HELANO CARIOCA FREITAS
ENVOLVIMENTO DA INTERLEUCINA-18 (IL-18) NA
PATOGÊNESE DA MUCOSITE GASTROINTESTINAL INDUZIDA
PELO CLORIDRATO DE IRINOTECANO (CPT-11)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro
FORTALEZA – CEARÁ
2007
HELANO CARIOCA FREITAS
ENVOLVIMENTO DA INTERLEUCINA-18 (IL-18) NA
PATOGÊNESE DA MUCOSITE GASTROINTESTINAL INDUZIDA
POR IRINOTECANO (CPT-11)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro
Aprovado em: 19 de Dezembro de 2007
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________
Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro (Orientador)
Universidade Federal do Ceará - UFC
__________________________________________________
Prof. Dr. Reinaldo Barreto Oriá
Universidade Federal do Ceará - UFC
__________________________________________________
Prof. Dr. Fernando de Queiroz Cunha (Professor Titular)
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP
À minha Débora, grande amor,
Que sempre me dá força pra seguir adiante.
Aos meus pais e irmãos, grandes exemplos
AGRADECIMENTOS
Ao professor Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, pelo incentivo à iniciação
científica e pelo apoio, exemplo e amizade ao longo dos últimos treze anos.
Ao professor Fernando de Queiroz Cunha, pela receptividade em seu
laboratório, onde grande parte deste trabalho foi realizada.
Às professoras Gerly Anne de Castro Brito e Mariana Lima Vale, pela
disponibilidade e ajuda nas análises histológicas e imunoistoquímica.
Ao amigo Roberto César Lima, pela imensa colaboração neste trabalho.
Aos estudantes, Larissa Eloy, Victor Parahyba, Lorena Granja e Leandro
Leite, cuja ajuda foi vital para a conclusão deste trabalho.
Aos técnicos Maria Silvandira França Pinheiro (Vandinha), pela ajuda e
disponibilidade e José Ivan Rodrigues de Souza, pelo capricho na confecção
dos cortes histológicos.
À técnica Giuliana Bertozzi, pela ajuda nas dosagens de citocinas em
Ribeirão Preto.
Aos colegas do Oncocentro, Ana Angélica Andrade, Kelly Carneiro e
Roberto Furlani, pelo apoio e compreensão em minhas ausências.
Aos meus amigos, a quem procuro nas horas difíceis e com quem
desejo comemorar as alegrias.
A Marta Edna e Juan, pela receptividade e carinho com que sempre me
acolheram em Ribeirão Preto.
Finalmente, aos meus pais, pelo sacrifício para priorizar a educação dos
filhos. Aos meus irmãos, Max e Fred, pelo exemplo. À minha esposa, Débora,
pelo companheirismo em todas as horas. Aos meus sobrinhos, Vitinho e
Fredinho, pela alegria que trazem a nossa família e à Nina, companheira das
noites em claro.
RESUMO
Envolvimento da interleucina-18 (IL-18) na patogênese da mucosite
gastrointestinal (MGI) induzida por irinotecano (CPT-11). Autor: HELANO
CARIOCA FREITAS. Mestrado em Farmacologia, Departamento de Fisiologia e
Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará. Defesa: 20 de
Dezembro de 2007. Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro.
Introdução: MGI é o termo que descreve os efeitos da quimioterapia antineoplásica
nas mucosas, podendo acometer o trato alimentar de maneira global ou localizada. 15
a 40% dos pacientes em quimioterapia apresentam algum grau de mucosite. Muito da
fisiopatologia da MGI permanece desconhecido. A IL-18 é uma citocina pleiotrópica,
com função regulatória sobre o sistema imune e envolvimento nas fases iniciais da
inflamação. Objetivo: Avaliar o envolvimento de IL-18 na patogênese da MGI induzida
por CPT-11. Materiais e Métodos: camundongos Balb/C IL-18Wt ou IL-18KO,
machos, foram tratados durante quatro dias consecutivos com CPT-11 (60mg/Kg, i.p.)
ou veículo (0,5 mL, i.p.). Um grupo de animais IL-18Wt recebeu, além do CPT-11, a
proteína ligante de IL-18 (IL-18Bp; 200µg, i.p.). Os seguintes parâmetros foram
avaliados: diarréia, leucograma, sobrevida, análise histopatológica, atividade de
mieloperoxidade (MPO), dosagem de citocinas (TNF-α, IL-1β) por ELISA e
imunoistoquímica para TNF-α e IL-1β nas mucosas ileais. Resultados: CPT-11
induziu diarréia significante e promoveu alterações intestinais exuberantes
(encurtamento de vilos, achatamento e vacuolização de enterócitos, necrose em
criptas e infiltrado inflamatório de leucócitos polimorfonucleares e células
mononucleares) Observou-se aumento da atividade de MPO e dos níveis tissulares de
TNF-α e IL-1β dosados por ELISA e intensa imunomarcação com anticorpos antiTNFα e anti-IL-1β nesses animais. Além disso, tais animais apresentaram resposta
contrátil intestinal exacerbada ao estímulo com colinérgicos (acetilcolina e betanecol).
Os animais IL-18KO tratados com CPT-11 apresentaram diarréia estatisticamente
menos severa e menor intensidade de alterações morfométricas e histológicas. Não
houve aumento de TNFα, mas houve de IL-1β, a atividade de MPO não diferiu da
observada nos animais que receberam veículo e não houve aumento de resposta
contrátil ao estímulo colinérgico. Os animais que receberam CPT-11 e IL-18Bp
apresentaram diarréia estatisticamente menos intensa que aqueles que receberam
apenas CPT-11, resposta contrátil estatisticamente menos acentuada e menor
atividade de MPO. Entretanto, as alterações morfométricas e histológicas não
diferiram das encontradas nos animais tratados só com CPT-11. Conclusão: IL-18
está envolvida na patogênese da MGI induzida por CPT-11. IL-18Bp atenua os
eventos envolvidos na MGI induzida por CPT-11 e é um possível candidato a
modulador farmacológico desse processo. As alterações contráteis no intestino
promovidas pelo CPT-11 parecem ter um componente inflamatório.
Palavras-Chave: mucosite, interleucina-18.
ABSTRACT
Involviment of interleukin-18 (IL-18) in the pathogenesis of gastrointestinal
mucositis (GIM) induced by irinotecan (CPT-11). HELANO CARIOCA FREITAS.
Post-graduation in Pharmacology. Department of Physiology and Pharmacology,
Faculty of Medicine, Federal University of Ceará. Defense: 2007, December 20.
Advised by Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro.
Introduction: The term GIM refers to the adverse effects of cancer chemotherapy on
mucosal surfaces, affecting different portions of the alimentary tract. 15% to 40% of
patients in chemotherapy present some degree of mucositis. By now, much of GIM
pathophysiology remains unknown. IL-18 is a pleiotropic cytokine that exerts regulatory
functions over the immune system and is also involved in inflammation. Purpose: The
aim of the present study was to elucidate the involvement of IL-18 in the pathogenesis
of CPT-11-induced mucositis. Materials and methods: Male IL-18 wild type (Wt) or IL18 knockout (KO) Balb/C mice received CPT-11 (60mg/kg/day, i.p.) or vehicle (0.5ml,
i.p.) in a four day schedule. A group of IL-18Wt also received IL-18 binding protein (IL18Bp, 200µg, i.p., 1h before CPT-11). Animals were sacrificed on the fifth day. The
following parameters were assessed: histologycal analysis, diarrhea, survival curve,
leucogram, myeloperoxidase (MPO) activity assay, ileum levels of TNF-α and IL-1β by
ELISA, immunohistochemistry for TNF-α and IL-1β and contractility assay. Results: IL18Wt animals receiving CPT-11 presented diarrhea and intense histological alterations
in the ileum (shortening of villi, flattening and vacuolization of enterocytes, cript
necrosis and the presence of inflammatory infiltrate). There was also increased MPO
activity, increased levels of TNF-α and IL-1β and strong immunostaining for TNF-α and
IL-1β in the ileum. In addition, the CPT-11 treated mice presented increased intestinal
contractility when stimulated with cholinergic drugs (bethanecol, BCh and
acetylcholine, ACh). In contrast, IL-18KO animals treated with the same dose of CPT11 presented less diarrhea and less intestinal histological alterations. There was no
increase in MPO activity nor in TNF levels, but in IL-1 levels. In addition, TNF−α and IL1β immunostaining was weaker IL-18KO animals. Also, the intestinal contractility in IL18KO animals was not exarcerbated after a cholinergic challenge. IL-18Wt animals
receiving CPT-11 and IL-18Bp did not present significant diarrhea and there was no
significant alterations on intestinal contractility after Ach administration. Although MPO
activity was not increased in IL-18Bp treated animals, the ileal mucosa presented
moderate to severe histological alterations. Conclusion: IL-18 participates in the CPT11-induced GIM. IL-18Bp attenuates some inflammatory (cell infiltrate) and functional
(diarrhea and contractility) events of CPT-11-induced GIM. The contractility alterations
in CPT-11 treated animals seem to have an inflammatory related component.
Key Words: mucositis, interleukin-18.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 -
Constelação de sintomas e alterações clínicas da
mucosite gastrointestinal....................................................
21
FIGURA 2 -
Ativação e via de sinalização de IL-18...............................
27
FIGURA 3 -
Estrutura química do CPT-11.............................................
31
FIGURA 4 -
Metabolismo do CPT-11.....................................................
33
FIGURA 5-
Polimorfismos no gene UGT1A1 correlacionam-se com a
toxicidade do CPT-11.........................................................
35
FIGURA 6-
Escores de diarréia.............................................................
44
FIGURA 7-
Efeito da administração de cloridratro de irinotecano
(CPT-11) no leucograma de camundongos Balb/c IL18Wt....................................................................................
FIGURA 8-
55
Efeito da administração de diferentes doses de cloridrato
de irinotecano (CPT-11) sobre a curva de sobrevida de
camundongos Balb/C IL-18Wt............................................
FIGURA 9 -
Fotomicrografias de camundongos Balb/C IL-18Wt e IL18KO injetados com salina 0,9% ou CPT-11.....................
FIGURA 10 -
56
57
Efeito da administração de diferentes doses de cloridrato
de irinotecano (CPT-11) na morfometria intestinal em
camundongos Balb/C IL-18Wt............................................
FIGURA 11 -
58
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sobre a atividade de mieloperoxidase (MPO) no
íleo de camundongos Balb/C IL-18Wt................................
FIGURA 12 -
59
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sobre os níveis de citocinas (TNF-α e IL-1β) no
íleo de camundongos Balb/C IL-18Wt................................
FIGURA 13 -
60
Fotomicrografias de imunomarcação com anticorpos antiTNFα no íleo de camundongos Balb/C IL-18Wt e IL18KO
injetados
com
salina
0,9%
ou
CPT-
11........................................................................................
61
FIGURA 14 –
Fotomicrografias de imunomarcação com anticorpos antiIL-1β no íleo de camundongos Balb/C IL-18Wt e IL-18KO
injetados com salina 0,9% ou CPT-11................................
FIGURA 15-
62
Efeito da administração de diferentes doses de cloridrato
de irinotecano (CPT-11) sobre a resposta contrátil do
duodeno
ao
estímulo
com
betanecol
(BCh)
em
camundongos Balb/C.........................................................
FIGURA 16 -
63
Efeito da administração de cloridratro de irinotecano
(CPT-11) no leucograma de camundongos Balb/C IL18KO..................................................................................
FIGURA 17 -
68
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sobre a curva de sobrevida de camundongos
Balb/C IL-18KO...................................................................
FIGURA 18 -
Fotomicrografias de camundongos Balb/C IL-18Wt e IL18KO injetados com salina 0,9% ou CPT-11.....................
FIGURA 19 -
69
70
Efeito da administração de cloridratro de irinotecano
(CPT-11) na morfometria intestinal em camundongos
Balb/C IL-18Wt e IL-18KO..................................................
FIGURA 20 -
71
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sobre a atividade de mieloperoxidase (MPO) no
íleo de camundongos Balb/C IL18KO................................
FIGURA 21 -
72
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sobre os níveis de citocinas (TNF-α e IL-1β) no
íleo de camundongos Balb/c IL-18KO................................
FIGURA 22 -
73
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sobre a resposta contrátil do duodeno ao
estímulo com acetilcolina (ACh) em camundongos Balb/C
IL-18KO...............................................................................
FIGURA 23 -
74
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) no leucograma de camundongos Balb/c IL18Wt tratados com IL-18Bp................................................
FIGURA 24 -
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sobre a curva de sobrevida de camundongos
79
Balb/C IL-18Wt tratados com IL-18Bp................................
FIGURA 25 –
Fotomicrografias
de
camundongos
Balb/C
80
IL-18Wt
injetados com CPT-11 com ou sem pré-administração de
IL-18Bp...............................................................................
FIGURA 26-
81
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) na morfometria intestinal em camundongos
Balb/c IL-18Wt tratados com IL-18Bp.................................
FIGURA 27 -
82
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sobre a atividade de mieloperoxidase (MPO) no
íleo de camundongos Balb/c IL18Wt tratados com IL18Bp....................................................................................
FIGURA 28 –
83
Efeito da administração de cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sobre a resposta contrátil do duodeno ao
estímulo com acetilcolina (ACh) em camundongos Balb/C
IL-18Wt tratados com IL-18Bp............................................
FIGURA 29 -
Modelo
hipotético
mediadores
proposto
inflamatórios
para
a
envolvidos
cascata
na
84
dos
mucosite
gastrointestinal induzida por CPT-11..................................
93
LISTA DE QUADROS E TABELAS
QUADRO 1-
Diarréia: Critérios de toxicidade comum (versão 3.0)............
QUADRO 2 -
Sumário de guidelines de práticas clínicas baseadas em
22
evidência para o cuidado de pacientes com mucosite
gastrointestinal........................................................................
TABELA 1 -
Efeito de diferentes doses de cloridrato de irinotecan (CPT11)
na
indução
de
diarréia
em
camundongos
Balb/C......................................................................................
TABELA 2 -
24
54
Avaliação da intensidade da diarréia em camundongos
geneticamente depletados de IL-18 (IL-18KO) tratados com
cloridrato de irinotecano (CPT-11)..........................................
TABELA 3 -
67
Efeito da administração da proteína ligante de IL-18 (IL18Bp) na intensidade da diarréia induzida pelo cloridrato de
irinotecano (CPT-11)...............................................................
78
LISTA DE ABREVIATURAS
α
Alfa D
β
Beta
µL
Microlitro
µm
Micrômetro
5-FU
5-Fluorouracil
ACh
Acetilcolina
AChE
Acetilcolinesterase
ANOVA
Análise de variância
APC
7-etil-10-[4-N-(5-ácido aminopentanóico)-1-piperidino]carboxiniloxicamptotecina
BSA
Albumina sérica bovina
CE
Carboxilesterase
CPT-11
Cloridrato de irinotecano
DAB
3,3’ peróxido de diaminobenzidina
DMSO
Dimetil sulfóxido
DNA
Ácido desoxirribonucléico
ELISA
Ensaio imunoenzimático
EPM
Erro padrão da média
H&E
Hematoxilina e eosina
IFN
Interferon
IkB
Inibidor kappa B
IL-
Interleucina
IL-1ra
Antagonista do receptor de IL-1
i.p.
Intraperitoneal
i.v.
Intravenosa
KC
Quimiocina derivada de queratinócitos
kg
Quilograma
KGF
Fator de crescimento de queratinócitos
M
Molar
MAPK
Proteína quinase ativada por mitógenos
md
Mediana
mg
Miligrama
MGI
Mucosite Gastrointestinal
mL
Mililitro
mm3
Milímetro cúbico
MPO
Mieloperoxidase
MRP2
Proteína 2 associada a resistência multidroga
NF-κB
Fator de transcrição nuclear kappa B
NK
Natural Killer
NO
Óxido nítrico
NPC
7-etil-10-[4-amino-1-piperidino-]-carboniloxiicamptotecina
OPD
O-fenilenediamine diidrocloreto
PBMCs
Células mononucleares do sangue periférico
PBS
Solução tamponada de fosfato
pg
Picograma
PG
Prostaglandina
PGl2
Prostaciclina
P-gp
Glicoproteína P
PMN
Polimorfonucleares
PTX
Pentoxifilina
q.s.p.
Quantidade suficiente para
rhIL-11
IL-11 recombinante humano
RNA
Ácido ribonucléico
RNAm
RNA mensageiro
ROS
Espécies reativas de oxigênio
SCFAs
Ácidos graxos de cadeia curta
SN-38
7-etil-10-hidroxicamptotecina
SN-38G
SN-38 glicuronídio
s.c.
Subcutânea
Th
T helper
TNF
Fator de necrose tumoral
UDP-GT
Uridina difosfato glicuronosil-transferase
v.o.
Via oral
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................
