreira-Filho, O. 2000. A biodiversity approach in the neotropical Erythrinidae fish, Hoplias malabaricus. 90 Karyotypic survey, geographic distribution of cytotypes and cytotaxonomic considerations. Chromosome Research, 8: 603–613. Bidone, E. D.; Castilhos, Z. C.; Cid de Souza, T. M.; Lacerda, L. D. 1997. Fish contamination and human exposure to mercury in the Tapajós river basin. Pará state, Amazon, Brazil: a screening approach. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 59: 194–201. Birungi, Z.; B. Masola, M.F.; Zaranyika, I.; Naigaga, B. 2007. Marshall. Active biomonitoring of trace heavy metals using fish (Oreochromis niloticus) as bioindicator species. The case of Nakivubo wetland along Lake Victoria. Physics and Chemistry of the Earth, v. 32, p. 1350–1358. Bolognesi C.; Perrone E.; Roggieri P.; Pampanin D. M.; Sciutto M. 2006. Assessment of micronuclei induction in peripheral erythrocytes of fish exposed to xenobiotics under controlled conditions. Aquatic Toxicology, 78: 93–98. Bolognesi, C.; Hayashi, M. 2011. Micronucleus assay in aquatic animals. Mutagenesis, 26(1): 205–213. Bombail, V. A. D.; Gordon, E.; BATTY, J. 2001. Application of the comet and micronucleus assays to butterfish (Pholis gunnellus) erythrocytes from the Firth of Forth. Chemosphere, 44: 383–392. Borum, D.; Manibusan, M. K.; Schoeny, R.; Winchester, E. L. 2001. Water Quality Criterion for the Protection of Human Health: Methylmercury. Office of Science and Technology. Office of Water. U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC 20460. Bücker, A.; Carvalho W.; Alves-Gomes, J. A. 2006. Avaliação da mutagênese e genotoxidade em Eigenmannia virescens (Teleostei: Gymnotiformes) expostos ao benzeno. Acta Amazonica, 36(3): 357–364. Burns, G. W.; Bottino, P. J. 1991. Bases citológicas da herança. In: Genética 6ª edição. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. p. 35–58. 91 Buhler, D.R., Stokes, R.M and Caldwell, R.S. 1977. Tissue accumulation and enzymatic effects of hexavalent chromium in rain bow trout (Salmo gairdneri). J Fish Res Bd Can. 34(1): 9–18 Carrasco, K.R.; Tilbury, K.L.; Myers, M.S. 1990. Assessment of the piscine micronucleus test as an in situ biological indicator of chemical contaminant effects. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 47: 2123–2136. Castilhos, Z. C.; Bidone, E. D. 2000. Hg biomagnification in the ichthyofauna of the Tapajós River Region, Amazonia, Brazil. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 64: 693–700. Castro, R. M. C.; Casatti, L. 1997. The fish fauna from a small forest stream of the upper Parana river basin, southern Brazil. Ichthyological Exploration of Freshwater, 7 (4):337–352. Çavas, T.; Garanko, N. N. 2005. Arkhipchuk VV Induction of micronuclei and binuclei in blood, gill and liver cells of fishes subchronically exposed to cadmium chlorid and copper sulphate. Food Chem. Toxicol., 43: 569–574. Chatel, G.; Fahrenkrog B. 2011. Nucleoporins: Leaving the nuclear pore complex for a successful mitosis. Cellular Signalling, 23: 1555–1562. Chapman, P. M. 1996. Evaluation of bioaccumulation factors in regulating metals. Environ. Sci. Technol, 30: 448–452. Dabrowska, H.; Ostaszewska, T.; Kamaszewski, M.; Antoniak, A.; Napora-Rutkowski, Ł.; Kopko,O.; Lang, T.; Fricke, N. F.; Lehtonen K. K. 2012. Histopathological, histomorphometrical, and immunohistochemical biomarkers in flounder (Platichthys flesus) from the southern Baltic Sea. Ecotoxicology and Environmental Safety, 78: 14– 21. Dancey, C. P.; Reidy, J. 2006. Estatística sem Matemática para Psicologia: usando SPSS para Windows. [Tradução VIALI, L.]