Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro
Escola Nacional de Botânica Tropical
Programa de Pós-graduação Stricto Senso
Tese de Doutorado
Tecnologia de melhoramento de produção de
Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P.C. Silva.
Rafael Rodrigues Loureiro
Rio de Janeiro
2013
Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro
Escola Nacional de Botânica Tropical
Programa de Pós-graduação Stricto Senso
Tecnologia de melhoramento de produção de
Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P.C. Silva
Rafael Rodrigues Loureiro
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Botânica, Escola Nacional de
Botânica Tropical, do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Doutor em Botânica.
Orientadora: Renata Perpetuo Reis
Rio de Janeiro
2013
ii
Tecnologia de melhoramento de produção
Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P.C. Silva
de
Rafael Rodrigues Loureiro
Tese submetida ao corpo docente da Escola Nacional de Botânica Tropical,
Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro - JBRJ, como
parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Doutor.
Aprovada por:
Prof.a Dr.a Renata Perpetuo Reis (Orientadora)
_________________________________
Prof.a Dr.a Leila Hayashi
_________________________________
Prof.a Dr.a Nair Sumie Yokoya
__________________________________
Prof.a Dr.a Valéria Laneuville Teixeira
___________________________________
Prof.a Dr.a Yocie Yoneshigue-Valentin
___________________________________
em 22/02/ 2013
Rio de Janeiro
2013
iii
Loureiro, Rafael Rodrigues.
L892t
Tecnologia de melhoramento de produção de Kappaphycus
alvarezii (Doty) Doty ex P.C. Silva / Rafael Rodrigues Loureiro. – Rio
de Janeiro, 2013.
XIII, 79f. : il.
Tese (doutorado) – Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do
Rio de Janeiro/Escola Nacional de Botânica Tropical, 2013.
Orientadora: Renata Perpetuo Reis.
Bibliografia.
1.Algicultura. 2.Kappaphycus alvarezii. 3.Tecnologia de
melhoramento. I. Título. II. Escola Nacional de Botânica Tropical.
CDD 589.3
.
iv
“Oxalá adquiras - queres alcançá-las! - as virtudes do burrico!: humilde, duro para o
trabalho e perseverante, teimoso!, fiel, seguríssimo no seu passo, forte e - se tiver
bom dono - agradecido e obediente”
S. Josemaria Escrivá
v
AGRADECIMENTOS
Gostaria de manifestar meus sinceros agradecimentos a todas as pessoas que de
forma direta ou indireta me ajudaram a realizar este trabalho e foram responsáveis pelo
final de tão longa jornada:
À minha orientadora Dra Renata Perpetuo Reis, pelos ensinamentos divididos
durante longos anos de amizade e por sempre exigir o melhor de seus alunos.
Ao Dr. Alan T. Critchley, por durante esses quatro anos ter agido como um
coorientador honorário incentivando-me sempre a excelência.
À Dra Cristina A. G. Nassar, por ter sido a primeira a acreditar em meu potencial
e por continuar a fazê-lo.
A todos os funcionários da Escola Nacional de Botânica Tropical e do Instituto
de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro.
Aos colaboradores: Dr. Daniel Robledo, Dra Gloria Batista Veja, Dr. Jonas
Collén, Dra Lynn Cornish, Miguel Sepulveda e Dr. Raúl Ernesto Rincones pelas
informações sobre cultivos, bibliografias e críticas feitas ao longo deste trabalho.
Aos heróis sem medalha: Ana Carolina Calheiros, Beatriz Castelar, Flávia
Berrogain, Gian Berardinelli, Hanna Brum, Henrique Geromel Góes, Íris Menezes,
Guillermo Ivanov, Pedro Mattos, Rafael “Garrafa” Marroig e tantos outros; por
tornarem esse trabalho possível e por me ensinarem muito durante os anos de
convivência no LALGIC.
Aos meus pais, pelo incentivo e por sempre questionarem minha profissão,
instigando minha teimosia em “Quixoter” pelo caminho profissional que escolhi.
Ao meu irmão, pelas conversas, risadas e amor com que me presenteia nos
momentos bons e ruins.
À minha amada esposa Anne, por ser uma mulher fantástica a qual me força,
diariamente, tentar ser um homem melhor. – To my beloved wife Anne, for being an
amazing woman, compelling me daily to try to be a better man.
vi
RESUMO
Apesar do sucesso da indústria do cultivo de espécies de Eucheumatoides
(Kappaphycus spp. Doty e Eucheuma spp. J. Agardh), esta sofre inúmeras dificuldades,
não só devido à infestação por epífitas (goose bumps), mas também por doenças
causadas pelo sintoma conhecido como ice-ice. Os benefícios do uso de Acadian Marine
Plant Extract Powder (AMPEP), obtido a partir da macroalga marrom Ascophyllum
nodosum Mont., no melhoramento de cultivos agrícolas motivou esse trabalho no intuito
de, não somente, propor uma nova tecnologia de cultivo para Kappaphycus alvarezii
(Doty) Doty ex. P. C. Silva, através do uso do AMPEP, no incremento de biomassa,
rendimento de carragenana e mitigação do estresse causado por agentes abióticos ou
epífitos, mas também o entendimento dos processos envolvidos em tais respostas. Após
testes realizados in vitro, no qual foi estabelecido um protocolo de uso do AMPEP em
mudas de K.alvarezii (20g.L-1 e 1h de exposição) e confirmados in situ, a eficiência do
extrato comercial de A. nodosum, as quais validouo as seguintes hipóteses:maior taxa de
crescimento diário quando expostas ao AMPEP e incremento no rendimento de
carragenana. Neste experimento foi verificado que apesar de menor força e viscosidade
do gel, estes estiveram dentro da faixa considerada comercial. Além destes resultados, o
provável processo responsável pelaa ação do AMPEP em K.alvarezii foi proposto como
um “efeito vacina”, no qual o extrato comercial ilicita as defesas do próprio K.alvarezii
contra agentes externos, sendo eles abióticos (i.e. temperaturas de cultivo mais baixas
do que o ótimo considerado para a espécie) ou bióticos (i.e eliminação de epífitas não
cortiçadas e de ramos jovens não cortiçados de filamentosas cortiçadas). No final deste
estudo foi comprovada, portanto, a eficiência do extrato em pó comercial da alga
marrom A. nodosum (AMPEP) como uma técnica de incremento produtivo para a
algicultura de K.alvarezii e também em protocolos de translocação de mudas, para
evitar a introdução de alguns organismos acompanhantes, que podem ser potenciais
invasores, além de aumentar a resistência da alga perante o estresse do transporte e
aclimatação em um possível novo ambiente.
vii
ABSTRACT
Despite the success of the industry of the cultivation of Eucheumatoid (Kappaphycus
spp. Doty and Eucheuma spp. J. Agardh) it suffers from many difficulties, not only
because of the infestation of epiphytes (goose bumps), but also from diseases caused by
the condition known as ice-ice. The benefits of using Acadian Marine Plant Extract
Powder (AMPEP), obtained from the brown seaweed Ascophyllum nodosum Mont. on
agricultural crops has motivated this work, in order to not only, propose a new
technology of cultivation to Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex. P. C. Silva, through
the use of AMPEP, incrementing its biomass, carrageenan yield and mitigation of stress
caused by abiotic agents or epiphytes, but also on the understanding of the processes
involved in these responses. After tested in vitro, where a protocol for the use of
AMPEP with K.alvarezii seedlings was established (20g.L-1 and 1h exposure) and in
situ the efficiency of the commercial extract of A. nodosum was confirmed validating
the hypothesis: of higher daily growth rate when exposed to AMPEP as well as an
increased carrageenan yield without changing its rheological properties. Moreover, the
possible processes responsible for the interaction between AMPEP and K.alvarezii were
also proposed as a "vaccine effect", where the commercial extract elicits K.alvarezii
own defenses against external agents, such as abiotic factors (growth temperatures
lower than the optimum considered for the species) or biotic factors (elimination of noncorticated epiphytes and young branches of filamentous macroalgae that were yet noncorticated). At the end of this study, we confirmed the efficiency of the commercial
powdered extract of the brown algae A. nodosum (AMPEP) as a new technique to
increase the production of K. alvarezii, in translocation protocols of seedlings to prevent
the introduction of some escort organisms, that can which can be a potential invading
species and to increase the resistance of the algae to the stress of transportation and
acclimatization in a possible new environment.
viii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
1.1. HISTÓRICO DA UTILIZAÇÃO DE MACROALGAS ......................................................... 1
1.2. INDÚSTRIA NOS DIAS ATUAIS ................................................................................... 2
1.2.1. Agar ................................................................................................................ 4
1.2.2. Alginatos ......................................................................................................... 4
1.2.3 Carragenana.................................................................................................... 5
1.3. CULTIVO DE KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY EX P.C.SILVA ......................... 7
1.3.1. Cultivos em ilhas do Pacífico ......................................................................... 9
1.3.2 Cultivos em países africanos ........................................................................... 9
1.3.3. Cultivos em países asiáticos ..................................................................... 10
1.3.4 Cultivos em países americanos (norte, central e sul) ..................................... 11
1.3.4.1. Brasil .......................................................................................................11
1.3.4.2 Colômbia ................................................................................................ 14
1.3.4.3 Equador................................................................................................... 14
1.3.4.4 México .................................................................................................... 15
1.3.4.5 Panamá ................................................................................................... 15
1.3.4.6 Santa Lúcia, Saint Martin e Granadinas ................................................. 16
1.3.4.7 Venezuela ................................................................................................ 16
1.4. TECNOLOGIAS DE MELHORAMENTO PRODUTIVO NA ALGICULTURA DE K. ALVAREZII
.................................................................................................................................... 17
1.5. O USO DE ASCOPHYLLUM NODOSUM E PERSPECTIVAS NA MARICULTURA ................ 18
2. OBJETIVO................................................................................................................ 21
3. HIPÓTESES ............................................................................................................. 21
4. CAPÍTULOS ............................................................................................................. 21
4.1 CAPÍTULO I ............................................................................................................ 21
4.2 CAPÍTULO II ........................................................................................................... 22
4.3 CAPÍTULO III ......................................................................................................... 22
4.4 CAPÍTULO IV ......................................................................................................... 22
CAPÍTULO I: CULTIVO IN VITRO DE TRÊS VARIANTES (VERDE,
VERMELHA E MARROM) DE KAPPAPHYCUS ALVAREZII (RHODOPHYTA,
ARESCHOUGIACEACE) EXPOSTAS AO EXTRATO COMERCIAL DA ALGA
MARROM ASCOPHYLLUM NODOSUM (FUCACEAE, OCHROPHYTA). ....... 23
1- INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 24
2- MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 25
3- RESULTADOS ........................................................................................................... 26
4- DISCUSSÃO .............................................................................................................. 27
5- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 28
CAPÍTULO II: O EFEITO DE “VACINA” EM KAPPAPHYCUS ALVAREZII
(DOTY) DOTY EX. P.C. SILVA PROMOVIDO PELO EXTRATO EM PÓ DA
ALGA MARROM ASCOPHYLLUM NODOSUM (LINNAEUS) LE JOLIS
(AMPEP). ...................................................................................................................... 31
1 - INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 32
2 -MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 33
Condições laboratoriais e aclimatação .................................................................. 33
Desenho experiemental........................................................................................... 34
Crescimento de K. alvarezii e redimento de carragenana...................................... 35
ix
Análise estatística dos dados .................................................................................. 35
3- Resultados .......................................................................................................... 36
4- Discussão ........................................................................................................... 37
CAPÍTULO III: EFEITO DO EXTRATO COMERCIAL DA ALGA MARROM
ASCOPHYLLUM NODOSUM NA PRODUÇÃO DE BIOMASSA DE
KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY EX PC SILVA E NO SEU
RENDIMENTO E A QUALIDADE DO GEL DE CARRAGENANA CULTIVADA
NO BRASIL .................................................................................................................. 45
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 46
2. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 47
Área de estudo e desenho experimental .................................................................. 47
Taxa de crescimento diário de K. alvarezii............................................................. 48
Rendimento da carragenana semirefinada de K. alvarezii .................................... 48
Reologia de K. alvarezii ......................................................................................... 48
Análise estatística dos dados .................................................................................. 49
4- DISCUSSÃO .............................................................................................................. 50
5. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 53
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 53
CAPÍTULO IV: EFEITO DO EXTRATO COMERCIAL DA ALGA MARROM
ASCOPHYLLUM NODOSUM MONT. EM CULTIVO DE KAPPAPHYCUS
ALVAREZII (DOTY) DOTY EX P.C. SILVA SUBMETIDO À TEMPERATURAS
LETAIS .......................................................................................................................... 58
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 59
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 60
Condições laboratoriais ......................................................................................... 60
Desenho experiemental........................................................................................... 60
Crescimento, rendimento e qualidade da carragenana de K. alvarezii ................. 60
Análise estatística ................................................................................................... 61
3. RESULTADOS ............................................................................................................ 62
4. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 63
5- CONCLUSÃO ............................................................................................................ 66
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 66
7. CONCLUSÕES FINAIS .......................................................................................... 70
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS ................................................... 71
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores da indústria de hidrocolóides nos últimos 10 anos. Adaptada de Bixler
& Porse (2011). ................................................................................................................. 3
Tabela 2 Distribuição geográfica da produção de agar. Adaptada de Bixler & Porse
(2011). ............................................................................................................................... 4
Tabela 3 Distribuição geográfica da produção de alginato em 10 anos. PGA=propylene
glycol alginate. Adaptada de Bixler & Porse (2011). ....................................................... 5
Tabela 4 Distribuição geográfica da produção de carragenana em 10 anos, onde álcoll –
CR (carragenana refinada); PES (carragenana semi-refinada para consumo humano);
SRC (carragenana semi-refinada para consumo animal). Adaptada de Bixler & Porse
(2011). ............................................................................................................................... 7
Tabela 5. Uma década de produção e preços de K. alvarezii “cottonii” nas Filipinas e
Indonésia. Adaptada de Bixler & Porse (2011). ............................................................. 10
Tabela 6. Cultivos de Kappaphycus alvarezii nas Américas e Caribe (adaptada em
colaboração com Hurtado et al. – Kappaphycus Cultivation: Problems and Impacts of
Acadian Marine Plant Extract Powder – em preparo). ................................................... 17
Tabela 7. Média±desvio padrão da taxa de crescimento diário e do rendimento de
carragenana de Kappaphycus alvarezii cultivado em diferentes tratamentos após 14 dias
in vitro. Tratamentos são representados por (KC) = K. alvarezii; (KA) = K. alvarezii
banhado em solução de AMPEP; (KO) = K. alvarezii submetido a induzir pulso
oxidativo; (KAO) = K. alvarezii banhado em solução de AMPEP previamente induzido
a produzir pulso oxidativo; (KE) = Epífita amarrada em K. alvarezii; (KAE) = Epífita
amarrada em K. alvarezii previamente banhada em solução de AMPEP; (KOE) = Epífita
amarrada em K. alvarezii induzido ao pulso oxidativo (KAOE) = Epífita amarrada em
K. alvarezii banhada em solução de AMPEP previamente induzido ao pulso oxidativo.
As letras indicam a aparência de K. alvarezii; K. alvarezii (A) = amostras saudáveis sem
branqueamento; (B) = amostras sem cor característica, porém sem branqueamento e (C)
= amostras com branqueamento. Asteriscos indicam a aparência de Polysiphonia
xi
subtilissima (*) = amostras saudáveis; (**) = amostras com as porções apicais (não
corticadas) branqueadas e (***) = amostras totalmente branqueadas. ........................... 37
Tabela 8 Resultados de taxa de crescimento diario (TCD), redimento de carragenana
(RC), força do gel (FG) e viscosidade do gel (VG) de amostras de K. alvarezii (n=12)
submetidas a dois tratamentos (controle e AMPEP) em dois periodos de cultivo (20 e 40
dias). ............................................................................................................................... 50
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Aspecto de uma muda de Kappaphycus alvarezii proveniente de cultivo
comercial em Paraty Mirin, RJ. Foto R.G. Marroig. A- Corte transversal do talo; B- Talo
tetraspórico e C- Aspecto geral do cistocarpo. Fonte: FAO ............................................. 8
Figura 2. Região entre as latitudes ±10o na qual existe o potencial mundial para o
cultivo de K. alvarezii. Retirado de Hayashi et al. (2010). .............................................. 9
Figura 3. Desenho de balsas flutuantes com (a) a técnica rede tubular e (b) e com a
técnica tie-tie. Fonte: Góes & Reis, 2011. Foto com a dimensão do módulo da balsa de
de cultivo. Foto: Renata P. Reis. ..................................................................................... 13
Figura 4. Detalhe de um banco natural de Ascophyllum nodosum em Halifax, Canadá.