18
1.1 Mucosite gastrointestinal (MGI).......................................................
19
1.1.1 Aspectos clínicos e abordagem terapêutica atual............................
19
1.1.2 Fisiopatogenia..................................................................................
20
1.2 Interleucina-18 (IL-18)........................................................................
25
1.3 Cloridrato de irinotecano (CPT-11)..................................................
30
1.3.1 Estrutura química..............................................................................
31
1.3.2 Farmacocinética................................................................................
32
1.3.3 Mecanismo de ação..........................................................................
36
1.3.4 Toxicidade.........................................................................................
36
1.4 Justificativa.........................................................................................
38
1.5 Objetivos.............................................................................................
39
2 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................
40
2.1 Animais de experimentação.............................................................
40
2.2 Drogas, soluções, corantes e anticorpos.......................................
40
2.3 Indução da MGI..................................................................................
42
2.4 Grupos experimentais.......................................................................
42
2.4.1 Grupo normal....................................................................................
42
2.4.2 Grupo controle..................................................................................
43
2.4.3 Grupos teste.....................................................................................
43
2.5 Parâmetros avaliados.......................................................................
43
2.5.1 Diarréia............................................................................................
43
2.5.2 Leucograma.....................................................................................
44
2.5.3 Sobrevida.........................................................................................
45
2.5.4 Análise histopatológica e morfométrica...........................................
45
2.5.5 Dosagem de mieloperoxidase (MPO)..............................................
46
2.5.6 Dosagem de citocinas (TNF-α e IL-1β) no íleo................................
46
2.5.7 Avaliação da expressão de citocinas (TNF-α e IL-1β) por
imunoistoquímica.......................................................................................
47
2.5.8 Contratilidade in vitro de duodeno...................................................
48
2.6 Análise estatística.............................................................................
49
3 RESULTADOS......................................................................................
50
3.1.1 Avaliação do leucograma de camundongos Balb/C após a
administração de CPT-11..........................................................................
50
3.1.2 Avaliação da sobrevida de camundongos Balb/C após a
administração de CPT-11..........................................................................
50
3.1.3 Avaliação dos escores de diarréia após a administração de CPT-11
em camundongos Balb/C............................................................................
51
3.1.4 Alterações nas estruturas histológicas do intestino após a
administração de CPT-11 em camundongos Balb/C...................................
51
3.1.5 Alterações nos parâmetros morfométricos do íleo após a
administração de CPT-11 em camundongos Balb/C...................................
52
3.1.6 Avaliação da atividade de mieloperoxidase (MPO) no íleo de
camundongos Balb/C após a administração de CPT-11..........................
52
3.1.7 Quantificação dos níveis de citocinas (TNFα e IL-1β) no íleo de
camundongos Balb/C após a administração de CPT-11...........................
52
3.1.8 Avaliação da expressão de citocinas (TNFα e IL-1β) no íleo de
camundongos Balb/C após a administração de CPT-11...........................
52
3.1.9 Avaliação da resposta contrátil do duodeno ao estímulo com
betanecol (BCh) em camundongos Balb/C após a administração de CPT11..................................................................................................................
3.2.
Avaliação
de
parâmteros
relacionados
à
53
mucosite
gastrointestinal após a administração de CPT-11 em camundongos
Balb/C geneticamente depletados de IL-18 (IL-18KO).........................
64
3.2.1 Avaliação do leucograma de camundongos Balb/C IL-18KO após a
administração de CPT-11.......................................................................
54
3.2.2 Avaliação da sobrevida de camundongos Balb/C IL-18KO após a
administração de CPT-11..........................................................................
64
3.2.3 Avaliação dos escores de diarréia após a administração de CPT-11
em camundongos Balb/C IL-18KO.......................................................
64
3.2.4 Alterações nas estruturas histológicas do intestino após a
administração de CPT-11 em camundongos Balb/C IL-18KO..................
65
3.2.5 Alterações nos parâmetros morfométricos do íleo após a
administração de CPT-11 em camundongos Balb/C IL-18KO..................
66
3.2.6 Avaliação da atividade de mieloperoxidase (MPO) no íleo de
camundongos Balb/C IL-18KO após a administração de CPT-11............
66
3.2.7 Quantificação dos níveis de citocinas (TNFα e IL-1β) no íleo de
66
camundongos Balb/C IL-18KO após a administração de CPT-11............
3.2.8 Avaliação da expressão de citocinas (TNFα e IL-1β) no íleo de
66
camundongos Balb/C IL-18KO após a administração de CPT-11............
3.2.9 Avaliação da resposta contrátil do duodeno ao estímulo com
acetilcolina
(ACh)
em
camundongos
Balb/C
IL-18KO
após
a
administração de CPT-11..........................................................................
3.3.
Avaliação
gastrointestinal
de
em
parâmetros
relacionados
camundongos
Balb/C
à
IL-18Wt
67
mucosite
após
a
administração da proteína ligante de IL-18 (IL-18Bp) e CPT-11..........
75
3.3.1 Avaliação do leucograma de camundongos Balb/C IL-18Wt após a
administração de IL-18Bp e CPT-11......................................................
75
3.3.2 Avaliação da sobrevida de camundongos Balb/C IL-18Wt após a
administração de IL-18Bp e CPT-11.........................................................
75
3.3.3 Avaliação dos escores de diarréia em camundongos Balb/C IL18Wt após a administração de IL-18Bp e CPT-11....................................
75
3.3.4 Alterações nas estruturas histológicas do íleo de camundongos
Balb/C IL-18Wt após a administração de IL-18Bp e CPT-11....................
76
3.3.5 Alterações nos parâmetros morfométricos do íleo de camundongos
Balb/C
IL-18Wt
após
a
administração
de
IL-18Bp
e
CPT-
11................................................................................................................
76
3.3.6 Avaliação da atividade de mieloperoxidase (MPO) no íleo de
camundongos Balb/C IL-18Wt após a administração de IL-18Bp e CPT11..................................................................................................................
77
3.3.7 Avaliação da resposta contrátil do duodeno ao estímulo com
acetilcolina
(ACh)
em
camundongos
Balb/C
IL-18Wt
após
a
administração de IL-18Bp e CPT-11............................................................
77
4 DISCUSSÃO..........................................................................................
85
5 CONCLUSÕES......................................................................................
92
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................
94
ANEXOS....................................................................................................
104
18
1 INTRODUÇÃO
Ao
longo
das
últimas
cinco
décadas, o
número
de
agentes
antineoplásicos tem crescido exponencialmente e contribuído para o aumento
da qualidade de vida e da sobrevida de pacientes com inúmeros tipos de
câncer (KENNEDY, 1991). Entretanto, os pacientes passaram a sofrer com
efeitos adversos limitantes como náuseas e vômitos, neutropenia, infecções,
mucosite gastrointestinal (MGI), entre outros.
Além de prejudicar a qualidade de vida dos pacientes, os efeitos
adversos relacionados à quimioterapia antineoplásica podem representar
prejuízo à eficácia terapêutica, pois são frequentes os atrasos em ciclos de
tratamento subsequentes, reduções de doses e baixa aderência por parte dos
pacientes (SONIS et al., 2004b; RUBENSTEIN et al., 2004).
Nos últimos anos, a qualidade de vida dos pacientes e a paliação dos
sintomas, sejam relacionados à doença ou ao tratamento, têm ganho maior
atenção por parte dos oncologistas.
No início da década de 1990, a chegada ao mercado de uma nova
classe de fármacos antieméticos da família dos inibidores do receptor 5-HT3 da
serotonina, representou uma inquestionável mudança de paradigma no manejo
de náuseas e vômitos relacionados à quimioterapia (KRIS et al., 1989).
O melhor suporte hemoterápico e a disponibilidade de fatores de
crescimento de granulócitos e de eritropoetina recombinante, também tornou a
mielotoxicidade relacionada à quimioterapia bem mais contornável.
Entretanto, apesar dos avanços na compreensão e no tratamento de
alguns
efeitos
adversos
dos
fármacos
antineoplásicos,
outros
ainda
permanecem pouco compreendidos, como a MGI, cujo tratamento ainda hoje
resume-se predominantemente a analgésicos, higiene da cavidade oral e
antidiarréicos.
Mucosite alimentar ou gastrointestinal é o termo clínico usado para
descrever os efeitos colaterais da quimioterapia antineoplásica e da
radioterapia nas mucosas, podendo acometer as mucosas do trato alimentar de
maneira global ou localizada. Os pacientes com mucosite oral podem
19
apresentar dor na mucosa oral, eritema, úlceras profundas com formação de
pseudomembranas, além de dificuldade de falar e de deglutir. A MGI é
caracterizada por náuseas, vômitos, dor abdominal, diarréia aquosa e, em
casos mais severos, hemorragia, necrose, formação de fístula e perfuração
intestinal (GIBSON et al., 2002; BLIJLEVENS et al., 2007). Sua incidência é
variável e influenciada por fatores como idade e nível de saúde bucal do
paciente e pelas características do tratamento em questão (PICO et al., 1998).
De forma geral, cerca de 15 a 40% dos pacientes em quimioterapia
apresentam algum grau de mucosite (PICO et al., 1998, RUBENSTEIN et al.,
2004). Entretanto, naqueles submetidos a transplante de medula óssea a
incidência pode chegar próximo a 100% (RUBENSTEIN et al., 2004).
A ocorrência de mucosite e seu grau de intensidade podem retardar ou
impedir
a
continuação
do
tratamento
antineoplásico.
Pacientes
que
apresentaram mucosite tendem a receber doses reduzidas de quimioterapia
nos ciclos subseqüentes ao episódio de mucosite (RUBENSTEIN et al., 2004),
Além disso, em pacientes neutropênicos, a presença de mucosite representa
um aumento de quatro vezes no risco de sepse (PICO et al., 1998). Portanto,
esse efeito adverso tem o potencial de interferir diretamente na eficácia e no
risco de um tratamento.
O objeto de investigação do presente estudo é a MGI induzida pelo
fármaco antineoplásico irinotecano (CPT-11) em camundongos, com especial
ênfase ao papel da interleucina-18.
1.1 Mucosite gastrointestinal (MGI)
1.1.1 Aspectos clínicos e abordagem terapêutica atual
Os pacientes podem apresentar mucosite em diferentes graus de
intensidade. Os quadros mais leves de mucosite oral cursam com dor e eritema
da mucosa e os mais graves cursam com ulcerações profundas, formação de
pseudomembranas e impossibilidade de alimentação por via oral. A MGI pode
20
estar relacionada a dor abdominal, náuseas, vômitos e diarréia. Clinicamente, a
diarréia é o sintoma mais marcante, podendo ser aquosa e em pequeno
volume uma ou duas vezes ao dia ou, nos casos mais severos, em número
superior a dez episódios por dia. Nos quadros mais dramáticos, pode haver
necessidade de nutrição parenteral ou até de intervenções cirúrgicas em casos
de perfuração intestinal ou hemorragia maciça (GIBSON et al., 2002;
BLIJLEVENS et al., 2007). A Figura 1 ilustra a ampla constelação de sintomas
e complicações decorrentes da MGI.
O Quadro 1 descreve os critérios de graduação da diarréia formulados
pelo Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI –National Cancer
Institute), usados universalmente em estudos clínicos e também na prática
clínica assistencial.
Em 2004, a Seção de Estudos de Mucosite da Associação Multinacional
de Terapia de Suporte em Câncer e da Sociedade Internacional de Oncologia
Oral publicou o primeiro guideline de tratamento de mucosite alimentar
baseado em revisão sistemática da literatura médica publicada entre 1966 e
2002 (RUBENSTEIN et al., 2002). O grupo propôs-se a realizar reavaliações
trienais do guideline e, em 2007, foi publicada sua primeira revisão (KEEFE et
al., 2007). O Quadro 2 resume as recomendações do guideline para o
tratamento da MGI, segmento do trato alimentar de particular interesse para o
presente estudo.
1.1.2 Fisiopatogenia
Até recentemente acreditava-se que a mucosite relacionada à
quimioterapia e à radioterapia ocorria em consequência à lesão direta das
células com alto poder de proliferação das camadas basais do epitélio do trato
alimentar. Dessa maneira, acreditava-se, o epitélio perdia temporariamente a
capacidade de regeneração e a lâmina própria ficava exposta ao conteúdo do
lúmen (SONIS, 2004). Nos últimos anos, novas evidências têm revelado
maiores detalhes desse processo.
Ijiri e Potten (1987) testaram dezoito agentes citotóxicos e mostraram
que todos promovem hipoplasia e apoptose em criptas intestinais. Keefe et al.
21
FIGURA 1 – Constelação de sintomas e alterações clínicas da mucosite
gastrointestinal
Os pacientes com MGI podem apresentar sintomas leves e auto-limitados. Entretanto,
esse é um efeito adverso potencialmente capaz de gerar numerosas complicações,
incluindo quadros graves e irreversíveis (KEEFE et al., 2007).
(2000), avaliando amostras de biópsias da terceira porção do duodeno em 23
pacientes submetidos a vários esquemas de quimioterapia, identificaram a
presença de apoptose em criptas no primeiro dia após a quimioterapia. Apenas
no terceiro dia foram observadas redução da área dos vilos e hipoplasia de
criptas. Tais dados sugerem que a apoptose antecede a hipoplasia em criptas.
Evidências mais recentes sugerem também a participação dos
componentes da lâmina própria, como as células endoteliais e os fibroblastos,
nos eventos iniciais da mucosite induzida por quimioterápicos e por
radioterapia. Paris et al. (2001), trabalhando com um modelo de irradiação
corporal total em camundongos, evidenciaram a presença de apoptose em
células endoteliais da lâmina própria 1 hora após a administração de 8 a 15Gy,
com intensidade máxima na quarta hora. No mesmo modelo, a apoptose no
epitélio colunar só inicia 10 horas após a dose de 15Gy. A apoptose em criptas
22
QUADRO 1 – Critérios comuns de terminologia para eventos adversos (versão
3.0) - Diarréia
Grau 1
Aumento da frequência das evacuações, menor que 4
vezes por dia
Grau 2
Aumento da frequência das evacuações de 4 a 6 vezes
por dia
Necessidade de hidratação venosa <24h
Sem interferência nas atividades diárias
Grau 3
Aumento da frequência das evacuações ≥ 7 vezes por
dia
Necessidade de hidratação venosa ≥24h ou
hospitalização
Interferência nas atividades diárias
Grau 4
Risco de vida (ex. colapso hemodinâmico)
Grau 5
Morte
Fonte: National Cancer Institute
ocorre inicialmente através de uma via dependente de p53 e, mais tardiamente,
independente de p53 (POTTEN et al., 1998). Em outro modelo de radioterapia
em ratos, os autores demonstraram por microscopia eletrônica a presença de
apoptose em fibroblasto precedendo a apoptose do epitélio (SONIS et al.,
2000). Os detalhes dessas alterações na mucosite induzida por quimioterapia
ainda não foram estudados, entretanto, sabe-se que o fármaco antineoplásico
ARA-C promove apoptose em fibroblastos associada ao aumento de expressão
de p53 e à ativação de caspase-3 e, por esse motivo, Sonis (2004b) propõe
que provavelmente a apoptose de fibroblastos ocorra de maneira semelhante
tanto
na
mucosite induzida por
radioterapia como
na
induzida por
quimioterapia.
Em 2004, Sonis (2004a) propôs um modelo de fisiopatologia para a MGI
induzida por quimioterapia e radioterapia, dividindo-a em cinco fases: iniciação,
resposta à lesão inicial, amplificação do sinal, ulceração e cicatrização. Essa
divisão tem objetivo didático, visto que muitos eventos acontecem de maneira
23
superposta,
principalmente
quando
se
considera
que
o
estímulo
desencadeador pode ser continuado, em frações diárias. Por exemplo, há
esquemas de quimioterapia seqüenciais onde o fármaco é administrado
durante alguns dias seguidos. Da mesma maneira, a radioterapia é aplicada
normalmente em frações diárias ou até em duas ou três frações por dia.
Segundo o modelo proposto por Sonis (2004a), na fase inicial do
processo a quimioterapia e a radioterapia seriam responsáveis pela lesão
direta do DNA de células da camada basal da membrana epitelial. Em paralelo,
seriam geradas espécies reativas de oxigênio. Nessa fase, as alterações
ocorreriam na submucosa e culminariam na lesão da mucosa sobrejacente.
Na segunda fase, a quebra do DNA ativaria vias de transdução de sinal
envolvendo p53 e o fator nuclear kappa-B (NF-κB). Esses fatores de
transcrição, principalmente o NF-κB, seriam responsáveis pela amplificação de
sinal através da ativação de outros fatores de transcrição como NRF2, ativação
de diversas vias de sinalização intracelular incluindo vias de apoptose e
produção de citocinas proinflamatórias como TNF, IL-1 e IL-6.
Durante o terceiro estágio, ocorreria amplificação ainda maior do sinal
inicial, pois o aumento da expressão gênica decorrente da ativação inicial de
fatores de transcrição seria responsável pelo acúmulo de inúmeras proteínas
no
ambiente
intracelular.
