Introdução a Bioquímica:
Biomoléculas
vai onde?
Aula 7
o que vai fazer?
Docking & Aplicações
Ignez Caracelli
Julio Zukerman Schpector
BioMat – DF – UNESP/Bauru
LaCrEMM – DQ – UFSCar
Bauru, 24 de setembro de 2007
de onde
veio?
O que sabemos?
Sabemos que….
“Tomou Doril, a dor sumiu.”
“É Gripe? Benegripe.”
“Melhoral pra você ficar legal.”
A aspirina
10 de agosto de 1897
químico da Bayer: Felix Hoffmann
A aspirina
Hipócrates, médico grego e pai da Medicina
científica, escreveu que o pó ácido da casca do
Salgueiro ou Chorão (que contém salicilatos mas é
potencialmente tóxico) aliviava dores e diminuia a
febre.
A aspirina
Este remédio também é mencionado em textos das
civilizações antigas do Médio Oriente, Suméria,
Egipto e Assíria.
A aspirina
A aspirina
Os nativos americanos usavam-no também, para
dores de cabeça, febre, reumatismo e tremores.
O reverendo Edmund Stone, de Chipping Norton
no condado de Oxford, Reino Unido, redescobriu
em 1763 as propriedades antipiréticas da casca do
Salgueiro e as descreveu de forma científica.
A aspirina
O princípio activo da
casca, a salicina ou ácido
salicílico (do nome latino
do Salgueiro Salix alba )
foi isolado na sua forma
cristalina em 1828 pelo
farmacêutico francês
Henri Leroux, e Raffaele
Piria, químico italiano.
A aspirina
50 partes de
ácido salicílico
+ 75 partes de
anidrido acético
t = 2 horas
T = 500oC
A aspirina
A aspirina
onde foi
parar?
A aspirina
Cristalografia – difração de raio X
solução
processamento
de dados
Estrutura:
solução e
refinamento
difração
fonte de RX
melhora do feixe RX
A aspirina
detecção
A aspirina
Ácido 2-etanoatobenzóico (conforme IUPAC)
liga onde?
Sinô
Sinônimos:
nimos:
Ácido acetilsalicílico (AAS)
Ácido O-acetilsalicílico
Acetilsalicilato
Enzima = proteína
enzima ↔ substrato
acelerador de reações
COX ↔ substrato
COX ↔ inibidor → aspirina
enzima ciclooxigenase
COX
COX
COX
COX
COX
Como ocorre a inibição?
COX
Como ocorre a inibição?
• para saber isso temos que ter:
• para saber isso temos que ter:
• estrutura tridimensional (3D) do complexo
formado entre enzima-inibidor
ou
• estrutura tridimensional (3D) do inibidor
(aspirina) +
• estrutura 3D da enzima
• estrutura tridimensional (3D) do complexo
formado entre enzima-inibidor
os is
t od nt a
mé ime
r
pe
ex
Fármacos
Como ocorre a inibição?
• para saber isso temos que ter:
Fontes
• estrutura tridimensional (3D) do inibidor
(aspirina) +
• estrutura 3D da enzima
os
t od
mé
ico
sil
in
naturais
sintéticas
Alvos
química
física
Perfil da Indústria Farmacêutica
cristalografia
Tipos de Alvos
bioquímica
computação
hardware
receptores 45%
desconhecidos 7%
fisiologia
outras...
farmácia
enzimas 28%
hormônios e fatores 11%
canais de íons 5%
receptores nucleares 2%
ácidos nucléicos 2%
biofísica
computação
software
matemática
biologia
Perfil da Indústria Farmacêutica
fármaco no mercado: 10-12 anos
Descoberta de um fármaco
iní
início:
estudos pré-clínicos
• busca de alvo biológico
e/ou
pesquisadores
imaginação;
objetivos
síntese de
novos
compostos
testes in vitro
testes in vivo
formulação ,
estabilidade,
fabricação
análise
FDA
• busca de molécula com atividade biológica
estudos clínicos
Descoberta de um fármaco
• descoberta do compostocomposto-líder:
líder identificação de um composto
com atividade biológica especifica.
