Universidade Camilo Castelo Branco
Instituto de Engenharia Biomédica
RITA DE CÁSSIA FERNANDES BORGES
ANÁLISE DE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS (PERFIL LIPÍDICO E
GLICÊMICO) NO SORO HUMANO A PARTIR DA ESPECTROSCOPIA
RAMAN DISPERSIVA
ANALYSIS OF BIOCHEMICAL PARAMETERS (GLYCEMIC AND LIPID PROFILES)
IN HUMAN PLASMA BY THE DISPERSIVE RAMAN SPECTROSCOPY
São José dos Campos, SP
2014
ii
Rita de Cássia Fernandes Borges
ANÁLISE DE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS (PERFIL LIPÍDICO E GLICÊMICO)
NO SORO HUMANO A PARTIR DA ESPECTROSCOPIA RAMAN DISPERSIVA
Orientador: Prof. Dr. Ricardo S. Navarro
Coorientador: Prof. Dr. Landulfo Silveira Jr
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica da
Universidade Camilo Castelo Branco, como complementação dos créditos necessários para obtenção
do Título de Mestre em Engenharia Biomédica.
São José dos Campos, SP
2014
iii
iv
v
Dedico esta dissertação aos meus pais,
Joaquim Borges de Carvalho e Aldir
Fernandes de Carvalho por acreditarem que
eu iria conseguir concluir mais esta etapa,
sempre me apoiando nas horas difíceis.
Ao meu marido, Naelson Pereira de Melo,
por ter me acompanhado nesta jornada.
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por mais uma missão concluída, que exigiu sacrifícios, porém
muito vantajosa.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Ricardo S. Navarro, pelo apoio incondicional e auxílio
constante em meio a tantos compromissos. Pela maturidade e experiência
científicas com que me orientou na elaboração desta dissertação.
Ao meu coorientador, Prof. Dr. Landulfo Siqueira Júnior, pela atenção e orientação,
apoiadas em seu vasto conhecimento. Agradeço pela seriedade e disciplina com
que direcionou esta dissertação.
A todos os funcionários da Universidade Camilo Castelo Branco, que criam com sua
competência o local ideal para se pesquisar e realizar experimentos.
À Universidade Camilo Castelo Branco, por ser parte importante da minha formação.
A todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram nesta dissertação e
não fazem parte somente de um projeto de pesquisa, mas, também de uma história
de vida.
Muito Obrigada!
vii
ANÁLISE DE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS (PERFIL LIPÍDICO E
GLICÊMICO) NO SORO HUMANO A PARTIR DA ESPECTROSCOPIA
RAMAN DISPERSIVA
RESUMO
A espectroscopia Raman pode ser uma poderosa ferramenta empregada na análise
da concentração de glicose e lipídios no soro humano em tempo real, pois, permite o
monitoramento dinâmico, diminuição na quantidade de volume sanguíneo requerido
sem interferir na amostra, além da análise em intervalos muito curtos de tempo. Este
estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade da técnica de espectroscopia Raman
na distinção das diferenças espectrais no soro humano (glicose e componentes
lipídicos) para fins de diagnóstico. Após a aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa foram coletadas 44 amostras de soro humano para análises clínicas de
rotina. O exame bioquímico da glicose (GLI), colesterol total (CHL), triglicérides
(TRG), lipoproteínas de baixa e alta densidade (LDL e HDL) foi realizado com o
método de ensaio bioquímico padrão. Após a avaliação, as amostras de soro foram
colocadas em tubos Eppendorf® (200 mL), mantidas a uma temperatura de 5°C e
submetidas à espectroscopia de Raman. A coleta de dados espectrais foi realizada
por meio de um espectrómetro Raman dispersivo com excitação por laser díodo no
comprimento de onda 830 nm e potência de saída de 250 mW. Os espectros médios
dos grupos normais e alterados foram calculados para cada componente bioquímico,
a fim de determinar quais as bandas Raman podem ser correlacionadas com o
exame bioquímico de interesse e, finalmente, para diferenciar as amostras normais
das alteradas. Foram observadas as intensidades dos picos maiores em bandas
relacionadas com compostos de soro alterados em comparação com as normais.
Nos espectros de glicose ocorreram alterações nos picos em 507, 1065 e 1128 cm-1.
Para compostos lipídicos as principais mudanças ocorreram nos seguintes picos:
CHL: 428, 700, 881, 1085, 1451 e 1659 cm-1; TRG: 877, 1085, 1271, 1307 e 1451
cm-1; HDL: 546, 700, 717, 962, 1004, 1085, 1128, 1320, 1342, 1406, 1555, e 1659
cm-1; e LDL: 546, 700, 1004, 1128 e 1659 cm-1. As diferenças identificadas nas
intensidades dos picos Raman podem ser usadas para discriminar as amostras
viii
normais das alteradas no soro sanguíneo de glicose, colesterol total, triglicérides,
lipoproteínas de baixa e alta densidade, podendo ser empregadas como um meio de
diagnóstico em análises clínicas.
Palavras-chave: Espectroscopia Raman, soro humano, glicose, lipídios, colesterol,
triglicérides.
ix
ANALYSIS OF BIOCHEMICAL PARAMETERS (GLYCEMIC AND
LIPID PROFILES) IN HUMAN PLASMA BY THE DISPERSIVE RAMAN
SPECTROSCOPY
ABSTRACT
Raman spectroscopy can be a powerful tool used to analyze the concentration of
glucose and lipids in human serum in real time thus allows monitoring dynamic,
decrease in the amount of blood volume required without interfering in the samples,
besides the analysis in very short intervals of time. This study aimed to evaluate the
feasibility of the technique of Raman Spectroscopy in the distinction of the spectral
differences in human serum (glucose and lipid components) for diagnostic purposes.
After approval by the Committee of ethics in research were collected 44 human
serum samples for routine clinical analyses, which were kindly provided for use in this
study. The biochemical examination of glucose (GLU), total cholesterol (CHL),
triglycerides (TRG), low and high density lipoproteins (LDL and HDL) was performed
with the standard biochemical test method. After the evaluation, serum samples were
placed in Eppendorf ® tubes (200 mL), maintained at a temperature of 5° C and
subjected to Raman spectroscopy. Spectral data collection was accomplished
through a dispersive Raman spectrometer with laser excitation by diode at 830 nm
wavelength and output power of 250 mW. The average spectra of normal and altered
groups were calculated for each biochemical component, in order to determine the
Raman bands can be correlated with biochemical examination of interest and, finally,
to differentiate normal samples of altered. Observed peak intensities were greatest in
bands related to altered serum compounds compared to the normal. In the spectra of
GLU occurred changes in the peaks at 507, 1065 and 1128cm-1. For lipid compounds
the main changes occurred in the following peaks: CHL: 428, 700, 881, 1085, 1451
and 1659 cm-1; TRG: 877, 1085, 1271, 1307 and 1451 cm-1; HDL: 546, 700, 717,
962, 1004, 1085, 1128, 1320, 1342, 1406, 1555, and 1659 cm-1; and LDL: 546, 700,
1004, 1128 and 1659 cm-1. Identified differences in the intensities of the Raman
peaks can be used to discriminate between normal samples of altered in the blood
serum of glucose, total cholesterol, triglycerides, low and high density lipoproteins,
and may be employed as a means of diagnosis in clinical analyses.
x
Key-words: Raman spectroscopy, human serum, glucose, lipids, cholesterol,
triglycerides.
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Estrutura molecular da glicose..........................................................
23
Figura 2
Oxidação do gliceraldeído-3-fosfato-Desidrogenase......................
31
Figura 3:
Equação da Hexoquinase..............................................................
36
Figura 4:
Exemplo de espectro Raman no infravermelho-próximo do
colesterol indicando as curvas (bandas) das ligações entre os
elementos moleculares..................................................................
46
Figura 5:
O físico C. V. Raman.........................................................................
47
Figura 6:
Esquema representativo da trajetória de um feixe de luz
interagindo com um obstáculo........................................................... 48
Figura 7:
O espalhamento (a) elástico e (b) inelástico.....................................
Figura 8:
Esquema representativo da interação da radiação óptica com o
tecido biológico ................................................................................
Figura 9:
49
49
Esquerda: Diagrama esquemático do espectrômetro Raman
acoplado a um cabo de fibra óptica. Direita: Configuração do
instrumento real de micro-Raman.....................................................
57
Figura 10: Gráfico da Intensidade do pico de 518 cm-1 em função da
concentração da glicose....................................................................
60
Figura 11: Gráfico da Intensidade do pico de 1128 cm-1 em função da
concentração da glicose……….......................................................
61
Figura 12: Espectro médio de todas as amostras de soro humano, retiradas
de amostras com diferentes concentrações de compostos
bioquímicos selecionados.................................................................
62
Figura 13: Espectros de amostras de soro com concentrações normais e
alteradas de glicose ……..................................................................
63
Figura 14: Espectros de amostras de soro com concentrações normais e
alteradas de Colesterol ….................................................................
64
Figura 15: Espectros de amostras de soro com concentrações normais e
alteradas de Triglicérides ……………................................................ 64
Figura 16: Espectros de amostras de soro com concentrações normais e
alteradas de HDL..............................................................................
65
xii
Figura 17: Espectros de amostras de soro com concentrações normais e
alteradas de LDL ……………............................................................
65
Figura 18: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo
modelo PLS para amostras de triglicérides/treino.........................
68
Figura 19: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo
modelo PLS para amostras de triglicérides/validação...................
68
Figura 20: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo
modelo PLS para amostras de colesterol/treino............................
69
Figura 21: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo
modelo PLS para amostras de colesterol/validação......................
69
Figura 22: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo
modelo PLS para amostras de HDL/treino.....................................
70
Figura 23: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo
modelo PLS para amostras de HDL/validação...............................
70
Figura 24: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo
modelo PLS para amostras de LDL/treino......................................
71
Figura 25: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo
modelo PLS para amostras de LDL/validação...............................
71
Figura 26: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo
modelo PLS para amostras de glicose/treino................................
72
Figura 27: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo
modelo PLS para amostras de glicose/validação.........................
72
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1:
Classificação etiológica do DM..................................................
Tabela 2:
Valores de glicemia plasmática para o diagnóstico do Diabetes
27
Mellitus e seus estágios pré-clínicos..........................................
28
Tabela 3:
Glicemia média estimada conforme valor da HbA1c..................
35
Tabela 4:
Classificação, propriedades e composição das lipoproteínas
humanas.....................................................................................
38
Tabela 5:
Descrição das principais apolipoproteínas.................................
39
Tabela 6:
Valores de referência.................................................................
42
Tabela 7:
Fases para o tratamento das dislipidemias................................
45
Tabela 8:
Concentração dos componentes sanguíneos através da análise
bioquímica..................................................................................
Tabela 9:
54
Os valores de referência estabelecidos para glicose e lipídios no
soro sanguíneo humano, de acordo com o American Heart
Association................................................................................
58
Tabela 10: Número de amostras e faixa de valores de concentrações nos
grupos normais e alterados........................................................
58
Tabela 11: Concentração de glicose diluída em água destilada – Curva de
calibração...................................................................................
59
Tabela 12: Número de amostras de soro humano utilizadas para treino.....
66
Tabela 13: Número de amostras de soro humano utilizadas para validação
67
Tabela 14: Concentração dos elementos bioquímicos para validação e
treino das amostras de soro humano por meio do modelo PLS
de quantificação.........................................................................
73
Tabela 15: Dados representativos do desempenho do analisador utilizados
pelo laboratório para o método de análise bioquímica do HDL..
74
Tabela 16: Dados representativos do desempenho do analisador utilizados
pelo laboratório para o método de análise bioquímica do
colesterol...................................................................................
74
Tabela 17: Dados representativos do desempenho do analisador utilizados
pelo laboratório para o método de análise bioquímica do
triglicérides.................................................................................
75
xiv
Tabela 18: Dados representativos do desempenho do analisador utilizados
pelo laboratório para o método de análise bioquímica do LDL..
75
Tabela 19: Dados representativos do desempenho do analisador utilizados
pelo laboratório para o método de análise bioquímica da glicose
76
xv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ADA
American Diabetes Association
AVC
Acidente Vascular Cerebral
CCD
Charge Coupled Device
CT
Colesterol Total
DAC
Doença da Artéria Coronária
DM
Diabetes Mellitus
DM1
Diabetes Mellitus tipo 1
DM2
Diabetes Mellitus tipo 2
EPI
Equipamentos de Proteção Individual
GAD
Descarboxilase do Ácido Glutâmico
Hb
Hemoglobina
Hb A1c1
Hemoglobina Glicada
HDL
Lipoproteínas de Alta Densidade
IAA
Anticorpo Anti-Insulina
ICA 512
Anticorpo Anti-Células de Ilhota (marcador de diabetes de
etiologia autoimune)
IDL
Lipoproteínas de Densidade Intermediária
Laser
Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação
LDL
Lipoproteínas de Baixa Densidade
MEV
Mudança de Estilo de Vida
NAD
Nicotinamida Adenina Dinucleótido
NADH
Nicotinamida Adenina Dinucleótido Hidreto
NIR
Infravermelho Próximo
PC
Personal Computer
PLS
Partial Least Squares
TCLE
Termo de Consentimento Livre Esclarecido
TOTG
Teste Oral de Tolerância à Glicose
VLDL
Lipoproteína de Muito BaixaDensidade
µL
Microlitro
cm-¹
Unidade do Deslocamento Raman
NR
Não Realizado
xvi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................
18
1.1. Objetivo geral..........................................................................................
20
1.2. Objetivos específicos............................................................................... 20
2. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................
21
2.1 Doenças cardiovasculares.......................................................................
21
2.1.1. Epidemiologia......................................................................................
22
2.2. Glicose....................................................................................................
22
2.2.1. Controle endócrino do metabolismo....................................................
23
2.2.2. Insulina................................................................................................
25
2.2.3. Diabetes Mellitus..................................................................................
25
2.2.3.1. Classificação do diabetes.................................................................
26
2.2.3.2. Mensuração da glicemia................................................................
27
2.2.3.3. Métodos utilizados para verificar a glicemia.................................
29
2.2.3.4. Novas tecnologias de medição de glicemia..................................
33
2.3. Lipídios....................................................................................................
36
2.3.1. Lipoproteínas plasmáticas...................................................................
36
2.3.2. Apolipoproteínas..................................................................................
39
2.4. Dislipidemia: principais tipos, diagnóstico e implicações clínicas...........
40
2.4.1. Classificação laboratorial ou bioquímica..............................................
41
2.4.2. Classificação etiológica........................................................................
42
2.4.3. Avaliação laboratorial das dislipidemias............................................... 43
2.4.4. Classificação das dislipidemias............................................................
44
2.4.4.1. Avaliação de placas ateroscleróticas através da espectroscopia
Raman...............................................................................................
45
2.5. Espectroscopia Raman...........................................................................
46
2.5.1. Espalhamento Raman..........................................................................
48
2.5.2. Definição de uma banda no espectro..................................................
50
2.5.3. Aplicações biomédicas da Espectroscopia Raman.............................. 51
3. MATERIAL E MÉTODO.................................................................................
54
3.1. Amostras de Soro Humano ....................................................................
54
3.2. Espectroscopia Raman...........................................................................
56
xvii
4. RESULTADOS...............................................................................................
62
4.1. Espectros Raman de Soro Humano.......................................................
62
4.2. Avaliação do Perfil Glicêmico.................................................................
63
4.3. Avaliação do Perfil Lipídico (colesterol total, triglicérides, HDL, LDL)....
63
4.4. Correlação dos resultados bioquímicos e Raman por meio do
Método PLS de Quantificação......................................................................
66
5. DISCUSSÃO..................................................................................................
77
6. CONCLUSÃO................................................................................................
81
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................
82
ANEXO A. Aprovação do Comitê de Ética........................................................
90
ANEXO B. Carta de Solicitação de Material Biológico.....................................
