Microbiologia
Departamento de Zoologia da Universidade de
Coimbra
MICROBIOLOGIA
António Verissimo
Paula Morais
Indução e repressão catabólica de b-galactosidase em E. coli
As bactérias possuem mecanismos diversificados capazes de controlar a sua actividade
celular procurando responder eficazmente às transformações operadas no meio em que se
encontram, de tal modo que, a sua taxa de crescimento seja máxima em cada uma das
condições ambientais. Um dos níveis mais importantes a que esse controlo é exercido é, sem
dúvida, ao nível da expressão dos seus genes.
De facto, quando pensamos num animal ou numa planta superior, não será difícil
conceber o seu crescimento e diferenciação como uma intrincada cadeia de acontecimentos,
em que alguns genes são sempre transcritos, enquanto que outros, se encontram ora
"silenciosos", ora activos, obedecendo a modificações do meio intracelular e extracelular.
Este conceito pode, no entanto, parecer menos óbvio para um organismo como
Escherichia coli, cujo cromossoma aparenta estar num constante estado de replicação, cujo
ciclo de vida pode demorar apenas 20 minutos e cuja capacidade de diferenciação "no sentido
eucariota" parece ser negligenciável. Contudo, de facto, os genes de uma bactéria encontramse sob o controlo de sofisticados sistemas de regulação.
Genes constitutivos e genes regulados
Podemos fazer uma distinção básica entre genes cuja expressão é regulada e genes em
que a expressão não o é. Aos últimos podemos apelidar de genes constitutivos.
Um gene constitutivo é expresso continuamente, assim, o seu produto (uma enzima, por
exemplo) é encontrado invariavelmente na célula e sempre, mais ou menos, na mesma
concentração; independentemente das condições de cultivo e independentemente do seu
substrato (se se tratar de uma enzima) estar ou não presente.
Pelo contrário, a expressão de um gene regulado está sujeita a alterações provocadas por
estímulo químico que "aparece" e "desaparece" do ambiente em que o gene se encontra.
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Esta distinção não representa que a expressão de um gene constitutivo se processe de
modo perfeitamente "desregulado". Existem muitos níveis de controlo para a expressão de
todos os genes, inclusive os genes constitutivos. Estes podem, por exemplo, ser regulados
por:
a) A estrutura do promotor pode influenciar a frequência de transcrição do gene pela
RNA polimerase.
b) A estrutura do gene na forma de RNA mensageiro pode determinar a rapidez com que
"mensagem" é digerida pelas ribonuclases celulares.
c) A sequência de bases associada ao sinal AUG de início, na "mensagem" transcrita,
pode influenciar a velocidade de início da tradução.
Podemos no entanto, distinguir facilmente os genes constitutivos de genes regulados pois
nos primeiros os controlos são invariáveis, enquanto que os controlos que modulam a
expressão dos genes regulados estão sujeitos a modificações.
Assim, as enzimas constitutivas (codificadas por genes constitutivos) são geralmente,
aquelas que são necessárias em qualquer altura do ciclo de vida do microrganismo, como as
enzimas envolvidas no metabolismo da glucose (enzimas da glicólise e da via da hexose
monofosfato), uma vez que será fácil de admitir que o metabolismo da glucose é
absolutamente central para a maioria das bactérias heterotróficas e portanto estas vias devem
estar continuamente funcionais.
Por outro lado, o metabolismo de hidratos de carbono raros, como por exemplo a lactose,
arabinose ou galactose é efectuado por enzimas reguladas; sintetizar estas enzimas só
quando o seu substrato se encontra presente é, do ponto de vista energético, muito mais
económico.
Genes regulados também codificam enzimas de grande parte das vias biossintéticas (de
amino ácidos, purinas e pirimidinas, por exemplo); novamente parece "ter lógica" que estas
enzimas só sejam sintetizadas quando existe carência dos seus produtos biossintéticos.
Propriedades dos genes regulados
É possível conceber dois mecanismos gerais que, em ocasiões específicas, limitem a
expressão de genes regulados. A acção reguladora pode ser exercida ao nível da
transcrição e neste caso, um gene regulado só será transcrito quando se reunirem um
conjunto de condições apropriadas. Em alternativa, a acção reguladora pode ser exercida ao
nível da tradução e neste caso o RNA mensageiro de um gene regulado, só será traduzido
quando se reunirem as condições apropriadas.
Nas bactérias existem poucos exemplos de controlo na tradução (algumas proteínas
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ribossomais), na sua grande maioria os genes regulados das bactérias são controlados ao
nível da transcrição.
Para que a transcrição de um gene seja regulada, é necessário que alguns elementos
genéticos, associados ao gene, respondam a sinais ambientais permitindo, ou não, a síntese de
RNA mensageiro, a partir do gene em causa.