Foto: R.R.Loureiro. ........................................................................................................ 19
Figura 5. Taxa de crescimento de três variantes de Kappaphycus alvarezii submetidas à
diferentes concentrações do extrato de Ascophyllum nodosum. Símbolos - quadrado
representa a mediana; retângulo, os quartis, superior e inferior; barras, a projeção dos
non-outliers e círculo, os outliers. .................................................................................. 27
Figura 6. (A) Taxa de crescimento diário, (B) redimento de carragenana, (C) força do
gel e (D) viscosidade do gel de amostras de K. alvarezii previamente banhadas em
solução de AMPEP (TA) ou não reatadas (TC) (n=8) e submetidas a três temperaturas
(T1 =16±1oC; T2 =19±1oC e T3 = 22±1oC). .................................................................. 63
xiii
1. Introdução
1.1. Histórico da utilização de macroalgas
A utilização de macroalgas para consumo humano tem registros escritos desde o
século 4o D.C. no Japão e 6 D.C. na China. Porém, acredita-se que esta prática seja
muito mais antiga, pelos registros de tentativas de cultivo, utilizando métodos simples,
como a disposição de hastes de bambu próximas aos bancos naturais. A explotação de
macroalgas pode datar de muito antes, uma vez que na região da Serra do Bussaco
(Portugal), existem vestígios desta prática em cavernas. O documento de medicina
conhecido como o Tratado Zheng Hi, documento Chinês do século 6 D.C., descreve o
manejo e cultivo de macroalgas para fins medicinais. Neste, são detalhados: a qualidade
do bambu que será utilizado, os númerosos riscos em cada haste (com o intuito de
deixar a superfície mais rugosa para captar mais esporos), as luas ideais para cultivo
(fluxo das marés e esporulação) e que as estruturas de cultivo deveriam ser colocadas
próximas aos bancos naturais (Craigie 2011).
Nas Ilhas Britânicas e na Escandinávia, espécies nativas também foram
utilizadas, pelas populações locais, durante séculos para inúmeras finalidades. Em um
poema escrito em 523 D.C., atribuído a São Columbo foi relatado que os monges de
Iona coletavam dulse (Palmaria palmata (Linnaues) Weber & Mohr) nas rochas, que
eram fervidas e, posteriormente, misturadas no mingau de aveia. Na Edda, coletânea de
sagas viking, escrita no século IX, foi narrada a história de um herói ferido em combate,
que foi tratado com uma “poção mágica” feita a partir de algas marinhas. A porção foi
confeccionada por uma bruxa que vivia em uma cabana perto do mar, que colheu e
ferveu as “plantas da água” para aplicar o elixir no ferimento. Provavelmente, o efeito
foi devido à alta concentração de iodo contida nas algas pardas, comuns em regiões de
água fria (Celb 2000).
Nos séculos XVII e XVIII, novas utilizações para macroalgas foram
descobertas, o que deu início ao processo de produção industrial conhecido atualmente.
No final do século XVII, indústrias de extração e beneficiamento de iodo e compostos
de potássio (Potash), a partir de espécies dos gêneros Fucus Linnaues, Laminaria J.V.
Lamouroux e Ascophyllum Stackhouse foram instaladas pelo Império Britânico no
arquipélago formado pelas Ilhas do Oeste e Orkney, com a intensão de quebrar o
monopólio espanhol. Este produzia um composto chamado barilla, rico em iodo e
potássio, que era usado na indústria de vidraria, fabricação de sabão e lavagem e
1
branqueamento de tecidos e, assim, se livrar do bloqueio imposto pelas guerras
napoleônicas. Contudo, a indústria britânica teve seu declínio após a descoberta de
minas de compostos de potássio na região de Stassfurd, Alemanha e de cristais de iodo
no Chile no início do século XIX (Craigie 2011).
Após a primeira guerra mundial, um novo grupo de produtos químicos derivados
de macroalgas cresceu em interesse comercial, os hidrocolóides. Em 1881, o cientista
escocês E.C. Stanford trabalhou com extratos de Laminaria sp. que aumentaram o
interesse pelo uso dos hidrocolóides, principalmente, devido a sua capacidade
gelatinizante, espessante e emulsificante. Estes extratos eram utilizados em rações
militares e em produtos médicos. Contudo, tais produtos já eram utilizados de maneira
impirica e tradicional por inúmeras comunidades. Anos mais tarde, em 1949, com a
descoberta de Kathleen Drew-Baker da fase conchocelis do ciclo de vida de Porphyra
sp. foi possível estabelecer a técnica de cultivo desta espécie, que alavancou a indústria
de Porphyra e sua comercialização mundial (Celb 2000).
1.2. Indústria nos dias atuais
O consumo de macroalgas é mundial. Indústrias associadas aos cultivos são
responsáveis por um arcabouço de produtos que gera valores anuais de US$ 4,5 a 5
bilhões de dólares por ano com foco em agar, carragenana e alginatos. Além disso,
compostos biologicamente ativos são vendidos como suplemento alimentar, a alga é
usada no consumo direto, ou no uso indireto. Corantes e flavorizantes vem ganhando
espaço no mercado. Dados recentes mostram o aumento no consumo e na produção em
países da America Latina e Caribe (FAO 2010).
O cultivo de algas marinhas se expandiu rapidamente incentivado pela crescente
demanda da indústria a qual, inicialmente, contava apenas com a explotação de bancos
naturais. Esta demanda motivou a busca de tecnologias para o melhoramento da
produção que resultassem em maneiras mais efetivas para o incremento de biomassa e
de indivíduos mais resistentes (Zemke-White & Ohno 1999). Cultivos comerciais estão
presentes em 35 países, distribuídos em ambos os hemisférios, e são responsáveis por
90% da produção mundial de macroalgas para a indústria (Lüning & Pang 2003; FAO
2010; Bixler & Porse, 2011).
A estrutura industrial de macroalgas início na década de 30 com pequenos
produtores. A partir da década de 60, as companhias de maior porte, como a Algin Corp
e Marine Colloids/FMC, se interessaram em incentivar a produção de algas em larga
2
escala e a investir mais nesta indústria.
Com o passar do tempo o inverso ocorreu em países como as Filipinas e a
Malásia, onde pequenos produtores se organizaram em pequenas cooperativas e
originaram as grandes corporações (e.g. Shemberg Corp., TBK e Marcel Trading Corp.)
e atrairam a atenção de empresas ocidentais. Empresas como a Cargill, a CPKelko e
FMC Corporation atualmente compram o material bruto de empresas locais (alga seca
ou carragenana semirefinada) ou instalam suas sedes em locais de compra de matéria
prima, a fim de reduzir os custos em transporte, produção e mão de obra (Zemke-White
& Ohno 1999; Bixler & Porse 2011; Bindu & Levine 2011).
Entre os maiores produtores mundiais, destacam-se os países asiáticos. A China
é a maior produtora de algas para consumo direto, com uma produção de 7,5 milhões de
toneladas fresca.ano-1 de seu total de produção de 11,092 milhões no ano de 2010 (FAO
2010; Bixler & Porse 2011).
A maior parte da produção está voltada para o cultivo de kombu [Saccharina
japonica (Areschoug) C.E.Lane, C.Mayes, Druehl & G.W.Saunders], cultivada em
centenas de hectares em sistemas de cordas suspensas (Tseng, 2001; McHugh 2003). A
República da Coréia produz anualmente cerca de 500.000 toneladas fresca.ano
-1
com
destaque para os cultivos de Porphyra sp. e wakame [Undaria pinnatifida (Harvey)
Suringar]. O Japão é o segundo maior produtor de algas para consumo direto, com
700.000 toneladas fresca.ano-1 e o nori (Porphyra spp.) é responsável por 65% do total
desta produção. Dentre as algas cultivadas para consumo direto, o nori é o mais
valorizado, podendo atingir US$ 16.000 por tonelada seca, dependendo da origem e da
qualidade do produto, quando comparado ao wakame US$ 6.900 por toneladas secas e
ao kombu US$ 2.800 toneladas secas (FAO 2010) (Tab. 1).
Tabela 1. Valores da indústria de hidrocolóides nos últimos 10 anos. Adaptada de Bixler
& Porse (2011).
Hidrocolóide
1999 (US$ milhões)
2009 (US$ milhões)
Agar
128
173
Alginato
225
318
Carragenana
291
527
Total
644
1018
3
1.2.1. Agar
Dois gêneros, Gracilaria sp. Greville e Gelidium sp. J.V. Lamouroux, são as
principais fontes de matéria-prima para indústria de agar no mundo (McHugh 2003;
Bixler & Porse 2011). Contudo, apenas Gracilaria sp. obteve sucesso em cultivos no
Chile e na Indonésia. Atualmente, Gelidium sp. é preferencialmente utilizado na
fabricação de géis para culturas bacteriológicas, sendo explotado em bancos naturais de
países como a França, Indonésia, República da Coréia, México, Marrocos, Portugal e
Espanha (Bixler & Porse, 2011).
No Chile, bancos naturais de Gracilariopsis sp. E.Y. Dawsom também são
explotados em menor quantidade, assim como na Índia, onde Gelidiella sp. Feldmann &
G.Hamel é retirada de bancos naturais e utilizada exclusivamente no mercado interno
(Becker & Rotmann 1990; Jensen 1993).
A indústria de agar gera US$ 132 milhões.ano-1 e companhias como Algas
Marinas (Chile) e Agarindo Bogatama (Indonésia) produzem cerca de 3.600
toneladas.ano-1, o que representa 58% da produção mundial. Empresas como a Setexam
(Marrocos), MSC Co. (República da Coreia), Hispanagar (Espanha) e Huey Shyang
Seaweed Industrial Company (China) somam uma produção de 5.500 toneladas ano-1
(57% do mercado mudial). Contudo, apenas 77% da produção mundial (12.500 tonelada
seca.ano-1) é utilizada devido à competição entre os produtores (McHugh 2003; Bixler
& Porse 201,Tab.2).
Tabela 2. Distribuição geográfica da produção de agar. Adaptada de Bixler & Porse
(2011).
Região
Volume (t) 1999
Volume (t) 2009
Europa
1.000
700
900
800
Américas
2.600
2.800
Ásia-Pacífico
3.000
5.300
Produção total
7.500
9.600
Total estimado
9.000
12.500
83
77
África
% Utilizado
1.2.2. Alginatos
A indústria de alginatos produz ácido algínico e sais alcalinos. Dentre seus
4
derivados, o PGA (propylene glycol alginate) destaca-se em preço de mercado e é o
insumo mais barato utilizado na indústria alimentícia (Turan & Neori, 2010; Bixler &
Porse, 2011). O cultivo de macroalgas para a produção de alginato é excessivamente
custoso, portanto, a indústria utiliza a exploração controlada de bancos naturais e,
principalmente, com os excedentes das produções de espécies de Laminaria e Undaria
Suringar, as quais são muito utilizadas no consumo direto (McHugh 2003). A partir da
na década de 80, a China tornou-se a maior produtora de alginato e quebrou o domínio
europeu, norte americano e japonês, com a implementação das indústrias de
beneficiamento de alginato, as quais também usam o excedente dos cultivos de algas
utilizadas no consumo direto (Vasquez 1995; Tseng 2001; Vauchel et al. 2008).
O valor da produção mundial de alginato não é preciso, uma vez que na
elaboração de blends, que são misturas de substâncias químicas ao alginato, a
quantidade de alginato utilizada, por motivo de segredo industrial, não é descrita e a
China ser o maior produtor mundial, que por sua vez não fornece dados precisos de
produção (Bixler & Porse, 2011). Estima-se que a produção de alginato a partir da
espécie de maior consumo, a Saccharina japônica, seja de 22.000 toneladas ano-1 (FAO
2010).
A indústria de alginato norte americana é praticamente inexistente quando
comparada com outros produtores mundiais. Na Europa, dois terços da produção de
alginato é creditado à FMC Corporation. Os países do Indo-pacífico são a verdadeira
força motriz desta indústria (McHugh, 2003; Bixler & Porse 2011, Tab.3).
Tabela 3. Distribuição geográfica da produção de alginato em 10 anos. PGA=propylene
glycol alginate. Adaptada de Bixler & Porse (2011).
Região
Alginato (t) 1999 PGA (t) 1999 Alginato (t) 2009 PGA (t) 2009
Europa
12.000
0
10.000
0
Américas
4.000
1.000
1.000
100
Ásia-Pacífico
9.000
1.000
15.500
1.900
Subtotal
25.000
2.000
26.500
2.000
Total estimado
28.000
2.300
35.000
-
89
-
76
-
% Utilizado
1.2.3 Carragenana
A maior indústria de hidrocolóides é a indústria de carragenana, que gera
anualmente US$ 240 milhões e está difundida em todos os continentes (Bindu & Levine
5
2011).
Inicialmente, esta indústria dependia da explotação de bancos naturais de
Chondrus crispus Stackhouse, alga nativa do Atlântico Norte. No início da década de
70, a indústria da carragenana expandiu-se de maneira exponencial, devido à descoberta
do potencial de explotação e cultivo de carragenófitas em locais de clima quente e do
avanço de tecnologias de cultivo fomentadas pela pesquisa básica (Bixler & Porse 2011;
Bindu & Levine 2011).
A carragenana é outro ficocolóide difícil de ser quantificado e caracterizado.
Uma das dificuldades de se caracterizar a carragenana é que, apesar de ser conhecido
que a carragenana kapa e iota formam géis, sendo a iota mais elástica, e a carragenana
lambda é viscosa e de difícil obtenção, muitas vezes esta última é obtida de misturas de
carragenanas mu/nu extraídas de espécies de Gigartina sp. Stackhouse e de Sarcothalia
sp. Kützing e são feitas misturas de kappa e iota (McHugh 2003, Bixler & Porse 2011).
Além disso, de maneira semelhante ao alginato são elaborados blends nos quais a
quantidade e o tipo de carragenana não citados (H.G. Góes comunicação pessoal).
No passado, a maior produção de carragenana era realizada por indústrias
européias e norte americanas e o restante pelos países da Ásia-Pacífico e
latinoamericanos. A partir da década de 70, com a permissão do uso da carragenana
semirefinada (PES) para consumo humano, aumentou a demanda por carragenana e os
locais de sua produção (McHugh 2003; Bixler & Porse 2011, Tab. 4).
Anteriormente, nos Estados Unidos, a carragenana semirefinada (SRC) usada em
alimentos de animais de estimação era limpa de microorganismos no processo de
esterelização e purificada na industrialização para consumo humano e não era exigida a
diferenciação entre a carragenana refinada e a semirefinada, enquanto que as agências
européias e a FAO/WHO (Food and Agriculture Organization of the United
Nations/World Health Organization) Codex Alimentarius exigiam a clasificação de
carragenana refinada como E 407 e a semirefinada PES, E 407a.
A partir da liberação da carragenana semirefinada (PES) para consumo humano,
a indústria indo-Pacífica e a chinesa cresceram (McHugh 2003; Bixler & Porse 2011).
6
Tabela 4. Distribuição geográfica da produção de carragenana em 10 anos, onde álcoll –
CR (carragenana refinada); PES (carragenana semi-refinada para consumo humano);
SRC (carragenana semi-refinada para consumo animal). Adaptada de Bixler & Porse
(2011).
Região (ano)
Álcool (t)
gel (t)
PES (t)
SRC (t)
Total (t)
1999
Europa
7.700
2.500
200
-
10.400
Américas
4.800
2.000
-
-
6.800
Ásia-Pacífico
1.000
3.000
8.000
11.000
23.000
-
1.000
1.000
-
2.000
Produção total
13.500
8.500
9.200
11.000
42.000
Total estimado
15.200
11.000
12.000
13.000
55.200
88
77
77
85
76
Europa
6.000
1.000
100
-
7.100
Américas
4.500
3.500
1.400
-
9.400
Ásia-Pacífico
1.000
4.000
16.000
5.000
26.000
-
4.500
3.000
-
7.500
Produção total
11.500
13.000
20.500
5.000
50.000
Total estimado
13.500
16.500
27.000
8.000
65.000
85
78
76
65
76
China
%Utilizado
2009
China
%Utilizado
1.3. Cultivo de Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P.C.Silva
Indivíduos do gênero Kappaphycus Doty podem atingir mais de 100 cm de
altura. Seu talo principal é multiaxial podendo conter uma medula central composta por
células isodiamétricas. Contudo, algumas espécies apresentam estrutura de talo do tipo
pseudoparenquimatosa formando uma mistura de células grandes e pequenas variando
em forma e quantidade (Fig.1) (Areces 1995)
7
Figura 1. Aspecto de uma muda de Kappaphycus alvarezii proveniente de cultivo
comercial em Paraty Mirin, RJ. Foto R.G. Marroig. A- Corte transversal do talo; B- Talo
tetraspórico e C- Aspecto geral do cistocarpo. Fonte: FAO
Estágios iniciais de reprodução do gênero ainda não foram totalmente descritos,
porém assemelham-se ao gênero Eucheuma, do qual faziam parte até 1987, quando
Doty segregou o gênero Kappaphycus pela presença de kappa carragenana. O
cistocarpo maduro tem a tendência de formar-se no talo principal (Areces 1995; Guiry
& Guiry 2011).
A espécie tipo é oriunda do arquipélago de Sulu, localizado no mar de Sulu,
sudoeste das Filipinas. Devido à sua importância para a maricultura, o gênero foi
introduzido em vários países e nomeada em honra ao biólogo pesquisador filipino
Vicente Alvarez. Populações nativas podem ser encontradas no Pacífico oeste e central,
no leste africano, na Indonésia, na Malásia, na Ilha Hainan, nas Filipinas e na
Micronésia (Guiry & Guiry 2011).