93
ANEXO C. Carta de Doação do Material Biológico.......................................
95
18
1. INTRODUÇÃO
A composição bioquímica do plasma sanguíneo reflete a situação metabólica dos
tecidos, de forma a avaliar lesões teciduais, transtornos no funcionamento dos
órgãos e desequilíbrios metabólicos. A interpretação do perfil bioquímico é complexa
devido aos mecanismos que controlam o nível sanguíneo de vários metabólitos,
sendo que para detecção destes problemas são realizadas as análises laboratoriais.
Estas incluem a detecção dos componentes lipídicos circulantes, como colesterol,
low density lipoproteins (LDL), high density lipoproteins (HDL), triglicérides, além da
glicose e hemoglobina glicada, dentre outros marcadores que são usados para
detectar alterações metabólicas e que têm potencial para desenvolver doenças
cardíacas (BACHORIK et al., 2001; BARMAN et al., 2012).
Os fatores de risco cardíaco (sedentarismo, obesidade, stress, dislipidemia,
diabetes, tabagismo) têm papel importante no desenvolvimento da doença
aterosclerótica, porém a progressão da aterosclerose depende da quantidade e tipo
de lipídios circulantes e do potencial de se acumularem na parede das artérias.
Portanto, a análise precisa das lipoproteínas é um fator de extrema relevância para
evolução e prevenção da doença aterosclerótica coronariana (VAN DE POLL et al.,
2001; BUSCHMAN et al., 2001).
O Diabetes Mellitus (DM) e a hipertensão arterial, juntamente com a
dislipidemia,
constituem
cardiovasculares,
sendo
os
principais
atualmente
fatores
de
consideradas
risco
como
para
as
doenças
epidemia
mundial,
traduzindo-se em grande desafio para os sistemas de saúde de todo o mundo
(SMELTZER; BARE, 2005). Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde
(OMS), no Brasil, o diabetes junto com a hipertensão arterial, são responsáveis pela
primeira causa de mortalidade e de hospitalização, de amputação de membros
inferiores e representa, ainda, 62,1% dos diagnósticos primários em pacientes com
insuficiências renais crônicos submetidos à diálise (AMERICAN DIABETES
ASSOCIATION, 2011).
O DM está, diretamente, relacionado às dislipidemias, que levam ao
desenvolvimento de aterosclerose acelerada e dão origem às complicações
macrovasculares como o infarto do miocárdio, o acidente vascular cerebral (AVC) e
à insuficiência vascular periférica, bem como às complicações microvasculares que
19
determinam a retinopatia, nefropatia e neuropatia nos pacientes com DM tipo 1 e 2.
Devido à micro-angiopatia, o DM é uma das principais causas de cegueira,
insuficiência renal crônica e neuropatias debilitantes, ou seja, valores de glicose
alterados, principalmente em processos crônicos, podem trazer consequências
negativas como degeneração progressiva e falência de órgãos importantes como
cérebro, rim, fígado, coração e artérias (KNUDSON; WEINSTOCK; HENRY, 2001).
A melhor maneira de reduzir as complicações associadas às alterações na glicemia
e colesterol é manter os níveis destes componentes em concentrações normais
(ALEIXO et al., 2007).
A espectroscopia Raman é uma técnica de excelência para realizar a análise
bioquímica, pois permite a medição da energia vibracional das moléculas, sem
destruição ou remoção de tecido, proporcionando conhecimento quantitativo da
composição molecular in situ, em tempo real (DINGARI et al., 2012). Por ser uma
poderosa ferramenta, tem possibilidade de ser empregada na análise da glicose e
triglicérides no soro sanguíneo humano, pois não tem necessidade de preparação
da amostra, diminuição na quantidade de volume sanguíneo requerido sem interferir
no processo, além da análise em tempo reduzido, permitindo, em última instância, o
monitoramento dinâmico com baixo custo (BACHORIK et al., 2001; CORDOVA et
al., 2009; GUIMARÃES et al., 2006).
Pelo método Raman é possível quantificar proteínas, colesterol, gordura
adventícia e cristais de cálcio nas artérias (KOMACHI; SATO; TASHIRO, 2006). A
análise macroscópica e microscópica pelo método tem grande potencial para os
estudos bioquímicos e pode fornecer informações sobre a estrutura, concentração e
interação bioquímica das moléculas em seus respectivos microambientes sem
extração do tecido, homogeneização, marcas, etiquetas ou uso de agentes de
contraste fornecendo informação de diagnóstico qualitativo e quantitativo in vivo
(BUSCHMAN et al., 2001; HANLON et al. 2000). Um método de quantificação de
componentes do soro sanguíneo baseado em espectroscopia Raman pode, em um
futuro próximo, tornar-se uma alternativa ou até mesmo substituir os métodos
bioquímicos existentes (DINGARI et al., 2011).
A espectroscopia Raman é uma ferramenta óptica que vem sendo
empregada na identificação de alterações patológicas em tecidos neoplásicos tais
como câncer de pele, identificação e quantificação de proteínas e lipídios na placa
ateromatosa (STONE et al., 2013), e fluidos biológicos usados na pesquisa realizada
20
por Saade et al., (2008) que identificaram a hepatite C em amostras de sangue
humano no infravermelho (NIRS) de Espectroscopia Raman; Dou et al. (1996)
determinaram, quantitativamente, a concentração de glicose, acetona, ureia e
creatina na urina humana (McMURDY; BERGER, 2003). A medição de vários
componentes-chave tais como colesterol, ureia, glicose e outros, foi realizada por
Berger, Itzkan e Feld (1997) em concentrações fisiológicas, usando um sistema de
dispersão da Espectroscopia Raman.
1.1. Objetivo geral
•
Correlacionar os elementos bioquímicos (lipídios e glicose) presentes no soro
humano por meio da espectroscopia Raman dispersiva, comparativamente,
com o método bioquímico com o intuito de obter um diagnóstico precoce das
dislipidemias e alterações glicêmicas.
1.2. Objetivos específicos
•
Quantificar e analisar as concentrações normais e alteradas de glicose e
lipídios, especificamente colesterol total, triglicérides, LDL e HDL no soro
humano por meio da espectroscopia Raman dispersiva através do método
PLS;
•
Comparar os parâmetros obtidos nos exames bioquímicos da glicose e lipídios,
especificamente colesterol total, triglicérides, LDL e HDL com os parâmetros da
espectroscopia Raman dispersiva.
21
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Doenças cardiovasculares
As doenças cardiovasculares (DCV) responsáveis pela maior taxa de morbidade e
mortalidade em nível mundial têm se tornado o foco de diversos estudos, pois
atingem enorme contingente populacional, além de representar elevado custo social
e econômico (SIMÃO et al., 2002).
Conforme Smith et al. (2004), as doenças cardiovasculares estão entre as
principais causas de morte no Brasil. É uma doença multifatorial em resposta à
agressão endotelial, acometendo principalmente a camada íntima de artérias de
médio e grande calibre, cuja prevenção passa pela identificação e controle dos
principais fatores de risco. Vários fatores de risco contribuem com a progressão da
aterosclerose, dentre eles os quatro principais são o tabagismo, o diabetes mellitus
(DM), a hipertensão arterial sistêmica (HAS) e as dislipidemias.
Do ponto de vista etiológico, a HAS é indicada como o principal fator de risco
para as DCV. Cerca de 80% das mortes por acidente vascular cerebral (AVC) e 40%
dos óbitos por doença coronariana são resultantes de HAS; a doença hipertensiva
por si é responsável diretamente por cerca de 5% dos óbitos do grupo dos DCV
(SIMÃO et al., 2002).
As dislipidemias, a HA e o diabetes mellitus (DM) são considerados as
principais entidades mórbidas que apresentam os maiores índices de morbidade e
mortalidade cardiovascular (SIMÃO et al., 2002).
Smith et al. (2004), afirmam que os níveis plasmáticos de Low Density
Lipoproteins (LDL) estão diretamente relacionados com a incidência de eventos
coronarianos e morte cardiovascular, contudo existem, ainda, fatores como o
estresse, a obesidade, o sedentarismo e o alcoolismo que influenciam no processo
dos problemas cardíacos.
Segundo estudo realizado pela Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD),
publicado em 2011, faz-se necessária uma mudança de paradigma no processo de
monitorização e de educação em Diabetes Mellitus, sem o que não se obterá um
avanço concreto na melhoria da assistência aos pacientes com DM no Brasil, onde
90% das pessoas com DM1 e 73% das com DM2 apresentam um mau controle do
22
mesmo, portanto a importância das intervenções educacionais e da monitorização
inteligente e racional do controle glicêmico para, juntamente com a intervenção
farmacológica da utilização de análogos de insulina, aumentar significativamente as
probabilidades de sucesso terapêutico.
2.1.1. Epidemiologia
As doenças cardiovasculares são responsáveis por 29,4% de todas as mortes
registradas no País em um ano. Isso significa que mais de 308 mil pessoas
faleceram principalmente de infarto e acidente vascular cerebral (AVC). Estudos do
Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (São Paulo, SP.) mostram que 60%
dessas vítimas são homens, com média de idade de 56 anos. A alta frequência do
problema coloca o Brasil entre os 10 países com maior índice de mortes por
doenças cardiovasculares (GOMES, 2011).
Já a incidência do diabetes tipo 1 aproxima-se de 0,5 casos novos para cada
100.000 habitantes ao ano e acomete principalmente crianças, adolescentes e
adultos jovens, sendo a maior idade de ocorrência por volta da adolescência.
Diversos estudos recentes apontam para uma tendência mundial ao aumento da
incidência da doença em menores de 5 anos de idade, com maior destaque aos
países nórdicos (PINTO, 2012).
2.2. Glicose
A glicose é um monossacarídeo do grupo dos carboidratos mais importantes,
também chamada de glucose ou dextrose, neste estudo optou-se por padronizar a
nomenclatura de glicose.
A glicose, a frutose e a galactose são monossacarídeos e são os únicos
carboidratos que podem ser absorvidos pela corrente sanguínea através da parte
interna do intestino. A lactose, a sacarose e a maltose são dissacarídeos e são
facilmente convertidos em suas bases monossacarídicas pelas enzimas no trato
digestivo. Monossacarídeos e dissacarídeos são chamados de carboidratos simples.
Eles também são açúcares, têm sabor doce, são digeridos e entram na corrente
sanguínea de forma muito rápida (FRANCISCO JÚNIOR, 2008).
23
A glicose é a aldo-hexose de maior importância para a manutenção
energética do organismo. O nome Glicose veio do grego (glykys), que significa
"doce", mais o sufixo-ose, indicativo de açúcar. Tem função de regulador de energia,
participa das vias metabólicas, além de ser precursora de outras importantes
moléculas (BRAND-MILLER; FOSTER-POWELL; COLAGIURI, 2003).
A glicose é formada por seis átomos de carbono, 12 moléculas de hidrogênio
e 6 de oxigênio, conforme ilustra a Figura 1. A glicose é um açúcar simples, assim
como a frutose, principal açúcar das frutas e lactose (açúcar encontrado no leite)
produzida a partir de uma molécula de glicose ligada a uma de galactose tem a
mesma fórmula química da glicose (C6H12O6), porém a organização dos átomos é
um pouco diferente (BUSH, 2004).
Figura 1: Estrutura molecular da glicose.
Fonte: http://www.objetoseducacionais2.mec.gov.br.
2.2.1. Controle endócrino do metabolismo
O sistema endócrino, juntamente com o sistema nervoso, regula e controla todas as
funções do organismo humano. O sistema endócrino atua no crescimento dos
tecidos, no equilíbrio hídrico do corpo, na reprodução e no metabolismo de
carboidratos (FRANCISCO JÚNIOR, 2008).
O sistema endócrino se constitui de várias glândulas e tecidos que secretam
substâncias químicas, os chamados hormônios, responsáveis pelo controle da
24
maioria das funções biológicas. Os hormônios são responsáveis pela manutenção
da homeostase, ou seja, pelo equilíbrio e perfeito funcionamento do organismo
(MIGLIORINI, KETTELHUT, 2004).
De acordo Bush (2004), o metabolismo intermediário é, coletivamente, a
síntese (anabolismo), a decomposição (catabolismo) e as transformações das três
classes de nutrientes orgânicos ricos em energia – carboidrato, gordura e proteína –
dentro do organismo. A glicose e os ácidos graxos derivados de carboidratos e
gorduras, respectivamente são utilizados principalmente como combustíveis
metabólicos, enquanto os aminoácidos derivados de proteínas são utilizados
principalmente para a síntese de proteínas estruturais e enzimáticas (FRANCISCO
JÚNIOR, 2008).
Durante o estado absortivo após uma refeição, o excesso de nutrientes
absorvidos e não imediatamente necessários para a produção de energia ou para a
síntese proteica é, até certo ponto, armazenado como glicogênio no fígado e nos
músculos, mas, majoritariamente, como triglicérides no tecido adiposo. Durante o
estado pós-absortivo entre as refeições, quando nenhum nutriente novo entra no
sangue, os estoques de glicogênio e triglicérides são catabolizados para liberar
moléculas de nutrientes no sangue. Se necessário, as proteínas do organismo são
degradadas para liberar aminoácidos que são convertidos em glicose, processo
chamado de gliconeogênese (FRANCISCO JÚNIOR, 2008). A concentração de
glicose no sangue é controlada por fatores que regulam a absorção de glicose pelas
células e a produção de glicose pelo fígado.
As mudanças nas vias metabólicas entre os estados absortivos e pósabsortivos são controladas por hormônios, e o mais importante deles é a insulina. A
insulina é secretada pelas células β das ilhotas de Langherans, células endócrinas
localizadas no pâncreas (FRANCISCO JÚNIOR, 2008).
A insulina é um hormônio anabólico, que promove a absorção celular de
glicose, ácidos graxos e aminoácidos e aumenta a conversão em glicogênio,
triglicérides e proteínas, respectivamente. Ao fazer isso, ela reduz as concentrações
dessas pequenas moléculas orgânicas no sangue. A secreção de insulina aumenta
durante o estado absortivo, principalmente por efeito direto de um maior nível de
glicose no sangue sobre as células β via acoplamento excitação-secreção. A insulina
guia os nutrientes para dentro das células durante este estado (BUSH, 2004).
25
O glucagon, hormônio secretado pelas células α pancreáticas mobiliza as
moléculas ricas em energia de seus estoques durante o estado pós-absortivo, em
resposta a um efeito direto da queda da glicose no sangue sobre as células α, em
geral se opõe às ações da insulina (BUSH, 2004).
2.2.2. Insulina
Conforme Calliari (2012), a insulina é uma proteína simples na qual duas cadeias de
polipeptídios de aminoácidos são reunidas por ligações de dissulfeto. Através da
insulina a glicose é transformada nas células para que elas possam oxidar e produzir
energia para o corpo. No tecido adiposo, a insulina facilita o armazenamento da
glicose e sua conversão em ácidos graxos.
A insulina permite a decomposição química dos ácidos graxos. No músculo,
ela permite que os aminoácidos produzam proteínas no tempo ideal. No fígado,
ajuda a converter a glicose em glicogênio (o armazenamento de carboidrato em
animais) e reduz a gliconeogênese (a formação de glicose a partir de fontes de não
carboidratos). A ação da insulina é antagonizada pelo glucagon (outro hormônio
pancreático) e pela adrenalina (CALLIARI, 2012).
Conforme Gabbay e Dib (2006), as funções da insulina são: possibilitar que
a glicose seja transportada pelas membranas das células; transformar a glicose em
glicogênio para ser armazenado no fígado e músculos; ajudar o excesso de glicose
a ser convertido em gordura; processo com alto custo de energia.