Algumas
dessas
proteínas,
como
o
TNF,
promoveriam retroalimentação positiva através de nova ativação de NF-κB.
Além disso, o TNF ativaria várias vias de sinalização culminando na ativação
de caspase-3 e apoptose.
As principais alterações de mucosa e os sintomas clínicos seriam mais
pronunciados na quarta fase da mucosite. Nessa fase, a quebra da barreira de
mucosa permitiria a exposição da submucosa às bactérias presentes na
cavidade oral e no lúmen intestinal, promovendo uma cascata de eventos
inflamatórios iniciada pela ativação de células mononucleares residentes,
produção de citocinas, migração celular etc. Em pacientes neutropênicos, esse
quadro tem maior risco potencial, já que quebra da barreira mucosa é um fator
de risco importante para bacteremia e sepse (PICO et al., 1998).
24
A última fase da mucosite seria a de cicatrização. Uma vez cessado o
estímulo, os eventos seriam auto-limitados e a completa recuperação das
mucosas ocorreria dentro de dias.
QUADRO 2 - Sumário de guidelines de práticas clínicas baseadas em
evidência para o cuidado de pacientes com mucosite gastrointestinal
Cuidados intestinais básicos e boas práticas clínicas:
1. O painel sugere que cuidados intestinais básicos devam incluir hidratação
adequada e que se considere o potencial para intolerância transitória à lactose
e a presença de patógenos bacterianos.
Quimioterapia e quimioterapia em altas doses: Prevenção
2. O painel recomenda ranitidina ou omeprazol para a prevenção de dor
epigástrica após tratamento com ciclosfosfamida, metrotrexato e 5-fluorouracil
ou tratamento com 5-fluorouracil com ou sem ácido fólico.
3. O painel recomenda que glutamina sistêmica não deve ser usada para
prevenção de mucosite gastrointestinal.
Quimioterapia e quimioterapia em altas doses: Tratamento
4. Quando loperamina falha no controle da diarréia induzida por quimioterapia
ou quimioterapia em altas doses associada com transplante de medula óssea,
o painel recomenda octreotide na dose ≥ 100 µg SC, duas vezes ao dia.
Combinação de quimioterapia e radioterapia: Prevenção
5. O painel sugere o uso de amifostina para reduzir a esofagite induzida por
quimioterapia e radioterapia concomitantes em pacientes com câncer de
pulmão não-pequenas células.
Fonte: Adaptado de KEEFE et al., 2007
Recentemente, o grupo de Keefe, utilizando um modelo de MGI induzida
por CPT-11 em ratos, demonstrou a presença de NF-κB e de citocinas
proinflamatórias (TNF, IL-1e IL-6) a partir de 2 horas após a administração de
CPT-11 nas mucosas oral, do jejuno e do cólon, atingindo um pico de
25
expressão na sexta hora (LOGAN et al., 2007). Esse achado fortalece a
hipótese de Sonis de que os eventos envolvidos na MGI acontecem de maneira
semelhante ao longo das diferentes porções do trato digestório, com possíveis
variações relacionadas a particularidades de cada segmento.
No mesmo estudo, os autores demonstraram que a elevação de NF-κB,
TNF, IL-1 e IL-6 antecede o surgimento das alterações morfológicas de
mucosa, como o aumento número de corpos apoptóticos, o achatamento de
vilos e criptas e o surgimento de infiltrado inflamatório. Entretanto, o estudo não
permite conclusões sobre a relação cronológica entre a produção de NF-κB e a
produção de TNF, IL-1e IL-6.
O envolvimento de citocinas proinflamatórias na MGI já havia sido
descrito por outros autores (SONIS, 2004a; LOGAN, 2007; MELO et al., 2007).
Recentemente, em nosso laboratório, foi demonstrado que o pré-tratamento
com talidomida e com pentoxifilina, fármacos que interferem na síntese de TNF
e outras citocinas, reduz a intensidade das alterações morfométricas e o
infiltrado inflamatório na mucosa jejunal de camundongos com mucosite
intestinal induzida por CPT-11. Através de imunoistoquímica e da dosagem
das citocinas no tecido por ELISA, os autores demonstraram uma menor
expressão de TNF-α, IL-1β e da quimiocina KC nesses animais (MELO et al.,
2007).
1.2 Interleucina-18 (IL-18)
A IL-18 foi descrita pela primeira vez em 1989 como um fator indutor de
interferon-γ (IGIF, interferon-γ inducing factor) em células de baço de
camundongos (NAKAMURA et al., 1989), entretanto, sua clonagem e batismo
só ocorreram em 1995 (OKAMURA et al.). Integra a família da IL-1, com a qual
apresenta similaridades nos mecanismos de ativação e de transdução de sinal
(DELALEU et al., 2004).
Sua produção ocorre em diversos tipos de células, como macrófagos,
células dendríticas, células epiteliais, células da micróglia e monócitos e o
26
receptor de IL-18 (IL-18R) já foi descrito em macrófagos, linfócitos, células NK,
células endoteliais, células epiteliais e células de músculo liso (DELALEU et al.,
2004; REDDY, 2004). Sua liberação para o meio extracelular é feita através de
receptores purinérgicos P2X-7 (GRACIE, 2004).
As vias de ativação e sinalização da IL-18 estão esquematizadas na Figura
2. Pró-IL-18 é a molécula precursora da IL-18 e não dispõe de atividade
biológica. Seu peso molecular é 28 kDa e, para ser ativada, precisa sofrer
clivagem enzimática. Sabe-se que a clivagem ocorre no ambiente intracelular,
mas há evidências de que a pro-IL18 possa ser secretada e ativada também
fora da célula (FANTUZZI et al., 1999;). A enzima ICE (IL-1 converting enzyme
ou caspase-1) é uma protease cisteínica citoplasmática que, além de
transformar pró-IL-1β em IL-1β, também cliva a pró-IL-18 na posição Asp35,
gerando a IL-18, com 24 kDa. Essa é considerada a via “clássica” de ativação
da IL-18 (FANTUZZI et al., 1999, DELALEU et al., 2004).
Entretanto, ela pode ser ativada alternativamente através da ação da
caspase-3 e da caspase-4. A caspase-4 cliva a pro-IL-18 na mesma posição
que a ICE (Asp35), mas com eficiência centenas de vezes menor. Já a
caspase-3 realiza a clivagem na posição Asp 69, podendo gerar formas de IL18 biologicamente menos potentes ou sem atividade biológica (FANTUZZI et
al., 1999; DELALEU et al., 2004).
A pró-IL-18 secretada pela célula também pode ser ativada por enzimas
extra-celulares expressas constitutivamente por leucócitos, como a proteinase3 (FELDERHOFF-MUESER et al., 2005).
O receptor de IL-18 (IL-18R) é um heterodímero formado por uma
subunidade alfa (IL-18Rα) que é responsável pela ligação da IL-18 e uma
subunidade beta (IL-18Rβ), que aumenta a afinidade de ligação ao ligante e
tem papel essencial na transdução de sinal. A ligação da IL-18 ao receptor
forma um complexo ternário entre a própria IL-18 e as duas subunidades do
receptor (DELALEU et al., 2004; REDDY, 2004).
A IL-18 compartilha com a IL-1 e o TNF alguns dos mecanismos de
sinalização (ex.: TLR-toll like receptor, Figura ). Uma vez que a IL-18 esteja
ligada ao seu receptor, a proteína acessória de IL-1R (IL-1Racp) recruta o
MyD88 e a quinase ativadora de IL-1 (IRAK, IL-1R receptor activating kinase).
27
Esta última associa-se à molécula de sinalização TRAF-6, que por sua vez,
associa-se com a quinase indutora de NF-κB (NIK, NF-κB inducing kinase)
iniciando a cascata de ativação do NF-κB (DELALEU et al., 2004, NOVICK et
al., 1999) .
A família da IL-18 inclui ainda uma proteína chamada IL-18 binding-protein
(IL-18Bp), que é secretada na forma solúvel, sem domínio transmembrana, e
tem função análoga à do receptor solúvel de IL-1. Ou seja, a IL-18Bp, liga-se à
IL-18 impede sua interação com o IL-18R (DELALEU et al., 2004; NOVICK et
al., 1999).
Figura 2 – Ativação e via de sinalização de IL-18
Pró-IL-18 é a molécula precursora da IL-18 e não dispõe de atividade biológica. Ela é
ativada no meio intracelular pela caspase-1, mesma enzima que cliva a pró-IL-1β. No
meio extracelular, a IL-18 pode interagir com seu receptor IL-18R. Uma vez que a Il-18
esteja ligada ao receptor, a proteína acessória de IL-1R (IL-1Racp) recruta o MyD88 e
a quinase ativadora de IL-1 (IRAK, IL-1R receptor activating kinase). Esta última
associa-se à molécula de sinalização TRAF-6, que por sua vez, associa-se com a
quinase indutora de NF-κB (NIK, NF-κB inducing kinase) iniciando a cascata de
ativação do NF-κB (DELALEU et al., 2004).
28
Até o momento, foram descritas duas isoformas de IL-18Bp murinas e
quatro humanas (IL-18Bp a, b, c, d). As isoformas a e c neutralizam a atividade
biológica da IL-18, as outras duas, não. IL-18Bpa é expressa constitutivamente
no baço e, em menor quantidade, no cólon, no intestino delgado e na próstata
(CORBAZ et al., 2002).
O RNA da IL-18Bp é constitutivamente expresso em linfócitos do sangue
periférico, baço, timo, cólon, intestino delgado e próstata. Experimentos in vitro
demonstraram que essa proteína impede a resposta Th1, bloqueia a produção
de IFN-γ induzida pela IL-18, além de bloquear a produção de IL-8 e a ativação
de NF-κB (NOVICK et al., 1999).
A expressão de IL-18Bp pode ser aumentada pelo próprio IFN-γ, formando
uma alça de retroalimentação negativa Esse dado reforça a participação da
famíla IL-18 na regulação da resposta imune (CORBAZ et al., 2002).
A IL-18 é uma citocina pleiotrópica, reconhecida como um importante
regulador da resposta imune inata e adquirida (GRACIE, 2004). Estimula a
maturação de células T e células NK, promovendo nestas aumento da
expressão de FasL (Fas-ligand) e da citotoxicidade mediada pela ligação FasFasL. Pode estimular tanto respostas Th1, agindo em sinergia com IL-1, como
Th2. Quando incubada in vitro com linfócitos T CD4+ sozinha ou em
associação com IL-2 ou IL-4, estimula expressão de IgE e induz resposta Th2
(REDDY, 2004; GRACIE, 2004).
Em um modelo murino de asma (resposta Th2 típica), linfócitos Th1 de
memória podem desencadear resposta Th2 quando o estímulo é apresentado
na presença de IL-18 (SUGIMOTO et al., 2004). Em outro modelo murino de
infecção por Listeria, a IL-18 em conjunto com a IL-12 estimula células T de
memória na ausência de antígeno cognato, desencadeando uma resposta Th1
(BERG et al., 2003). A geração do tipo de resposta Th1 ou Th2 está
relacionada a contextos distintos, com diferentes estímulos, células e citocinas
coadjuvantes envolvidos.
A IL-18 também é capaz de induzir a produção diversas citocinas e
mediadores inflamatórios, como TNF-α, IL1β, IL-8, IFN-γ, óxido nítrico e
prostaglandinas (CORBAZ et al., 2002).
29
Em modelos experimentais de sepse, o bloqueio de IL-18 com anticorpos
anti-IL-18 reduz a lesão de órgãos como fígado e pulmão e os níveis de IFN-γ,
MIP-2 e TNF-α, além de aumentar a sobrevida (DINARELLO et al., 2003).
Em um modelo de isquemia/reperfusão (I/R) em miocárdio humano
perfundido, a expressão de RNAm de IL-18 e os níveis de IL-18 no
homogenato estão aumentados após a I/R. A adição de IL-18Bp ao perfusato
durante e após a I/R melhora a função contrátil (POMERANTZ et al., 2001).
A expressão dos genes de IL-18 e caspase-1 está aumentada no cérebro
de ratos com meningoencefalite autoimune experimental durante a fase aguda
da doença e nas raízes dos nervos de ratos com polineuropatia desmielinizante
inflamatória, também na fase aguda da doença (FELDERHOFF-MUESER et
al., 2005).
O envolvimento da IL-18 também já foi descrito em inúmeras doenças,
como artrite reumatóide, psoríase, artirite juvenil idiopática, diabete melito
insulino-dependente, doença de Crohn e esclerose múltipla (CORBAZ et al.,
2002; ANDERSON et al., 2006).
A expressão de IL-18 está aumentada no soro e na sinóvia de pacientes
com artrite reumatóide e artrite psoriásica, assim como nas células epiteliais e
nos macrófagos das lesões intestinais em pacientes com doença de Crohn
(GRACIE, 2004; CORBAZ et al., 2002).
Em um modelo experimental de doença de Crohn em camundongos com
imunodeficiência
combinada
severa
(SCID
-
severe
combined
immunodeficiency disease) reconstituídos com células T CD62+ CD4+, a IL-18
é fortemente expressa no epitélio intestinal lesado (WIRTZ et al., 2002).
Em outro modelo de colite induzida por DSS (dextran sulfate sodium) em
camundongos, os níveis de IL-18 no cólon aumentam em paralelo ao aumento
da dose de DSS e à progressão da lesão. A administração de IL-18Bp resulta
em redução da lesão de maneira dose-dependente. Resultados semelhantes
foram obtidos em outro modelo de colite induzida por trinitrobenzeno
DINARELLO et al., 2003).
Atualmente, portanto, a IL-18 é reconhecida como um importante regulador
do sistema imune e um dos mediadores inflamatórios cruciais em diversos
processos patológicos, juntamente com IL-1β e TNF-α. Até o presente
30
momento não há estudos descritos na literatura sobre o envolvimento de IL-18
na patogênese da MGI.
1.3 Cloridrato de irinotecano (CPT-11)
A Camptotheca acuminata é uma árvore originária da China e do Tibet,
onde é conhecida como xi shu (árvore alegre). Em 1966, o programa de
triagem do Instituto Nacional do Câncer norte-americano descobriu que a
camptotecina, um alcalóide presente em seu tronco, sua casca e em suas
flores possuía atividade antitumoral (WALL et. al., 1966).
Os primeiros estudos pareciam promissores, mas problemas com a
solubilidade da droga e com os efeitos colaterais (mielossupressão e cistite
hemorrágica) contribuíram para que o desenvolvimento da mesma fosse
adiado indefinidamente. Apenas com a descoberta de seu mecanismo de ação
é que a droga voltou a atrair interesse e foram desenvolvidos derivados mais
hidrossolúveis (PIZZOLATO et. al., 2003).
O CPT-11 foi o primeiro derivado semi-sintético hidrossolúvel da
camptotecina a ser testado clinicamente. Os estudos iniciaram na década de
80 no Japão e em 1994 a droga foi aprovada naquele país para uso clínico em
pacientes com câncer de pulmão. Em 1995 e 1996 vieram as aprovações para
uso em pacientes com câncer de cólon metastático na Europa e nos Estados
Unidos, respectivamente (PIZZOLATO et. al., 2003).
Atualmente, o CPT-11 é utilizado no tratamento do câncer colorretal
metastático (SALTZ et al., 2001; VAMVAKAS et al., 2002; ROSATI et al.,
2002), no câncer de pulmão de pequenas células e não-pequenas células
(ROCHA-LIMA et al., 2004a; LANGER, 2004), no câncer de estômago (AJANI,
2005; ENZINGER et al., 2005), nos cânceres de ovário (SUGIYAMA et al.,
1996), pâncreas (ROCHA-LIMA et al., 2004b) e mama (PEREZ et al., 2004), no
linfoma de Hodgkin (RIBRAG et al., 2003), entre outros.
31
1.3.1 Estrutura química
FIGURA – 3 Estrutura química da camptotecina, do CPT-11 e de suas formas
de equilíbrio pH-dependente.
O CPT-11 é um derivado semi-sintético hidrossolúvel da camptotecina. CPT-11 e SN38, seu metabólito mais ativo, possuem um anel α-hydroxi-3-lactona, que é lábil e
sofre hidrólise facilmente no lúmen intestinal, de maneira dependente do pH. Em
condições ácidas a formação de lactona é favorecida. Em pH fisiológico ou básico, a
forma lactona é instável e o equilíbrio favorece a hidrólise para abrir o anel de lactona
e levar à formação de carboxilato. A forma lactona tem maior afinidade pela
topoisomerase I e possui maior atividade antitumoral (ARIMORI et al., 2001; IKEGAMI
et al., 2002).