Nas bactérias é possível encontrar duas classes fundamentais desses elementos
controladores. Ambos são porções do cromossoma e situam-se sempre muito próximo do
gene (ou genes) que controlam. Um designa-se por promotor e o outro designa-se por
operador.
Um promotor é uma sequência de nucleótidos que é reconhecida pela RNA polimerase
(DNA dependente), a ligação promotor - polimerase inicia a transcrição do gene estrutural
vizinho.
Em muitos sentidos a função do promotor de um gene regulado é semelhante à do
promotor do gene constitutivo. Provavelmente, a maior diferença entre os dois tipos de
promotores é que os promotores de genes constitutivos têm propriedades de iniciação
relativamente invariáveis, enquanto que, os promotores de genes regulados encontram-se mais
ou menos activos a promover a transcrição dependendo da presença, ou da ausência de
proteínas específicas, conhecidas por proteínas reguladoras.
Um operador é também uma sequência de nucleótidos que interage com uma proteína.
Esta proteína também se designa por reguladora; a interacção operador - proteína reguladora
impede, ou promove, dependendo do operador em questão, a transcrição do(s) gene(s)
regulado(s).
A distinção fundamental entre operador e promotor é que o operador, contrariamente ao
promotor, não é um local de ligação da RNA polimerase.
Inicialmente, o termo operador foi introduzido por F. Jacob e J. Monod como sendo o
elemento regulador de um operão. Um operão é um conjunto de genes associados (quer
fisicamente, quer na função das proteínas codificadas) que são transcritos numa só molécula
de RNA mensageiro, sendo portanto, todos eles regulados pelos mesmos elementos de
controlo. Recentemente, foram encontrados genes isolados que possuem operador com a
mesma função dos seus congéneres nos operões. Por isso, por vezes, esses genes isolados
são também designados por operão (com um só gene estrutural).
De qualquer modo podemos dizer que um operador interage com uma molécula
reguladora e situa-se sempre entre o promotor e o(s) gene(s) controlado(s).
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Moléculas envolvidas na regulação
As proteínas reguladoras (também chamadas por reguladores, proteínas afectoras, ou
simplesmente por afectores) têm um papel central nos processos de regulação da transcrição.
Elas têm a capacidade de se ligar especificamente aos elementos de controlo; a especificidade
reside na sua conformação tridimensional.
Se a transcrição de um gene depende da ligação ou dissociação da proteína reguladora ao,
ou do, elemento genético de controlo, temos obviamente que considerar um outro tipo de
moléculas que "governam" quando tal ligação ou dissociação deve ocorrer.
Este novo tipo de molécula designa-se por molécula efectora. As moléculas efectoras
são sempre moléculas pequenas; geralmente são um açúcar, um amino ácido ou um
nucleótido. Estas moléculas têm a capacidade de se ligar às proteínas reguladoras, alterandolhes a capacidade de interacção com o elemento de controlo.
Uma vez que a molécula reguladora é uma proteína , ela tem que ser codificada por um
gene. Os genes que codificam proteínas reguladoras tomam o nome de genes reguladores.
Podemos então, definir quatro elementos básicos essenciais para a regulação da
expressão genética a nível da transcrição nas bactérias:
1. O gene estrutural regulado (ou um conjunto de genes - operão).
2. Os elementos genéticos de controlo (incluem o promotor e o operador).
3. A proteína reguladora (e o seu gene estrutural - o gene regulador).
4. O efector.
De facto, todos os mecanismos de regulação genética ao nível considerado, mesmo os
aparentemente mais complexos, podem ser explicados pelas interacções entre estes quatro
tipos de moléculas ou regiões do DNA.
Operões induzíveis e operões repressíveis
Operões, tais como o operão lac (lactose), o operão gal (galactose) e o operão ara
(arabinose) são designados por operões induzíveis; as taxas máximas de transcrição só
ocorrem se os seus açúcares efectores estiverem presentes. Neste caso, os efectores podem
denominar-se indutores.
Operões tais como o operão trp (triptofano), o operão his (histidina) e o operão arg
(arginina) são denominados operões repressíveis; nestes casos, as taxas máximas de
transcrição ocorrem até que os seus aminoácidos efectores atingem uma concentração crítica,
nesse ponto, a transcrição é inibida. Neste caso os efectores podem denominar-se
correpressores.
Ambos os mecanismos de regulação cumprem, claramente, o mesmo objectivo, embora de
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forma recíproca.
Tipicamente, os operões induzíveis das bactérias codificam enzimas "não necessárias"
(não requeridas para sobrevivência directa); usualmente são enzimas envolvidas no
catabolismo de um substrato nem sempre presente no meio. Assim, "tem lógica" que, por
exemplo, as enzimas necessárias para a utilização da arabinose sejam induzíveis pela própria
arabinose; este açúcar só raramente é "encontrado" pelas bactérias portanto, do ponto de vista
energético, é mais eficiente produzir as enzimas para a degradação da arabinose só "por
pedido".