2.2.3. Diabetes Mellitus
De acordo com a American Diabetes Association (2011), o Diabetes Mellitus (DM) é
caracterizado um grupo de doenças metabólicas caracterizadas por hiperglicemia,
resultante de defeitos na secreção de insulina e/ou em sua ação. A hiperglicemia se
manifesta por sintomas como poliúria, polidipsia, perda de peso, polifagia e visão
turva ou, ainda, por complicações agudas que podem levar a risco de vida como, por
exemplo, a cetoacidose diabética e a síndrome hiperosmolar hiperglicêmica não
cetótica. A hiperglicemia crônica está associada a dano, disfunção e falência de
vários órgãos, especialmente olhos, rins, nervos, coração e vasos sanguíneos.
26
O DM é uma doença prevalente, classificada como uma epidemia pela
Organização Mundial de Saúde (OMS). A estimativa da prevalência mundial está em
torno de 4% (KING; ALBERT; HERMAN, 1998; WILD et al., 2004) e, no Brasil, em
7,6% na última avaliação (GROSS et al., 2002).Sua incidência tem aumentado de
forma assustadora nos países em desenvolvimento, tanto em adultos quanto em
adolescentes, e estima-se um aumento de 60% da prevalência na população adulta
acima de 30 anos em 2025 (KING; ALBERT; HERMAN, 1998) apresentando maior
significância a faixa que se encontra entre 45 e 64 anos(MARASCHIN et al., 2010).
O DM é o conjunto mais comum de distúrbios do metabolismo dos
carboidratos, doença crônica é a sexta causa de mortes por doenças nos Estados
Unidos e é responsável por morbidade e mortalidade e custos significantes. O DM é
a principal causa de amputações não traumáticas, e a causa mais comum de
cegueira entre adultos, entre os 20 e os 74 anos de idade. Agravos neurológicos,
conhecidos como neuropatia diabética, ocorrem em 60 a 70% das pessoas com a
doença. Os autores chamam a atenção para o fato de que a maioria dos óbitos em
decorrência de diabetes, no entanto, está relacionada ao risco aumentado de
desenvolvimento de doença ateroesclerótica. “As pessoas com diabetes são quatro
a
cinco
vezes
mais
propensas
a
desenvolver
doenças
cardíacas
e
cerebrovasculares do que aquelas sem diabetes” (KNUDSON; WEINSTOCK;
HENRY, 2001, p. 250).
De acordo com Smeltzer e Bare (2005), o impacto econômico do diabetes é
muito alto em virtude dos cuidados de saúde crescentes e de uma população em
envelhecimento. As principais metas do tratamento de pacientes com diabetes
incluem o controle dos níveis glicêmicos e desviar-se das complicações agudas e de
longo prazo.
2.2.3.1. Classificação do diabetes
O Diabetes Mellitus (DM) pode ser classificado de acordo com a etiologia, definido
de acordo com defeitos ou processos específicos, e a classificação em estágios de
desenvolvimento, abrangendo estágios pré-clínicos e clínicos, este último incluindo
estágios em que a insulina é necessária para controle e sobrevivência (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE DIABETES, 2011). A Tabela 1 apresenta a classificação etiológica
do DM.
27
Tabela 1: Classificação etiológica do Diabetes Mellitus.
I-
Diabetes tipo 1
• Destruição das células beta, usualmente levando à deficiência completa de insulina.
A – autoimune
B – Idiopático
II- Diabetes tipo 2
• Graus variados de diminuição de secreção e resistência à insulina
III- Outros tipos específicos
A – Defeitos genéticos da função da célula β
B – Defeitos genéticos da ação da insulina
C – Doenças do pâncreas exócrino
D – Endocrinopatias
E – Indução por drogas ou produtos químicos
F – Infecções
G – Formas incomuns de diabetes imunoimediato
IV- Diabetes Gestacional
Fonte: Gross et al., (2002).
De acordo com a etiologia os tipos de diabetes mais frequentes são o
diabetes tipo 1 e o diabetes tipo 2, que compreende cerca de 90% do total de casos.
Outro tipo de diabetes encontrado é o diabetes gestacional, que, em geral, é um
estágio pré-clínico de diabetes, detectado no rastreamento pré-natal. Outros tipos
específicos de diabetes menos frequentes podem resultar de defeitos genéticos da
função das células beta, defeitos genéticos da ação da insulina, doenças do
pâncreas exócrino, endocrinopatias, efeito colateral de medicamentos, infecções e
outras síndromes genéticas associadas ao diabetes (BRASIL, 2006).
2.2.3.2. Mensuração da glicemia
Glicemia refere-se ao nível de glicose circulante no sangue e seu valor pode ser
expresso em mg/dL. Em condições normais, o organismo mantém a glicose no
sangue em quantidades adequadas ao seu funcionamento (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2001).
De acordo com Brasil (2006), a glicemia pode ser medida no sangue venoso
total, do plasma ou do sangue capilar. O resultado obtido dos capilares poderá ser
entre 5% e 10% maiores do que no sangue venoso, respectivamente para o jejum e
28
duas horas após refeição, que por sua vez resulta em valor até 15% mais baixos que
os obtidos através do plasma.
Em situações patológicas, como o diabetes, o equilíbrio de regulação da
glicemia é afetado, resultando em níveis anormais. A confirmação de diagnóstico de
tais patologias é realizada por meio da medição desses níveis. As classificações
Tolerância à Glicose Alterada e Glicemia de Jejum Alterada correspondem a
estágios intermediários entre o diabetes e a normalidade (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2001).
A Tabela 2 mostra os valores definidos como critério de diagnóstico
estabelecido pela Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD, 2011).
Tabela 2: Valores de glicemia plasmática para o diagnóstico do Diabetes Mellitus e seus estágios
pré-clínicos.
CATEGORIA
Glicemia de
jejum
(mg/dL)
Glicemia de 2 h
após 75g de
glicose (mg/dL)
NORMAL
< 100
<140
<5,7
140 -199
5,7 – 6,4%
≥ 200 com
sintomas
clássicos.
≥ 6,5%
PRÉ-DIABETE
Glicemia de
jejum
alterada
≥ 126
HbA1c (%)
100 – 125
Tolerância à
glicose
diminuída
DIABETES
Glicemia
casual
(mg/dL)
≥ 200
Fonte: American Diabetes Association (2011).
De
acordo
com
a
Sociedade
Brasileira
de
Diabetes
(2011),
as
consequências para o organismo, de valores anormais de glicemia, são classificadas
como complicações agudas e crônicas. As complicações agudas podem ocorrer por
hiperglicemia ou hipoglicemia. No primeiro caso pode ocorrer a cetoacidose,
decorrente do envolvimento de proteínas e gorduras para obtenção de glicose, e a
desidratação do corpo, devido ao aumento da osmolaridade do sangue e
consequente eliminação de líquidos pela função renal. No caso da hipoglicemia, com
o cérebro sem energia, cuja única fonte é a glicose no sangue, as consequências
são tonturas, distúrbios do comportamento, perdas da consciência. Em ambos os
casos, se não houver tratamento a tempo, as complicações podem levar ao coma e
29
a morte. As complicações crônicas são devido a um longo período com níveis
elevados de glicemia, que implicam na degeneração progressiva e falência de vários
órgãos, como rins, olhos e coração (Sociedade Brasileira de Diabetes (2011)).
2.2.3.3. Métodos utilizados para verificar a glicemia
O monitoramento clínico da glicose no sangue foi decisivo para melhorar o controle
e a qualidade de vida do indivíduo com diabetes nos últimos anos. Para obtenção de
resultados ainda melhores se faz necessário compreender e educar o paciente
quanto às causas de muitos dos erros comuns no uso dos monitores (CORDOVA et
al., 2009).
Conforme Gross et al. (2002), as vantagens e necessidades de manter
rigorosamente a glicemia em valores normais deram origem a métodos de auto
monitoração, possibilitando medições regulares e permitindo especificações de
medidas terapêuticas nas doses certas. Alguns métodos criados utilizam uma
amostra de sangue que, em reação com uma fita reagente, resulta numa
determinada cor, onde por meio de uma comparação visual entre a cor resultante e
um cartão padrão de cores, a ordem de grandeza da glicemia pode ser estimada.
A glicose no sangue reage com outra substância na tira e da reação química
são gerados elétrons (eletroquímica). A corrente elétrica produzida, proporcional à
glicemia, é lida pelo aparelho e convertida em níveis de glicose (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2001).
Aleixo et al (2007), afirmam que ultimamente, a maioria dos sistemas
portáteis de monitorização da glicose, conhecidos como glicosímetros são aparelhos
capazes de definir a concentração da glicose em sangue total. A amostra é obtida
através da punção dos dedos das mãos e é denominada como sangue capilar,
sendo estes aparelhos compostos por uma fita reagente que entra em contato com
um reflectômetro. Na maioria dos sistemas, a glicose do sangue capilar é oxidada
para ácido glucônico e peróxido de hidrogênio após o contato do sangue com as
fitas reagentes que contêm glicose oxidase ou peroxidase. Esta reação leva a uma
alteração na cor da fita que será interpretada por meio de dois métodos: fotométrico
ou amperométrico. Aleixo et al. (2007), explicam que nos sistemas fotométricos, o
resultado da glicemia é obtido pela intensidade de mudança da cor, este modelo em
sua maioria, é capaz de interpretar um único comprimento de onda, embora alguns
30
glicosímetros que utilizam o método fotometria de absorbância possam interpretar
mais de um comprimento.
Existem, ainda, os sistemas fotométricos de monitorização de glicose
baseados na avaliação da reação da glicose com a hexoquinase, ou seja, quando o
sangue é aplicado à tira reagente, a glicose é fosforilada em glicose-6-fosfato,
posteriormente é depois oxidado com redução concomitante do NAD.
A NADH desidrogenase, também designada como complexo I e NADH:
quinona oxidorredutase, é uma enzima localizada na membrana mitocondrial interna
que catalisa a transferência de elétrons do NADH para a coenzima Q.
O NADH formado é diretamente proporcional à quantidade de glicose
presente na amostra, conforme Figura 2. Em seguida, o NADH, na presença de
outra enzima, reduz o corante e um produto colorido é gerado. A tira com o sangue
capilar é inserida no fotômetro, que mede a reflectância da reação, sendo então
utilizado um algoritmo para calcular e quantificar a glicose daquela amostra (ALEIXO
et al., 2007).
31
Figura 2: Oxidação do gliceraldeído-3-fosfato–Desidrogenase.
Fonte: http://materiais.dbio.uevora.pt/jaraujo/biocel/glicolise.htm.
Boyd, Leigh e Stuart (2005) descrevem que no sistema amperométrico,
emprega-se a medida eletrônica da luz que é refletida da fita reagente, onde a
quantificação é feita pela medida da corrente que é produzida quando a glicose
oxidase catalisa a oxidação da glicose em ácido glucônico ou quando a glicose
desidrogenase catalisa a oxidação de glicose para gluconolactona. Os elétrons
gerados durante esta reação são transferidos a partir do sangue para os eletrodos. A
magnitude da corrente resultante é proporcional à concentração de glicose na
amostra e é convertida para uma leitura no monitor.
Conforme a Sociedade Brasileira de Diabetes (2009), independentemente do
tipo de tecnologia usada, os fabricantes devem testar e informar se a eficácia de
seus glicosímetros encontra-se dentro das especificações sugeridas pela resolução
International Organization for Standardization (ISO) ISO-15197: 2003.
Para Aleixo et al. (2007), os dois tipos de glicosímetros ainda são os
aparelhos que oferecem o melhor resultado, porém, estes resultados podem ser
alterados por: condições ambientais, como por exemplo, a umidade elevada, altitude
e modo de utilização do equipamento. As desvantagens desses dispositivos são os
relativamente elevados custos das tiras reagentes e o incômodo causado por
frequentes perfurações no dedo, para a coleta da amostra de sangue, o que os
caracterizam como métodos invasivos.
Cordova et al. (2009) relatam, que, na prática clínica, pode haver
necessidade de alvos mais rigorosos de eficácia e precisão do método, como, por
exemplo, nos indivíduos com episódios de hipoglicemia e naqueles que fazem
ajustes frequentes na dose da insulina baseados na glicemia capilar. A imprecisão
de sistemas de monitoramento de glicose é multifatorial e pode, basicamente, ser
resultante de quatro fatores: as tiras, físicos, paciente e farmacológico.
32
Para os mesmos autores as fitas com defeito de fabricação e perda da
cobertura enzimática, com pontos desencapados, levam a uma subestimação dos
valores de glicose. Tiras que precisam de uma amostra maior de sangue têm menor
eficácia devido à possibilidade de não se alcançar o volume apropriado para
cobertura completa da superfície reagente.
Os fatores físicos podem interferir na armazenagem das tiras com uma
temperatura e umidade elevada ou com o tubo aberto, permitindo que a umidade
penetre nas fitas, o que pode encurtar a sua vida útil.
Cordova et al. (2009) descrevem que diferentes marcas de fitas de glicose
podem falhar de modo diferente. Quando ocorre uma falha, algumas marcas podem
subestimar o valor de glicose, enquanto que outras podem superestimá-lo, o autor
cita como exemplo, altitudes extremas, com alteração da concentração de oxigênio
quando se utilizam monitores baseados na reação da glicose oxidase, sendo neste
caso, mais adequada a utilização de reagente pelo método glicose desidrogenase.
Em ambos os casos, o erro pode ser grande e, geralmente, os medidores são
incapazes de detectar um problema com a tira mal armazenada.
Outro problema relacionado com o paciente, pois segundo os autores erros
ou esquecimento ao fazer a codificação para calibrar a fita são frequentes. Os
glicosímetros que não necessitam de codificação reduzem este tipo de risco de erro.
Outros problemas que podem levar a erro de medições estão relacionados com a
não lavagem das mãos quando restos de alimentos ou corantes se misturam à
amostra coletada, variações do hematócrito também podem alterar os resultados;
entretanto, diversos glicosímetros informam ajustes para o hematócrito, reduzindo
estes erros, mesmo assim, não é recomendado o uso dos glicosímetros em
indivíduos com hematócrito muito baixo (CORDOVA et al., 2009).
Alguns medicamentos, tais como: acetaminofen, tolazamida e ácido
ascórbico, também, podem alterar de forma muito discreta, as leituras de
glicosímetros amperométricos ou fotométricos que utilizam a reação da glicose
oxidase. Outros açúcares também podem interferir: a maltose e a xilose podem ter
um efeito pequeno nos monitores que utilizam a reação da glicose desidrogenase.
Por outro lado, o icodextrin, que é utilizado em alguns fluidos de diálise peritoneal,
pode aumentar o valor de glicose medida pela reação da glicose desidrogenase em
mais do que 100 mg/dL (FUCHS; WANNMACHER; FERREIRA, 2006).
33
Para que aumente a segurança da utilização das fitas usadas em
glicosímetros, o fabricante deve identificar e alertar, publicamente, o que vai
acontecer com uso de tiras vencidas ou tiras que foram expostas à temperatura ou
umidade inadequadas (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2009).
2.2.3.4. Novas tecnologias de medição de glicemia
Na busca por minimizar ou mesmo evitar, o desconforto causado pelos métodos
invasivos, muitos esforços estão sendo dedicados no desenvolvimento de técnicas
semi-invasivas e não invasivas de monitoração da glicemia. Grande parte desses
novos métodos, ainda, está em desenvolvimento ou em fase de avaliação. Por esse
motivo informações sobre resultados de experimentos com seres humanos, análise
de incertezas e custos, são dificilmente encontradas (PICA, 2002).
Os métodos semi-invasivos utilizam amostras de sangue ou líquido
intersticial em volumes muito menores que necessitam os métodos invasivos. A
coleta da amostra pode ser feita por sensor implantado sob a pele ou por técnica
que a extraiam da pele (PICA, 2002).
Mendosa (2007) relata que os sensores implantados sob a pele executam,
automaticamente, várias medições durante o dia, sendo denominados de monitores
contínuos. As desvantagens são a necessidade de trocar o sensor, periodicamente e
problemas com biocompatibilidade. O futuro desta técnica é desenvolver um sistema
que meça a glicemia e, em função desse valor, entre com a injeção de insulina, ou
outro medicamento.