Registros dos primeiros cultivos de K. alvarezii datam de 1960, na região sul de
Mindanao, Filipinas e informam a utilização de variantes derivadas de indivíduos
coletados em bancos naturais (Bindu & Levine, 2011). Após quatro décadas, os cultivos
de K. alvarezii e de Eucheuma denticulatum (N.L.Burman) F.S.Collins & Hervey
representavam 88% da produção de kappa (K. alvarezii) e iota (E. denticulatum)
carragenana, o que corresponde a 120.000 toneladas secas.ano-1. Os principais países
produtores são as Filipinas, Indonésia e Tanzânia (Ask et al. 2001; Hayashi et al. 2010;
8
Bindu & Levine 2011). Contudo, cultivos de K. alvarezii são encontrados em mais de
20 países localizados entre as latitudes de ±10o (Fig.2), a qual possui as condições
abióticas ideais para o cultivo da espécie (Hayashi et al. 2010).
Figura 2. Região entre as latitudes ±10o na qual existe o potencial mundial para o
cultivo de K. alvarezii. Retirado de Hayashi et al. (2010).
1.3.1. Cultivos em ilhas do Pacífico
Cultivos comerciais de K. alvarezii começaram a ser difundidos na região,
principalmente após o sucesso dos cultivos nas Filipinas, em meados da década de 70,
indicado como uma alternativa de geração de recursos e postos de trabalho para
populações costeiras e ao desenvolvimento econômico da região (Pickering 2006).
Pickering & Forbes (2002) apontaram o crescimento do cultivo de K. alvarezii como o
responsável pela consolidação da algicultura em países como Fiji e Nova Guiné.
As pesquisas básicas associadas à práticas locais, geraram manuais práticos de
assistência aos maricultores nativos (Teitelbaum 2003) e workshops instrutivos
organizados pelos governos, a fim de solucionar problemas como a herbívora excessiva,
macroalgas epífitas e o ice-ice, sintoma observado pelo branqueamento do talo e
enfraquecimento do indivíduo (Bindu & Levine 2011)
1.3.2 Cultivos em países africanos
Os primeiros cultivos de K. alvarezii registrados em países africanos ocorreram
em meados dos anos 80, associados aos cultivos de E. denticulatum, na Tanzânia e mais
tardiamente na costa leste de Zanzibar e nas Ilhas Pemba expandindo-se na década de
9
90 (Ask et al. 2001).
O método utilizado, diferente dos long-lines usados nas Filipinas, foi composto
por cercados retangulares. Mtolera (2003) fez uma associação entre a baixa produção do
método com a cobertura de gramíneas marinhas que promoveram a limitação da
captação de recursos pelas algas (e.g. luz e nutrientes) com consequente diminuição da
produção.
1.3.3. Cultivos em países asiáticos
As Filipinas mantém a maior concentração de refinarias de carragenana da Ásia,
e compra matéria prima de outros países produtores asiáticos, a Indonésia, a Malásia, o
Japão, o Vietnã, a China e a Índia (McHugh 2003; Bindu & Levine 2011).
K. alvarezii é responsável por 80% das exportações de macroalgas das Filipinas.
A alga é vendida úmida ou seca, sendo a última mais valorizada no mercado externo. A
alga úmida (87%) é consumida nos países asiáticos (Hurtado 2003; Hayashi et al.
2010).
A Indonésia é a principal produtora mundial K.alvarezii, após quebrar o domínio
filipino que durou mais de 35 anos (Tab.5). Isto ocorreu, principalmente, por perda de
produção ocasionada por problemas decorrentes de mudanças climáticas, epifitismo e
ice-ice, assim como políticas governamentais desfavoráveis aos pequenos produtores
(Bindu & Levine 2011).
Tabela 5. Uma década de produção e preços de K. alvarezii “cottonii” nas Filipinas e
Indonésia. Adaptada de Bixler & Porse (2011).
Ano
Produção Filipina
(t seca)
Produção
Indonésia (t seca)
Produção total de
cottonii (t seca)
Preço Filipino
(US$ t-1 seca)
Preço Indonésio
( US$ t-1 seca)
2000
113.000
27.000
140.000
710
650
2001
97.000
28.000
125.000
575
525
2002
91.000
30.000
121.000
420
535
2003
90.000
44.000
134.000
770
615
2004
97.000
49.000
146.000
850
750
2005
89.000
56.000
145.000
774
650
2006
84.000
68.000
142.000
748
617
2007
81.000
74.000
155.000
947
811
2008
73.000
79.000
152.000
2.342
2.166
2009
61.000
85.000
146.000
1.280
1.208
10
Além do crescimento na Indonésia no cenário mundial do cultivo de K. alvarezii,
outros países, como a Índia, que tradicionalmente não usavam o cultivo de macroalgas
como uma atividade comercial, passaram a se destacar como produtores, com
promissores programas geridos pelos governos locais, que vislumbraram no cultivo de
macroalgas um meio de desenvolvimento econômico sustentável, além de gerar novos
postos de emprego para populações de baixa renda (Bindu 2006; 2007; 2009; Bindu &
Levine 2011).
1.3.4 Cultivos em países americanos (norte, central e sul)
Ask & Azanza (2002) citam a incipiência de cultivos comerciais de K. alvarezii
nas américas, que apresentam potencial de produção para atingir o patamar dos grandes
produtores mundiais. No entanto, a maior preocupação da introdução nesses países é o
potencial de risco ambiental. Algumas complicações foram relatadas na introdução de
K. alvarezii para fins comerciais no Havaí (Rodgers & Cox 1999; Conklin & Smith
2005), com relatos posteriores na Venezuela (Barrios 2005) e na Índia (Chandrasekaran
et al. 2008). Contudo, outros pesquisadores comentaram que a invasão desta espécie é
restrita à locais que sofreram ações antropogênicas (Pickering et al. 2007).
Além disso, a falta de cultura e tradição no cultivo de macroalgas marinhas na
região e poucos incentivos governamentais deixa para a academia a tarefa de gerar
alternativas biotecnológicas e estudos de riscos ambientais da introdução para fazer o
cultivo Eucheumatoides nas Américas e no Caribe tornar-se sustentável.
1.3.4.1. Brasil
Tradicionalmente as algas são colhidas por mulheres, jovens ou pescadores em
bancos naturais na região Nordeste. As macroalgas são uma fonte de renda alternativa
para as comunidades costeiras que as vendem como matéria-prima para a indústria de
carragenana. Hypnea musciformis (Wulfen) J.V. Lamouroux é a carragenófita explorada
em bancos naturais, como matéria prima para a indústria de carragenana brasileira,
entretanto não supre a demanda nacional. Devido à falta de manejo de colheita, os
bancos naturais estão se esgotando (Castelar et al. 2009).
Atualmente, a espécie exótica K. alvarezii é a principal macroalga cultivada
comercialmente no Brasil. O seu sucesso é explicado por sua simples técnica de manejo,
ou seja, através de crescimento vegetativo a partir da fragmentação do talo, a resiliência
da espécie a fatores abióticos e as suas elevadas taxas de crescimento (Góes & Reis
11
2011; Pellizari & Reis 2011).
A introdução de K. alvarezii no Brasil ocorreu na baía de Ubatuba, SP, por
Edison José de Paula e seu grupo de pesquisa da Universidade de São Paulo. Foi
utilizado um clone do Japão, originário das Filipinas. Após uma quarentena de 10
meses, mudas foram introduzidas no mar (Paula et al. 2002; Reis et al. 2007). Também,
foram introduzidas mudas de Kappaphycus striatus (F. Schmitz) Doty ex P.C. Silva, que
foram retiradas do mar por produzirem tetrásporos viáveis (Bulboa et al. 2007; Reis et
al. 2007).
A primeira algicultura no Brasil foi implantada na baía da Ilha Grande, RJ, por
Miguel Sepúlveda, em 1998, após um período de quarentena em tanques, em SC, com
mudas trazidas da Venezuela (Castelar et al. 2009). Em 2004, outro cultivo foi instalado
na baía de Sepetiba, RJ, pela Ondas Biomar Cultivo de Algas Marinhas Ltda. Esta
empresa possuiu o maior cultivo de K.alvarezii na América Latina, com mais de 20
hectares. No entanto, em 2008, esta empresa finalizou suas atividades, porcausa de altos
custos operacionais. O que se seguiu, foram as implantações de pequenos cultivos
comerciais espalhados no sul da baía de Sepetiba (Góes & Reis 2011). Atualmente, a
maioria dos cultivos comerciais está localizada na baía da Ilha Grande, no sul do estado
do Rio de Janeiro e pertence a empresas privadas sem qualquer ligação com o governo.
Na legislação brasileira para a liberação do cultivo desta espécie foram criadas
duas instruções normativas pelo IBAMA/MMA. A primeira foi a Instrução Normativa
no165, de 17 de julho de 2007, permitiu a implantação de cultivos comerciais que
tivessem requisição para implantação enviada à Secretaria de Aquicultura e Pesca SEAP, atual Ministério de Pesca e Aquicultura, até 29 de novembro de 2005 e o
empreendedor deveria apresentar após um ano um relatório sobre os riscos ambientais
em suas fazendas.
Através da parceria entre o Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de
Janeiro e a empresa Ondas Biomar Cultivo de Algas Ltda. foi iniciado um estudo que
avaliou o potencial invasor das fazendas de K. alvarezii nas baías de Sepetiba e Ilha
Grande (Reis et al. 2007). Foi constatada a ausência de recrutamento de esporos, a falta
de estrutura reprodutiva em mudas e a ausência de recrutamento ou o estabelecimento
de mudas fora dos sítios de cultivo, que comprovou ausência de risco ambiental
(Castelar et al. 2009). Uma vez que estes estudos foram iniciados em 2006, foi enviado
ao IBAMA, um relatório técnico com base neste estudo e em outros desenvolvidos no
estado de São Paulo, que subsidiaram a elaboração da Instrução Normativa no185, 22 de
12
julho de 2008, que permitiu o cultivo comercial de K. alvarezii na costa sudeste do
Brasil entre a baía de Sepetiba, ao sul do estado do Rio de Janeiro e a Ilhabela, no norte
do estado de São Paulo (Reis, em preparo).
No Brasil, as técnicas de cultivo utilizadas para K. alvarezii são compostas de
balsas flutuantes feitas com tubos de PVC (Tab. 6; Fig. 3), diferindo das técnicas mais
utilizadas no cultivo da espécie em outros países, como os sistemas off-bottom (Hayashi
et al. 2010; Góes & Reis 2011). Este fato se deve principalmente pela maior turbidez da
água e fundo lodoso nos locais de cultivo, que tornou as técnicas usuais de cultivo
utilizadas em países asiaticos impossíveis de serem estabelecidas nestes locais (Reis, em
preparo).
Góes & Reis (2011) proposurem o uso de uma nova técnica de cultivo, a de rede
tubular em balsas flutuantes. Nesta técnica, as balsas flutuantes de PVC são mantidas,
no entanto a tradicional técnica tie-tie é substituída por redes tubulares recheadas com
mudas de K. alvarezii. Nesta técnica não ocorreu diferença na taxa de crescimento
diário das mudas e no rendimento e na qualidade da carragenana, quando comparada
com a técnica tie-tie, entretanto, o tempo de manejo foi reduzido e foi mais fácil e o
custo foi menor. Ressaltaram inclusive que, o maior custo em uma produção é com o
pagamento de pessoal, que com o uso desta técnica é reduzido.
Figura 3. Desenho de balsas flutuantes com (a) a técnica rede tubular e (b) e com a
técnica tie-tie. Fonte: Góes & Reis 2011. Foto com a dimensão do módulo da balsa de
cultivo. Foto: Renata P. Reis.
Marroig & Reis (2011) afirmaram que nos cultivos de K. alvarezii na costa sul
13
fluminense, apesar das balsas flutuantes serem incrustadas por vários organismos, a
incrustação por organismos sem carbonato de cálcio não afetaram a produção. As balsas
incrustadas por animais com conchas podem ser afundadas com a massa destes
organismos. Por este motivo, incentiva-se a necessidade de limpeza constante destas
estruturas de cultivo. Foi constatado que, não foram observadas mudas estabelecidas
nos costões rochosos localizados próximos aos cultivos.
No litoral sul, no estado de Santa Catarina, a viabilidade do cultivo desta alga é
restrita nos meses do inverno, quando a temperatura da água pode dimuir até 16 oC, que
é letal para esta espécie (Hayashi et al. 2010).
1.3.4.2 Colômbia
K. alvarezii foi introduzida na Colômbia, em 1991 (Tab. 6), através de um
programa financiado pela FAO, orientado pelo Prof. Bula Germnán Meyer. Mudas
cubanas, originadas da Venezuela, tiveram um processo de quarentena e aclimatização
em tanques fechados (Raúl Ernesto Rincones, comunicação pessoal).
Atualmente, programas pilotos oriundos do programa original da FAO, vem
sendo financiados pela organização não governamental Fundação Terrazul, em Cabo de
La Vela na península de La Guarija. Trabalham com comunidades nativas americanas,
como os Wayuu, em fazendas experimentais, e utilizam balsas flutuantes com redes
tubulares em tanques, anteriormente utilizados na criação de camarão. No entanto, tais
tentativas de criar uma cultura semifechada para diminuir os riscos de invasões
biológicas foram ineficazes, uma vez que, K. alvarezii foi relatada em 2004, ao longo da
costa de La Guarija devido ao descaso no manejo de descarte de mudas (Rincones 2006;
Hurtado et al. em preparo).
Diversas ocorrências de ice-ice, seguidas da infestação das mudas por epífitas
foram observadas. Contudo, o que parece ser a maior preocupação é a herbívoria, que
causa perdas significativas na maioria dos cultivos (Miguel Sepúlveda e Raúl Ernesto
Rincones, comunicação pessoal, Hurtado et al. em preparo).
1.3.4.3 Equador
Introduzida por Miguel Sepúlveda (consultor de algas marinhas do Brasil), as
mudas oriundas do Brasil foram trazidas para o Equador para fazer parte de uma
empresa chamada Ecualgas SA, que recebeu incentivo do governo local através do
Ministério da Pesca e Aquicultura (MAGAP). O cultivo ainda está restrito em tanques
14
de criação de camarão (camaroeiras), ativos ou desativados, onde a aclimatação de K.
alvarezii e seu processo de quarentena ocorreu com mudas cultivadas no método offbottom (Tab. 6). Nestes tanques, K. alvarezii apresentou o sintoma de ice-ice e
infestação por epífitas, sem solução aparente (Miguel Sepulveda, comunicação pessoal;
Hurtado et al. em preparo).
1.3.4.4 México
Muñoz et al. (2005) propôs o cultivo de K. alvarezii na península de Yucatán
após a obtenção de resultados promissores. Esta tentativa não teve apoio do governo e
foi voltada para um programa de cultivo sustentável de K. alvarezii realizado por
pescadores e comunidades costeiras por meio de cooperativas sociais.
As mudas utilizadas foram originárias do Brasil e foram colocadas em
quarentena, seguindo as regras da Norma Oficial Mexicana (NOM). Não há relatos de
complicações nos cultivos, tanto com herbívoros quanto com a infestação por epífitas.
Tal fato, foi atribuído às características abióticas locais, aliadas à técnica de cultivo offbottom (Tab. 6). A principal causa da perda de colheitas foi observada pelo sintoma de
ice-ice, o qual foi atribuído a alta temperatura da água, acima de 30°C, um problema
que pode ser resolvido por meio da utilização de balsas flutuantes (Daniel Robledo,
comunicação pessoal; Hurtado et al. em preparo).
1.3.4.5 Panamá
Juntamente com o Brasil e os países do Caribe, Santa Lúcia, Saint Martin e
Granadinas, o Panamá é um dos poucos que mantém fazendas comerciais de K.
alvarezii nas américas e exporta sua produção para a Europa e Ásia (Glória Batista Vega
e Raúl Ernesto Rincones, pessoal comunicação; Hurtado et al., em preparo).
Mudas de K.alvarezii da Venezuela foram originalmente introduzidas no Panamá
pelo Smithsonian Tropical Research Institute, sem procedimentos de quarentena para
fins experimentais, na província de Colón, um lugar que hoje detém o único cultivo
comercial no Panamá, e que tem apoio de empresas privadas, como a Seafarms
Bansistemas S.A. e é supervisionado pelo governo local, através da Autoridade de
Recursos Aquáticos do Panamá (ARAP). Além disso, na província de Bocas del Toro,
estudos experimentais estão sendo realizados com balsas flutuantes e tie-tie, sistema
também utilizado na península de Colón (Batista 2006; 2009; Hurtado et al. em
preparo).
15
Nos primeiros anos dos cultivos na península Colón (Tab. 6), as infestações de
epífitas foram uma grande preocupação, por influenciar as taxas de crescimento de K.
alvarezii e causar perdas na colheita (Batista 2009). Atualmente, não existem relatos de
epífitas, no entanto, a ocorrência de ice-ice e de herbívoros é a preocupação dos
algicultores locais (Raúl Ernesto Rincones, comunicação pessoal; Hurtado et al., em
preparo).