Pelo contrário, os operões repressíveis codificam enzimas "necessárias", as enzimas que
participam em processos biossintéticos. Por exemplo, a histidina é constantemente requerida
por uma célula em crescimento e assim, o operão his é transcrito, mas por vezes, os níveis de
histidina podem ser muito altos (como por exemplo, quando o crescimento cessa ou, se o
meio de cultivo contém este aminoácido), nestas condições a expressão do operão é
reprimida.
O operão lac e a utilização da lactose
A utilização de lactose por células de E. coli depende da expressão genética do conjunto
de genes que constituem o operão lac.
Este operão é constituido por três genes estruturais :
a) o gene lac Z; que codifica a ß-galactosidase, a enzima que cliva a lactose em glucose e
galactose.
b) o gene lac Y; que codifica a proteína M, uma proteína membranar que aumenta a
permeabilidade da célula à lactose.
c) o gene lac A; que codifica uma transacetilase, uma enzima de função desconhecida.
Este operão é hoje um dos mais bem conhecidos, por isso podemos apontar as suas
características principais.
1. O operão lac é regulado por controlo negativo; quer isto dizer que, quando a proteína
reguladora, conhecida por repressor lac, interage com o operão a transcrição é inibida. O
repressor é codificado pelo gene regulador lac I, que se situa no cromossoma, imediatamente
antes do operão.
2. O repressor lac liga-se ao operador lac inibindo a transcrição, a menos que, o efector
(lactose ou um análogo) esteja presente. Assim, na presença do efector, o repressor deixa o
operador, permitindo a transcrição, por isso, o operão lac é induzível.
3. O operão lac é também regulado por controlo positivo o que quer dizer que, quando
interage com uma proteína reguladora conhecida por CAP (catabolite activator protein), a
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transcrição é activada e só então ocorre à sua taxa máxima. O gene regulador que codifica
CAP é crp e encontra-se distante do operão lac.
4. A proteína reguladora CAP liga-se a uma zona do promotor lac, activando a transcrição
só quando glucose está ausente ou se encontra em níveis muito baixos. A glucose causa a
dissociação de CAP do elemento de controlo e nestas condições a taxa de transcrição é
baixa. Este efeito é designado por repressão catabólica. A ligação de CAP ao promotor só
ocorre quando os níveis de AMP cíclico intracelular são altos, o que acontece só quando a
glucose está ausente do meio.
Assim, podemos dizer que a principal função do controlo do operão lac é, como parece
ser a "lógica" da regulação genética, uma boa gestão dos recursos que são apresentados à
bactéria. No caso deste operão, ele só será expresso eficazmente se houver uma boa razão,
isto é, a lactose ser a única fonte de carbono e energia à disposição da bactéria.
Em termos evolutivos, a origem de um sistema como este é difícil de visualizar. Se
assumirmos que, em organismos primitivos, os diferentes genes do operão se encontravam
dispersos pelo cromossoma, não é na verdade fácil antever como estes diversos fragmentos
se associaram e se apresentam hoje próximos uns dos outros e sob o mesmo controlo. No
entanto, parece lógico supor que, quando surgiu um arranjo do tipo operão, ele terá conferido
uma tão grande vantagem adaptativa que, sem dúvida alguma, terá sido "imediatamente"
conservada.
Influência da natureza da fonte de carbono na síntese de ß–galactosidase
Fundamento
A detecção da enzima, em células provenientes de meios de cultura com diferentes
hidratos de carbono, será feita com o auxílio de um substrato análogo à lactose: o ortonitrofenil-ß-galactosídeo (oNPG) (Fig.6)
Este composto, apesar de análogo de lactose, não induz a síntese de ß-galactosidase, mas
serve de substrato; quando ocorre hidrólise, a enzima liberta orto-nitrofenol (oNP) que é um
composto de cor amarela. Assim, a concentração de oNP formado pela actividade da enzima,
pode ser facilmente quantificada por colorimetria.
Uma vez que a ß-galactosidase é uma enzima intracelular, as células serão tratadas com
tolueno (substância que provoca ruptura na membrana celular), para que o substrato fique
acessível à enzima.