Ainda, de acordo Mendosa (2007), quando a amostra precisa ser extraída da
pele é necessária uma pequena abertura nesta. Essa pequena abertura é feita por:
(1) processo de sucção, (2) reação química, (3) laser, (4) agulha muito fina ou (5)
pulsos elétricos. Os locais do corpo para a extração são variados, o antebraço é um
exemplo. A amostra pode ser analisada em dispositivos portáteis ou por um sensor
aderido no local, para monitoração contínua. De forma geral, os resultados obtidos
com os métodos semi-invasivos são bons. Porém, em certos métodos é necessária
uma calibração diária, principalmente para os níveis baixos de glicose onde a
incerteza é maior.
Os métodos não invasivos, além de propriedades do sangue, utilizam para
medir a glicose: fluído intersticial, suor, saliva, lágrimas e líquidos oculares. Alguns
34
dos locais que podem ser explorados são: lábio, olho, antebraço, cutícula, orelha. As
técnicas em desenvolvimento são classificadas como métodos óticos de medição
(PICA, 2002).
Conforme Pica (2002), nos métodos ópticos, um feixe de luz com
características específicas é direcionado para alguma parte do corpo, que o penetra,
atingindo uma área de interesse. O espectro da luz refletida é função da espessura,
cor e estrutura da pele, do sangue, gordura e de todos os elementos que a luz
atravessa. O nível de glicose pode ser estimado analisando as mudanças do sinal
de luz, que, dependendo da técnica, pode modificar o comprimento de onda, o
estado da polarização, a refração, a intensidade e outras características do espectro.
A conversão para valores de glicemia é feita por análise de regressão multivariável,
levando em conta a concentração da amostra, condições fisiológicas e outros fatores
específicos de cada método.
Existem várias pesquisas propondo diferentes técnicas para a medição da
glicemia, dos resultados disponíveis é observado que, para cada método, existe uma
correlação significativa, entre a glicemia e os parâmetros analisados, em
experimentos bem controlados, contudo, muitos problemas precisam ser resolvidos
(DINGARI et al.,2011).
Teste oral de tolerância à glicose (TOTG-75g) é um teste em que o paciente
recebe uma carga de 75 g de glicose, em jejum, e a glicemia é medida antes e 120
minutos após a ingestão; pessoas cuja glicemia de jejum situa-se entre 110 e 125
mg/dL, considerada glicemia de jejum alterada, por apresentarem alta probabilidade
de ter diabetes, podem requerer avaliação por TOTG-75g em duas horas. Mesmo
quando a glicemia de jejum for normal (< 100 mg/dL), pacientes com alto risco para
diabetes ou doença cardiovascular devem realizar avaliação por TOTG (BRASIL,
2006).
Formada por glicosilação não enzimática (glicação) de hemoglobina (Hb)
exposta ao sangue com glicose, portanto, tem uma forte correlação com as
concentrações de glicose no sangue, sendo a espectroscopia Raman um método
alternativo para detecção da hemoglobina glicada (HbA1c1), este método é capaz de
distinguir amostras de Hb e HbA1c1, quantificar a precisão da previsão e dos analitos
em amostras com mistura dos dois componentes (Hb e HbA1c em diferentes
proporções) e investigar a reprodutibilidade das medições em amostras resultantes
da mistura (Hb e HgbA1c1), conforme Tabela 3 (BARMAN et al, 2012).
35
O teste da hemoglobina glicada fornece um índice das concentrações
médias de glicose sanguínea no período de dois ou três meses precedentes. Ficou
demonstrado que o controle glicêmico adequado está associado com a prevenção
ou com o retardo na evolução das complicações microvasculares no diabetes
(KNUDSON; WEINSTOCK; HENRY, 2001).
Tabela 3: Glicemia média estimada conforme valor da HbA1c.
HbA1c (%)
GME (mg/dL)
5
97
6
126
7
154
8
183
9
212
10
240
11
269
12
298
Fonte: http://professional.diabetes.orq/glucosecalculator.
A maioria dos procedimentos para determinação da glicose utiliza métodos
enzimáticos, os quais fornecem especificidade e podem ser usados em testes no
local de atendimento. Três sistemas enzimáticos são atualmente empregados para
quantificar a glicose: glicose desidrogenase, glicose oxidase e hexoquinase. Essas
reações geram uma corrente elétrica que é proporcional à concentração inicial da
glicose ou um produto que, quantificado por espectrofotometria, é proporcional à
concentração inicial de glicose. Interessa a esta pesquisa o sistema de hexoquinase.
O ensaio do sistema hexoquinase é o método de referência, geralmente
aceito para determinar a glicose. A reação é ilustrada a seguir na Figura 3. A
concentração da glicose é proporcional à taxa de produção de NAD(P)H, que é
acompanhada por espectrofotometria. Dependendo da fonte de glicose-6-fosfato
desidrogenase, a enzima pode requerer especificidade para NADP ou para o NAD.
Amostras hemolisadas podem ser problemáticas uma vez que os conteúdos
liberados dos eritrócitos podem interferir na relação estequiométrica entre o acúmulo
de glicose e NAD(P)H (KNUDSON; WEINSTOCK; HENRY, 2001).
36
Glicose+MgATP → (Hexoquinase) →
Glicose-6-fosfato (G6P) + MgADP
G6P+NA(P)+→(glicose-6-fosfato desidrogenase)→
6-fosfogliconolactona + NAD(P)H+H+
Figura 3: Equação da Hexoquinase.
Fonte: Knudson, Weinstock e Henry (2008)
2.3. Lipídios
Lipídios são substâncias orgânicas insolúveis em água, porém, solúveis em
solventes apolares. Estão presentes em todos os tecidos e apresentam grande
importância em vários aspectos da vida. Atuam como hormônios ou precursores
hormonais, combustível metabólico, componentes estruturais e funcionais das
biomembranas, isolantes que permitem a condução nervosa e previnem a perda de
calor. Os lipídios principais no plasma humano são o colesterol, ésteres de
colesterol, triglicérides, fosfolipídios e os ácidos graxos não esterificados e todos
podem acumular nas células (KUMAR et al., 2010; NATIONAL CHOLESTEROL
EDUCATION PROGRAM, 2002).
De acordo Martinez et al. (2008), as concentrações dos lipídios plasmáticos
são índices estáticos do metabolismo lipoprotéico utilizados no estudo do risco
cardiovascular. O conhecimento dos fatores que determinam os níveis lipídicos no
sangue
é
fundamental
para
a
compreensão
da
fisiopatologia
das
hiperlipoproteínemias. Estes fatores incluem processos anabólicos como a absorção
e síntese, junto a processos catabólicos como a mobilização, degradação e
excreção.
2.3.1. Lipoproteínas plasmáticas
Lipoproteínas são partículas esféricas que transportam lipídios apolares em seu
núcleo. Estes complexos são constituídos por quantidades variáveis de colesterol e
seus ésteres, triglicérides, fosfolipídios e proteínas (apoproteínas) sendo solúveis no
plasma devido à natureza hidrofílica da parte proteica. A classificação das
37
lipoproteínas está fundamentada nas propriedades físico-químicas de cada grupo,
que diferem entre si na composição lipídica e proteica (NATIONAL CHOLESTEROL
EDUCATION PROGRAM, 2002).
De acordo com Bachorik et al. (2001) existem quatro classes importantes de
lipoproteínas (quilomícrons, lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL),
lipoproteínas de baixa densidade (LDL), lipoproteínas de alta densidade (HDL) e
várias lipoproteínas quantitativamente menores, as chamadas lipoproteínas de
densidade intermediária (IDL).
Conforme Sposito et al., (2007), as lipoproteínas plasmáticas em humanos
normais são os Quilomícrons, partículas grandes, produzidas pelo intestino, muito
ricas (85 a 95%) em triacilgliceróis, principal forma de transporte dos triglicérides
exógeno até os tecidos.
A interação entre quilomícrons e lipase resulta em uma partícula menor, com
menor conteúdo de triacilgliceróis e de alguns elementos da superfície, que é
denominada remanescente do quilomícron (BACHORIK et al., 2001).
As lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL) são menores do que os
quilomícrons, e também são ricas em triacilgliceróis, embora em menor grau.
Transportam triglicérides de origem endógena desde o fígado e, em menor
quantidade, do intestino delgado para os tecidos. O colesterol e os fosfolipídios
perfazem aproximadamente 40% da partícula, e aproximadamente 10% da massa é
proteína, principalmente a apoB-100 e a apoC, e também alguma apoE. O tamanho
das partículas das lipoproteínas VLDL influem na variação simultânea da
composição química; isto é, quanto maiores as partículas mais ricas em
triacilgliceróis e em apoC, e quanto menores as partículas, menor quantidade
apresentam desses dois componentes (BACHORIK et al., 2001).
As partículas menores com menor conteúdo de triacilgliceróis e de material
de superfície resultam da hidrólise de VLDL pela lipoproteína lipase e são
denominadas remanescentes de VLDL e IDL (BACHORIK et al., 2001).
As lipoproteínas de baixa densidade (LDL) compõem aproximadamente 50%
da massa de lipoproteínas totais no plasma humano. O colesterol, em grande parte
esterificado, contribui com cerca de metade da massa das LDL. Aproximadamente,
25% da massa da LDL é constituída de proteína, principalmente a apoB-100, com
quantidades traço de ApoC.
38
Subfrações discretas de LDL foram identificadas e diferenciam ligeiramente
em tamanho e composição química. As menores espécies de LDL contêm menores
quantidades de colesterol éster, resultando em menor razão colesterol apoB nessas
partículas do que nas espécies maiores de LDL. “Quantidades aumentadas de
partículas menores foram encontradas em pacientes com várias formas comuns de
dislipoproteinemias, associadas com coronariopatias” (BACHORIK et al., 2001).
As lipoproteínas de alta densidade (HDL), que atuam na captação do
colesterol ao nível celular, e conduzindo-os até o fígado onde é catabolizado e
eliminado. A Tabela 4 mostra a composição, propriedades e composição das
lipoproteínas humanas.
Tabela 4: Classificação, propriedades e composição das lipoproteínas humanas.
Parâmetro
Quilomícron
VLDL
LDL
HDL
<0,93
0,93 – 1.006
1.006 – 1.063
1.063 – 1,21
>70
25 – 70
19,6 – 22,7
4 – 10
Origem
Pré-β
Β
Α
Colesterol livre
2
5–8
13
6
Colesterol esterificado
5
11-14
39
13
Fosfolipídios
7
20-23
17
28
Triglicérides
84
44 – 60
11
3
Proteínas
2
4 – 11
20
50
A-I
7,4
Traços
-
67
A-II
4,2
Traços
-
22
B-100
Traços
36,9
98
Traços
B-48
22,5
Traços
-
-
66
49,9
Traços
5-11
E-II, E-III, E-IV
-
13
Traços
1-2
D
-
-
-
Traços
Intestino
Intestino,
fígado
Intravascular
Intestino,
fígado
Densidade (g/ml)
Diâmetro (nm)
Mobilidade eletroforética
Composição (% do peso)
Apolipoproteínas (% do total)
CI, C-II, C-III
Local da síntese
Fonte: Santos (2001).
39
A função fisiológica dessas partículas e a relação das baixas concentrações
de partículas contendo apoA-I e as doenças cardiovasculares são alvos de interesse
atual, e as determinações laboratoriais, eventualmente se mostram úteis na clínica
(BACHORIK et al., 2001).
2.3.2. Apolipoproteínas
Galoro, Mendes e Burattini (2009), afirmam que os componentes proteicos das
lipoproteínas, as apolipoproteínas, são uma família complexa de polipeptídios que
promovem e controlam o transporte dos lipídios no plasma e sua captação pelos
tecidos. A estrutura das partículas lipoproteicas é geralmente formada por um núcleo
hidrofóbico de ésteres de colesterol e triglicérides. A camada externa hidrófila é
constituída por compostos polares tais como, proteínas solúveis, porção hidrófila dos
fosfolipídios e colesterol livre com seu grupo hidroxila direcionado para a periferia do
complexo.
Conforme os autores as apolipoproteínas são divididas em vários grupos,
cujos membros mais importantes estão descritos na Tabela 5.
Tabela 5: Descrição das principais apolipoproteínas.
APOLIPOPROTEÍNAS
DESCRIÇÃO
ApoA
Sintetizada no fígado e intestino, está inicialmente presente nos
quilomícrons na linfa, mas é rapidamente transferida para as HDL.
ApoB
Está presente no plasma em duas formas: apo B100 e apoB48. A
apoB100 é o componente proteico das LDL e está também
presente nos quilomícrons e VLDL. A apoB48 é somente
encontrada nos quilomícrons. A apoB100 é reconhecida por
receptores específicos nos tecidos periféricos.
ApoC
Esta família de três proteínas (apoC-I, apoC-II e apoC-III) é
sintetizada no fígado e incorporada pelas HDL.
ApoE
Sintetizada no fígado, incorporada ao HDL e transferida, na
circulação, para os quilomícrons e VLDL. É, provavelmente, a
principal apolipoproteína envolvida na captação hepática dos
quilomícrons remanescentes; liga-se aos receptores apoB nos
tecidos.
Apo(a)
Está presente em quantidades e quimoleculares a apoB100 nas
lipoproteínas A, Lp (a). Tem elevado conteúdo de carboidratos e
uma sequência de aminoácidos similar ao plasminogênio.
Fonte: Galoro, Mendes e Burattini (2009)
40
2.4. Dislipidemia: principais tipos, diagnóstico e implicações clínicas.
A dislipidemia é definida como um distúrbio que altera os níveis séricos dos lipídios
(gorduras). Essas alterações do perfil lipídico podem incluir colesterol total alto,
triglicérides (TG) alto, colesterol de lipoproteína de alta densidade baixo (HDL-c) e
níveis elevados de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-c). Em
consequência, a dislipidemia é considerada como um dos principais determinantes
da ocorrência de doenças cardiovasculares (DCV) e cerebrovasculares, dentre elas
aterosclerose que é o espessamento e perda da elasticidade das paredes das
artérias (ANVISA, 2011).
Libby (2002) descreve a formação da placa ateromatosa, como uma cascata
de eventos, conforme exposta abaixo:
1. Partículas de LDL acumulam-se na parede dos vasos e sofrem alterações
químicas estimulando as células endoteliais a produzir moléculas adesivas
as quais capturam monócitos e células T da corrente sanguínea e as atraem
para a íntima;
2. Nesta os monócitos transformam-se em macrófagos ativos e junto com as
células produzem mediadores inflamatórios inclusive citosinas e fatores que
promovem a divisão celular. Os macrófagos também produzem outros
receptores que os ajudam a ingerir as LDL modificadas;
3. Ingeridas as LDL os macrófagos ficam repletos de gotículas gordurosas e
tomam o aspecto de célula espumosa. Nasce à estria gordurosa, primeira
manifestação da placa ateromatosa, e
4. A partir de então fenômenos inflamatórios levam à progressão do processo
aterosclerótico com acúmulo de macrófagos no núcleo lipídico e a replicação
das células musculares lisas. A interação de linfócitos T e células
musculares lisas pode levar a intensa resposta proliferativa, com síntese de
enzimas hidrolíticas, citosinas e fatores de crescimento, como também
grande quantidade de tecido conjuntivo-fibroso produzido pelas células
musculares lisas, as quais se mantêm em constante proliferação e migração,
formando a capa fibrosa responsável por recobrir o núcleo lipídico da agora
lesão avançada ou complicada.
41
A maioria das técnicas para detecção e tratamento das placas vulneráveis é
voltada para a placa com risco de ruptura. Esse tipo de placa tem sido chamado de
“fibroateroma de capa fina” (KOLODGIE et al., 2001).