Descoberta de um fármaco
• sorte
• otimização:
otimização propriedades do líder são testadas em ensaios
biológicos; novas moléculas são projetadas e sintetizadas para
obter as propriedades desejadas.
penicilina
descoberta de
composto-lider
otimização do
composto-líder
Descoberta de um fármaco
Descoberta de um fármaco
modificação química
screening
corantes
fármaco
atividade
biológica
Prontosil derivou de um corante com atividades anti-bacterianas.
Descoberta de um fármaco
desenho racional de fármacos (rational drug design)
• primeira etapa: com projeto de compostos com requerimentos
específicos.
• segunda etapa:
moléculas
planejadas
sintetizadas
• primeira etapa: com projeto de compostos com requerimentos
específicos.
• pergunta: de onde vem os requerimentos específicos?
compostos
químicos
modelagem
molecular
Descoberta de um fármaco
desenho racional de fármacos (rational drug design)
cristalografia
estrutura 3D
testes
biológicos
Pharmacophore-based Drug Design
• ligantes e atividade: são examinados os ligantes ativos e inativos.
• grupos químicos no ligante: gera hipótese sobre os grupos
químicos, se são necessários ou não para a função biológica.
• ligantes e grupos químicos: gera novos ligantes que tem os
mesmos grupos químicos 3D – mimetiza os grupos ativos.
referência
estrutura 3D do composto
pharmacophore-based drug design
•alvo como um todo
•alvo enzima específica
•ensaios in vitro
•ensaios in vivo
Descoberta de um fármaco
novo desenho
estrutura 3D do alvo
receptor-based drug design
Descoberta de um fármaco
Receptor-based Drug Design
• estrutura 3D do alvo: utiliza estrutura 3D, história bioquímica
da macromolécula, verifica se está ou não complexada, pode
verificar proteínas/seqüências homologas.
• grupos químicos : busca por grupos químicos especificos que
podem fazer parte de uma interação atrativa entre a proteinaalvo e o fármaco.
• ligantes e grupos químicos:
projeta um fármaco-candidato
de acordo com sua
complementaridade de
interações com o alvo.
receptor
ligante projetado
Descoberta de um fármaco
Estruturas tridimensionais
Rational Drug Design
• anos 1970: não se utilizavam a estrutura
3D dos alvos → farmacóforo.
• anos 1990: aumento substancial da
estrutura tridimensional dos alvos 3D
→ proteínas.
métodos
experimentais
métodos
teóricos
• anos 2000: metodologias
andam paralelas.
Estruturas Tridimensionais
métodos experimentais: cristal
Estruturas Tridimensionais
métodos teóricos
informações obtidas em
• literatura especializada
• bancos de dados
Estruturas tridimensionais
moléculas
pequenas
moléculas
grandes
Docking:
“O que é docking?”
“Como se forma o complexo entre
uma proteína e um ligante?”
ligante?”
“Qual a importância de estudar um
complexo proteínaproteína-ligante?”
ligante?”
“O que é docking?”
docking
“O que é docking?”
docking
Docking é o processo de encontrar o melhor
ajuste de encaixe entre duas moléculas.
(ancoragem, atracagem)
Docking é o processo de encontrar o
melhor ajuste de encaixe entre duas
moléculas tridimensionais.
tridimensionais
R
ec
ep
to
r
=
+
Lig
an
te
Co
mp
le x
o
Idéia central
Docking:
“Qual a importância de estudar um
complexo proteínaproteína-ligante?”
receptor
a ação de um fármaco está determinada univocamente pela
sua complementaridade bioquímica e tridimensional em seu
sítio receptor especifico
ligante
ligante: moléculas
pequenas,
fragmentos de
proteínas, ...
é uma atividade de pesquisa que permite a redução do
número de potenciais alvos relacionados ao estudo de uma
enfermidade particular
receptor: proteínas,
enzimas, DNA, ...
Docking:
“Como se forma o complexo entre
uma proteína e um ligante?”
ligante?”
“Como se forma o complexo entre
duas estruturas tridimensionais?”
tridimensionais?”
permite a redução do custo e tempo de desenvolvimento de
um novo fármaco
Laboratório
Experimento no laboratório:
o que é necessário para realizar o experimento?
equipamentos
reagentes
controle de temperatura.....
Docking
Docking
Experimento in silico:
silico
Parte 1:
o que é necessário para realizar o experimento?
definição do método computacional
equipamentos métodos computacionais
reagentes definição do receptor, ligantes, ...
Docking:
busca de
conformação
Dinâmica Molecular
Monte Carlo
Algoritmos genéticos
função score
Campo de Forças
PMF (Potential of
Mean Force)
Métodos empíricos
Principais Programas de Docking
Gold
Genetic Optimisation for Ligand Docking
Algoritmos genéticos
flexibilidade total do ligante e parcial do
receptor
Principais Programas de Docking
Principais Programas de Docking
FlexX
AutoDock
Métodos baseados em fragmentos
flexibilidade total do ligante
Automated Docking of flexible ligands to
receptors
Monte Carlo simulated annealing
flexibilidade total do ligante e receptor rígido
Principais Programas de Docking
Dock3.5
Dock3.5
Mecânica Molecular corpos rígidos
ligante rígido e receptor rígido
Dock4.0
Dock4.0
Mecânica Molecular
ligante flexível e receptor rígido
Dock3.5: Kuntz, I.D et al.
“A geometric approach to
macromolecule-ligand interactions”
J. Mol. Biol. 161: 269269-288, 1982.
•busca de cavidades, reentrâncias e
de protuberâncias
• ajuste da protuberância de uma
molécula na reentrância da outra
Docking
Parte 2: fundamental
(a) definição das moléculas de interesse
(b) preparação das moléculas para o
experimento in silico.
preparação da
macromolécula
preparação da
macromolécula
preparação do
ligante
estudo de formação
do complexo
coordenadas
http://www.rcsb.org/pdb
modelagem molecular
SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL - docking
análise dos resultados em tela gráfica
Protein Data Bank (PDB)
Lisozima: Informações
http://pdb.rcsb.org/pdb/
lisozima
data de consulta: 29 de setembro de 2007
48395 estruturas depositadas
raios X ∼ 85%
NMR ∼ 15%
Lisozima: Informações
lisozima
total de estruturas PDB: 1037
método experimental:
raio X:
X 1021
NMR:
NMR 9
pdb: 1037 estruturas
metodo experimental: ???
fonte: ???
mutante: ???
resolução:???
ligante ou não (complexo)
Métodos Experimentais: Informações
raio X
NMR
microscopia eletrônica
difração de elétrons
difração de nêutrons
Métodos Experimentais:
Microscopia Eletrônica
Métodos Experimentais:
Microscopia Eletrônica
c
Busca no PDB: resolução
Resultado experimental:
Mapa de densidade eletrônica
o que você vê +
o que você pensa =
o que você obtém
Resultado experimental
= o que você vê
preparação da
macromolécula
coordenadas
escolha do sítio
http://www.rcsb.org/pdb
modelagem molecular
adição de H polares
preparação da
macromolécula
coordenadas
modelagem
molecular
o sitio está preparado para
receber o ligante?
conhecimento prévio:
p.ex, dados bioquímicos
escolha do sítio
o sítio está preparado para receber
o ligante?
o sítio está preparado para receber o ligante?
Proteína: glutationa redutase
http://www.rcsb.org/pdb
humana: 1gre e 1xan
(seqüências de aminoácidos iguais)
1xan
1gre
preparação do
ligante
sítio
descrição
geométrica
do sítio
descrição
eletrostática
do sítio
cristalografia
desenho da
molécula
cristalografia
modificação
sítio preparado
para o docking
otimização da estrutura
ligante com cargas parciais
preparação da
macromolécula
preparação do
ligante
lig 
rec
rec
rec q

A jj
B jj
j

E = ∑  Aii ∑ 12 − Bii ∑ 6 + 332, 0 qi ∑
rij
i =1 
j =1 rij
j =1
j =1 Drij 


van der Waals de atração
estudo de formação
do complexo
SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL - docking
eletrostático
van der Waals de repulsão
D: função dielétrica
332,0 fator de conversão a kcal/mol
Docking
docking rígido
energias
(van der Waals, eletrostática, total)
ligante
sítio
pontuação por contato
interações
distâncias
análise gráfica
orientações
Chagas
Aplicação:
biomoléculas
Chagas e Leishmania: enzimas-alvo
Glutationa redutase (GR)
humanos e mamíferos em geral
Tripanotiona redutase (TR)
tripanossomatídeos
TR:
TR enzima tripanotiona redutase de T. cruzi
GR:
GR enzima glutationa redutase humana
Chagas e Leishmania: enzimas-alvo TR e GR
Glutationa redutase
(GR)
Tripanotiona redutase
(TR)
enzimas homodiméricas 500 aa / monômero
flavoproteínas: grupo prostético → FAD
coenzima: NADPH
Chagas e Leishmania: enzimas-alvo TR e GR
Ciclo da Reação Catalítica da GR
a
GSH
ES-SE
Glutationa redutase (GR)
E-S-S-G
f
H+
substrato GSSG
GSH
NADPH
GSSG + NADPH + H+GR
→ 2 GSH + NADP+
b
E-S-S-G • GS-
EH2 + NADP+
e
Tripanotiona redutase (TR)
substrato TS2
NADP+
TS2 + NADPH + H+
TR
→
T(SH)2 + NADP+
c
EH2 • G-S-S-G
EH2
GSSG
Chagas
Chagas
nifurtimox®
Projeto: sítio ativo
Nitrocompostos
Nitrofuranos
NO2
GI01
GI03
RD06
HC05
O
O
X
N
N
N
butil
2hexil
R
2--metoxietil
feniletil
4-( R ))-1-(5(5-nitrofurfuriliden)
nitrofurfuriliden)semicarbazida
Nitrotiofenos
Nitrotiofenos
NO2
SG03
SG01
SR06
SH05
O
S
X
N
N
nitrofurano
N
4-( R ))-1-(5(5-nitrotieniliden)
nitrotieniliden)semicarbazida
butil
R
2hexil
2--metoxietil
feniletil
cristalografia
e
docking
atividade
in
vitro
planejamento
síntese
atividade de compostos
nas
enzimas
atividade in vivo
d
Projeto: sítio ativo
Projeto: sítio ativo
mecanismo de inibição enzimática
AS
docking
ligantes
competitivo
TR
ligantes
ligantes
Estruturas Tridimensionais
conformação
dobrada
1conformação
conformação
planejada
dobrada
planejamento
HC05
HC05
Cristalografia
HC05
HC05
síntese
cristalografia
1conformação
conformação
não-planejada
estendida
moléculas pequenas
conformação
estendida
conformação
intermediária
Estudo das conformações
Busca de
conformações de
mínima energia
dinâmica molecular
otimização de geometria por MM+ e AM1
seleção de conformações
= estendida (HC05) cristalográfica
= outra intermediária
= intermediária (SH05) cristalográfica
= dobrada (HC05) cristalográfica
GR
docking
semi-rígido
SH05
Nitrocompostos
tendência geral
TR
GR
Repetição de orientações?
orientações
GR
IS ; AS
IS ; AS
TR
His75A
His75B
energia favorável
padrões de ligação bem definidos (VG)
alta % de repetição (VG)
AS
energia favorável
padrões de ligação bem definidos (VG)
alta % de repetição (VG)
IS
Phe78B
Phe78A
Asn71A
Asn71B
Trp70A
(2)
Trp70B
sem diferenças de energia
sem padrões de ligação claros
(visualização gráfica VG)
NS
Nitrocompostos
tendência geral
IS > AS
IS > AS
TR
GR
AS
ENF-TR = -18,896 kcal/mol
ENF-GR = -25,478 kcal/mol
Projeto: sítio de interface
GR
TR
mecanismo de inibição enzimática
Sítio de ligação
energia favorável
padrões de ligação bem definidos
alta % de repetição
não-competitivo
Computer assisted design of potentially active antianti-trypanosomal compounds
JOURNAL OF MOLECULAR STRUCTURESTRUCTURE-THEOCHEM 584: 9595-105 APR 26 2002
Projeto: sítio da interface
TR
ligantes
ligantes
docking
ligantes
GR
m
co
e
pl
xo
cr
r
pa
se
ão
aç
l
ia
fic
i
t
ar
Algoritmo
de
Docking
do
is
o
fic
rá
g
lo
ta
re
c
co on
m str
pl uç
ex ã
o o
SI
Redocking validação
Projeto: sítio interface
Redocking
His82
Nitrocompostos
HC05 - amarelo
SG05 - vermelho
GI01 - azul
SG01 - rosa
GI03 - vinho
SG03 - violeta
RD06 - laranja
SR06 - verde
His75
Phe78
Tyr407
Trp70
Leu438
Nitrocompostos
tendência geral
TR
GR
IS
ENF-TR = -30,976 kcal/mol
ENF-GR = -36,750 kcal/mol
IS > AS
IS > AS
Projeto: sítio da interface
GR
TR
energia favorável Sítio
Sítio de
+ provável
ligação
padrões de ligação bem definidos
alta % de repetição
Conformational analyses and docking studies of a series of
5-nitrofuran- and 5-nitrothiophen-semicarbazone derivatives
in three possible binding sites of trypanothione and glutathione reductases
Vega-Teijido, Caracelli, Zukerman-Schpector
JOURNAL OF MOLECULAR GRAPHICS & MODELLING 24 (5): 349-355 MAR 2006
Conclusões:
Conclusões:
do ponto de vista da análise gráfica da estrutura tridimensional :
• a preferência pelo sítio SI da GR, é devida ao canal formado
pelo canal formado pelas Phe78
do ponto de vista do docking:
docking:
•
• acomodam-se preferencialmente no sítio da interface, tanto
em GR como em TR, com probabilidade maior em GR;
•
• podem também se ligar ao sítio ativo de ambas enzimas;
• observam-se interações favoráveis nos sítios SA e SI.
•
• os sítios SA e SI podem comunicar-se.
•
•
• os complexos obtidos nos estudos de docking mostraram
uma dependência da conformação do ligante;
•
do ponto de vista do mecanismo de reação:
• os nitrocompostos podem ligar-se nos sítios SA e SI.
• compatível com mecanismo enzimático não-competitivo, misto.
•
• resultados são compatíveis com dados de cinética de inibição
para outros nitrofuranos.
•
coordenadas do receptor
coordenadas do receptor
coordenadas do ligante
coordenadas do ligante
sítio de ligação
sítio de ligação
docking
rec
rec
rec q 

A jj
B jj
E = ∑  Aii ∑ 12 − Bii ∑ 6 + 332, 0 qi ∑ j 
r
r
i =1 
j =1
j =1
j =1 Drij 
ij
ij


conhecimento do
problema,
lig
energias
visualização gráfica
decisões do
pesquisador
docking
rec
rec
rec q 

A jj
B jj
E = ∑  Aii ∑ 12 − Bii ∑ 6 + 332, 0 qi ∑ j 
r
r
i =1 
j =1
j =1
j =1 Drij 
ij
ij


lig
(4)bioquímica
da
das proteínas
envolvidas
energias
visualização gráfica
de um plano de
ação
análise: distâncias, orientações, interações
complexo enzima-ligante
análise: distâncias, orientações, interações
família de
ligantes
Inibidores de Cisteíno-Proteases
• Compostos de telúrio estão sendo
estudados na sua interação com
catepsinas, no intuito de entender o
mecanismo de inibição de processos
invasivos envolvidos com o câncer de
próstata.
complexo enzima-ligante
(4)
+ de 75% do
tempo
variam com
o algoritmo
utilizado
Cl 1
Cl 2
Cl 2
Cl 3
Cl 1
Cl 1
Cl 2
Drug Delivery - nanotecnologia
novos métodos de preparação de sistemas
liberadores de fármacos
Drug Delivery - nanotecnologia
inaladores
microesferas
implantes
patches
Drug Delivery - nanotecnologia
polímero
polímero
fármaco
tempo t = 0
tempo t = t
Obrigada pela atenção!