1.3.4.6 Santa Lúcia, Saint Martin e Granadinas
Sem o apoio do governo e contando com empresas privadas e organizações não
governamentais, tais como: Ashton Multiusage Cooperative AMCO e Projeto
Sustentável Granadinas, esses países do Caribe são os únicos a manterem cultivos
funcionais de K.alvarezii na região, com mudas oriundas da Venezuela (Tab. 6). Essas
mudas foram introduzidas em 2011, sem procedimento de quarentena (Raúl Ernesto
Rincones e Miguel Sepulveda, comunicação pessoal; Hurtado et al. em preparo).
Através de várias técnicas de cultivo disponíveis, que variaram de acordo com o
sítio de cultivo (i.e. balsas flutuantes e sistema off-bottom, ambos com tie-tie), não
houve relatos de infestações por epífitas. Contudo, complicações ocasionadas por
herbívoros e por ice-ice também foram observadas nestes países, bem como na maioria
dos países das Américas (Raúl Ernesto Rincones, comunicação pessoal; Hurtado et al.
em preparo).
1.3.4.7 Venezuela
K. alvarezii foi legalmente introduzida na Venezuela com mudas das Filipinas,
em 1996, após aclimatação de seis semanas e processo de quarentena. Teve apoio do
governo, através do Instituto Nacional de Pesquisas Agropecuária (INIA) e da Fundação
do Desenvolvimento Rural, Inovação e Capacitação da Venezuela, estudos
experimentais foram realizados com K.alvarezii na península de Araya e Ilha Cubagua
(Rincones & Rubio 1999; Smith & Rincones 2006; Hurtado et al. em preparo).
Esses estudos deram as informações necessárias para o governo permitir o
cultivo de espécies exóticas ao longo da península de Araya (estado Sucre), através da
utilização de balsas flutuantes com redes tubulares ou tie-tie, dependendo do local de
cultivo. Redes tubulares são mais utilizadas em locais com maior movimentação de
água para evitar a perda de mudas (Tab. 6). Até o momento não foram relatadas
complicações causadas pela infestação de epífitas (Hurtado et al. em preparo).
16
Tabela 6. Cultivos de Kappaphycus alvarezii nas Américas e Caribe (adaptada em
colaboração com Hurtado et al. – Kappaphycus Cultivation: Problems and Impacts of
Acadian Marine Plant Extract Powder – em preparo).
País
Cultivo
Técnica de cultivo
Origem da
muda
Processo de
quarentena
/inspeção
Complicações
Brasil
Comercial
Balsa flutuante; rede
tubular.
Japão e
Venezuela
Sim/Sim
Herbívoros.
Colômbia
Experimental
Balsa flutuante; rede
tubular/tie-tie.
Caribe; Cuba
Sim
(mudas
Cubanas)
Herbívoros;
Ice-Ice;
Epífitas.
Equador
Experimental
off-bottom;
camaroeiras.
Brasil
Sim/Sim
Ice-Ice;
Epífitas.
México
Experimental
off-bottom; tie-tie.
Brasil
Sim/Não
Ice-Ice.
Panamá
Experimental;
(Bocas del Toro)
comercial (Colón)
Balsas flutuantes; tietie.
Venezuela
Não
Herbívoros;
Ice-Ice.
Santa Lucia,
San Martin
&
Granadinas.
Comercial
Balsas flutunates;
tie-tie e off-bottom.
Venezuela
Não
Herbívoros;
Ice-Ice.
Venezuela
Experimental
Balsas flutuantes;
redes tubulares; tietie
Filipinas
Sim/Sim
Herbívoros;
Ice-Ice.
1.4. Tecnologias de melhoramento produtivo na algicultura de K. alvarezii
Além das alternativas indicadas ao combate do ice-ice e do goose bump, muitos
esforços têm sido realizados, especialmente por cientistas e empresas de processamento,
para combater os problemas de declínio da produção em cultivo e aumentar o número
de mudas geradas. Um desses esforços foi o desenvolvimento dos sistemas de cultivo
em balsas flutuantes em contraste com o método off-bottom tradicionalmente utilizado
nos países que são os maiores produtores de K.alvarezii (Góes & Reis 2011).
Considerando que o método off-bottom é trabalhado durantes as marés baixas, em locais
mais profundos, onde não existe esta possibilidade, a técnica com linhas flutuantes,
pode ser usada e de maneira constante, não dependendo da maré baixa. No entanto, é
necessário o uso de barcos e canoas, para a manutenção e colheita que encarece a
17
produção. Esta técnica pode ser uma solução para as comunidades costeiras pobres, que
na verdade, constituem a maioria dos produtores (Msuya et al. 2007).
Outros esforços foram focados na utilização de extratos de algas para mitigar a
proliferação de epífitas e aumentar a produtividade da alga. Experimentos utilizaram o
extrato comercial da alga marrom Ascophyllum nodosum (Linnaeus) Le Jolis, o AMPEP
(Acadian Marine Plant Extract), utilizado em horticultura e agricultura, que testaram a
eficiência deste extrato através de sua aplicação em Kappaphycus alvarezii (Hurtado et
al. 2009; Loureiro et al. 2010; Yunque et al. 2011; Borlongan et al. 2011). Estes autores
observaram a eficiência do uso do AMPEP para reduzir a incidência de algumas epífitas
e para aumentar a taxa de crescimento diário de K. alvarezii. Em outro estudo, o uso de
AMPEP em cultura de tecidos de K. alvarezii var. tambalang obtec=veve sucesso na
micropropagação de mudas para plantio (Hurtado et al. 2008).
Em 2005, na Tanzânia, os compradores das algas, em resposta ao baixo retorno
de seus investimentos com perda de K. alvarezii, com sintmas de ice ice, introduziram
K. striatus (F.Schmitz) Doty ex P.C.Silva em colaboração com o governo, devido a
restrições a importação e cautela na introdução de novas espécies. Neste local, esta alga
é conhecida como kikarafuu pela semelhança do seu talo com o cravo, que é chamada
de karafuu em Swahili, a língua local da Tanzânia. As taxas de crescimento de K.
striatus foram menores do que as de K. alvarezii. No entanto, são mais resistentes e não
apresentam os sintomas de ice-ice (Hayashi et al. 2010)
1.5. O uso de Ascophyllum nodosum e perspectivas na maricultura
As macroalgas e as microalgas são utilizadas na agricultura como adubo e
agentes condicionadores de solo (Chapman & Chapman 1980; Guiry & Blunden, 1981;
Metting et al. 1988; 1990; Hong et al. 2007; Craigie, 2010). Os benefícios observados
no crescimento, vigor e rendimento das culturas vegetais foram atribuídos ao
fornecimento por nutrientes, melhora na textura do solo e maior retenção de água.
18
O desenvolvimento de produtos liquefeitos ou em pó de algas, que são vendidos
como extratos, e seus resultados promissores pelo uso de pequenas quantidades do
produto por hectare (<15 L.ha-1) induziram o exame mais detalhado dos componentes
das algas (nutrientes), conhecidos por promover o crescimento de plantas. A alga
marrom Ascophyllum nodosum (Fig.4) destaca-se por ser a espécie com o maior número
de artigos científicos sobre bioensaios de produção agrícola (Craigie 2011).
Figura 4. Detalhe de um banco natural de Ascophyllum nodosum em Halifax, Canadá.
Foto: R.R. Loureiro.
Dominante na zona de entremarés nas costas do Atlântico Norte, onde a
temperatura da água não ultrapassa 270C, na região da Nova Escócia, A. nodosum
produz safra de 71,3 tonelada umida.ano-1. As frondes são penduculares e fixam-se nas
rochas. No apressório basal crescem vários filóides e geralmente a planta regenera
novas frondes da base, quando uma destas é danificada, o que é de interesse para a
indústria desde que a colheita seja cuidadosamente administrada para garantir a
viabilidade deste recurso renovável (Ugarte et al. 2010). As frondes são perenes e
capazes de sobreviver mais de 20 anos e a porção basal pode sobreviver por um século
ou mais (Xu et al. 2008; Guiry & Guiry 2011).
Produtos derivados de A. nodosum têm sido usados na agricultura como agentes
de crescimento, melhorando a capacidade de absorção de nutrientes, através do aumento
de tecido radicular e proteção contra infecções causadas por fungos (Jayaraj et al. 2008;
19
Khan et al. 2008; 2009; Parys et al. 2009; Fan, 2010; Jayaraman et al. 2011). Partindo
do pressuposto desta melhora, estudos foram realizados sobre o efeito do uso do extrato
em pó obtido de A. nodosum, comercializado como AMPEP (Acadian Marine Plant
Extract), no rendimento produtivo de K. alvarezii. Os resultados foram promissores em
cultura de tecidos, no aumento de taxas de crescimento diário e na mitigação na
ocorrência de epífitas (Hurtado et al. 2009; Loureiro et al. 2010; Yunque et al. 2011;
Borlongan et al. 2011).
Em relação aos mecanismos de ação do AMPEP em K. alvarezii, Khan et al.
(2009) citaram a presença de elicitores de citoquinina em outro produto fabricado a
partir de A. nodosum macerado, oriundo do leste do Canadá. Esta descoberta indicou
que estes elicitores podem atuar no crescimento de mudas de K. alvarezii quando
expostas ao AMPEP. De fato, é conhecido que as algas vermelhas apresentam um
sistema de defesa complexo e eficaz contra patógenos e bioincrustantes, sendo capazes
de perceber a presença de epibiontes e agentes patogênicos e os seus efeitos negativos e
que respondem de maneira específica para cada ameaça (Weinberger & Potin 2010).
A maioria destas informações foi obtida através de ensaios realizados com
espécies de Gracilaria Greville e com Chondus crispus Stackhouse, que indicaram a
presença de caminhos moleculares de sinalização em algas vermelhas (Weinberger et al.
1999; 2001; Weinberger 2007). Outra substância presente em Rhodophyta, são os
compostos orgânicos halogenados (Kladi et al. 2004) e seu possível papel nos
mecanismos de defesa. Entretanto, pouco foi investigado sobre tais compostos, que
podem estar relacionados aos processos de sinalização (Weinberger & Potin 2010). Os
compostos orgânicos halogenados voláteis são produzidos por algas vermelhas após um
período de estresses ambientais, como a forte movimentação da água e as variações na
temperatura e na salinidade, e estão relacionados ao estresse oxidativo (Mtolera et al.
1996; Pedersen et al. 1996a; Potin et al. 2002; Gachon et al. 2010). Weinberger et al.
(1999) observaram que a resposta da halogenação, causada por um pulso oxidativo
provocado por uma fonte de estresse externa, pode desencadear a liberação de peróxido
de hidrogênio que causa o aumento na atividade de bromação em Gracilaria spp.. Este
fato pode provocar uma reação que culmina em sintomas semelhantes ao de ice-ice,
como o branqueamento do talo (Pedersen et al. 1996b).
20
2. Objetivo
Examinar o efeito do extrato em pó da alga marrom A.nodosum (AMPEP) em
K.alvarezii, quanto à sua taxa de crescimento diário, ao seu rendimento de carragenana,
no controle de epífitas, em suas propriedades reológicas e na sua resistência à variação
de temperatura e avaliar os processos envolvidos nas respostas obtidas.
3. Hipóteses
1.
Amostras de K. alvarezii previamente expostas ao extrato AMPEP antes de
cultivadas in vitro e in situ apresentarão maior crescimento quando comparadas as
amostras não expostas ao AMPEP;
2.
Amostras de K. alvarezii previamente exposta ao extrato AMPEP in vitro e in situ
apresentarão maior rendimento de carragenana quando comparadas as amostras não
expostas ao AMPEP;
3.
Amostras de K. alvarezii previamente expostas ao extrato AMPEP apresentarão
variações em suas propriedades reológicas (viscosidade e dureza do gel) quando
comparadas as amostras não expostas ao AMPEP;
4.
O uso do AMPEP apresenta efeito de vacina em K. alvarezii que estimula defesas
naturais dos indivíduos expostos e
5.
O uso do AMPEP em amostras de K. alvarezii in vitro promove efeito mitigatório
aos possíveis danos causados por temperatura baixas consideradas como letais para esta
espécie.
4. Capítulos
A tese foi dividida em quatro capítulos, cada um representa uma etapa das
análises sobre o efeito do AMPEP no beneficiamento do cultivo de K. alvarezii e
corresponde a um artigo científico aceito ou submetido. As conclusões de cada artigo
estão reunidas na conclusão geral da tese.
4.1 Capítulo I
Título: Cultivo in vitro de três variantes (verde, vermelha e marrom) de Kappaphycus
alvarezii (Rhodophyta, Areschougiaceace) expostas ao extrato comercial da alga
marrom Ascophyllum nodosum (Fucaceae, Ochrophyta).
Objetivo: Testar a eficiência do extrato de A. nodoum no aumento do crescimento
21
diário e no combate a epífitas em três variantes de Kappaphycus alvarezii em
experimentos in vitro.
4.2 Capítulo II
Título: Efeito “vacina” em Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex. P.C. Silva
promovido pelo extrato em pó da alga marrom Ascophyllum nodosum (Linnaeus) Le
Jolis (AMPEP).
Objetivo: Sugerir os processos envolvidos no beneficiamento do uso do extrato de A.
nodosum em cultivos de K. alvarezii relacionandos ao aumento do crescimento e
combate ao epifitismo .
4.3 Capítulo III
Título: Efeito do extrato comercial da alga marrom Ascophyllum nodosum na produção
de biomassa de Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P.C. Silva e no seu rendimento e
qualidade do gel de carragenana cultivada no Brasil
Objetivo: Verificar o efeito do uso do AMPEP em cultivos de K. alvarezii no mar,
através da taxa de crescimento diário, rendimento e qualidade de carragenana.
4.4 Capítulo IV
Título: Efeito do extrato comercial da alga marrom Ascophyllum nodosum Mont. em
cultivo de Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P.C. Silva submetido a temperaturas
letais.
Objetivo: Analisar a taxa de crescimento diário, o rendimento e a qualidade do gel
obtido em mudas de K.alvarezii in vitro, cultivadas em três temperaturas (16±1; 19±1 e
22±1 oC) quando expostas previamente à uma solução do extrato em pó da alga marrom
A. nodosum.
22
Capítulo I: Cultivo in vitro de três variantes (verde, vermelha e marrom) de
Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Areschougiaceace) expostas ao extrato
comercial da alga marrom Ascophyllum nodosum (Fucaceae, Ochrophyta).
Rafael R. Loureiro; Renata P. Reis e Alan T. Critchley. Artigo publicado em no
Journal of Applied Phycology, 22: 101-104.
23
1- Introdução
O sucesso mundial da indústria de carragenana está baseado em espécies de
Eucheuma J. Agardh e Kappaphycus Doty referenciadas na literatura como
Eucheumatoids (Ask & Azanza 2002). Um dos maiores problemas enfrentados pelos
cultivos comerciais é a doença conhecida como ice-ice, responsável por causar o
branqueamento (Vairappan 2006) e fragmentação do talo (Largo et al. 1997). Vairappan
et al. (2008) comenta que ice-ice foi primeiramente reportada por Trono (1974) nas
Filipinas e Uyenco et al. (2008) relacionadam à condições ambientais não favoráveis
para o cultivo nos sítios onde foram cultivadas. Largo et al. (1995a; 1995b; 1997;
1998) relataram a presença de bactérias dos complexos Vibrio–Aeromonas e
Cytophaga–Flavobacterium nos indivíduos afetados e relacionaram à presença de
bactérias nos indivíduos afetados por ice-ice, previamente submetidos a estresses de alta
irradiância e temperatura, assim como, à baixa salinidade.
Outro problema crítico é o goose bumps causado pela alga filamentosa
Neosiphonia sayateri (Hariot) M.S. Ki et I.K. Lee (Vairappan et al. 2008), antes
identificada como Polysiphonia sp. Mont, em trabalhos pretéritos sobre o mesmo
problema, no qual a epífita se estabelece na camada cortical do hospedeiro e ocasiona
rupturas no talo, propiciando um ambiente ideal para a infecção por bactérias
(Vairappan 2006; Huratado et al. 2006; Vairappan et al. 2008). Ambos ice-ice e goose
bumps são responsáveis por decréscimos significativos na produção e qualidade de
carragenana destas espécies em países como as Filipinas, Indonésia, Malásia, e Tanzânia
(Vairappan et al. 2008).
Estudos recentes mostraram que o epifitismo causado por Neosiphonia (tida
como Polysiphonia) provocou mais de 70% de perda na produção de Kappaphycus nas
Ilhas Calaguas, Filipinas (Hurtado et al. 2006). O método mais utilizado para sanar o
problema foi retirar todas as algas do cultivo atingido e descartar os indivíduos afetados
ou não, que causou a perda do ciclo de produção e de mudas para futuros cultivos
(Hurtado et al. 2005).
Algas marinhas vêm sendo utilizadas como fertilizantes naturais por séculos,
contudo, seu verdadeiro potencial nunca foi totalmente explorado (Guiry & Blunden
1991). Estudos sobe o uso do extrato da alga marrom Ascophyllum nodosum (Linnaeus)
Le Jolis mostraram sua eficácia no aumento da produção (biomassa) e redução de
pragas (fungos) em vegetais superiores, consequentemente melhorando a qualidade final
24
do produto (Blunden et al. 1996; Leach et al. 1999). Tais efeitos positivos em vegetais
superiores motivaram os objetivos desse trabalho que tem como foco a tentativa de
aumentar a taxa de crescimento diário e mitigar a ocorrência de epífitas e doenças em
K.alvarezii, através da utilização do extrato comercial de A. nodosum.