2.4.1. Classificação laboratorial ou bioquímica
De acordo com o tipo de mudança dos níveis séricos de lipídios, a dislipidemia é
classificada como:
•
Hipercolesterolemiaisolada: elevação isolada do colesterol total (CT), em
geral representada por LDL-c (≥ 160 mg/dL);
•
Hipertrigliceridemiaisolada: elevação isolada dos triglicérides (TG) (≥150
mg/dL), em geral representada por aumento das VLDL, ou dos quilomícrons,
ou de ambos;
•
Hiperlipidemiamista: valores aumentados do Colesterol Total e Triglicérides.
•
HDL-C Baixo: diminuição isolada (homens <40 mg/dL e mulheres <50
mg/dL), ou em associação com aumento de LDL-c e/ou de TG.
O colesterol é um esteroide com um grupo hidroxílico secundário na posição
C3, sintetizado em muitos tipos de tecido, mas, sobretudo no fígado e na parede
intestinal. Cerca de três quartos do colesterol é formado por síntese e um quarto tem
origem na dieta alimentar (GREILING; GRESSNER, 1995).
Esta é a classificação utilizada quando se refere às alterações lipídicas.
Os valores de referência para avaliação dos níveis de lipídios na circulação
sanguínea estão descritos na Tabela 6.
42
Tabela 6: Valores de Referência.
Valores de Referência (adultos até 20 anos)*
Baixo
(mg/dL)
Desejável
Limítrofe
(mg/dl)
Alto (mg/dL)
Muito
Alto
(mg/dL)
Colesterol
Total
<200
200 – 239
≥240
-
LDL-C
100 – 129
130 – 159
160 – 189
≥190
-
≥ 60
-
VLDL
<30
30 – 67
>67
Triglicérides
<150
150 – 200
200 – 499
Homens: <40
HDL-C
Mulheres: <50
≥500
Fonte: Adaptado de Sposito et al. (2007); Sociedade Brasileira de Cardiologia (2009)
* Os valores de referência ou metas terapêuticas dependem além da idade, do sexo e da presença de
outras patologias, tais como: hipertensão arterial, aterosclerose, síndrome metabólica e diabetes
mellitus.
A ANVISA (2011) destaca que os níveis de lipídios na corrente sanguínea
estão relacionados ao hábito de praticar exercícios, de ingerir bebidas alcoólicas,
carboidratos e gorduras. Soma-se a isto o índice de massa corpórea e idade
influenciam as taxas de gordura sérica. Para auxiliar no controle da dislipidemia
indica-se a atividade física aeróbica regular, como corrida, caminhada.
2.4.2. Classificação etiológica
Rader, Cohen e Hobbs (2003), classificam as dislipidemias primárias de origem
genética, com ou sem causa aparente, como genotipicamente em monogênicas e
poligênicas.
Aproximadamente
50%
da
variação
interindividual
dos
níveis
plasmáticos de LDL-c é atribuída a variações genéticas.
Dentre as monogênicas, Martinez et al. (2008) ressaltam a importância da
hipercolesterolemia familiar, dislipidemias secundárias causadas por outras doenças
ou uso de medicamentos: hipotireoidismo, diabetes mellitus (DM), síndrome
nefrótica, insuficiência renal crônica, obesidade, alcoolismo, icterícia obstrutiva, uso
de doses altas de diuréticos, betabloqueadores, corticosteróides, anabolizantes.
43
2.4.3. Avaliação laboratorial das dislipidemias
De acordo com Pimazoni Netto et al. (2009), o exame laboratorial é uma ferramenta
de auxílio ao raciocínio clínico e para a definição da conduta terapêutica,
constituindo-se em indicador sensível e objetivo do estado de saúde do paciente.
Sendo assim, o resultado de um exame laboratorial é uma informação complementar
que ajuda na definição do diagnóstico de 60 a 70% das decisões médicas,
principalmente, quando este não pode ser esclarecido somente com os dados de
histórica clínica e exame físico (FORSMAN, 1996).
A análise do colesterol foi relatada por Liebermann em 1885, tendo
seguidamente sido reportada por Burchard em 1889. Na reação de LiebermannBurchard, o colesterol forma um corante azul-esverdeado proveniente de hidratos de
carbono poliméricos não-saturados num meio de ácido acético/anidrido acético/ácido
sulfúrico concentrado. O método de Abell e Kendall é específico para o colesterol,
porém, é tecnicamente complexo e exige o uso de reagentes corrosivos (ABELL et
al., 1958). Em 1974, Roeschlau e Allain descreveram o primeiro método, totalmente
enzimático que baseia-se na determinação da ∆4-colesterona após clivagem
enzimática do éster de colesterol pela colesterol esterase, conversão do colesterol
pela colesterol oxidase, subsequente determinação do peróxido de hidrogênio
formado, utilizando a reação de Trinder. A otimização da clivagem dos ésteres
(>99.5%) permite a padronização com padrões primários e secundários e uma
comparação direta com os métodos de referência CDC e NIST (TRINDER, 1969).
O teste é realizado por meio do método colorimétrico enzimático – em que
os ésteres de colesterol são clivados através da ação da colesterolesterease e
produzem colesterol livre e ácidos graxos. O colesterol oxidase catalisa a oxidação
do colesterol para colest-4-en-3-ona e peróxido de hidrogênio. Em presença da
peroxidase, o peróxido de hidrogênio formado afeta o acoplamento oxidativo do
fenol e da 4-aminoantipirina, formando um corante vermelho de quinona-imina. A
intensidade da cor do corante é diretamente proporcional à concentração de
colesterol e é determinada medindo o aumento da absorvância a 512 nm (PISANI et
al.,1995;WHO/DIL/LAB/99, 2002).
Segundo Sposito et al. (2007), o perfil lipídico é definido pelas
determinações do colesterol total (CT), HDL colesterol (HDL-c), TG e, quando
possível, do LDL-c após jejum de 12 a 14 horas, utilizando-se a fórmula indireta de
44
determinação da LDL-c, a Fórmula de Friedewald: LDL-C = CT – HDL-C – TG/5,
(válida se TG <400mg/dL). O CT é normalmente determinado com o somatório LDLc + HDL-c + VLDL (SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2009).
Alguns laboratórios já utilizam a mensuração direta da LDL-c no plasma.
Recomenda-se que o perfil lipídico deva ser realizado em indivíduos com um estado
metabólico estável, ou seja, com dieta habitual e o peso corpóreo mantidos por, pelo
menos, duas semanas antes da realização do exame. Deve-se levar em
consideração, que após qualquer doença ou cirurgia em geral, o perfil lipídico do
paciente poderá estar temporariamente comprometido. Neste caso, recomenda-se,
aguardar mais de oito semanas para a determinação dos lipídios sanguíneos
(NATIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM, 2002).
Martinez et al. (2008) relatam que algumas orientações devem ser seguidas
antes da avaliação, tais como, nenhum exercício físico vigoroso deve ser realizado
nas 24 horas que antecedem o exame, bem como se recomenda evitar a ingestão
de álcool nas 72 horas que antecedem o exame. As dosagens seriadas devem ser
realizadas sempre que possível no mesmo laboratório, para minimizar o efeito da
variabilidade analítica, relacionadas à metodologia e aos procedimentos utilizados
pelos laboratórios, e as pré-analíticas, relacionadas a fatores individuais como: estilo
de vida, medicações, doenças associadas, procedimentos de coleta e preparo da
amostra.
2.4.4. Classificação das dislipidemias
Sposito et al.(2007) classificam as dislipidemias segundo a sua etiologia (primária e
secundária) e sob o ponto de vista laboratorial ou bioquímico, conforme descrito
abaixo:
Os mesmos autores relatam que no Consenso Brasileiro sobre Dislipidemias
da Sociedade Brasileira de Cardiologia, publicado em 2007, foram propostas fases
ou passos na estratificação do risco cardiovascular.
Ao deparar com alterações lipídicas, utiliza-se a classificação laboratorial
(elevação CT, TG, mista ou TG +CT, diminuição HDL-c), e avalia da seguinte forma,
como recomendado pela Diretriz de Dislipidemia, conforme apresentado na Tabela
7.
45
Tabela 7: Fases para o tratamento das dislipidemias.
Fase 1
Identificação de manifestações clínicas da doença aterosclerótica
ou DM. Estes indivíduos possuem risco > 20% em 10 anos de
eventos de DAC (principalmente DAC ou AVC), ou alto risco.
Fase 2
Utiliza-se o Escore de risco de Framingham. Determinando com
esta fase o risco baixo (menor que 10%) e risco alto (maior que
20%), e risco intermediário (entre 10% e 20%). Para os indivíduos
com risco intermediários detectados pela fase 2, utiliza-se a Fase
3.
Fase 3
Faz-se uso de fatores agravantes, entre eles: histórico familiar
precoce, síndrome metabólica, microalbunirúria, hipertrofia ao
eletrocardiograma ou ecocardiograma, creatinina >1,5, PCR >
3mg/dl, escore de cálcio > percentil 75 para idade, que servem
para reclassificar. Segue então para o tratamento e a Fase 4.
Fase 4
Mudança de estilo de vida (MEV), dieta, exercício físico,
medicação: uso contínuo e ininterrupto de estatina para alterações
do LDL-c, e fibrato para do TG principalmente.
Fonte: Sociedade Brasileira de Cardiologia (2009)
2.4.4.1. Avaliação de placas ateroscleróticas através da espectroscopia Raman
Os fatores de risco cardíaco (sedentarismo, obesidade, stress, dislipidemia,
diabetes, tabagismo) não predizem como a doença poderá se comportar. A
progressão da aterosclerose é dependente da quantidade e tipo de lipídios que se
acumulam na parede das artérias, portanto, a análise precisa das lipoproteínas é um
fator de extrema relevância, para prevenção da doença arterial coronariana (DAC)
(VAN DE POLL, 2001).
Atualmente tem havido interesse crescente do uso da espectroscopia laser
para identificação e quantificação da placa ateromatosa, o que justifica a sua
utilização na identificação das lipoproteínas humanas. A espectroscopia Raman,
uma técnica de excelência para realizar a análise bioquímica sem remoção de tecido
pode
dar
essa
informação,
proporcionando
conhecimento
quantitativo
da
composição molecular e a avaliação não destrutiva das amostras (SILVEIRA et al.,
2002). Pelo método Raman é possível quantificar proteínas, colesterol, gordura
adventícia, e cristais de cálcio nas artérias. A análise macroscópica e microscópica
pelo método Raman tem grande potencial para os estudos bioquímicos e pode
fornecer informações sobre a estrutura, concentração e interação bioquímica das
46
moléculas em seus respectivos microambientes sem extração do tecido,
homogeneização, marcas, etiquetas ou uso de agentes de contraste (BUSCHMAN
et al., 2001).
A Figura 4 apresenta como exemplo um espectro Raman normalizado obtido
do colesterol indicando as principais bandas das ligações entre os elementos
moleculares que o identificam, e a molécula de colesterol (área pontilhada).
Figura 4: Exemplo de espectro Raman no infravermelho-próximo do colesterol indicando as curvas
(bandas) das ligações entre os elementos moleculares.
Fonte: Adaptado de Hanlon et al. (2000)
2.5. Espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman é um processo de análise por meio do espalhamento
inelástico. Foi observado, experimentalmente, pelo físico indiano Chandrasekhara
Ventaka Raman, em 1928, em parceria com K. S. Krishnan. Em 1930, Raman
recebeu o prêmio Nobel de física pela descoberta que levou o seu nome (RAMAN;
KRISHMAN, 1928), mas a obra fundamental referente à teoria do espalhamento
Raman foi publicada em 1934, de autoria de Placzek, citado por Schrader (1995).
47
.
Figura 5: O físico C. V. Raman.
Fonte: http://lakshyafoundation.org.in/special-issue/nsd/biography.htm.
De acordo Benício (2006), a análise do espectro da radiação espalhada
inelasticamente possibilita a determinação dos níveis de energia de átomos ou
moléculas. O efeito do espalhamento inelástico, descoberto por Raman, permitiu a
obtenção de valiosas informações relativas à estrutura molecular de um composto
pela análise não destrutível dessa estrutura. Desde a sua descoberta o efeito
despertou o interesse de pesquisadores que procuravam explicar o seu mecanismo.
Na década de 1940, os químicos já utilizavam a espectroscopia Raman para
obter informações relativas à simetria molecular e às ligações químicas. A partir da
década de 1960, os lasers comerciais foram associados aos espectrômetros Raman
comerciais utilizando detectores multicanais que, em seguida, evoluíram para
detectores de CCD desenvolvidos para a espectroscopia Raman (BENÍCIO, 2006).
Dessas descobertas até os tempos atuais a evolução na aquisição de
espectros foi favorecida por vários outros equipamentos e procedimentos, como:
fonte de excitação laser; filtros ópticos de alta precisão; e espectrógrafos sensíveis
(BENÍCIO, 2006). Atualmente, o espectro Raman é obtido em laboratório a partir da
luz monocromática de um laser que incide sobre uma amostra a ser analisada. A luz
espalhada, dispersa por uma rede de difração no espectrômetro e no detector, em
seguida converte a intensidade da luz em sinais elétricos que são interpretados por
um software de computador integrado ao sistema de detecção. Uma sequência de
filtros instalada na entrada do espectrômetro é utilizada para rejeitar comprimentos
de onda não desejados (RIBEIRO, 2011).
48
2.5.1. Espalhamento Raman
Conforme Ribeiro (2011), o espalhamento Raman acontece quando fótons se
chocam com moléculas de uma amostra que pode ser de gás, líquido ou sólido. De
modo simplificado, pode-se dizer que a molécula é um conjunto de átomos ligados
uns aos outros por forças de origem elétrica. O feixe de luz interage com o obstáculo
dispersando-se em diversas direções, conforme Figura 6.
Figura 6: Esquema representativo da trajetória de um feixe de luz interagindo com um obstáculo.
Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Reflex%C3%A3o_(f%C3%ADsica).
Esse espalhamento da luz é classificado como elástico quando os feixes não
alteram o seu comprimento de onda durante as colisões. A primeira teoria referente
ao espalhamento da luz foi proposta por Rayleigh, em 1871, e por isso recebeu seu
nome. Ele aplicou a teoria eletromagnética clássica para explicar o fenômeno do
espalhamento de luz por moléculas de gases, demonstrando que as partículas
dispersas em um meio qualquer atuam como fontes de luz (BENÍCIO, 2006).
O espalhamento inelástico ocorre quando, ao contrário do espalhamento
elástico em que os feixes não alteram o seu comprimento de onda durante as
colisões, o feixe, após a colisão com alguma partícula, sofre uma alteração no seu
comprimento de onda, pois parte da energia do fóton é transferida para a molécula
da partícula atingida. Ocorre, então, uma transferência de energia do fóton do feixe
de luz emitido para a molécula da partícula que estava na trajetória do feixe.
O físico Chandrasekhara Ventaka Raman demonstrou que uma fração
menor da luz espalhada apresentava alteração em seu comprimento de onda
quando comparada ao seu fóton inicial. Essa alteração foi detectada por meio do
deslocamento de frequência que resultou em fótons de menor ou maior energia,
(BENÍCIO, 2006).
49
A
B
Figura 7: O espalhamento (a) elástico e (b) inelástico.
Fonte: http://www.seara.ufc.br/especiais/fisica/raman/raman.htm.
O espalhamento Raman pode decorrer de dois processos diferentes:
emissão de componentes Stokes e anti-Stokes. Na emissão da componente antiStokes o fóton emitido tem uma energia maior do que aquela da radiação incidente,
isto é, o fóton tem um comprimento de onda menor do que o comprimento de onda
do fóton incidente. Os estudos utilizam, na maioria das vezes, o espalhamento na
região Stokes porque existe uma probabilidade de se encontrar um número maior de
moléculas no estado vibracional fundamental, determinando que a energia na região
Stokes seja mais intensa (RIBEIRO, 2011).
A Figura 8 ilustra o esquema representativo da interação da radiação óptica
com o tecido biológico.
Figura 8: Esquema representativo da interação da radiação óptica com o tecido biológico.
Fonte: http://biomedicaltopics.net/.