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Equipamento, culturas e soluções
Incubadora orbital com temperatura e agitação reguláveis
Centrífuga refrigerada; rotor médio
Tubos de centrífuga de 45 ml
Balança de pratos
Espectrofotómetro; "cuvettes"
Pipetas
5 frascos tipo "Erlenmeyer", de 50 ml
Tubos de ensaio
Relógio
"Vortex"
1 cultura de E. coli em MB+glucose 0.4%, com 7h de idade; D.O.= 0.2
1 cultura de E. coli em MB+lactose 0.5%, com 7h de idade; D.O.= 0.2
1 cultura de E. coli em MB+glucose 0.4%+lactose 0.5%, com 7h de idade;D.O.=0.2
Soro fisiológico (NaCl 0.9%) frio
Água fria
Tolueno
Tampão fosfato; pH 7,2
Solução de oNPG 0,05 M
Solução de Na2CO3 1M
Banho de gelo
Procedimento
A. Obtenção de extractos celulares de E. coli cultivada com os diferentes hidratos
de carbono
Cerca de 40 ml de cada uma das culturas são colocados em respectivos tubos de
centrífuga 1. Os seus pesos devem ser equilibrados com auxílio de uma balança; centrifuga1
Os tubos devem ser cuidadosamente rotulados, para que se possa distinguir a origem de cada uma das
suspensões celulares.
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se a 9000 g, durante 10 min., à temperatura de 4-6°C. O sobrenadante obtido é constituido
pelo meio onde se procedeu ao cultivo das bactérias; o sedimento é constituido,
essencialmente, por células intactas de E. coli. Despreza-se o sobrenadante de cada um dos
tubos e ressuspende-se cada um dos sedimentos em 40 ml de soro fisiológico2.
Os diferentes tubos, depois de novamente equilibrados, são centrifugados nas mesmas
condições da centrifugação anterior. Esta ressuspensão em soro fisiológico funciona como
lavagem, na tentativa de remover a maior parte dos compostos que adsorvem à superfície das
células. A operação pode ser repetida por mais de uma vez.
Os sobrenadantes são de novo desprezados e cada um dos sedimentos celulares é
ressuspenso em 10 ml de água fria.3
A suspensão constituída por células de E. coli cultivadas em lactose é dividida em duas
partes iguais.
A cada uma das suspensões, com excepção de uma das porções de 5 ml de células
cultivadas em lactose, é adicionado 1 ml de tolueno e são agitadas vigorosamente. O tolueno
provoca a ruptura celular, com o consequente esvaziamento dos conteúdos celulares. Assim
obtemos 4 suspensões de extractos celulares de E. coli:
1. Extracto celular de E.coli cultivada com glucose 0,4%.
2. Extracto celular de E.coli cultivada com glucose 0,4% e com lactose 0,5%.
3. Extracto celular de E.coli cultivada com lactose 0,5%.
4. Suspensão de células "intactas" de E. coli cultivadas em lactose 0,5%.
B. Detecção da actividade da ß-galactosidase nos diferentes extractos celulares de
E. coli
1- Em cada um de 5 "Erlenmeyers" de 50 ml, colocar 12 ml de tampão fosfato e 1.5 ml de
oNPG 0,05 M.
2- Incubar durante 15 min. a 37°C com agitação de100 rot./min..
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Deve ter-se a precaução de não contaminar os diferentes sedimentos, uns com os outros. Assim devem usarse diferentes pipetas para diferentes sedimentos.
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Os tubos contendo as diferentes suspensões celulares devem ser mantidos num banho de gelo até à sua
utilização.
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3- Adicionar 2 ml de cada uma das suspensões celulares aos "Erlenmeyers" respectivos4.
Agitar. Iniciar a contagem do tempo. Imediatamente após cada uma das adições retirar 1 ml
de amostra para tubos de ensaio que contêm 1 ml de Na2CO3 1 M e agitar.
4- Continuar a incubação.
5- De 10 em 10 min., durante 50 min., retirar amostras de 1 ml de cada um dos
"Erlenmeyers" para tubos de ensaio5 que contêm 1 ml de Na2CO3 1M. Agitar.
6- Adicionar 8ml de H2O a cada um dos tubos de ensaio. Agitar.
7- Determinar a absorvência das soluções dos diferentes tubos a 420 nm, utilizando água
como referência, para acertar o zero do espectrofotómetro.
8- Relacionar a absorvência determinada com a concentração de oNP através de uma
curva padrão para oNP.
Realização de uma curva padrão para oNP.
1- Preparar a seguinte série de tubos:
Tubo
oNP 1 mM
H2O
(ml)
(ml)
Na2CO3 1 M
(ml)
________________________________________________________
1
0,25
8,75
1,0
2
0,50
8,50
"
3
0,75
8,25
"
4
1,00
8,00
"
5
1,50
7,50
"
6
2,00
7,00
"
7
2,50
6,50
"
8
0,00
9,00
"
2- Misturar bem o conteúdo de cada tubo e medir a absorvência a 420 nm, usando a
solução do tubo 8 como referência, para ajustar o zero do espectrofotómetro.
3- Construir uma curva padrão para oNP, relacionando a absorvência determinada, com a
respectiva concentração de oNP.
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Os "Erlenmeyers" devem ser rotulados, indicando a natureza do extracto celular que cada um contem.
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Os tubos devem ser rotulados, indicando a proveniência da amostra e o tempo de recolha.
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