UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Obtenção de polímeros graftizados de quitosana e estudo das
propriedades físico-químicas para aplicação na indústria do petróleo
Keila dos Santos Alves
__________________________________
Tese de Doutorado
Natal/RN, dezembro de 2013
Keila dos Santos Alves
OBTENÇÃO DE POLÍMEROS GRAFTIZADOS DE QUITOSANA E ESTUDO DAS
PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS PARA APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA DO
PETRÓLEO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Química da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte – UFRN, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor em Química.
Orientadora: Profa. Dra. Rosangela de Carvalho
Balaban (UFRN)
Natal/RN
2013
UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede.
Catalogação da Publicação na Fonte.
Alves, Keila dos Santos.
Obtenção de polímeros graftizados de quitosana e estudo das
propriedades físico-químicas para aplicação na indústria do petróleo. /
Keila dos SantosAlves. – Natal, RN, 2013.
144 f.: il.
Orientadora: Profa. Dra. Rosangela de Carvalho Balaban.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Ciências Exatas e da Terra. Instituto de Química. Programa
de Pós-Graduação em Química.
1. Quitosana - Tese. 2. Alquilação redutiva - Tese. 3. Método onepot - Tese. 4. Solubilidade – Tese. 5. PH-responsivo – Tese. 6.
Espalhamento de luz dinâmico – Tese. I. Balaban, Rosangela de
Carvalho. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III.
Título.
RN/UF/BCZM
CDU 547.995
Ao meu querido irmão: Elizeu dos Santos Alves.
“Somente Deus tem a fórmula da vida
É a única saída, nEle eu posso descansar
Somente Deus, alimenta minha alma
Teu Espírito me acalma, meu socorro vem de Ti”.
(Maciel Martins)
AGRADECIMENTOS
Agradeço especialmente a Deus que me concedeu forças para a realização de mais uma
conquista, mesmo com todas as adversidades da vida.
Agradeço à minha família, sempre presente, pelo incentivo, apoio, paciência e carinho.
Agradeço a professora Rosangela Balaban pela oportunidade concedida para que eu
desenvolvesse este trabalho, pela amizade, apoio, carinho e dedicação a minha orientação.
Agradeço à minha amiga Bruna Lima pelo incondicional apoio, paciência e carinho.
Agradeço aos professores Marcos Villetti e Rosangela Vidal, pelo apoio, incentivo e
inúmeras discussões científicas compartilhadas.
Agradeço aos meus amigos Ana Maria, Ítalo, Lucianna, Maurício, Nívea, Oldemar e Ruza e
aos colegas que fazem parte da grande família LAPET, pela amizade, apoio, incentivo,
momentos de descontração e contribuição para a realização deste trabalho. Aos professores e
funcionários do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Agradeço a professora Nádya Pesce da Silveira e ao José Daniel Souza do LIMDIMUniversidade Federal do Rio Grande do Sul por gentilmente contribuir com todo apoio para
a realização das análises de DLS e potencial zeta.
Agradeço à Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP) pelo
suporte financeiro e ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande
do Norte (IFRN) pela liberação das minhas atividades de ensino durante a fase da
elaboração da Tese.
RESUMO
A quitosana é um biopolímero derivado de carapaças de crustáceos, de baixo custo,
biodegradável, renovável, que apresenta propriedades físico-químicas importantes e, ainda,
proporciona diferentes possibilidades de modificações em sua estrutura química, gerando
novas propriedades, o que torna esse polissacarídeo muito atraente do ponto de vista de
aplicação. Os polímeros são utilizados em várias operações na produção do petróleo.
Entretanto, a crescente preocupação com as restrições ambientais têm promovido a busca por
materiais ambientalmente sustentáveis pela indústria do petróleo. Dessa forma, esse estudo
propôs a obtenção de quitosana graftizada com grupos hidrofílico (poli(etileno glicol), mPEG)
e/ou hidrofóbico (n-dodecila) por uma metodologia mais simples (one-pot) e a avaliação de
suas propriedades físico-químicas em função da variação de pH, através das análises de
reologia, espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS), espalhamento de luz dinâmico
(DLS) e potencial zeta. Os derivados de quitosana foram preparados utilizando a reação de
alquilação redutiva em condições reacionais brandas e a estrutura química dos polímeros foi
caracterizada por ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e análise elementar
CHN. Considerando constante a razão molar mPEG/Quitosana na modificação química da
quitosana em diferentes metodologias, foi possível melhorar a solubilidade da quitosana em
uma ampla faixa de pH (ácido, neutro e básico) usando a metodologia one-pot, em que uma
parte dos grupos amino foi reacetilada. Nesta condição, até mesmo com a inserção simultânea
do n-dodecila, a solubilidade se manteve. Por outro lado, a solubilidade dos derivados obtidos
apenas com a incorporação de mPEG através de metodologia tradicional, ou com o grupo ndodecila, foi similar ao seu precursor. O grupo hidrofílico promoveu a diminuição da
viscosidade das soluções poliméricas a 10 g/L em meio ácido. Entretanto, em pH básico, esse
grupo contribuiu para o aumento da viscosidade e da estabilidade térmica das soluções, assim
como, favoreceu um comportamento pseudoplástico mais acentuado, sugerindo fortes
associações intermoleculares no meio alcalino. Os resultados de SAXS apresentaram um
comportamento de polieletrólito com a diminuição do pH para os sistemas poliméricos. As
análises de DLS revelaram que as soluções diluídas dos polímeros a 1 g/L em pH 3, embora
apresentem uma alta densidade de grupos amino protonados ao longo da cadeia polimérica, o
alto grau de cargas contribuiu significativamente para a agregação, promovendo o aumento do
tamanho das partículas com a diminuição do pH. Além disso, o grupo hidrofóbico também
contribuiu para aumentar o tamanho dos agregados em solução no pH 3 e o grupo hidrofílico
favoreceu para reduzi-los em toda faixa de pH. Entretanto, a natureza de agregação foi
dependente do pH do meio. Os resultados do potencial zeta indicaram que seus valores não
dependem apenas da carga da superfície da partícula, mas é resultante da carga líquida do
meio. Os sistemas poliméricos associativos em solução aquosa obtidos neste estudo
apresentam propriedades que podem ser atraentes em várias aplicações na indústria do
petróleo.
Palavras-chave: quitosana; alquilação redutiva; método one-pot; solubilidade; pHresponsivo; espalhamento de luz dinâmico.
ABSTRACT
Chitosan is a biopolymer derived from the shells of crustaceans, biodegradable,
inexpensive and renewable with important physical and chemical properties. Moreover, the
different modifications possible in its chemical structure generate new properties, making it
an attractive polysaccharide owing to its range of potential applications. Polymers have been
used in oil production operations. However, growing concern over environmental constraints
has prompted oil industry to search for environmentally sustainable materials. As such, this
study sought to obtain chitosan derivatives grafted with hydrophilic (poly(ethylene glycol),
mPEG) and/or hydrophobic groups (n-dodecyl) via a simple (one-pot) method and evaluate
their physicochemical properties as a function of varying pH using rheology, small-angle Xray scattering (SAXS), dynamic light scattering (DLS) and zeta potential. The chitosan
derivatives were prepared using reductive alkylation under mild reaction conditions and the
chemical structure of the polymers was characterized by nuclear magnetic resonance (1H
NMR) and CHN elemental analysis. Considering a constant mPEG/Chitosan molar ratio on
modification of chitosan, the solubility of the polymer across a wide pH range (acidic, neutral
and basic) could only be improved when some of the amino groups were submitted to
reacetylation using the one-pot method. Under these conditions, solubility is maintained even
with the simultaneous insertion of n-dodecyl. On the other hand, the solubility of derivatives
obtained only through mPEG incorporation using the traditional methodology, or with the ndodecyl group, was similar to that of its precursor. The hydrophilic group promoted decreased
viscosity of the polymer solutions at 10 g/L in acid medium. However, at basic pH, both
viscosity and thermal stability increased, as well as exhibited a pronounced pseudoplastic
behavior, suggesting strong intermolecular associations in the alkaline medium. The SAXS
results showed a polyelectrolyte behavior with the decrease in pH for the polymer systems.
DLS analyses revealed that although the dilute polymer solutions at 1 g/L and pH 3 exhibited
a high density of protonated amino groups along the polymer chain, the high degree of charge
contributed significantly to aggregation, promoting increased particle size with the decrease in
pH. Furthermore, the hydrophobic group also contributed to increasing the size of aggregates
in solution at pH 3, whereas the hydrophilic group helped reduce their size across the entire
pH range. Nevertheless, the nature of aggregation was dependent on the pH of the medium.
Zeta potential results indicated that its values do not depend solely on the surface charge of
the particle, but are also dependent on the net charge of the medium. In this study, water-
soluble associative polymers exhibit properties that can be of great interest in the petroleum
industry.
Keywords: chitosan; reductive alkylation; one-pot method; solubility; pH-responsive;
dynamic light scattering.
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1
Estruturas químicas da celulose, quitina e quitosana ..............................
17
Figura 3.2
Diagrama de produção comercial de quitina e quitosana .......................
18
Figura 3.3
Espectro de RMN 1H de uma amostra de quitosana ...............................
24
Figura 3.4
Variação do pH crítico em função do grau de acetilação .......................
27
Figura 3.5
Reações para obtenção de derivados de quitosana .................................
31
Figura 3.6
Esquema de aminação redutiva ...............................................................
32
Figura 3.7
Reações de N-alquilação redutiva da quitosana com açúcares ...............
33
Figura 3.8
Reações de N-alquilação redutiva da quitosana com diferentes grupos
funcionais substituídos ............................................................................
34
Figura 3.9
Reação de N-alquilação redutiva da quitosana com grupo cetona .........
34
Figura 3.10
Reação de N-alquilação redutiva da quitosana com 3-O-dodecil-Dglucose ....................................................................................................
36
Figura 3.11
Representação de ligações cruzadas na quitosana ..................................
37
Figura 3.12
Reação de N-alquilação redutiva na superfície da quitosana..................
38
Figura 3.13
Reação de N-alquilação redutiva com aldeídos fotossensíveis...............
39
Figura 3.14
a) Relação entre razão molar Ac2O/OH mPEG e teor de aldeído de
mPEG; b) Efeito do tempo de reação e teor de aldeído; c) Efeito de
DMSO e teor de aldeído de mPEG; (T 22 °C; DMSO 30 mL - a, c;
tempo de reação 9 h - a, c; razão molar 20 - b, c ....................................
43
Representação dos regimes de concentração de polímero em solução e
da concentração crítica (C*) ..................................................................
47
Figura 3.16
Modelo de placas paralelas: escoamento de fluido de Newton ..............
52
Figura 3.17
Curvas de tensão (a) e viscosidade (b) versus taxa de cisalhamento
para os fluidos newtonianos, pseudoplásticos e dilatantes .....................
53
Esquema ilustrativo do efeito do pH para soluções de quitosana-CS e
derivado-NPCS .......................................................................................
55
Comportamento reológico do derivado-NPCS: viscosidade versus taxa
de cisalhamento .......................................................................................
55
Influência da temperatura na viscosidade das N-alquilquitosanas em
solução de ácido acético 0,3 M/acetato de sódio 0,05 M; ω = 0,1 Hz ....
56
Esquema da medida da intensidade de luz espalhada (a) e a sua
correspondente função de correlação (b) obtida por espalhamento de
luz dinâmico ............................................................................................
60
Distribuição normalizada em função do tempo de relaxação ( τ ) e RH
( θ = 90 °; concentração de quitosana 0,01 % (m/m); solução de ácido
acético 0,2 M/acetato de amônio 0,15 M; pH 4,5)..................................
62
Figura 3.15
Figura 3.18
Figura 3.19
Figura 3.20
Figura 3.21
Figura 3.22
Função de distribuição normalizada do raio hidrodinâmico a) GA 0 %
e b) GA 56 % ( θ = 90°; concentração de quitosana 1,2 x 10-3 mol/L
em 0,3 M de ácido acético/0,05 de acetato de sódio) ............................
64
Modelo representativo de espécies de agregados de quitosana GA 30
% em solução com diferentes forças iônicas (concentração de
polímero 0,40 mg/mL, solução aquosa de ácido acético 0,10 M) .........
66
Distribuição dos raios hidrodinâmicos de oligômeros de quitosana
obtidos por DLS ......................................................................................
69
Esquema da agregação e dissociação da quitosana-g-mPEG em meio
aquoso em função do pH.........................................................................
72
Representação da agregação em função do pH para quitosana
graftizada com grupos hidrofóbicos e hidrofílicos .................................
73
Figura 3.28
Representação do potencial zeta .............................................................
74
Figura 3.29
O efeito do pH no potencial zeta.............................................................
75
Figura 3.23
Figura 3.24
Figura 3.25
Figura 3.26
Figura 3.27
LISTA DE ABREVIATURAS
mPEG
CH
GA
GD
GS
pK
RMN 1H
RMN 13C
RMN 15N
IV
UV
CLAE
TG
NaBH4
NaCNBH3
GS
PEG
Quitosana-g-mPEG
DMSO
Ac2O
TEMPO
NaClO
BIAB
DLS
SAXS
ηr
ηsp
ηred
ηinh
[η]
C*
ζ
metóxi-poli(etileno glicol)
quitosana
grau de acetilação
grau de desacetilação
grau de substituição
constante de dissociação
espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio
espectroscopia de ressonância magnética nuclear de carbono
espectroscopia de ressonância magnética nuclear de nitrogênio
espectroscopia na região do infravermelho
espectroscopia na região do ultravioleta
cromatografia líquida de alta eficiência
termogravimetria
borohidreto de sódio
cianoborohidreto de sódio
grau de substituição
poli(etileno glicol)
quitosana graftizada com mPEG
dimetilsulfóxido
anidrido acético
N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina
hipoclorito de sódio
bis(acetóxi)iodobenzeno
espalhamento de luz dinâmico
espalhamento de raios-X a baixos ângulos
viscosidade relativa
viscosidade específica
viscosidade reduzida
viscosidade inerente
viscosidade intrínseca
concentração crítica
potencial zeta
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO .........................................................................................................
13
2 OBJETIVOS ..............................................................................................................
15
2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................
15
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................
15
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................
16
3.1 QUITOSANA ...........................................................................................................
16
3.1.1 Obtenção e Estrutura da Quitosana ..................................................................
16
3.1.2 Caracterização da Quitosana .............................................................................
21
3.1.2.1 Grau de Desacetilação/Acetilação ......................................................................
21
3.1.2.2 Solubilidade ........................................................................................................
24
3.1.3 Modificação Química ..........................................................................................
29
3.1.3.1 Aminação Redutiva (ou Alquilação Redutiva) da Quitosana .............................
32
3.1.3.2 QUITOSANA-g-PEG.........................................................................................
41
3.1.4 Estudo das Propriedades Físico-Químicas ........................................................
45
3.1.4.1 REOLOGIA ........................................................................................................
46
3.1.4.2 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS) .............................................................
57
3.1.4.3 Potencial Zeta ( ζ ) .............................................................................................
73
3.1.4.4 Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) .......................................
76
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................
78
4 METODOLOGIA, RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................
89
5 CONCLUSÕES..........................................................................................................
136
ANEXO I........... ............................................................................................................
138
ANEXO II......................................................................................................................
144
13
1 INTRODUÇÃO
Os desafios da sustentabilidade econômica com a preservação do meio ambiente vêm
promovendo nos últimos anos um crescente interesse por pesquisas que proporcionem o
desenvolvimento de novos materiais provenientes de polímeros naturais para o uso em
diversas áreas. A importância dos biopolímeros está relacionada não apenas com as questões
ambientais, mas também devido a sua origem renovável, abundância na natureza, variedade
estrutural e propriedades funcionais. Tais características tornam esses polímeros sistemas
alternativos e competitivos aos materiais clássicos (Alves e Mano, 2008; Casettari, Vllasaliu
et al., 2012; Kumar, 2000; Kurita, 2001; Mourya e Inamdar, 2008; Pillai, Paul et al., 2009;
Prashanth e Tharanathan, 2007; Rinaudo, 2006).
Dentre os polímeros naturais, destaca-se a quitosana, obtida através do processo de
desacetilação da quitina, um dos polissacarídeos mais abundantes na natureza e
comercialmente extraído das carapaças de crustáceos. A quitosana apresenta importantes
propriedades, tais como biodegradabilidade, biocompatibilidade, atoxicidade, bioatividade,
natureza policatiônica e possibilidade de diferentes formas de utilização (pó, filmes, gel,
fibras, soluções). Essas propriedades estão relacionadas ao seu potencial em aplicações
industriais, tecnológicas e biológicas. Sua utilidade se torna ainda mais extensa quando
incluímos os diversos derivados de quitosana, os quais são obtidos através de modificações
químicas em sua estrutura polimérica, permitindo adicionar outras propriedades e, portanto,
novas aplicações. Assim, a quitosana é considerada muito versátil com uso nas indústrias
farmacêutica, alimentícia, cosmética, têxtil, na agricultura, na medicina e em tratamento de
efluentes (Alves e Mano, 2008; Casettari, Vllasaliu et al., 2012; Chen, Mi et al., 2011;
Craveiro, Craveiro et al., 1999; Kumar, 2000; Kumirska, Weinhold et al., 2011; Mourya e
Inamdar, 2008; Pillai, Paul et al., 2009; Prashanth e Tharanathan, 2007; Rinaudo, 2006;
Sashiwa e Haiba, 2004;).
Diferentes reações químicas são empregadas na modificação estrutural da quitosana.
Considerando as diversas possibilidades, a reação de alquilação redutiva é uma alternativa
interessante, pois permite a funcionalização seletiva do grupo amino da cadeia da quitosana e
pode ser processada em condições reacionais brandas e em sistemas homogêneos (Kurita,
2001). Dentre os derivados de quitosana obtidos através da N-alquilação redutiva, podemos
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
14
destacar os polímeros resultantes da inserção de grupos hidrofílicos e/ou hidrofóbicos na
cadeia polimérica, uma vez que é possível melhorar a solubilidade da quitosana e obter
derivados pertencentes à classe de polímeros hidrossolúveis hidrofobicamente modificados.
Esses polímeros apresentam propriedades associativas e são bastante atraentes em várias
aplicações, principalmente, quando o controle reológico de fluidos é requerido, como no caso
das tintas, dos cosméticos, dos alimentos, nos sistemas carreadores de fármacos e
biomoléculas, dos fluidos de perfuração e dos processos de recuperação avançada de petróleo
(Chiu, Chen et al., 2009; Desbrières, 2004; Kjniksen, Beheshti. et al., 2008; Philippova e
Korchagina, 2012; Yang, Chou et al., 2002).
No caso de aplicações de polímeros na indústria do petróleo, a goma xantana é um dos
polissacarídeos mais usados nos processos de produção de petróleo. Esse polímero funciona
como agente viscosificante do meio aquoso. No entanto, a goma xantana apresenta um alto
custo como a principal limitação do seu uso. Além disso, a solução da goma xantana
apresenta diminuição nos valores de viscosidade com o aumento da temperatura (Lucas,
Mansur et al., 2009; Sorbie et al., 2009). Uma alternativa para superar essas limitações pode
surgir do estudo da quitosana, embora ela apresente limitação de solubilidade em meio neutro
e alcalino. Já que a estrutura da quitosana permite modificação química que pode melhorar as
suas propriedades e por ser um produto natural, biodegradável, renovável e de baixo custo, a
quitosana apresenta um potencial para aplicação. Além disso, as carapaças de crustáceos são
resíduos rejeitados pela indústria pesqueira, sendo em muitos casos considerados poluentes.
Portanto, o aproveitamento desses resíduos ainda minimiza os impactos ambientais que
podem ser causados pelo uso de um descarte inadequado (Reis, Silva et al., 2011; Saleah e
Basta, 2008).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
15
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O projeto de tese se constituiu na obtenção de quitosana graftizada com grupos
hidrofílicos e/ou hidrofóbicos, a fim de melhorar a solubilidade da quitosana e promover
características associativas em solução aquosa, e avaliação das propriedades físico-químicas
dos derivados de quitosana.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obter quitosana graftizada com grupos hidrofílicos (metóxi-poli(etileno glicol) mPEG) e/ou hidrofóbicos (n-dodecila);

Caracterizar a estrutura dos derivados de quitosana (CHP, CHC e CHPC: quitosana
(CH) graftizada com mPEG, n-dodecila e mPEG/n-dodecila, respectivamente);

Avaliar as propriedades físico-químicas, tais como solubilidade, estabilidade e
viscosidade das soluções aquosas das amostras de quitosana;

Avaliar o comportamento reológico dos derivados de quitosana em solução aquosa;

Avaliar o comportamento de agregação dos derivados de quitosana e do precursor em
soluções aquosas como função do pH da solução.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
16
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 QUITOSANA
3.1.1 Obtenção e Estrutura da Quitosana
A quitosana é um biopolímero de cadeia linear obtida, principalmente, da Ndesacetilação da quitina. A celulose e a quitina são os polissacarídeos mais abundantes na
natureza, formam a base estrutural e de proteção de plantas e animais, respectivamente.
Quitina é encontrada principalmente em carapaças de crustáceos (em especial no caranguejo,
no camarão e na lagosta), insetos, moluscos e na parede celular de fungos. A estrutura
química da quitina (Figura 3.1) é formada por unidades repetidas 2-acetamido-2-deoxi-Dglicopiranose unidas por ligações glicosídicas do tipo β-(1→4). Sua composição é muito
semelhante à estrutura da celulose (Figura 3.1), diferem apenas no substituinte do carbono 2
(C2), constituído pelo grupo acetamido na estrutura da quitina e pelo grupo hidroxila na
celulose (Alves e Mano, 2008; Craveiro, Craveiro et al., 1999; Kumar, 2000; Kurita, 2001;
Pillai, Paul et al., 2009; Prashanth e Tharanathan, 2007; Rinaudo, 2006).
As fortes ligações de hidrogênio inter e intramoleculares existentes nas cadeias da
quitina resultam na sua insolubilidade em meio aquoso e na maioria dos solventes orgânicos,
consequentemente, minimiza o potencial da quitina em muitas aplicações. Apesar de suas
limitações, quitina é usada, sobretudo, na indústria têxtil, alimentícia, cosméticos e tem
aplicações médicas e farmacêuticas. Além disso, a grande importância da quitina refere-se à
produção da quitosana (Craveiro, Craveiro et al., 1999; Kumar, 2000; Prashanth e
Tharanathan, 2007; Rinaudo, 2006).
Quitosana é um dos biopolímeros que se destacam em razão de suas propriedades
estruturais e funcionais favoráveis, tais como biocompatibilidade, biodegradabilidade,
atoxicidade, bioatividade, além de ser uma fonte renovável de baixo custo proveniente de
resíduos de cascas de crustáceos. Diversas possibilidades de modificação química em sua
estrutura possibilitam a elaboração de novos materiais. A aplicação da quitosana é
significativa em vários setores industriais. Na área ambiental, para o tratamento de efluentes,
funciona como quelante de metais pesados e floculante; no setor agrícola, age como protetora
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
17
de sementes através da sua ação bactericida e fungicida, além de atuar na retenção de umidade
e nutrientes. É muito utilizada na indústria de alimentos em produtos dietéticos e aditivos
alimentares; em formulação de cosméticos; na indústria farmacêutica, funciona como agentes
de liberação controlada de fármacos e tem ação farmacológica em função das suas
propriedades antimicrobiana, coagulante, assim como é utilizada na composição de
biomateriais para regeneração de estrutura óssea e ferimentos, dentre outras aplicações (Alves
e Mano, 2008; Casettari, Vllasaliu et al., 2012; Chen, Mi et al., 2011; Craveiro, Craveiro et
al., 1999; Kumar, 2000; Kumirska, Weinhold et al., 2011; Mourya e Inamdar, 2008; Pillai,
Paul et al., 2009; Prashanth e Tharanathan, 2007; Rinaudo, 2006; Sashiwa e Haiba, 2004).
Figura 3.1 - Estruturas químicas da celulose, quitina e quitosana
Celulose
Quitina
Quitosana
Fonte: adaptado de (Kurita, 2001)
A estrutura química da quitosana (Figura 3.1) é constituída por unidades β-(1→4)-2amino-2-deoxi-D-glicopiranose e β-(1→4)-2-acetamido-2-deoxi-D-glicopiranose, porém,
predominam os constituintes formados por grupos amino (unidades desacetiladas). Os
principais parâmetros que diferenciam quitosana da quitina são o grau de desacetilação (GD fração de grupos amino em relação aos grupos acetamido (acetilados) presentes no
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
18
biopolímero) e a solubilidade. Geralmente, a quitosana possui o grau de desacetilação acima
de 50 % e apresenta-se solúvel em meio aquoso (pH ácido). Enquanto que a quitina tem GD
abaixo de 50 %, além de ser insolúvel em meio aquoso (Brugnerotto, Lizardi et al., 2001;
Kurita, 2001; Pillai, Paul et al., 2009).
A reação de N-desacetilação da quitina é promovida em meio alcalino com hidróxidos
de sódio ou potássio, à temperatura elevada (Canella e Garcia, 2001; Santos, 2004). Um
exemplo das condições experimentais para obtenção comercial da quitina e quitosana é
apresentado na Figura 3.2 (Santos, 2004).
Figura 3.2 - Diagrama de produção comercial de quitina e quitosana
Fonte: adaptado de (Santos, 2004)
O polissacarídeo de partida, quitina, é submetido à modificação química em condição
experimental heterogênea. De fato, os agentes modificadores estão dissolvidos no meio
reacional, mas não têm completo acesso aos sítios reativos das cadeias poliméricas, que
permanecem insolúveis em suspensão, durante a reação devido à associação entre as cadeias
através de numerosas ligações de hidrogênio. Nas regiões amorfas, nas quais a acessibilidade
aos sítios reativos é maior, a reação é considerada pseudo-homogênea. Entretanto, como as
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
19
regiões cristalinas não são completamente atingidas, as modificações estão mais sujeitas à
ocorrência nas superfícies dos cristalitos. Assim, a N-desacetilação da quitina em solução
aquosa de NaOH ocorre de modo heterogêneo e gera produto cujas cadeias são formadas por
sequências de unidades modificadas quimicamente e unidades que não sofreram modificação
química. Portanto, a quitosana é formada por unidades desacetiladas e acetiladas (Signini e
Campana-Filho, 2001).
Os principais fatores que afetam a eficiência da N-desacetilação da quitina na
obtenção da quitosana são: a) temperatura e tempo de reação; b) concentração da solução
alcalina e adição de diluente (álcoois de cadeia curta e cetonas); c) razão quitina/solução
alcalina; d) tamanho das partículas de quitina; e) atmosfera da reação e presença de agentes
que evitam a despolimerização (Campana-Filho e Signini, 2001). As condições mais severas
são geralmente empregadas no sentido de favorecer a eficiência da N-desacetilação, no
entanto, resulta em acentuada despolimerização via hidrólise alcalina. A suposição de que o
oxigênio molecular participe do processo tem suscitado o emprego de aditivos e de condições
reacionais específicas para evitar seu efeito oxidante. O uso de gases inertes e a adição de
agentes redutores no meio reacional são medidas relativamente eficazes no sentido de
minimizar a despolimerização (Campana-Filho, Brito et al., 2007).
Canella e Garcia (2001) observaram que o processo de N-desacetilação da quitina
realizado em meio heterogêneo pode gerar uma distribuição não aleatória dos grupos
acetamido ao longo da cadeia polimérica. Este efeito ocasionou a solubilidade parcial da
quitosana em solução aquosa de ácido acético, mesmo para amostras que já tinham alcançado
um grau médio de desacetilação acima de 50 %, e que deveriam, portanto, ser solúveis em
meio aquoso na presença de ácido (Canella e Garcia, 2001).
Campana-Filho e Signini (2001) avaliaram reações de N-desacetilação de quitina
comercial em suspensão aquosa de hidróxido de sódio e os efeitos de aditivos (borohidreto de
sódio e antraquinona) e de borbulhamento de gases inertes (nitrogênio e argônio) sobre as
características das amostras desacetiladas. Quitosana com predominância de estrutura
cristalina foi obtida quando um dos gases inertes foi borbulhado no meio reacional durante a
desacetilação. As amostras ligeiramente mais desacetiladas foram obtidas na ausência de
aditivo, entretanto, intensa despolimerização ocorreu nesses casos. A adição de borohidreto de
sódio no sistema de reação reduziu significativamente a despolimerização, mas a presença de
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
20
antraquinona e o borbulhamento de nitrogênio ou de argônio não surtiram qualquer efeito,
indicando que a presença de oxigênio não foi um pré-requisito para a ocorrência de
despolimerização (Campana-Filho e Signini, 2001).
A proporção de unidades acetiladas/desacetiladas nas estruturas da quitina e quitosana
é dependente da origem e do modo de obtenção do biopolímero. A extração da quitina resulta
em N-desacetilação parcial, mesmo quando são empregadas condições brandas nas etapas de
desmineralização e desproteinização. A quitina nativa, que está associada a outros materiais
constituintes das carapaças de caranguejos e de camarões, é um produto natural de
composição variável quanto à dimensão das cadeias, teor e distribuição de unidades
acetiladas/desacetiladas ao longo da cadeia do polímero. Estes fatores refletem diretamente
nas características da quitosana comercial produzida da quitina (Campana-Filho, Brito et al.,
2007).
Youn e colaboradores demostraram que a composição química e algumas propriedades
físico-químicas e funcionais de amostras de quitosana preparadas com as carapaças de
caranguejos coletadas em três anos diferentes (2004, 2005 e 2007) exibiram variações. A
amostra de 2004 apresentou um grau de acetilação maior e uma viscosidade menor em relação
às outras amostras de quitosana. Enquanto que a espécie de 2007 teve o teor de proteína e de
quitina mais elevados (Youn, No et al., 2009).
A caracterização estrutural da quitosana é um aspecto importante para o estudo das
suas propriedades e, consequentemente, para o direcionamento de aplicações. A influência de
muitos fatores, desde a natureza da matéria-prima até as condições experimentais utilizadas
nos tratamentos para a obtenção da quitosana, determina as diferentes características e
propriedades físico-químicas da quitosana. As diferenças nas especificações de pureza, grau
de desacetilação, solubilidade, viscosidade, massa molar e polidispersão também podem estar
vinculadas à intrínseca variabilidade da matéria-prima empregada pelos produtores de quitina
e quitosana. Nesse caso, as variações são razoáveis já que o polímero é proveniente
essencialmente de uma indústria pesqueira, que coleta os animais diretamente da natureza,
sem discriminação de espécie, idade e fase de desenvolvimento (Campana-Filho, Brito et al.,
2007; Craveiro, Craveiro et al., 1999; Domard, 2011; Kumirska, Weinhold et al., 2011; Youn,
No et al., 2009).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
21
3.1.2 Caracterização da Quitosana
3.1.2.1 Grau de Desacetilação/Acetilação
As propriedades da quitosana dependem intensamente da proporção relativa das
unidades 2-amino-2-deoxi-D-glicopiranose e 2-acetamido-2-deoxi-D-glicopiranose existentes
em sua estrutura polimérica. A fração de grupos acetamido em relação aos grupos amino
presente na quitosana determina o grau de acetilação (GA), grandeza complementar ao grau
de desacetilação (GA + GD = 1). Esse parâmetro é muito relevante, pois tem efeito marcante
nas propriedades físicas, químicas e biológicas da quitosana (Craveiro, Craveiro et al., 1999;
Kumirska, Weinhold et al., 2011; Kurita, 2001). Pesquisadores têm estudado, principalmente,
o seu efeito nas propriedades físico-químicas da quitosana em solução, uma vez que se faz
necessário preparar soluções do polímero antes da obtenção de qualquer tipo de material
como gel, filme, esponja, fibra, etc, assim como, para as aplicações da quitosana em sistemas
usuais através de solução (Chen, Hsu et al., 2011; Philippova, Korchagina et al., 2012;
Schatz, Viton et al., 2003; Sorlier, Denuzière et al., 2001; Sorlier, Viton et al., 2002).
A relação das unidades acetiladas e desacetiladas na quitosana governa o equilíbrio
entre as propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas em solução. A quantidade e a distribuição
aleatória ou em bloco dos grupos acetamido na cadeia da quitosana afetam as interações intra
e intermolecular, já que esses grupos contribuem na formação das ligações de hidrogênio e
apresentam caráter hidrofóbico através dos grupos metílicos. Os grupos amino determinam as
interações eletrostáticas em meio ácido através dos sítios amino protonados e as ligações de
hidrogênio, assumindo uma natureza hidrofílica. O aumento das ligações de hidrogênio intra e
intermolecular e das interações hidrofóbicas promovem a formação de agregados em solução
aquosa, influenciando a solubilidade da quitosana (Chen, Hsu et al., 2013; Philippova,
Korchagina et al., 2012; Rinaudo, 2006).
Schatz e colaboradores (2003) estudaram o comportamento relacionado às
propriedades físico-químicas da quitosana em solução aquosa de ácido acético em função do
grau de acetilação utilizando as técnicas de viscosimetria e espalhamento de luz. Nesse
estudo, as amostras de quitosana com diferentes GA foram obtidas em condições reacionais
homogêneas para preservar uma distribuição aleatória dos grupos acetamido e manter a massa
molar equivalente. Os colaboradores concluíram que a quitosana apresenta três
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
22
comportamentos diferentes de acordo com o valor do GA: i) quitosana com GA abaixo de 20
% comporta-se como polieletrólito catiônico e as interações eletrostáticas são predominantes;
ii) as interações hidrofílicas e hidrofóbicas estão em equilíbrio para as amostras com valores
de GA entre 20 e 50 %; iii) para quitosana com GA acima de 50 %, predominam as interações
hidrofóbicas e surgem as associações entre as cadeias do polímero. Esses resultados
confirmam conclusões prévias de Sorlier e colaboradores (2001, 2002), que encontraram
características semelhantes de comportamento da quitosana, quando estudaram a constante de
dissociação (pK) em função do GA (Schatz, Viton et al., 2003; Sorlier, Denuzière et al., 2001;
Sorlier, Viton et al., 2002).
Segundo Sorlier e colaboradores (2001), através do estudo do GA em função do grau
de dissociação (densidade de cargas em solução), verificaram que uma amostra de quitosana
com GA de 89 %, em pH 7 correspondeu a um grau de dissociação abaixo de 0,4, enquanto
que uma quitosana de GA 20 % foi quase neutralizada nesse pH. Como consequência das
diferentes estruturas da quitosana, as suas propriedades físico-químicas são diretamente
afetadas, proporcionando aplicações de acordo com o seu comportamento específico para o
tipo de estrutura. Nesse sentido, quitosana com baixo valor de GA apresenta alta densidade de
cargas positivas em ambiente ácido, proveniente dos grupos amino protonados, sendo assim,
favorece as propriedades de floculação e adsorção de partículas carregadas negativamente,
enquanto a quitosana com elevado GA, predomina as interações hidrofóbicas e favorece a
formação de gel (Sorlier, Denuzière et al., 2001).
Contudo, podemos encontrar divergências sobre o efeito do GA relacionado ao
comportamento das agregações entre as cadeias da quitosana. Philippova e colaboradores
(2012) mostraram que as amostras de quitosana são capazes de agregar em meio aquoso
ácido, independente do teor dos grupos acetamido. Embora o mecanismo exato de formação
dos agregados ainda não esteja bem compreendido, as observações demonstraram que as
associações poliméricas em soluções aquosas ácidas não são especificamente devidas às
interações entre os grupos acetamido, os quais representam as interações hidrofóbicas na
cadeia da quitosana. Assim, tanto as ligações de hidrogênio como as interações hidrofóbicas
são fatores importantes na agregação da quitosana. Além disso, presume-se que as agregações
mais resistentes provêm de possíveis domínios cristalinos formados em zonas de junção entre
as macromoléculas (Philippova, Korchagina et al., 2012).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
23
Existem várias metodologias para a determinação do grau médio de desacetilação da
quitosana, tais como espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN
1
H), carbono (RMN 13C) e nitrogênio (RMN 15N); espectroscopia na região do infravermelho
(IV) e do ultravioleta (UV); titulação condutimétrica e potenciométrica; difração de raios-X;
análise elementar; cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e termogravimetria (TG).
(Brugnerotto, Lizard et al., 2001; Fernandez-megia, Novoa-Carballal et al., 2005; Jiang, Chen
et al., 2003; Lavertu, Xia et al., 2003; Liu, Wei et al., 2006; Santos, Soares et al., 2003;
Zhang, Xue et al., 2005). Cada método tem suas vantagens e desvantagens, a escolha de uma
técnica dependerá da natureza da amostra (pureza, quantidade e solubilidade) e da
disponibilidade do equipamento.
Um dos métodos usados para determinar o grau de desacetilação da quitosana é a
espectroscopia de RMN 1H. A determinação do GD pode ser realizada através de diferentes
combinações entre as áreas dos picos do espectro de RMN 1H da quitosana. Exemplos dessas
relações são apresentados nas seguintes equações: Equação 3.1 e Equação 3.2 (Lavertu, Xia et
al., 2003) e Equação 3.3 (Santos, Soares et al., 2003).

1


 3 × A H-8(Ac)  
GD  %   1  
   100

 1 × A H-2/6  
 6


(3.1)


A H-1(D)
 
A H-8(Ac)
A
 H-1(D) +
3

(3.2)
GD  % 
 A H-8(Ac) 
GA  %  = 
 × 100
3 × A
H-2(D) 



  100



GD  % = 100 - GA  %
(3.3)
Em que, ―A” é a área dos picos equivalentes do espectro de RMN 1H da quitosana na
Figura 3.3. Conforme os assinalamentos no espectro da quitosana, o pico que corresponde ao
deslocamento químico 2,3 ppm é atribuído aos núcleos de hidrogênio da metila do grupo
acetamido (H-8(Ac)). Os sinais relacionados a 3,5 ppm e 5,2 ppm, respectivamente, são
atribuídos ao núcleo de hidrogênio na posição 2 do anel da unidade desacetilada, no qual o
grupo amino está presente (H-2(D)) e ao próton anomérico da unidade desacetilada (H-1(D)).
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24
A região mais larga do espectro, compreendida entre 3,8 e 4,2 ppm, é relativa aos demais
hidrogênios pertencentes à estrutura da quitosana (H-2/6).
Figura 3.3 - Espectro de RMN 1H de uma amostra de quitosana
Fonte: Autor
3.1.2.2 Solubilidade
Do ponto de vista prático, a solubilidade permite a distinção entre a quitosana e o seu
precursor de modo simples e rápido. A quitina apresenta uma afinidade limitada por solventes
devido às fortes ligações de hidrogênio intra e intermoleculares. É solúvel especialmente em
N,N-dimetilacetamida contendo 5 a 10 % de cloreto de lítio e em alguns solventes que contêm
flúor. Diferentemente da quitina, a quitosana comporta-se como uma base em meio aquoso,
pode ser solúvel em ácidos orgânicos diluídos como soluções de ácido acético, fórmico,
láctico, oxálico e em ácidos inorgânicos diluídos, porém em ácidos fortes (ácido clorídrico e
sulfúrico) a quitosana é hidrolisada (Kurita, 2001).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
25
Os ácidos mais comuns usados para dissolver a quitosana são o ácido acético e o ácido
clorídrico. Em soluções ácidas diluídas, a quitosana tem o comportamento típico de
polieletrólito catiônico devido à protonação dos grupos amino (NH2). A reação de equilíbrio,
que descreve o estado de ionização da quitosana, é apresentada na Equação 3.4.
QuitNH2 + H3O+
QuitNH3+ + H 2O
(3.4)
A solubilidade da quitosana em meio ácido está relacionada com a quantidade de
grupos amino protonados (NH3+) na cadeia polimérica. Quanto maior a quantidade destes
grupos protonados, maior a repulsão eletrostática entre as cadeias e, consequentemente, maior
a solvatação do polímero em água, facilitando a dissolução. Para uma dada concentração de
ácido, o grau de protonação depende do pK do ácido usado para solubilizar a quitosana
(Rinaudo, Pavlov et al., 1999; Santos, Soares et al., 2003). A solubilização da quitosana em
solução de ácido acético ou ácido clorídrico ocorre para um grau de protonação de
aproximadamente 0,5. Em meio ácido, os grupos amino da quitosana são protonados e o
polímero torna-se solúvel em solução aquosa. Entretanto, após a dissolução em condições
ácidas, quando o pH da solução é aumentado, os grupos amino têm suas cargas positivas
reduzidas e ao atingir um pH em torno de 6,5 a quitosana precipita na solução aquosa (Pillai,
Paul et al., 2009; Rinaudo, 2006; Sogias, Khutoryanskiy et al., 2010).
A remoção da maioria dos grupos acetilados da estrutura da quitina gera efeitos
significativos para a solubilidade da quitosana em água. Essa condição reduz em parte as
ligações de hidrogênio, já que os grupos acetilados também são potenciais em ligações de
hidrogênio. Além disso, origina os grupos amino, os quais promovem as cargas positivas na
macromolécula em meio ácido, causando repulsão entre os grupos vizinhos carregados e,
consequentemente, inibindo as interações polímero-polímero que favorecem o aumento da
natureza hidrofílica do biopolímero. Assim, a diminuição das ligações de hidrogênio entre as
cadeias combinado com o aumento do caráter hidrofílico da macromolécula ocasiona o
aumento da solubilidade da quitosana em solução aquosa. Como em sistemas de
polieletrólitos catiônicos, bons solventes usados para a dissolução da quitosana devem ter a
habilidade de impedir as ligações de hidrogênio entre as interações polímero-polímero e
conferir acidez no ambiente de dissolução, aumentando as interações polímero-solvente
(Weinhold, 2010).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
26
Diversos parâmetros interferem na solubilidade da quitosana, tais como o grau de
acetilação e sua distribuição ao longo da cadeia, a massa molar, as condições de extração e
secagem do polissacarídeo, o pH da solução, a concentração de polímero e a força iônica do
meio. Todos estes fatores citados acima são importantes para o estudo das propriedades da
quitosana em solução (Casettari, Vllasaliu et al., 2012; Nyström, Kjøniksen et al., 1999;
Pillai, Paul et al., 2009; Rinaudo, 2006).
De acordo com Signini e Campana-Filho (2001), diferentes procedimentos de
purificação de um mesmo tipo de quitosana podem resultar em amostras de quitosana
distintas quanto à solubilidade, hidrofilicidade e características morfológicas. Há processos de
purificação em que os sítios responsáveis pela formação de ligações de hidrogênio não são
modificados, consequentemente, as interações intra e intermoleculares não são alteradas e o
seu empacotamento não é modificado, deste modo, dificultando a solubilização da quitosana.
Entretanto, há metodologias de purificação da quitosana em que a presença de
cargas/contraíons dificulta as interações inter e intra-cadeias, minimizando o empacotamento
entre as cadeias e, assim, favorecendo o processo de solubilização (Signini e Campana-Filho,
2001).
De um modo geral, a quitosana é insolúvel em soluções aquosas com pH neutro e
alcalino, em álcool, acetona e na maior parte de solventes orgânicos, sendo estes sistemas
importantes para os processos de precipitação e purificação da quitosana. A dificuldade de
solubilização da quitosana está relacionada à sua regularidade estrutural (natureza cristalina),
a ocorrência de intensas ligações de hidrogênio inter e intramoleculares entre as cadeias do
biopolímero e a quantidade e distribuição não homogênea dos grupos acetamido ao longo da
macromolécula. Esse comportamento pode ser atribuído à preservação parcial de domínios
estruturais remanescentes da quitina, onde as interações associativas predominam na cadeia
polimérica, favorecendo a agregação e diminuindo a solubilidade da quitosana (Craveiro,
Craveiro et al., 1999; Peesan, Sirivat et al., 2006; Philippova, Korchagina et al., 2012; Sogias,
Khutoryanskiy et al., 2010; Sugimoto, Morimoto et al., 1998).
Schatz e colaboradores verificaram ao considerar o pH crítico da quitosana (pH
correspondente ao estado entre uma solução e antes da precipitação ocorrer), que o aumento
no grau de acetilação permite preservar a solubilidade da quitosana em solução aquosa em um
pH maior (Figura 3.4). No entanto, para valores maiores de GA (70 %) seu caráter
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
27
hidrofóbico tem tendência a formar dispersões de agregados. À medida que o GA na
quitosana aumenta, o comportamento eletrostático é menos acentuado (quantidade menor de
cargas na cadeia) e, assim, diminui a dependência da solubilidade em função do pH devido à
formação de uma conformação molecular menos sensível a variação de pH (Schatz, Pichot et
al., 2003).
Figura 3.4 – Variação do pH crítico em função do grau de acetilação
Fonte: (Schatz, Pichot et al., 2003)
O efeito do grau de acetilação na solubilidade da quitosana foi avaliado através da
comparação de amostras em três condições diferentes, quitosana comercial com GA 14 %,
completamente desacetilada e 52 % acetilada. Os resultados mostraram que a quitosana com
52 % acetilada permaneceu solúvel até o pH 7,4 e apresentou menor índice de cristalinidade.
A quitosana com GA 14 % e a desacetilada precipitaram em solução em pH 6 e 5,8,
respectivamente. A amostra completamente desacetilada teve o maior grau de cristalinidade.
Segundo os colaboradores, a protonação dos grupos amino e a cristalinidade são os dois
principais fatores que governam a solubilidade da quitosana. Entretanto, a cristalinidade da
amostra foi o fator limitante na solubilidade. Além disso, a quitosana 52 % acetilada, quando
em presença de ureia ou cloreto de guanidínio, permaneceu solúvel em ampla faixa de pH (1 12) (Sogias, Khutoryanskiy et al., 2010).
O efeito do grupo acetamido na variação da estrutura cristalina da quitosana indica que
a modificação do GA pode ser usada para controlar a solubilidade da quitosana (Pillai, Paul et
al., 2009). A quitosana pode ter a sua solubilidade ampliada através do controle do grau de
acetilação em torno de 50 % e com os grupos acetilados distribuídos de forma homogênea na
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28
cadeia (Kubota, Tatsumoto et al., 2000; Lu, Song et al., 2004; Qin, Li et al., 2006). Kubota e
colaboradores (2000) propuseram uma metodologia para obter quitosana solúvel em água e
em solventes orgânicos. A massa molar da quitosana foi reduzida usando borato de sódio, em
seguida realizou-se uma N-acetilação controlada com anidrido acético em meio homogêneo.
Obtiveram amostras com 50 % de unidades acetiladas distribuídas aleatoriamente cuja
solubilidade também aumentou com a diminuição da massa molar (Kubota, Tatsumoto et al.,
2000).
Lu e colaboradores (2004) após terem obtido quitosana (GA 50%) solúvel em água,
utilizaram duas rotas para recuperar a quitosana da solução, coagulação por etanol e
precipitação alcalina, em seguida, analisaram a solubilidade em água. A quitosana regenerada
por etanol foi solúvel posteriormente, mas o método alcalino resultou em insolubilidade.
Dados de difratogramas de raios-X revelaram que a amostra insolúvel obteve um aumento do
grau de cristalinidade (Lu, Song et al., 2004).
A literatura descreve diferentes modificações químicas na estrutura da quitosana,
através da funcionalização dos grupos amino e/ou hidróxidos, para melhorar a afinidade da
quitosana em água e em solventes orgânicos. Derivados de quitosana têm sido obtidos através
de diversas reações, incluindo carboxilação (Chen e Park, 2003), quaternização, alquilação
(Desbrières, 2004), acilação (Kubota, Tatsumoto et al., 2000; Qin, Li et al., 2006) e
graftização (Gorochovceva, Naderi et al., 2005; Mai-Ngam, 2006; Muslim, Morimoto et al.,
2001; Liu, Lu et al., 2009; Yang, Guo et al., 2010; Yuan, Zhao et al., 2011). A incorporação
de estruturas hidrofílicas ou de uma pequena quantidade de grupos hidrofóbicos à cadeia
linear da quitosana pode alterar propriedades como a solubilidade e a flexibilidade do
polímero, tornando seus derivados solúveis em solventes aquosos e/ou orgânicos. No entanto,
estas propriedades dependem da estrutura molecular, do comprimento e da distribuição dos
grupos laterais inseridos na cadeia polimérica (Desbrières, 2004; Yang, Chou et al., 2002).
Sugimoto e colaboradores (1998) prepararam derivados graftizados de quitosana com
cadeias laterais de metóxi-poli(etileno glicol) (mPEG). A solubilidade em água dependeu da
massa molar do mPEG, da razão molar entre quitosana e mPEG, do grau de substituição (GS)
e do grau de acetilação. O PEG de maior massa molar favoreceu a solubilidade em água dos
derivados (Sugimoto, Morimoto et al., 1998).
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29
Yang e colaboradores (2002) prepararam derivados de quitosana por N-alquilação
utilizando monossacarídeos e dissacarídeos, incluindo glucose, galactose, glicosamina,
frutose, lactose, maltose e celobiose. Todos os derivados com monossacarídeos foram
solúveis em pH abaixo de 7 com o comportamento de solubilidade similar à quitosana. No
entanto, os derivados com dissacarídeos foram mais solúveis e estáveis em água destilada e
em pH acima de 7. Portanto, a solubilidade da quitosana pode ser melhorada através da Nalquilação com dissacarídeos (Yang, Chou et al., 2002). Do mesmo modo, Tømmeraas e
colaboradores (2002) conseguiram derivados solúveis em toda faixa de pH através da
modificação da quitosana com oligossacarídeos (Tømmeraas, Köping-Höggard et al., 2002).
Os derivados carboxilados de quitosana são polímeros anfóteros cuja solubilidade
depende do pH. Esses derivados têm a solubilidade melhorada em água com pH acima de 7,
porém pode ocorrer a separação de fases entre pH 2,5 e 6,5 em função do grau de substituição
dos grupos carboxilados e da relação entre as cargas positivas e negativas no polímero em
solução (Chen e Park, 2003).
3.1.3 Modificação Química
Ao longo dos últimos anos, a produção industrial da quitosana tem apresentado um
elevado crescimento e as suas aplicações têm se desenvolvido em diversas áreas. O aumento
da utilização da quitosana deve-se, principalmente, as suas propriedades, a sua natureza
catiônica e a possibilidade de numerosas modificações em sua estrutura. A presença de grupos
reativos na composição da quitosana, NH2 e OH, permitem diversas alterações estruturais as
quais são responsáveis por mudanças no desempenho das propriedades físico-químicas do
polímero e expansão dos seus campos de aplicação (Alves e Mano, 2008; Casettari, Vllasaliu
et al., 2012; Chen, Mi et al., 2011; Craveiro, Craveiro et al., 1999; Sashiwa e Haiba, 2004;
Kumar, 2000; Kurita, 2001; Kumirska, Weinhold et al., 2011; Mourya e Inamdar, 2008;
Philippova e Korchagina, 2012; Pillai, Paul et al., 2009; Prashanth e Tharanathan, 2007;
Rinaudo, 2006).
As modificações químicas na quitosana são baseadas na reatividade dos grupos
substituintes da sua estrutura, nos carbonos 2, 3 e 6. A reatividade desses grupos ligados aos
carbonos do anel obedece à seguinte ordem decrescente C2, C6 e C3, referentes,
respectivamente, ao grupo amino da quitosana, ao grupo hidroxila primário e ao grupo
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
30
hidroxila secundário, este último requer um agente desprotonante para tornar-se prédisponível à reação (Rinaudo, 2006; Xu, Mccarthy et al., 1996).
Na modificação química dos polímeros, a síntese pode ocorrer em condições
reacionais homogêneas ou heterogêneas. Usualmente, o meio heterogêneo é acompanhado de
diversos problemas, pode haver um menor grau de substituição, ocorrência de reação de
forma localizada apenas nos sítios acessíveis da cadeia macromolecular, menor controle de
reação e degradação parcial dos produtos provocada por condições mais severas empregadas
durante o procedimento. Sendo assim, as propriedades dos produtos obtidos por uma
modificação química podem ser bem diferentes em função da reação ocorrer em meio
homogêneo ou heterogêneo, mesmo quando todas as demais condições reacionais são
mantidas constantes (Kurita, 2001).
Há várias possibilidades de preparar derivados funcionais de quitosana, e muitos
trabalhos têm sido propostos na literatura. As modificações típicas incluem reações de
hidrólise, acetilação, carboxilação, acilação, formação de base de Schiff, sulfonação,
alquilação, quaternização, oxidação, copolimerização por graftização, dentre outras (Casettari,
Vllasaliu et al., 2012; Kurita, 2001; Philippova e Korchagina, 2012; Pillai, Paul et al., 2009;
Rinaudo, 2006).
A Figura 3.5 mostra alguns exemplos de reações possíveis para a obtenção de
derivados de quitosana (Santos, 2004). Considerando as reações químicas para modificar a
estrutura da quitosana, a aminação redutiva também denominada de N-alquilação redutiva
tem despertado interesse por ser uma reação versátil e pelo seu potencial de aplicação. O uso
dessa reação permite a inserção de grupos hidrofílicos e/ou hidrofóbicos na quitosana, que
pode melhorar a sua solubilidade e fornecer novas propriedades através dos grupos
substituintes correspondentes, porém preservando na maioria das vezes as propriedades
intrínsecas da quitosana (Kurita, 2001; Philippova & Korchagina, 2012; Rinaudo, 2006).
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31
Figura 3.5 - Reações para obtenção de derivados de quitosana
Fonte: (Santos, 2004)
A quitosana comporta-se como polímeros anfifílicos catiônicos, porém as suas
características específicas relativas aos grupos anfifílicos podem ser potencializadas através
da inserção de grupos hidrofóbicos, utilizando, por exemplo, a reação de alquilação redutiva.
Os polímeros anfifílicos são constituídos de uma cadeia hidrofílica com uma pequena
quantidade de grupos hidrofóbicos. Em meio aquoso, os grupos hidrofóbicos se associam para
minimizar o seu contato com a água, gerando agregados intra e/ou intermoleculares. Os
agregados formados pelas interações atrativas combinado com as repulsões eletrostáticas nos
polieletrólitos levam a um aumento significativo da viscosidade da solução polimérica. Os
polieletrólitos modificados hidrofobicamente têm sido usados em inúmeros processos
tecnológicos (Barany e Szepesszentgyörgyi, 2004; Bratskaya, Avramenko et al., 2006;
Desbrières, Martinez et al., 1996; Desbrières, 2004; Nyström, Kjoniksen et al., 1999;
Philippova e Korchagina, 2012).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
32
3.1.3.1 Aminação Redutiva (ou Alquilação Redutiva) da Quitosana
A reação de aminação redutiva ocorre quando o carbono da carbonila de aldeído ou
cetona sofre um ataque nucleofílico da amina primária formando o intermediário hemiaminal
ou imina, os quais, em seguida, sofrem redução para resultar em um produto N-alquila ou Narila. Uma representação para esta reação é mostrada na Figura 3.6. A formação de iminas
(C=N), base de Schiff, geralmente ocorre mais rapidamente entre pH 4 e 5, pois a reação é
processada por ataque nucleofílico do nitrogênio com caráter básico ao átomo de carbono do
grupo carbonila. A reação segue mais lentamente em pH muito baixo ou muito alto. Para
favorecer a reação, a solução deve ser suficientemente ácida para que o composto carbonílico
se encontre protonado, tornando o carbono ainda mais suscetível ao ataque do nucleófilo,
mais não tão ácida ao ponto da concentração de nitrogênio livre (nucleófilo) se tornar muito
baixa, o que dificultaria a reação (Solomons e Fryhle, 2006).
Figura 3.6 - Esquema de aminação redutiva
Aldeído
ou
Cetona
Amina
primária
Hemiaminal
Imina
Amina secundária
Fonte: (Solomons e Fryhle, 2006)
Do mesmo modo acima, podemos inserir grupos substituintes na quitosana através da
reação aminação redutiva. Nesse caso, a quitosana reage com um aldeído ou uma cetona
produzindo uma imina como intermediário, o qual é convertido em um derivado N-alquila ou
N-arila através da redução com borohidreto de sódio (NaBH4) ou cianoborohidreto de sódio
(NaCNBH3). Essa metodologia é uma alternativa importante devido à possibilidade de
funcionalizar de modo seletivo os grupos amino da quitosana em condições experimentais
brandas e obter uma distribuição dos substituintes de forma homogênea ao longo da cadeia da
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
33
quitosana (Desbrières, Martinez et al., 1996; Kurita, 2001; Rinaudo, 2006). Alguns exemplos
de quitosana modificada obtidos pela reação de aminação redutiva são apresentados a seguir
para ilustrar a diversificação de possibilidades de derivados.
Kurita (2001) relatou trabalhos das décadas de 80 e 90 sobre derivados de quitosana
por N-alquilação redutiva com substituintes que visam melhorar a solubilidade da quitosana e
aumentar a sua capacidade seletiva de adsorção por metais. Na presença de açúcares
redutores, incluindo glucose, galactose, lactose e celobiose, e cianoborohidreto de sódio
(agente redutor), a N-alquilação redutiva ocorre através da reação dos grupos amino da
quitosana e o grupo aldeído do açúcar, seja este na forma de cadeia aberta ou com o aldeído
incorporado como substituinte nos açúcares. Do mesmo modo, outros compostos que contêm
o grupo aldeído são capazes de reagir com os grupos amino da quitosana e, na presença de
agente redutor, proceder à reação de N-alquilação redutiva (Kurita, 2001).
As Figuras 3.7 e 3.8, respectivamente, mostram alguns modelos de reação de Nalquilação redutiva da quitosana, utilizando açúcares e diferentes grupos funcionais
substituídos, contudo, o grupo aldeído está presente em todos os reagentes como grupo ativo
para a reação.
Figura 3.7 - Reações de N-alquilação redutiva da quitosana com açúcares
Fonte: adaptado de (Kurita, 2001)
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
34
Figura 3.8 - Reações de N-alquilação redutiva da quitosana com diferentes grupos funcionais substituídos
Fonte: adaptado de (Kurita, 2001)
O grupo cetona também pode ser utilizado para a reação de N-alquilação redutiva da
quitosana, como é o caso da obtenção dos derivados N-carboximetilquitosana e Ncarboxibutilquitosana (Figura 3.9), mediante a utilização do ácido glioxílico e ácido
levulínico, respectivamente. Nestes casos, a reação se dá entre os grupos amino da quitosana e
o grupo cetona. De modo similar, muitos outros derivados têm sido preparados com ácidos
carboxílicos contendo um grupo cetona ou aldeído. A solubilidade desses polímeros em meio
ácido, neutro e básico é explicada pelo caráter anfótero adquirido após a reação, resultando
em derivados com ambos os grupos amino e carboxílico (Kurita, 2001).
Figura 3.9 - Reação de N-alquilação redutiva da quitosana com grupo cetona
Fonte: (Kurita, 2001)
Rinaudo e colaboradores (2001) obtiveram os derivados N-carboxibutilquitosana e N5-metilpirrolidinona quitosana utilizando o ácido levulínico. O tipo de estrutura obtida foi
diretamente dependente das condições experimentais empregadas. As variáveis avaliadas
foram a razão molar dos reagentes, o tempo de reação e o agente redutor (NaBH4 e
NaCNBH3). Os colaboradores constataram que o ácido levulínico em excesso promove a
dissolução da quitosana e favorece a derivatização da mesma. Entretanto, um grande excesso
do agente redutor degradou a cadeia polimérica. Uma adição rápida do agente redutor levou
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
35
ao derivado monocarboxilado linear, enquanto que uma adição lenta gerou a forma cíclica
(Rinaudo, Desbrières et al., 2001).
Dos Santos e colaboradores (2005) descreveram uma metodologia para otimização da
síntese da carboxibutilquitosana através do planejamento fatorial 32. Esse estudo verificou,
que ao utilizar as proporções molares entre 1 e 3 mol de ácido levulínico por mol de quitosana
e 0,5 a 1 mol de borohidreto de sódio por mol de quitosana, o aumento da concentração molar
de ácido levulínico favoreceu a formação da N-carboxibutilquitosana, enquanto que o
aumento da concentração do agente redutor favoreceu a ciclização do grupo carboxílico para a
formação da 5-metilpirrolidinona quitosana (Dos Santos, Silva et al., 2005).
Mais recentemente, Kurita e Isogai (2010), utilizando acetona e ácido levulínico como
reagentes para a obtenção dos derivados de quitosana N-isopropil e 5-metil-pirrolidinona,
respectivamente, alcançaram um GS maior em meio reacional aquoso com pH inicial entre
4,5 e 5,0 e temperatura ambiente. Além disso, nenhuma despolimerização ocorreu na
quitosana sob as condições usadas na reação de N-alquilação redutiva (Kurita e Isogai, 2010).
Para melhorar a afinidade da quitosana por solventes orgânicos, Kurita e
colaboradores (2002) prepararam, inicialmente, bases de Schiff através da reação dos grupos
amino da quitosana com os aldeídos formaldeído, acetaldeído e pentaldeído. As bases de
Schiff foram reduzidas com NaCNBH3 para formar N-alquilquitosanas. Estes derivados foram
posteriormente acetilados com anidrido acético visando aumentar o grau de grupos acetamido
na cadeia polimérica. O grau de substituição foi calculado por análise elementar utilizando a
relação C/N e variou de acordo com a quantidade de aldeído utilizado. O aumento de grupos
hidrofóbicos na cadeia da quitosana favoreceu a interação com solventes orgânicos (Kurita,
Mori et al., 2002).
Desbrières e colaboradores (1996, 2004) modificaram hidrofobicamente a quitosana e
estudaram as suas propriedades em solução. Segundo a reação de N-alquilação redutiva, a
quitosana e aldeídos alifáticos com três a doze carbonos (C3, C6, C8 e C12) foram processados
em meio homogêneo através da diluição da quitosana em solução de ácido acético, a fim de
garantir uma substituição bem distribuída ao longo das cadeias do polímero. O agente redutor
usado foi o NaCNBH3 e a caracterização da estrutura química dos polímeros sintetizados foi
obtida por RMN 1H. Os principais fatores que influenciaram as interações hidrofóbicas das
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
36
amostras poliméricas em solução foram a natureza e o número de sítios hidrofóbicos, a
concentração do polímero, a temperatura e a força iônica do meio (Desbrières, Martinez et al.,
1996; Desbrières, 2004).
Donati e colaboradores (2005) reportaram propriedades biológicas da quitosana
modificada por N-alquilação redutiva com a inserção de lactose. As proporções molares
utilizadas na reação foram 0,8 e 2,5 de lactose, 2 e 6 de NaCNBH3 por unidade repetitiva de
quitosana, os colaboradores conseguiram obter derivados com grau de substituição (GS) 9 e
64 %, respectivamente. A inserção de grupos flexíveis e hidrofílicos levou a uma diminuição
da viscosidade intrínseca do polímero. No entanto, os colaboradores asseguraram que o
procedimento de derivatização não induziu a degradação da cadeia polimérica, mesmo
utilizando excesso de agente redutor (Donati, Stredanska et al., 2005).
Ngimhuang e colaboradores (2004) obtiveram derivados de quitosana com
propriedades surfactantes e potencial aplicabilidade no controle e liberação de espécies
bioativas. Os colaboradores empregaram a reação de N-alquilação redutiva da quitosana
utilizando o composto 3-O-dodecil-D-glucose pré-sintetizado (Figura 3.10). Esses derivados
foram obtidos com valores de GS 9,8 e 27 %, sendo solúveis em meio aquoso e em solventes
orgânicos. O derivado com menor GS obteve maior solubilidade em água. Entretanto, o
derivado com maior GS proporcionou maior estabilidade para a formação de micelas em
solução aquosa de ácido acético 0,1 %. Esse resultado sugeriu que o balanço
hidrofílico/hidrofóbico na estrutura da quitosana é essencial para a sua solubilidade em água,
e um GS mais elevado de grupos hidrofóbicos na cadeia macromolecular facilita a agregação
em micelas (Ngimhuang, Furukawa et al., 2004).
Figura 3.10 - Reação de N-alquilação redutiva da quitosana com 3-O-dodecil-D-glucose
Fonte: (Ngimhuang,
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
Furukawa et al., 2004)
37
No mesmo segmento com propriedades de surfactantes através da N-alquilação
redutiva, Mai-Ngam (2006) obteve derivados de quitosana com atividade bactericida. O autor
inseriu grupos hidrofóbicos na cadeia da quitosana utilizando aldeído alifático com seis
carbonos e, simultaneamente, introduziu grupos hidrofílicos usando poli(óxido de etileno)
com um grupo terminal aldeído. A incorporação das cadeias hidrofóbicas (C6),
aparentemente, induziu as agregações moleculares, enquanto que as cadeias laterais dos
grupos hidrofílicos facilitaram a solubilização no meio aquoso e funcionaram como uma
barreira, prevenindo a adesão de bactérias na superfície de silicone (Mai-Ngam, 2006).
A reação de N-alquilação redutiva da quitosana com dialdeídos forma polímeros com
ligações cruzadas. Essa reação ocorre entre dois grupos amino da quitosana com apenas uma
molécula de dialdeído envolvendo ambos os grupos aldeídos da molécula, resultando na
reticulação, um sistema de rede tridimensional que, nesse caso, são interligados por dois
grupos N-alquil, quando em presença de agente redutor para a redução dos grupos imino préformados (Figura 3.11).
Figura 3.11 - Representação de ligações cruzadas na quitosana
Fonte: Autor
O glutaraldeído é um dialdeído muito utilizado para obter quitosana com ligações
cruzadas. Segundo a literatura, as reações envolvendo quitosana e glutaraldeído formam
estruturas complexas e, geralmente, três estruturas distintas podem ser consideradas: (a)
conversão de apenas um grupo aldeído do glutaraldeído à imina, ficando o outro grupo
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
38
aldeído livre, sendo comumente usado em reações subseqüentes; (b) formação de ligações
cruzadas entre moléculas livres do glutaraldeído e a quitosana e (c) formação de ligações
cruzadas entre moléculas maiores de glutaraldeído polimerizado (contendo ligações C=C) e a
quitosana (Monteiro Jr. e Airoldi, 1999).
Ramos e colaboradores (2006) prepararam derivados de quitosana com ligações
cruzadas utilizando poli(etileno glicol) ligados a grupos aldeído nos dois extremos da cadeia
(OHC-PEG-CHO). Inicialmente, a quitosana foi modificada para quitosana-N-metilfosfônica
(NMPC). Em seguida, realizou-se a N-alquilação redutiva com o PEG-dialdeído de massas
molares diferentes (200, 2000, 8000 g/mol) e o NaBH4 (agente redutor). A modificação
produziu o inchamento do derivado de quitosana em água (pH neutro e alcalino) e foi solúvel
em pH ácido. O grau de substituição foi de 9, 3 e 2 % para os derivados de quitosana-PEG200, 2000 e 8000, respectivamente. O aumento da cadeia hidrofílica (PEG) elevou a absorção
de água do polímero, no entanto, a retenção de água em função do tempo foi diminuída
(Ramos, Rodríguez et al., 2006).
Hoven e colaboradores (2007) modificaram a superfície de filmes de quitosana com
grupos sulfonato, carregados negativamente, reagindo os grupos amino da quitosana com o
grupo aldeído, substituinte do ácido furano-2-sulfônico. A reação ocorreu à temperatura
ambiente e as amostras foram reduzidas com NaBH4 (Figura 3.12). A extensão da
modificação da superfície da quitosana em meio heterogêneo foi resultante da variação do
tempo de reação e da concentração dos reagentes. Os filmes da quitosana modificada
exibiram propriedades de adsorção seletiva por proteínas. A adsorção foi explicada em função
das interações de atração e repulsão eletrostática (Hoven, Tangpasuthadol et al., 2007).
Figura 3.12 - Reação de N-alquilação redutiva na superfície da quitosana
Fonte: adaptado de (Hoven, Tangpasuthadol et al., 2007)
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Renbutsu e colaboradores (2007) prepararam derivados de quitosana usando aldeídos
fotossensíveis como grupos laterais inseridos na quitosana por N-alquilação redutiva (Figura
3.12). Durante a redução das bases de Schiff, parte dos grupos ésteres dos derivados
assinalados (*) na Figura 3.13 sofre hidrólise quando utilizado o agente redutor NaBH4.
Entretanto, esse comportamento não ocorreu quando foi usado NaCNBH3. Os demais
derivados resistiram às condições de pH alto com a utilização de NaBH4, como agente
redutor. Os derivados de quitosana foram transformados em gel quando submetidos à
irradiação ultravioleta e alcançaram melhor solubilidade em solventes orgânicos do que a
quitosana não modificada. Esses compostos apresentaram boa capacidade de adsorção de
paládio em pH ácido, sendo útil para imobilizar catalisadores de paládio, também tiveram
êxito como material de revestimento para galvanização, sem uso de eletrodos, em substâncias
não condutoras (Renbutsu, Okabe et al., 2007, 2008).
Figura 3.13 - Reação de N-alquilação redutiva com aldeídos fotossensíveis
*
*
Fonte: adaptado de (Renbutsu, Okabe et al., 2007)
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
40
Concernente aos derivados de quitosana obtidos por aminação redutiva, maior atenção
tem sido dada à ênfase da síntese de quitosana com substituintes N-alquila. No entanto, os
derivados N-arila também apresentam propriedades e aplicações importantes, conforme visto
acima. Sajomsanga e colaboradores (2008) investigaram a influência dos grupos doadores de
elétrons e retiradores de elétrons substituídos em aldeídos aromáticos na síntese de Narilquitosana através da aminação redutiva. O grau de substituição foi dependente da razão
molar entre o aldeído e as unidades amino da quitosana, do tempo de reação e do substituinte
no anel aromático. Os polímeros apresentaram um grau de substituição menor quando foram
utilizados os aldeídos aromáticos com substituintes doadores de elétrons (Sajomsanga,
Tantayanon et al., 2008).
Rabea e colaboradores (2006) obtiveram quitosana com substituintes N-alquila e Narila que apresentaram atividades fungicidas e inseticidas superiores a da própria quitosana.
Em pesquisas mais recentes (2009), os resultados mostraram que a modificação química da
quitosana com os aldeídos aromáticos aumentou a atividade biológica contra bactérias e
fungos patogênicos de plantas. Estes resultados trazem perspectivas de que os derivados de
quitosana têm potencial de tornarem-se alternativas para o controle das doenças em plantas,
em vez de alguns pesticidas nocivos (Rabea, Badawy et al., 2006, 2009).
Em estudos referentes à quitosana modificada por N-alquilação redutiva, publicamos
em 2009 um artigo que relata a obtenção de derivados de quitosana usando glutaraldeído e 3amino-1-propanol na presença de borohidreto de sódio. A modificação na estrutura da
quitosana resultou em derivados com ação viscosificante. A solubilidade dos polímeros em
solução aquosa ácida diminuiu com o aumento da razão molar de glutaraldeído e 3-amino-1propanol em relação à quitosana. O agente redutor e a atmosfera inerte no meio reacional
contribuíram para aumentar a solubilidade e a viscosidade da solução polimérica (Alves,
Vidal et al., 2009).
Os desafios para superar as limitações de solubilidade da quitosana em meio aquoso,
em uma ampla faixa de pH, têm despertado muito interesse de pesquisadores. Considerando
as metodologias que podem promover esse efeito, a graftização de grupos hidrofílicos na
cadeia da quitosana mostra-se como um método favorável. Nesse sentido, o poli(etileno
glicol), PEG, destaca-se como uma alternativa importante para a graftização da quitosana e
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
41
uma das formas de inserir o PEG é através da reação de N-alquilação redutiva (Casettari,
Vllasaliu et al., 2012).
3.1.3.2 QUITOSANA-g-PEG
PEG é um polímero sintético com fórmula estrutural H-(O-CH2-CH2)n-OH, onde n é o
número médio de unidades repetidas, óxido de etileno, na estrutura química. Comercialmente,
ele é encontrado em uma grande variedade de massas moleculares. É um polímero solúvel em
água e em solventes orgânicos como acetona e etanol, sendo insolúvel em éter e
hidrocarbonetos alifáticos. PEG é um polímero muito utilizado como produto farmacológico
devido à sua biocompatibilidade, também é usado como agente dispersante (Abdel-Mohsen,
Aly, et al., 2012; Casettari, Vllasaliu et al., 2012; Gorochovceva, Naderi et al., 2005).
Para a obtenção de quitosana ramificada com PEG (quitosana-g-PEG), as hidroxilas
terminais do PEG devem ser modificadas para um grupo funcional mais reativo que permita a
funcionalização nos grupos amino ou hidroxilas da quitosana. A ativação do PEG pode ser
obtida com diferentes funções químicas, tais como aldeído, ácido carboxílico, epóxido,
tosilato, carbonato de p-nitrofenila, sulfonato, azida, maleimida e éster succinimida (Casettari,
Vllasaliu et al., 2012; Gorochovceva, Naderi et al., 2005). Quando o PEG com a função
hidroxila bifuncional nas extremidades da sua cadeia é ativado para modificar a estrutura da
quitosana, ocorre reticulação entre as cadeias e produto final reticulado tem a sua solubilidade
reduzida em meio aquoso. Assim, o análogo monofuncional metóxi-poli(etileno glicol),
mPEG, que apresenta uma metila e uma hidroxila como grupos terminais tem sido utilizado
em vez do PEG para modificar a quitosana, pois evita a formação de ligações cruzadas
durante a modificação química (Abdel-Mohsen, Aly, et al., 2012; Bentley, Roberts, et al.,
1998; Casettari, Vllasaliu et al., 2012; Gorochovceva, Naderi et al., 2005; Hu, Jiang et al.,
2005; Jeong, Kim et al., 2008; Yao, Zhang et al., 2007; Zhang, Zhang et al., 2008).
A reação de alquilação redutiva tem sido bastante empregada para a obtenção de
quitosana-g-mPEG, pois várias vantagens envolvem o uso dessa metodologia (AbdelMohsen, Aly, et al., 2012; Bentley, Roberts, et al., 1998; Du e Hsieh, 2007; Gorochovceva,
Naderi et al., 2005; Muslim, Morimoto et al., 2001; Sugimoto, Morimoto et al., 1998; Yao,
Zhang et al., 2007; Zhang, Zhang et al., 2008). A seletividade da reação com substituição
prioritária ao grupo amino da quitosana, as condições reacionais de forma branda, sistema
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
42
aquoso, pH da solução não agressivo (pH 5-6) e temperatura ambiente. Além disso, a reação
ocorre em sistema homogêneo. A modificação química realizada em condições homogêneas
evita uma distribuição não uniforme das unidades substituintes na cadeia da macromolécula
(Casettari, Vllasaliu et al., 2012; Desbrières, Martinez, et al., 1996; Kurita, 2001; Rinaudo,
2006).
O processo de modificação da quitosana com PEG por alquilação redutiva inicia com
a oxidação da hidroxila terminal do PEG para a função aldeído. Após a reação, o PEG-aldeído
obtido é separado por (re)precipitações em solventes orgânicos, filtrações e secagem, para
posterior inserção na quitosana (Abdel-Mohsen, Aly, et al., 2012; Bentley, Roberts, et al.,
1998; Du e Hsieh, 2007; Gorochovceva, Naderi et al., 2005; Muslim, Morimoto et al., 2001;
Sugimoto, Morimoto et al., 1998).
Em geral, a síntese de quitosana-g-mPEG através da alquilação redutiva resulta em
copolímeros com baixo grau de substituição. Porém, a maioria das outras metodologias de
reação usada para aumentar o grau de incorporação de PEG na cadeia polimérica da quitosana
é complexa. Muitos métodos utilizam várias etapas de reação, seja através da inserção de
grupos protetores, a fim de obter quimioseletividade, ou na elaboração de PEG ativado com
grupos funcionais mais reativos. Recursos como catalisadores também são utilizados, mais
removê-los do produto final torna-se dificultoso (Abdel-Mohsen, Aly, et al., 2012; Casettari,
Vllasaliu et al., 2012; Sugimoto, Morimoto et al., 1998). No entanto, a obtenção de quitosanag-PEG com baixo grau de substituição de elevada massa molar de mPEG favorece a
solubilidade em água e pode manter mais facilmente a estrutura da quitosana preservada,
conservando importantes propriedades peculiar a natureza original. Nesse caso, um baixo grau
de substituição na quitosana torna-se uma vantagem (Sugimoto, Morimoto et al., 1998).
Gorochovceva e colaboradores (2005) avaliaram alguns processos de oxidação do
mPEG (massa molar 2000) para obtenção de mPEG-aldeído, em seguida, procederam a
graftização na quitosana por alquilação redutiva. A oxidação foi realizada por procedimentos
químico e enzimático, o primeiro método foi baseado em dimetilsulfóxido (DMSO) com
cloreto de ácido oxálico e anidrido acético (Ac2O). Também foi utilizado o reagente oxidante
N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina (radical TEMPO), usando o hipoclorito de sódio (NaClO)
e o [bis(acetóxi)iodobenzeno] conhecido como BIAB. A metodologia enzimática empregou a
enzima álcool oxidase, porém houve desnaturação da enzima durante a reação, causando a
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
43
conversão mais desfavorável. O uso do sistema TEMPO/BIAB resultou em oxidação
excessiva, formando produto bifuncional que promove quitosana reticulada. Os melhores
resultados foram obtidos com DMSO/cloreto de ácido oxálico, entretanto a temperatura de
reação é muito baixa (30 °C negativo). O percentual de conversão alcançou 30 a 54 % para o
uso de TEMPO/NaClO e DMSO/Ac2O (Gorochovceva, Naderi et al., 2005).
Mais recentemente, Abdel-Mohsen e colaboradores (2012) estudaram a oxidação do
mPEG através do DMSO com anidrido acético. As variáveis investigadas foram a razão molar
dos reagentes (Ac2O/OH do mPEG - massa molar 2000), o tempo de reação e o volume do
solvente (DMSO). A Figura 3.14 exibe os resultados das variáveis estudas (Abdel-Mohsen,
Aly, et al., 2012).
Figura 3.14 – a) Relação entre razão molar Ac2O/OH mPEG e teor de aldeído de mPEG; b) Efeito do tempo de
reação e teor de aldeído; c) Efeito de DMSO e teor de aldeído de mPEG; (T 22 °C; DMSO 30 mL - a, c; tempo
de reação 9 h - a, c; razão molar 20 - b, c
Fonte: (Abdel-Mohsen, Aly et al., 2012)
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
44
Sugimoto e colaboradores (1998) investigaram a graftização de PEG através da Nalquilação redutiva na quitosana, considerando as variáveis reacionais. A solubilidade dos
produtos no meio aquoso em maiores faixas de pH foi dependente da massa molar de PEG, do
grau de substituição e do grau de acetilação da quitosana (Sugimoto, Morimoto et al., 1998).
Em geral, a literatura relata baixos valores de grau de substituição para obtenção de
quitosana-g-mPEG, embora, derivados análogos com mPEG (massa molar 2000) foram
obtidos com grau de substituição elevado. Além disso, um alto porcentual de conversão foi
obtido em 5 minutos do início de reação (temperatura de reação foi 55 °C, tempo de reação 6
h). A dificuldade de separação e purificação desses polímeros foi superada utilizando salting
out com sulfato de amônio. Entretanto, as amostras de baixa massa molar apresentaram baixo
rendimento devido à perda do polímero no processo de lavagem com acetona. A solubilidade
dos derivados em água foi maior com o aumento do grau de substituição (Gorochovceva,
Naderi et al., 2005).
Gorochovceva e colaboradores (2005) avaliaram as amostras de quitosana-g-mPEG e
do precursor, em solução salina e faixa de pH 5-6, em função das propriedades de adsorção
em sílica. Os polímeros, que apresentaram ambas as interações eletrostática (grupos amino
protonados - cargas positivas) e ligação de hidrogênio (cadeias de mPEG - grupos
hidrofílicos) com a superfície da sílica (cargas negativas), tiveram maior adsorção sobre a
superfície da sílica (carregada negativamente). No entanto, com o aumento do grau de
substituição de mPEG na estrutura da quitosana, os polímeros foram mais facilmente
desorvidos, quando submetidos à lavagem com solução salina, devido ao impedimento
estérico que inibiu a fixação do polímero na superfície plana da sílica (Gorochovceva, Naderi
et al., 2005).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
45
3.1.4 Estudo das Propriedades Físico-Químicas
O uso da quitosana está principalmente relacionado com sistemas em soluções aquosas
e, portanto, existe uma necessidade de compreender o seu comportamento em tal meio. Em
alguns casos, as cadeias da quitosana em solução encontram-se como macromoléculas
individuais (cadeias livres), em outros, como agregados. As propriedades físico-químicas das
soluções de quitosana e de seus derivados influenciam diretamente as suas aplicações
(Philippova e Korchagina, 2012).
A quitosana em solução aquosa ácida comporta-se como um polieletrólito catiônico
anfifílico, portanto as suas propriedades dependem da relação entre as interações hidrofílicas e
hidrofóbicas. Estas interações podem ocorrer entre os segmentos da mesma cadeia ou das
diferentes cadeias da quitosana; e entre os segmentos da cadeia polimérica e as moléculas de
solvente ou substâncias adicionadas ao sistema. Estas interações dependem essencialmente do
potencial eletrostático do polímero em solução (Domard, 2011).
As propriedades físico-químicas das soluções de quitosana e dos derivados estão
associadas às interações intra e intermoleculares. Estas interações são dependentes da
natureza do polímero e dos parâmetros de solução, tais como o grau médio de carga no
polímero e sua distribuição ao longo das cadeias, massa molar, pH da solução, concentração
de polímero, temperatura e força iônica do meio, entre outros. Todos estes fatores são
importantes para o estudo das propriedades da quitosana em solução (Chiu, Chen et al., 2009;
Domard, 2011; Kumirska, Weinhold et al., 2011; Nyström, Kjoniksen et al., 1999; Philippova
e Korchagina, 2012; Philippova, Korchagina et al., 2012).
A dependência entre as interações moleculares e as propriedades físico-químicas de
derivados de quitosana com relação às aplicações pode ser exemplificada pelos resultados da
pesquisa de Main-gam (2006). A estrutura da quitosana foi modificada quimicamente
utilizando o poli(óxido de etileno) e hexanal, grupos hidrofílicos e hidrofóbicos,
respectivamente. O balanço entre a composição hidrofílica e hidrofóbica proporcionou
propriedades surfactantes e foram utilizados como agentes modificadores de superfície de
silicone. As cadeias hidrofóbicas promoveram agregações intermoleculares e as espécies
laterais hidrofílicas, em maior proporção, melhoraram a solubilidade em meio aquoso e
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
46
atuaram como uma barreira, impedindo a adesão e o crescimento de bactérias na superfície de
silicone, portanto atuando como bactericida (Mai-Ngam, 2006).
Várias técnicas são empregadas para avaliação do comportamento das propriedades
físico-químicas da quitosana em solução aquosa. Dentre os métodos usuais, mencionaremos
reologia, espalhamento de luz dinâmico (DLS), espalhamento de raios-X a baixos ângulos
(SAXS) e potencial zeta (  ). Através dessas técnicas podemos obter informações sobre o
comportamento
reológico,
viscosidade,
tamanho
de
partículas,
agregações
das
macromoléculas e estabilidade da partícula em solução. A seguir, serão abordadas algumas
contribuições dessas técnicas na caracterização das propriedades da quitosana e derivados.
3.1.4.1 REOLOGIA
A Reologia consiste no estudo do escoamento ou deformação dos materiais quando
submetido a uma tensão. Os materiais poliméricos apresentam ambas as propriedades de
líquidos (comportamento viscoso) e sólidos (comportamento elástico), por essa razão são
chamados de viscoelásticos. O estudo reológico de polímeros em solução permite avaliar as
propriedades relacionadas à estrutura macromolecular em solução. Através de medidas de
viscosidade (medida da resistência de um material à fluência) de soluções poliméricas é
possível caracterizar as estruturas e as propriedades dos polímeros. Podemos obter, por
exemplo, informações a respeito das dimensões da cadeia, do formato e tamanho da partícula
de polímero (volume hidrodinâmico), da massa molar, do comportamento de fluxo.
Diversos parâmetros afetam a viscosidade das soluções das macromoléculas,
especialmente, a concentração de polímero, a massa molar, a natureza do polímero, as
características do solvente e a temperatura. Geralmente, a preparação da amostra para os
ensaios viscosimétricos também interfere nos resultados das medidas de viscosidade das
soluções poliméricas. Dependendo do tipo de procedimento adotado, tais como filtração e
centrifugação das soluções, pode-se ter adsorção física e/ou química do material a ser
analisado ou a eliminação de moléculas maiores que irão refletir diretamente nos resultados
(Kulicke e Clasen, 2004).
Para avaliar as propriedades físicas de uma solução polimérica que é dependente da
concentração de polímero, segundo a literatura, existem três regimes dinâmicos de
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
47
concentração para uma solução polimérica: sistema diluído, semidiluído (semiconcentrado) e
concentrado. Considerando os regimes de concentração de polímero em solução, um
parâmetro de interesse é a concentração crítica do polímero (C* - overlap concentration). Esta
concentração crítica marca uma transição de uma solução diluída para uma solução mais
concentrada (Cho, Heuzey et al., 2006; Kulicke e Clasen, 2004). A Figura 3.15 exemplifica
um esquema da concentração crítica e dos regimes de concentração de uma solução
polimérica.
Figura 3.15 - Representação dos regimes de concentração de polímero em solução e da concentração
crítica (C*)
C < C*
Solução diluída
C*
Concentração crítica
C > C*
Solução semidiluída
Basicamente, a diferença entre os regimes está relacionada às interações das
macromoléculas em solução. Pode-se definir o regime diluído como sendo um sistema em que
a probabilidade de existir interação entre as macromoléculas em solução é muito pequena,
pois as cadeias do polímero estão isoladas umas das outras no solvente. Na transição deste
regime para soluções mais concentradas, o sistema passa por uma concentração intermediária,
sendo esta denominada de concentração crítica. Essa transição é acompanhada de grandes
mudanças nas propriedades de fluxo de um polímero em solução. Em concentrações acima de
C*, o comportamento de fluxo é determinado pelas interações intermoleculares, já que nesse
meio ocorrem entrelaçamentos dos novelos poliméricos (Cho, Heuzey et al., 2006; Kulicke e
Clasen, 2004).
A viscosidade de uma solução polimérica está relacionada com a dimensão da
molécula do polímero e as interações existentes entre as partículas do sistema, ou seja,
interações polímero-polímero e polímero-solvente. Em geral, as espécies poliméricas com
massas molares maiores estão associadas às soluções mais viscosas, assim como, maiores
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
48
concentrações de polímero em solução proporcionam viscosidades mais elevadas. Estes
efeitos são devidos às interações intermoleculares (Sorbie, 1991).
Em concentrações diluídas de polímero, as interações polímero-polímero são
reduzidas, permitindo medir as interações polímero-solvente. Essas medidas fornecem
informações a respeito das dimensões da cadeia, do formato e tamanho da partícula do
polímero (volume hidrodinâmico) em solução. Os termos viscosimétricos relacionam,
principalmente, à contribuição do soluto no incremento de viscosidade do solvente. Na
maioria das vezes, os experimentos são realizados em viscosímetros capilares e
fundamentam-se no tempo de escoamento do solvente e da solução (Kulicke e Clasen, 2004).
A viscosidade pode ser expressa de diversas formas, tais como viscosidade relativa, r,
específica, sp, reduzida, red, inerente, inh, e intrínseca, []. A maioria das relações que
exprimem a viscosidade é dependente da concentração (C). No entanto, a viscosidade
intrínseca é uma expressão independente da concentração, isto é, a viscosidade é expressa
através da extrapolação da concentração quando C→0, sendo muito importante para
relacionar ao tamanho da molécula do polímero, bem como correlacionar com a massa molar.
Expressões de viscosidades são definidas na Tabela 3.1 (Kulicke e Clasen, 2004; Sorbie,
1991).
Tabela 3.1. Expressões de viscosidade.
Viscosidade
Fórmula
r 
Relativa
Específica
 sp 

t

0 t0
(   0 )
0

Reduzida
 red 
Inerente
 inh 
Intrínseca
(t  t 0 )
 r 1
t0
 sp
C
ln  r
C
sp
 liminh
C 0 C
C 0
[ ]  lim
t: tempo de escoamento da solução de polímero; t0: tempo de escoamento do solvente.
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49
Equações matemáticas para a determinação da viscosidade intrínseca de um polímero
em solução estão disponíveis na literatura. Em sistemas diluídos as equações empíricas
expressam uma região linear, desde que as interações polímero-polímero sejam minimizadas.
Nestes casos, as equações podem ser empregadas para obtenção da viscosidade intrínseca. As
relações mais usualmente utilizadas são: Equação de Huggins (Equação 3.5), Equação de
Kraemer (Equação 3.6) e Equação de Schulz-Blaschke (Equação 3.7) (Kulicke e Clasen,
2004).
sp
C
=   + K H   C
2
lnr
2
=   + K K   C
C
sp
C
=   + ΚSB  sp
(3.5)
(3.6)
(3.7)
Em que, sp é a viscosidade específica, sp/C é a viscosidade reduzida, r é a
viscosidade relativa, lnr/C é a viscosidade inerente, [] é a viscosidade intrínseca, C é a
concentração da solução e KH, KK e KSB são as constantes de Huggins, Kraemer e SchulzBlaschke, respectivamente.
As equações matemáticas citadas exprimem uma relação gráfica da viscosidade em
função da variação da concentração. Para as equações de Huggins, Kraemer e SchulzBlaschke, a viscosidade intrínseca é o coeficiente linear da reta, determinada pela
extrapolação dos dados da viscosidade quando C→0, e as respectivas constantes são obtidas a
partir do coeficiente angular da reta e da viscosidade intrínseca.
De acordo com a literatura, as constantes de Huggins e Kraemer são adequadas para
avaliar a qualidade do solvente. KH é considerado um parâmetro relacionado às interações
polímero-solvente. Resultados experimentais indicam que para alta afinidade entre polímero e
solvente, atribuindo boa solvatação, KH varia de 0,25 a 0,5. Do mesmo modo, valores
negativos de KK são atribuídos a bons solventes e valores positivos sugerem maus solventes
(Delpech, Coutinho et al., 2002). Diferentemente dos polímeros flexíveis, os polissacarídeos
possuem estruturas mais rígidas e, por isso, os valores de KH, normalmente, são mais
elevados.
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50
Dentre os parâmetros que influenciam a viscosidade das soluções de polímeros em
geral, já mencionados, os polieletrólitos também são afetados por outros fatores, tais como o
grau de dissociação dos grupos iônicos, a força iônica do meio e o pH da solução (Cho,
Heuzey et al., 2006; Kulicke e Clasen, 2004).
Considerando a estrutura da quitosana como um polieletrólito catiônico em meio
aquoso ácido, os grupos amino protonados ocasionam repulsão eletrostática entre as cadeias
do policátion, resultando na expansão das cadeias poliméricas. Em soluções de polieletrólitos,
em geral, conforme o grau de dissociação aumenta, na presença de um bom solvente, o
volume do polímero em solução torna-se maior, aumentando a viscosidade da solução.
Entretanto, em solução diluída, a adição de uma quantidade limite de sal de baixa massa
molar à solução do polieletrólito, o efeito das interações repulsivas é reduzido, devido à
blindagem das cargas positivas pelos íons de carga oposta, reduzindo o volume da molécula e,
consequentemente, diminuindo a viscosidade da solução (Cho, Heuzey et al., 2006; Qun e
Ajun, 2006; Rinaudo, Pavlov et al., 1999).
A dependência entre as condições de análise (solvente, temperatura) e a dimensão da
cadeia do polímero em solução fornece diferentes valores da constante de Huggins. Desbrères
e colaboradores (1996) relataram um valor de KH = 0,7 para a quitosana em solução aquosa de
ácido acético 0,3 M/acetato de sódio 0,05 M, a 20 ºC. Desbrères (2004) reportou KH = 0,45
para a quitosana no mesmo solvente citado acima, mas na temperatura de 25 ºC (Desbrères,
Martinez et al., 1996; Desbrères, 2004). Cho e colaboradores (2006) demonstraram o efeito da
força iônica do meio na constante de Huggins para a quitosana a 25 ºC. Para soluções aquosas
de ácido acético 0,5 M, KH = 0,28; de ácido acético 0,5 M/acetato de sódio 0,1 M, KH = 0,44;
ácido acético 0,5 M/acetato de sódio 0,1 M/cloreto de sódio 0,3 M, KH = 0,66. A solubilidade
da quitosana diminuiu em função do aumento da força iônica (Cho, Heuzey et al., 2006).
A medida da viscosidade intrínseca também pode ser utilizada para a determinação da
massa molar média e para estimar a concentração crítica. De modo prático, a concentração
crítica pode ser determinada pelo recíproco da viscosidade intrínseca (C*  1/[]), entretanto,
em muitos casos, C* encontra-se na faixa de 0,5/[] a 2/[] (Desbrères, 2002).
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51
A viscosidade intrínseca está relacionada à massa molar viscosimétrica média dos
polímeros através da relação matemática descrita pela Equação de Mark-Houwink-Sakurada
(Equação 3.8). Esta equação é somente utilizada para polímeros lineares (Kulicke e Clasen,
2004).
  = K  ×  MV 
α
(3.8)
Em que, [] é a viscosidade intrínseca, K[] e  são constantes dependentes do sistema
polímero-solvente e da temperatura, Mv é a massa molar viscosimétrica média.
As constantes K[] e  são estabelecidas para um dado sistema polímero-solventetemperatura e uma vez determinadas, a massa molar de outras amostras do mesmo polímero
pode ser obtida, necessitando apenas o conhecimento da viscosidade intrínseca nas mesmas
condições.
De acordo com Gorochovceva e colaboradores (2005), a viscosidade intrínseca de
quitosana-g-mPEG foi inversamente proporcional ao GS, embora não tenha ocorrido
degradação da cadeia polimérica. A diminuição da viscosidade com o aumento de mPEG
(massa molar 2000) nos copolímeros foi atribuída às propriedades do mPEG, já que a
quitosana apresentou maior viscosidade em comparação com os derivados e o mPEG. O
aumento do GS das amostras favoreceu a solubilidade em água. Em meio aquoso as cadeias
longas de mPEG são hidratadas, inibindo as associações intermoleculares através de
impedimento estérico (Gorochovceva, Naderi et al., 2005).
A definição de viscosidade de um fluido por Newton é a resistência ao deslizamento
de suas moléculas devido à fricção interna e, quanto maior o grau de fricção interna de um
fluido, maior é a sua viscosidade. Segundo o modelo de duas placas paralelas, de áreas A,
separadas por uma distância h, movimentadas através da aplicação de uma força F (Figura
3.16). A força requerida por unidade de área (F/A) para manter uma diferença de velocidade
entre as placas (dv/dx) é diretamente proporcional ao gradiente de velocidade através do
líquido. Assim, o coeficiente de proporcionalidade é igual à viscosidade () Equação 3.9. A
força por unidade de área é conhecida como tensão de cisalhamento () e o gradiente de
velocidade é conhecido como taxa de cisalhamento (). A lei de Newton da viscosidade pode
ser expressa pela Equação 3.10 (Ferreira, Brandão et al., 2005).
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52
Figura 3.16 – Modelo de placas paralelas: escoamento de fluido de Newton
Fonte: (Ferreira, Brandão et al., 2005)
F
dv
=
A
dx
=
σ
γ
(3.9)
(3.10)
O comportamento de fluxo de soluções é resultado das propriedades do fluido e pode
ser observado através de medidas de viscosidade ou de tensão () em função da taxa de
cisalhamento (). A avaliação e o controle destas propriedades são requisitos essenciais para a
seleção de um material em muitas aplicações industriais (Schramm, 2006).
De acordo com a classificação do comportamento reológico, os fluidos cuja
viscosidade não depende da taxa de cisalhamento são chamados de newtonianos. Os sistemas
em que a viscosidade é dependente da taxa de cisalhamento são denominados fluidos nãonewtonianos. Dependendo do comportamento da viscosidade, os fluidos podem ser
pseudoplásticos, neste caso, as curvas apresentam diminuição da viscosidade com o aumento
da taxa de cisalhamento, e dilatantes, para os fluidos em que a viscosidade aumenta em
função do aumento da taxa de cisalhamento. Também existem os sistemas que dependem do
limite de escoamento, que são designados de fluidos plásticos e pseudoplásticos com limite de
escoamento. Curvas de tensão e viscosidade em função da taxa de cisalhamento são
frequentemente utilizadas para expressar o comportamento reológico de soluções poliméricas
(Figura 3.17) (Schramm, 2006).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
53
Figura 3.17 - Curvas de tensão (a) e viscosidade (b) versus taxa de cisalhamento para os fluidos newtonianos,
pseudoplásticos e dilatantes
(a)
(b)
Fonte: (Schramm, 2006)
Propriedades reológicas foram avaliadas por Yang e colaboradores (2002) para
derivados de quitosana preparados por N-alquilação redutiva com monossacarídeos e
dissacarídeos. O comportamento de fluxo dos compostos em solução mudou de newtoniano
para pseudoplástico com o aumento da concentração dos derivados ou a diminuição do GS. O
efeito do pH e da força iônica na viscosidade das soluções poliméricas foi atenuado com o
aumento do GS (Yang, Chou et al., 2002).
Os polímeros hidrofobicamente modificados, também denominados de polímeros
associativos, apresentam um comportamento de viscosidade que está relacionado às
associações intra/intermoleculares entre os microdomínios hidrofóbicos em solução em
função da concentração de polímero. Pesquisas têm mostrado que em condições de alto
cisalhamento, as interações hidrofóbicas podem ser desfeitas, resultando na diminuição da
viscosidade. No entanto, a baixas taxas de cisalhamento, as associações hidrofóbicas podem
ser novamente formadas, promovendo um aumento de viscosidade do fluido (Desbrières,
2004; Philippova e Korchagina, 2012).
A incorporação de uma pequena quantidade de grupos hidrofóbicos em uma cadeia
polimérica hidrofílica, geralmente resulta em sistemas de polimeros associativos, nos quais
suas soluções apresentam um aumento de viscosidade, um aumento da tolerância aos sais e
das estabilidades térmica e mecânica. Esse comportamento é devido às associações
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
54
hidrofóbicas que ocorrem em meio aquoso. As interações hidrofóbicas possuem um papel
central em muitos processos em que a agregação acontece em meio aquoso, tal como o
enovelamento de proteínas, formação de micelas e de complexos macromoleculares. Os
polímeros que apresentam o comportamento associativo em solução têm sido utilizados em
recuperação avançada de petróleo (Philippova e Korchagina, 2012).
A quitosana modificada hidrofobicamente também apresenta o comportamento de
associações moleculares. Chiu e colaboradores (2009) desenvolveram um sistema de hidrogel
sensível ao pH que exibe uma mudança rápida de conformação da estrutura em uma faixa
estreita de pH. Os autores modificaram a quitosana com cadeias laterais hidrofóbicas
provenientes de ácido palmítico (Chiu, Chen et al., 2009).
As propriedades físico-químicas da quitosana em solução são significativamente
influenciadas pelo pH do meio. A Figura 3.18 ilustra o efeito do pH para as soluções de
quitosana e derivado. Em solução mais ácida (pH 3), os grupos amino presentes na cadeia da
quitosana estão protonados (NH3+), limitando as interações entre as suas macromoléculas
carregadas devido à repulsão eletrostática. Com o aumento do pH para aproximadamente pH
6, os grupos amino na quitosana tendem a ser desprotonados (NH2) e favorecem a formação
de ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxilas e os grupos amina da quitosana. Portanto,
interações intermoleculares são formadas nesse meio e sua dinâmica reológica reflete uma
natureza viscosa com o aumento do pH de 3,0 para 6,2. O derivado-NPCS em solução aquosa
ácida apresenta cargas positivas (grupos amino protonados) e cadeias laterais hidrofóbicas
(grupos provenientes do ácido palmítico), portanto suas propriedades em solução são
resultantes do equilíbrio entre a repulsão eletrostática e as interações hidrofóbicas como
resposta ao pH do meio. Em pH baixo, a repulsão entre as cargas dos grupos amino
protonados foi dominante, conduzindo à expansão das cadeias. Com o aumento do pH, as
interações hidrofóbicas predominaram no sistema, formando agregados de macromoléculas
em uma organização tridimensional, ou seja, um aumento significativo de ligações cruzadas
intermoleculares de natureza física, sugerindo um aumento da natureza elástica do derivado
em solução aquosa em pH mais elevado e um comportamento como um polieletrólito em
baixo pH (Chiu, Chen et al., 2009).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
55
Figura 3.18 – Esquema ilustrativo do efeito do pH para soluções de quitosana-CS e derivado-NPCS
Fonte: (Chiu, Chen et al., 2009)
A Figura 3.19 mostra o comportamento relógico do derivado hidrofóbico de quitosana
(derivado-NPCS) em solução aquosa (pH 6,5). A redução significativa da viscosidade
(comportamento pseudoplástico) com o aumento da taxa de cisalhamento resultou da ruptura
das ligações cruzadas físicas entre as cadeias do polímero. Além disso, o sistema foi capaz de
rapidamente retornar a condição inicial de viscosidade após cessar o cisalhamento devido à
auto-associação molecular (Chiu, Chen et al., 2009).
Figura 3.19 – Comportamento reológico do derivado-NPCS: viscosidade versus taxa de cisalhamento
Fonte: adaptado de (Chiu, Chen et al., 2009)
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56
Desbrières e colaboradores (1996) modificaram a estrutura da quitosana com
substituintes hidrofóbicos. Os sistemas de quitosana modificada apresentaram associações
hidrofóbicas em solução aquosa ácida, formando soluções viscosas. Os parâmetros que
tiveram grande influência nessas interações hidrofóbicas incluíram a natureza e o número de
sítios hidrofóbicos, a concentração de polímero, a temperatura e a força iônica do meio
(Desbrières, Martinez et al., 1996).
Desbrières (2004) apresentou um estudo sobre N-alquilquitosanas em função do
comportamento reológico, focando a influência dos parâmetros estruturais (tamanho das
cadeias alquilas inseridas na quitosana e GS) e da temperatura. Dependendo da estrutura
química do derivado, diferentes comportamentos reológicos foram observados. O aumento da
viscosidade ou o valor constante da viscosidade com a elevação da temperatura foi verificado
após um ajuste da concentração do polímero em solução. A Figura 3.20 exemplifica esse
comportamento reológico. As concentrações de polímero utilizadas foram: 8 g/L (CC12 - GS
5 %), 10 g/L (CC8 - GS 12 %), 10 g/L (CC6 - GS 50 %) e 53 g/L para a quitosana original. A
notação CC12 – GS 5 % corresponde a alquilquitosana contendo grupos alquila de doze
carbonos (CC12) e grau de substituição de 5 % (GS 5 %), sistemática similar corresponde as
demais notações (Desbrières, 2004).
Figura 3.20 - Influência da temperatura na viscosidade das N-alquilquitosanas em solução de ácido acético 0,3
M/acetato de sódio 0,05 M; ω = 0,1 Hz
Fonte: (Desbrières, 2004)
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
57
Esses
derivados
N-alquilquitosana
com
cadeias
alifáticas
apresentaram
comportamento reológico específico que, juntamente com as propriedades dos polímeros
naturais, permitem aplicações não apenas em indústrias de alimento e cosmético como
modificadores reológicos, mas também na área de petróleo (Desbrières, 2004).
Bhattarai e colaboradores (2005) obtiveram hidrogéis termosensíveis de quitosana-gPEG, obtidos através da N-alquilação redutiva. Os autores observaram um aumento na
viscosidade dos hidrogéis com a elevação da temperatura de 10 para 37 °C em função do
tempo. A transição sol-gel ocorreu em temperatura inferior à temperatura corporal média (~
37 °C). Tais observações associadas ao aumento da solubilidade em meio aquoso permitiram
a preparação dos hidrogéis em uma maior faixa de pH, incluindo o pH fisiológico no qual
espécies bioativas podem ser incorporadas, classificando o produto como um hidrogel
injetável, com características para o potencial uso na liberação controlada de fármacos
(Bhattarai, Ramay, et al., 2005).
Diferentemente dos hidrogéis físicos, Argüelles-Monal e colaboradores (1998)
produziram géis químicos através de ligações cruzadas por ligações químicas entre quitosana
e glutaraldeído. Quimicamente, a reticulação foi formada por ligações covalentes entre os
grupos amino da quitosana e os aldeídos terminais do glutaraldeído, gerando uma rede
tridimensional e restringindo a mobilidade do polímero. O comportamento viscoelástico do
sistema polimérico resultou na formação de um gel mais consistente para as condições que
apresentaram mais ligações cruzadas (Argüelles-Monal, Goycoolea et al., 1998).
3.1.4.2 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)
O espalhamento de luz é uma das metodologias muito utilizada na caracterização de
polímeros em solução. A técnica divide-se em espalhamento de luz estático (SLS – static light
scattering) e dinâmico (DLS - dynamic light scattering), no SLS mede-se a intensidade média
da luz espalhada por um conjunto de partículas para o espalhamento estático e no DLS medese as flutuações da intensidade do espalhamento em função do tempo. A técnica de
espalhamento de luz dinâmico também é denominada por espectroscopia de correlação de
fótons (PCS - photon correlation spectroscopy) e espalhamento de luz quase elástico (QELS quasi-elastic light scattering).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
58
Em espalhamento de luz, um feixe de luz monocromático (normalmente uma fonte de
laser de He-Ne) incide sobre uma amostra e a onda eletromagnética original é espalhada para
todas as direções. A intensidade de luz espalhada é detectada por uma fotomultiplicadora. O
módulo do vetor de espalhamento (q) é definido pela Equação 3.11. O valor de q é a diferença
vetorial entre o vetor de onda da radiação incidente (magnitude 2 /  ) e o vetor de onda da
luz espalhada (aproximadamente igual à radiação incidente).
q 
4 n0

 
sen  
2
(3.11)
Em que:  - ângulo de espalhamento; n0 - índice de refração do solvente onde as partículas
estão imersas e  - comprimento de onda da luz incidente.
Nos experimentos de espalhamento de luz dinâmico, a intensidade da luz espalhada,
em curtos intervalos de tempo, é registrada como uma função do tempo e as flutuações nessa
intensidade da luz espalhada são observadas como consequência das flutuações de
concentração no volume de espalhamento. A origem das flutuações são as variações no índice
de refração dentro do volume de espalhamento, devido ao movimento Browniano das
partículas (Lucas, Soares et al., 2001). O sinal da radiação é transformado por meio de um
correlator em função de correlação temporal.
g 2 (t ) 
 I (t ) . I (t   ) 
 I (t ) 2
(3.12)
A função g2 (t) pode ser relacionada com a função de correlação do campo elétrico g1 (t)
através da relação de Siegert.
g 2 t   1  B g 1 t 
2
(3.13)
Em que: B é um parâmetro instrumental.
Para um conjunto de espalhadores monodispersos, g1 (t) está relacionada com a
frequência de relaxação das partículas:
g1  t   exp  t 
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
(3.14)
59
Em que:  = 1/ é a frequência de relaxação das partículas (Heineck, Cardoso et al., 2008).
Enquanto que para um sistema polidisperso, g1  t    A exp( t ) .
Através dos experimentos de espalhamento de luz dinâmico, é possível determinar o
coeficiente de difusão (D) de macromoléculas em solução a partir do valor da freqüência de
relaxação (  ) obtido da análise de uma função de correlação temporal, segundo a Equação
3.15, em que q é o vetor de onda da luz espalhada (Lucas, Soares et al., 2001).
  D.q 2
(3.15)
A partir do valor de D, é possível determinar o raio hidrodinâmico (RH) da partícula
esférica espalhante através da equação de Stokes-Einstein, em que:  é a viscosidade do
solvente a uma dada temperatura (T) e  B é a constante de Boltzmann (Equação 3.16).
RH 
k BT
6 D
(3.16)
Para um grande número de processos de relaxação independentes, g1(t) é a soma das
contribuições dos processos individuais e g1(t) pode ser expressa através da distribuição
contínua de relaxação, indicada na Equação 3.17. Em que A() é a distribuição da luz
espalhada em função do tempo de relaxação.

g 1 t    A  exp  t  d
(3.17)
0
Podemos também interpretar os dados de espalhamento de luz dinâmico através da
função de correlação temporal, que é descrita por uma exponencial simples, seguida de
tempos maiores através de uma extensão exponencial, em que Af + As = 1.

g 1 t   A f exp  1  f   As exp  t  se 
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado


(3.18)
60
Os parâmetros Af e As correspondem às amplitudes dos modos de relaxação rápido
(―fast‖) e lento (―slow‖), respectivamente. A variável le é o tempo de relaxação efetivo, e 
(0    1) é uma medida da distribuição dos tempos de relaxação.
Em geral, o modo de relaxação rápido reflete o movimento das cadeias de polímeros
relativas ao solvente. O modo de relaxação lento está associado à relaxação de um conjunto
de cadeias individuais ou agregado.
A Figura 3.21 ilustra flutuações temporais na intensidade de luz espalhada por
dispersões de partículas grandes e dispersões de partículas pequenas. O movimento lento de
partículas grandes causa lentas alterações na intensidade da luz espalhada. Enquanto que, a
movimentação rápida de partículas pequenas provoca uma flutuação muito rápida na
intensidade de luz espalhada. As flutuações de intensidade de luz espalhada ao longo do
tempo são representadas através de uma função de correlação de tempo. Para partículas
pequenas, a função de correlação entre as intensidades diminui mais rapidamente com o
tempo, do que no caso de partículas grandes (Lim, Yeap et al. 2013).
Figura 3.21 – Esquema da medida da intensidade de luz espalhada (a) e a sua correspondente função de
correlação (b) obtida por espalhamento de luz dinâmico
Fonte: (Lim, Yeap et al., 2013)
As análises de DLS fornecem informações sobre a distribuição dos tamanhos das
partículas poliméricas, sejam as macromoléculas livres em solução (individuais) ou
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
61
agregadas. Além disso, DLS é uma técnica muito sensível para investigar a presença de
agregados, pois a intensidade do espalhamento de luz aumenta significativamente com o
aumento do diâmetro da partícula (d). Mesmo uma população muito pequena de agregados
resulta em uma alta intensidade de espalhamento de luz (I α d6). Por isso, DLS tem sido
extensivamente empregado para estudar o comportamento de agregação de diversos
polímeros em meio aquoso, dentre eles, a quitosana (Blagodatskikh, Bezrodnykh et al., 2013;
Chen, Hsu et al., 2011; Philippova, Korchagina et al., 2012; Popa-Nita, Acouffe et al., 2010).
O fenômeno de agregação das cadeias de quitosana em meio aquoso ácido, estudado
por DLS, tem sido atribuído principalmente a três efeitos: (a) os grupos acetamido residuais,
(b) a desprotonação dos grupos amino e (c) a concentração polimérica. Mais recentemente,
novos aspectos têm sido abordados, porém, o exato mecanismo de agregação em soluções de
quitosana ainda não está totalmente compreendido (Blagodatskikh, Bezrodnykh et al., 2013;
Chen, Hsu et al., 2011, Philippova, Korchagina et al., 2012).
De acordo com os resultados de medidas de DLS de soluções de quitosana em regime
diluído, na ausência de sal e com os grupos amino completamente protonados, obtém-se uma
única distribuição de tamanho de partícula, com raio hidrodinâmico observado em torno de 25
nm para as amostras de quitosana com até 70 % de grau de desacetilação. Nesse caso, as
cadeias encontram-se isoladas em solução e assumem uma condição de máxima hidratação e
expansão das cadeias poliméricas. Conforme os grupos amino protonados sofrem
neutralização, uma segunda população com raio hidrodinâmico médio de 250 nm é obtida.
Essa nova distribuição foi atribuída à formação de nano-agregados de natureza hidrofóbica. O
aumento do diâmetro das partículas de quitosana em solução em função do aumento do GA
foi relacionado aos grupos acetamido, em razão do seu caráter hidrofóbico, que contribuem
para as interações atrativas em solução aquosa. A formação dos agregados também foi
favorecida com o aumento da concentração, especialmente acima da concentração crítica, c*.
Nesse caso, os agregados são obtidos em solução com os grupos amino completamente
desprotonados, e as associações foram atribuídas ao aumento das ligações de hidrogênio
(Domard, 2011; Schatz, Pichot et al., 2003).
A Figura 3.22 apresenta dados de experimentos de DLS para quitosana em solução
aquosa em regime diluído e em alta concentração salina. O aumento do grau de acetilação
favorece a formação de agregados (RH ~ 300 nm) e a formação de aglomerados em escala
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
62
micrométrica. Segundo Popa-Nita e colaboradores (2010), o aumento da concentração
favoreceu a população de maior tamanho de aglomerados. A Figura 3.22 também mostra que
os agregados foram removidos em processos de filtração das soluções (0,45µm - Millipore),
resultando em apenas um modo de relaxação atribuído às cadeias isoladas. Entretanto, os
colaboradores verificaram que, com o aumento da concentração de polímero, não ocorre
remoção completa dos agregados por filtração ou os agregados são regenerados em um tempo
curto, existindo um equilíbrio dinâmico entre cadeias livres e agregadas. Esses resultados
demonstram que os agregados não são originados da dissolução incompleta do polímero. As
dimensões dos agregados e dos clusters dependem das características estruturais da quitosana
e da constituição da solução (concentração, solvente, agente de neutralização, força iônica,
temperatura, etc) (Popa-Nita, Acouffe et al., 2010).
Figura 3.22 – Distribuição normalizada em função do tempo de relaxação () e RH ( = 90 °; concentração de
quitosana 0,01 % (m/m); solução de ácido acético 0,2 M/acetato de amônio 0,15 M; pH 4,5)
Fonte: (Popa-Nita, Acouffe et al., 2010)
Blagodatskikh e colaboradores (2013) estudaram a influência de procedimentos de
filtração das soluções diluídas de oligômeros de quitosana e o fenômeno de agregação das
partículas através da técnica de DLS. Os colaboradores verificaram que o tamanho de poro
(1,2; 0,45; 0,2 µm) e o material da membrana (éster de celulose ou fluoreto de polivinilideno
–PVDF) utilizada na filtração das amostras afetam os resultados de agregação. Quanto maior
a porosidade do filtro, maior é o tamanho do RH dos agregados. Considerando a mesma
porosidade e o tipo de material diferente das membranas, quando se utiliza filtro de celulose,
os agregados em solução não são eliminados, porém, com o uso de filtro de PVDF, os
agregados são desfeitos. Outro dado interessante é a regeneração dos agregados em solução
após o procedimento de liofilização da solução previamente filtrada em PVDF, seguida de reKeila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
63
dissolução e submissão à análise de DLS sem filtração adicional. Para o mesmo processo
anterior, porém submetendo a uma nova filtração em PVDF antes do ensaio de DLS,
novamente os agregados são desfeitos. Os estudos de espalhamento de luz mostraram que os
oligômeros de quitosana, em soluções diluídas, se encontram parcialmente associados em toda
faixa de pH abaixo do pH crítico, antes da separação de fase, em solventes de diferentes
forças iônicas (ácido acético 0,1 M; ácido acético 0,1 M/acetato de sódio 0,3 M pH 5,4). No
entanto, em análises de cromatografia de exclusão por tamanhos de alto desempenho e de
viscosimetria, não se observa a influência da filtração. Esses resultados foram atribuídos à
ação de cisalhamento (Blagodatskikh, Bezrodnykh et al., 2013).
O comportamento de agregação da quitosana em solução tem sido reconhecido por
muitos pesquisadores, especialmente, quando os grupos acetamido presentes na quitosana
formam longas sequências ao longo das cadeias poliméricas. Sugere-se que estes grupos
interagem entre si através de ligações de hidrogênio, além das interações hidrofóbicas devido
aos grupos acetamido presentes na estrutura química do biopolímero. No que se refere à
quitosana com distribuição aleatória das unidades acetiladas, os dados disponíveis sobre o
efeito do GA no seu comportamento de agregação mostram contradições. As agregações são
mais pronunciadas com valores de GA 50 – 60 %, atribuídas às interações hidrofóbicas pelos
grupos acetamido. Entretanto, essas amostras apresentam maior solubilidade e menor
cristalinidade, indicando interações intermoleculares mais fracas, devido aos impedimentos
estéricos causados pelos grupos acetamido (Kubota, Tatsumoto et al., 2000; Philippova,
Korchagina et al., 2012; Sogias, Khutoryanskiy et al., 2010).
Em geral, o comportamento de melhor solubilidade de quitosana com GA 50 %
observa-se, principalmente, para as amostras obtidas por re-acetilação homogênea proveniente
de quitina totalmente desacetilada. Por outro lado, o comportamento de agregação de
quitosana com GA alto é frequentemente encontrado para as amostras preparadas por
desacetilação parcial de quitina. Neste caso, espera-se que algumas zonas cristalinas
permaneçam, como resultado de uma dissolução incompleta do polímero (Philippova,
Korchagina et al., 2012).
De acordo com a Figura 3.23, as amostras de quitosana podem apresentar agregação
em meio ácido, de forma independente da quantidade de grupos acetamido presentes na
estrutura da quitosana. Os resultados de DLS para quitosana com GA = 0 mostram a formação
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
64
de agregados intermoleculares e cadeias livres com o raio hidrodinâmico de 145 nm e 17 nm,
respectivamente, em condições de solvente-. Além disso, a fração da intensidade de
espalhamento de luz para as cadeias isoladas da amostra completamente desacetilada é muito
menor do que para a quitosana acetilada (GA 56 %). A quitosana GA = 56 % mostrou uma
tendência menor para agregação. Estas observações demonstram que a agregação em soluções
aquosas ácidas de quitosana não é principalmente devido às interações entre os grupos
acetamido. Portanto, esses resultados contrariam a condição geralmente admitida de que as
interações entre as unidades acetiladas são a principal causa da agregação (Philippova,
Korchagina et al., 2012).
Figura 3.23 – Função de distribuição normalizada do raio hidrodinâmico a) GA 0 % e b) GA 56 %
( = 90°; concentração de quitosana 1,2 x 10-3 mol/L em 0,3 M de ácido acético/0,05 de acetato de sódio)
Fonte: (Philippova, Korchagina et al., 2012)
A agregação das amostras de quitosana desacetiladas pode ser explicada pela sua
elevada capacidade de cristalização, em razão da estrutura ser mais regular com a ausência de
grupos laterais volumosos, facilitando o empacotamento das macromoléculas. A cristalização
é reforçada por numerosas ligações de hidrogênio intra e intermoleculares (Philippova,
Korchagina et al., 2012; Sogias, Khutoryanskiy et al., 2010).
Philippova e colaboradores (2012) também verificaram o efeito da filtração de
soluções de quitosana em função do fenômeno de agregação. Soluções de quitosana foram
filtradas em filtro de acetato de celulose com poros de diâmetro menor do que o tamanho dos
agregados obtidos em solução. Ainda assim, os agregados permaneceram em solução,
indicando que os agregados estão em equilíbrio dinâmico com as macromoléculas individuais.
Os agregados são formados principalmente como resultado da interação intermolecular entre
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
65
as macromoléculas dissolvidas e não devido às partículas insolúveis. A adição de ureia na
solução de quitosana enfraqueceu a agregação, confirmando que ligação de hidrogênio e/ou
interações hidrofóbicas são parcialmente responsáveis pelas agregações. Portanto, o efeito
parcial da ureia na agregação da quitosana pode ser resultado da formação de domínios
cristalinos, que tornam as ligações de hidrogênio inacessíveis e/ou mais estáveis à ureia
(Philippova, Korchagina et al., 2012; Sogias, Khutoryanskiy et al., 2010).
Devido à existência de interações eletrostáticas em polieletrólitos, como a quitosana
em solução aquosa ácida, geralmente, os estudos sobre as propriedades hidrodinâmicas de
polieletrólitos têm sido realizados em soluções com adição de sal para blindar as cargas dos
grupos iônicos ao longo das cadeias e, consequentemente, minimizar as repulsões
eletrostáticas.
Chen e colaboradores (2011) estudaram o comportamento de agregação de amostras
de quitosana (GA 30 % e 7,3 %) em soluções de diferentes concentrações de sal (0,01 - 0,5
M) através de DLS. O aumento da força iônica e um maior grau de acetilação favoreceram o
aumento do raio hidrodinâmico da quitosana em solução diluída. Em solução com força
iônica média (I = 0,1), para a amostra com grau de acetilação maior e através da diminuição
do ângulo de espalhamento de luz de 90º para 30°, houve a identificação de agregados.
Enquanto que a diminuição da força iônica (I = 0,01) contribuiu para a observação de
agregados independente do grau de acetilação. A Figura 3.24 exibe uma representação das
espécies de quitosana (GA 30 %) em solução aquosa ácida, em diferentes forças iônicas (I)
(Chen, Hsu et al., 2011).
Em sistema de baixa força iônica (I = 0,01 M) (Figura 3.24 (a)), há dois modos de
relaxação para as soluções. O modo de relaxação rápido pode ser resultado do acoplamento do
movimento entre as cadeias de policátions e os contra íons do solvente, enquanto que o modo
de relaxação lento pode ser atribuído à formação de estruturas agregadas em solução de força
iônica baixa.
Em meios de força iônica média (I = 0,1 M) (Figura 3.24 (b)), as macromoléculas de
quitosana encontram-se isoladas e em pequena quantidade de agregados em solução. A
blindagem das cargas da quitosana (ou a diminuição da densidade de prótons da quitosana
com a inibição da repulsão eletrostática) resultou na compactação das cadeias. Embora, o
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
66
solvente utilizado (ácido acético 0,2 M/ de acetato de sódio 0,1 M) seja considerado um bom
solvente para a quitosana, provavelmente, para a amostra com GA mais elevado, possa
proporcionar uma redução da qualidade do solvente, favorecendo as interações hidrofóbicas
como também as ligações de hidrogênio, causando agregações entre as cadeias e,
consequentemente, o aumento do raio hidrodinâmico. A compactação intra-cadeia gera a
diminuição do volume hidrodinâmico da quitosana e a associação inter-cadeias causa a
formação de agregados, aumentando o raio hidrodinâmico.
Em soluções de força iônica elevada (I ≥ 0,2 M) (Figura 3.24 (c)), o aumento de sal
em solução diminui a hidratação da quitosana, favorecendo a formação de interações
hidrofóbicas e a associação entre as macromoléculas compactas, promovendo o aumento na
concentração de agregados.
Figura 3.24 – Modelo representativo de espécies de agregados de quitosana GA 30 % em solução com
diferentes forças iônicas (concentração de polímero 0,40 mg/mL, solução aquosa de ácido acético 0,10 M)
Fonte: (Chen, Hsu et al., 2011)
Segundo Chen e colaboradores (2011), deve-se destacar que a intensidade de luz
espalhada das soluções de quitosana diminui significativamente com a redução da força iônica
do meio no intervalo estudado. Com a força iônica do meio suficientemente baixa, uma
pequena quantidade de agregados foi exibida. Entretanto, em uma força iônica maior, os
agregados poderiam estar ocultos devido a um sinal de espalhamento de luz intenso do
polieletrólito em solução, sendo detectado apenas através da diminuição da intensidade de luz
espalhada. Outra abordagem referente à agregação em soluções ácidas de baixa força iônica
resulta da interação atrativa de variações dipolares em solução. O processo teria origem em
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
67
uma pequena quantidade de espécies comparadas à estrutura da quitina presentes em solução.
Neste caso, as espécies e os grupos amino protonados da quitosana poderiam distribuir-se de
forma assimétrica. Embora existam as repulsões eletrostáticas, as ligações de hidrogênio
poderiam ser favorecidas entre as espécies comparadas à quitina e, assim, gerar uma
distribuição assimétrica entre os grupos em solução, favorecendo interações atrativas
resultantes de variação dipolar na solução. O resultado seria a agregação das moléculas com
as espécies semelhantes à quitina e esse processo de agregação seria diferente daquele
encontrado em soluções de elevada força iônica (Chen, Hsu et al., 2011).
Geralmente, a avaliação das propriedades hidrodinâmicas da quitosana, assim como
para os polieletrólitos em solução em análises de DLS, é realizada em solução aquosa salina.
No caso da quitosana, em presença de sal ocorre à blindagem dos grupos amino carregados
positivamente pelos contra íons do sal e, consequentemente, as fortes interações eletrostáticas
entre as cadeias poliméricas são reduzidas (Blagodatskikh, Bezrodnykh et al., 2013; Chen, et
al., 2011; Philippova e Korchagina, 2012; Philippova, Korchagina et al., 2012; Popa-Nita,
Acouffe et al., 2010). Embora o pH altere significativamente os sistemas constituídos por
cargas positivas e/ou negativas e, por conseguinte, as propriedades em solução de um
polieletrólito, existem poucas publicações que relatam estudos sobre a quitosana e seus
derivados em solução aquosa na ausência de sal (Liu, Xu et al., 2009; Pa e Yu, 2001, Schatz,
Pichot et al., 2003).
Os resultados de análises de DLS obtidos em ângulo de espalhamento de luz de 25º
por Pa e Yu (2001) revelaram dois modos de relaxação com duas distribuições de tamanhos
de partículas para as soluções aquosas de quitosana em ácido acético, na ausência de sal. O
aparecimento do modo lento em soluções de quitosana em meio ácido foi atribuído ao
conjunto de várias moléculas de quitosana, tendo o raio hidrodinâmico do agregado
aumentado com a diminuição do valor de pH da solução. Segundo os colaboradores, a ligação
entre os íons dos grupos aminos protonados pertencentes às moléculas da quitosana e os íons
carregados negativamente (acetato) do solvente causaram a formação de agregados. A
expansão da cadeia da quitosana e a interação com o contra íon podem reduzir a distância
entre as moléculas de quitosana e favorecer a formação de aglomerados (Pa e Yu, 2001).
A agregação da quitosana pode ser facilmente afetada pelo pH da solução, já que o
mesmo altera o grau de dissociação das cadeias poliméricas. Em alguns casos, agregados de
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
68
quitosana são formados em solução aquosa ácida com a diminuição do pH e distanciamento
do pH crítico, quando as cadeias poliméricas estão completamente carregadas e em sua
hidratação máxima. Nestas amostras, a atração entre os grupos associativos pode ser tão forte
que supera tanto a repulsão eletrostática entre as cadeias quanto a perda da entropia derivada
dos contra íons que estão localizados no interior dos agregados (Pa e Yu, 2001; Philippova e
Korchagina, 2012).
De um modo geral, a tendência de agregação torna-se mais pronunciada com o
aumento do pH para as proximidades do pH crítico da quitosana, antes de ocorrer a
precipitação do polímero (Philippova e Korchagina, 2012). Esse fato é atribuído, em parte, à
diminuição da quantidade das espécies protonadas (NH3+), que impedem a agregação das
macromoléculas através das repulsões eletrostáticas. Além disso, os grupos neutralizados
(NH2) podem formar ligações de hidrogênio adicionais estabilizando o estado agregado. Esta
agregação, que antecede a precipitação do polímero, é reversível e pode ser comprovada por
histerese (Schatz, Pichot et al., 2003).
Kulikov e colaboradores (2012) demonstraram que os oligômeros de quitosana
também podem formar agregados em soluções diluídas. A Figura 3.25 apresenta a
distribuição dos raios hidrodinâmicos de cadeias individuais e de agregados de tamanhos
distintos para os oligômeros. Embora a quantidade de grupos amino protonados varie de
acordo com o pH, os raios hidrodinâmicos dos agregados permaneceram com valores
constantes em quase toda faixa de pH ácido. Este resultado pode ser atribuído à condensação
iônica, os contra íons localizam-se perto dos sítios carregados das cadeias poliméricas e,
consequentemente, a carga efetiva das macromoléculas torna-se praticamente a mesma. No
entanto, próximo ao pKa, pH 6,42, além dos agregados menores, também foram observados
agregados com dimensões maiores. As amostras analisadas por DLS foram previamente
filtradas em membranas de tamanho de poro 0,22 (nitrocelulose), enquanto que para as
análises em pH 6,42 foram utilizadas membranas de 0,8  (éter de celulose). Vale ressaltar
que agregados podem ser afetados por procedimentos de filtração em análises de DLS,
entretanto, os colaboradores não relacionaram a questão no artigo (Blagodatskikh,
Bezrodnykh et al., 2013; Kulikov, Tikhonov, et al., 2012; Philippova e Korchagina, 2012).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
69
Figura 3.25 – Distribuição dos raios hidrodinâmicos de oligômeros de quitosana obtidos por DLS
Fonte: (Kulikov, Tikhonov, et al., 2012)
O aumento da concentração favorece a formação de agregados de quitosana em
solução, como também afeta a dimensão dos agregados. O aumento no RH dos agregados é
observado quando a atração dos grupos associativos é favorecida, superando a repulsão
eletrostática. Isto ocorre sob condições em que as cadeias de quitosana têm a densidade de
cargas reduzida, em solução com pH mais elevado, em quitosana de maior GA e em solução
salina. Entretanto, quando em solução de baixo pH, em que as macromoléculas estão
totalmente protonadas e a concentração de sal é insuficiente para blindagem dos grupos
carregados, os agregados tendem a não aumentar de tamanho devido à natureza de
estabilização eletrostática. Caso contrário, a sua carga poderá exceder um valor crítico,
resultando no colapso dos agregados. Este resultado está relacionado com o comportamento
da gota carregada de Rayleigh, em que uma gota esférica, cuja carga é superior a um
determinado valor crítico decompõe-se em várias gotas menores com uma carga menor do
que o valor crítico (Domard, 2011; Korchagina e Philippova, 2010; Philippova e Korchagina,
2012; Schatz, Pichot et al., 2003; Tamashiro e Schiessel, 2006).
Embora o mecanismo de agregação em soluções de quitosana ainda não esteja
totalmente elucidado, os derivados de quitosana e quitina também merecem atenção com
relação ao fenômeno de agregação. Philippova e colaboradores (2012), ao considerar os
derivados
O-carboximetilquitina
(na
presença
de
grupos
acetamido)
e
di-N,N-
carboximetilquitosana (na ausência de grupos acetamido), observaram que a agregação é
inerente aos derivados solúveis em água de quitina e quitosana, incluindo sistemas com cargas
positivas e negativas. Tal como ocorre na quitosana, os grupos acetamido não foram
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
70
necessários para que ocorressem agregações em solução dos derivados. Além disso, as
agregações e as cadeias isoladas ocorreram em regiões de tamanhos de RH similares à
quitosana (Philippova, Korchagina et al., 2012).
Quitosana modificada hidrofobicamente apresenta domínios hidrofóbicos inerentes
aos substituintes hidrofóbicos e à própria quitosana, proveniente dos grupos acetamido. Em
geral, a graftização de substituintes hidrofóbicos na estrutura da quitosana aumenta a sua
tendência para agregação em sistemas aquosos, semelhante a qualquer outro polieletrólito
hidrofóbico associativo. Em solução diluída, a agregação intramolecular predomina quando a
quantidade de grupos associativos em uma cadeia polimérica é suficiente para estabilizá-la,
caso contrário, a agregação intermolecular será favorecida (Philippova e Korchagina, 2012).
A quantidade e a dimensão de substituintes hidrofóbicos inseridos na quitosana
influenciam no fenômeno de agregação. Geralmente, o aumento dos sítios hidrofóbicos na
estrutura da quitosana resulta em agregados mais densos com tamanhos reduzidos devido ao
aumento da atração entre os grupos associativos. Os grupos hidrofóbicos com dimensões
maiores contribuem significativamente para agregação do polímero. O aumento no tamanho
do substituinte tende a gerar agregados com diâmetros maiores em presença de interações
intermoleculares, e partículas menores em interações intramoleculares. A partir de seis átomos
de carbono, há uma tendência a ocorrer agregações intermoleculares, pois espécies volumosas
aumentam o impedimento estérico e a rigidez da macromolécula. Contudo, o tamanho e o teor
devem ser considerados conjuntamente. Em todo caso, a dimensão da quitosana é
determinada pela relação entre as forças atrativas através das ligações de hidrogênio e
interações hidrofóbicas que favorecem a agregação, e as forças repulsivas eletrostáticas dos
grupos amino protonados (Philippova e Korchagina, 2012).
De acordo com os resultados de Robles e colaboradores (2013), os diâmetros
hidrodinâmico médio dos derivados hidrofóbicos em solução aquosa (pH 5,3) diminuíram
quando comparados à quitosana (360 nm), e acentuou-se com o aumento do grau de
substituição de grupos n-dodecila (310 nm, GS 5% e 250 nm, GS 50%) ou n-octila (260 nm,
GS 5% e 140 nm, GS 50%) introduzidos na estrutura da quitosana (Robles, Villar et al.,
2013).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
71
Em solução diluída e solvente Korchagina e Philippova (2010) observaram a
presença de cadeias individuais e agregadas, simultaneamente, para as diferentes massas
molares de quitosana e seus derivados hidrofóbicos graftizados com segmentos n-dodecila. A
conformação semi-rígida da cadeia da quitosana e o baixo grau de substituição de segmentos
hidrofóbicos na macromolécula favoreceram a agregação intermolecular, que resultou no
aumento do tamanho dos agregados e do número de agregação para os derivados. Os
colaboradores demonstraram que o tamanho dos agregados formados é independente do
comprimento das cadeias individuais dos polímeros. Os agregados contêm uma quantidade
específica de grupos associativos e de grupos carregados positivamente, em que o número de
cadeias poliméricas presentes nos agregados diminui com o aumento da massa molar do
polímero, mas permanece com o mesmo número de monômeros. Como consequência, o
tamanho dos agregados mantém-se constante, 134 nm para quitosana e 180 nm para o
derivado, em diferentes massas molares dos respectivos polímeros. Este efeito deriva da
natureza eletrostática de estabilização para os agregados (Korchagina e Philippova, 2010).
Derivado de quitosana com ácido linoléico obtido por Liu e colaboradores (2005)
apresentou alteração no diâmetro hidrodinâmico em função da presença de sal, mudança de
pH e concentração de ureia. A adição de NaCl e o aumento do pH diminuíram o tamanho das
partículas em solução. A compactação dos agregados está associada à redução da repulsão
eletrostática, causada pelo efeito de blindagem dos grupos amino protonados pelos contra íons
do sal e redução da densidade de cargas nas cadeias poliméricas com o aumento do pH.
Adicionalmente, os grupos neutralizados (NH2) formam ligação de hidrogênio que
contribuem para a estabilização da conformação mais contraída. Por outro lado, o tamanho
das partículas aumentou à medida que elevou a concentração de ureia devido à diminuição
das ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas, assumindo uma conformação mais
estendida (Liu, Chen et al., 2005).
Ouchi e colaboradores (1998), utilizando análise de DLS para quitosana-g-mPEG em
água, obtiveram diâmetros hidrodinâmicos entre 70 e 120 nm com o aumento de mPEG
(massa molar 5000) inserido na quitosana, respectivamente. O efeito do mPEG foi
determinante para a solubilização em água, diminuindo as interações entre as macromoléculas
da quitosana por impedimento estérico. A Figura 3.26 ilustra a organização da estrutura
quitosana-g-mPEG em meio aquoso em função do pH. Os colaboradores observaram que a
incorporação de um fármaco hidrofóbico em quitosana-g-mPEG foi máxima em meio alcalino
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
72
e neutro em função das agregações intermoleculares em solução aquosa. Entretanto, o
polímero em condição ácida favoreceu a liberação do fármaco, admitindo-se que os agregados
foram desfeitos devido à repulsão eletrostática dos grupos amino protonados (Ouchi,
Nishizawa et al., 1998).
Figura 3.26 - Esquema da agregação e dissociação da quitosana-g-mPEG em meio aquoso em função do pH
Fonte: (Ouchi, Nishizawa et al., 1998)
Derivados graftizados de quitosana (CS-g-PCLePEG) com grupos hidrofóbicos policaprolactona (PCL -massa molar 3000) e grupos hidrofílicos – metóxi-poli(etileno glicol)
(mPEG - massa molar 5000) foram sintetizados e avaliados quanto ao processo de agregação
em meio aquoso. As cadeias de PEG desempenharam um papel crucial na estabilidade dos
agregados. Análises de DLS exibiram uma distribuição monomodal atribuída aos agregados
com diâmetros hidrodinâmicos em torno de 200 - 400 nm. Os agregados diminuíram de
tamanho com o aumento do grau de substituintes inseridos na quitosana e do pH (Figura
3.27), mas praticamente não foram alterados com a variação da concentração do polímero em
solução. Entretanto, em meio neutro e GS específico, o diâmetro aumentou em função do
tempo nos primeiros dez dias até manter-se constante. O tamanho, a morfologia e a
estabilidade dos agregados podem ser controlados ajustando a razão dos grupos hidrofóbicos
e hidrofílicos na estrutura da quitosana (Liu, Xu et al., 2009).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
73
Figura 3.27 – Representação da agregação em função do pH para quitosana graftizada com grupos hidrofóbicos
e hidrofílicos
Fonte: (Liu, Xu et al., 2009)
3.1.4.3 Potencial Zeta ()
O potencial zeta ( ) é definido como o potencial eletrocinético que existe no plano de
cisalhamento entre a unidade, formada pela superfície de partículas carregadas e contraíons
próximo da superfície, e o fluido circundante (Figura 3.28). A maioria dos materiais em
contato com um líquido adquire uma carga elétrica em sua superfície, proveniente da
dissociação de grupos ionizaveis da superfície da partícula e da adsorção diferencial de íons
da solução na superfície da partícula. A carga líquida na superfície da partícula afeta a
distribuição de íons na sua vizinhança, aumentando a concentração de contraíons junto à
superfície. Assim, forma-se uma dupla camada elétrica na interface da partícula com o
líquido. Uma região interna que inclui íons fortemente ligados à superfície e uma região
exterior onde a distribuição dos íons é determinada pelo equilíbrio entre forças eletrostáticas e
o movimento térmico. Dessa forma, o potencial nessa região decai com o aumento da
distância da superfície até atingir o potencial da solução. Esse potencial é convencionado
como potencial zero (http://www.instrutecnica.com/represen/bic/teoriazeta.html).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
74
Figura 3.28 – Representação do potencial zeta
Fonte: (http://www.instrutecnica.com/represen/bic/teoriazeta.html)
As medidas do  não podem ser feitas diretamente, entretanto, o potencial zeta pode
ser calculado a partir das medidas de mobilidade eletroforética ( e ) das partículas em
solução. Os dados de potencial zeta permitem investigar a carga líquida do sistema
polimérico, assim 
é um indicador indireto da densidade de carga superficial e da
estabilidade do sistema. Embora o potencial zeta seja considerado o potencial de superfície da
partícula, o sinal e a grandeza do potencial zeta também dependem das condições da solução,
tais como força iônica e pH do meio, reagentes que fazem ligação química com a superfície,
resultando em valores de potencial zeta positivos ou negativos, independente da partícula ser
neutra ou não. De uma forma geral, a mobilidade eletroforética está relacionada com o
potencial zeta pela Equação de Henry (Equação 3.19) (Beliciu e Moraru, 2011; Buschmann,
Merzouki et al., 2013; Camino, Sánchez et al,. 2011; Pujana, Pérez-Álvarez et al., 2012;
Robles, Villar et al., 2013).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
75
e 
2
f (ka)
3
(3.19)
Onde f (ka) é função dependente do modelo,  é a constante dielétrica,  é a
viscosidade do solvente. ka é um produto adimensional, onde a é o raio da unidade cinética.
Para limite em que ka → 0, a equação de Henry se reduz à equação de Hückel. Neste caso, f
(ka) é igual a 1. No limite ka →  , a equação de Henry se reduz à equação de Smoluchowski
e f (ka) é igual a 1,5 (Hiemenz, Rajagopalan, 1997; Shaw, 1992).
O potencial zeta é um indicador da carga de superfície, portanto  pode ser usado
para prever a estabilidade de sistemas coloidais. Quanto maior o valor do potencial zeta mais
provável é que a suspensão seja estável devido à repulsão entre as partículas que supera a
tendência natural de agregação (http://www.instrutecnica.com/represen/bic/teoriazeta.html).
Um dos parâmetros mais influentes nos valores de potencial Zeta é o pH do meio
(Pujana, Pérez-Álvarez et al., 2012; Robles, Villar et al., 2013). A Figura 3.29 mostra o efeito
do pH nos valores de potencial zeta das partículas de quitosana com poli(etileno glicol) – PEG
(Pujana, Pérez-Álvarez et al., 2012). Pujana e colaboradores (2012) observaram que os
valores do  aumentaram de (-8) – (-10) para 30-45 mV na faixa de pH de 10 a 4, o que pode
ser atribuído a progressiva protonação dos grupos amino com a diminuição do pH. Os grupos
amino presentes não apenas na superfície como também dentro das partículas contribuem com
os valores do zeta.
Figura 3.29 – Efeito do pH no potencial zeta
Fonte: (Pujana, Pérez-Álvarez et al., 2012)
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
76
3.1.4.4 Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS)
O espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) é um método analítico usado
para investigar a estrutura de sistemas de partículas em relação aos tamanhos médios das
partículas e suas conformações. A técnica de SAXS pode ser aplicada em diversas áreas para
análises de materiais como polímeros em solução (Schnablegger e Singh, 2011).
Em um experimento de SAXS, os feixes de raios-X altamente colimado e
monocromático com comprimento de onda entre 0,01 e 0,2 nm são espalhados elasticamente
através de um sistema de partículas. As partículas que interagem com os raios-X enviam sinal
para um detector, que mede a estrutura média de todas as partículas iluminadas do sistema,
em um determinado ângulo  . A intensidade de espalhamento I (q) está relacionada com a
diferença na densidade eletrônica entre diferentes partes de um sistema de partículas em
estudo (Blazek e Gilbert, 2011; Schnablegger e Singh, 2011).
Os experimentos de espalhamento a baixos ângulos medem a intensidade de
espalhamento em função do vetor de espalhamento (q), que é definido pela Equação 3.20
(Blazek e Gilbert, 2011):
q 
4

sen
...................................................(3.20)
Onde  é a metade do ângulo em que a radiação é espalhada e  é o comprimento de onda
da radiação incidente.
O vetor de espalhamento na intensidade máxima do pico, qmax , está relacionado com o
comprimento de correlação (  ) ou distância entre cadeias de acordo com a Lei de Bragg
(   2 qmax ). Popa-Nita e colaboradores (2009) avaliaram quitosana com diferentes graus
de acetilação (69%, 37%, 9% e 1,5%) em solução de acetato. Os autores observaram um
deslocamento de qmax em direção aos valores mais altos de q com a diminuição do grau de
acetilação (Popa-Nita et al., 2009)
Boucard e colaboradores (2007) estudaram a gelificação da quitosana em solução
aquosa ácida (13,7 g/L e GA = 46%) em contato com um gás amônia por SAXS. A estrutura
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
77
do polieletrólito foi caracterizada pela posição da sua intensidade máxima. O pico do efeito
polieletrolítico dos géis estudados desapareceu completamente em pH acima de 6,5, devido à
neutralização dos grupos NH3+ presentes na cadeia da quitosana (Boucard et al., 2007).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
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89
4. METODOLOGIA, RESULTADOS E DISCUSSÃO
A metodologia experimental, os resultados e discussão estão descritos nos manuscritos
intitulados:
 Manuscrito: ―One-pot preparation of water-soluble chitosan-g-mPEG and its aqueous
solution properties‖ - Submetido a Carbohydrate Polymers.
 Manuscrito: ―Hydrophilic and hydrophobic chitosan derivatives: The effect of pH on
the stability and aggregation phenomenon in the dilute regime‖ - Em fase de
submissão.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
90
One-pot preparation of water-soluble chitosan-g-mPEG and its aqueous
solution properties
Keila S. Alvesa,b*, Bruna V. Limaa, Marcos A. Villettic, Rosangela R. L. Vidald, Elisangela F. Boffod,
Rosangela C. Balabana
a
Laboratory of Petroleum Research, LAPET, Institute of Chemistry, Federal University of Rio Grande do Norte,
UFRN, 59078-970, Natal/RN, Brazil
b
Federal Institute of Education, Science and Technology of Rio Grande do Norte, IFRN, 59508-000,
Ipanguaçu/RN, Brazil
c
Lepol, Department of Physics, CCNE, Federal University of Santa Maria, UFSM, 97105-900, Santa Maria/RS,
Brazil
d
Department of Physical Chemistry, Federal University of Bahia, UFBA, 40170-115, Salvador/BA, Brazil
*Correspondence to: K. S. Alves (E-mail: [email protected])
Abstract
Chitosan was grafted with poly(ethylene glycol) (mPEG) by reductive amination and
simultaneously acetylated, using a one-pot method under mild reaction conditions. The
chemical structure of the polymers was characterized by nuclear magnetic resonance (1H
NMR) and CHN elemental analysis. The physicochemical properties were evaluated as a
function of pH by turbidity, zeta potential, small-angle X-ray scattering (SAXS) and
rheology. The low incorporation of mPEG combined with the reacetylation of amino groups
was significant to improve the solubility and thermal stability of chitosan in a wide pH range
from 3 to 13. SAXS data showed that chitosan-g-mPEG (CHPI) did not present a
polyelectrolyte character depending of pH value, in contrast to the chitosan. The CHPI
solutions exhibited lower viscosity than chitosan in acid medium. However, at basic pH, both
viscosity and thermal stability increased, as well as presented a pronounced shear thinning
behavior, suggesting strong intermolecular associations in the alkaline medium.
Keywords: Chitosan; Poly(ethylene glycol); Reductive amination; One-pot method;
Solubility
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
91
1. Introduction
The highlight of chitosan (CH) has grown significantly as it is commercially produced
from renewable resources, chitin derivative, an abundant biopolymer extracted mostly from
crustaceans shell wastes. Furthermore, chitosan has important structural and functional
properties with a large variety of applications (Alves & Mano, 2008; Casettari et al., 2012;
Kumar, 2000; Kurita, 2001; Mourya & Inamdar, 2008; Philippova & Korchagina, 2012;
Pillai, Paul, & Sharma, 2009; Prashanth & Tharanathan, 2007; Rinaudo, 2006).
Chitosan is insoluble in both water and organic solvents due to strong intramolecular
and intermolecular hydrogen bonds and its crystallinity index. However, it dissolves in acidic
aqueous solutions owing to protonation of the amino groups present on chitosan (Casettari et
al., 2012; Pillai et al., 2009; Rinaudo, 2006; Sogias, Khutoryanskiy, & Williams, 2010).
Different chemical modifications of chitosan through derivatization of the amine and/or
hydroxyl groups can be used to overcome its lack of solubility in neutral and alkaline aqueous
solutions in addition to improving its properties and extend its applications. Several
approaches to increase solubility of chitosan are described in the literature such as
carboxymethylation, quaternization, alkylation, acylation and grafting onto chitosan (Casettari
et al., 2012; Kurita, 2001; Mourya & Inamdar, 2008; Pillai et al., 2009; Prashanth &
Tharanathan, 2007).
Poly(ethylene glycol) (PEG), composed of repeated ethyleneoxy units with free
terminal hydroxyl group, is an ideal graft-forming polymer mainly because of its solubility in
both water and organic solvents and low toxicity (Abdel-Mohsen, Aly, Hrdina, Montaser, &
Hebeish, 2012; Casettari et al., 2012). The activation of the hydroxyl group of PEG with
appropriate reagents allows the functionalization of amino and/or hydroxyl groups of
chitosan. This activation can result in different chemical functions, for example, aldehyde,
carboxylic acid, epoxide, tosylate, p-nitrophenyl carbonate, azide, maleimide and
succinimidyl ester. In general, monomethoxy poly(ethylene glycol) (mPEG) has been used as
PEG source in order to avoid the obtaining crosslinking chitosan caused by bifunctional PEG
(Abdel-Mohsen et al., 2012; Bentley, Roberts, & Harris, 1998; Bhattarai, Ramay, Gunn,
Matsen, & Zhang, 2005; Casettari et al., 2012; Du & Hsieh, 2007; Gorochovceva, Naderi,
Dedinaite, & Makuska, 2005; Hu, Jiang, Xu, Wang, & Zhu, 2005; Jeong, Kim, Jang, & Nah,
2008; Muslim et al., 2001; Ouchi, Nishizaha, & Ohya, 1997; Peng, Xiong, Li, Chen, & Zhao,
2010; Sugimoto, Morimoto, Sashiwa, Saimoto, & Shigemasa, 1998; Yao, Zhang, Ping, & Yu,
2007; Zhang et al., 2008).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
92
Owing to the greater reactivity of the amino groups compared to hydroxyl groups
becomes easier and selective to obtain amino-derivatization of chitosan (Casettari et al., 2012;
Kurita, 2001; Xu, McCarthy, & Gross, 1996). The reductive amination (alkylation), reaction
between amino groups of chitosan and aldehyde or ketone groups in the presence of a
reducing agent, has been reported as a suitable method for modifying chitosan. It is selective
to functionalization of amino groups of the chitosan chain as well as can be performed in
aqueous solution under mild and homogeneous conditions (Desbrières, Martinez, & Rinaudo,
1996; Kurita, 2001; Rinaudo, 2006).
Several publications concerning the grafting of mPEG onto chitosan by reductive
amination have been reported (Abdel-Mohsen et al., 2012; Bentley et al., 1998; Bhattarai et
al., 2005; Du & Hsieh, 2007; Gorochovceva et al., 2005; Muslim et al., 2001; Sugimoto et al.,
1998; Yao et al., 2007; Zhang et al., 2008). In agreement with the literature, grafting mPEG
onto chitosan chain improves the water solubility and primarily exceeds the solubility limit of
the native biopolymer. This is one of the most important targets for expand the chitosan
applications. It has been reported that the water solubility depends on several parameters, such
as the molecular weight of mPEG and chitosan, the degree of substitution (DS) of grafted
chitosan, the degree of acetylation (DA), the acetyl groups distribution along the chain as well
as solution conditions (Casettari et al., 2012; Pillai et al., 2009; Rinaudo, 2006; Sogias et al.,
2010; Sugimoto et al., 1998).
Acetylation of the amine groups likewise has been used as a method for improving
water solubility of chitosan. Some authors showed that chitosan with DA about 50% may be
water-soluble even at a high pH (7-9). This behavior is different among chitosan samples with
other DA values (Kubota, Tatsumoto, Sano, & Toya, 2000; Lu, Song, Cao, Chen, & Yao,
2004; Qin et al., 2006; Sogias et al., 2010; Taghizadeh & Davari, 2006).
It is known that the solubility of mPEG-g-chitosan in water is effectively influenced
by DS with high molecular weight mPEG and DA of chitosan. Although mPEG graft onto
chitosan improves water solubility its, in general, the reaction methods used to obtain
chitosan-g-mPEG are laborious. The difficult removal of reagents and catalyst dispersed in
the final product, various reaction steps, slow purification processes and low degree of
conversion of mPEG into mPEG-aldehyde are aspects that need to be overcome (Casettari et
al., 2012; Gorochovceva et al., 2005; Sugimoto et al., 1998). Therefore, it would be
interesting apply DA and DS parameters, concomitantly, through of a simpler procedure to
achieve water-soluble chitosan. In the present study, chitosan was chemically modified with
grafting of mPEG by reductive amination and included simultaneously the acetylation of
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
93
chitosan backbone. The chemical reaction was operated as a one-pot process under mild
conditions. The intermediates and reagents of reaction were only eliminated in the separation
and purification process of the final product. Solubility of the samples was evaluated in water
and its aqueous solution properties were analyzed by zeta potential, rheology and small angle
X-ray scattering (SAXS) at a wide pH range.
2. Materials and methods
2.1.
Materials
Chitosan (CH) (Polymar LTD) was purified as follows: 5 g of chitosan were dispersed
in 1.5 L of acetic acid aqueous solution (0.5 M AcOH) and maintained under magnetic
stirring for 48 hours. The suspension was centrifuged for 20 minutes at 15000 rpm and 25 ºC.
The supernatant was separated and a sodium hydroxide aqueous solution (10% NaOH) was
added until precipitation of the polymer (pH 8.5). The precipitate was separated and then
dissolved in 1 L of 0.5 M AcOH solution under stirring, for 24 hours. The same
centrifugation/precipitation process was carried out by dissolving the precipitate in 0.5 L of
acidic solution. Finally, precipitate polymer was washed repeatedly with distilled water until
achieving conductivity of approximately 20 µS/cm, and then washed with ethanol/aqueous
solutions until washing with pure ethanol. The resulting polymer was vacuum dried at 60 ºC.
All the others reagents were of analytical grade and used without further purification.
Average viscosimetric molecular weight was estimated from the value of intrinsic
viscosity using the Mark–Houwink equation. Viscosity measurements were performed in an
Ubbelohde capillary viscometer (ϕ=53 mm) at 25 ± 0.05 °C maintained with a thermostatic
bath. The solvent used for viscosity measurements was 0.3 M acetic acid solution/0.2 M
sodium acetate solution. Before the experiments, the solvent and solutions were filtered
through 3 and 0.45 μm cellulose acetate membranes (Millipore) (Alves, Vidal, & Balaban,
2009; Kassai, 2007).
2.2.
Preparation and structural characterization of chitosan-g-mPEG
In this study, chitosan was chemically modified with insertion of methoxy
poly(ethylene glycol) (mPEG, Mw 2000 g/mol) by reductive amination using two methods: i)
traditional method - chitosan-g-mPEG (CHPII) was obtained with previous separation of the
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
94
mPEG-aldehyde through repeated precipitations in ethylic ether, then filtered and dried for
subsequent grafting onto chitosan backbone and ii) one-pot method - chitosan-g-mPEG
(CHPI) was obtained without previous separation of the mPEG-aldehyde, i.e., the resulting
reaction mixture containing mPEG-aldehyde was used directly to modify the chitosan.
mPEG-aldehyde was prepared by oxidation of the mPEG-terminal hydroxyl. Firstly,
mPEG was dissolved in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) followed by addition of acetic
anhydride (Ac2O). In one-pot method, 1% chitosan aqueous solution (0.5 M AcOH) was
added to initial system above. Afterward, sodium borohydride (NaBH4) was dropwise in the
reaction medium to reduce the imine groups formed during the reductive amination reaction.
The final mixture was poured in acetone and the precipitated polymer was separated and
dissolved in 0.5 M AcOH. Solution pH was increased to about 6 with NaOH solution and
dialyzed with dialysis membrane (Mw 12000 cut off) against distilled water. The obtained
product was freeze dried. The reaction conditions are summarized in Table 1. Reaction
scheme for the preparation of chitosan derivatives is shown in Fig. 1.
Table 1. Reaction conditions used in preparation of chitosan derivatives
Polymer
Ac2O/mPEG mPEG/CH NaBH4/mPEG
molar ratio
molar ratio
molar ratio
CHPIa
10
0.2
8
CHPIIb
10
0.2
5
Time (h)
13
2
24
a
CHPI: chitosan-g-mPEG obtained traditional method
b
CHPII: chitosan-g-mPEG obtained one-pot method
Fig. 1. Scheme of synthesis of chitosan derivatives
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
95
Structural characterization of the polymers was performed by 1H NMR spectroscopy
using a Varian Inovar 500 MHz spectrometer. The polymers (10 mg of CH and 20 mg of
derivatives) were dissolved in D2O/HCl (1 mL/0.05 mL) under magnetic stirring for 24 h, at
25 °C. The 1H NMR spectra were acquired at 70 °C (Lavertu et al., 2003). Degree of
deacetylation (DD) of chitosan and degree of substitution (DS) of derivatives were
determined by CHN elemental analysis using a Perkin Elmer analyzer, model 2400. The
solubility of the polymers in solution was evaluated by 2100AN turbidimeter – HACH, at 25
°C. Polymers were dissolved in 0.25 M AcOH solution at a concentration of 1 g/L under
magnetic stirring for 24 h. The pH of the solutions was adjusted to 3, 5 and 13 with the
addition of 10% NaOH solution. The polymer solutions used in each experiment were
prepared by following the same procedure above, but changing the polymer concentration and
pH of the solutions according to the requirements of each analysis.
2.3.
Zeta potential
Zeta potential (  ) data were obtained using a Brookhaven’s ZetaPALS to investigate
the liquid charge of polymeric systems in dilute solutions at 1 g/L and 3 g/L in the absence of
salt and in a pH range of 3-13 (CHPI) and 3-6 (CH and CHPII). The experiments were
performed at 25 °C and  measurements were reported with experimental error smaller than
2%. Zeta potential is related to the electrophoretic mobility (  ) by the Smoluchowski
Equation (1), where  is the viscosity of the solvent and  is the dielectric constant of the
solvent (Robles et al., 2013).
 
2.4.
 ………………………………………(1)

Rheology
Rheological measurements of the polymer solutions were carried out in a Haake Mars
Controller Rheometer using coaxial cylinder geometry (DG41 Ti) and the temperature was
controlled by a thermostatic bath coupled to the equipment. The viscosities of polymer
solutions at a concentration of 10 g/L were measured at shear rates ranging from 0.1 to 300 s-1
at 25 °C and in a pH range of 3-13 (CHPI) and at pH 3 (CH and CHPII). The rheological
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
96
behavior was also studied in a temperature range of 25 to 55 °C at a constant shear rate of 10
s-1.
2.5.
Small-angle X-ray scattering (SAXS)
The SAXS measurements of CH, CHPII and CHPI were performed at the D11ASAXS1 beamline of the Brazilian Synchrotron Light Laboratory - LNLS (Campinas-SP,
Brazil). Data were collected using Pilatus 300k detector and 300 s exposure time for each
measurement at 25 ºC. The scattering intensities I(q) were recorded with scattering vector q in
the range of 0.039 nm-1 < q < 1.45 nm-1 and at a wavelength of 1.488 Å. SAXS measurements
were performed at a polymer concentration of 15 g/L, in aqueous solutions with different pH
values (pH 3-13 for CHPI; pH 3 and 5 for CH and CHPII samples). The samples were placed
in a stainless steel sample holder closed by two mica windows and the scattering patterns
were recorded under vacuum. The scattering profiles were corrected for sample absorption
and detector response.
3. Results and discussion
3.1.
Chemical modification and structural characterization of chitosan-g-mPEG
In this study, the average molecular weight (Mv = 4.5×104 g/mol) of purified chitosan
(CH) was estimated through the Mark–Houwink equation and the intrinsic viscosity ([  ] =
255 mL/g) was calculated by the Huggins equation, extrapolating the concentration to zero
(Alves et al., 2009; Kassai, 2007). The degree of deacetylation (DD) of CH was estimated at
81% based on the CHN elemental analysis data using Equation (2) (Santos et al., 2009).
DD (%) = 100 (4 - 0.583093 x WC/N )
…………………….. (2)
Where WC/N is the mass ratio between the carbon and nitrogen present in chitosan.
In general, chitosan-g-mPEG have been produced at very low degree of substitution
(DS) or, in order to reach higher substitution on chitosan, some complex methods have been
used, involving multiple-step reactions to protect or generate intermediates and using
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
97
catalysts, which are difficult to remove. Moreover, important properties of the chitosan can be
lost when it has high DS (Sugimoto et al., 1998). Different methods have been used to obtain
chitosan derivatives with mPEG (Casettari et al., 2012). Among these, reductive amination
has also been used for grafting mPEG onto chitosan. This reaction occurs between amino
groups of chitosan and mPEG-aldehyde group in the presence of a reducing agent at neutral or
slightly acidic conditions, resulting in the chitosan-g-mPEG (Abdel-Mohsen et al., 2012;
Bentley et al., 1998; Bhattarai et al., 2005; Du & Hsieh, 2007; Gorochovceva et al., 2005;
Muslim et al., 2001; Sugimoto et al., 1998; Yao et al., 2007; Zhang et al., 2008).
Reductive amination can be performed in aqueous solution under very mild conditions
at pH 4–6, room temperature (25 °C) and homogeneous conditions to obtain randomly
distributed substituents along the chitosan backbone. In this study, mPEG was grafted onto
chitosan by reductive amination using one-pot and traditional methods. The reaction involved
the oxidation of mPEG-terminal hydroxyl using Ac2O and DMSO to convert the hydroxyl
group in aldehyde group. In one-pot method, the amount of Ac2O could not be too excessive
to prevent high reacetylation degree of amino groups of chitosan during reactional process.
Furthermore, the amount of DMSO should be optimized due to the insolubility of chitosan in
DMSO to avoid its precipitation at the beginning of the reductive amination. One-pot
preparation of chitosan-g-mPEG did not require the separation of the mPEG-aldehyde
intermediate, avoiding the use of organic solvent and lost time. In this procedure, the aqueous
solution of chitosan was added in the system after the oxidation of mPEG-terminal hydroxyl
in order to promote the reaction between amino group of chitosan and aldehyde group of
mPEG-aldehyde, resulting in imine group, which was reduced to amine by addition of
reducing agent (NaBH4).
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) is a widely used reducing agent in reductive
amination systems because it is more reactive and selective than usual reducing agents
(Desbrières et al., 1996). However, it is highly toxic and generates toxic by-products such as
hydrogen cyanide or sodium cyanide, which may result in product contamination. The use of
NaBH3CN is not acceptable in green synthesis, especially in industrial applications (Cho &
Kang, 2005; Sato, Sakamoto, Miyazawa, & Kikugawa, 2004). For the above reasons, we
preferred to use NaBH4, that is an inexpensive, safe to handle and environmental friendly
reducing agent.
Furthermore, one important point is that the excess of reducing agent can turn the
solution more alkaline in which chitosan becomes less soluble, leading to its precipitation and
suppressing the reduction of imine. These factors decrease the final polymer solubility.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
98
Therefore, the addition of the reducing agent must be dropwise and in a suitable quantity to
avoid precipitation of the polymer (Sugimoto et al., 1998). In this case, the reaction medium
had a good solubility, evidenced by the transparent color of the system.
The polymer purification step is very important and influences the polymer properties.
In our procedure, at the end of the reaction, the mixture was poured in acetone to precipitate
the polymer and remove undesirable reactants. The precipitated polymer was separated,
immediately dissolved in 0.5 M acetic acid solution, adjusted to pH 6, dialyzed against
distilled water and freeze dried. This methodology provided a pure product and improved the
solubility of the resulting polymer.
According to Sugimoto and coauthors, mPEG in the aqueous solution could go
through the dialysis membrane (cut-off molecular weight 12000) easily, but free mPEG could
not be separated from the mixture of mPEG, chitosan and chitosan-g-mPEG by the dialysis.
Furthermore, derivative would not precipitate from aqueous solution by the addition of
organic solvent like acetone in reaction medium, due to the high hydrophilicity of derivative
(Sugimoto et al., 1998). The latter question can be observed in our experiments, however the
addition of reaction mixture in pure acetone was a suitable methodology to obtain chitosan-gmPEG and remove free mPEG.
Chitosan and derivatives were characterized by 1H NMR. The spectra are shown in
Fig. 2. Compared with chitosan, the derivatives spectra clearly showed new peaks with a
strong signal at 3.85 ppm related to the methylene protons (e) of mPEG that is overlapped
with H-2-6 protons of chitosan, and a weak signal at 3.5 ppm was attributed to methyl protons
(d) of mPEG. In addition, a more intense signal at 2.30 ppm corresponding to methyl protons
of the acetyl group (H-8) appeared in the CHPI due to reacetylation of amino groups. A weak
signal at 3 ppm corresponding to protons of the methylene group linked to the N atom is
exhibited in insert shown in Fig. 2. The assignments demonstrate that the desired chemical
modification of polymer was achieved (Du & Hsieh, 2007; Hu et al., 2005; Yao et al., 2007).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
Rosangela_02PEG_IS_1H
99
0.0030
Normalized Intensity
0.0025
0.0020
CHP - tese.esp
0.025
f
0.0015
d
e
d
0.0010
0.020
0.045 CHP ppt - tese.esp
Normalized Intensity Normalized Intensity Normalized Intensity
0.0005
0.040
0.015
0.035
0.045
0.030
0.010
0.040
f
0
Quitosana-tese.esp
10
9
8
7
6
0.025
0.035
5
4
Chemical Shift (ppm)
3
2
1
0
-1
e
0.005
0.020
0.030
0.015
0.025
0.010
0.020
d
CHPI
9
8
7
6
f
5
4
e
Chemical Shift (ppm)
3
2
1
0
-1
3
2
1
0
-1
2
1
0
-1
0.005
0.015
CHPII
0.010
9
8
7
6
0.005
d
D25O
H-2-6
4
Chemical Shift (ppm)
H-1(D)
H-2(D)
H-8
CH
9
8
7
6
5
4
Chemical Shift (ppm)
3
Chemical shift (ppm)
Fig. 2. 1H NMR spectra for chitosan (CH) and derivatives (CHPI and CHPII) in D2O/HCl at 70 °C
Due to overlapping signals in 1H NMR spectra, the degree of substitution (DS) of
mPEG group grafted onto the chitosan backbone was estimated based on the CHN elemental
analysis data by the use of the C/N ratios in the following Equation (3) (Huo et al., 2010).
DS (%) =
C/N (mol)CHd  C/N (mol)CH
n
x 100
(3)
Where C/N (mol) is the C and N molar ratio of samples CHd – chitosan derivatives (CHPI or
CHPII) and CH – chitosan, and n is the number of carbons incorporated.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
100
The DS values for CHPII and CHPI were 1.6% and 2.4%, respectively. The degree of
substitution for CHPI was higher than to CHPII due to the reacetylation of amino groups
present in the chitosan chain, since the excess Ac2O reagent is present in the oxidation
reaction of mPEG-terminal hydroxyl during the preparation of CHPI using one-pot method.
This result is in accord with 1H NMR spectrum of CHPI, as shown in Fig. 2. The low DS can
be explained by low degree of conversation of original hydroxyl of mPEG to mPEG-aldehyde
and low reactivity to insertion of long mPEG-aldehyde chains on chitosan (Gorochovceva et
al., 2005).
The turbidity of CH, CHPII and CHPI in aqueous solution at different pH is
summarized in Table 2.
Table 2. Turbidity of chitosan (CH) and derivatives (CHPII and CHPI) at 1.0 g/L in 0.25 M AcOH
CH
CHPII
pH*
CHPI
Turbidity (NTU), 455 nm
3
19.4
8.2
10.2
5
18.0
8.6
10.6
13
184.0
186.0
10.9
*pH adjuted with 10% NaOH
An increase in turbidity is indicative of the formation of insoluble particles or
aggregates. The turbidity measurements indicated that the CH, CHPII and CHPI were soluble
in the aqueous solution at pH 3 and pH 5 (transparent solutions), with turbidity values of
around 19, 8 and 10 NTU, respectively. However, CH and CHPII became increasingly
insoluble at alkaline pH, causing increasing turbidity value to around 185 NTU. As opposed
to that, CHPI obtained by one-pot method exhibited a constant turbidity value (~10 NTU) at
acid and alkaline pH, indicating improved solubility in water when compared to other
polymers.
The solubility of chitosan and derivatives in acid aqueous solution is related to
protonated amino groups, thus these polymers become water-soluble cationic polyelectrolytes.
On the other hand, as the pH increases, amino groups become deprotonated and the polymers
lose its charges. CH and CHPII became insoluble at neutral and basic pH, while CHPI
remained soluble in a wide pH range, in contrast to the precursor polymer, which precipitates
above pH 6.5.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
101
The low incorporation of hydrophilic and flexible mPEG chains onto chitosan
backbone combined with the reacetylation of amino groups prevented interactions between
the CHPI macromolecules avoiding precipitation with increasing pH, due to the pronounced
hydrogen bonding between CHPI chains and water, which favored its solubility. According to
literature, the reacetylation of amine groups also has been used to improve the water solubility
of chitosan due to decrease in crystallinity. This behavior is achieved by reacetylated chitosan
with DA around 50%, indicating reducing chain packing due to steric hindrances caused by
acetyl groups (Kubota et al., 2000; Lu et al., 2004; Qin et al., 2006; Sogias et al., 2010;
Sugimoto et al., 1998; Taghizadeh & Davari, 2006). Sogias and coauthors showed that occur
chemical disruption of chitosan crystallinity through partial reacetylation caused by the
addition of Ac2O (Sogias et al., 2010). In our study, it was observed that CHPI obtained from
original chitosan with DA 19% and modified with low DS 2.4% (mPEG and reacetylated
amine groups) exhibited a good solubility in water and thus can be used in a wide pH range.
Sugimoto and coauthors obtained chitosan-mPEG and some of these were soluble in
saline buffer. However, when the solubility was evaluated at a concentration of 5 mg/mL in
1% acetic acid aqueous solution and after increasing of pH with NaOH, a little precipitate
appeared after standing at pH 11. They showed that chitosan-mPEG of high DS was watersoluble, while that chitosan-mPEG of low DS were water-insoluble (Sugimoto et al., 1998).
In our study, the advantage of reductive amination by one-pot method was to obtain chitosang-mPEG with low degree of substitution and soluble in aqueous solution in a wide pH range
(pH 3-13). The mPEG is biocompatible, but it is not biodegradable, therefore a low degree of
substitution is more appropriate, while that high degree of substitution of the amino groups on
chitosan backbone could lead to lose the physicochemical and biochemical properties of
precursor.
3.2.
Polymer properties in aqueous solution
As the charge density and physicochemical properties of chitosan and derivatives are
substantially influenced by the medium pH, properties of salt-free polymers aqueous solutions
were analyzed by zeta potential, rheology and SAXS at a wide pH range.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
102
3.2.1. Zeta potential
Zeta potential (  ) provides an indirect measurement of net charge of the system,
resulting of charged particle surface and solution conditions, and is a relative indicator of
system stability. Particles containing amine groups can undergo ionization in solution such as
chitosan, thus the ionization degree depends on the pH of the solution. Therefore, zeta
potential is strongly influenced by pH change of the solution in which the particles are
dispersed. Fig. 3 shows zeta potential as a function of pH for chitosan (CH) and derivatives
(CHPII and CHPI).
70
60
CH 1g/L
CH 3g/L
CHPII 1g/L
CHPII 3g/L
CHPI 1g/L
CHPI 3g/L
Zeta potential (mV)
50
40
30
20
10
0
-10
-20
2
4
6
8
10
12
14
pH
Fig. 3. Zeta potential as a function of pH of the medium for chitosan (CH) and derivatives (CHPII and CHPI)
In acidic medium,  values were positive for all the polymers solutions studied due to
the protonation of the amino groups, as the pH increased from 3 to 6, the number of
protonated amino groups was reduced, resulting in lower positive  values. On the other
hand, in basic medium,  values were negative for CHPI owing to the amino groups of the
polymer are not protonated. The negative signal is the result of the basic aqueous solution.
The CHPI does not precipitated at basic pH, it remained in solution because of strong
hydrogen bonding between CHPI and water molecules.
At pH 3, there is a greater difference between  values of polymers solutions, with
higher  values for derivatives than that of chitosan. This result can be attributed the steric
contribution of the mPEG hydrophilic substituent, which improved the solubility of polymer
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
103
in solution and favored a higher exposure of positive charges of the polymeric surface. The
values of  for CHPII (1 and 3 g/L,  ~ + 60 mV) are higher when compared to the 
values for CHPI (1 g/L,  ~ + 45 mV and 3 g/L,  ~ + 27 mV). Since the reacetylation of
amino groups only occurred in the chemical modification to obtain CHPI, decreasing the
number of protonated amino groups and increasing aggregation with rise polymer
concentration.
Considering zeta potential as a function of pH, our results are in accord with the
observations reported in the literature (Yang et al., 2010; Pujana, Pérez-Álvarez, Iturbe, &
Katime, 2012). Yang and coauthors observed that the zeta potential values of chitosan-gpluronic in aqueous solution decreased with increasing pH (Yang et al., 2010). Similar
behavior was observed by Pujana and coauthors for PEG in aqueous solution (Pujana et al.,
2012).
3.2.2. Rheological properties
Fig. 4 shows the apparent viscosity as a function of the shear rate for chitosan (CH)
and chitosan-g-mPEG (CHPII and CHPI) at polymer concentration of 10 g/L in 0.25 M acetic
acid solution at 25 ºC, the insert shows an enlargement of the curve of CH at pH 3. Apparent
viscosity for chitosan and derivatives solutions at pH 3-7 slightly decreased with the
increasing shear rate, indicating shear thinning behavior. This effect is related to orientation of
the polymer chains in the flow direction and disruption of the physical interactions between
polymeric chains through the application of strains in the polymer solution as the shear rate
increases (Chiu et al., 2009). Furthermore, a pronounced shear thinning behavior can be
clearly observed for CHPI solution at pH 11 and 13, suggesting an increase of the
intermolecular interactions by hydrogen bonds and hydrophobic associations. However, the
physical interactions between the polymeric chains were capable of quickly reforming after
the decreasing of shear rate due to molecular self-association process, showing that the
hysteresis is present in the dynamic of these solutions.
The viscosity values were slight greater for CH than for CHPII and CHPI in acid
solutions. The cationic nature of chitosan in acid medium causes expansion of the polymeric
chains owing to electrostatic repulsions. According to literature (Rinaudo, 2006; Sogias, et al.,
2010), chitosan exhibits a partially crystalline structure with strong hydrogen bonds, which
favor the intermolecular interactions resulting in a higher viscosity for chitosan solution. As
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
104
opposed to that, grafting of mPEG segments onto the structure of chitosan can separate its
chains through steric hindrance, resulting in decreasing the intermolecular interactions.
Similar results were found by Hu and coauthors (Hu et al., 2005). The apparent viscosity for
CHPI solution decreased with the increase in pH from 3 to 5, due to the decrease of charge
density, a similar behavior was obtained for CH and CHPII (not shown here). However, in pH
11 and 13, the apparent viscosity for CHPI solutions significantly increased compared to
behavior in acid and neutral pH conditions. This result is owing to the decreasing of solvent
quality, which favors the polymer-polymer interactions increase, indicating the formation of
intermolecular aggregates.
Apparent viscosity (mPa.s)
Apparent viscosity (mPa.s)
100
30
CH pH 3
CHPII pH 3
CHPI pH 3
CHPI pH 5
CHPI pH 7
CHPI pH 11
CHPI pH 13
CH pH3
25
20
15
0
50
100
150
200
250
300
Shear rate (1/s)
10
0
50
100
150
200
250
300
Shear rate (1/s)
Fig. 4. Apparent viscosity as a function shear rate for chitosan (CH) and derivatives (CHPII and CHPI) at 10
g/L, at different pH values and at 25 °C. The insert shows an enlargement of the curve of CH at pH 3
The apparent viscosity curves for CH, CHPII and CHPI in aqueous solutions at
different pH as a function of temperature are shown in Fig. 5. At pH 3, 5 and 7, apparent
viscosity of polymers aqueous solutions decreased as temperature rose. This behavior is
resulted of greater thermal molecular agitation, which leads to reduced intermolecular
interactions, thus decreasing the flow resistance. On the other hand, in basic medium, the
viscosity of the CHPI solutions was higher and maintained practically constant with the
increase of temperature, suggesting the formation of stronger intermolecular aggregates.
When temperature increases, CHPI undergoes a dehydration process. This process can be
attributed to the break of hydrogen bonds, primarily between ether groups and water
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
105
molecules, resulting in enhancement of intermolecular hydrophobic associations (Yang et al.,
2010). These data clearly show that CHPI exhibits thickening behavior and thermal stability
in basic medium in temperature range studied.
70
Apparent viscosity (mPa.s)
60
CH pH 3
CHPII pH 3
CHPI pH 3
CHPI pH 5
CHPI pH 7
CHPI pH 11
CHPI pH 13
50
40
30
20
10
0
25
30
35
40
45
50
55
60
Temperature (°C)
Fig. 5. Apparent viscosity as a function of temperature for chitosan (CH) and derivatives (CHPII and CHPI) at
10 g/L, at different pH values and at 10 s−1
3.2.3. Small-angle X-ray scattering (SAXS)
The influence of the pH in the conformation of the salt-free polymers solutions (15 g/
L) was examined by SAXS. Fig. 6a, b shows the logarithmic plots of the scattered intensity I
(q) versus scattering vector q (nm-1) for CH, CHPII and CHPI at different pH values.
The Fig. 6a shows a polyelectrolyte peak more pronounced for CH in aqueous solution
at pH 3 than at pH 5. This result can be attributed to the increase charge density along the
polymer chain with the decreasing pH value of the solution. The electrostatic repulsion
between its positively charged chains leads to an extended conformation of the chains, which
favors the reduction of the distance between chains. Boucard e coauthors described a similar
behavior to the changes in the SAXS diagram during gelation of a chitosan in aqueous acidic
solution in contact with ammonia gas. The polyelectrolyte peak in the studied gels
disappeared fully at pH above 6.5, due to neutralization of the NH3+ groups onto the chitosan
backbone (Boucard et al., 2007).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
106
The position of the peak at q maximum increased with decreasing the pH from 5 to 3.
The scattering vector q at the maximum (max) of the correlation peak is related to the
correlation length (  ) or distance between chains according to Bragg’s law (   2 / qmax )
(Popa-Nita, Rochas, David, & Domard, 2009). SAXS curves of CH, in aqueous solutions at
pH 3 and pH 5, exhibited positions of qmax in agreement with those observed for chitosan
acetate solutions with different DA by Popa-Nita and coauthors. These authors observed a
shift of qmax toward higher q values with decreasing DA (Popa-Nita et al., 2009).
-3
6x10
-3
6x10
(a)
-3
5x10
-3
4x10
-3
4x10
-3
3x10
-3
3x10
I (q) (a.u.)
I (q) (a.u.)
(b)
-3
5x10
-3
2x10
CH pH 3
CH pH 5
CHPII pH 3
CHPII pH 5
CHPI pH 3
CHPI pH 5
-3
10
0,1
-3
2x10
CHPI pH 3
CHPI pH 5
CHPI pH 7
CHPI pH 9
CHPI pH 11
CHPI pH 13
-3
10
q (nm-1)
1
0,1
q (nm-1)
1
Fig. 6. Logarithmic plot of the scattered intensity I (q) as a function of the scattering vector q for (a) chitosan
(CH) and derivatives (CHPII and CHPI) and (b) CHPI, at a polymer concentration of 15 g/L, in aqueous
solutions with different pH values, at 25 °C
The polyelectrolyte peak practically disappeared for CHPII (DS 1.6%) and CHPI (DS
2.4%) with increasing pH (Fig. 6a), which was attributed to the decrease in the polymer
charge density. Similar behavior was observed with increasing DS, thus CHPI exhibits a less
extended conformation than the CHPII.
As pH increased, the charge density on the polymer backbone gradually decreased and
the reduction in electrostatic repulsion reinforced the hydrogen bonding between CHPI
chains. The polyelectrolyte peak observed for CHPI at pH 3 disappeared fully at pH  7 (Fig.
6b). This behavior can be explained by the neutralization of protonated amino groups of
CHPI, indicating the absence of the polyelectrolyte character and pronounced hydrogen
bonding between CHPI chains and water that contributed to the stability of the polymer in this
medium, as discussed previously by the data of solubility and zeta potential.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
107
4. Conclusions
The chemical modification of chitosan was successfully performed by reductive
amination under mild homogeneous conditions and using a facile method (one-pot), which
consisted in an attractive procedure to obtain a chitosan derivative, chitosan-g-mPEG (CHPI),
with both low DS and water-solubility in a wide pH range (3-13). The turbidity and zeta
potential data showed that mPEG substituent contributed to improve the solubility and
stability of chitosan in aqueous medium. In contrast to the chitosan, CHPI did not present a
polyelectrolyte character depending of pH value. The rheological properties of CHPI showed
a more pronounced shear thinning behavior, hysteresis phenomenon, thickening effect and
thermal stability in basic aqueous solution, which are desirable properties in various fields of
applications.
Acknowledgements
The authors thank IFRN and MCT/ANP/PRH30 for the financial support,
NUPPRAR/UFRN for the CHN elemental analysis and ABTLuS for the use of LNLS
facilities (Project D11A - SAXS1 # 13546) at Campinas-SP, Brazil. The authors also thank
Dra. Nádya Pesce da Silveira and José Daniel Souza of LIMDIM Laboratory from UFRGS
for the zeta potential analysis.
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Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
111
Hydrophilic and hydrophobic chitosan derivatives: The effect of pH on the
stability and aggregation phenomenon in the dilute regime
Keila S. Alvesa,b*, Bruna V. Limaa, Ruza G. M. A. Macedoa, Marcos A. Villettic, Rosangela C. Balabana
a
Laboratory of Petroleum Research, LAPET, Institute of Chemistry, Federal University of Rio Grande do Norte,
UFRN, 59078-970, Natal/RN, Brazil
b
Federal Institute of Education, Science and Technology of Rio Grande do Norte, IFRN, 59508-000,
Ipanguaçu/RN, Brazil
c
Lepol, Department of Physics, CCNE, Federal University of Santa Maria, UFSM, 97105-900, Santa Maria/RS,
Brazil
*Correspondence to: K. S. Alves (E-mail: [email protected])
Abstract
Chitosan derivatives grafted with hydrophilic (poly(ethylene glycol) - mPEG) and/or
hydrophobic (n-dodecyl) groups by reductive alkylation under mild reaction conditions using
one-pot method were characterized by nuclear magnetic resonance (1H NMR) and CHN
elemental analysis. Size of aggregates and stability in diluted solutions of chitosan and
derivatives were evaluated as a function of varying pH by dynamic light scattering (DLS) and
zeta potential. DLS analyses revealed that although the dilute polymer solutions at pH 3 have
a high density of protonated amino groups along the polymer chain, the high degree of charge
contributed significantly to aggregation, promoting increased particle size with the decrease in
pH. The hydrophobic groups also contributed to increasing the size of aggregates in solution
at pH 3, whereas the hydrophilic group helped reduce their size across the entire pH range.
Zeta potential results indicated that its values do not depend solely on the surface charge of
the particle, but are also dependent of the presence of the hydrophilic and hydrophobic
groups.
Keywords: Chitosan; hydrophilic and hydrophobic derivatives; pH-responsive; aggregation;
dynamic light scattering; zeta potential
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
112
1. Introduction
The study of physicochemical properties of a polymer in solution is highly significant
because it leads to correlations between polymer properties/structure and its performance in a
particular application. Chitosan, an important biopolymer isolated principally of crustacean
wastes, and its derivatives have been extensively studied due to their interesting properties in
solution and their varied applications (Domard, 2011; Korchagina & Philippova, 2010;
Kulikov et al., 2012; Kumirska, Weinhold, Thöming, & Stepnowski, 2011; Philippova &
Korchagina, 2012; Popa-Nita, Alcouffe, Rochas, David, & Domard, 2010; Rinaudo, 2006;
Robles et al., 2013; Schatz, Pichot, Delair, Viton, & Domard, 2003).
It is known that chitosan is considered an amphiphilic macromolecule in which the
fraction of amino and acetamide units distributed along the polymer backbone are responsible
for the balance between hydrophilic and hydrophobic interactions (Domard, 2011; Schatz et
al., 2003). Furthermore, it is soluble only in acidic aqueous solutions due to protonation of the
amino groups on macromolecule and therefore it behaves as a cationic polyelectrolyte. In this
case, the electrostatic interactions also play an important role in determining behavior of
chitosan in aqueous solutions. Thus, the organization of the chitosan chains in solution
depends of different types of contributions such as electrostatic interactions, hydrophobic
interactions and hydrogen bonding (Kumirska et al., 2011; Philippova & Korchagina, 2012;
Pillai, Paul, & Sharma, 2009; Popa-Nita et al., 2010; Rinaudo, 2006).
The physicochemical properties of chitosan solutions and its derivatives are related to
polymer-polymer interactions (intra- and inter-molecular) and polymer-solvent interactions.
These relationships depend on the structural characteristics of the polymer and solution
parameters, such as the degree of acetylation (DA: fraction of acetamide units on the chitosan
backbone), charge density and its distribution along the polymeric chain, molecular weight,
polymer concentration, temperature, dielectric constant of the solvent, pH of the solution,
time and ionic strength. All these factors are very important to evaluate and to control the
properties of chitosan in solution (Chiu et al., 2009; Domard, 2011; Kumirska et al., 2011;
Nyström, Kjøniksen, & Iversen, 1999; Philippova & Korchagina, 2012; Philippova et al.,
2012).
The chitosan chains in solution may behave as individual macromolecules and/or as
aggregates. The parameters that affect the aggregation behavior of chitosan have been an
ongoing subject of interest. According to literature, the aggregates have been assigned to three
main effects: the residual acetyl groups, the deprotonated amino groups and polymer
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
113
concentration (Chen, Hsu, Huang, Tsai & Chen, 2011; Domard, 2011; Philippova &
Korchagina, 2012; Schatz et al., 2003). Nevertheless, the exact mechanism of the formation of
aggregates is not still well understood (Blagodatskikh et al., 2013; Philippova et al., 2012).
In general, most of the studies of hydrodynamic properties of chitosan by dynamic
light scattering (DLS) have been carried out in aqueous salt solutions to shield the positively
charged amino groups and thus to minimize the strong electrostatic interactions between
polymeric chains (Blagodatskikh et al., 2013; Chen et al., 2011; Philippova & Korchagina,
2012; Philippova et al., 2012; Popa-Nita et al., 2010). Although the pH itself significantly
alters the charged system and hence properties of chitosan and its derivatives in solution, only
a few studies report the influence of solution pH in absent of salt to the chitosan systems (Liu,
Xu, Guo, & Han, 2009; Pa & Yu, 2001; Schatz et al., 2003).
More recently, it was demonstrated by dynamic light scattering (DLS) measurements
that the filtration procedures of chitosan solutions affect the aggregation of the
macromolecules (Blagodatskikh et al., 2013; Chen et al., 2011; Popa-Nita et al., 2010).
Approaches concerning the chitosan aggregation in aqueous solution have been reported,
however, there are still some important issues which require to be addressed.
The aim of this study was evaluate the effect of pH on the zeta potential and size of
aggregates in diluted solution of chitosan and its derivatives grafted with hydrophilic and/or
hydrophobic substituents which were prepared by one-pot method under mild conditions. In
addition, centrifuged samples were analyzed by DLS measurements in order to observe if
there is any characteristic relationship between the aggregation behavior of chitosan and its
derivatives.
2. Materials and methods
2.1 Materials
Chitosan (CH) (Polymar LTD) was purified by dissolving-centrifuge-precipitation
process (Alves, Lima, Villetti, & Balaban, In manuscript). The molecular weight was
estimated from the intrinsic viscosity value ([η] 255 mL/g) using the Mark–Houwink equation
(Mv 4.5x104 g/mol) (Alves, Vidal, & Balaban, 2009; Kassai, 2007). Codes for the chitosan
derivatives CHC, CHP and CHPC correspond to hydrophobically (dodecyl) modified
chitosan, chitosan-g-mPEG, and hydrophilic and hydrophobically modified chitosan,
respectively. All the others reagents (methoxy poly(ethylene glycol) (mPEG Mw 2000), acetic
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
114
anhydride (Ac2O), dimethyl sulfoxide (DMSO), sodium borohydride (NaBH4) and n-dodecyl
aldehyde) were of analytical grade and used without further purification.
2.2. Chemical modifications of chitosan and characterization of derivatives
The chitosan was grafted with hydrophilic and/or hydrophobic groups by reductive
alkylation. CHP was obtained on based in the literature, but with some modifications. mPEGterminal hydroxyl was converted into an aldehyde group by mild oxidation using Ac2O and
DMSO. The resulting reaction mixture without previous separation of the PEG-aldehyde was
used to modify the chitosan through one-pot method. In this case, the reacetylation of amino
groups occurred during chemical modification. Final system was precipitated in acetone,
separated and dissolved in 0.5 M acetic acid solution, adjusted to pH 6, dialyzed against
distilled water and freeze dried. CHPC was prepared in a similar manner to CHP, but with
addition of dodecyl groups, through reaction between dodecyl aldehyde and the chitosan
amine groups. CHC was performed as reported by Desbrières (Desbrières, Martinez, &
Rinaudo, 1996), however following the purification described above. The reaction conditions
are summarized in Table 1.
Table 1. Reaction conditions used in preparation of chitosan derivatives
Polymer
Ac2O/mPEG mPEG/CH dodecyl/CH NaBH4/mPEG
molar ratio
molar ratio
molar ratio
molar ratio
CHC
-
-
0.1
5
CHP
10
0.2
-
8
CHPC
10
0.2
0.1
8
Time (h)
13
2
2
24
Structural characterization of the polymers was performed by 1H NMR spectroscopy
using a Varian Inovar 500 MHz spectrometer. The polymers (10 mg of CH and 20 mg of
derivatives) were dissolved under magnetic stirring in D2O/HCl (1 mL/0.05 mL), at 25 °C, for
24 h. The 1H NMR spectra were acquired at 70 °C (Lavertu et al., 2003). Degree of
deacetylation (DD) of chitosan and degree of substitution (DS) of derivatives were
determined by CHN elemental analysis using a Perkin Elmer analyzer, model 2400.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
115
2.3. Dynamic light scattering (DLS)
DLS measurements were performed using a Brookhaven Instrument goniometer to
investigate the size of particles of chitosan and derivatives in dilute solutions at 1 g/L in the
presence of different pH values. The experiments were carried out at a scattering angle of 90°
and at 25 °C. A laser He-Ne (λ = 632.8 nm) was used as light source. The solutions were
thermostated in a refractive-index-matching liquid (decaline). In the DLS experiments, the
normalized intensity autocorrelation function, g2 (t), is related to the normalized electric field
autocorrelation function, g1 (t), by Siegert relation, as demonstrated in Equation (1) (Villetti et
al., 2011), where β is the spatial coherence factor.
g 2 (t) = 1 +  g1 (t)
2
(1)
For polydisperse systems, the g1 (t) can be written as an integral through the Equation
(2) (Chen et al., 2011).
g1 (t) =  A(τ)e(  t/τ)dτ
(2)
Where A (τ) is a distribution of relaxation times and t is the delay time of the correlation
function.
Distributions of relaxation times A (τ) were obtained from the intensity of
autocorrelation function by using the GENDIST program which employs the algorithm
REPES. In this study, the distributions of the relaxation times are shown as τ(A)τ versus log
(τ /µs). The mean relaxation times (τ) or the relaxation frequency (Γ = 1/ τ) can be
quantitatively associated to an apparent diffusion coefficient (D) determined according to the
Equation (3) (Heineck, Cardoso, Giacomelli, & Silveira, 2008).
D=

q2
q is the magnitude of the scattering vector given by Equation (4).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
(3)
116
q=
4πn
θ
sin  
λ
2
(4)
Where θ is the scattering angle, n is the medium refraction index, and λ is the light
wavelength.
Finally, hydrodynamic radius (RH) of the polymers was calculated using the
Stokes−Einstein Equation (5) (Santos et al., 2012), where kB is the Boltzmann constant, T is
the absolute temperature and η is the viscosity of the solvent.
RH =
κ BT
6πηD
(5)
2.4. Zeta potential
Direct measurements of the zeta potential () can not be made, however, the Zeta
potential can be calculated from electrophoretic mobility (µ) measurements of the particles in
solution. Zeta potential data were obtained using a Brookhaven’s ZetaPALS to investigate the
liquid charge of polymeric systems in dilute solutions at 1 g/L in the absence of salt in
different pH values. The experiments were performed at 25 °C. Results of the  were reported
with experimental error smaller than 2%.
The Smoluchowski Equation (6) was used to convert mobility to zeta potential, as follows
(Robles et al., 2013), where  is the viscosity of the solvent and  is the dielectric constant of
the solvent.
 =
ημ
ε
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
(6)
117
3. Results and discussion
3.1. Structural characterization of chitosan derivatives
Chitosan derivatives with dodecyl alkyl groups as hydrophobic moieties and/or mPEG
chains as hydrophilic moieties were synthesized for study the effect of pH on the size of
aggregates of polymers in aqueous solutions and evaluate the influence of hydrophobic and
hydrophilic groups. Reaction scheme for the preparation of chitosan derivatives is shown in
Fig. 1 (a). The structural characterization of the derivatives by 1H NMR confirmed the
presence of hydrophobic and/or hydrophilic groups grafted onto the chitosan backbone. The
Fig. 1 (b) displays 1H NMR spectra for chitosan and derivatives.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
118
Fig. 1. Scheme of synthesis of chitosan derivatives (a) 1H NMR spectra for chitosan and derivatives in D2O/HCl
at 70 °C (b)
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
119
Proton signals for chitosan were assigned as follows: 2.30 ppm (methyl protons, acetyl
group-H-8), 3.45 ppm (H-2 (D)), 3.75-4.25 ppm (H-2-6) and 4.7 ppm (H-1 (D)) (Lavertu et
al., 2003). Compared with the unmodified chitosan, the 1H NMR spectra of derivatives show
additional peaks due to the protons of hydrophobic and hydrophilic groups. The signals for
CHC at 0.5 and 0.9 ppm are exclusive of the substitution reaction of dodecyl grafted onto the
chitosan chain, which are attributed to the methyl (a) and methylene (b) protons, respectively.
According to literature the protons due to methylene group linked to the N atom is superposed
with signal attributed to H-2 proton of the glucosamine residue (Desbrières et al., 1996; Yao,
Zhang, Ping, & Yu, 2007). The CHP spectrum shows a strong signal at 3.85 ppm related to
the methylene protons (e) of mPEG that is overlapped with H-2-6 protons of chitosan, and a
weak signal at 3.5 ppm was attributed to methyl protons (d) of mPEG (Du & Hsieh, 2007; Hu,
Jiang, Xu, Wang, & Zhu, 2005; Yao et al., 2007). For CHPC, the characteristic signals of both
dodecyl and mPEG indicated the coexistence of two grafts onto chitosan.
The degree of deacetylation (DD) for CH and degree of substitution (DS) of groups
grafted onto the chitosan backbone were estimated based on the CHN elemental analysis data
by the use of the C/N ratios in the following Equations (7) e (8) (Santos et al., 2009; Huo et
al., 2010).
DD (%) = 100.(4 - 0.583093 x WC/N )
(7)
Where WC/N is the mass ratio between the carbon and nitrogen present in chitosan.
DS (%) =
C/N (mol)CHd  C/N (mol)CH
n
x 100
(8)
Where C/N (mol) is the C and N molar ratio of samples CHd – chitosan derivative (CHC,
CHP or CHPC) and CH – chitosan, and n is the number of carbons incorporated.
The DD of chitosan was estimated at 81% and the DS values for CHC, CHP and
CHPC were 10%, 2.4% and 3.5%, respectively.
The amount of the amino groups present in the chitosan is a factor important to
understand association and dissociation mechanisms at the molecular level. Chitosan exhibits
protonated amino groups in acid solutions, which become it soluble in this medium. On the
other hand, as the pH increases above 6.5, charged amino groups of the polymer decrease and
thus chitosan becomes insoluble, with pKa value around pH 6-6.5. Chitosan derivatives
grafted with hydrophobic and hydrophilic segments were obtained by reductive alkylation
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
120
under mild conditions and using a facile method (on-pot), which consisted in an attractive
procedure to obtain soluble chitosan derivatives (CHP and CHPC) in aqueous medium in a
wide pH range. CHP and CHPC were soluble in acidic aqueous solution and maintained
soluble when increasing pH to neutral and alkaline, in contrast to the precursor polymer.
Detailed discussions of the chemical modification will appear in a following publication
(Alves, Lima, Villetti, & Balaban, In manuscript).
3.2. Dynamic light scattering (DLS)
DLS analyses provide information on the size distribution of polymer particles,
whether the macromolecules are individual in solution or aggregated. Moreover, DLS is a
highly sensitive technique for investigating the presence of aggregates in dilute solutions,
since the intensity of light scattering rises significantly with the increase in particle diameter.
Even a small population of aggregates results in high intensity light scattering (I α d 6).
Therefore, DLS has been widely used to study the aggregation behavior of several polymers
in aqueous solution, including chitosan (Blagodatskikh et al., 2013; Chen et al., 2011;
Philippova 2012; Popa-Nita et al., 2010).
The phenomenon of chitosan chain aggregation in aqueous solutions, studied by DLS,
has been attributed primarily to three effects: (a) residual acetyl groups, (b) the deprotonation
of amino groups and (c) polymer concentration. New aspects that influence chitosan
aggregation in aqueous solution have recently been addressed, such as procedures involved in
the filtration of polymer solutions, considering different membrane types and porosity.
However, there are other noteworthy effects that may contribute to aggregate formation in
chitosan solutions (Blagodatskikh et al., 2013; Chen et al., 2011, Philippova et al., 2012;
Popa-Nita et al., 2010).
Generally, the hydrodynamic properties of chitosan and polyelectrolytes in solution,
analyzed by DLS, are evaluated in saline aqueous solution. In the case of chitosan, in the
presence of salt the positively charged amino groups are shielded by salt ions, thereby
reducing the strong electrostatic interactions between the polymer chains (Blagodatskikh et
al., 2013; Chen et al., 2011; Philippova e Korchagina, 2012; Philippova et al., 2012; PopaNita et al., 2010). Although pH significantly alters the systems constituted by positive and/or
negative charges and hence the properties of a polyelectrolyte in solution, there are few
publications that report studies on chitosan and its derivatives in aqueous solution in the
absence of salt (Liu et al., 2009; Pa e Yu, 2001, Schatz et al., 2003).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
121
DLS analyses were performed to assess the influence of pH on the size of aggregates
of chitosan and their derivatives, using centrifuged polymer solutions to minimize aggregate
loss. Fig. 2 shows the normalized temporal autocorrelation functions (a) and relaxation time
distribution curves (b) obtained with REPES software for aqueous solutions of chitosan at pH
3, 5 and 6. According to Fig. 2 (a), the relaxation process of the chitosan in solution occurs
over longer periods at pH 3 than pH 5 and pH 6. In other words, the macromolecules of
chitosan take longer to relax at low pH than at high pH. The behavior observed by the
temporal autocorrelation functions is also described by the relaxation time distribution curves;
however, depending on pH, different populations of particles are evident in the chitosan
solution, attributed to fast and slow relaxation modes (Fig. 2 (b)).
1.2
CH pH 3
CH pH 5
CH pH 6
Fit
1.0
g2 () - 1
0.8
0.6
0.4
0.2
(a)
0.0
1
2
3
4
5
6
log  (s)
1.2
CH pH 3
CH pH 5
CH pH 6
1.0
 A ()
0.8
0.6
0.4
0.2
(b)
0.0
1
2
3
4
5
6
log  (s)
Fig. 2. Normalized autocorrelation functions (a) and their corresponding relaxation time distributions (b)
measured at scattering angle of 90° as revealed by REPES analysis for solutions of chitosan (CH) in a
concentration of 1.0 g/L in 0.1 M AcOH at pH 3-6, at 25 °C
Rapid relaxation occurs within a shorter time period while slow relaxation takes place
over a longer period. The former may be the result of movement between the polyelectrolyte
chains and the counterions of the solvent, whereas the latter can be attributed to the formation
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
122
of aggregate structures in solutions due to the interaction of several chitosan molecules. At pH
5, the distribution curve of the chitosan particles showed a single population with a mean RH
value of 151 nm, attributed to the aggregates. At pH 3 and pH 6, populations of individual
chains (RH = 24 nm) and aggregates (RH = 478 nm, pH 3 and RH = 151 nm, pH 6) were well
defined. However, individual chains may be hidden at pH 5 due to a wider particle
distribution.
The varying pH of the solution alters the degree of ionization of the polymer, thereby
affecting the charge density in a polyelectrolyte solution. In turn, the charge density also
depends on the distribution of fixed charges over the macromolecule, counterions and
electrolytes added in solution. In the case of an aqueous solution of chitosan at pH 3, in the
absence of salt, a greater density of positive charges along the polymer chains favors an
extended conformation. According to the chain model that describes the expansion of
polyelectrolytes in solution, polymer chains can be considered locally rigid, acquiring a
similar conformation to that of a stiff rod. This supposition is only strictly true if the
polyelectrolyte solution is diluted in the absence of salt (Villetti, 2001).
Table 2 shows that the hydrodynamic radius of aggregates in the chitosan solution
increases with the decreasing pH value of the solution. At pH 3, the chitosan chain is
extended and its interaction with the counterions of the solvent (acetate) may lower the
electrostatic repulsion between its positively charged chains and reduce the distance between
its macromolecules, favoring the formation of aggregates through intermolecular interactions.
This behavior can be explained by Manning’s theory, which applies to polyelectrolyte
solutions in the absence of salt and predicts the counterion condensation phenomenon.
According to the model, polyelectrolytes can acquire a high density charge when dissolved in
solution. Thus, the electrostatic potential around the polyelectrolyte can affect the equilibrium
of the counterions distribution in solution. When pH increases from 5 to 6, the charge density
of protonated amino groups decreases. This contributes to reducing electrostatic repulsion and
the stiffness of the polyelectrolyte, causing the shrink of the polymer chains in solution.
Moreover, the reduction in the quality of the solvent also collaborates with this effect. These
conditions favor the formation of aggregates that differ in size and nature from those found at
pH 3, where larger aggregates are observed. Pa and Yu (2001) also reported an increase in the
particle size of chitosan in solution when pH changed from 3.50 to 1.55.
Chen et al. (2011) studied the aggregation behavior of chitosan samples (DA 30% and
7.3%) in solutions with different salt concentrations (0.01 – 0.5 M) using DLS. The increase
in ionic strength from 0.1 M and greater degree of acetylation contributed to increasing the
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
123
hydrodynamic radius of chitosan in dilute solution. In a solution of average ionic strength (I =
0.1 M), the sample with the highest degree of acetylation only exhibited aggregates when the
light scattering angle was reduced from 90º to 30°, whereas ionic strength had to be increased
above 0.1M in order to observe aggregates in the sample with the lowest degree of
acetylation. In a solution with low ionic strength (I = 0.01 M), aggregates were evident
regardless of the degree of acetylation and light scattering angle. According to the authors,
aggregation at I = 0.01 M originates in a small number of species compared to the structure of
the chitin present in solution. In this case, species above and protonated amino groups of
chitosan may be asymmetrically distributed. Despite the presence of electrostatic repulsions,
hydrogen bonds may be favored among species compared to chitin, thereby generating
asymmetrical distribution between the groups in solution and favoring attractive interactions
caused by dipolar variation in the solution. This would result in the aggregation of molecules
with species similar to chitin in a different aggregation process from that found in solutions
with high ionic strength (I > 0.1 M) (Chen et al., 2011).
Our analyses showed that a chitosan solution at pH 3 with a high density of positive
charges exhibited aggregates with large particle sizes. This indicates that high charge density
in the absence of salt may be a relevant factor in the formation of aggregates in solution. It is
likely that the aggregates observed under these conditions are those identified by Chen et al.
(2011) for the aqueous solution of chitosan with low ionic strength (I = 0.01 M).
Table 2 Dynamic Light Scatttering data (log  and RH) of polymers solutions with different pH
pH 3
Polymer
CH
CHC
CHP
CHPC
pH 5
pH 6
pH 9
pH 11
log  (s)
RH (nm)
log 
(s)
RH
(nm)
log 
(s)
RH
(nm)
log 
(s)
RH
(nm)
log 
(s)
RH
(nm)
2.5
24
-
-
2.5
24
-
-
-
-
3.8
478
3.3
151
3.3
151
-
-
-
-
2.7
37
2.0
8.0
-
-
-
-
-
-
3.8
478
3.1
95
3.0
76
-
-
-
-
4.9
6,015
4.2
1,200
-
-
-
-
-
-
2.1
10
2.1
10
2.1
10
2.2
12
-
-
3.4
190
3.2
120
3.2
120
3.1
95
3.1
95
2.5
24
2.5
24
-
-
-
-
-
-
3.7
380
3.2
120
3.1
95
3.0
76
2.9
60
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
124
Since the aggregation mechanism of chitosan in solution has yet to be fully elucidated,
chitosan derivatives may also be relevant to the phenomenon of aggregation.
Hydrophobically modified chitosan (CHC) displays hydrophobic domains inherent to
hydrophobic substituents and to chitosan itself, from acetyl groups. In general, grafting
hydrophobic substituents onto chitosan increases its tendency to aggregate in aqueous
solutions, similar to any other associative hydrophobic polyelectrolyte. In dilute solution,
intramolecular aggregation predominates when the number of associative groups in a polymer
chain is sufficient to stabilize it; otherwise, intermolecular aggregation is favored (Philippova
e Korchagina, 2012).
The amount and length of hydrophobic constituents grafted onto chitosan influence
aggregation behavior. Larger hydrophobic groups contribute significantly to aggregation of
the polymer. An increase in the length of the substituent tends to generate larger aggregates
when intermolecular interactions are favored, and smaller aggregates forming in a solution
where intramolecular interactions predominate. According to the literature (Desbrières et al.,
1996), from six carbon atoms onwards, there is a tendency to occur intermolecular
aggregations since bulky species increase the steric hindrance and stiffness of the
macromolecule. Nevertheless, length and degree of substitution should be considered
together. In any case, the particle size is determined by the relationship between attractive
forces through the hydrogen bonds and hydrophobic interactions that favor aggregation, and
the electrostatic repulsions from the protonated amino groups (Philippova and Korchagina,
2012).
In the present study, chitosan was grafted with the hydrophobic substituent n-dodecyl
(DS = 10%) to assess the effect of the hydrophobic group on particle size of this chitosan
derivative in solutions at different pH (3, 5 and 6). Fig. 3 shows normalized temporal
autocorrelation functions (a) and relaxation time distribution curves (b) for the aqueous
solutions of hydrophobically modified chitosan (CHC). Fig. 3 (a) demonstrates that the
relaxation time of the polymer chains in solution lowered with the increase in pH from 3 to 6.
Based on the distribution curves (Fig. 4 (b)), the mean relaxation time of each population is
obtained and the hydrodynamic radius of the populations is calculated using the StokesEinstein Equation (5) (Table 2).
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
125
1.2
CHC pH 3
CHC pH 5
CHC pH 6
Fit
1.0
g2 () - 1
0.8
0.6
0.4
0.2
(a)
0.0
1
2
3
4
5
6
log  (s)
1.2
CHC pH 3
CHC pH 5
CHC pH 6
1.0
 A ()
0.8
0.6
0.4
0.2
(b)
0.0
1
2
3
4
5
6
log  (s)
Fig. 3. Normalized autocorrelation functions (a) and their corresponding relaxation time distributions (b)
measured at scattering angle of 90° as revealed by REPES analysis for solutions of hydrophobically modified
chitosan (CHC) in a concentration of 1.0 g/L in 0.25 M AcOH at pH 3-6, at 25 °C
At pH 3 and pH 5, the distribution curves of CHC particles exhibited populations with
mean particle size attributed to individual chains (RH = 37 nm, pH 3 and RH = 8,0 nm, pH 5)
and aggregates (RH = 478, pH 3 and RH = 95 nm, pH 5), as shown in Table 2. In addition,
micrometer-sized aggregates were also observed. At pH 6, a single population showing a
wider distribution of particles is observed, with a mean hydrodynamic radius of 76 nm. The
results indicate that particle size increases with the decrease in pH from 6 to 3, with
aggregates five times larger observed at pH 3. This behavior can be attributed to the
combination of two effects: (i) Manning condensation, which reduces the electrostatic
repulsion between polymer chains with extended conformation and (ii) the presence of
hydrophobic groups containing 12 carbons, which favors the formation of intermolecular
aggregates with a greater hydrodynamic volume than that of the chitosan chains containing
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
126
acetyl groups. The rise in pH lowers the charge density of CHC and quality of the solvent,
leading to compressed conformation with the formation of smaller aggregates.
The results of DLS analyses for chitosan solutions and hydrophobic derivatives at pH
5.3 reported by Robles et al. (2013) corroborate the data observed in our study. Mean
hydrodynamic radius values of the hydrophobic derivatives in aqueous solution decreased
when compared to chitosan (180 nm), becoming more accentuated with the increasing degree
of substitution (DS) of n-dodecyl (155 nm, DS 5% and 125 nm, DS 50%) or n-octyl groups
(130 nm, DS 5% and 70 nm, DS 50%) incorporated onto chitosan (Robles et al., 2013).
In dilute solution and θ solvent (0.3 M acetic acid and 0.05 M sodium acetate),
Korchagina and Philippova (2010) also reported the simultaneous presence of individual and
aggregated chains for different molecular weights of chitosan and derivatives grafted with ndodecyl segments. The semi-rigid conformation of the chitosan chain and low degree of
substitution of the hydrophobic segments in the macromolecule favored intermolecular
aggregation, which resulted in larger aggregates and a greater aggregation number for the
derivatives. The authors demonstrated that the size of the aggregates formed is independent of
the length of individual polymer chains (Korchagina and Philippova, 2010).
In order to obtain soluble materials at a wider pH range and evaluate the aggregation
process in aqueous medium, chitosan was modified with hydrophilic mPEG chains. Fig. 4 (a)
shows that the relaxation time of chitosan-g-mPEG chains (CHP) in solution decreased with
the rise in pH, as observed for CH and CHC. Combining data from the normalized
distribution curves (Fig. 4 (b)) with Table 2 shows a slight difference in the size of aggregates
at pH 5, 6, 9 and 11, although the aggregates exhibit a smaller size than at pH 3.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
127
1.2
CHP pH 3
CHP pH 6
CHP pH 9
CHP pH 11
Fit
1.0
g2 () - 1
0.8
0.6
0.4
0.2
(a)
0.0
1
2
3
4
5
6
log  (s)
1.2
CHP pH 3
CHP pH 6
CHP pH 9
CHP pH 11
1.0
 A ()
0.8
0.6
0.4
0.2
(b)
0.0
1
2
3
4
5
6
log  (s)
Fig. 4. Normalized autocorrelation functions (a) and their corresponding relaxation time distributions (b)
measured at scattering angle of 90° as revealed by REPES analysis for solutions of chitosan-g-mPEG (CHP) in a
concentration of 1.0 g/L in 0.25 M AcOH at pH 3-6, at 25 °C
The grafting of the flexible mPEG chain onto the chemical structure of chitosan and
the reacetylation of amino groups during chemical modification lowered the amount of amino
groups available in its chain and hence the charge density, which contributed to reducing the
stiffness of the polymer chain.
The size of CHP aggregates in aqueous acidic solution (pH 3-6) did not vary
dramatically when compared to CH and CHC, indicating that aggregate formation in solutions
of chitosan derivatives is influenced by both charge density and the stiffness of the chain.
Since the chitosan-g-mPEG chain in acid solution exhibits a less extended conformation than
the chitosan chain, CHP aggregates formed in solution are smaller than those of chitosan.
With an increase in pH from 9 to 11, the conformation of CHP becomes even more
compressed due to the reduced quality of the solvent, favoring intra and intermolecular
interactions between the polymer chains through hydrogen bonds, resulting in smaller
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
128
aggregates than in acidic solution. However, the presence of mPEG contributed to the
solubility of chitosan in basic solution owing to the hydrogen bonds between the mPEG
chains and water molecules, which contributed to further stabilization of the more contracted
conformation.
Ouchi and authors (1998) chemically modified chitosan via mPEG grafting and
proposed a structural organization of chitosan-g-mPEG in aqueous solution as a function of
pH. In acidic solution, chitosan-g-mPEG chains are dissociated due to the electrostatic
repulsions between protonated amino groups, resulting in nonaggregated cationic particles.
On the other hand, in basic solution the polymer chains form nonionic intermolecular
aggregates through hydrogen bonds (Ouchi et al., 1998). By contrast, our study found
aggregates in both basic and acidic solutions, and particularly in acid medium, due to the
contribution of Manning condensation.
The influence of hydrophilic and hydrophobic groups simultaneously incorporated
onto chitosan was investigated for aqueous solutions of hydrophilically and hydrophobically
modified chitosan (CHPC) at different pH.
Fig. 5 shows the temporal correlation function (a) and respective normalized time
distribution curves (b) for CHPC. The value of RH calculated for each of the particle
populations using Equation 5 follows the trend of decreasing aggregate size with increasing
pH, as previously demonstrated for the other polymers studied. In acidic solution, CHPC
solutions exhibited individual and aggregates chains. At pH 3 in particular, CHPC aggregates
are larger than CHP aggregates due to the contribution of the 12-carbon hydrophobic chain,
and smaller than CH and CHC aggregates owing to the presence of the flexible mPEG chain.
However, in basic solution smaller aggregates are observed when compared to CHP
aggregates. This result suggests that the size of aggregates depends on the balance between
charge density and the type of substituent grafted.
Liu and authors (2009) evaluated the aggregation process in aqueous solution of
chitosan grafted with hydrophobic groups – polycaprolactone with molecular weight of 300
g/mol and hydrophilic groups – methoxy-poly(ethylene glycol) with molecular weight of
5000 g/mol. DLS results showed unimodal distribution attributed to aggregates with
hydrodynamic diameters of approximately 200 - 400 nm. The aggregates decreased in size
with the increase in pH and the degree of substituents inserted into chitosan, but remained
almost unaltered with the varying polymer concentration of the solution. The authors also
found that the mPEG chains played an important role in the stability of the aggregates and
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
129
that the size and stability of aggregates can be controlled by adjusting the ratio of hydrophobic
and hydrophilic groups in the chitosan structure (Liu et al., 2009).
1.2
CHPC pH 3
CHPC pH 5
CHPC pH 6
CHPC pH 9
CHPC pH 11
Fit
1.0
g2 () - 1
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
1
2
3
4
5
6
log  (s)
1.2
CHPC pH 3
CHPC pH 5
CHPC pH 6
CHPC pH 9
CHPC pH 11
1.0
 A ()
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
1
2
3
4
5
6
log  (s)
Fig. 5. Normalized autocorrelation functions (a) and their corresponding relaxation time distributions (b)
measured at scattering angle of 90° as revealed by REPES analysis for solutions of hydrophilic and
hydrophobically modified chitosan (CHPC) in a concentration of 1.0 g/L in 0.25 M AcOH at pH 3-6, at 25 °C
3.3. Zeta Potential
Zeta potential ( ζ ) is defined as electrokinetic potential that exists in the shear plane
between the unit (charged particle surface and counterions near the surface) and the
surrounding fluid. Zeta potential provides an indirect measurement of surface charge density
and is a relative indicator of system stability. Though strictly incorrect, zeta potential is
considered a substitute for surface potential. However, the sign and magnitude of zeta
potential also depends on solution conditions such as ionic strength, temperature,
conformation of the chain and chemical species concentration. Zeta potential is strongly
influenced by pH changes of the solution in which the particles are dispersed. Thus, the
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
130
ionization and/or dissociation of particles containing carboxylic acid or amine functional
groups depend on the pH of the solution. As such, zeta potential results are dependent on the
net charge of the system, resulting in positive or negative zeta potential values (Beliciu &
Moraru, 2011; Robles et al., 2013; Buschmann et al., 2013; Yang et al., 2010; Pujana, PérezÁlvarez, Iturbe, & Katime, 2012).
Fig. 6 shows zeta potential as a function of pH for chitosan and its derivatives. As
previously discussed, since amino groups are present along the chitosan chain and its pKa is
about 6.5, zeta potential is influenced by pH changes. In acidic medium, ζ values were
positive for all the polymer solutions studied due to the protonation of the amino groups of
chitosan. At pH 3 there is a greater difference between ζ values, largely because of the high
charge density and the groups grafted onto the chitosan chain. Whereas ζ values are closer at
pH 5 and 6 likely due to low charge density, since the increase in pH gradually reduces the
number of protonated amino groups.
At pH 3 in particular, significant differences in the ζ values of the polymer solutions
are observed due to the incorporation of hydrophobic and hydrophilic groups onto the
chitosan backbone. In light of the chemical modifications that occur in the amino groups of
chitosan, ζ values are generally expected to be low because of the decrease in free amino
groups. On the other hand, ζ values will not decline if substituent groups also have positive
charges or when the conformation of the polymer chain is altered by solution conditions in a
manner that favors greater exposure of positive charges on the surface of chitosan. Zeta
potential data demonstrated that CHC exhibited higher positive ζ than that of unmodified
chitosan and the other derivatives obtained. This result can be explained by the steric
contribution of the n-dodecyl hydrophobic group incorporated into the chitosan chain, which
may have favored greater exposition of the protonated amino groups, leading to a higher ζ
value (+ 65 mV). This confirms the superior stability of the system in comparison to the other
polymer systems (Fig. 6), corroborating the zeta potential results observed by Robles and
authors (2013) (Robles et al., 2013).
Considering the hydrophilic and flexible substituents such as mPEG grafted onto
chitosan, CHP, the value of ζ (+46 mV) at pH 3 is lower when compared to the ζ value (+65
mV) of CHC, but higher than the ζ of CH (+29 mV). The grafting of mPEG onto chitosan
and the reacetylation of amino groups during chemical modification lowers the number of free
amino groups. However, the results show that both the number of protonated amino groups
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
131
and the net charge resulting from the polymer system contribute to the zeta potential value.
Apparently, the net charge of the CHP system is higher than in the CH and lower than in the
CHC. The former can be attributed to the hydrophilic nature of mPEG and its flexibility,
which contribute to increasing solubility in relation to chitosan and favor the exposure of its
positive sites. The latter behavior can be explained by the long flexible side chains, which can
more easily hide the positive sites of the polymer chain than the short side chains found in a
more rigid polymer system such as that of CHC. The ζ value (+20 mV) of CHPC is lower
than that of other polymers. This result seems to indicate a marked decline in free amino
groups due to a combination of the grafting of mPEG and n-dodecyl segments onto the
chitosan chain and the reacetylation of amino groups. However, low DS of CHPC suggests
that amino groups were less significant than conformational changes in the ζ value. The CHP
and CHPC samples, soluble in basic medium, showed negative ζ values at pH 9 and pH 11.
In this case, given that the amino groups of the polymer are not protonated, the negative sign
of ζ is the result of the basic aqueous solution. In regard to the stability of the polymer
system, the  value (-28 mV, pH 9 and 11) of the CHPC system suggests greater stability than
that of the CHP system (-6 mV, pH 9; -4 mV, pH 11), which can be attributed to steric
hindrance caused by the presence of n-dodecyl hydrophobic group.
70
CH
CHC
CHP
CHPC
60
Zeta Potential (mV)
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
-40
2
4
6
8
10
12
pH
Fig. 6. Zeta potential as a function of pH of the medium for chitosan and derivatives
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
132
4. Conclusions
Hydrophylic and/or hydrophobic groups were successfully incorporated onto the
chitosan backbone by reductive alkylation using a one-pot process under mild conditions. The
chemical structures of polymers were elucidated by 1H NMR. DLS analyses revealed that
although the dilute polymers solutions at pH 3, in the absence of salt, exhibited a high density
of protonated amino groups along the polymer chain, the high degree of charge contributed
significantly to aggregation, promoting increased particle size with the decline in pH.
Furthermore, the hydrophobic groups also contributed to increasing the size of aggregates in
solution at pH 3, whereas the hydrophilic groups helped reduce their size across the entire pH
range. Nevertheless, the nature of aggregation was dependent on the pH of the medium. Zeta
potential results indicated that its values do not depend solely on the surface charge of the
particle, but are also dependent on the net charge of the medium.
Acknowledgements
The authors thank IFRN and MCT/ANP/PRH30 for the financial support. The authors
also thank NUPPRAR/UFRN for the CHN elemental analysis, Dra. Nádya Pesce da Silveira
and José Daniel Souza of LIMDIM Laboratory from UFRGS for the DLS and zeta potential
analysis and Dra. Rosangela Regia Lima Vidal and Dra. Elisangela F. Boffo from UFBA,
who recorded the 1H NMR spectra.
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Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
136
5. CONCLUSÕES
Derivados de quitosana graftizados com cadeias mPEG e mPEG/n-dodecila foram
obtidos pela alquilação redutiva sob condições reacionais brandas e usando um método
simples (one-pot), o qual consistiu em um procedimento atrativo para obter derivados de
quitosana (CHPI e CHPC) com baixo grau de substituição e solúvel em uma ampla faixa de
pH (ácido, neutro e básico).
A combinação de uma baixa incorporação do mPEG com a reacetilação de grupos
amino, mesmo com a inserção de grupos hidrofóbicos (n-dodecila), usando o método one-pot,
foi importante para obter derivados de quitosana solúveis em meio aquoso. De modo
contrário, CHPII obtido pelo método tradicional, com a separação do intermediário mPEGaldeído, foi insolúvel em solução aquosa com pH acima de 6, tal como o seu precursor.
As
propriedades
reológicas
indicaram
que
CHPI
exibiu
comportamento
pseudoplástico, histerese, propriedade viscosificante e estabilidade térmica em solução com
pH alcalino, os quais são propriedades desejáveis em vários campos de aplicações.
Os dados de SAXS exibiram uma diminuição do caráter de polieletrólito para os
polímeros com o aumento do pH da solução e para os derivados de quitosana com o aumento
do grau de substituição (GS). CHPI (DS 2,44 %) apresentou uma conformação menos
estendida do que CHPII (GS 1,65 %). Para valores de pH acima de 7, o pico do efeito
polieletrolítico do CHPI desapareceu completamente, devido à neutralização efetiva dos
grupos amino protonados.
O efeito da alta densidade de cargas do polímero em solução diluída, na ausência de
sal, contribuiu significativamente para a agregação, promovendo o aumento do tamanho das
partículas em solução com a diminuição do pH. O tamanho dos agregados também foi
influenciado pela presença de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos na cadeia da quitosana, em
toda a faixa de pH estudada. A natureza de agregação em solução foi dependente do pH do
meio.
Os resultados do potencial zeta indicaram que seus valores não dependem apenas da
carga da superfície da partícula, mas é dependente também da presença dos grupos
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
137
hidrofílicos e hidrofóbicos no sistema. Além disso, os grupos hidrofóbicos presentes em
CHPC contribuíram para uma maior estabilidade em solução básica através de impedimento
estérico.
Os sistemas poliméricos associativos em solução aquosa obtidos neste estudo
apresentam propriedades que podem ser atraentes em várias aplicações na indústria do
petróleo.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado
138
ANEXO I
Artigo publicado ―Chitosan derivatives with thickening properties obtained by reductive
alkylation‖ Materials Science and Engineering C 29 (2009) 641.
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140
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141
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142
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144
ANEXO II
Manuscrito intitulado ―Reductive amination: a versatile procedure for chitosan modification‖
- Em preparação.
Reductive amination: a versatile procedure for chitosan modification
Keila S. Alves1,2*, Rosangela C. Balaban1
1
Institute of Chemistry, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal 59078-970, Brazil
Federal Institute of Education, Science and Tecnology of Rio Grande do Norte, Ipanguaçu
59508-000, Brazil
*Correspondence to: K. S. Alves (E-mail: [email protected])
2
Abstract
Chitosan is a polymer derived from chitin, an abundant polysaccharide in nature. Chitosan has
been increasingly highlighted in the development of new materials for use in cosmetics, food,
wastewater treatment, the pharmaceutical industry and in biomaterial production. Different
chemical modifications of chitosan are used to improve its properties and extend its
applications. Among these, the reductive amination reaction of chitosan is an important
alternative since it is selective to functionalization of amino groups of the chitosan chain, can
be done under mild conditions and in homogeneous environment. Furthermore, different
derivatives have great application potential in several areas. In the current article, reductive
amination of chitosan is summarized according to some data found in the literature.
Keywords: Chitosan; reductive amination; properties; applications.
Keila dos Santos Alves – Tese de Doutorado