Com a utilização de laser este método tem sido testado em amostras de
sangue, humor aquoso e fluído intersticial. O reflexo do laser é analisado quanto ao
espalhamento da luz. Possui a vantagem de não ser influenciado pela água,
50
entretanto muitos outros problemas existem: erros devido a substâncias químicas na
amostra e instabilidade espectral do laser (PICA, 2002).
2.5.2. Definição de uma banda no espectro
Um espectro que consiste de intensidades versus energia do fóton é expresso em
nm, Hz, eV ou cm-1. Este se constitui de um conjunto de picos derivados de aspectos
fundamentais, relacionados aos modos vibracionais normais de uma molécula
(SAADE, 2008; WITKOWSKI, 2005). Estes picos surgem combinados e sobrepostos
formando as bandas de um espectro. Três parâmetros caracterizam uma banda ou
pico, são eles:
•
A posição do máximo do pico (λmax);
•
A intensidade do pico:
(i) o máximo, Imax;
(ii) a intensidade integrada
•
A largura do pico medida à meia altura (FWHM).
A posição do pico λmax é o parâmetro mais significativo, pois fornece
informações acerca do tipo de vibração. O deslocamento desta frequência informa
as mudanças estruturais ocorridas em uma molécula (WITKOWSKI, 2005).
A intensidade de um pico Imax informa o número de grupos moleculares
vibrando com determinada frequência. A intensidade integrada (Iint) apresenta um
sentido físico maior visto que reflete a probabilidade de ocorrer a transição entre os
níveis.
A largura do pico a meia altura (FWHM) depende de duas implicações: a
primeira relacionada às condições do instrumental usado, tais como: a largura da
fenda de um espectrômetro, rede de difração, qualidade espectral do feixe de
excitação, entre outros. A segunda refere-se às condições intrínsecas da molécula,
por exemplo, número e natureza das interações físicas com a vizinhança (SAADE,
2008; WITKOWSKI, 2005).
A primeira pode, eventualmente, ser eliminada, levando-se em conta a
largura do pico considerado. Já a segunda depende, entre outras coisas, da
proximidade dos outros sistemas moleculares.
51
Segundo esses autores a largura de um nível energético aumenta – ou seja,
a banda se alarga – com o aumento da temperatura, como resultado das interações
de moléculas adjacentes. A molécula se torna mais complexa quando aumenta o
número de interações de outros osciladores com uma vibração específica de um
dado oscilador. É um fenômeno assíduo encontrado durante a investigação de
macromoléculas biológicas, que possuem espectros caracterizados por bandas e
picos sobrepostos (ANALYTICAL, 1991).
Um aparelho espectrômetro Raman dispersivo é constituído basicamente de
uma fonte de luz, um conjunto de lentes ópticas, filtros, um elemento dispersivo e um
sistema de detecção.
Os ótimos resultados alcançados pela espectroscopia Raman (ER) na
análise de processos biológicos é uma consequência direta dos avanços no
instrumental da técnica. O aprimoramento no desenvolvimento de filtros, detectores,
espectrômetros, fontes de luz e sistemas ópticos diminuíram o tempo de análise e
melhoraram a relação sinal-ruído (DOU et al., 1996).
2.5.3. Aplicações biomédicas da Espectroscopia Raman
A adoção da espectroscopia Raman na área de biomédica teve início no fim da
década de 1980 e início de 1990, e vem crescendo numa constante (CLARKE;
WANG; ISNER, 1987). Esta técnica se transformou em uma ferramenta significativa
na análise química da área médica e já permite, na atualidade, o desenvolvimento
de pesquisas de patologias humanas in vitro por meio da detecção de componentes
bioquímicos em sangue, urina, tecidos biológicos e fluidos corporais obtendo
diagnósticos em tempos bem mais curtos e, em alguns casos, não invasivos
(PILOTTO et al., 2001; SHAPIRO, 2007).
Algumas das mais recentes aplicações in vitro em artérias humanas são a
classificação histopatológica em artérias coronarianas, identificação de cálcio em
valvas cardíacas e estudo de aterosclerose (OTERO et al., 2004; ROCHA et al.,
2007; SILVEIRA JR et al., 2002).
A pesquisa desenvolvida por Saade (2008) propôs um método para análise
de soro sanguíneo humano com hepatite C, empregando a Espectroscopia Raman
(ER) dispersiva no Infravermelho. Os resultados estatísticos obtidos por meio do
PCA apresentaram detalhes a respeito de que as informações espectrais são
52
relevantes para diferenciação dos fluidos e a distância de Mahalanobis mostrou ser
muito eficiente na discriminação entre os dois tipos de soro humano, saudável e com
hepatite C. A especificidade calculada para o soro saudável foi de aproximadamente
88% e a sensibilidade para o sangue com hepatite C foi aproximadamente 92%.
A pesquisa revelou-se, particularmente, interessante para esta patologia no
que se refere ao índice de sensibilidade ser maior que o de especificidade, o que
implica em uma menor probabilidade de um falso negativo do que na de um falso
positivo no diagnóstico, ou seja, existe um risco menor ao paciente diagnosticado,
visto que a hepatite C pode ser bastante agressiva na destruição dos hepatócitos e
outras células do fígado gerando sequelas para o paciente.
O soro humano é constituído da seguinte classe de lipídios: triglicérides,
fosfolipídios e ésteres de colesterol. Porém, essas bandas são bastante sobrepostas
para permitir uma clara distinção e a concentração desses componentes está
geralmente, em uma faixa de 0,03-0,3% no soro humano normal, o que é
significativamente baixo para permitir uma detecção dessas bandas. Por isso, fazer
uma separação inicial nas amostras possibilita uma maximização do sinal e permite,
em alguns casos, a detecção dessas estruturas (STUART; ANDO, 1997). Na
pesquisa realizada por Saade (2008), as amostras de sangue não foram submetidas
a nenhum processo de tratamento ou separação prévia, o que explica a ausência de
algumas bandas no espectro do soro saudável. No caso das amostras com hepatite
C, as enzimas e outras estruturas presentes no soro por causa da doença, têm suas
concentrações bastante aumentadas por causa do processo de destruição das
células do fígado, o que poderia justificar a existência de espectro com bandas mais
intensas (NISHIKAWA et al., 1994).
A espectroscopia Raman foi utilizada como ferramenta de diagnóstico em
uma pesquisa para análise do líquido sinovial de pacientes com osteoartrite. Ficou
evidente que a intensidade da banda Raman aumentou significativamente nos
espectros coletados a partir do líquido sinovial de pacientes com comprovação
radiológica de osteoartrite, o que torna a ER forte candidata para avaliação de lesão
articular em pacientes com osteoartrite no joelho.
Estudos recentes têm demonstrado que os métodos espectroscópicos para
análise de urina apresentam muitas vantagens sobre os métodos químicos, entre
eles: o contato; amostra menor, porém com maior quantidade de informações, sendo
que a urina tem sido objeto de diversos estudos espectroscópicos. Amostras de
53
urina como alternativa pode ser obtida com mais facilidade e em maior quantidade
do que o sangue. Um exame de urina fornece informações de diagnóstico sobre
doenças metabólicas (diabetes), infecções do trato urinário e outras doenças
(McMURDY; BERGER, 2003).
A
Espectroscopia
Raman
Dispersiva
e
Surface-Enhanced
Raman
Spectroscopy (SERS) foi adotada para analisar os componentes presentes na urina
humana. De acordo com os dados apresentados os dois métodos usados foram
adequados para investigar os compostos nitrogenados totais presentes na urina,
creatinina e a taxa de excreção (ureia/creatinina) (PREMASIRI; CLARKE; WOMBLE,
2001).
O uso da técnica da Espectroscopia Raman vem sendo aplicado com
sucesso nas mais variadas áreas biomédicas, pois o material biológico pode ser
analisado em curto espaço de tempo, a coleta do sinal Raman é bastante rápida e,
ainda, é possível analisar amostras líquidas ou sólidas em tempo real (SILVEIRA JR
et al., 2002).
A Espectroscopia Raman tem grande potencial para fornecer informação de
diagnóstico quantitativo in vivo. A principal vantagem da aplicação dessa técnica na
biomedicina é que por meio do ajuste da frequência de excitação, próximo da
absorção de frequência, os marcadores bioquímicos da doença podem analisados
de forma seletiva no espectro Raman (HANLON et al., 2000).
54
3. MATERIAL E MÉTODO
Esta pesquisa foi realizada segundo princípios éticos e normas regulamentadoras de
pesquisa envolvendo seres humanos, de acordo com a resolução nº 196/96 do
Conselho Nacional de Saúde, tendo sido aprovada pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Camilo Castelo Branco, nº 315.993 em 25/06/2013, CAAE
nº: 16464913.4.0000.5494.
3.1. Amostras de Soro Humano
As amostras de soro humano foram obtidas de pacientes que buscaram o serviço do
Laboratório de Análises Clínicas Oswaldo Cruz (São José dos Campos, SP, Brasil),
para realização de exames laboratoriais de rotina, após a avaliação clínica
laboratorial, não sendo constatada nenhuma doença infecciosa (contaminação
sanguínea por HIV, Sífilis, Hepatite B e C). Foram analisadas amostras de soro de
44 pacientes com diferentes concentrações, sendo realizados os exames
bioquímicos anteriormente e doado pelo laboratório, conforme está descrito na
Tabela 8.
Tabela 8: Concentração dos componentes sanguíneos através da análise bioquímica.
.
COLESTEROL TRIGLICÉRIDES
GLICOSE
LDL
HDL
PROTOCOLO
TOTAL (CT)
(TG)
(mg/dL)
(mg/dL)
(mg/dL)
(mg/dL)
(mg/dL)
02-020793
145
297
1162
114
31
00-078177
93
252
375
138
39
02-020811
80
112
44
74
29
00-078227
95
230
455
117
29
52-000663
169
287
396
157
50
00-078121
91
284
281
177
50
00-078151
89
289
142
202
58
00-078170
80
150
79
56
78
00-078176
101
294
140
209
57
00-078204
93
120
142
54
37
00-078219
257
201
74
149
37
00-078238
88
304
269
189
64
02-020847
87
206
317
90
52
(continua)
55
(continuação)
PROTOCOLO
GLICOSE
(mg/dL)
COLESTEROL
TOTAL (CT)
(mg/dL)
TRIGLICÉRIDES
(TG)
(mg/dL)
LDL
(mg/dL)
HDL
(mg/dL)
00-078179
77
282
163
159
90
50-007418
147
141
186
70
33
00-80204
114
204
284
113
34
00-80385
120
312
881
132
31
00-80407
77
273
298
113
100
00-80417
97
274
198
207
27
02-21440
101
223
260
141
30
02-21475
95
189
342
83
38
50-07734
101
178
212
92
44
00-79935
84
227
239
125
54
00-80030
77
187
99
56
111
00-80206
91
251
174
171
45
00-80378
87
185
171
110
41
00-80384
85
184
172
116
34
00-80390
91
228
59
151
65
00-80411
88
242
84
172
53
00-80427
100
234
88
167
49
00-079332
88
271
221
NR
47
00-082086
95
250
318
NR
36
00-082638
131
137
232
NR
22
00-082731
328
270
99
NR
56
00-082759
142
363
606
231
31
00-082870
78
334
180
NR
101
00-082990
79
206
99
NR
103
00-083148
81
266
206
NR
138
02-022085
132
NR
NR
NR
NR
02-022105
122
165
340
NR
31
02-022113
259
236
689
88
33
02-022117
137
NR
418
109
NR
02-022154
101
277
460
NR
32
02-022195
78
243
205
NR
95
*Os valores destacados em vermelho correspondem às amostras alteradas
56
Após a avaliação bioquímica, as amostras de soro foram acondicionadas em
tubos Eppendorf de 200 mL, mantidas refrigeradas em uma caixa térmica (5ºC) e
submetidas à espectroscopia Raman. A dosagem bioquímica das concentrações de
glicose, triglicérides e HDL foi obtida através do analisador COBAS 6000
(Roche/Hitachi, Indianápolis, EUA), enquanto que as concentrações de colesterol
foram obtidas através do analisador COBAS INTEGRA 400 Plus e COBAS
INTEGRA 800 (Roche/Hitachi, Indianápolis, EUA). O LDL é calculado pela equação
de Friedewald (LDL = colesterol total - HDL - triglicérides/5). O LDL pode ser
mensurado
diretamente
no
plasma
em
pacientes
com
hipertrigliceridemia
(triglicérides > 400 mg/dL), dada a imprecisão da equação para estes casos.
3.2. Espectroscopia Raman
Os experimentos de coleta do espectro Raman das amostras de soro foram
realizados em sala com temperatura controlada, ajustada em 24ºC. As amostras de
soro foram colocadas em porta amostra de alumínio contendo orifícios de 100 µL,
sendo, em seguida, submetida ao espectrômetro Raman. A potência laser de
excitação, na extremidade da ponteira do Raman, foi de aproximadamente 250 mW.
Para a coleta dos dados espectrais foi utilizado um sistema de
Espectroscopia Raman portátil dispersivo no infravermelho próximo (sistema Raman
Dimension P-1, Lambda Solutions, Inc. MA, EUA), equipado com laser diodo
emitindo em 830 nm e potência de saída máxima de 350 mW. A radiação gerada por
esse sistema é acoplada e guiada por um cabo de fibras ópticas (Raman probe) até
o porta-amostra. O deslocamento Raman gerado pela amostra é coletado pelo
mesmo cabo, via fibras periféricas, e guiado até o espectrômetro. O sinal coletado
foi medido por uma câmera CCD, que converteu o sinal óptico em sinal elétrico para
posterior processamento. O processamento do sinal foi realizado em um computador
do tipo PC através do software Matlab, versão 6.0 a aquisição do sinal foi
configurada para realizar 10 acumulações com 5 segundos para cada amostra.
A calibração espectral (correlação deslocamento Raman para pixel e
correção da resposta espectral do espectrógrafo) foi realizada automaticamente pelo
software que faz as coletas de espectros do sistema Raman portátil. A fluorescência
de background foi removida após a coleta dos espectros (off-line) com um filtro de
função polinomial de ordem 7, essa função polinomial gera uma linha de base no
57
espectro, linha de base está que é subtraída ao espectro bruto. Os espectros
calibrados foram delimitados em uma faixa de 400 a 1800 cm-¹, através de uma
rotina desenvolvida no Matlab (Figura 5).
Figura 9: Esquerda: Diagrama esquemático do espectrômetro Raman acoplado a um cabo de fibra
óptica. Direita: Configuração do instrumento real de micro-Raman.
Fonte: Bispo (2012)
Foram obtidas três medições espectrais em cada amostra, com um total de
132 espectros para as 44 amostras. Os espectros foram separados em grupos de
acordo com as concentrações normais ou alterados dos elementos bioquímicos do
soro, conforme Tabela 9: glicose, colesterol total, triglicérides, LDL e HDL. Destacase que uma amostra possuía a determinação da concentração de mais de um
elemento bioquímico, portanto o total de amostras em cada grupo com
concentrações bioquímicas normais e alteradas é apresentado na Tabela 10. A partir
desta diferenciação normal/alterado, foram calculadas as médias dos espectros para
os elementos bioquímicos, visando determinar as bandas Raman que podem ser
usadas para diferenciar os grupos normal e alterado para cada bioquímico.
58
Tabela 9: Os valores de referência estabelecidos para glicose e lipídios no soro sanguíneo humano,
de acordo com o American Heart Association (Stone et al., 2013).
COMPONENTES
SANGUÍNEOS
VALORES DE REFERÊNCIA (mg/dL)
70 (minimum)
Glicose
99 (maximum)
Colesterol Total
<200
Triglicerídeos
<160
LDL
<160
HDL
>40
Tabela 10: Número de amostras e faixa de valores de concentrações nos grupos normais e
alterados.