32
A estrutura química da camptotecina e do CPT-11 (7-etil-10-[4-(1piperidino)-1-piperidino] carboxiniloxi-camptotecina) pode ser vista na Figura 1
1.3.2 Farmacocinética
O CPT-11 apresenta uma característica única em relação aos derivados
da camptotecina, uma cadeia lateral formada por um dipiperidina ligada à
camptotecina por uma ligação carboxil-éster (Figura 1). Essa cadeia lateral
confere maior hidrosolubilidade, mas reduz a atividade antitumoral do CPT-11
(PIZOLLATO et. al., 2003). A clivagem dela pela enzima carboxilesterase (CE),
encontrada principalmente no fígado e no trato gastrointestinal, forma o
metabólito SN-38 (7-etil-10-hidroxicamptotecina), que é até 1000 vezes mais
potente que o CPT-11 e é a forma ativa da droga (KAWATO et. al., 1991).
CPT-11 e SN-38 possuem um anel α-hydroxi-3-lactona, que é lábil e
sofre hidrólise facilmente no lúmen intestinal, de maneira dependente do pH.
Em condições ácidas a formação de lactona é favorecida. Em pH fisiológico ou
básico, a forma lactona é instável e o equilíbrio favorece a hidrólise para abrir o
anel de lactona e levar à formação de carboxilato. A forma lactona tem maior
afinidade pela topoisomerase I e possui maior atividade antitumoral (ARIMORI
et al., 2001; IKEGAMI et al., 2002).
No fígado, a enzima CYP3A4 atua sobre o CPT-11 gerando dois
compostos
inativos,
APC
(7-etil-10-[4-N-(5-ácido
aminopentanóico)-1-
piperidino]-carboniloxicamptotecina) e NPC (7-etil-10-[4-amino-1-piperidino]carboniloxicamptotecina) (HAAZ et. al., 1998; CHESTER et al., 2003;
MATHIJSSEN et al., 2004). Apenas o NPC pode ser metabolizado pela CE em
SN-38 in vitro, contribuindo para a atividade antitumoral e para a toxicidade do
CPT-11 (DODDS et al., 1998; KHERER et al., 2000).
A meia-vida do CPT-11, sob a forma de lactona (Figura 2), é de
aproximadamente 6,8 horas (5 a 9,6 horas). A meia-vida do SN-38 é maior, de
aproximadamente 11,05 horas (9,1 a 13 horas). A depuração sistêmica é de
aproximadamente 46,9 L/h/m2 (TAKIMOTO; ARBUK, 2001). E, o volume de
distribuição para as doses de 125mg/ m2 e 340 mg/m2, é de 110±48,5 L/ m2 e
234±69,6 L/ m2, respectivamente (ALIMONTI et al., 2004).
33
FIGURA 4 – Metabolismo do CPT-11
No fígado, a enzima CYP3A4 atua sobre o CPT-11 gerando dois compostos inativos,
APC (7-etil-10-[4-N-(5-ácido aminopentanóico)-1-piperidino]-carboniloxicamptotecina)
e NPC (7-etil-10-[4-amino-1-piperidino]-carboniloxicamptotecina). O NPC pode ser
metabolizado pela CE em SN-38. A depuração do SN-38 é feita no fígado pelo
polipeptídio A1 da família da uridina difosfato glicosiltransferase 1 (UGT1A1), gerando
glicuronídios de SN-38 (SN-38G), que são desprovidos de atividade biológica. CPT11, SN-38 e SN-38G são excretados na bile através das proteínas de transporte
MDR1 (multidrug resistance protein 1) e MRP2 (multidrug resistance-associated
protein 2) e chegam ao intestino delgado. No intestino delgado, o CPT-11 pode ser
clivado pela CE intestinal, formando mais SN-38. Além disso, o SN-38G pode ser
desconjugado pela ação de bactérias intestinais produtoras de β-glicuronidase,
transformando-se novamente em SN-38. Este, por sua vez, é reabsorvido iniciando um
processo de recirculação êntero-hepática (TREINEN-MOSLEN et. al., 2006; HAAZ et.
al., 1998; CHESTER et al., 2003; MATHIJSSEN et al., 2004; DODDS et al., 1998;
KHERER et al., 2000; PIZZOLATO et al., 2003; GUPTA et. al., 1994; CHU et. al.,
1997; IYER et. al., 2002).
34
A depuração do SN-38 é feita no fígado pelo polipeptídio A1 da família
da uridina difosfato glicosiltransferase 1 (UGT1A1), gerando glicuronídios de
SN-38 (SN-38G), que são desprovidos de atividade biológica. Embora a
maioria dos tecidos possa ativar o CPT-11 através da ação da CE, apenas o
fígado é capaz de inativar o SN-38 (PIZZOLATO et al., 2003; GUPTA et. al.,
1994).
Algumas drogas podem interagir com a UGT1A1, como é o caso do
ácido valpróico e do fenobarbital. O primeiro inibe a atividade da enzima,
aumentando a biodisponibilidade do SN-38. Já o segundo trem efeito oposto,
aumentando
a
reação
de
conjugação
do
SN-38
e
reduzindo
sua
biodisponibilidade (GUPTA et al., 1997).
Polimorfismos na região promotora do gene UGT1A1 podem implicar em
menos glicuronidação de SN-38 e, consequentemente, maior toxicidade. Duas
bases extras (TA) na sequência A(TA)6TAA da região promotora resulta em 30
a 80% de redução na expressão da enzima UGT1A1. Assim, a razão
metabólica
SN-38/SN-38G
num
paciente
homozigoto
(TA)7/(TA)7
ou
heterozigoto (TA)7/(TA)6 são anormalmente mais altas do que em outro
paciente com o genótipo selvagem (TA)6/(TA)6 (ANDO et al., 1998; IYER et al.,
1999; JINNO et al., 2003).
O CPT-11 pode ser eliminado nas fezes (60-70%), pela bile (25%) e pela
urina (10-20%) (ALIMONTI et al., 2004). CPT-11, SN-38 e SN-38G são
excretados na bile através das proteínas de transporte MDR1 (multidrug
resistance protein 1) e MRP2 (multidrug resistance-associated protein 2) e
chegam ao intestino delgado (CHU et. al., 1997; IYER et. al., 2002). No
intestino delgado, o CPT-11 pode ser clivado pela CE intestinal, formando mais
SN-38. Além disso, o SN-38G pode ser desconjugado pela ação de bactérias
intestinais produtoras de β-glicuronidase, transformando-se novamente em SN38. Este, por sua vez, é reabsorvido iniciando um processo de recirculação
êntero-hepática que contribui para a intensificação dos efeitos adversos do
CPT-11 (TREINEN-MOSLEN et. al., 2006).
35
FIGURA 5 – Polimorfismos no gene UGT1A1 correlacionam-se com a
toxicidade do CPT-11.
Polimorfismos na região promotora do gene UGT1A1 podem implicar em menos
glicuronidação de SN-38 e, consequentemente, maior toxicidade. O acréscimo de
duas bases extras (TA) na sequência A(TA)6TAA da região promotora resulta em 30 a
80% de redução na expressão da enzima UGT1A1. Assim, a razão metabólica SN38/SN-38G num paciente homozigoto (TA)7/(TA)7 ou heterozigoto (TA)7/(TA)6 são
anormalmente mais altas do que em outro paciente com o genótipo selvagem
(TA)6/(TA)6 (ANDO et al., 1998; IYER et al., 1999; JINNO et al., 2003).
36
1.3.3 Mecanismo de ação
O CPT-11 é um inibidor seletivo da topoisomerase I. SN38, seu
metabólito ativo, é até 1000 vezes mais potente que o CPT-11 na inibição
dessa enzima (KAWATO et. al., 1991).
A topoisomerase I (Topo I) é uma proteína monomérica que catalisa
interconversões entre diferentes estados topológicos do DNA. Ela promove a
quebra de ligações fosfodiéster em uma hélice de DNA, permite a livre
passagem da outra hélice pela quebra e, logo a seguir, promove a religação,
deixando o DNA intacto. Com isso, a Topo I reduz a tensão torsional do DNA
através da remoção das espirais durante a replicação e transcrição (LARSEN
et al., 1999; TAKIMOTO et al., 2001).
A droga forma um complexo ternário estável com o DNA e a Topo I e
impede a progressão do garfo de replicação do DNA, bloqueando a replicação.
A célula pára na fase S do ciclo celular e, na ausência de correção do dano ao
DNA, entra em apoptose (LARSEN et al., 1999; TAKIMOTO et al., 2001).
1.3.4 Toxicidade
Diarréia e mielossupressão são os dois efeitos adversos mais típicos e
significantes do CPT-11. Neutropenia acontece em até 43% dos pacientes e a
diarréia pode atingir mais de 80% dos pacientes, com incidência de graus 3 ou
4 variando de 22 a 29% (PIZZOLATO et al., 2003; ABIGERGES et al., 1995;
SALIBA et al., 1998). Além desses, outros efeitos adversos graus 3 ou 4
relatados são náuseas e vômitos (9%), astenia (14%), alopecia (53%),
elevação de transaminases hepáticas (8%) e anemia (9%) (ABIGERGES et al.,
1995).
A diarréia pode acontecer durante ou logo após a infusão ou surgir mais
tardiamente, após as primeiras 24 horas. A de início precoce é um efeito
colinérgico, frequentemente acompanhado de cólicas, rubor e sudorese, e cede
com a administração de atropina. Já a tardia é um dos sintomas ligados à MGI
e não está completamente elucidada ainda (HURWITZ et al., 1994).
37
Atualmente, a abordagem mais frequentemente utilizada no manejo da
diarréia tardia é a prescrição de loperamida, um antidiarréico sintético que inibe
a motilidade e a secreção intestinal ao interagir com receptores opióides e
bloquear canais de cálcio (HURWITZ et al., 1994).
Entretanto, inúmeras abordagens foram testadas com intuito de
amenizar esse limitante efeito adverso. Três estudos clínicos de fase 2
testaram a administração de antibióticos como neomicina, penicilina com
estreptomicina ou cefalosporina em pacientes em tratamento com CPT-11. O
uso desses antibióticos reduz a quantidade de β-glicuronidase produzida no
cólon, limitando a formação de SN-38 a partir de SN-38G (TAKASUNA et al.,
1998; TAKASUNA et al., 2006; CHOWBAY et al., 2003).
Estudos farmacogenéticos recentes demonstraram uma correlação
positiva entre o genótipo do promotor do gene UGT1A1 e a toxicidade do CPT11, especialmente diarréia e leucopenia. Mais de trinta variações polimórficas
já foram descritas, mas o polimorfismo TA na região promotora tem sido a
alteração de maior repercussão clínica até o momento (ANDO et al., 2000;
IYER et al., 2002). Consta na bula do medicamento informação sobre as
variações polimórficas associadas a um perfil de toxicidade diferenciado, muito
embora ainda não seja rotineira a pesquisa de tais polimorfismos antes da
indicação terapêutica de CPT-11.
O CPT-11 é um antineoplásico disponível para uso clínico há cerca de
uma década e hoje tem amplo uso na Oncologia. A diarréia tardia, uma das
manifestações clínicas da MGI, é um de seus efeitos adversos limitantes mais
frequentes, atingindo até 80% dos pacientes (SALIBA et. al., 1998). Apesar do
conhecimento disponível hoje a respeito da farmacocinética, farmacogenômica
e do mecanismo de ação da droga, a única ferramenta clínica para tratar esse
efeito adverso atualmente é o uso de antidiarréicos que inibem a motilidade
intestinal. A melhor compreensão da fisiopatologia da MGI induzida pelo CPT11 pode contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas
no futuro.
38
1.4 Justificativa
A MGI induzida por quimioterapia e por radioterapia é um efeito adverso
frequente que pode interferir na qualidade de vida e na eficácia do tratamento
antineoplásico e, em casos severos, com potencial risco para a vida dos
pacientes. As alterações iniciam-se logo nas primeiras horas após o estímulo
(quimioterapia ou radioterapia) nas células da camada submucosa e, no caso
do intestino delgado, também nas células tronco da base das criptas. A partir
daí, uma sequência de eventos acontece, como a produção de espécies
reativas de oxigênio, ativação de NF-κB e a produção de citocinas próinflamatórias (TNF, IL-1, IL-6). Somente num segundo momento ocorre
apoptose e necrose de células epiteliais e das demais células das criptas,
expondo a submucosa ao conteúdo do lúmen intestinal e aumentando o risco
de sepse em pacientes neutropênicos (LOGAN et al., 2007; MELO et al., 2007;
PARIS et al., 2001; PICO et al., 1998; SONIS et al., 2000, 2004a, 2004b) .
O interesse especial nos aspectos iniciais da MGI implica numa eventual
possibilidade de modulação farmacológica do processo. Como hoje ainda não
se dispõe de meios efetivos para amenizar os efeitos da mucosite na maioria
dos casos (RUBENSTEIN et al., 2002), os pacientes ainda sofrem com
sintomas desconfortáveis, com o maior risco de sepse e com a possível
redução da eficácia do tratamento oncológico devido a atrasos e reduções de
doses (PICO et al., 1998; GIBSON et al., 2002; BLIJLEVENS et al., 2007;
KEEFE et al., 2007).
O envolvimento da IL-18 já foi descrito em inúmeras doenças, como
artrite reumatóide, psoríase, artirite juvenil idiopática, diabete melito insulinodependente, esclerose múltipla e doença inflamatória intestinal (CORBAZ et al.,
2002; ANDERSON et al., 2006). Ela é uma citocina pleiotrópica reconhecida
como um importante regulador do sistema imune, um dos mediadores
inflamatórios cruciais em diversos processos patológicos, juntamente com IL-1β
e TNF-α e, até o presente momento, não há estudos descritos na literatura
sobre o envolvimento de IL-18 na patogênese da MGI.
39
1.5 Objetivos
O objetivo principal desse estudo é investigar o envolvimento de IL-18 na
patogênese da MGI induzida pelo fármaco antitumoral CPT-11. Para isso, os
seguintes objetivos específicos foram traçados:
- Adaptar o modelo de MGI induzida por CPT-11 para camundongos
Balb/C, reproduzindo as alterações morfo-funcionais e histológicas clássicas.
- Realizar a modulação farmacológica de IL-18 utilizando camundongos IL18KO (disponíveis na espécie Balb/C) e a proteína ligante de IL-18 (IL-18Bp).
- Avaliar a contratilidade intestinal de camundongos com MGI induzida por
CPT-11.
40
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Animais de experimentação
Camundongos Balb/C machos, com peso entre 25 a 30g foram utilizados
nos experimentos. Os animais foram provenientes do Biotério Setorial do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará (UFC) e do Biotério Setorial do Departamento
de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP).
Dois dias antes dos experimentos eles foram acomodados em gaiolas e
permanecem nas mesmas condições nos dias da pesquisa.
Todos foram mantidos em ciclos de alternância claro/escuro de 12
horas, em gaiolas ventiladas, com livre acesso a água e à ração balanceada
utilizada rotineiramente no biotério. Os experimentos realizados seguiram o
Manual Sobre Cuidados e Usos de Animais de Laboratório, estipulados pelo
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), que segue as normas
da National Research Concil (U.S.A., 1996). O projeto foi previamente
aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC
(protocolo 02/04 – ANEXO 1).
2.2 Drogas, soluções, corantes e anticorpos
- Cloridrato de Irinotecano – CPT11 (Camptosar: ampolas 5mL –
100mg/mL, Pharmacia & Upjohn Co, Kalamazoo, EUA)
- Solução salina: cloreto de NaCl a 0,9% (15M): frasco de 500mL
(Tayuyna)
- Dimetil sulfóxido (DMSO: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
- Álcool etílico 70% (Reagen)
- Formaldeído 40% (Reagen)
41
- Hematoxilina (Reagen)
- Eosina (Merck)
- Hematoxilina de Mayer (Reagen)
- Vectastatin – kit ABC (Vector)
- Anticorpo IgG monoclonal de coelho anti-TNF-α (Santa Cruz
Biotechnology, CA, U.S.A.)
- Anticorpo IgG monoclonal de coelho anti-IL-1β (Santa Cruz
Biotechnology, CA, U.S.A.)
-
Anticorpo
IgG
policlonal
de
carneiro
anti-KC
(Santa
Cruz
Biotechnology, CA, U.S.A.)
- Anticorpo primário policlonal de carneiro anti-TNF-α (Santa Cruz
Biotechnology, CA, U.S.A.)
- Anticorpo primário policlonal de coelho anti-IL-1β (Santa Cruz
Biotechnology, CA, U.S.A.)
- Anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de carneiro (Santa Cruz
Biotechnology, CA, U.S.A.)
- Anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de coelho (Santa Cruz
Biotechnology, CA, U.S.A.)
- Tampão fosfato de potássio: solução A – 988mL + solução B – 12mL
Solução A:
KH2PO4 (Synth)................................................................
6,8g
Água destilada ........................................................q.s.p. 1L
Solução B:
KH2PO4 (Synth)................................................................
8,7g
Água destilada ........................................................q.s.p.
1L
- Tampão de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB)
HTAB (Sigma)..................................................................
5g
Tampão fosfato de potássio.............................................
1L
- Peróxido de hidrogênio (0,1%)
Peróxido de hidrogênio 30% (Vetec)................................ 1mL
42
Água destilada.........................................................q.s.p.
30mL
- Solução de o-dianisidina
O-dianisidina (Sigma).......................................................
16,7mL
Tampão fosfato de potássio.............................................
10mL
H2O2.................................................................................
50µL
Água destilada.................................................................
90mL
- Líquido de Turk
Ácido acético glacial P.A. (Merck)....................................
20mL
Violeta de genciana.........................................................
2mL
Água destilada.................................................................
1L
2.3 Indução da MGI
O modelo de MGI experimental utilizado foi descrito por Ikuno et al.
(1995) e adaptado no Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer
(LAFICA), Universidade Federal do Ceará (MELO et al., 2007).
A dose de 75 mg/Kg/dia de CPT-11 via intraperitoneal (i.p.) por quatro
dias seguidos havia sido previamente determinada como aquela capaz de
induzir MGI com baixa letalidade em camundongos Swiss. No presente estudo
foram testadas as doses de 45, 60 e 75mg/Kg em camundongos C57BL6 e de
60 e 75mg/kg em camundongos Balb/C.
2.4 Grupos experimentais
Os animais foram divididos em grupos de, no mínimo seis animais,
conforme discriminado a seguir.
2.4.1 Grupo normal
43
Os animais receberam a administração de solução salina (0,5 ml), i.p.,
por quatro dias seguidos e foram sacrificados no quinto ou no sétimo dia
experimental.
2.4.2 Grupo controle
Os animais IL-18Wt receberam a administração de CPT-11 60 ou 75
mg/kg/dia, i.p., por quatro dias seguidos e foram sacrificados no quinto ou no
sétimo dia experimental.
2.4.3 Grupos teste
Animais IL-18KO receberam a administração de CPT-11 60 ou 75
mg/kg/dia, i.p., por quatro dias seguidos.
Os animais IL-18Wt receberam a
administração de CPT-11 60 mg/kg/dia via i.p. por quatro dias seguidos e de IL18Bp (200µg/dia, i.p., por quatro dias, 1 hora antes do CPT-11).
2.5 Parâmetros avaliados
2.5.1 Diarréia
A intensidade da diarréia foi monitorada duas vezes ao dia, durante todo
o período experimental (cinco ou sete dias), de acordo com os seguintes
escores descritos por Kurita et al. (2000): 0 – normal, ausência de diarréia; 1 –
diarréia leve, fezes levemente umedecidas; 2 – diarréia moderada, fezes sem
forma ou presença de quantidade moderada de sujidades na região perianal; e
3 – diarréia grave, fezes aquosas com grande quantidade de sujidades na
região perianal.
Episódios de diarréia até uma hora após a administração do CPT-11
foram considerados como diarréia precoce. Após 6-24 horas da administração,
a diarréia foi considerada tardia (KASE et al., 1997; ARIMORI et al., 2001).
44
FIGURA 6 – Escores de diarréia.
Intensidade da diarréia: Grau 0 – normal, ausência de diarréia; Grau 1 – diarréia leve,
fezes levemente umedecidas; Grau 2 – diarréia moderada, fezes sem forma ou
presença de quantidade moderada de sujidades na região perianal; e Grau 3 – diarréia
grave, fezes aquosas com grande quantidade de sujidades na região perianal.
2.5.2 Leucograma
Os animais foram anestesiados com éter e, em seguida, colhidas
amostras de sangue periférico no seio retro-orbital por capilaridade,
imediatamente antes do sacrifício. Amostras de 20µL de sangue diluído em
380µL de líquido de Turk foram utilizadas para contagem do número total de
leucócitos em câmara de Neubauter, conforme metodologia descrita por Moura
et al. (1998). Os valores foram expressos em número total de leucócitos x
103/mm3.
45
2.5.3 Sobrevida
A mortalidade dos animais em cada grupo experimental foi registrada
diariamente.
2.5.4 Análise histopatológica e morfométrica
Após o sacrifício dos animais, foram removidos segmentos do duodeno,
jejuno e íleo. Considerou-se como duodeno a porção proximal a 3 cm do
ligamento de Treitz; jejuno, a porção que compreende o ponto médio entre o
ligamento do Treitz e a válvula íleo-cecal; e íleo, a porção proximal a 6 cm da
válvula íleo-cecal (CARNEIRO-FILHO et al., 2004).
A seguir, as amostras
foram fixadas em formalina tamponada 10% e processados para coloração
pelo método hematoxilina-eosina (H&E).
A caracterização histopatológica foi realizada através de um microscópio
Nikon com um aumento de 100 a 400x. Neste estudo foram analisados o
aspecto dos vilos e criptas, bem como presença e intensidade do infiltrado
inflamatório.
O grau de severidade da mucosite foi graduado de acordo com os
seguintes escores descritos por Woo et al. (2000): 0 – ausência de lesão; 1 –
menos de 10% das criptas contêm células necróticas; 2 - mais de 10% das
criptas contêm células necróticas, mas a arquitetura permanece intacta; 3 –
mais de 10% das criptas contêm células necróticas com perda da arquitetura
das criptas (< 20%), os vilos encontram-se encurtados e ocorre variável
hipertrofia e hiperbasofilia nas criptas remanescentes; 4 – semelhante a 3,
entretanto, é mais extensa a perda da arquitetura das criptas e o encurtamento
dos vilos.
Na análise morfométrica, utilizou-se microscópio Nikon com objetivas
10x e lente ocular micrométrica Leitz Wetzlar 10x. As variáveis morfométricas
avaliadas incluíram altura dos vilos, considerada desde o topo até a base,
correspondente à junção cripta/vilo, e a profundidade das criptas, definida
como a invaginação entre os vilos adjacentes (CARNEIRO-FILHO et al., 2004).
46
Estas medidas realizaram-se com auxílio do programa de computador NIH
imageJ (U.S.A., 2005), considerando-se a média aritmética destas medidas
obtidas entre cinco a dez locais diferentes. Os valores foram expressos como
média ± erro padrão da média (EPM) em micrômetros (µm).
2.5.5 Dosagem de mieloperoxidase (MPO)
No momento do sacrifício, uma porção do intestino foi processada para
dosagem de MPO, segundo método adaptado pelo descrito por Bradley et al.
(1982).
As amostras obtidas foram pesadas e mantidas à temperatura de -70°C
até realização do ensaio. Durante a determinação, as amostras foram trituradas
por duas vezes em homogeneizador Politron Ultra-Turrax em solução tampão,
sob condições adequadas de refrigeração. A seguir, estas foram centrifugadas
(centrífuga Eppendorf 5804R) a temperatura de 4°C, durante dez minutos, com
freqüência de 4.200rpm.
O sobrenadante foi colhido e utilizado para determinação de MPO por
ensaio imunoenzimático (ELISA) em placa com noventa e seis poços, em
realizando-se duas leituras. Os valores encontrados foram expressos em
unidade de MPO/mg de tecido.
2.5.6 Dosagem de citocinas (TNF-α e IL-1β) no íleo
Após o sacrifício (5° e 7° dia experimental), foram removidos segmentos
de íleo e estocados a -70°C. Posteriormente, foi procedida a homogeinização e
coleta do sobrenadante para dosagem de TNF-α e IL-1β segundo o método de
Safieh-Garabedian et al. (1995).
A detecção das concentrações destas citocinas foi realizada por ELISA
(CUNHA et al., 1993), de acordo as etapas a seguir: (1) incubação com 2µg/mL
de anticorpo anti-TNFα e anti-IL-1β diluídos em tampão de bicarbonato (pH 8.2)
- 100µL/poço (placa de 96 poços) por 16-24h a 4°C; (2) lavagem da placa (3x)
com PBS-tween 20, 0,1% v/v; (3) bloqueio com albumina bovina 1% diluída em
47
tampão de lavagem, 100µL/poço por duas horas à temperatura ambiente; (4)
lavagem da placa (3x); (5) incubação com curva padrão de TNF-α, IL-1β e KC
diluída em tampão de lavagem e das amostras a serem dosadas (100µL/poço
por 16-24h a 4°C); (6) lavagem da placa (3x); (7) incubação com anticorpo
biotinilado diluído 1:1000 em tampão de lavagem contendo 1% de soro normal
de carneiro por uma hora à temperatura ambiente; (8) lavagem da placa (3x);
(9) incubação com avidinaperoxidase (DAKO) diluída 1:5000 em tampão de
lavagem, 100µL/poço por 15 minutos à temperatura ambiente; (10) lavagem da
placa (3x); (11) incubação com o-fenilenediamina diidocloreto (OPD) em
tampão substrato, 100µL/poço, cobriu-se a placa e deixou-se no escuro 5-20
minutos à temperatura ambiente; (12) a reação foi paralisada com 150µL/poço
de H2SO4 1M; (13) leitura em espectofotômetro a 490nm. Os resultados foram
expressos em pg/mL como a curva padrão.
2.5.7
Avaliação
da
expressão
de
citocinas
(TNF-α
e
IL-1β)
por
imunoistoquímica
A imunohistoquímica para TNF-α e IL-1β foi realizada utilizando-se o
método de estreptavidina-biotina-peroxidase (HSU et al., 1981). No quinto dia,
os animais foram sacrificados e tiveram o duodeno removido e fixado em
formol 10% por 24 horas para confecção de lâminas para imunohistoquímica.
Os cortes foram desparafinados, hidratados em xilol e álcool e imersos em
tampão citrato 0,1M (pH 6,0), sob aquecimento em forno de microondas por 15
minutos para a recuperação antigênica. Após o resfriamento, obtido em
temperatura ambiente durante 20 minutos, foram feitas lavagens com solução
tamponada de fosfato (PBS), intercaladas com bloqueio da peroxidase
endógena com solução de H2O2 a 3% (15 minutos). Os cortes foram então
incubados overnight (4°C) com os anticorpos primários anti-TNF-α e anti-IL-1β,
diluídos em PBS com albumina sérica bovina 5% (PBS-BSA) na concentração
1:200 e 1:400, respectivamente. Após lavagem no dia seguinte, foi feita a
incubação com anticorpo secundário biotinilado anti-IgG, diluídos 1:200 ou
1:400 em PSA-BSA, por 30 minutos. Depois de lavados, os cortes foram
48
incubados com o complexo estrepto-avidina peroxidase conjugada (complexo
ABC Vectastatin) por 30 minutos. Após nova lavagem com PBS, seguiu-se
coloração com o cromógeno 3,3 diaminobenzidine-peróxido (DAB), seguida por
contracoloração por hematoxilina de Mayer. Por fim, realizou-se a desidratação
das
amostras
e
montagem das
lâminas.
Controles
negativos
foram
processados simultaneamente como descrito acima, sendo que o anticorpo
primário foi substituído por PBS-BSA 5%.
O grau de expressão foi avaliado utilizando-se os seguintes escores
descritos por Yeoh et al.(2005): 0 – sem marcação; 1 – leve marcação; 2 –
moderada marcação; 3 – moderada a intensa marcação e 4 – intensa
marcação.
2.5.8 Contratilidade in vitro de duodeno.
Após o sacrifício dos animais, a cavidade peritoneal dos animais foi
exposta e segmentos de duodeno foram retirados, cortados no sentido da
musculatura circular e colocados em uma placa de Petri contendo solução
nutriente Tyrode modificada (contendo a seguinte composição expressa em
mM: NaCl 136; KCl 5; MgCl2 0,98; CaCl2 2,0; NaH2PO4 0,36; NaHCO3 11,9;
Glicose 5,5) para limpeza e retirada de tecidos adjacentes. Em seguida, os
segmentos de duodeno foram amarrados com linha, suspensos em banho de
órgão (20mL de solução Tyrode, aquecida a 37oC, pH=7,4 e aerada
continuamente com mistura carbogênica 95% O2/5% CO2) e conectados a um
transdutor de força (ADInstruments, modelo MLT0201, EUA) apropriado para
registro
isométrico
de
contrações
e
conectado
a
um
Amplificador
(ADInstruments, ML845 Powerlab 4/25, EUA). Os sinais gerados pelo
transdutor foram registrados em um Sistema de Aquisição de Dados (Chart
Pro, EUA). Após calibração do sistema, foi aplicado ao tecido 1g de tensão de
repouso e o tempo de equilíbrio com as condições artificiais do banho foi de 40
minutos. Duas contrações padrão foram inicialmente obtidas com KCl 60mM e
em seguida foi feita uma curva concentração-efeito com o agonista colinérgico
acetilcolina (ACh em concentrações crescentes e cumulativas variando de 10-10-4M adicionadas ao banho pelo período máximo de 5min para cada
10
49
concentração). Entre as aplicações de KCl e entre a de KCl e a primeira de
ACh foi realizada a troca de solução (lavagem do preparo), permitindo a
estabilização do padrão contrátil basal antes da adição de novo agente ao
banho (Figura 4). Os dados obtidos da curva de ACh foram analisados como
percentual de resposta contrátil em relação à média das contrações padrão
observadas inicialmente para o KCl 60mM.
2.6 Análise estatística
A análise estatística foi realizada com auxílio do software GraphPad
Prism, versão 4.01 (2004). Nos escores de avaliação da diarréia e análise do
grau de mucosite, os dados obtidos foram expressos como mediana (md)
acompanha pelos respectivos valores extremos do rol de dados e comparados
através do teste de Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. As taxas de
sobrevida foram calculadas pelo teste de Kaplan-Meier e os dados analisados
pelo teste de Logrank. Nos demais parâmetros, os resultados foram expressos
como média acompanhada pelo erro padrão da média (média ± EPM) e para
comparação utilizou-se a análise de variância (ANOVA) e teste de Bonferroni.
Em todos os parâmetros, considerou-se estatisticamente significante p < 0,05.
50
3 RESULTADOS
A indução de mucosite gastrointestinal baseou-se no modelo descrito
por Ikuno et al. (1995) e adaptado no Laboratório de Farmacologia da
Inflamacão e do Câncer (LAFICA) por Melo et al. (2007). No presente estudo,
foram testadas duas doses de CPT-11 (60 e 75 mg/kg i.p. durante quatro dias
consecutivos) em camundongos Balb/C.
3.1. Avaliação de parâmteros relacionados à mucosite gastrointestinal
após a administração de CPT-11 em camundongos Balb/C
3.1.1 Avaliação do leucograma de camundongos Balb/C após a administração
de CPT-11
Os animais tratados com CPT-11 (60mg/kg, i.p., por quatro dias
consecutivos) apresentaram leucopenia em relação aos animais injetados com
salina, de forma estatisticamente significativa (p<0,001), no quinto e no sétimo
dias experimentais (Figura 7).
3.1.2 Avaliação da sobrevida de camundongos Balb/C após a administração de
CPT-11
A injeção de CPT-11 nas doses de 60mg/kg e 75 mg/kg por quatro dias
consecutivos promoveu aumento na mortalidade dos animais em relação ao
grupo controle injetado com salina, de forma estatisticamente significativa
(p<0,001) (Figura 8). 56% dos camundongos injetados com a maior dose de
CPT-11 morreram no quinto dia experimental e 40% dos que foram injetados
com a menor dose morreram no sexto dia experimental.
51
3.1.3 Avaliação dos escores de diarréia após a administração de CPT-11 em
camundongos Balb/C
A Tabela 1 mostra que o CPT-11 administrado por quatro dias
consecutivos induziu diarréia tardia quando comparado aos animais que
receberam solução salina.
No quinto dia experimental, ambas as doses estiveram associadas a
diarréia tardia estatisticamente significante em relação ao grupo controle
(p<0,05). Na dose de 60mg/kg, essa diferença também foi observada no sexto
dia e, no sétimo dia, apesar de alguns animais já mostrarem sinais de
recuperação, outros permaneciam com diarréia severa (graus 2 e 3).
Na dose mais alta, a alta mortalidade após o quinto dia nos
camundongos Balb/C interferiu na avaliação da severidade da diarréia no sexto
e sétimo dias devido ao número de animais reduzido (apenas cerca de 10 a
15% dos animais permanecia vivo no sétimo dia, em geral com diarréia
severa).
3.1.4 Alterações nas estruturas histológicas do intestino após a administração
de CPT-11 em camundongos Balb/C
A Figura 9 mostra as alterações histológicas observadas após a
administração de CPT-11 nas doses de 60 e 75 mg/kg por quatro dias
consecutivos em camundongos Balb/C.
Nos
animais
injetados
com salina,
observam-se
as
estruturas
histológicas do íleo em seus aspectos habituais, com a arquitetura preservada.
As vilosidades estão íntegras, assim como o epitélio cilíndrico que as recobre.
As criptas intestinais estão intactas, com células de Paneth preservadas e
facilmente identificáveis.
Entretanto, nos animais injetados com CPT-11, o íleo apresenta aspecto
distinto.
As
vilosidades
apresentam-se
encurtadas
e
os
enterócitos
apresentam-se achatados e com vacuolização. Na região das criptas, há
células apoptóticas e áreas com extensa necrose. Percebe-se ainda a
presença de infiltrado de células inflamatórias.
52
3.1.5 Alterações nos parâmetros morfométricos do íleo após a administração
de CPT-11 em camundongos Balb/C
Na Figura 10 evidenciam-se as alterações morfométricas no íleo de
camundongos Balb/C tratados com CPT-11 (60 e 75mg/kg por quatro dias
consecutivos).
Em relação aos animais injetados com salina, o comprimento dos vilos
apresenta-se reduzido nos animais que receberam CPT-11, nas duas doses
testadas, de forma estatisticamente significativa (p<0,001). Da mesma maneira,
a profundidade das criptas mostra-se diminuída nos animais tratados com
ambas as doses de CPT-11 (p<0,001).
3.1.6 Avaliação da atividade de mieloperoxidase (MPO) no íleo de
camundongos Balb/C após a administração de CPT-11
Após
a
administração
de
CPT-11
(60mg/kg
por
quatro
dias
consecutivos), a atividade de mieloperoxidase no íleo dos animais apresenta
aumento progressivo do quinto ao sétimo dia experimental. O aumento da
atividade de MPO no sétimo dia apresenta diferença estatisticamente
significativa (p<0,001) em relação ao grupo injetado com salina (Figura 11).
3.1.7 Quantificação dos níveis de citocinas (TNFα e IL-1β) no íleo de
camundongos Balb/C após a administração de CPT-11
Na Figura 11, evidencia-se um aumento nos níveis de citocinas no
quinto e no sétimo dias experimentais após a administração de CPT-11
(60mg/kg por quatro dias consecutivos). No quinto dia a elevação de TNFα e
IL-1β é mais marcante, estatisticamente diferente comparada aos animais que
receberam salina (p<0,05)
3.1.8 Avaliação da expressão de citocinas (TNFα e IL-1β) no íleo de
camundongos Balb/C após a administração de CPT-11
53
Os
animais
que
receberam
apenas
salina
não
apresentaram
imunomarcação anti-TNFα (Figura 13) e leve imunomarcação anti-IL-1β no
epitélio dos vilos e nas criptas (Figura14). Os animais com MGI induzida pelo
CPT-11 apresentaram imunomarcação mais acentuada para ambos os
anticorpos no epitélio dos vilos, nas criptas e em células da submucosa do que
os tratados com salina (Figuras 13 e 14).
3.1.9 Avaliação da resposta contrátil do duodeno ao estímulo com betanecol
(BCh) em camundongos Balb/C após a administração de CPT-11
Na Figura 15 evidencia-se que doses crescentes de CPT-11 induzem,
de forma dose-dependente, um aumento progressivo de resposta contrátil
intestinal ao agente colinérgico betanecol. Esta resposta exuberante é
estatisticamente diferente daquela observada em animais injetados apenas
com salina (p<0,05).
54
TABELA 1 – Efeito de diferentes doses de cloridrato de irinotecan (CPT-11) na
indução de diarréia em camundongos Balb/C.
CPT-11 (mg/Kg)
Dia
Salina
60
75
5o
0 (0-0)
2 (0-3)*
2 (0-3)*
6o
0 (0-0)
2 (0-3)*
-
7o
0 (0-0)
1 (0-3)
-
Os animais receberam CPT-11 (60 ou 75mg/kg) ou salina por quatro dias consecutivos
(i.p.). A diarréia foi avaliada de acordo com os seguintes escores descritos por Kurita
et al. (2000): 0 – normal, ausência de diarréia; 1 – diarréia leve, fezes levemente
umedecidas; 2 – diarréia moderada, fezes sem forma ou presença de quantidade
moderada de sujidades na região perianal; e 3 – diarréia grave, fezes aquosas com
grande quantidade de sujidades na região perianal. Os valores representam a
mediana e a variação e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis com
comparação de Dunn. * Diferença estatística comparado aos animais tratados com
salina (p<0,05). O número mínimo de animais utilizados em cada grupo foi oito.
55
Leucócitos x mm
3
10000
7500
5000
*
2500
0
*
Salina
D5
D7
CPT-11
IL-18Wt
FIGURA 7 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11) no
leucograma de camundongos Balb/c IL-18Wt.
Os animais receberam CPT-11 (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.) e foram sacrificados no quinto ou no sétimo dia experimental. O
sangue foi coletado por punção na artéria ocular imediatamente antes do sacrifício e a
contagem totel de leucócitos foi realizada em câmara de Neubauer, conforme descrito
por Moura et al. (1998). Os valores representam a média ± EPM e foram analisados
pelo teste de Bonferroni (ANOVA). * Diferença estatística, comparação com animais
tratados com salina (p<0,001). Número de animais por grupo igual ou superior a seis.
56
Sobrevida (%)
100
50
* *
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tempo (dias)
Salina (n=5)
CPT-11 60mg/kg (n=5)
CPT-11 75mg/kg (n=5)
FIGURA 8 - Efeito da administração de diferentes doses de cloridrato de
irinotecano (CPT-11) sobre a curva de sobrevida de camundongos Balb/C IL18Wt.
Os animais receberam CPT-11 (60 ou 75mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro
dias consecutivos (i.p.). A sobrevida foi calculada pelo método de Kaplan-Meier e a
diferença entre os grupos pelo teste de Logrank. * Diferença estatística comparado
aos animais que receberam salina (p<0,05). O número de animais por grupo foi cinco.
57
FIGURA 9 - Fotomicrografias de camundongos Balb/C IL-18Wt e IL-18KO
injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam CPT-11 60mg/kg i.p. ou salina 0,9% por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O íleo foi removido e
processado para a técnica de coloração pelo método H&E (A e B – 100x; C, D, E e F –
400x). A mucosa dos animais que receberam salina está íntegra, com vilos (A e C) e
criptas preservados (D). Na mucosa dos animais que receberam CPT-11 os vilos
estão encurtados (B, D e F, setas horizontais), há achatamento e vacuolização de
enterócitos (D e F, setas horizontais), necrose de criptas (F, seta vertical) e infiltrado
de células inflamatórias (cabeças de seta).
Comprimento dos vilos
(µm)
58
150
*
100
*
50
0
Salina
60
75
CPT-11 (mg/kg) x 4 dias
IL-18Wt
Comprimento das
criptas (µm)
150
*
100
*
50
0
Salina
60
75
CPT-11 (mg/kg) x 4 dias
IL-18Wt
FIGURA 10 - Efeito da administração de diferentes doses de cloridrato de
irinotecano (CPT-11) na morfometria intestinal em camundongos Balb/C IL18Wt.
Os animais receberam CPT-11 (60 ou 75mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro
dias consecutivos (i.p.) e foram sacrificados no quinto dia experimental. Segmentos do
íleo foram removidos, processados e corados pela técnica H&E. Os valores
representam a média ± EPM e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). *
Diferença estatística, comparação com animais tratados com salina (p<0,001).
Número de animais por grupo igual ou superior a seis.
59
Atividade de MPO
neutrófilos/mg tecido
4000
*
3000
2000
1000
0
Salina
D5
D7
CPT-11
IL-18Wt
FIGURA 11 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11)
sobre a atividade de mieloperoxidase (MPO) no íleo de camundongos Balb/C
IL-18Wt.
Os animais receberam CPT-11 (60mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.) e foram sacrificados no quinto ou no sétimo dia experimental.
Segmentos do íleo foram removidos e congelados em freezer -70°C. O ensaio foi
realizado através de método adaptado de Bradley et al. (1982).Os valores
representam a média ± EPM e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). *
Diferença estatística, comparação com animais tratados com salina (p<0,001).
Número de animais por grupo igual ou superior a seis.
TNF-α (pg/mg proteína)
60
*
0.2
0.1
0.0
Salina
D5
D7
CPT-11
IL-1β (pg/mg proteína)
IL-18Wt
0.75
*
0.50
0.25
0.00
Salina
D5
D7
CPT-11
IL-18Wt
FIGURA 12 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11)
sobre os níveis de citocinas (TNF-α e IL-1β) no íleo de camundongos Balb/C
IL-18Wt.
Os animais receberam CPT-11 (60mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.) e foram sacrificados no quinto ou no sétimo dia experimental.
Segmentos do íleo foram removidos e congelados em freezer -70°C. O ensaio foi
realizado por ELISA através de método descrito por Cunha et al. (1993).Os valores
representam a média ± EPM e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). *
Diferença estatística, comparação com animais tratados com salina (p<0,05). Número
de animais por grupo igual ou superior a quatro.
61
FIGURA 13 - Fotomicrografias de imunomarcação com anticorpos anti-TNFα
no íleo de camundongos Balb/C IL-18Wt e IL-18KO injetados com salina 0,9%
ou CPT-11.
Os animais receberam CPT-11 (60mg/kg, i.p.) ou salina 0,9% por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O íleo foi removido e
processado para a técnica de imunoistoquímica para detecção de TNFα (aumento de
400x). Controle negativo, íleo de animal tratado com CPT-11 na ausência de anticorpo
primário anti-TNFα (A e D). Ausência de imunomarcação anti-TNFα (B e E) em
animais injetados com salina. Íleo de animal IL-18Wt tratado com CPT-11 mostrando
intensa imunomarcação com anti-TNFα (C) em contraste com imunomarcação leve em
íleo de animal IL-18KO que recebeu a mesma dose de CPT-11 (F).
62
FIGURA 14 - Fotomicrografias de imunomarcação com anticorpos anti-IL-1β no
íleo de camundongos Balb/C IL-18Wt e IL-18KO injetados com salina 0,9% ou
CPT-11.
Os animais receberam CPT-11 (60mg/kg, i.p.) ou salina 0,9% por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O íleo foi removido e
processado para a técnica de imunoistoquímica para detecção de IL-1β (aumento de
400x). Controle negativo, íleo de animal tratado com CPT-11 na ausência de anticorpo
primário anti-IL-1β (A e D). Imunomarcação anti-IL1β moderada na linha epitelial (B e
E) em animais injetados com salina. Moderada imunomarcação anti-IL-1β na linha
epitelial e na lâmina própria em animal IL-18Wt injetado com CPT-11 (C) e apenas na
linha epitelial em animal IL-18KO (F) que recebeu o mesmo tratamento.
63
FIGURA 15 – Efeito da administração de diferentes doses de cloridrato de
irinotecano (CPT-11) sobre a resposta contrátil do duodeno ao estímulo com
betanecol (BCh) em camundongos Balb/C.
Os animais receberam CPT-11 (45, 60 ou 75mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.) e foram sacrificados no quinto dia experimental. As amostras de duodeno
foram coletadas e colocadas em solução de Tyrod modificada para realização de ensaio de
contratilidade in vitro. Os dados obtidos da curva de BCh foram analisados como percentual de
resposta contrátil em relação à média das contrações padrão observadas inicialmente para o
KCl 60mM. * Diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina (p<0,05).
64
3.2. Avaliação de parâmetros relacionados à mucosite gastrointestinal
após a administração de CPT-11 em camundongos Balb/C geneticamente
depletados de IL-18 (IL-18KO)
3.2.1 Avaliação do leucograma de camundongos Balb/C IL-18KO após a
administração de CPT-11
Os animais IL-18KO tratados com CPT-11 (60mg/kg por quatro dias
consecutivos) apresentaram leucopenia em relação aos animais injetados com
salina, de forma estatisticamente significativa, no quinto e no sétimo dias
experimentais (p<0,05) (Figura 16).
3.2.2 Avaliação da sobrevida de camundongos Balb/C IL-18KO após a
administração de CPT-11
Os animais IL-18KO tratados com CPT-11 (60mg/kg por quatro dias
consecutivos) apresentaram menor mortalidade em relação aos animais com
genótipo selvagem para o gene da IL-18 (IL-18Wt). A diferença entre as curvas
de mortalidade é estatisticamente significativa (p<0,001). No sexto dia
experimental, os animais IL-18KO apresentaram mortalidade 40% menor que o
grupo controle (Figura 17).
3.2.3 Avaliação dos escores de diarréia após a administração de CPT-11 em
camundongos Balb/C IL-18KO
A Tabela 2 mostra que, no quinto e no sexto dias experimentais, a
administração de CPT-11 (60mg/kg por quatro dias consecutivos) em animais
IL-18Wt promoveu diarréia tardia com diferença estatisticamente significante
em relação ao grupo controle (p<0,05). Já nos animais IL-18KO, no quinto dia,
apenas 25% apresentaram escores 2 ou 3, contra 58% nos animais IL-18Wt.
Não houve diferença estatística na mediana dos escores de diarréia nos
animais IL-18KO em relação aos animais injetados com salina.
65
3.2.4 Alterações nas estruturas histológicas do intestino após a administração
de CPT-11 em camundongos Balb/C IL-18KO
A Figura 18 mostra as alterações histológicas observadas após a
administração de CPT-11 (60mg/kg por quatro dias consecutivos) em
camundongos Balb/C IL-18Wt e IL-18KO.
Nos
animais
injetados
com salina,
observam-se
as
estruturas
histológicas do íleo em seus aspectos habituais, com a arquitetura preservada.
As vilosidades estão íntegras, assim como o epitélio cilíndrico que as recobre.
As criptas intestinais estão intactas, com células de Paneth preservadas e
facilmente identificáveis.
Entretanto, nos animais IL-18Wt injetados com CPT-11, o íleo apresenta
aspecto distinto. As vilosidades apresentam-se encurtadas e, na linha epitelial,
percebem-se muitos enterócitos com vacuolização. Na região das criptas,
áreas com evidente necrose estão presentes.
Nos animais IL-18KO, as estruturas intestinais estão parcialmente
preservadas. Percebem-se vilos com altura normal, mas com epitélio
apresentando algumas células contendo vacúolos.
A maioria das criptas tem
aspecto normal.
3.2.5 Alterações nos parâmetros morfométricos do íleo após a administração
de CPT-11 em camundongos Balb/C IL-18KO
Na Figura 19 evidenciam-se as alterações morfométricas no íleo de
camundongos Balb/CIL-18Wt e IL-18KO tratados com CPT-11 (60mg/kg por
quatro dias consecutivos) ou com salina.
Em relação aos animais injetados com salina, o comprimento dos vilos
apresenta-se reduzido nos animais que receberam CPT-11 de forma
estatisticamente significativa (p<0,001). Já profundidade das criptas não
mostra-se alterada nos animais IL18Wt tratados CPT-11 em relação ao grupo
tratado com salina.
66
Nos animais IL-18KO, não houve diferença estatística na altura dos vilos
nem na profundidade das criptas em relação ao grupo tratado com salina.
3.2.6 Avaliação da atividade de mieloperoxidase (MPO) no íleo de
camundongos Balb/C IL-18KO após a administração de CPT-11
Após
a
administração
de
CPT-11
(60mg/kg
por
quatro
dias
consecutivos), a atividade de mieloperoxidase no íleo dos animais IL-18KO não
apresenta alteração significativa em relação ao grupo injetado com salina
(Figura 20).
3.2.7 Quantificação dos níveis de citocinas (TNFα e IL-1β) no íleo de
camundongos Balb/C IL-18KO após a administração de CPT-11
Na Figura 21, após a administração de CPT-11 (60mg/kg por quatro dias
consecutivos) em camundongos IL-18Wt, evidencia-se um aumento nos níveis
de TNF e IL-1 no quinto dia experimental. A dosagem dessas citocinas nos
animais IL-18KO mostra-se menor que nos animais IL-18Wt, sem significância
estatística em relação ao grupo que recebeu apenas salina.
3.2.8 Avaliação da expressão de citocinas (TNFα e IL-1β) no íleo de
camundongos Balb/C IL-18KO após a administração de CPT-11
Os
animais
que
receberam
apenas
salina
não
apresentaram
imunomarcação anti-TNFα, mas apresentaram leve imunomarcação anti-IL-1β
no epitélio dos vilos e nas criptas. Os animais IL-18Wt com MGI induzida pelo
CPT-11 apresentaram imunomarcação mais acentuada de ambas as citocinas
no epitélio dos vilos, nas criptas e em células da submucosa (Figura 13). Já os
animais IL-18KO apresentaram imunomarcação menos intensa de TNFα em
todos esses locais. Tanto os animais IL-18Wt quanto os IL-18KO tratados com
CPT-11 apresentaram moderada imunomarcação anti-IL1β na linha epitelial,
entretanto, apenas os primeiros apresentaram imunomarcação na lâmina
própria (Figura 14).
67
3.2.9 Avaliação da resposta contrátil do duodeno ao estímulo com acetilcolina
(ACh) em camundongos Balb/C IL-18KO após a administração de CPT-11
Na Figura 22 evidencia-se que o CPT-11 induz um aumento progressivo
de resposta contrátil intestinal ao agente colinérgico ACh. Esta resposta
exuberante é estatisticamente diferente daquela observada em animais
injetados apenas com salina (p<0,05). No entanto, em animais IL-18KO que
receberam CPT-11, a resposta contrátil intestinal à ACh é semelhante àquela
observada nos animais tratados apenas com salina.
TABELA 2 – Avaliação da intensidade da diarréia em camundongos
geneticamente depletados de IL-18 (IL-18KO) tratados com cloridrato de
irinotecano (CPT-11).
CPT-11 (60mg/Kg)
Dia
Salina
IL-18Wt
IL-18KO
5o
0 (0-0)
2 (0-3)*
0 (0-2)
6o
0 (0-0)
2 (0-3)*
0 (0-3)
7o
0 (0-0)
1 (0-3)
0 (0-1)
Animais IL-18Wt ou IL-18KO receberam CPT-11 (60mg/kg) ou salina por quatro dias
consecutivos (i.p.). A diarréia foi avaliada de acordo com os seguintes escores
descritos por Kurita et al. (2000): 0 – normal, ausência de diarréia; 1 – diarréia leve,
fezes levemente umedecidas; 2 – diarréia moderada, fezes sem forma ou presença de
quantidade moderada de sujidades na região perianal; e 3 – diarréia grave, fezes
aquosas com grande quantidade de sujidades na região perianal. Os valores
representam a mediana e a variação e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
com comparação de Dunn. * Diferença estatística comparado aos animais tratados
com salina (p<0,05). O número mínimo de animais utilizados em cada grupo foi oito.
68
Leucócitos x mm
3
10000
7500
*
5000
*
2500
0
Salina
D5
D7
CPT-11
IL-18KO
FIGURA 16 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11) no
leucograma de camundongos Balb/C IL-18KO.
Os animais receberam CPT-11 (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (ip) e foram sacrificados no quinto ou no sétimo dia experimental. O
sangue foi coletado por punção na artéria ocular imediatamente antes do sacrifício e a
contagem totel de leucócitos foi realizada em câmara de Neubauer, conforme descrito
por Moura et al. (1998). Os valores representam a média ± EPM e foram analisados
pelo teste de Bonferroni (ANOVA). * Diferença estatística em comparação com
animais tratados com salina (* p<0,05). Número de animais por grupo igual ou superior
a seis.
69
Sobrevida (%)
100
80
60
40
20
*
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tempo (dias)
IL-18Wt
IL-18KO
FIGURA 17 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11)
sobre a curva de sobrevida de camundongos Balb/C IL-18KO.
Os animais receberam CPT-11 (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.). A sobrevida foi calculada pelo método de Kaplan-Meier e a
diferença entre os grupos pelo teste de Logrank. * Diferença estatística comparado
aos animais IL-18Wt. O número de animais por grupo foi cinco.
70
FIGURA 18 - Fotomicrografias de camundongos Balb/C IL-18Wt e IL-18KO
injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam CPT-11 (60mg/kg, i.p.) por quatro dias consecutivos e foram
sacrificados no quinto dia experimental. O íleo foi removido e processado para a técnica de
coloração pelo método H&E (A e D – 100x; B, C, E, F – 400x). Na mucosa dos animais que
receberam CPT-11 os vilos estão encurtados (A, B, C setas horizontais), há achatamento e
vacuolização de enterócitos (C, seta horizontal), necrose de criptas (C, seta vertical) e infiltrado
de células inflamatórias (C, cabeças de seta). Nos animais IL-18KO que receberam CPT-11, a
mucosa apresenta menor encurtamento de vilos (D e E), criptas preservadas (F) e menos
infiltrado de células inflamatórias na lâmina própria.
Comprimento dos vilos
(µm)
71
150
100
*
50
0
Salina
IL18Wt
IL18KO
CPT-11 60mg/kg x 4 dias
Comprimento das
criptas (µm)
100
75
50
25
0
Salina
IL18Wt
IL18KO
CPT-11 60mg/kg x 4 dias
FIGURA 19 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11) na
morfometria intestinal em camundongos Balb/C IL-18Wt e IL-18KO.
Os animais receberam CPT-11 (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.) e foram sacrificados no quinto dia experimental. Segmentos do íleo
foram removidos, processados e corados pela técnica H&E. Os valores representam a
média ± EPM e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). * Diferença
estatística, comparação com animais tratados com salina (p<0,001). Número de
animais por grupo igual ou superior a seis.
72
Atividade de MPO
neutrófilos/mg tecido
10000
*
7500
5000
2500
0
Salina
IL-18Wt
D5
D7
IL-18KO
CPT-11
FIGURA 20 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11)
sobre a atividade de mieloperoxidase (MPO) no íleo de camundongos Balb/C
IL18KO.
Os animais receberam CPT-11 (60mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.) e foram sacrificados no quinto ou no sétimo dia experimental.
Segmentos do íleo foram removidos e congelados em freezer -70°C. O ensaio foi
realizado através de método adaptado de Bradley et al. (1982).Os valores
representam a média ± EPM e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). *
Diferença estatística, comparação com animais tratados com salina (p<0,001).
Número de animais por grupo igual ou superior a seis.
TNF-α (pg/mg proteína)
73
*
0.2
0.1
0.0
Salina
IL-18Wt
IL-18KO
IL-1β (pg/mg proteína)
CPT-11
0.75
*
*
0.50
0.25
0.00
Salina
IL-18Wt
IL-18KO
CPT-11
FIGURA 21 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11)
sobre os níveis de citocinas (TNF-α e IL-1β) no íleo de camundongos Balb/c IL18KO.
Os animais receberam CPT-11 (60mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.) e foram sacrificados no quinto dia experimental. Segmentos do íleo
foram removidos e congelados em freezer -70°C. O ensaio foi realizado por ELISA
através de método descrito por Cunha et al. (1993).Os valores representam a média ±
EPM e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). * Diferença estatística,
comparação com animais tratados com salina (p<0,05). Número de animais por grupo
igual ou superior a quatro.
74
FIGURA 22 – Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11)
sobre a resposta contrátil do duodeno ao estímulo com acetilcolina (ACh) em
camundongos Balb/C IL-18KO.
Os animais receberam CPT-11 (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.). Os animais foram sacrificados no quinto dia experimental e as
amostras de duodeno foram coletadas e colocadas em solução de Tyrod modificada
para realização de ensaio de contratilidade in vitro. Os dados obtidos da curva de ACh
foram analisados como percentual de resposta contrátil em relação à média das
contrações padrão observadas inicialmente para o KCl 60mM. * Diferença estatística
em relação ao grupo IL-18Wt que recebeu salina (p<0,05). O CPT-11 não promoveu
alteração de contratilidade em animais IL-18KO em relação aos animais que
receberam apenas salina.
75
3.3. Avaliação de parâmetros relacionados à mucosite gastrointestinal em
camundongos Balb/C IL-18Wt após a administração da proteína ligante de
IL-18 (IL-18Bp) e CPT-11
3.3.1 Avaliação do leucograma de camundongos Balb/C IL-18Wt após a
administração de IL-18Bp e CPT-11
Os animais IL-18Wt injetados com CPT-11 (60mg/kg por quatro dias
consecutivos) e tratados com IL-18Bp (200µg/dia por quatro dias consecutivos,
1 hora antes da administração do CPT-11) apresentaram leucopenia em
relação aos animais injetados com salina, de forma estatisticamente
significativa, no quinto e no sétimo dias experimentais (p<0,001) (Figura 23).
3.3.2 Avaliação da sobrevida de camundongos Balb/C IL-18Wt após a
administração de IL-18Bp e CPT-11
Na Figura 24 evidencia-se que os animais IL-18Wt injetados com CPT11 (60mg/kg por quatro dias consecutivos) e tratados com IL-18Bp (200µg/dia
por quatro dias consecutivos, 1 hora antes da administração do CPT-11) não
apresentaram diferença de mortalidade em relação aos animais IL-18Wt
injetados apenas com CPT-11.
3.3.3 Avaliação dos escores de diarréia em camundongos Balb/C IL-18Wt após
a administração de IL-18Bp e CPT-11
Na Tabela 3 evidencia-se que os animais IL-18Wt injetados com CPT-11
(60mg/kg por quatro dias consecutivos) e tratados com IL-18Bp (200µg/dia por
quatro dias consecutivos, 1 hora antes da administração do CPT-11) não
76
apresentam diferença na mediana dos escores de diarréia em relação aos
animais IL-18Wt injetados com salina.
3.3.4 Alterações nas estruturas histológicas do íleo de camundongos Balb/C IL18Wt após a administração de IL-18Bp e CPT-11
A Figura 25 mostra as alterações histológicas observadas após a
administração de CPT-11 (60mg/kg por quatro dias consecutivos) em
camundongos Balb/C IL-18Wt e IL-18KO.
Nos
animais
injetados
com salina,
observam-se
as
estruturas
histológicas do íleo em seus aspectos habituais, com a arquitetura preservada.
As vilosidades estão íntegras, assim como o epitélio cilíndrico que as recobre.
As criptas intestinais estão intactas, com células de Paneth preservadas e
facilmente identificáveis.
Entretanto, nos animais IL-18Wt injetados com CPT-11, o íleo apresenta
aspecto distinto. As vilosidades apresentam-se encurtadas e, na linha epitelial,
percebem-se muitos enterócitos com vacuolização. Nas criptas, áreas com
evidente necrose estão presentes.
Nos animais tratados com IL-18Bp, observa-se proteção parcial às
estruturas histológicas da mucosa. Embora existam áreas de maior
preservação das estruturas intestinais, em outras áreas há encurtamento de
vilos e achatamento epitelial, assim como necrose em criptas.
3.3.5 Alterações nos parâmetros morfométricos do íleo de camundongos
Balb/C IL-18Wt após a administração de IL-18Bp e CPT-11
Na Figura 26 evidenciam-se as alterações morfométricas no íleo de
camundongos Balb/CIL-18Wt injetados com CPT-11 (60mg/kg por quatro dias
consecutivos) e tratados com IL-18Bp (200µg/dia por quatro dias consecutivos,
1 hora antes da administração do CPT-11).
Em relação aos animais injetados com salina, o comprimento dos vilos
apresenta-se reduzido tanto nos animais que receberam CPT-11 como nos que
receberam CPT-11 e IL-18Bp, de forma estatisticamente significativa
77
(p<0,001). Já a profundidade das criptas não se mostra alterada em nenhum
dos dois grupos quando comparada ao grupo que recebeu salina.
3.3.6 Avaliação da atividade de mieloperoxidase (MPO) no íleo de
camundongos Balb/C IL-18Wt após a administração de IL-18Bp e CPT-11
Em animais IL-18Wt injetados com CPT-11 (60mg/kg por quatro dias
consecutivos) e tratados com IL-18Bp (200µg/dia por quatro dias consecutivos,
1 hora antes da administração do CPT-11), a atividade de mieloperoxidase no
íleo não apresenta alteração significativa em relação ao grupo injetado com
salina (Figura 27).
3.3.7 Avaliação da resposta contrátil do duodeno ao estímulo com acetilcolina
(ACh) em camundongos Balb/C IL-18Wt após a administração de IL-18Bp e
CPT-11
Na Figura 28 evidencia-se que o CPT-11 induz um aumento progressivo
de resposta contrátil intestinal ao agente colinérgico ACh. Esta resposta
exuberante é estatisticamente diferente daquela observada em animais
injetados apenas com salina (p<0,05). No entanto, em animais que receberam
CPT-11 e IL-18Bp, a resposta contrátil intestinal à ACh é inferior à observada
nos animais tratados com CPT-11 e não difere estatisticamente da resposta
obtida em animais animais tratados apenas com salina.
78
TABELA 3 – Efeito da administração da proteína ligante de IL-18 (IL-18Bp) na
intensidade da diarréia induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11).
CPT-11 (60mg/Kg)
Dia
Salina
Salina
IL-18Bp
5o
0 (0-0)
3 (1-3)*
0 (0-2)
A mucosite gastrointestinal foi induzida através da administração de CPT-11 (60mg/kg,
i.p.) por quatro dias consecutivos. Os animais receberam IL-18Bp (200µg/dia, i.p.) ou
salina (i.p) por quatro dias consecutivos, 1 hora antes da administração de CPT-11. A
diarréia foi avaliada de acordo com os seguintes escores descritos por Kurita et al.
(2000): 0 – normal, ausência de diarréia; 1 – diarréia leve, fezes levemente
umedecidas; 2 – diarréia moderada, fezes sem forma ou presença de quantidade
moderada de sujidades na região perianal; e 3 – diarréia grave, fezes aquosas com
grande quantidade de sujidades na região perianal. Os valores representam a
mediana e a variação e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis com
comparação de Dunn. * Diferença estatística comparado aos animais tratados com
salina (p<0,05). O número mínimo de animais utilizados em cada grupo foi oito.
79
Leucócitos x mm
3
10000
7500
5000
*
2500
0
*
Salina
IL18Bp
CPT-11
IL-18Wt
FIGURA 23 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11) no
leucograma de camundongos Balb/c IL-18Wt tratados com IL-18Bp.
Os animais receberam CPT-11 (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (ip) e foram sacrificados no quinto ou no sétimo dia experimental. Um
grupo foi tratado com IL18Bp (200mg/dia, i.p., 1hora antes do CPT-11) por quatro dias.
O sangue foi coletado por punção na artéria ocular imediatamente antes do sacrifício e
a contagem totel de leucócitos foi realizada em câmara de Neubauer, conforme
descrito por Moura et al. (1998). Os valores representam a média ± EPM e foram
analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). * Diferença estatística, comparação com
animais tratados com salina (* p<0,001). Número de animais por grupo igual ou
superior a seis.
80
Sobrevida (%)
100
50
*
*
0
0
4
8
Tempo (dias)
Salina (n=6)
CPT-11 (n=6)
CPT-11 + IL-18BP (n=5)
FIGURA 24 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11)
sobre a curva de sobrevida de camundongos Balb/C IL-18Wt tratados com IL18Bp.
Os animais receberam CPT-11 (60 ou 75mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro
dias consecutivos (i.p.). Um grupo recebeu IL-18Bp (200mg/dia, i.p., 1 hora antes do
CPT-11) por quatro dias. A sobrevida foi calculada pelo método de Kaplan-Meier e a
diferença entre os grupos pelo teste de Logrank. * Diferença estatística comparado
aos animais que receberam salina (p<0,05). O número de animais por grupo foi cinco.
81
FIGURA 25 - Fotomicrografias de camundongos Balb/C IL-18Wt injetados com
CPT-11 com ou sem pré-administração de IL-18Bp.
Os animais receberam CPT-11 (60mg/kg, i.p.) por quatro dias consecutivos e foram
sacrificados no quinto dia experimental. Um grupo recebeu também IL-18Bp (200µg/dia, i.p.,
quatro dias). O íleo foi removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (A
– 100x; B, C, D, E, F – 400x). Na mucosa dos animais que receberam CPT-11 os vilos estão
encurtados (A, B, C, setas horizontais), há achatamento e vacuolização de enterócitos (C, seta
horizontal), necrose de criptas (C, seta vertical) e infiltrado de células inflamatórias (C, cabeças
de seta). Nos animais tratados com CPT-11 e IL-18Bp, houve preservação parcial da
morfologia da mucosa (D, E, F).
Comprimento dos vilos
(µm)
82
200
0
*
*
100
Salina
IL-18Bp
CPT-11
IL-18Wt
Comprimento das
criptas (µm)
150
100
50
0
Salina
IL-18Bp
CPT-11
IL-18Wt
FIGURA 26 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11) na
morfometria intestinal em camundongos Balb/c IL-18Wt tratados com IL-18Bp.
Os animais receberam CPT-11 (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.) e foram sacrificados no quinto dia experimental. Um grupo recebeu
tratamento com IL-18Bp (200µg/dia, i.p., 1hora antes do CPT-11) por quatro dias.
Segmentos do íleo foram removidos, processados e corados pela técnica H&E. Os
valores representam a média ± EPM e foram analisados pelo teste de Bonferroni
(ANOVA). * Diferença estatística, comparação com animais tratados com salina
(p<0,05). Número de animais por grupo igual ou superior a quatro.
83
Atividade de MPO
neutrófilos/mg tecido
10000
*
7500
5000
2500
0
Salina
IL-18Bp
CPT-11
IL-18Wt
FIGURA 27 - Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11)
sobre a atividade de mieloperoxidase (MPO) no íleo de camundongos Balb/c
IL18Wt tratados com IL-18Bp.
Os animais receberam CPT-11 (60mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.) e foram sacrificados no quinto dia experimental. Um grupo recebeu
tratamento com IL-18Bp (200µg/dia, i.p., 1hora antes do CPT-11) por quatro dias.
Segmentos do íleo foram removidos e congelados em freezer -70°C. O ensaio foi
realizado através de método adaptado de Bradley et al. (1982).Os valores
representam a média ± EPM e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). *
Diferença estatística, comparação com animais tratados com salina (p<0,05). Número
de animais por grupo igual ou superior a seis.
84
FIGURA 28 – Efeito da administração de cloridrato de irinotecano (CPT-11)
sobre a resposta contrátil do duodeno ao estímulo com acetilcolina (ACh) em
camundongos Balb/C IL-18Wt tratados com IL-18Bp.
Os animais receberam CPT-11 (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.). Um grupo recebeu IL-18Bp (200µg/dia, i.p., 1 hora antes do CPT11) por quatro dias. Os animais foram sacrificados no quinto dia experimental e as
amostras de duodeno foram coletadas e colocadas em solução de Tyrod modificada
para realização de ensaio de contratilidade in vitro. Os dados obtidos da curva de ACh
foram analisados como percentual de resposta contrátil em relação à média das
contrações padrão observadas inicialmente para o KCl 60mM. a - diferença estatística
em relação ao grupo que recebeu salina (p<0,05). b - diferença estatística em relação
ao grupo que recebeu apenas CPT-11 (p<0,05).
85
4. DISCUSSÃO
A mucosite gastrointestinal (MGI) é um efeito adverso frequente e
potencialmente grave do tratamento antineoplásico. Sua incidência varia de 15
a 40% em esquemas de quimioterapia convencional e pode chegar a 100% em
pacientes submetidos a transplante de medula óssea (PICO et al., 1998;
RUBENSTEIN et al., 2004).
A fisiopatologia da mucosite tem sido muito estudada nos últimos anos,
especialmente a mucosite oral. Entretanto, o progresso no manejo clínico dos
pacientes tem avançado mais lentamente e a compreensão dos eventos
envolvidos na patogênese da MGI pode contribuir para o desenvolvimento de
novas abordagens terapêuticas.
Recentemente, Sonis (2004a) propôs um modelo de fisiopatologia para a
mucosite oral induzida por quimioterapia e radioterapia, dividindo-a em cinco
fases: iniciação, resposta à lesão inicial, amplificação do sinal, ulceração e
cicatrização. O autor propõe que a mucosite nas demais regiões do trato
disgestório tenham fisiopatogenia semelhante, embora haja muitas diferenças
nas mucosas oral e intestinal.
Na segunda fase da mucosite, segundo o modelo de Sonis (2004a), a
quebra do DNA decorrente da agressão promovida por quimioterapia ou
radioterapia ativaria vias de transdução de sinal envolvendo p53 e o fator
nuclear kappa-B (NF-κB). Esses fatores de transcrição, principalmente o NFκB, seriam responsáveis pela amplificação de sinal, ativação de diversas vias
de sinalização intracelular incluindo vias de apoptose e produção de citocinas
proinflamatórias como TNFα, IL-1β e IL-6. Algumas dessas proteínas, como o
TNF, promoveriam retroalimentação positiva através de nova ativação de NFκB. Além disso, o TNF ativaria várias vias de sinalização culminando na
ativação de caspase-3 e apoptose. Presente desde o início do processo, o TNF
teria um papel importantíssimo na fase de amplificação do sinal.
Não há dúvida de que a participação de citocinas e quimiocinas na MGI
tem grande importância desde o início do processo. Logan et al. (2007)
demonstraram a presença de citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IL-1β e IL-6)
86
nas primeiras horas após a administração de CPT-11 em ratos. Além de
demonstrar a presença de TNFα, IL-1β e da quimiocina Kc, Melo et al.
demonstraram a atenuação das alterações de mucosa com a administração de
pentoxifilina e talidomida, fármacos que interferem na produção de citocinas,
dentre elas TNFα. A demonstração da importância do envolvimento de
citocinas e a atenuação da MGI com o bloqueio na produção de algumas delas
traz
ao
horizonte
novas
perspectivas
de
intervenção
e
modulação
farmacológica desse processo.
A IL-18 é uma citocina pleiotrópica, reconhecida como um importante
regulador da resposta imune inata e adquirida que pode estimular tanto
respostas Th1 como Th2 (GRACIE, 2004). Dentre outras coisas, ela estimula a
maturação de células T e células NK, promovendo nestas aumento da
expressão de FasL (Fas-ligand) e da citotoxicidade mediada pela ligação FasFasL.
Esta citocina compartilha com a IL-1 e o TNF alguns dos mecanismos de
sinalização (ex.: TLR-toll like receptor, Figura 2), iniciando a cascata de
ativação do NF-κB (DELALEU et al., 2004, NOVICK et al., 1999) . Ela integra a
família da IL-1, com quem tem semelhanças estruturais e compartillha a
mesma via de ativação, através da caspase-1. A IL-18 está envolvida em
inúmeros processos patolológicos e sua ativação pode anteceder e induzir a
produção de TNF e talvez também de IL-1 (DELALEU et al., 2004).
Com base nessas observações, a participação de IL-18 na patogênese
da MGI torna-se bastante provável e até o momento, não há informações a
esse respeito na literatura.
O modelo de MGI induzida por CPT-11 utilizado por Melo et al. (2007) foi
adaptado em camundongos Balb/C, uma vez que os animais IL-18KO que
seriam utilizados pertecem a essa cepa. Melo et al. (2007) utilizaram a dose de
75mg/kg/dia de CPT-11, i.p., por quatro dias consecutivos. Com essa dose, os
camundongos Balb/C apresentaram mortalidade de 60% no quinto dia. Uma
dose menor, de 60mg/kg/dia, i.p., por quatro dias, foi testada e mostrou-se
capaz de induzir MGI de forma satisfatória nessa espécie. Os camundongos
que receberam CPT-11, como esperado, apresentaram leucopenia já
evidenciada no quinto dia experimental e mantida no sétimo dia. Juntamente
87
com a diarréia, a mielotoxicidade é um efeito adverso limitante do CPT-11
(PIZZOLATO et al., 2003; ABIGERGES et al., 1995; SALIBA et al., 1998).
A avaliação da diarréia foi realizada utilizando-se os escores descritos
por Kurita et al. (2000). 58% dos camundongos que receberam CPT-11
(60mg/kg/dia, i.p., por quatro dias) apresentaram escore 2 ou 3 no quinto dia
experimental e 60% no sexto dia, indicando a presença de diarréia acentuada
A atividade de mieloperoxidase (MPO) mostrou-se aumentada nos
animais com mucosite induzida por CPT-11 já no quinto dia experimental e, no
sétimo dia, o aumento atingiu diferença estatística em relação ao grupo
controle tratado com salina. A MPO é uma enzima presente nos grânulos dos
neutrófilos e é utilizada como marcador indireto da presença dessas células
(BRADLEY et al., 1982).
O aspecto morfológico do intestino dos camundongos Balb/C tratados
com CPT-11 mostrou-se bem diferente do de animais tratados com salina,
havendo encurtamento de vilos e criptas, achatamento e vacuolização do
epitélio cilíndrico intestinal, infiltrado de células inflamatórias na lâmina própria,
apoptose de células das criptas e necrose de criptas inteiras.
Além disso, esses animais também apresentaram elevação dos níveis
tissulares de citocinas proinflamatórias (TNFα e IL-1β) no quinto dia
experimental e a presença dessas citocinas pôde ser detectada no tecido por
imunoistoquímica.
O modelo experimental utilizado em camundongos Balb/C conseguiu
reproduzir de maneira satisfatória as alterações morfométricas relacionadas à
MGI descritas previamente na literatura (MELO et al. 2007; LOGAN et al.
2007). Entretanto, a administração seqüencial de CPT-11 em quatro dias
prejudica a avaliação cronológica do processo. Como demonstrado por Logan
et al. (2007), as alterações histológicas na mucosa sucedem em horas ou dias
o surgimento de mediadores inflamatórios, mas precedem o aparecimento dos
sintomas. Detectamos a presença de exuberantes alterações na mucosa
intestinal coincidindo com o pico de citocinas (TNFα e IL-1β), mas não
dosamos citocinas nos primeiros quatro dias experimentais, visto que os
animais ainda estavam em tratamento. Logan et al. (2007) utilizaram um
modelo em ratos, com aplicação de CPT-11 em dose única.
88
A investigação da participação de IL-18 na MGI induzida por CPT-11
envolveu a utilização de animais geneticamente depletados de IL-18 (IL-18KO).
Esses animais apresentaram leucopenia após a administração de CPT-11 de
forma semelhante aos animais selvagens para essa proteína.
A ausência de IL-18 parece proteger parcialmente os animais da lesão
induzida pelo CPT-11. Os animais apresentam menor mortalidade, menos
diarréia e alterações histológicas menos exuberantes, muito embora não haja
um bloqueio completo dos eventos inflamatórios envolvidos.
A taxa de mortalidade dos animais IL-18KO foi 40% menor em relação
aos animais IL-18Wt tratados com a mesma dose de CPT-11.
O aspecto histológico comparativo entre intestinos de animais IL-18Wt e
IL-18KO com MGI induzida por CPT-11 revela que os animais IL-18KO
apresentam alterações com menor intensidade, como vilos mais preservados,
menos necrose em criptas e infiltrado de células inflamatórias menos
exuberante. Além disso, a atividade de MPO não chega a elevar-se de maneira
significativa nesses animais.
Os animais IL-18KO tratados com CPT-11 também apresentam níveis
de TNFα, mas não de IL-1β, mais baixos em relação aos animais IL-18Wt.
Considerando-se que IL-1β e IL-18 partilham a mesma via de ativação através
da ação da caspase-1, a ausência de IL-18 não impede a formação de IL-1β,
que pode funcionar como uma via alternativa de iniciação da cascata
inflamatória (DELALEU et al., 2004). Isso também ajuda a explicar porque não
há bloqueio dos eventos inflamatórios, mas atenuação dos mesmos nos
animais IL-18KO.
Esses animais IL-18KO apresentaram menos diarréia em relação ao
grupo de animais IL-18Wt tratado com a mesma dose de CPT-11. Apenas 25%
dos animais IL-18KO apresentaram escores 2 ou 3 no quinto dia experimental,
contra 58% dos animais IL-18Wt que receberam a mesma dose de CPT-11.
Não houve diferença estatística na mediana dos escores em animais IL-18KO
tratados com CPT-11 comparados aos animais que receberam apenas salina.
Da mesma maneira, a administração da proteína ligante de IL-18 (IL-18Bp)
protegeu da diarréia os animais IL-18Wt tratados com CPT-11.
89
IL-18Bp é uma proteína secretada na forma solúvel, sem domínio
transmembrana, e tem função análoga à do receptor solúvel de IL-1. Ou seja,
liga-se à IL-18 e impede sua interação com o IL-18R (DELALEU et al., 2004;
NOVICK et al., 1999).
O fato de animais que não expressam IL-18 ou em que sua ação foi
bloqueada apresentarem diarréia em menor intensidade abre a perspectiva de
uma possível modulação farmacológica da diarréia relacionada à MGI. A
diarréia é a manifestação clínica mais marcante da MGI e nos quadros mais
dramáticos, pode haver necessidade de nutrição parenteral ou até de
intervenções cirúrgicas em casos de perfuração intestinal ou hemorragia
maciça (GIBSON et al., 2002; BLIJLEVENS et al., 2007).
Em um ensaio de contratilidade para avaliar a resposta contrátil do
duodeno dos camundongos Balb/C ao estímulo com acetilcolina (ACh), doses
crescentes de CPT-11 induziram, de forma dose-dependente, aumento
progressivo de resposta contrátil intestinal ao agente colinérgico. Esta resposta
exuberante não ocorreu em animais injetados apenas com salina nem em
animais IL-18KO. Da maneira correlata, a exacerbação da resposta contrátil foi
inibida em animais IL-18Wt tratados com CPT-11 e que receberam IL-18Bp.
A diarréia causada pelo CPT-11 tem dois componentes. A diarréia
precoce, que ocorre nas primeiras horas após a administração do CPT-11 e
pode vir acompanhada de salivação, diaforese, lacrimejamento e rubor facial, é
prontamente revertida com a administração de atropina. Isso porque o CPT-11
é um potente inibidor da enzima acetilcolinesterase (AChE), que degrada a
acetilcolina na fenda sináptica (HYATT et al., 2005).
A diarréia tardia ocorre alguns dias após a administração do fármaco e
sua etiologia é mais complexa. Os níveis sistêmicos de PGE2 encontram-se
aumentados, assim como a absorção de água e eletrólitos está prejudicada.
Entretanto, a inibição da produção de PGE2 com indometacina não resulta em
melhora da diarréia. A PGE2, portanto, não parece ter um papel central
desencadeador da diarréia tardia, mas pode agravá-la ao promover diminuição
da absorção de água e eletrólitos (KASE et al., 1997).
A presença da enzima carboxilesterase no intestino permite a conversão
de CPT-11 em SN38G, seu metabólito mais ativo, e as bactérias intestinais
90
também convertem a forma inativa SN-38G em SN-38, possibilitando maior
toxicidade direta à mucosa intestinal (KAWATO et. al., 1991). O intestino sofre,
portanto, exposição prolongada ao CPT-11 e seus metabólitos ativos.
O aumento da resposta contrátil à ACh em animais tratados com CPT-11
poderia estar relacionado à ação colinérgica do fármaco. Entretanto, a diarréia
e o aumento da resposta contrátil do intestino em animais tratados com CPT-11
foram revertidos com a administração de IL-18Bp. Isso sugere que o
componente inflamatório do processo deve ter influência na gênese da diarréia,
além da ação colinérgica da droga.
Até 80% dos pacientes em uso de CPT-11 apresentam algum grau de
diarréia (SALIBA et al., 1998). Além disso, uma das queixas frequentes de
pacientes com diarréia relacionada a mucosite é cólica. O fato de animais IL18KO e animais tratados com IL-18Bp apresentarem diarréia mais branda e
menor resposta contrátil após a administração de CPT-11 merece atenção e
precisa ser melhor estudado.
A loperamida é um antidiarréico com ação sobre receptores opióides,
promovendo redução da motilidade intestinal, sendo hoje a ferramenta mais
utilizada na clínica para tratamento da diarréia associada ao CPT-11. Esse
fármaco, como o IL-18Bp, também promove inibição da resposta contrátil
intestinal à ACh (dados não mostrados). Entretanto, a loperamida não tem ação
sobre os eventos inflamatórios envolvidos na MGI, enquanto o IL-18Bp, na
dose testada, foi capaz de amenizá-los parcialmente.
O IL-18Bp desempenha uma função regulatória endógena na via da IL18. Ao ligar-se à IL-18, impede sua interação com o receptor na superfície da
célula (DELALEU et al., 2004). No presente estudo, a administração de IL-18Bp
promoveu melhora da diarréia, redução da atividade de MPO e reversão da
alteração contrátil promovida pelo CPT-11. Entretanto, não houve alteração na
sobrevida dos animais e apenas proteção parcial às alterações de mucosa
como encurtamento de vilos, necrose de criptas e achatamento do epitélio.
A curva de sobrevida de animais tratados com CPT-11 e IL-18Bp
possivelmente será diferente se o tratamento com IL-18Bp for mantido além do
quarto dia experimental, mantendo a via da IL-18 bloqueada por um tempo
mais prolongado.
91
Devido à quantidade da substância disponível ser reduzida, até o
momento só foi testada uma dose de IL-18Bp (200µg/dia, i.p., por quatro dias
seguidos, 1 hora antes do CPT-11) e em um número reduzido de animais
(n=06), o que implica na continuidade da investigação tão logo haja maior
disponibilidade da droga. Talvez em doses maiores o IL-18Bp seja capaz de
conferir proteção maior à mucosa intestinal, transformando-o em uma potencial
ferramenta de modulação da MGI induzida por CPT-11.
Enfim, o envolvimento de IL-18 na MGI induzida por CPT-11 parece
evidente. O papel desempenhado por essa citocina parece fazer parte dos
eventos iniciais da MGI e estar relacionado à intensidade das alterações da
mucosa. A modulação com IL-18Bp parece ser um caminho promissor na
atenuação dos sinais e sintomas relacionados à MGI e necessita ser estudada
de maneira mais profunda.
92
5 CONCLUSÕES
Analisados
em
conjunto,
nossos
dados
permitem
concluir
especificamente que:
- No modelo de MGI induzida por CPT-11 adaptado em camundongos
Balb/C, foram observadas alterações morfológicas (achatamento de vilos),
funcionais (diarréia) e histológicas (necrose de criptas e infiltrado inflamatório)
condizentes com aquelas descritas previamente na literatura em outros
modelos animais.
- A IL-18 está envolvida nos eventos inflamatórios (infiltração celular) e
funcionais (diarréia e contratilidade) da MGI induzida por CPT-11.
- O IL-18Bp atenua os eventos inflamatórios (infiltração celular) e
funcionais (diarréia e contratilidade) da MGI induzida por CPT-11, constituindose em um possível candidato a modulador farmacológico desse processo
patológico.
- As alterações contráteis no intestino promovidas pelo CPT-11, além do
componente colinérgico previamente descrito, parecem ter um componente
inflamatório.
93
FIGURA 29 – Modelo hipotético proposto para a cascata dos mediadores
inflamatórios envolvidos na mucosite gastrointestinal induzida por CPT-11.
94
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ANEXO 1- Documento de aprovação do projeto de pesquisa pela Comissão de
Ética em Pesquisa Animal