2- Materiais e Métodos
Três variantes da alga Kappaphycus alvarezii (e.g. morfotipos da cor verde,
vermelha e marrom) foram cultivadas in vitro após serem expostas a diferentes
concentrações de um extrato alcalino, preparado com a alga marrom A. nodosum. O
extrato produzido pela Acadian Seaplants Limited (Dartmouth, Nova Scotia, Canada) é
composto por: 3-5% de proteínas/aminoácidos; 1% lipídios; 12-18% acido algínico; 1215% polímeros contendo fucose; 5-6% manitol e 10-15% de outros carboidratos.
As amostras de K. alvarezii utilizadas no experimento, foram obtidas em
cultivos localizados na Praia Grande, Ilha de Itacuruçá, norte da baía de Sepetiba, estado
do Rio de Janeiro, Brasil (22°57′02″S e 43°54′22″W). O voucher do material utilizado
foi incluído no Herbário do Jardim Botânico do Rio de Janeiro (RB 425.507). As
variantes foram previamente limpas de epífitas, com o uso de pinças e toalhas de papel,
com o intuito de não lesionar o talo, e foram aclimatadas durante 30 dias, em aquários
de 5 litros (temperatura da água-22±2°C, irradiância da superfície da água-130±5 μmol
fótons.m−2·s−1, fotoperíodo-12 h, salinidade (PSS)-35±2 e pH-8.1±0.3). Para testar o
efeito do extrato de A.nodosum nas epífitas, porções apicais de K. alvarezii (controle e
testadas) não foram limpas após o período de aclimatação, foram mantidas nas mesmas
condições, e suas epífitas, identificadas através de literatura taxonômica apropriada e
adotanda a nomenclatura descrita no Algaebase (Guiry & Guiry, 2008).
Após o período de aclimatação, porções apicais foram banhadas em diferentes
concentrações do extrato de A.nodosum (e.g., 5, 10, 15, 20, 25 e 30 g.L−1 de água do
mar) pelo período de 1 h (período escolhido para tornar possível a utilização do extrato
em cultivos comerciais). Seis repetições de cada variante de K. alvarezii com 5cm (com
5 g±0.2 cada) foram dispostas em frascos Erlenmeyer com 1 L de água do mar filtrada
em membrana de ester celulose (0,45 μm-Millipore), com aeração constante por duas
semanas nas mesmas condições de aclimatação. No tratamento controle, as porções
apicais não foram expostas ao extrato. O crescimento das porções apicais foi estimado
em taxa crescimento diário (TCD), calculado de acordo com a fórmula
TCD=100×[ln(Mf /Mo)/t], onde Mo é o massa inicial, Mf o massa final e t o tempo de
25
cultivo (Reis et al. 2006).
A normalidade (teste de Shapiro-Wilk) e a homogeneidade (teste de Cochran)
dos dados foram inicialmente testadas. A diferença entre as taxas de crescimento diário
das variantes de K.alvarezii submetidas a diferentes concentrações do extrato de A.
nodosum e seus controles foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney, uma vez que os
dados não apresentaram homogeneidade. A interação entre as variantes de K. alvarezii e
as concentrações do extrato de A. nodosum em relação as suas taxas de crescimento
diário foram testadas utilizando o teste de ANOVA bifatorial e, em seguida, o teste
posterior de Tukey, a fim de distinguir as diferenças significativas entre as médias.
Todas as análises estatísticas foram realizadas no programa Statistica 6.0, da
StatSoft®, em usado o intervalo de confiança de 95% (p<0,05). Os dados foram
expressos em média±desvio padrão.
3- Resultados
Após 14 dias de cultivo em laboratório, as porções apicais de K. alvarezii
banhadas no extrato de A. nodosum apresentaram quase o dobro do valor de suas taxas
de crescimento diário, quando comparadas aos seus controles (controle, Z=2,88,
p<0,001, Fig. 5). Foi bservada uma interação positiva entre as três variantes de K.
alvarezii (ANOVA bifatorial, F=4,50, p<0,001) e as diferentes concentrações do extrato
de A .nodosum (ANOVA bifatorial, F=219.00, p<0.001).
A maior taxa de crescimento de K. alvarezii obtida durante o período de cultivo,
foi observada nas porções apicais banhadas nas concentrações de 15 e 20 g.L-1, seguidas
por 25 g.L-1, 30 g.L-1 e os menores valores do crescimento diário nas concentrações de
10 g.L-1, seguida por 5 g.L-1 (ANOVA bifatorial, F=32,71, p<0,001). As variantes
verdes e marroms obtiveram os maiores resultados em crescimento diário quando
comparadas com a vermelha (Fig. 5). No período de duas semanas Cladophora sp.
Kützing e Ulva sp. Linnaeus não foram encontradas nas porções epifitadas de K.
alvarezii submetidas às concentrações do extrato (e.g., 5, 10, 15, 20, 25, and 30 g.L−1),
contudo, Polysiphonia subtilissima Mont, permaneceu como pequenos tufos ao longo
do talo em todas as concentrações testadas.
26
Figura 5. Taxa de crescimento de três variantes de Kappaphycus alvarezii submetidas à
diferentes concentrações do extrato de Ascophyllum nodosum. Símbolos - quadrado
representa a mediana; retângulo, os quartis, superior e inferior; barras, a projeção dos
non-outliers e círculo, os outliers.
4- Discussão
Robert-Anderson et al. (2006) examinaram o efeito do extrato comercial de
Ecklonia maxima (Osbeck) Papenfuss, Kelpak® na alga vermelha Gracilaria gracilis
(Stackhouse) Steentoft, Irvine et Farnham em cultivos in vitro e em cultivos comerciais
de Ulva lactuca Linnaeus e obtiveram resultados promissores na taxa de crescimento
dos indivíduos submetidos ao extrato (controle - 2,8%.dia-1 e tratadas com Kelpak® 6,1%.dia-1). Diferente desse estudo, os experimentos conduzidos com o extrato de E.
maxima tiveram o acréscimo de PES (Provasoli Enriched Seawater) uma vez que o
Kelpak® apresenta baixa concentração de nutrientes.
O crescimento de 5,9%.dia-1 nas amostras de K. alvarezii submetidas ao extrato,
quando comparadas ao de 2,4%.dia-1 de seus controles, mostra-se promissor para a
utilização dessa tecnologia em cultivos comerciais, uma vez que o maior crescimento
em menor tempo reduz a exposição das algas a agentes que possam ser danosos ao
27
produção final.
As altas taxas de crescimento obtidas pelas amostras banhadas em solução de A.
nodosum podem estar relacionadas à presença de hormônios vegetais (e.g. citocinina)
em K. alvarezii, no qual o extrato age como um indutor de tal fator, aumentando assim a
produção de antioxidantes e promovendo a divisão celular (Salisbury & Ross, 1992).
Provavelmente, esse efeito pode promover a resistência de K. alvarezii contra fatores
abióticos estressantes como temperatura e irradiância e as porções previamente
banhadas ficam menos suscetíveis aos efeitos danosos como o ice-ice.
A eliminação das epífitas Ulva e Cladophora nas concentrações de 15 a 25 g.L-1
de A. nodosum, pode estar relacionada ao limite de tolerância de tais espécies as
concentrações testadas do extrato, uma vez que em concentrações mais baixas (i.e. 5 a
10 g.L-1) os dois gêneros estavam presentes ao final dos 14 dias de cultivo. P.
subtilissima provou ser mais tolerante, por estar presente em concentrações elevadas de
25 e 30 g.L-1. Nessas concentrações, K. alvarezii apresentou menores valores de taxas
de crescimento diário quando comparados com a concentração de 15 g.L-1, contudo,
estes valores foram maiores do que os do controle, ou seja, os não banhados em A.
nodosum.
Esses resultados mostram que o extrato de A. nodosum foi eficiente no aumento
da taxa de crescimento diário de K. alvarezii e, em cultivos comerciais, também pode
ser utilizado na mitigação de epífitas pertencentes à classe Ulvophyceae.
5- Referências bibliográficas
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30
Capítulo II: O efeito de “vacina” em Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex. P.C.
Silva promovido pelo extrato em pó da alga marrom Ascophyllum nodosum
(Linnaeus) Le Jolis (AMPEP).
Rafael R. Loureiro; Renata P. Reis; Flávia D. Berrogain e Alan T. Critchley.
Artigo publicado em 2012, no Journal of Applied Phycology 24: 427-432.
31
1 - Introdução
A indústria mundial de carragenana tem como base o cultivo de Eucheuma J.
Agardh (para iota carragenana) e Kappaphycus Doty (para Kappa carragenana) sendo
estas as principais fontes de renda e emprego para muitas familías em países em
desenvolvimento como a Indonésia, Filipinas, Malásia e Tanzania (Pickering 2006;
Bixler & Porse 2001). Doenças como o ice-ice, que provoca o branqueamento do talo de
Kappaphucys, e o goose bumps causado pelo epifitismo da alga vermelha Neosiphonia
apiculata (Hollenberg) Masuda & Kogame, são responsáveis pela perda de mais de
70% da produção em cultivos comerciais de Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P.C.
Silva (Largo et al. 1995a; 1995b; 1997; 1998; Vairappan 2006; Vairappan et al. 2008). A
maneira mais efetiva encontrada para contornar tais complicações é a retirada do cultivo
e a não utilização de mudas oriundas de áreas de cultivo infectadas. Contudo, tal prática
vem afeta drasticamente a cadeia de fornecimento de novas mudas para cultivo
(Hurtado et al. 2006).
Embora, ocorreram progressos na tentativa de compreender e gerenciar tais
problemas (Goecke et al. 2010; Solid et al. 2010; Vairappan et al. 2010), não existe
solução viável para evitar a perda de cultivos inteiros.
Extratos de algas marinhas têm sido usados na agricultura como agentes de
crescimento, melhorando a capacidade de absorção de nutrientes através do aumento de
tecido radicular e de proteção contra infecções causadas por fungos (Jayaraj et al. 2008;
Khan et al., 2008; 2009; Fan 2010). Umas das macroalgas mais utilizadas em aplicações
agrícolas é a alga marrom Ascophyllum nodosum (Linnaeus) Le Jolis (Parys et al. 2009;
Craigie 2011; Jayaraman et al. 2011).
Estudos recentes que utilizaram o Acadian Marine Plant Extract (AMPEP),
extrato comercial em pó da alga A. nodosum em Kappaphycus alvarezii, apresentaram
resultados promissores na melhoria de mudas em cultura de tecidos, no aumento de
taxas de crescimento diário e na mitigação na ocorrência de epifitas (Hurtado et al.
2009; Loureiro et al. 2010; Yunque et al. 2011; Borlongan et al. 2011). No entanto, os
mecanismos de ação do AMPEP em K. alvarezii ainda não foram discutidos ou testados.
Experimentos conduzidos por Khan et al. (2009) citaram a presença de elicitores
de citoquinina em outro produto fabricado a partir de Ascophyllum nodosum macerado,
oriundo do leste do Canadá. Esta evidência indica o que pode ocorrer quando amostras
de K. alvarezii forem expostas ao AMPEP, especialmente no tocante ao aumento das
32
taxas de crescimento diário.
É conhecido que algas vermelhas apresentam um complexo e eficaz sistema de
defesa contra patógenos e bioincrustações e são capazes de perceber a presença de
epibiontes e agentes patogênicos e os seus efeitos negativos e, consequentemente,
respondem de maneira específica a cada ameaça (Weinberger & Potin 2010).
A maioria destas informações foi obtida através de ensaios realizados com
espécies do gênero Gracilaria Greville e de Chondus crispus Stackhouse, que indicaram
a presença de caminhos moleculares de sinalização em algas vermelhas (Weinberger et
al. 1999; 2001; Weinberger 2007). Outro aspecto presente em Rhodophyta são os
compostos orgânicos halogenados (Kladi et al. 2004) e seu possível papel nos
mecanismos de defesa, embora pouco tenha sido investigado sobre tais compostos, que
podem estar relacionados aos processos de sinalização (Weinberger & Potin, 2010). Os
compostos orgânicos halogenados voláteis, até onde se sabe, são produzidos por algas
vermelhas após um período de estresse (e.g. fatores ambientais, como a movimentação
abrupta e violenta de água e variações em temperatura e salinidade) e estão ligados
diretamente ao estresse oxidativo (Mtolera et al. 1996; Pedersen et al. 1996a; Potin et
al. 2002; Gachon et al. 2010). Weinberger et al. (1999) observaram que a resposta da
halogenação, causada por um pulso oxidativo provocado por uma fonte de estresse
externa, pode desencadear a liberação de peróxido de hidrogênio que causa aumento na
atividade de bromação em Gracilaria spp. Tal fato pode provocar uma reação que
culmina em sintomas semelhantes ao de ice-ice, como o branqueamento do talo
(Pedersen et al. 1996b).
O presente estudo examina as relações entre os mecanismos de defesa presentes
em algas vermelhas e as respostas obtidas em K. alvarezii através da utilização do
AMPEP.
2 -Materiais e Métodos
Condições laboratoriais e aclimatação
Amostras de K. alvarezii foram obidas em um cultivo comercial localizado na
Praia Grande, Ilha Itacuruça, ao norte da baía de Sepetiba, Rio de Janeiro, Brasil
(22°57′02″S e 43°54′22″W). O voucher do material utilizado foi incluído no Herbário
do Jardim Botânico do Rio de Janeiro (RB 425.507). As amostras foram previamente
limpas de epífitas com o uso de pinças e toalhas de papel, com o intuito de não lesionar
o talo, e aclimatadas durante 30 dias em aquários com 5 litros de ágia do mar e foi
33
utilizado as mesmas condições sugeridas por Loureiro et al. (2010), tais como:
temperatura da água - 22±2°C, irradiância da superfície da água - 130±5 μmol photons
m−2·s−1, fotoperíodo – 12:12h, salinidade (PSS) - 35±2 e pH-8.1±0.3. Todas as variantes
de cor foram tratadas de maneira única, sendo que porções apicais de cada variante
foram coletadas em proporções iguais a fim de que todas as variantes fossem
representadas em cada frasco de cultivo.
Desenho experiemental
Após o período de aclimatação, durante 1h, amostras de 5g de K. alvarezii (n=6),
obtidas a partir de porções apicais de 5cm, foram banhadas em solução de AMPEP (20
g.L-1 em água do mar filtrada) sugerida por Loureiro et al. (2010) como a concentração
ideal para aumentar o crescimento de K. alvarezii, ou submetidas ao tratamento de
indução de pulso oxidativo, através de agitação mecânica por haste de metal por 3
minutos, ou por uma combinação de ambos (amostras induzidas a produzir pulso
oxidativos e banhadas em AMPEP).
Para testar o efeito do AMPEP nas epifitas de K. alvarezii, a alga Polysiphonia
subtilissima Mont. foi escolhida devido a sua semelhança morfológica com Neosiphonia
spp. M.-S. Kim & I.K, Lee. De acordo com Guiry & Guiry (2011), ambas as espécies
têm organização de talo semelhante (e.g., talo formado por regiões medulares e
corticais) e são membros da familia Rhodomelaceae. As amostras foram limpas com
ajuda de um microscópio estereoscópico e aclimatadas por 30 dias, sob as mesmas
condições de K. alvarezii.
Após as amostras de K. alvarezii terem sido banhadas em AMPEP e submetidas
aos outros tratamentos, cada P. subtilissima (um indivíduo com apressório, com 2±0,2 g
coletada no Canal do Jardim de Alah, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) foi amarrada com uma
linha nas porções apicas de K. alvarezii. Para induzir K. alvarezii a produzir pulso
oxidativo como uma resposta de defesa, as amostras de porções apicais foram
submetidas ao procedimento descrito por Mtolera et al. (1996) em Eucheuma
denticulatum (NL Burman) FS Collins & Hervey de indução de estresse para produzir
compostos orgânicos halogenados voláteis.
Os tratamentos foram: KC= K. alvarezii; KA= K. alvarezii banhado em solução
de AMPEP; KO= K. alvarezii submetido à indução de pulso oxidativo; KAO= K.
alvarezii banhado em solução de AMPEP previamente submetido à indução de pulso
oxidativo; KE= K. alvarezii com epífita amarrada; KAE= epífita amarrada em K.
34
alvarezii previamente banhada em solução de AMPEP; KOE= epífita amarrada em K.
alvarezii previamente submetida à indução de pulso oxidativo; KAOE= epífita amarrada
em K. alvarezii previamente submetida à indução de pulso oxidativo e banhada em
solução de AMPEP. Cada tratamento foi realizado em Erlenmeyer com 1L de água do
mar filtrada e mantido por duas semanas, nas mesmas condições em que as amostras
haviam sido aclimatadas.
Crescimento de K. alvarezii e redimento de carragenana
O crescimento das amostras foi estimado em taxa de crescimento diário (TCD) e
calculado de acordo com a fórmula: TCD=100×[ln(Mf /Mo)/t], onde Mo é a massa
inicial, Mf a massa final e t o tempo de cultivo (Góes & Reis 2011). Foi utilizado o
método para obtenção de carragenana semirefinada. Neste método, as amostras de K.
alvarezii são secas em estufa (60 ºC) por 48 horas e pesadas. Após duas horas em
solução de hidróxido de potássio em banho maria (80 °C), as amostras foram lavadas
em água corrente e colocadas em solução de hipoclorito de sódio, em temperatura
ambiente, durante 25 minutos e, posteriormente, lavadas em água corrente por
aproximadamente 5 minutos a fim de retirar resíduos.