Componente
Sanguíneo
Número de amostras com
concentrações normais
(faixa de concentração mg/dL)
Número de amostras
com concentrações
alteradas (faixa de
concentração - mg/dL)
Total de
Amostras
Glicose
26 [77 - 97]
18 [100 - 328]
44
Colesterol Total
11 [112 - 189]
31 [201 - 363]
42
Triglicérides
12 [44 - 142]
31 [163 - 1162]
43
LDL
24 [54 - 159]
09 [167 - 231]
33
HDL
23 [41 - 138]
19 [22 - 39]
42
Em seguida os dados obtidos a partir da Espectroscopia Raman foram
normalizados e submetidos à análise pelo método Partial Least Squares (PLS) de
quantificação. O método PLS vem sendo utilizado, preferencialmente aos modelos
clássicos de quantificação em análises químicas, quando aplicado a métodos
espectroscópicos. Em sistemas complexos e multivariados, tais como análise de
componentes
sanguíneos,
a
regressão
linear
univariada
clássica
torna-se
insuficiente frente à quantidade de dados que podem ser obtidos a partir de um
espectro. O PLS inclui todas as variáveis relevantes no modelo e, assim, a
calibração pode ser realizada com eficiência mesmo na presença de interferentes,
59
enquanto que os métodos de calibração univariada necessitam de amostras simples
(ex. compostos puros) para que se obtenham resultados satisfatórios (CUNHA et al.;
2003).
Dentro deste contexto, o de mínimos quadrados (ou em inglês, Partial Least
Square – PLS) é um método adotado para construir modelos preditivos quando
existem muitas variáveis independentes colineares. É importante destacar que tal
método enfatiza a predição das respostas, sem necessariamente entender a relação
entre as variáveis dependentes e independentes.
De acordo Geladi e Kowlaski (1986), o PLS é uma técnica que generaliza e
combina as características de uma Análise de Componentes Principais e um Modelo
de Regressão Múltipla. É, particularmente, útil quando é preciso prognosticar uma
série de variáveis dependentes a partir de uma grande base de dados de variáveis
independentes.
Para Saigo, Krämer e Tsuda (2008), o método PLS apresenta como principal
característica a troca de variáveis independentes originais por um subconjunto
truncado de variáveis latentes dos dados originais. Neste caso, as variáveis latentes
podem ser vistas como as projeções das variáveis independentes de entrada e são
usadas para construir o modelo de regressão relacionando a entrada à saída.
Inicialmente foi realizado um estudo preliminar (fase 1), para mensuração
das diferentes concentrações da glicose diluída em água destilada, conforme dados
apresentados na Tabela 11.
Tabela 11: Concentração de glicose diluída em água destilada - Curva de calibração.
Quantidade de
glicose (mg)
Concentração de
glicose (mgmL)
1
20
2,0
2
40
4,0
3
60
6,0
4
80
0,8
5
100
10,0
6
120
12,0
7
140
14,0
60
8
160
16,0
9
180
18,0
10
200
20,0
11
300
30,0
12
400
40,0
13
600
60,0
Foram selecionados os dois maiores picos de glicose: 518 cm-1 e 1128 cm-1.
Por meio do programa Microsoft Excel 2003 elaborou-se uma coluna de calibração
que foi inserida em todos os espectros, convertendo os pixels para cm-1. As figuras
10 e 11 mostram as intensidades dos picos Raman em 518 cm-1 e 1128 cm-1 em
função da concentração da glicose, respectivamente. Foram obtidas as seguintes
curvas de calibração: y= 34,20 x + 49,92; R² = 0,995 para o pico de 518 cm-1 e
Intensidade (u.a.)
y= 3,7,8 x + 56,31; R²= 0,994 para 1128 cm-1.
0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
Concentração de glicose (mg/mL)
-1
Figura 10: Gráfico da Intensidade do pico de 518 cm em função da concentração da glicose.
Intensidade (u.a.)
61
0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
Concentração de glicose (mgmL)
-1
Figura 11: Gráfico da Intensidade do pico de 1128 cm em função da concentração da glicose.
Os resultados mostram que a glicose pode ser mensurada em água
destilada através da espectroscopia Raman Dispersiva, como demonstrado nas
figuras acima.
62
4. RESULTADOS
4.1. Espectros Raman de soro humano
O presente estudo propôs-se a utilizar a Espectroscopia Raman como uma
ferramenta de identificação de alguns elementos bioquímicos no soro humano
(glicose, colesterol, triglicérides, HDL e LDL). Com o intuito de comparar os
resultados
obtidos
no
presente
estudo,
foram
empregadas
as
análises
convencionais que são utilizadas na prática médica como rotina. Os espectros
Raman foram obtidos através de amostras selecionadas, da mesma amostra que foi
utilizada na análise quantitativa através do método bioquímico. As figuras com os
dados dos elementos bioquímicos analisados estão a seguir.
Figura 12: Espectro médio de todas as amostras de soro humano, retiradas de amostras com
diferentes concentrações de compostos bioquímicos selecionados.
A Figura 12 apresenta o espectro médio de todas as amostras de soro
humano no intervalo espectral de 400 a 1800 cm-1. Neste espectro observam-se,
predominantemente, picos Raman relacionados a proteínas, principalmente a
albumina e globulinas (MOVASAGHI; REHMAN; REHMAN, 2007). Os picos mais
intensos podem ser atribuídos em: 1004 cm-1- fenilalanina, 1319 cm-1 - amida III e
CH3, CH2, 1343 cm-1-CH3, CH2 , 1451 cm-1 - CH3, CH2
,
e 1659 cm-1 - C=O
alongamento de amida I. (MOVASAGHI et al., 2007; ROHLEDER et al., 2005;
BERGER; ITZKAN; FELD, 1997).
63
4.2. Avaliação do Perfil Glicêmico
A Figura 13 apresenta o espectro médio das amostras com concentrações normais e
alteradas de glicose, conforme valores de referência da Tabela 9. Os picos em 507,
1065 e 1128 cm-1 podem ser atribuídos à glicose, proteínas e lipídios no soro
(BARMAN et al., 2012; BERGER; ITZKAN; FELD, 1997; DINGARI et al., 2011;
SAADE et al., 2012; SHAO et al., 2012).Nesta pesquisa foi observada uma pequena
diferença espectral entre os grupos normais e alterados, a região do pico de
1.065cm-1 foi a única com diferença estatisticamente significativa entre os dois
grupos (T-test, p< 0.05).
Figura 13: Espectros de amostras de soro com concentrações normais e alteradas de glicose.
4.3. Avaliação do Perfil Lipídico (colesterol total, triglicérides, HDL, LDL)
A Figura 14 apresenta o espectro médio das amostras com concentrações normais e
alteradas de colesterol total, conforme valores de referência apresentados na Tabela
9. As principais diferenças espectrais ocorreram nos picos em: 428, 700, 881, 1085,
1451, e 1659 cm-1 (T-test, p< 0.05), e estão relacionadas com o espectro de
colesterol puro (BERGER et al., 1999; GREMLICH; YAN, 2001; HANLON et al.,
2000; KRAFFT et al., 2005; MOVASAGHI; REHMAN; REHMAN, 2007).
64
Figura 14: Espectros de amostras de soro com concentrações normais e alteradas de colesterol.
A figura 15 apresenta o espectro médio das amostras com concentrações
normais e alteradas de triglicérides, conforme valores de referência da Tabela 9. As
principais diferenças espectrais ocorreram nos picos em: 877, 1085, 1271, 1307, e
1451 cm-1, que podem estar relacionados com os triglicérides (BUSCHMAN et al.,
2001; KOMACHI; SATO; TASHIRO, 2006; KRAFFT et al., 2005; MOVASAGHI;
REHMAN; REHMAN, 2007; VAN DE POLL et al., 2001).
Figura 15: Espectros de amostras de soro com concentrações normais e alteradas de triglicérides.
A figura 16 apresenta o espectro médio das amostras com concentrações
normais e alteradas de HDL, conforme valores de referência da Tabela 9. As
principais diferenças espectrais no espectro de HDL ocorreram nos picos
65
relacionados com lipídios e proteínas (MOVASAGHI; REHMAN; REHMAN, 2007). As
principais diferenças espectrais ocorreram nos picos em: 546, 700, 717, 962, 1004,
1085, 1128, 1320, 1342, 1406, 1555, e 1659 cm-1(T-test, p< 0.05).
Figura 16: Espectros de amostras de soro com concentrações normais e alteradas de HDL.
A Figura 17 apresenta o espectro médio das amostras com concentrações
normais e alteradas de LDL, conforme valores de referência da Tabela 9. As
principais diferenças espectrais no espectro de HDL ocorreram nos picos
relacionados com lipídios e proteínas (MOVASAGHI; REHMAN; REHMAN, 2007). As
principais diferenças espectrais ocorreram nos picos em: 546, 700, 1004, 1128, e
1659 cm-1(T-test, p < 0.05).
Figura 17: Espectros de amostras de soro com concentrações normais e alteradas de LDL.
66
4.4. Correlação dos resultados bioquímicos e Raman por meio do método PLS
de quantificação.
Como descrito anteriormente, para realizar uma análise quantitativa e comparar
efetivamente os resultados obtidos nos exames bioquímicos e os dados obtidos nos
espectros Raman, foram calculadas as médias das amostras normais e alteradas da
glicose, colesterol total, triglicérides, HDL e LDL, e em seguida realizada a
correlação dos dados normalizados através do método PLS.
A partir da análise bioquímica das amostras obtidas e processamento dos
espectros calculou-se treino e validação das amostras no soro humano, sendo que
para treino foram utilizadas 30 amostras de cada componente do soro humano e
para validação 14 de glicose, 12 de colesterol, 13 de triglicérides, 3 de LDL e 12
HDL, conforme está descrito nas Tabelas 12 e 13.
Tabela 12: Número de amostras de soro humano utilizadas para treino
Amostra
Nº
Glicose
Colesterol
Triglicérides
LDL
HDL
1
145
297
1162
114
31
2
93
252
375
138
39
3
80
112
44
74
29
4
95
230
455
117
29
5
169
287
396
157
50
6
91
284
281
177
50
7
89
289
142
202
58
8
80
150
79
56
78
9
101
294
140
209
57
10
93
120
142
54
37
11
257
201
74
149
37
12
88
304
269
189
64
13
87
206
317
90
52
14
77
282
163
159
90
15
147
141
186
70
33
16
114
204
284
113
34
17
120
312
881
132
31
18
77
273
298
113
100
continua
67
continuação
19
97
274
198
207
27
20
101
223
260
141
30
21
95
189
342
83
38
22
101
178
212
92
44
23
84
227
239
125
54
24
77
187
99
56
111
25
91
251
174
171
45
26
87
185
171
110
41
27
85
184
172
116
34
28
91
228
59
151
65
29
88
242
84
172
53
30
100
234
88
167
49
*Os valores destacados em vermelho correspondem às amostras alteradas.
Tabela 13: Número de amostras de soro humano utilizadas para validação
Amostra
Nº
Glicose
Colesterol
Triglicérides
LDL
HDL
1
88
271
281
NR
47
2
95
250
318
NR
36
3
131
137
232
NR
22
4
328
270
99
NR
56
5
142
363
606
231
31
6
78
334
180
NR
101
7
79
206
99
NR
103
8
81
266
206
NR
138
9
132
NR
NR
NR
NR
10
122
165
340
NR
31
11
259
236
689
88
33
12
137
NR
418
109
NR
13
101
277
460
NR
32
14
78
243
205
NR
95
*Os valores destacados em vermelho correspondem às amostras alteradas.
Os parâmetros estatísticos dos modelos PLS de quantificação obtidos para
treino e validação das amostras do soro sanguíneo humano (lipídios e glicose)
podem ser observados nas figuras a seguir, que apresentam os espectros Raman
68
normalizados obtidos de Triglicérides (TG), Colesterol Total (CT), Lipoproteína de
alta densidade (HDL), Lipoproteína de baixa densidade (LDL) e Glicose.
Figura 18: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo modelo PLS para
amostras de triglicérides/treino.
Figura 19: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo modelo PLS
para amostras de triglicérides/validação.
A partir da análise dos espectros Raman obtidos do soro humano, as
principais alterações referentes aos Triglicérides foram determinadas em 854, 892,
1160, 1180, 1211, 1322, 1453 e 1534 cm-1. Em seguida, foi feita a correlação entre a
concentração dos picos Raman normais e alterados da glicose e a concentração
69
determinada através método bioquímico, conforme valores descritos na Tabela 13 e
Tabela 14, por meio do método PLS para quantificação, utilizando duas variáveis.
De acordo com os dados apresentados na figura 18 e na figura 19, o valor de r²
referente à correlação do treino foi de 0,7815 e valor de r² referente à correlação da
validação foi 0,8269. De acordo com os dados apresentados nas figuras, há uma
boa correlação entre as duas técnicas.
Figura 20: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo modelo PLS para
amostras de colesterol/treino.
Figura 21: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo modelo PLS para
amostras de colesterol/validação.
A partir da análise dos espectros Raman, obtidos do soro humano pode-se
observar que as principais alterações referentes ao colesterol total foram
70
determinadas em 892, 1160, 1180, 1322, 1453 e 1534 cm-1. Em seguida, foi feita a
correlação entre a concentração dos picos Raman normais e alterados do colesterol
total e a concentração determinada através do método bioquímico, conforme valores
descritos na Tabela 13 e Tabela 14, por meio do método PLS para quantificação,
utilizando três variáveis. De acordo com os dados apresentados na figura 20 e na
figura 21, o valor de r² referente a correlação do treino foi de 0,7788 e valor de r²
referente a correlação da validação foi 0,7843. De acordo com os dados
apresentados nas figuras, há uma boa correlação entre as duas técnicas.
Figura 22: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo modelo PLS para
amostras de HDL/treino.
Figura 23: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo modelo PLS para
amostras de HDL/validação.
71
A partir da análise dos espectros Raman obtidos do soro humano pode-se
observar que as principais alterações referentes ao HDL foram determinadas em
1160, 1567 e 1661 cm-1. Em seguida, foi feita uma correlação entre a concentração
dos picos Raman normais e alterados do HDL e a concentração determinada
através do método bioquímico, conforme valores descritos na Tabela 13 e Tabela
14, por meio do método PLS para quantificação, utilizando seis variáveis. De acordo
com os dados apresentados nas figuras 22 e 23, o valor de r² referente à correlação
do treino foi de 0,3307 e valor de r² referente a correlação da validação foi 0,9624.
Figura 24: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo modelo PLS para
amostras de LDL/treino.
Figura 25: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo modelo PLS para
amostras de LDL/validação.
72
A partir da análise dos espectros Raman obtidos do soro humano pode-se
observar que as principais alterações referentes ao LDL foram determinadas em
1160, 1453 e 1530 cm-1. Em seguida, foi feita a correlação dos resultados entre a
concentração dos picos Raman normais e alterados da LDL e a concentração
determinada através do método bioquímico, conforme valores descritos na Tabela
13 e Tabela 14, por meio do método PLS para quantificação, utilizando uma variável.
De acordo com os dados apresentados nas figuras 24 e 25, o valor de r² referente à
correlação do treino foi de 0,0377 e valor de r² referente a correlação da validação
foi 0,8821.
Figura 26: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo modelo PLS para
amostras de glicose/treino.
Figura 27: Gráfico da concentração real versus concentração prevista pelo modelo PLS para
amostras de HDL/validação.
73
A partir da análise dos espectros Raman, obtidos do soro humano, pode-se
observar que as principais alterações referentes à glicose foram determinadas em
1180, 1568 e 1660 cm-1. Em seguida, foi feita uma correlação entre a concentração
dos picos Raman normais e alterados da glicose e a concentração determinada do
método bioquímico, conforme valores descritos na Tabela 13 e Tabela 14, por meio
do método PLS para quantificação, utilizando seis variáveis. De acordo com os
dados apresentados nas figuras 26 e 27, o valor de r² referente à correlação do
treino foi de 0,3563 e valor de r² referente à correlação da validação foi de 0,9535.