. 3a ed. Porto Alegre: Artmed. 608p. De Flora, S.; Bagnasco, M.; Serra, D.; Zanacchi, P. 1990. Genotoxicity of chromium compounds. A review. Mutation Research, 238 (2): 99–172. 92 Deng, B.; Stone, A.T. 1996. Surface-catalyzed Cr (+6) reduction: Reactivity comparisons of different organic reductants and different oxide surfaces. Environ Sci Technol. 30: 2484–2494. EPA – US Environmental Protection Agency. 2007. Framework for metals risk assessment: EPA 120/R-07/001. (http://water.epa.gov/scitech/wastetech/guide/metalfinishing/). Acesso: 28/06/13. Esteves, F. A.; Furtado, A. L. S. 2011. Oxigênio Dissolvido. In: Esteves, F. A. Fundamentos de limnologia. Vol 3. Interciência, Engenho Novo, Rio de Janeiro, p. 167– 190. Fadini, P.S.; Jardim, W. F. 2001. Is the Negro river basin (Amazon) impacted by naturally occurring mercury? Science of the Total Environment, 275: 71–82. FAO/WHO - Expert Committee on Food Additives. 2006. Evaluation of certain food additives and contaminants: sixty-seventh report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Rome, Italy, 67p. Fenech, M. 2000. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research, 445: 81–95. Ferraro, M. V.; Fenocchio, A.; Mantovani, M.; Ribeiro, C.; Cestari, M. M. 2004. Mutagenic effects of tributyltin and inorganic lead (Pb II) on the fish H. malabaricus as evaluated using the comet assay and the piscine micronucleus and chromosome aberration tests. Genet Mol Biol.: 27:103–107. Ferreira, E. J. G. 1998. Peixes comerciais do médio Amazonas: região de Santarém, Pará. Brasília, 213p. Forbes, A. 2009. Iron and parental nutrition. Gastroenterology, 137(5): 47–54. Forsberg, M. C. S.; Forsberg, B. R.; Zeidemman, V. K. 1999. Mercury contamination in humans linked to river chemistry. Ambio, 28: 519–521. Förstner, U.; Wittmann, G.T.W. 1983. Metal Pollution in the Aquatic Environment. Berlin, Springer-Verlag, 486p. Fréry N.; Maury-Brachet, R.; Maillot, E.; Deheeger, M.; Mérona, B.; Boudou, A. 2001. Gold mining activities and mercury contamination of native Amerindian communities in 93 French Guiana: key role of fish in dietary uptake. Environ Health Perpect, 109: 449– 456. Gillian, J.F.; Fraser, D. F. 2001. Movement in corridors: Enhancement by predation threat, disturbance, and habitat structure. Ecology, 82: 258–273. Goulding, M.; Barthem, R.; Ferreira, E. 2003. The Negro and the Trombetas – Black and Clear Waters from Ancient Lands. In: The Smithsonian Atlas of the Amazon. Smithsonian Institution Press, Washington, DC, 98p. Grisolia, C.K.; Cordeiro, C.M.T. 2000. Variability in micronucleus induction with different mutagens applied to several species of fish. Genetics and Molecular Biology, 23 (1): 235–239. Groff, A. A.; Silva, J.; Nunes, E. A.; Ianistcki, M.; Guecheva T. N.; Oliveira A. M.; Oliveira C. P. F.; Val, A. L.; Henriques, J. A. P. 2010. UVA/UVB-induced genotoxicity and lesion repair in Colossoma macropomum and Arapaima gigas Amazonian fish. Journal of Photochemistry and Photobiology (Biology), 99: 93–99. Heath, A. C. 1995. Water pollution and fish physiology, 2ª Ed. Lews, Boca Raton, 494p. Heddle, J. A. 1973. A rapid in vivo test for chromossomal damage. Mutation Research, 18: 187–190. Hedges, J. I.; Clark, W. A.; Quay, P. D. ; Richey, E. J.; Devol, H. A.; Santos, U. M. 1986. Compositions and fluxes of particulate organic material in the Amazon river. Limnology and Oceanography, 31: 717–738. IBGE. 2010. (http://www.censo2010.ibge.gov.br/sinopse/index.php?uf=13&dados=1). Censo. Acesso: 10/06/2013. IARC – International Agency for Research on Cancer. 1990. Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans: chromium, nickel and welding. Lyon, p. 49– 214. Jardim, W. F. 1988. Contaminação por mercúrio: fatos e fantasias. Ciência Hoje, 7: 78– 79. 94 Jardim, W. F.; Fadini, P. S. 1999. Há muito mercúrio natural no rio Negro, sem relação com o garimpo. Revista Fapesp, 47: 32–35. Jardim, W. F.; Bisinoti, M. C.; Fadini, P. S.; Silva, G. S. 2010. Mercury Redox Chemistry in the Negro River Basin, Amazon: The Role of Organic Matter and Solar Light. Aquatic Geochemical, 16: 267–278. Junk, W.J.1997. General Aspects of Floodplain Ecology with Special Reference to Amazonian Floodplains. In: W.J. Junk (ed.) The Central Amazon Floodplain, Ecology of a Pulsing System, Ecological Studies 126, Springer, Berlin. p. 3–17. Junk, W. J.; Piedade, M. T. F.; Schöngart J.; Cohn-Haft, M.; Adeney J. M.; Wittmann, F. 2011. A Classification of Major Naturally-Occurring Amazonian Lowland Wetlands. Wetlands, 31: 623–640. Küchler, I. L.; Miekeley N.; Forsberg B. R. 2000. A Contribution to the Chemical Characterization of Rivers in the Rio Negro Basin, Brazil. J. Braz. Chem. Soc., 11(3): 286–292. Lacerda, L. D.; Pfeiffer, W. C.; Malm, O.; Souza, C. M. M.; Bastos, W. R.; Silveira, E. G. 1987. Contaminação por mercúrio na Amazônia: Avaliação preliminar do Rio Madeira, Rondônia. Anais II Congresso Brasileiro de Geoquímica, p. 165–169. Lacerda, D. L. 1997. Contaminação por mercúrio no Brasil: fontes industriais versus garimpo de ouro. Química Nova, 20: 196–199. Lailson-Brito, J.; Cruz, R.; Dorneles, P.R.; Andrade, L.; Azevedo, A. F.; Fragoso, A. B.; Vidal, L. G.; Costa, M. B.; Bisi, T. L.; Almeida, R.; Carvalho, D. P.; Bastos, W. R.; Malm, O. 2012. Mercury-Selenium Relationships in Liver of Guiana Dolphin: The Possible Role of Kupffer Cells in the Detoxification Process by Tiemannite Formation. PLoS ONE 7(7): e42162. doi:10.1371/journal.pone.0042162. Langard, S. 1990. One hundred years of chromium and cancer: a review of epidemiological evidence and selected case reports. Am. J. Ind. Med., 17: 189–215. Lauren, D. J.; McDonald, D. G. 1987. Acclimation to copper by rainbow trout, Salmo gairdneri: biochemistry. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 44: 99– 104. 95 Lebel,l J.; Roulet, M.; Mergler, D.; Lucotte, M.; Larribe, F. 1997. Fish diet and mercury exposure in a riparian Amazonian population. Water Air Soil Pollution, 97: 31–44. Lemos C. T.; Iranço, F. A.; D'Ávila de Oliveira, N. C.; Souza, G. D.; Fachel, J. M. G. 2008. Biomonitoring of genotoxicity using micronuclei assay in native population of Astyanax jacuhiensis (Characiformes: Characidae) at sites under petrochemical influence. Sci Total Environ, doi:10.1016/j.scitotenv.2008.07.006. Macan, J. M.; Teixeira, G. A.; Pich, C. T. Pedrosa, R. C.; Fávere, V. T.; Geremias, R. 2012. Avaliação da toxicidade de drenagem ácida de mina de carvão, utilizando parâmetros físico-químicos e bioensaios. Brazilian Journal of Biosciences: 10(3): 275– 280. Mafra, D.; Cozzolino, S. M. F. 2004. The importance of zinc in human nutrition. Rev. Nutr, 17: 79–87. Malm, O.; Pfieffer, W. C.; Harada, M.; Souza, C. M. M. 1990. Mercury pollution due to gold mining in the Madeira river basin, Brazil. Science of the total Environment, 175: 141–150. Malm, O.; Branches, F. J. P.; Akagi, H.; Castro, M. B. ; Pfieffer, W. C.; Harada, M.; Bastos, W.; Kato, H. 1995. Mercury and methylmercury in fish and human hair from the Tapajós river basin, Brazil. Science of the total Environment, 175: 141–150. Malm, O.; Guimarães, J. R. D.; Castro, M. B.; Bastos, W. R.; Viana, J. P.; Branches. F. J. P.; Silveira, E. G.; Pfieffer, W. C. 1997. Follow-up of mercury levels in fish, human hair and urine in the Madeira and Tapajós basins, Amazon, Brazil. Watep, Air and Soil Pollution, 97: 45–51. Marques, D. F. 2011 Diversidade cromossômica e molecular (DNA Barcode) no complexo Hoplias malabaricus (Characiformes, Erythrinidae) da Região do Baixo Amazonas. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Oeste do Pará – Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais da Amazônia. Santarém, 71p. Martins, K. F.; Boschini Filho, J. 2003. Determinação da frequência de micronúcleos e outras alterações nucleares em células da mucosa bocal de indivíduos não-fumantes e fumantes. Revista da Faculdade de Ciências Médicas de Sorocaba, 5(1): 43–53. 96 Maurice-Bourgoin, L.; Gasc, F.; Seyler, P.; Elbaz Poulichet, F. 1999. Trace elements distribution in the Andean sub-basins of the Madeira river: role of the weathering processes in the freshwaters geochemistry. In: Manaus’99: Hydrological and Geochemical Processes in Large Scale River Basins. Mccarroll, N.; Keshava, N.; Chen, J.; Arkeman, G.; Kligerman, A.; Rinder, E. 2010. An evaluation of the mode of action framework for mutagenic carcinogens case study II: chromium (VI). Environmental and Molecular Mutagenesis, 51: 89–111. Minissi, S.; E. Lombi. 1997. Heavy metal content and mutagenic activity, evaluated by Vicia faba micronucleus test, of Tiber river sediments. Mutation Research, 39: 317–321. Miranda, R. G.; Pereira, S. F. P.; Alves, D. T. V.; Oliveira, G. R. F. 2009. Qualidade dos recursos hídricos na Amazônia – rio Tapajós: avaliação de caso em relação aos elementos químicos e parâmetros físico-químicos. Ambi-Agua, 4 (2): 75–92. Monteiro, V; Cavalcantea, D. G. S. M.; Viléla, M. B. F. A.; Sofia, S. H.; Martineza, C. B. R. 2011. In vivo and in vitro exposures for the evaluation of the genotoxic effects of lead on the Neotropical freshwater fish Prochilodus lineatus. Aquatic Toxicology 104: 291– 298. Nelson, J. S. 1994. Fishes of the world 3ª ed. John Wiley & Sons Inc, New York. 600 p. Oliveira, J. P. W.; dos Santos, R. N.; Pibernat, C. C.; Boeira, J. M. 2012. Genotoxicity and Physical Chemistry Analysis of waters from Sinos River (RS) using Allium cepa and Eichhornia crassipes as bioindicators. Biochemistry and Biotechnology Reports, 1(1): 15–22. Oyakawa. O. T. 2003. Family Erythrinidae. In: reis, R. E.; Kullander, S. O.; Ferraris J. R. C. J. Check list of the freshwater fishes of South and Central America. EDIPUCRS, Porto Alegre,. p. 238–240. Peakall, D. B. 1994. The role of biomarkers in environmental assessment (1). Introduction. Ecotoxicology, 3: 157–160. Pfeiffer, W. C.; Lacerda, L. D. 1988. Mercury inputs to the Amazon region, Brazil. Environmental Technology Letters, 9: 325–30. 97 Pfeiffer, W. C.; Malm, O.; Souza, C. M. M.; Silveira, E. G. ; Bastos, W. R.; 1989. Mercury concentration in inland waters of gold mining areas in Rondônia, Brazil. Sci. Total Environ. 87: 33–240. Pinheiro, M. C. N.; Nakanishi, J.; Oikawa, T.; Guimarães, G.; Quaresma, M.; Cardoso, B.; Amoras, W. W.; Harada, M.; Magno, C.; Vieira, J. L. F.; Xavier, M. B.; Bacelar, D. R. 2000. Methylmercury human exposure in riverine villages of Tapajos basin, Pará State, Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 33(3): 265–269. PNPO – Programa Nacional de Prospecção de Ouro. 1999. Mapa de Reservas e Produção de Ouro do Brasil. Ministério de Minas e Energia. (http://www.cprm.gov.br/arquivos/pdf/recmin/mapareserva.pdf). Acesso: 30/06/2013. Porto, J. I. R.; Araújo, C. S. O.; Feldberg, E. 2005. Mutagenic effects of mercury pollution as revealed by micronucleus test on three Amazonian fish species. Environmental Research, 97: 287–292. Pretti, E.; Cavalcante, C.; Simonato J. D.; Martinez, C. B. R. 2007. Ensaio do cometa e indução de anormalidades eritrocíticas nucleares para detecção de genotoxicidade e mutagenicidade no peixe neotropical Prochilodus lineatus expostos à fração solúvel da gasolina. Anais do VIII Congresso de Ecologia do Brasil. Caxambu – MG. Queiroz, M. M. A, Horbe, A. M. C.; Seyler, P.; Moura, C. A. V. 2009. Hidroquímica do rio Solimões na região entre Manacapuru e Alvarães – Amazonas – Brasil. Acta Amazonica, 39 (4): 943–952. Rabitto, I. S; Bastos, W. R.; Almeida, R.; Anjos A.; Holanda, I. B. B.; Galvão, R. C. F.; Filipak Neto, F.; Menezes, M. L.; Santos, C. A. M.; Ribeiro, C. A. O. 2011. Mercury and DDT exposure risk to fish-eating human populations in Amazon. Environment International, 37: 56–65. Rai, D.; Sass, J.M.; Moore, D.A. 1987. Chromium (III) hydrolysis constants and volubility of chromium (III) Hydroxide Inorg. Inorganic Chemistry. 26(3): 345–349. Ramsdorf, W.; Ferraro, M. V. M.; Oliveira-Ribeiro, C. A.; Costa, J. R. M.; Cestari, M. M. 2009. Genotoxic evaluation of different doses of inorganic lead (PbII) in Hoplias malabaricus. Environ Monit Assess:,158:77–85. 98 Rashed, M.N. 2001. Monitoring of environmental heavy metals in fish from Nasser lake. Environment International, 27: 27–33. Riba, I.; Blasco J.; Jiménez-Tenorio N.; González de Canales M.L.; Ángel DelValls T. 2005. Heavy metal bioavailability and effects: II. Histopathology–bioaccumulation relationships caused by mining activities in the Gulf of Cádiz (SW, Spain). Chemosphere, 58: 671–682. Ribeiro L. R.; Salvadori, D. M. F.; Marques, E. K. 2003. Mutagênese Ambiental. ULBRA, Canoas. 356pp. Rocha, J. C.; Rosa, A. H. 2003. Substâncias húmicas aquáticas: interações com espécies metálicas. UNESP, São Paulo. p. 41–72 Rocha, C. A. M.; Santos, R. A.; Bahia, M. O.; Cunha, L. A.; Ribeiro, H. F.; Burbano, R. M. R. 2009. The Micronucleus Assay in Fish Species as an Important Tool for Xenobiotic Exposure Risk Assessment - A Brief Review and an Example Using Neotropical Fish Exposed To Methylmercury. Fisheries Science, 17: 478–484. Rocha, C. A. M.; Almeida, V. H. C.; Silva Pinheiro, R. H. S.; Cunha, L. A. 2010. Micronuclei and other nuclear abnormalities in acará Aequidens tetramerus (Perciformes: Cichlidae) exposed to Copper Sulfate. Uakari, 6 (2): 57–66. Roulet, M.; Lucotte, M.; Saint-Aubin, A.; Tran, S.; Rhéault, I.; Farella, N.; De Jesus Da silva, E.; Dezencourt, J.; Sousa Passos, C.-J.; Santos Soares, G.; Guimarães, J.-R.D.; Mergler, D.; Amorim, M. 1998. The geochemistry of mercury in central Amazonian soils developed on the Alter-do-Chão formation of the lower Tapajós River Valley, Pará state, Brazil. The Science of the Total Environment, 223: 1–24. Roulet, M.; Lucotte, M.; Farella, N.; Serique, G.; Coelho, H.; Sousa-Passos, C. J.; Silva, E. J.; Scavone, E.; Andrade, P.; Mergler, D., Guimarães, J. R. D.; Amorim, M. 1999. Effects of recent human colonization on the presence of mercury in Amazonian ecosystems. Water Air Soil Pollution, 112: 297–313. Roulet, M.; Lucotte, M.; Canuel, R.; Peleja, J. R. P.; Farella, N.; Guimarães, J. R. D.; Mergler, D.; Amorin, M. 2001. Spatio-temporal geochemistry of Hg in waters of the Tapajós and Amazon rivers, Brazil. Limnology Oceanography, 46:1158–1170. 99 Sánchez, P.; Llorente, M. T.; Castaño A. 2000. Flow cytometric detection of micronuclei and cell cycle alterations in fish-derived cells after exposure to three model genotoxic agents: mitomycin C, vincristine sulfate and benzo(a)pyrene. Mutation Research, 465: 113–122. Santos, G.M.; Ferreira, E.J.G. 1999. Peixes da bacia Amazônica. In: Lowe-McConnel, R. H. (Ed.). Estudos ecológicos de comunidades de peixes tropicais. São Paulo, EDUSP, p 345–375. Schmid, W. 1975. The micronucleus test. Mutation Research Amsterdam, 31: 915. Seyler, P.T.; Boaventura, G. R. 2001. Trace elements in the mainstream Amazon river. In: McClain, M.E.; Victoria, F.R.L.; Richey, J.E. (Eds). The biogeochemistry of the Amazon basin. Oxford Press, p. 307–327. Shahidul-Islam, M.; Tanaka, M. 2004. Impacts of pollution on coastal and marine ecosystems including coastal and marine fisheries and approach for management: a review and synthesis. Marine Pollution Bulletin, 48: 624–649. Silva, J.; Erdtmann, J. A. B.; Henriques, J. A. P. 2003. Genética Toxicológica. Ed. Alcance, Porto Alegre. 424p. Silva, G. S.; Filipak Neto, F.; Assis, H. C. S.; Bastos, W. R.; Ribeiro, C. A. O. 2012. Potential risks of natural mercury levels to wild predator fish in an Amazon reservoir. Environ Monit Assess,184:4815–4827. Sindayigaya, E., R. V. Cauwnbergh, H. Robberecht, and H. Deelstra. 1994. Copper, zinc, manganese, iron, lead, cadmium, mercury, and arsenic in fish from Lake Tanganyika, Burundi. The Science of the Total Environment, 144:103–115. Sioli, H. 1950. Das Wasser im Amazonasgebiet. Forsch.u.Fortschr. vol. 26: 274–280. Sioli, H. 1956. As águas da região do alto rio negro. Belém: IAN: p117-155 (IAN. Boletim Tecnico, 032). Sioli, H. 1984a. Hydrochemistry and geology in the Brazilian Amazon region. Amazoniana, 1: 74–83. 100 Sioli, H. 1984b. The Amazon and its main affluents: Hydrography, morphology of the river sourses, and river types. In: Sioli, H. (ed.) The Amazon: Limnology and Lanscape Ecology of a Mighty Tropical River and its Basin. Junk Publishers, Holanda. p. 127-165. Siqueira, G. W.; Pereira, S. F. P.; Aprile, F. M. 2006. Determination of trace elements (Zn, Co and Ni) in sediments at the Amazon Continental shelf on influence of the Amazon River discharge. Acta Amazonica, 36(3): 321–326. Souza, G. R.; Garcez, M. A. P.; Santos, V. C. G.; Silva, D. B.; Caetano, J.; Dragunski, D. C. 2009. Quantificação de metais pesados em peixes de um pesqueiro localizado na cidade de Umuarama - Pr. Arq. Ciênc. Vet. Zool. Unipar, Umuarama, 12(1): 61–66. Tapisso, J. T.; Marques, C. C.; Mathias, M. L. Ramalhinho, M. G. 2009. Induction of micronuclei and sister chromatid exchange in bone-marrow cells and abnormalities in sperm of Algerian mice (Mus spretus) exposed to cadmium, lead and zinc. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 678(1): 59–64. Thier, R.; Bonacker, D.; Stoiber, T.; Böhm, K.; Wang, M.; Unger, E.; Bolt, H.; Degen, G. 2003. Interaction of metal salts with cytos-keletal motor protein systems. Toxicol Lett., 140(41):75–81. Thurman, E.M., 1985. Geochemistry of Natural Waters. Martinus Nijhof/Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht, Boston, USA, pp. 497. Udroiu, I. 2006. The micronucleus test in piscine erythrocytes. Aquatic Toxicology, 79: 201–204. Van der Oost, R.; Beyer, J.; Vermeulen, N. P. E. 2003. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review. Environmental Toxicology and Pharmacology, 13: 57–149. Vargas, V.M.F.; Migliavacca, S.B.; Melo, A.C.; Horn R.C.; Guidobono, R.R.; Ferreira, I.C.F.S.; Pestana, M.H.D. 2001. Genotoxicity assessment in aquatic environments under the influence of heavy metals and organic contaminants. Mutation Research, 490:141–158. Venkatramreddy, V.; Vutukuru, S. S.; Tchounwou, P. B. 2009: Ecotoxicology of hexavalent chromium in fresh water fish. Rev Environ Health. 24(2): 129–145. 101 Vicari, M. R; Artoni, R. F; Bertollo L. A. C. 2005. Comparative cytogenetics of Hoplias malabaricus (Pisces, Erythrinidae). A population analysis in adjacent hydrographic basins. Genetics and Molecular Biology, 28(1): 103–110. Vicari, T.; Ferraro, M. V. M.; Ramsdorf, W. A.; Mela, M.; de Oliveira Ribeiro, C. A.; Cestari, M. M. 2012. Genotoxic evaluation of different doses of methylmercury (CH3Hg+) in Hoplias malabaricus. Ecotoxicology and Environmental Safety, 82: 47–55. Vutukuru, S. S. 2005. Acute effects of hexavalent chromium on survival, oxygen consumption, hematological parameters and some biochemical profiles of the Indian major carp, Labeo rohita. Int J Environ Res Public Health, 2 (3-4): 456–62. Wang, M.; Riffel, M. 2011. Making the right conclusions based on wrong results and small sample sizes: Interpretation of statistical tests in ecotoxicology. Ecotoxicology and Environmental Safety, 74: 684–692. Wood, C. M.; Al-Reasi, H.A.; Smith, D. S. 2011. The two faces of DOC. Aquatic Toxicology, 105: 3–8. Zeidemann V. K. 1998. A geoquímica de mercúrio em solos da bacia do Rio Negro e sua influência no ciclo regional do mercúrio. Ecologia, 75. 102 Anexo 103