Ao fim deste procedimento, as algas foram secas em estufa (60 oC), pesadas e
determinado o percentual de rendimento da carragenana semi-refinada (RC), através da
razão entre a massa seca da alga tratada e sua massa seca inicial. O pH de 8,4 foi
mantido durante o procedimento (Góes & Reis 2011). O rendimento da carragenana
(RC) das amostras de K. alvarezii foi expresso como o percentual de carragenana por
amostra de alga seca (Reis et al. 2008; Góes & Reis 2011) obtido pela formula: RC=
(Mc/Ma)× 100, onde Mc é o massa seca final da carragenana seca (seca em estufa a 60ºC
até obtenção de massa constante) e Ma o massa da alga seca (seca em estufa a 60ºC até
obtenção de massa constante).
Análise estatística dos dados
A normalidade dos dados (teste de Shapiro-Wilks) e a homogeneidade das
variâncias (teste de Cochran) foram previamente testadas para o uso de testes de análise
de variância paramétricos ou não paramétricos. A diferença da taxa de crescimento
diário de K. alvarezii submetida aos diferentes tratamentos foi testada pela análise
variância unifatorial (ANOVA) e para distinguir as médias significativamente diferentes
foi usado o teste posterior LSD Fisher. A diferença do rendimento de carragenana de K.
35
alvarezii sob diferentes tratamentos foi analisada pela Krushal-Wallis ANOVA.
As análises estatísticsa dos dados foram realizadas no programa Statistica 6.0 da
Statsoft em um intervalo de confiança de 95% (p<0,05). Os dados foram expressos em
média±desvio padrão e foram usadas seis repetições para cada tratamento (n=6).
3- Resultados
Depois de duas semanas de experimento, diferenças significativas foram
observadas na taxa de crescimento diário de K. alvarezii (p<0,001, Tab.7) e o
rendimento carragenana (p<0,001, Tab.7) em cada tratamento. A maior taxa de
crescimento diário foi obtida em amostras expostas ao AMPEP (KA e KAE, exceto
KAOE).
A taxa de crescimento diário das amostras que foram tratadas com AMPEP e
também sofreram indução de pulso oxidativo (KAO) não diferiram entre as que não
foram submetidos ao AMPEP (KE, p=0,641 e KO, p=0,753). Quando os tratamentos
não foram estimulados a produzir um pulso oxidativo (KE) ou, na ausência de
Polissiphonia subtilissima (KC) e quando expostos ao AMPEP (KA) houve diferença
significativa entre as taxas de crescimento diário das amostras de K. alvarezii
(KA>KC>KE). No entanto, quando elas foram estimuladas a produzir o pulso oxidativo
(KO e KAO), não diferiram entre si.
Os maiores valores de rendimento carragenana de K. alvarezii foram observados
em amostras que foram estimuladas a produzir pulso oxidativo, na presença de epífitas
ou em sua ausência (KO, KAO, KAE, KOE; KAEO; Tab.7).
O rendimento de carragenana foi afetado pela presença de epífitas. Em amostras
expostas à epífitas e estimuladas a produzir pulso oxidativo (KOE <KAOE), os valores
foram maiores do que as que não estavam na presença de P. subtilissima
(KC<KA<KO=KAO).
O branqueamento do talo das epífitas foi observado em amostras que foram
estimuladas a produzir pulso oxidativo (KOE, KAOE) e P. subtilissima morreu após 14
dias. Amostras de K. alvarezii banhadas em AMPEP e estimuladas a produzir pulso
oxidativo (KAO) não apresentaram branqueamento do talo no período de cultivo. No
entanto, as amostras as quais as epífitas foram fixadas e não foram estimuladas a
produzir pulso oxidativo (KAE) tiveram seus ramos apicais jovens esbranquiçados e
morreram após duas semanas.
36
Tabela 7. Média±desvio padrão da taxa de crescimento diário e do rendimento de
carragenana de Kappaphycus alvarezii cultivado em diferentes tratamentos após 14 dias
in vitro. Tratamentos são representados por (KC) = K. alvarezii; (KA) = K. alvarezii
banhado em solução de AMPEP; (KO) = K. alvarezii submetido a induzir pulso
oxidativo; (KAO) = K. alvarezii banhado em solução de AMPEP previamente induzido
a produzir pulso oxidativo; (KE) = Epífita amarrada em K. alvarezii; (KAE) = Epífita
amarrada em K. alvarezii previamente banhada em solução de AMPEP; (KOE) = Epífita
amarrada em K. alvarezii induzido ao pulso oxidativo (KAOE) = Epífita amarrada em
K. alvarezii banhada em solução de AMPEP previamente induzido ao pulso oxidativo.
As letras indicam a aparência de K. alvarezii; K. alvarezii (A) = amostras saudáveis sem
branqueamento; (B) = amostras sem cor característica, porém sem branqueamento e (C)
= amostras com branqueamento. Asteriscos indicam a aparência de Polysiphonia
subtilissima (*) = amostras saudáveis; (**) = amostras com as porções apicais (não
corticadas) branqueadas e (***) = amostras totalmente branqueadas.
Treatmento
Taxa de
Rendimento de
K. alvarezii
P. subtilissima
Crescimento Diário
carragenana
após 14 dias
após 14 dias
-1
(% dia )
(% PS)
KC
3,0±0,43
28,1±2,05
A
-
KA
5,6±0,23
33,3±1,10
A
-
KO
2,2±0,71
39,4±1,59
C
-
KAO
2,0±0,26
38,0±1,50
B
-
KE
2,3±0,22
30,6±1,69
B
*
KAE
4,7±0,34
37,0±1,70
A
**
KOE
1,6±0,45
42,1±3,51
C
***
KAOE
1,9±0,41
46,6±2,30
C
***
4- Discussão
A eficiência do uso de AMPEP em K. alvarezii no aumento da taxa de
crescimento diário e na prevenção contra o estabelecimento de epífitas foi demonstrado
por Hurtado et al. (2009), Loureiro et al. (2010), Yunque at al. (2010) e Borlongan et al.
(2011). Resultados semelhantes foram obtidos em todos os tratamentos no qual o
AMPEP foi utilizado neste trabalho (KA e KAE) quando estas foram comparadas com
as amostras induzidas a produzir pulso oxidativo (KAO e KAOE). No entanto, os
37
mecanismos responsáveis por estas respostas não foi totalmente investigado. É evidente
em bioensaios que o AMPEP apresentou respostas positivas quando utlizado em
K.alvarezii, mas não está claro como ou por quê. Os resultados apresentados neste
trabalho abrem uma discussão sobre alguns dos possíveis mecanismos e também amplia
a nossa compreensão sobre as interações funcionais de um extrato de alga marrom com
o crescimento de algas vermelhas e sua resistência a epífitas.
Com base nos resultados da melhoria na taxa de crescimento de K. alvarezii
banhada na solução de AMPEP (KA) e dos valores de rendimento de carragenana em
amostras induzidas a produzir pulso oxidativo (KAO, KAO, KOE, e KAOE), sugerimos
que o AMPEP pode ter um efeito de vacina em K. alvarezii. Isto é um tanto semelhante
a uma função já atribuída ao extrato conhecido como Vacciplant® da alga marrom
Laminaria Lamouroux e seus efeitos sobre vegetais superiores (Gachon et al. 2010).
A maioria dos resultados obtidos com o Vacciplant® é baseada sobre os efeitos
do β-1, 3 glucanos e sua indução à liberação de H2O2 em plantas de tabaco (Klarzynski
et al. 2000). Jayaraman et al. (2011) também destaca a capacidade do extrato de elicitar
enzimas de defesa, incluindo β-1, 3 glucanase conhecida por estar presente em algas
vermelhas com propriedades antifúngicas (Cordeiro et al. 2006). Isto, combinado as
atividades elicitoras de hormônios do extrato (principalmente citocinina) discutidas por
Reitz & Trumble (1996) e Khan et al. (2009) e a presença de betaínas demonstrada por
Mackinnon et al. (2009) e Blunden et al. (2009) em extratos de Ascophyllum, assim
como a influência do aumento no teor de clorofila discutido por Whapham et al. (1993),
o extrato de A. nodosum pode funcionar como um indutor de estresse que culmina na
produção de compostos halogenados voláteis que, como descritos por Mtolera et al.
(1996), atuam no processo de defesa da alga.
Estes compostos seriam parte do caminho que induz o pulso oxidativo e a
produção de peróxido de hidrogênio que acarreta o branqueamento do talo das epífitas,
como observado por Pedersen et al. (1996a; 1996b) e por Weinberger et al. (1999) em
Gracilaria conferta (Schousboe ex Montagne) Montagne. Também, pode explicar o não
estabelecimento ou sobrevivência dos propágulos das epífitas, como descrito por
Borlongan et al. (2010). Este processo, também explica o efeito do branqueamento
causado pelo pulso oxidativo nas amostras K. alvarezii induzidas a produzi-lo e o efeito
do branqueamento de P. subtilissima, bem como a baixa taxa de crescimento diário e
alto valor do rendimento de carragenana destas amostras de K. alvarezii quando
comparadas com as amostras não induzidas a produzir o pulso oxidativo.
38
A cor do talo de K. alvarezii das amostras expostas à solução de AMPEP (KAO e
KAEO) que não sofreu o efeito de branqueanto pode ser explicado pela presença de
betaínas e seus efeitos sobre K. alvarezii. As betaínas são conhecidas por aumentar o
conteúdo de clorofila, que por sua vez, aumentam a taxa fotossintética (Whapham et al.
1993). Estas, também, podem ser responsáveis por bloquear o efeito de branqueamento
produzido pelo estresse causado pela liberação de peróxido de hidrogênio, portanto, não
interferindo nas taxas de crescimento de K. alvarezii, como observado nos tratamentos.
O aumento das taxas de crescimento de K. alvarezii em amostras expostas a
solução de AMPEP (KA e KAE) em relação aos outros que não foram expostos a este
extrato (KC, KO, KE, e KOE) tornam-se mais claras quando considerarmos os efeitos
da presença de betaínas, como descrito por Mackinnon et al. (2010) e da elicitação da
atividade da citocinina promovida pela presença do extrato (Reitz & Trumble 1996;
Khan et al. 2009). A citocinina é conhecida por promover a divisão celular (Salisbury &
Ross 1992). Yokoya et al. (2010) discutiram a presença de citocininas em Rhodophyta
e afirmaram que a complexidade dos perfis hormonais encontrados em macroalgas
desempenham um papel fundamental na regulação dos processos fisiológicos das algas
vermelhas.
A administração do extrato em amostras induzidas ao pulso oxidativo reduziu os
efeitos do estresse oxidativo (produção de peróxido de hidrogênio), que pode ser
extremamente agressiva para um indivíduo e sua epífita. O branqueamento das porções
jovens do talo de P. subtilissima que foram cultivadas simulando epífitas em K.alvarezii
banhado em solução de AMPEP (KAE) confirmou que a reação foi evidente, na qual o
AMPEP protegeu K. alvarezii dos efeitos do peróxido de hidrogênio. A eficácia do
extrato também pode ser confirmada nos talos de K. alvarezii que foram protegidos do
clareamento (KAO) quando comparadas com as amostras que não foram banhadas em
solução de AMPEP (KO). Com as evidências apresentadas neste trabalho, uma hipótese
pode ser construída para começar a entender os caminhos complexos envolvidos nesta
nova abordagem do uso de um extrato de uma alga marrom como uma potencial vacina
em K. alvarezii, que provoca a ativação de suas defesas naturais contra patógenos e
ameniza os efeitos negativos da exposição em longo prazo ao pulso oxidativo (i.e. a
exposição ao peróxido de hidrogênio que culmina no branqueamento do talo).
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44
Capítulo III: Efeito do extrato comercial da alga marrom Ascophyllum nodosum
na produção de biomassa de Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex PC Silva e no
seu rendimento e a qualidade do gel de carragenana cultivada no Brasil
Rafael R. Loureiro; Renata P. Reis; Flávia D. Berrogain e Alan T. Critchley.
Artigo submetido ao Journal of Applied Phycology.
45
1. Introdução
Eucheumatoides é um termo que inclui espécies do género Kappaphycus Doty e
Ecuheuma J.Agardh, que são valiosos produtos cultivados para a indústria de
hidrocolóides e, juntos, contribuem com 88% da produção mundial de carragenana.
Entre as eucheumatoides, Kappaphyccus alvarezii Doty ex (Doty) P.C. Silva é a
principal fonte de matéria-prima para a indústria sendo cultivada em mais de 20 países
(Bindu e Levine 2011).
Apesar de seu sucesso, o cultivo de K. alvarezii vem sofrendo uma série de
complicações agronômicas que são comumente encontradas em cultivos na terra (i.e.
infestações de pragas e doenças), o que gerou uma grande preocupação para o cultivo de
algas marinhas mundial, principalmente relacionada a indústria de carragenana. O
epifitismo, causado principalmente por um pequeno número de macroalgas filamentosas
vermelhas e outras espécies: Neosiphonia savatieri (Hariot) M.S.Kim & I.K.Lee; N.
apiculata (Hollenberg) Masuda & Kogame, Ceramium sp. Roth, Acanthophora sp. J.V.
Lamouroux, Ulva sp. Lineu e Centroceras sp. Kützing afeta a produção de biomassa,
uma vez que compromete a porção cortical, abrindo feridas nos talos, permitindo
infecções bacterianas que causam necrose do talo (Vairappan 2006; Vairappan et al.
2008).
Problemas adicionais, que começam com por trocas nosfatores ambientais,
resultando em uma condição chamada ice-ice, sintoma que resulta no clareamento do
talo, culminando na menor produção de biomassa e de carragenana. Mendonza et al.
(2002) observaram uma depolimerização da carragenana nas porções apicais do talo que
diminuiu a qualidade da carragenana produzida por mudas afetadas (diminuindo a
viscosidade e a resistência do gel).
Surtos de ice-ice têm sido mais dominantes nas Filipinas e Indonésia, com relatos
recentes no leste da África, mas as perdas nas colheitas parece ser um fenômeno
causado pelo epifitismo e, depois de estabelecido, mais difícil de ser mitigado. A
remoção completa dos cultivares e a destruição das mudas são as alternativas
atualmente usadas para resolver rapidamente esses problemas (Mendonza et al. 2002;
Hurtado et al. 2006; Vairappan et al. 2006). Ao considerar o cultivo de K. alvarezii
como uma "cultura global", por serem usadas mudas de origem genética semelhante nos
cultivos espalhados pelo mundo, todos os cultivos estão suscetiveis a tais surtos.
46
Esforços têm sido realizados na tentativa de solucionar este problema com o uso do
extrato comercial da macroalga marrom Ascophyllum nodosum (Linnaeus) Le Jolis,
chamado AMPEP, nas mudas cultivadas de K. alvarezii. O AMPEP aumentou a taxa de
crescimento diário e o rendimento de carragenana de K. alvarezii bem como atenuou os
efeitos prejudiciais de epífitas (Hurtado et al. 2009; Loureiro et al. 2010; Yunque et al.
2011; Borlongan et al. 2012). O uso de AMPEP em K. alvarezii tem se mostrado
promissor e foi proposto por Loureiro et al. (2012), o "efeito de vacina", para explicar
as vias bioquímicas envolvidas nas respostas positivas observadas da ação do extrato
nas mudas de K. alvarezii. No entanto, nenhum dos estudos analisou o efeito da AMPEP
sobre a qualidade (propriedades reológicas, tais como a força e viscosidade do gel) da
carragenana extraída K. alvarezii.
Este estudo avaliou o efeito do AMPEP na taxa de crescimento diário, no
rendimento da carragenana, na força e na viscosidade do gel de amostras de K. alvarezii
tratadas com AMPEP.
2. Materiais e Métodos
Área de estudo e desenho experimental
O domínio amostral foi composto por três cultivos comerciais produtivos na baía
de Sepetiba, litoral sul do estado do Rio de Janeiro, Brasil: Prainha (22°57'17''S 43°54'31''W), Jardim (22°56'25''S - 43° 55'08'’W) e Praia Leste (22°56'01''S 43°52'20''W) de modo a incluir diferentes sítios submetidos a diferentes condições
ambientais. A baía tem um clima tropical (verões chuvosos e invernos secos) com alta
irradiação no verão que diminui no inverno (Góes & Reis 2011).
Neste experimento foram usadas as balsas flutuantes de cultivos comerciais, que
usavam a técnica de rede tubular por ser a principal técnica de cultivo usada em cultivos
brasileiros (Góes & Reis 2011). Cada balsa era composta por 10 a 15 módulos (3x5m) e
cada módulo feito com dois tubos de PVC (as extremidades fechadas) ligados uns aos
outros por cordas de polipropileno com 6 milímetros de diâmetro.
Para a montagem do experimento, oito balsas foram selecionadas aleatoriamente
em cada local de cultivo, que continham de 15 a 20 balsas flutuantes. Quatro receberam
o tratamento AMPEP e as outras atuaram como o tratamento controle. De cada balsa
comercial (compostas com 10 a 15 módulos), um módulo foi escolhido aleatoriamente.
Quatro redes tubulares foram colocadas em cada módulo, duas para serem removidas
em 20 dias e as outras duas em 40 dias. Em cada rede tubular foram colocadas oito
47
mudas.
O tratamento com AMPEP consistiu em banhar amostras de K. alvarezii
(indivíduos com 100±10g cada) em uma solução de 20 g.L-1 do extrato AMPEP com
água do mar durante 1h, adaptando o protocolo utilizado por Loureiro et al. (2010). Para
assegurar a cobertura total do talo, as amostras foram colocadas em recipientes plásticos
com capacidade de 60 L com a solução.
O período de 40 dias foi escolhido uma vez que é semelhante ao do ciclo de
produção de 45 dias usado no Brasil (Góes & Reis 2011; 2012).
Taxa de crescimento diário de K. alvarezii
No final de cada período de cultivo, o crescimento das amostras foi estimado
como taxa de crescimento diário (TCD) e calculada de acordo com a fórmula: TCD =
100 x [ln (Mt/Mo)/t] onde Mt foi a massa final , Mo a massa inicial e t o tempo de cultivo
(Góes & Reis 2011, 2012).
Rendimento da carragenana semirefinada de K. alvarezii
Doze amostras, de cada tratamento, foram levadas para o laboratório para a
obtenção da carragenana semirefinada de K. alvarezii através do processo de
transformação alcalina com solução de hidróxido de potássio 6% em banho-maria
(80°C) durante 2 h com lavagem sucessiva com água fresca. As amostras foram então
mantidas em solução de cloreto de sódio 0,06%, durante 30 min (25°C) e lavadas com
água doce para remoção dos resíduos. As amostras foram secas a 60°C em estufa até
obtenção de massa constante e o pH 8,4 foi mantido durante o procedimento (Loureiro
et al. 2010; Góes & Reis 2011; 2012).
O rendimento de carragenana de K. alvarezii (RC) foi expresso como a
percentagem de carragenana em relação à massa seca das algas (Reis et al. 2008; Góes
& Reis 2011; 2012), derivado da fórmula: RC (Mc/Ms)x100, onde Mc é a massa seca da
carragenana e Ms é a massa seca da alga (secas em estufa a 60°C até massa constante).
Reologia de K. alvarezii
Para preparar o gel da carragenana semirefinada, cada amostra foi macerada em
moinho de bola (Mixer Mill MM 400, Retsch) e misturada em uma solução de água
destilada na proporção de 1,5% de carragenana semirefinada (1,5 g de carragenana
semirefinada e 98,5 mL de água destilada). A solução foi mantida durante 1 h em
48
temperatura ambiente (25°C), depois aquecida (80ºC) durante 10 minutos em agitação
constante e posteriormente resfriada (7±2°C) durante 24 h.
A viscosidade do gel foi analisada em reômetro de cone DV-III Ultra (Brookfield
Engineering Labs, Inc.) em 75ºC com sonda CP-40. A força de gel das amostras foi
medida com um texturometro, TexturePro CT (Brookfield Engineering Labs, Inc.) com
uma sonda cilíndrica de 2,5cm de largura e 5cm de altura. As medições reológicas
foram realizadas após 40 dias, o que reflete um ciclo de cultivo completo, o que permite
a investigação de qualquer efeito do AMPEP sobre K. alvarezii relacionados à qualquer
possível transformação molecular da carragenana.
Análise estatística dos dados
A normalidade (Teste de Shapiro-Wilks) e a homogeneidade da variância (teste
de Levene) foram testadas para o uso de análises paramétricas ou não paramétricas dos
dados. As diferenças entre as amostras do controle e do AMPEP em cada período de
cultivo (taxa de crescimento diário e rendimento da carragenana em 20 dias e
viscosidade e força do gel) foram testadas utilizando o teste de Mann-Whitney, uma vez
que, mesmo após a transformação, os dados não satisfizeram os critérios para testes
paramétricos. A taxa de crescimento diário e rendimento de carragenana em 40 dias
foram analisados por meio de teste de Student. As análises foram realizadas utilizando o
programa Statistica 6.0, da StatSoft, no nível de confiança de 95% (p <0,05). Os dados
foram expressos em valores (mínimo) média±desvio padrão (máximo) com 12
repetições (n = 12) para cada tratamento.
3. Resultados
Após 20 dias de cultivo, não houve diferenças significativas entre os tratamentos
(p=0,43, Tab.8) das taxas de crescimento diário, entretanto, o rendimento de
carragenana foi maior nas amostras tratadas com AMPEP (p<0,001, Tab.8). Em 40 dias,
tanto a taxa de crescimento diário quanto o rendimento de carragenana das amostras
tratadas com AMPEP foram maiores quando comparadas com seus controles (p<0,001,
Tab.8).
A resistência do gel da carragenana semirefinada de K. alvarezii tratada com
AMPEP foi menor do que as amostras controle (p=0,03, Tab. 8), semelhante a
viscosidade do gel (p<0,001, Tab.8) que também foi menor nas amostras que receberam
o tratamento AMPEP.
49
Tabela 8 Resultados de taxa de crescimento diario (TCD), redimento de carragenana
(RC), força do gel (FG) e viscosidade do gel (VG) de amostras de K. alvarezii (n=12)
submetidas a dois tratamentos (controle e AMPEP) em dois periodos de cultivo (20 e 40
dias).
Variavel
Tempo
20
TCD
(%.dia-1)
40
RC
Treatmento
(mín)media±desvio padrão(max)
Controle
(3,6) 5,9±2,1 (8,9)
AMPEP
(4,1) 6,2±1,0 (7,5)
Controle
(1,9) 5,6±1,8 (7,9)
AMPEP
(4,7) 7,3±1,7 (10,2)
Controle
(17,5)31,6±6,2(46,6)
20
AMPEP
(17,0)38,0±6,7(48,3)
40
Controle
(22,1)35,1±8,9(50,3)
AMPEP
(34,2)42,0±5,9(53,8)
Controle
(255,3)479,2±150,58(750,1)
AMPEP
(205,8)369,0±133,6(533,5)
Control
(610,3)923,7±211,34(1228,9)
AMPEP
(270,3)527,2±133,6(879,7)
Teste
p
Resultado
Z= -0,79
0,43
C = AMPEP
Z= -0,44
0,01
C < AMPEP
Z= -3,64
0,55
C = AMPEP
Z= -2,40
0,02
C < AMPEP
Z= 1,45
0,03
C > AMPEP
t= -563,21
<0,001
C > AMPEP
(%)
FG
(g.cm-2)
VG
40
40
(cP)
4- Discussão
As taxas de crescimento diário de K. alvarezii cultivadas no mar, em condições
de produção comercial, durante 20 e 40 dias, foram, em gera, maiores do que o que é
esperado para a baía de Sepetiba. Na porção sul da baía de Sepetiba, Góes & Reis
(2011; 2012) relataram taxas médias de crescimento de K. alvarezii de 3,3 a 3,8 %. dia-1.
Os resultados obtidos neste estudo estão dentro da faixa obtida para mudas de K.
alvarezii cultivadas em balsas flutuantes no Brasil e em outros países, variando entre 0,8
a 7,2% dia-1 (Muñoz et al. 2004; Hayashi et al. 2007a; 2007b; Hung et al. 2009).
Os resultados das taxas de crescimento diário de K. alvarezii obtidos neste
estudo e as in vitro (5,5 %.dia-1 amostra AMPEP dia-1 e 2,5 % dia-1 amostra controle)
por Loureiro et al. (2010), que usaram o mesmo protocolo para tratar as amostras com
solução de AMPEP podem ser consideradas promissoras quando comparadas com os
resultados obtidos por by Borlongan et al. (2011). Eles examinaram a eficiência do
AMPEP em duas variantes de K.alvarezii em diferentes profundidades em cultivo
usando uma baixa concentração de extrato (0.1 gL-1 de AMPEP) e exposição das
amostras de K. alvarezii a um menor período (30 min). Eles também obtiveram
50
resultados positivos no implemento do crescimento (1,3 a 4,1 %.dia-1 em amostras
tratadas com AMPEP e 0,9 a 3,0 %.dia-1 nas amostras controle), entretanto, quando seus
resultados foram comparados com os nossos, as taxas de crescimento nas águas
brasileiras foram maiores.
Yokoya et al. (2010) relataram a presença de citocininas em algumas algas
vermelhas e discutiram a importância dos hormônios na fisiologia de crescimento das
algas vermelhas. Maiores concentrações de AMPEP induziram a maiores taxas de
crescimento de K. alvarezii, que pode estar relacionado aos compostos estimulatórios
presentes no extrato relacionado com a síntese de citocinina (Khan et al. 2008; 2009) e
pela presença de certas betaínas (Mackinnin et al. 2009) como observados em plantas
superiores.
O rendimento da carragenana de K. alvarezii em 20 e 40 dias (amostras AMPEP
e controle) estiveram dentro da faixa ideal para os padrões industriais, próximas a 30%
(Hung et al. 2009).
Hayashi et al. (2007a), Reis et al. (2008) e Góes & Reis (2012) discutiram a
importância das mudanças ambientais como fatores de estresse, tais como mudanças de
salinidade e movimentação da água, na conformação da carragenana, que
consequentemente causam alterações nas suas propriedades reológicas, assim como as
respostas a esses estresses. AMPEP pode atuar com elicitor para as respostas de
K.alvarezii as condições de estresse, no aumento de suas defesas e causando uma maior
produção de carragenana (Loureiro et al. 2012). Isto pode explicar o resultado de maior
rendimento de carragenana das amostras de K.alvarezii expostas ao AMPEP, em 20 dias
de cultivo quando comparado com o resultado das amostras do tratamento controle.
No entanto, em longo prazo, este fator não é prejudicial para K. alvarezii uma
vez que o extrato parece transportar uma série de indutores e moléculas de protecção
(isomorfos específicos de enzimas antioxidantes, como o superóxido dismutase [MnSOD-1, ~ 150 kDa], ascorbato peroxidase [APX-4, ~ 55 kDa], glutationa peroxidase
[GSH-Px-2, ~ 55 kDa] e glutationa redutase [GR-1, ~ 180 kDa] as quais
especificamente responderam à suplementação AMPEP) que, mesmo sob estresse e a
exposição a pulsos oxidativos (como uma resposta a condições desfavoráveis), são
capazes de sustentar e proteger as amostras, mesmo depois de um breve período de
exposição (Loureiro et al. 2012; Kumar et al. 2012).
Além de melhorar a taxa de crescimento e de produção de carragenana, AMPEP
parece ter sido eficaz na redução de algumas epífitas (Loureiro et al. 2010). Este fator
51
não foi testado, mas foi observado nas mudas que foram tratadas por AMPEP. Uma vez
que os experimentos foram realizados em balsas flutuantes de cultivos comerciais,
quando os módulos das balsas que continham amostras tratadas com AMPEP foram
comparados com os módulos das balsas do cultivo comercial, aparentemente os
módulos experimentais continham cerca de 20% menos de bioincutação do que os
módulos que não foram usados no experimento (observação pessoal).
AMPEP é rico em potássio solúvel (17-22%) em sua composição (Hurtado et al.
2009; Loureiro et al. 2010) e K. alvarezii em kappa carragenana (Pereira et al. 2013).
Como kapa carragenana é conhecida por ser sensível aos íons de potássio, a carragenana
extraída das amostras tratadas com AMPEP deveriam produzir géis mais rígidos. Isto
pode ser explicado pela troca na sinerese (extrusão espontânea de água através da
superfície do gel quando está em repouso) das mudas quando expostas a soluções
aquosas, ricas em potássio solúvel. Altas concentrações de potássio deveriam exibir
maior sinerese resultar em maior força de gel. No entanto, a força do gel de K. alvarezii
foi maior nas amostras controle, mas dentro da faixa obtida por Góes e Reis (2011,
2012) em cultivos na baía de Sepetiba e em outros locais (Ohno et al. 1994;. Hayashi et
al. 2007a; 2007b), que leva à ideia de que o potássio disponível pela exposição ao
tratamento AMPEP que foi absorvido por K.alvarezii, quando a alga foi cultivada no
mar não foi suficiente para alterar a estrutura molecular do carragenana extraída.
Apesar da viscosidade da carragenana derivada das amostras de K. alvarezii
tratadas com AMPEP terem sido menores do que as amostras controle, estes valores
foram semelhantes aos registrados para a Baía de Sepetiba por Góes & Reis (2011;
2012).
Quanto maior a viscosidade, esta pode ser creditada às diferentes técnicas de
análise aplicadas no processo de confecção do pó de carragenana semirefinado
(Montolalu et al. 2008). Basmal et al. (2009) analisou o efeito de um novo agente, KCl,
precipitando carragenana em diferentes concentrações e do seu impacto sobre as leituras
de força e viscosidade do gel. As amostras testadas demonstram que as técnicas que
utilizam diferentes concentrações de KCl podem produzir diferentes leituras de força e
viscosidade de gel mesmo usando as mesmas amostras.
Qaundo avaliando o rendimento e qualidade de carragenana, Mendoza et al.
(2002) encontraram que as amostras saudáveis forneciam um extrato com melhor
qualidade do gel (maior força gel e maior viscosidade) quando comparado com
amostras estressadas que apresentavam sintomas de ice-ice. As amostras afetadas por
52
ice-ice mostraram alterações na massa molecular, impedindo a formação correta de
pontes de hidrogénio, o que refleteu diretamente na capacidade para formar a dupla
hélice que ocorre no processo regular de gelificação. A carragenana é constituida de
unidades alternadas de D-galactose e 3,6-anidro-galactose (3,6-AG), unidas por α-1, 3 e
β-1, 4-glucosídicas. Níveis mais altos de sulfato de éster no extrato em pó podem
resultar em menor força e viscosidade do gel, devido a uma alteração da massa
molecular (Craigie e Wong 1979; Craigie 1990; Knutsen et al. 2001). Os resultados do
presente estudo corroboram com os de Loureiro et al. (2012), no qual o AMPEP atua
como um elicitor das próprias defesas de K. alvarezii.
5. Conclusão
O uso de AMPEP no cultivo de K.alvarezii in situ é recomendado para aumentar
o crescimento de K. alvarezii, uma vez que após 40 dias a taxa de crescimento diário
aumentou e foi superior aos valores obtidos para a região da baía de Sepetiba. Além
disso, mais carragenana foi produzida quando comparada com amostras não submetidas
ao AMPEP. Apesar do efeito negativo na qualidade da carragenana semirefinada os
valores estivram dentro dos valores comerciais.
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57
Capítulo IV:
Efeito do extrato comercial da alga marrom Ascophyllum
nodosum Mont. em cultivo de Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P.C. Silva
submetido à temperaturas letais
Rafael R. Loureiro; Renata P. Reis & Rafael G. Marroig
Artigo submetido ao Journal of Applied Phycology.
58
1. Introdução
Kappaphyccus alvarezii Doty ex (Doty). P.C. Silva é a principal fonte de matéria
prima para a indústria de carragenana (Bixler e Porse 2011; Bindu & Levine 2011). Para
suprir a demanda brasileira por carragenana, esta espécie foi introduzida
experimentalmente no Brasil na década de 90, seguido pela introdução em fazendas
comerciais. Entretanto, existe a necessidade de adaptar as técnicas de cultivo aos
diferentes fatores ambientais inadequados ao cultivo desta espécie neste novo ambiente.
A solução para o cultivo comercial de K. alvarezii foi o uso do sistema de balsas
flutuantes feitas com PVC e o uso da técnica de rede tubular em locais com fundo
lodoso e maior movimentação de água. Este sistema de cultivo foi espalhado por toda a
área permitida para cultivo comercial de K. alvarezii pelo Governo brasileiro na costa
sudeste (Góes & Reis 2011).
Hayashi et al. (2011) teve sucesso com cultivo experimental de K. alvarezii,
usando a mesma técnica no sul do Brasil, no estado de santa catarina. Entretanto, no
inverno a temperatura da água do mar (16-180C) na sua área amostral foi letal para as
amostras cultivadas. Para a viabilidade do cultivo de K. alvarezii nesta área existe a
necessidade de permitir o crescimento desta espécie em baixas temperaturas. Hayashi
(comunicação persoal) comentou que a melhor maneira de fazer isto é cultivar esta alga
em tanques durante os meses de baixas temperaturas. Outra opção que poderia ser
estabelecida em sítios com baixas temperaturas consiste em obter mudas saudáveis para
serem cultivadas até o final da estacao fria. Entretanto, partino do pressuposto que a
perda de mudas deve ser usada no futiros cultivos, existe a necessidade de translocar
mudas de outros plantios, que aumentará os custos para previnir a introdução de
organismos acompanhantes das mudas translocadas, que apesar de serem considerados
organismos nativos para a costa brasileira, eles podem ser tratados como organismos
exóticos em locais nos quais a translocação das mdas ocorrerá. Processos de quarentena
devem ser estabelecidos, entretanto até o momento ainda nao foram implantados.
Com base no beneficiamento do uso do extrato comercial em pó de Ascophyllum
nodosum, (Acadian Marine Plant Extract - AMPEP), nos cultivos de K. alvarezii in vitro
e no mar, o qual tornou a alga mais resistente à algumas epífitas e aumentou seu
crescimento e rendimento de carragenana (Hurtado et al. 2009; Loureiro et al. 2010;
Yunque et al. 2011; Borlongan et al. 2011; Loureiro et al. 2012). Foi levantada a
59
hipótese de que mudas previamente submetidas à solução de AMPEP serão mais
resistentes à algumas das temperaturas consideradas letais ao crescimento desta espécie.
Para testar esta hipótese, nos avaliamos o efeito do uso da solução de AMPEP
em K. alvarezii in vitro nas baixas tenmperaturas que ocorrem no sul do Brasil entre o
outono e a primavera (Hayashi et al. 2011). Os parâmetros escolhidos para a avaliação
da produção e desenvolvimento de K. alvarezii sob estresse de temperatura foi a taxa de
crescomento diário eo rendimento e qualidade de carragenana (viscosidade e rigidez do
gel).
2. Material e Métodos
Condições laboratoriais
Mudas de K. alvarezii foram obtidas em cultivo comercial em Paraty Mirim,
Município de Paraty, estado do Rio de Janeiro, Brasil (23°14'52"S e 44°39'09" W). As
amostras foram limpas de epífitas e aclimatadas durante 30 dias em aquários de 5 litros
(temperatura da água - 22±2°C; irradiância -130±5 μmol.fótons m−2·s−1; fotoperíodo 12:12h; salinidade (PSS); 35±1 e pH - 8.1±0,3).
Desenho experiemental
Após o período de aclimatação, as algas foram banhadas em solução de AMPEP
(20 gL-1 de água do mar filtrada , 0.45µm), durante 1h, em recipientes com 12 litros de
água do mar filtrada (0,45 Milipore), com aeração constante. As amostras que não foram
banhadas em solução de AMPEP foram denominadas como controle. Cada amostra foi
composta por porções apicais de K. alvarezii (5 cm de comprimento, em um total de 5g
de massa úmida) e foi cultivada em Erlenmeyer, com 500 ml de água filtrada (0.45µm)
e aeração constante. Oito repetições de amostras AMPEP e de amostras controle foram
submetidas a três temperaturas T1 (16±1oC); T2 (19±1oC) e T3 (22±1oC). As
temperaturas T1 e T2 correspondem às consideradas letais ao crescimento de K.
alvarezii. A temperatura T3 é a que ocorre nos cultivos comerciais de K. alvarezii no sul
fluminense (Góes & Reis, 2011). As temperaturas foram manipuladas com coolers
(ventiladores), marca BAYO FS-120, em recipientes plásticos contendo os Erlenmeyers.
O experimento teve duração de 20 dias.
Crescimento, rendimento e qualidade da carragenana de K. alvarezii
O crescimento das amostras foi estimado como taxa de crescimento diário
60
(TCD), que corresponde à TCD (% day-1) =[(Mt /M0)1/t−1]×100% onde M0 é a massa
úmida inicial, Mt é a massa úmida final e t os dias de cultivo (Yong et al. 2013).
Para calcular o rendimento da carragenana das amostras de K. alvarezii, pelo processo
de transformação alcalina foi obtida a carragenana semirefinada das amostras. Neste
processo as amostras permaneceram em solução KOH a 6% em banho-maria (80°C),
durante 2 h, com posterior lavagem em água corrente e manutenção em solução de
NaClO de 0,06%, durante 30 min, em temperatura ambiente (25°C). As amostras foram
lavadas em água corrente para remoção dos resíduos e foram secas em estufa (60°C) até
obtenção de massa seca constante. O pH 8,4 foi mantido durante o procedimento (Góes
& Reis 2011; 2012; Loureiro et al. 2012).
O rendimento da carragenana (RC) de cada amostra de K. alvarezii (n=8) foi
estimado através do cálculo da percentagem de carragenana semirefinada obtida em
relação à massa seca da amostra de alga (Góes & Reis 2011; 2012), pela fórmula RC =
(Mc/Ma) x 100, onde Mc é a massa seca de carragenana e Ma é a massa seca da amostra
de K. alvarezii.
A qualidade da carragenana de K. alvarezii foi estimada pela força do gel (FG) e
viscosidade do gel (VG) da carragenana de oito amostras de gel (n=8). Para o preparo
do gel da carragenana semirefinada, cada amostra foi macerada em moinho de bola
(Mixer Mill MM 400, Retsch) e misturada em 100 mL de água destilada na proporção
de 1,5%. Esta solução ficou em repouso durante 1h, em temperatura ambiente (25°C), e
foi aquecida (80ºC), durante 10 minutos em agitação constante e posteriormente foi
resfriada (7±2°C) durante 24 h.
A viscosidade do gel foi analisada em reômetro de cone, DV-III Ultra
(Brookfield Engineering Labs, Inc.) em 75ºC, com sonda CP-40. A força de gel foi
medida em texturômetro, TexturePro (Brookfield Engineering Labs, Inc.), com uma
sonda cilíndrica em frasco com 2,5cm de largura por 5cm de altura.
Análise estatística
As premissas da normalidade (teste de Shapiro-Wilks) e da homogeneidade
(teste de Cochran) dos dados foram previamente testadas. A diferença da taxa de
crescimento diário e da viscosidade do gel das amostras de K. alvarezii (AMPEP e
controle) cultivadas nas três temperaturas (T1, T2 e T3) foram obtidas Kruskal-Wallis
ANOVA por nao encontraram as premissas para o uso de testes paramétricos meso após
serem transformados. As medianas significativamente distintas foram identificadas
61
através de teste de comparações múltiplas.
As diferenças estatísticas do rendimento da carragenana e da forca do gel das
amostras de K. alvarezii nas três temperaturas foram obtidas pela análise de variância
unifatorial (ANOVA unifatorial) e diferenças obtidas pelo teste LSD Fisher. As análises
foram realizadas no programa Statistica 6.0, da StatSoft Inc. e foi usado o intervalo de
confiança de 95% (p<0.05). Foram usadas oito repetições por tratamento (n=8). Os
dados foram expressos como mádia ± desvio padrão.
3. Resultados
Após o período de cultivo (20 dias), houve diferença significativa entre os
tratamentos (H=43.83, p <0.001, Fig. 6). As maiores taxas de crescimento diário de K.
alvarezii foram obtidas nas amostras submetidas ao tratamento AMPEP, quando
comparadas com seus controles em todas as temperaturas (p<0,001, Fig. 6A). Na
temperatura TI (16±1°C), as amostras do controle apresentaram branqueamento do talo,
enquanto que este branqueamento não foi observado nas amostras submetidas ao
tratamento AMPEP.
Entretanto, ocorreram diferenças significativas no rendimento de carragenana
das amostras controle e das AMPEP (F = 271.94, p < 0.001, Fig. 6B). Quando as
amostras AMPEP foram comparadas com as amostras controle, os resultados nas
temperaturas T1 (16±1°C) e T2 (19±1°C) foram diferentes das amostras cultivadas na
temperatura T3 (22±1°C). Os maiores rendimentos foram obtidos nas amostras do
controle (p<0.001, teste LSD) enquanto que na temperature T3 (22±1°C), o rendimento
da carragenana das amostras AMPEP foi maior do que a das amostras controle (p
<0.001, teste LSD).
Resultados semelhantes foram obtidos com a viscosidade do gel de K. alvarezii
cultivado nas diferentes temperaturas (H=33.30, p < 0.001, Fig. 6C), com maior
viscosidade de gel nas amostras controle cultivadas nas temperaturas T1 e T2 e
viscosidade de gel semelhantes (AMPEP and Control) nas cultivadas na temperature T3.
Entretanto, a força do gel de K. alvarezii das amostras cultivadas nas diferentes
temperaturas (F=65.67, p<0.001, Fig. 6D) mostraram respostas diferentes, com menor
força de gel nas amostras controle quando cultivadas nas temperaturas T1 e T2 e sem
diferenca significativa na temperature T3.
62
Figura 6. (A) Taxa de crescimento diário, (B) redimento de carragenana, (C) força do
gel e (D) viscosidade do gel de amostras de K. alvarezii previamente banhadas em
solução de AMPEP (TA) ou não tratadas (TC) (n=8) e submetidas a três temperaturas
(T1 =16±1 oC; T2 =19±1 oC e T3 = 22±1 oC).
4. Discussão
As taxas de crescimento diário das mudas submetidas a solução de AMPEP e
cultivadas em baixas temperaturas estiveram dentro da faixa de valores encontrados em
cultivos comerciais no estado do Rio de Janeiro (Góes & Reis 2011; 2012) e na faixa
encontrada em outros estudos in vitro e no mar sobre o efeito do AMPEP nesta espécie
(Loureiro et al. 2010; 2012; Borlongan et al. 2011; Yunque et al. 2011).
Altas taxas de crescimento das mudas de K. alvarezii foram obtidas em todas as
tempertauras quando submetidas ao tratamento AMPEP, até em temperaturas
consideradas como adversas para o crescimento desta espécie (Ohno et al. 2004;
Hayashi et al. 2011). Isto talvez ocorra devido à presença de betaínas que promovem
proteção a interrupção de transporte de elétrons pelo fotosistema II e evita a degradação
de pigmentos, como descrito por Mackinnon et al. (2010). Entretanto, a presença de
citocininas também poderia atuar como uma atividade elicitora no estrato de AMPEP e
suas propriedades (Reitz & Trumble 1996; Khan et al. 2009).
Trabalhos com vegetais superiores mostraram que o extrato de A. nodosum
63
administrado no solo ou como spray foliar foi um eficaz antioxidante no combate a
pragas ou na proteção dos efeitos adeversos causados pela longa exposição a respostas
de defesa própria [ROS – Reactive Oxigen Species] (Jayaraj et al. 2008; Khan et al.
2008; 2009; Parys et al. 2009; Jayaraman et al. 2011).
O efeito benéfico do uso do AMPEP em outros organismos que foram
submetidos ao estresse térmico também mostrou resultados promissores. Rayirath et al.
(2008) observaram a eficiência deste extrato no auxílio a sobrevivência de Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh. in vitro (-7.5°C) e in situ (-5.5°C) e em geral atribuíram este
benefício a presença de compostos lipofílicos (LPC).
Nair e colaboradores (dados não publicados) também verificaram o efeito
positivo do uso de extrato de A.nodosum em A. thaliana em baixas temperaturas e
comentaram que a expressão de genes mostrou a acumulação de prolina, que foi
mediada pelo aumento da expressão dos genes de síntese de prolina (P5CS1 P5CS2) e
pela redução na expressão do gene da prolina desidrogenase (PRODH). Além disso, a
presença elevada de LPCs aumentou significativamente a concentração de açúcares
solúveis no citosol em resposta ao estresse de congelamento, comprovando o modo de
ação dos LPCs na proteção contra baixas temperaturas e seus efeitos.
Barros et al. (2006) quando submeteram K.alvarezii ao estresse por
congelamento, observaram a exsudação de H2O2 (prevenindo a ação efetiva da catalase
– CAT e a indução do gene APX (Ascorbate Peroxidase Gene). Foi sugerido que a
exudação foi uma estratégia fisilógica da alga vermelha para suportar a produção rápida
e elevada do altamente tóxico H2O2 em seus tecidos. Loureiro et al. (2012), observaram
resultado semelhante quando induziram K.alvarezii a produzir H2O2 para avaliar o
efeito do AMPEP em tais condições.
É sugerido que o gradual (porém constante) acúmulo de H2O2 no entorno do
cultivo pode ser responsável pelo atraso adequado nas respostas apropriadas de CAT e
APX, como sugerido por Barros et al. (2006), que garante uma aclimatação em longo
prazo, que permite que K. alvarezii aumente sua taxa de crescimento (aumento de
biomassa) sob condições ambientais adversas combinadas com compostos favoráveis
presentes no AMPEP e a sua ação antioxidante.
Os valores de rendimento de carragenana das mudas de K. alvarezii nas três
temperaturas (amostras AMPEP e controle) estiveram dentro da faixa considerada ideal
para os valores da indústria, perto de 30% (Hayashi et al. 2007; Hung et al. 2009, Góes
& Reis, 2011; 2012). Provavelmente, os maiores valores observados nas amostras em
64
baixas temperaturas (T1 e T2) quando comparadas com a temperatura T3, foi causado
pelo conhecido aumento na produção de polissacarídeo (agar, carragenana e alginato)
como a primeira defesa da alga em resposta aos estresses abióticos (Craigie & Wen
1984; Knutsen et al. 2001).
A força e a viscosidade do gel de amostras de K. alvarezii foram independentes
da faixa de temperatura que as amostras foram submetidas ou o efeito do tratamento
AMPEP e estão dentro da faixa de valores encontrados em outros trabalhos com esta
espécie em cultivos na baía de Sepetiba, RJ (Góes & Reis 2011; 2012) e em outros
locais (Ohno et al. 1994; Hayashi et al. 2007). Os valores também estão incluídos nos
esperados para a indústria de carragenana, força de gel superior a 200g.cm2 e
viscosidade entre 30 e 800 cP (Góes & Reis 2011; 2012).
Craigie e Wen (1984) comentaram que algas submetidas a baixas temperaturas
apresentam alta força do gel. Isto está de acordo com os resultados deste estudo,
independente das amostras terem sido banhadas ou não na solução de AMPEP. Além
disso, a força do gel da carragenana das amostras AMPEP cultivadas em temperaturas
baixas (T1 e T2) foram maiores do que as do controle. Possivelmente, pelo fato do
AMPEP ser rico em potássio solúvel (17-22%) em sua composição (Hurtado et al.
2009; Loureiro et al. 2010) e a kappa carragenana ser sensível aos íons de potássio, que
permitem a produção de géis mais rígidos quando as amostras são previamente expostas
à soluções aquosas ricas em potássio solúvel. A temperatura também afetou a proporção
de sulfato e 3,6 anidrogalactose na conformação final da carragenana, fato que está
diretamente relacionado às propriedades reológicas do polissacarídeo. Em temperaturas
baixas, a concentração de sulfato na carragenana é menor do que a de 3,6
anidrogalactose. Esta configuração molecular confere maior rigidez ao gel quando estes
são comparados com géis de indivíduos cultivados em temperaturas mais altas (Craigie
& Wong 1979; Craigie 1990; Craigie & Wen 1994).
Alterações negativas na massa molecular da carragenana ocasionadas por fatores
estressantes (nesse estudo a baixa temperatura) também impedem a formação correta de
pontes de hidrogênio, que são responsáveis pela formação da dupla hélice, a qual
aumenta o poder de gelificação do polissacarídeo. Esta deficiência acarreta a menor
viscosidade do gel (Mendonza et al. 2002). Neste experimento, este padrão foi
observado apenas nas amostras tratadas com a solução de AMPEP.
65
5- Conclusão
A utilização do extrato comercial em extrato de A. nodossum, AMPEP, em
amostras de K. alvarezii in vitro em baixas temperaturas atuou como um remediador ao
estresse térmico, através do aumento nas taxas de crescimento diário e na força de gel.
Apesar do menor rendimento de carragenana e de viscosidade do gel quando usado o
AMPEP, os valores estão entre os utilizados na indústria. Desta maneira, o tratamento
de mudas de K. alvarezii com solução de AMPEP pode ser uma alternativa como ação
preventiva para o cultivo de mudas em tanques e no mar em períodos de baixas
temperaturas.
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7. Conclusões Finais
Os resultados apresentados nos quatro capítulos evidenciam a eficiência do
extrato em pó comercial da alga marrom A. nodosum (AMPEP) na algicultura de K.
alvarezii, que é respaldada pelos seguintes resultados:
1 - In vitro foi constatado que o crescimento e o rendimento de carragenana das algas
tratadas com AMPEP (em concentrações de 15-20 gL-1, expostas por 1h) foram maiores
do que as não tratadas, assim como eliminou a presença de algumas epífitas;
2 - O extrato de A. nodosum induziu um efeito similar ao de uma vacina em mudas
de K. alvarezii, uma vez que, elicitou suas defesas contra agentes estressores;
3 - Após 40 dias de cultivo no mar (tempo de um ciclo de produção de K. alvarezii nos
cultivos brasileiros, quando as algas são coletadas de 40 a 50 dias), mudas de K.
alvarezii tratadas com AMPEP quando comparadas com as não expostas, apresentaram
maiores taxas de crescimento diário e de rendimento de carragenana e sem alteração em
sua reologia (força e viscosidade do gel de carragenana);
4 - O AMPEP pode ser usado como um agente remediador em mudas de K.
alvarezii afetadas por estresse térmico (baixas temperaturas), por promover o aumento
de suas taxa de crescimento diário e força de gel da carragenana;
5 - O uso do extrato de A. nodosum é recomendado em processos de quarentena de
mudas para futuro cultivo, no intuito de combater algumas epífitas e tornar as mudas
mais resistentes a baixas temperaturas da água do mar e com maior produção de
biomassa e
6 - Em protocolos para translocação de mudas de K. alvarezii, o tratamento com
AMPEP poderá evitar a introdução de alguns organismos acompanhantes, que podem
ser potenciais invasores, além de aumentar a resistência da alga perante o estresse do
transporte e aclimatação ao novo ambiente.
70
8. Referências bibliográficas gerais
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