Com base nos dados apresentados nas figuras acima, calculou-se a
concentração dos valores dos elementos bioquímicos para treino e validação das
amostras de soro humano por meio do modelo PLS de quantificação, conforme
apresentado na Tabela 14.
Tabela 14: Concentração dos elementos bioquímicos para validação e treino das amostras de soro
humano por meio do modelo PLS de quantificação.
COMPONENTES
SANGUÍNEOS
Treino (mg/dL)
Validação (mg/dL)
Triglicérides
87
62
Colesterol Total
34
23
HDL
29
5.9
LDL
51
43
Glicose
39
11
São apresentados a seguir dados representativos do desempenho nos
analisadores utilizados pelo laboratório para o método de análise bioquímico.
A precisão para HDL foi determinada utilizando amostras humanas e
controles em protocolo interno com repetibilidade (n = 21) e precisão intermédia (3
alíquotas por série, 1 série por dia, 10 dias), com os seguintes resultados:
74
Tabela 15: Dados representativos do desempenho do analisador utilizado pelo laboratório para o
método de analise bioquímica do HDL.
Repetibilidade
Média mmol/L (mg/dL)
Desvio Padrão mmol/L (mg/dL)
Soro humano 1
0,85 (32,9)
0,013 (0,503)
Soro humano 2
2,46 (95,1)
0,021 (0,812)
Precisão Intermédia
Média mmol/L (mg/dL)
Desvio Padrão mmol/L (mg/dL)
Soro humano 3
0,51 (19,7)
0,013 (0,491)
Soro humano 4
2,09 (80,8)
0,016 (0,615)
Fonte: Roche Diagnostics, HDL (2013).
A precisão para colesterol foi determinada utilizando amostras humanas e
controles em protocolo interno com repetibilidade (n = 21) e precisão intermédia (1
alíquota por série, 1 série por dia, 21 dias), com os seguintes resultados:
Tabela 16: Dados representativos do desempenho do analisador utilizado pelo laboratório para o
método de analise bioquímica do colesterol.
Repetibilidade
Média mmol/L (mg/dL)
Nível 1
2,74 (106)
Nível 2
6,20 (240)
Precisão Intermédia
Média mmol/L (mg/dL)
Nível 1
2,61 (101)
Nível 2
5,96 (230)
Fonte: Roche Diagnostics, Colesterol (2013).
A precisão para triglicérides foi determinada utilizando amostras humanas e
controles em protocolo interno com repetibilidade (n = 21) e precisão intermédia (3
alíquotas por série, 1 série por dia, 21 dias). Foram obtidos os seguintes resultados:
75
Tabela 17: Dados representativos do desempenho do analisador utilizado pelo laboratório para o
método de analise bioquímica do triglicérides.
Repetibilidade
Média mmol/L (mg/dL)
Desvio Padrão mmol/L (mg/dL)
Soro humano 1
1,67 (148)
0,02 (2)
Soro humano 2
2,72 (241)
0,02 (2)
Precisão Intermédia
Média mmol/L (mg/dL)
Desvio Padrão mmol/L (mg/dL)
Soro humano 3
1,18 (104)
0,02 (2)
Soro humano 4
2,95 (261)
0,05 (4)
Fonte: Roche Diagnostics, Triglycerides (2013).
A precisão para LDL foi determinada utilizando amostras humanas e
controles em protocolo interno com repetibilidade (n = 21) e precisão intermédia (3
alíquotas por série, 1 série por dia, 10 dias). Foram obtidos os seguintes resultados:
Tabela 18: Dados representativos do desempenho do analisador utilizado pelo laboratório para o
método de analise bioquímica do LDL.
Repetibilidade
Média mmol/L (mg/dL)
Desvio Padrão mmol/L (mg/dL)
Soro humano 1
1,97 (76,2)
0,04 (1,5)
Soro humano 2
7,90 (305)
0,07 (3) continua
Precisão Intermédia
Média mmol/L (mg/dL)
Desvio Padrão mmol/L (mg/dL)
Soro humano 3
1,81 (70,0)
0,06 (2,3)
Soro humano 4
7,65 (296)
0,12 (5)
Fonte: Roche Diagnostics, LDL (2014).
76
A precisão para glicose no soro/plasma foi determinada utilizando amostras
humanas e controles em protocolo interno com repetibilidade (n = 84) e precisão
intermédia (2 alíquotas por série, 2 séries por dia, 21 dias). Foram obtidos os
seguintes resultados:
Tabela 19: Dados representativos do desempenho do analisador utilizado pelo laboratório para o
método de analise bioquímica da glicose.
Repetibilidade
Média mmol/L (mg/dL)
Desvio Padrão mmol/L (mg/dL)
Soro humano 1
3,57 (64,3)
0,03 (0,5)
Soro humano 2
6,65 (120)
0,05 (1)
Soro humano 3
36,9 (665)
0,3 (5)
Precisão Intermédia
Média µmol/L (mg/dL)
Desvio Padrão µmol/L (mg/dL)
Soro humano 1
3,57 (64,3)
0,05 (0,8)
Soro humano 2
6,65 (120)
0,09 (2)
Soro humano 3
36,9 (665)
0,5 (9)
Fonte: Roche Diagnostics, Glucose (2014).
77
5. DISCUSSÃO
Dislipidemia é definida como um distúrbio que altera os níveis séricos de lipídios. As
mudanças no perfil dos lipídios incluem, mas não se limitam, a alterações nos níveis
de colesterol total (CT), triglicérides (TRG), lipoproteína de alta densidade (HDL) e a
lipoproteína de baixa densidade (LDL), componentes que foram avaliados neste
estudo. Como resultado, a dislipidemia é considerada como um dos principais
determinantes da ocorrência da síndrome metabólica, associada a fatores de risco
inter-relacionados de origem metabólica, que promove o desenvolvimento de DM
tipo 2, doença cardiovascular aterosclerótica, acidente vascular cerebral, bem como
o diagnóstico e controle preciso garante a manutenção de níveis seguros destes
compostos no sangue, de acordo com as diretrizes da American Heart Association
(AHA) (GRUNDY et al., 2005; STONE et al., 2013).
O Diabetes Mellitus combinado com a hipertensão arterial e dislipidemias
são responsáveis pela primeira causa de mortalidade, hospitalização e amputações
de membros inferiores e, no Brasil, representam diagnóstico primário em 62,1% dos
pacientes com insuficiência renal crônica, submetidos à diálise (BRASIL, 2006). Isto
leva à suposição de que o diagnóstico precoce no nível primário de atenção básica
de saúde é um fator preponderante na prevenção dessas morbidades.
A grande maioria das doenças é causada por alterações bioquímicas nas
células e / ou tecidos. Algumas doenças refletem em mudanças na bioquímica de
fluidos corporais selecionados, tais como alterações metabólicas no soro sanguíneo.
Neste contexto, a Espectroscopia Raman está emergindo como um poderoso
método para o diagnóstico médico, uma vez que estas alterações químicas podem
ser detectadas por espectroscopia óptica com análise rápida, não-destrutiva,
desempenho de baixo custo e sem necessidade de qualquer pré-tratamento da
amostra, a qual representa grande avanço em relação às técnicas convencionais
(HANLON et al., 2000).
Hanlon et al. (2000) descreveram a relevância da técnica de Raman para a
análise de material biológico de interesse clínico. Sendo que o espectro Raman é
composto por bandas nítidas com características distintas, específicas para cada
molécula, uma substância pode ser facilmente distinguida das outras. A
espectroscopia Raman é uma das técnicas ópticas distintas adequadas para biodiagnóstico, pois pode ser facilmente aplicado para a análise de fluidos biológicos.
78
Saade et al. (2008) discriminaram amostras de sangue humano normal a
partir de amostras infectadas com hepatite C utilizando espectroscopia Raman no
infravermelho próximo. Dou et al. (1996) determinaram quantitativamente a
concentração de glicose a qual foi adicionada artificialmente acetona, ureia e
creatinina na urina humana, com correlações mais elevadas do que 0,90. Berger et
al. (1999), realizaram a medição de vários componentes no soro e no sangue total,
tal como o colesterol, ureia, glicose e outros, utilizando espectroscopia Raman no
infravermelho próximo, obtendo precisão significativa nas previsões. Qi e Berger
(2007) mediram concentrações de elementos bioquímicos no soro sanguíneo e em
amostras de urina, tais como colesterol, triglicérides, HDL, LDL, albumina, creatinina,
entre outros, utilizando a espectroscopia de Raman, onde encontrou uma
significativa correlação entre as amostras analisadas e as concentrações de
referência. Rohleder et al. (2005) compararam técnicas de infravermelho e
espectroscopia de Raman para quantificar a proteína total, colesterol, HDL, LDL,
triglicérides, glicose, ureia e ácido úrico no soro humano, onde as técnicas
analisadas tiveram precisões similares para a quantificação. Shao et al. (2012),
demonstraram uma correlação elevada (0,91) em análise da concentração
sanguínea da glicose feita in vivo no sangue de rato, utilizando espectroscopia
Raman e um método normal para análise de glicose. Estes estudos confirmaram a
possibilidade e viabilidade da técnica de Raman como um método não-destrutivo e
eficaz para o diagnóstico de elementos biológicos.
De acordo com os resultados apresentados neste trabalho, a espectroscopia
Raman é uma técnica muito promissora para a análise de materiais biológicos em
soro humano, com muitas vantagens, tais como a análise rápida, pouca ou nenhuma
preparação da amostra, utilização de pouco volume de amostra, detecção de uma
grande quantidade de elementos bioquímicos dentro de um único espectro, e sem
necessidade de reagentes.
Saade et al (2012) relatam que os analistas de laboratório clínico padrão
empregam uma matriz de sensores, cada um medindo um produto químico em
alíquotas separadas. Em virtude de a detecção ser executada usando enzimas e
eletrodos, a amostra não pode ser usada novamente para outras medições. No
entanto, a metodologia de FT-Raman apresentada, não precisa mais do que um
pequeno volume de biofluído tais como hidratos de carbono, para analisar uma
grande quantidade de informações dos componentes bioquímicos. Além disso, este
79
pequeno volume de biofluído carrega a informação que pode ser obtida ao mesmo
tempo com um único espectro.
Pode-se observar nos espectros Raman dos componentes analisados,
algumas regiões que tiveram alterações espectrais relevantes, nos picos
relacionados à glicose, em 507, 1065 e 1128 cm-1, que podem ser correlacionados
com os parâmetros encontrados na obra de Bispo et al. (2013), onde o pico de 1128
cm-1, na urina, foi associado a um biomarcador de diabéticos e hipertensos. Picos
intensos e relevantes de soro foram encontrados em 877, 1004, 1271, 1307, 1343,
1451 e 1659 cm-1, que podem ser relacionados com lipídios e lipoproteínas
(BARMAN et al., 2012; BERGER; ITZKAN; FELD, 1997; BERGER et al., 1999;
DINGARI et al., 2011; GREMLICH; YAN, 2001; KOMACHI; SATO; TASHIRO, 2006;
KRAFFT et al., 2005; MOVASAGHI et al., 2007; SHAO et al., 2012; SILVEIRA et al.,
2012; VAN DE POLL et al., 2001); as alterações nas concentrações de compostos
lipídicos no soro sanguíneo podem aparecer como diferenças em intensidades de
pico relativas a tais compostos, tal como demonstrado em vários estudos
quantitativos (BERGER et al., 1999; QI e BERGER, 2007; ROHLEDER et al., 2005;
SHAO et al., 2012).
Foram constatadas pequenas diferenças nos espectros de Raman dos
componentes lipídicos. Este resultado pode estar relacionado à constituição do soro
humano que é complexo; ele contém de 92 a 95% de água, as proteínas de 4 a 8%
e os péptidios, 0,4 a 0,8% de lipídios totais, sendo 0,02-0,3% de triglicérides,
colesterol de 0,12 a 0,2%, sendo de 0,05 a 0,2% de LDL e 0,03 a 0,09% de HDL,
0,1% de glicose e electrólitos, resíduos orgânicos e uma variedade de moléculas de
concentrações muito pequenas em suspensão ou dissolvidas nele (PSYCHOGIOS
et al., 2011, WEATHERBY; FERGUSON, 2004). A High Density Lipoproteins (HDL)
é uma partícula pequena, consistindo em aproximadamente 50% de proteína, 20%
de colesterol, 30% de fosfolipídios e, apenas traços de triacilgliceróis. A Low Density
Lipoproteins (LDL) constituem aproximadamente 50% da massa de lipoproteínas
totais no plasma humano. As partículas são muito menores do que as lipoproteínas
ricas em triacilgliceróis. O colesterol esterificado contribui com cerca de metade da
composição das LDL. Aproximadamente 25% da LDL é proteína. Subfrações
discretas de LDL foram identificadas e diferem ligeiramente em tamanho e
composição química (BACHORIK et al., 2001; BARMAN et al., 2012).
80
A fração de lipídios do soro, em conjunto com a glicose e o colesterol,
representa menos de 1% da composição do soro, sendo as proteínas, o composto
mais relevante (mais de 80% de soro a seco é a proteína). Assim, os picos Raman
de proteínas, principalmente a albumina, domina o espectro e a pequena
concentração de outros compostos torna-se difícil de ser observada. Mesmo com
esta pequena concentração de componentes lipídicos e glicose no soro, foram
observadas diferenças, estatisticamente significativas em alguns picos relativos a
estes compostos.
Um método para quantificação de componentes do soro sanguíneo baseado
em espectroscopia Raman pode tornar-se, num futuro próximo, uma alternativa ou
mesmo
substituir
métodos
bioquímicos
existentes
para
a
análise
rápida,
principalmente na triagem populacional, pois investir na prevenção das possíveis
complicações é decisivo não só para garantir a qualidade de vida como também
para evitar a hospitalização e os consequentes gastos, principalmente, quando se
considera o alto grau de sofisticação tecnológica da medicina moderna.
Esta pesquisa permitiu afirmar o indiscutível avanço e a contribuição que a
técnica da Espectroscopia Raman pode oferecer ao diagnóstico das alterações
glicêmicas e lipídicas, evitando, assim, várias complicações causadas por doenças
cardiovasculares. Estudos estão em andamento para desenvolver um modelo de
ensaio quantitativo destes compostos, usando essas características espectrais
Raman únicas. É de suma importância que pesquisas futuras utilizando
Espectroscopia Raman com material biológico sejam realizadas e confrontadas com
a técnica convencional já adotada para análise de glicose e lipídios.
81
6. CONCLUSÃO
Este estudo permitiu identificar que a Espectroscopia Raman dispersiva, analisando
material biológico como o soro humano, demonstrou ser uma ferramenta promissora
para análise de glicose e lipídios. Este método foi capaz de determinar os
parâmetros bioquímicos presentes no soro humano dos componentes sanguíneos
analisados, pode-se também verificar uma boa correlação de alguns elementos,
principalmente colesterol total e triglicérides, sendo possível chegar ao resultado
através do Raman.
A precisão dos testes laboratoriais atuais para os parâmetros investigados,
ainda, é um pouco melhor do que resultados espectroscópicos. No entanto, a
metodologia de Espectroscopia Raman Dispersiva apresentada, neste estudo, não
precisa mais do que um pequeno volume de soro humano para analisar uma grande
quantidade de informações dos componentes bioquímicos, que podem ser obtidas
ao mesmo tempo com um único espectro Raman.
Estudos utilizando Espectroscopia Raman para prever a concentração de
glicose têm demonstrado bons resultados de medição dentro de intervalos
clinicamente relevantes. Neste estudo, o método utilizado foi capaz de identificar os
elementos sanguíneos analisados, porém, para finalidade de diagnóstico é
necessário estabelecer faixas com valores preestabelecidos para os componentes
analisados.
82
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90
ANEXO A
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA
91
92
93
ANEXO B
CARTA DE SOLICITAÇÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO
94
95
ANEXO C
CARTA DE DOAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO