UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES JOSÉ AUGUSTO NECCHI JUNIOR DESENVOLVIMENTO DE DISPOSITIVO A VÁCUO PARA SISTEMA FECHADO DE LANGENDORFF Mogi das Cruzes, SP 2006 Livros Grátis http://www.livrosgratis.com.br Milhares de livros grátis para download. 2 UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES JOSÉ AUGUSTO NECCHI JUNIOR DESENVOLVIMENTO DE DISPOSITIVO A VÁCUO PARA SISTEMA FECHADO DE LANGENDORFF Dissertação de Mestrado apresentada à Comissão da Pós-Graduação do Mestrado em Engenharia Biomédica da Universidade de Mogi das Cruzes para obtenção do Título de Mestre em Engenharia Biomédica. Prof. Orientador: Dr. Carlos Marcelo Gurjão de Godoy Mogi das Cruzes, SP 2006 3 4 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho primeiramente à Deus, fonte de toda vida. À todos aqueles que me incentivaram e ajudaram nesta conquista, em especial, à minha mulher Lúcia Helena e aos meus pais, José Augusto e Josely. 5 AGRADECIMENTOS Ao meu orientador Professor Carlos Marcelo Gurjão de Godoy pela dedicação e críticas construtivas que muito me ajudaram. Aos colegas do laboratório, Kleber, Alessandra, Juliana. Aos colegas, que muito me ajudaram neste trabalho, Diego Basile Colugnati, Maurício Marques de Oliveira e João Viannei Effting Jr. À Fabiyane da Silva pela ajuda nas horas difíceis; e à todos os funcionários. Agradeço à todos que, de alguma forma, me apoiaram e incentivaram nesta conquista. Muito Obrigado. 6 RESUMO O objetivo do presente estudo foi desenvolver um sistema de re-circulação baseado a vácuo (SRBV) e testá-lo em uma preparação de Langendorff com e sem o coração isolado. Os testes realizados sem o coração isolado mostraram que o SRBV é capaz de re-circular até 25ml/min (para volumes maiores que 100 ml). Os testes realizados com o coração isolado na condição de circulação fechada mostraram que a freqüência cardíaca, pressão ventricular esquerda e perfusão miocárdica têm uma diminuição importante após 30 minutos do começo do experimento com um volume de perfusão de 100ml, e após 60 minutos para um volume de perfusão de 200 ml, em relação à condição de circulação aberta. Adicionalmente, um teste realizado em circulação aberta por 60 minutos, fechada por 30 minutos e novamente aberta, mostrou que os mesmos parâmetros apresentam um decréscimo importante, não tendo uma recuperação quando a circulação foi aberta. Concluiu-se que o SRBV é eficiente para preparação de Langendorff em circulação fechada. No entanto, para circulação fechada com volumes de 100 ml e 200 ml, há perda significativa dos parâmetros cardíacos após 20 e 60 minutos respectivamente. Esta condição é irreversível e pode estar relacionada a um efeito cumulativo de substâncias liberadas pelo tecido cardíaco. Palavras-chave: Langendorff, Coração Isolado, Circulação Fechada, Re-circulação 7 ABSTRACT The purpose of the present study was to develop a vacuum-based re-circulatory system (VBRS) and test it on a Langendorff preparation with or without the isolated heart. The tests performed without the isolated heart showed that VBRS is capable to re-circulate up to 25ml/min (volumes higher than 100ml). The tests performed with isolated heart in loop circulation condition showed that heart rate, left ventricular pressure and myocardial perfusion had an important decrease after 30 minutes from the beginning of the experiments to a 100ml circulation volume, and after 60 minutes to a 200ml circulation volume, in relation to the open circulation condition. Additionally, it was performed a test in open circulation for 60 minutes, followed by loop circulation for 30 minutes and again in open circulation, showing an important decrease in the same parameters, but without recuperation even after opening the circulation. We concluded that the VBRS is an efficient device for Langendorff preparation working in loop circulation. However, for loop circulation volumes of 100ml and 200ml, important cardiac parameters are worsen significantly after 20 and 60 minutes respectively. This condition is irreversible and may be related to a cumulative effect of substaces released by the cardiac tissue. Keywords: Langendorff, Isolated heart, Loop circulation, Re-circulation. 8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18 Figura 19 Figura 20 Princípio de funcionamento das bombas peristálticas (esmagamento do circuito para impelir a solução)...................................................................... Ilustração das câmaras cardíacas, válvulas e grandes vasos........................... Montagem experimental para coração isolado de sapo, desenvolvida por Carl Ludwig e Elias Cyon.............................................................................. Montagem experimental para coração-pulmão de mamífero, desenvolvida por Henry Newell Martin............................................................................... Montagem experimental para coração isolado de mamífero, desenvolvida por Oscar Langendorff................................................................................... Montagem experimental utilizada em trabalhos atuais, seguindo os princípios propostos por Langendorff em 1895............................................. Esquema da montagem experimental de Langendorff................................... Dispositivo comercial (Radnoti Simple Myocite/langendorff -Isolated Heart System) para montagem experimental de Lagendorff, que utiliza a re-circulação da solução de perfusão por meio de bomba peristáltica........... Esquema da montagem experimental para perfusão de coração isolado em circuito fechado. Câmara de vácuo (A); reservatório de perfusão (B); câmara de perfusão (C).................................................................................. Funcionamento da torneira de vias................................................................. Representação esquemática do funcionamento da válvula passiva. 11(a) Válvula aberta, permitindo o gotejamento para o reservatório B. 11(b) Válvula fechada por meio de sucção do vácuo gerado na câmara A............. Foto da montagem experimental completa..................................................... Câmara de perfusão e sistema de aquisição do eletrograma cardíaco e pressão ventricular.......................................................................................... Tempo de atividade do coração isolado na montagem experimental em cada um dos 3 grupos estudados (“aberta“, “fechada 100ml“ e “fechada 200ml“)........................................................................................................... Freqüência cardíaca média (com erro padrão) nos grupos “fechada” e “aberta 100ml”, “aberta 200ml” e no experimento “aberta-fechadaaberta”ao longo do tempo de experimento..................................................... Pressão ventricular esquerda média (com erro padrão), nos grupos “fechada” e “aberta 100ml”, “aberta 200ml” e no experimento “abertafechada-aberta”ao longo do tempo de experimento....................................... Perfusão miocárdica média (com erro padrão), nos grupos fechadaaberta”ao longo do tempo de experimento.................................................... Normalização dos valores de freqüência cardíaca, pressão ventricular e perfusão para o grupo com circulação aberta................................................. Normalização dos valores de freqüência cardíaca, pressão ventricular e perfusão para o grupo com circulação fechada (volume = 100ml)................ Normalização dos valores de freqüência cardíaca, pressão ventricular e perfusão para o grupo com circulação fechada (volume = 200ml)................ 11 13 17 18 19 21 23 24 26 29 30 31 34 37 38 39 40 41 41 42 9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS bpm Batimentos por minuto cm Centímetro CO2 Dióxido de Carbono g Grama(s) KH Krebs-Henseleit min Minuto(s) ml Mililitro(s) mmHg Milímetros de Mercúrio ºC Graus Celsius O2 Oxigênio pH Potencial hidrogeniônico rpm Rotações por minuto 10 SUMÁRIO 1 APRESENTAÇÃO............................................................................................................. 2 INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 2.1 O SISTEMA CARDIOVASCULAR.............................................................................. 2.2 O ESTUDO DA FUNÇÃO DO CORAÇÃO.................................................................. 2.3 MODELOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO IN VITRO DO CORAÇÃO............ 2.4 O ESTUDO DO CORAÇÃO ISOLADO........................................................................ 2.4.1 A Montagem Experimental de Langendorff................................................................. 2.4.2 Circulação Retrógrada.................................................................................................. 2.4.3 Circulação Aberta versus Circulação Fechada (ou Re-circulação).............................. 2.5 CUIDADOS COM A MONTAGEM.............................................................................. 2.6 OBJETIVOS.................................................................................................................... 2.6.1 Geral............................................................................................................................. 2.6.2 Específicos.................................................................................................................... 3 MÉTODOS......................................................................................................................... 3.1 PRINCÍPIO DE FUNCIONAMENTO DA MONTAGEM............................................ 3.2 MONTAGEM EXPERIMENTAL.................................................................................. 3.3 DETALHAMENTO DO FUNCIONAMENTO DA MONTAGEM 10 13 13 14 15 16 18 22 22 24 25 25 25 26 26 27 EXPERIMENTAL................................................................................................................ 3.3.1 Funcionamento da Torneira de 3 Vias.......................................................................... 3.3.2 Funcionamento da Válvula Passiva.............................................................................. 3.4 TESTES DA MONTAGEM............................................................................................ 3.4.1 Testes de Estabilidade.................................................................................................. 3.4.2 Testes do Coração in vitro na montagem..................................................................... 3.4.2.1 Solução de Perfusão.................................................................................................. 3.5 AQUISIÇÃO DE SINAIS............................................................................................... 3.6 APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS...................................................................... 4 RESULTADOS.................................................................................................................. 4.1 TESTES DE ESTABILIDADE....................................................................................... 4.2 TESTES DO CORAÇÃO IN VITRO NA MONTAGEM............................................... 5 DISCUSSÃO...................................................................................................................... 6 CONCLUSÕES.................................................................................................................. REFERÊNCIAS.................................................................................................................... 27 29 30 30 32 32 33 33 35 36 36 36 43 46 47 11 1 APRESENTAÇÃO Desde que Langendorff descreveu sua técnica de perfusão em 1895, corações isolados de mamíferos foram usados em numerosos estudos que levaram à importantes descobertas sobre fisiologia, farmacologia e cirurgia cardíaca (HILL et al., 2005). Um grande número de modelos experimentais de coração isolado tem sido proposto e modificado, sendo ainda necessárias melhorias para um modelo ideal de estudo da função do coração (AN et al., 2002). Na área de pesquisa cardiovascular, muita atenção tem sido dada ao desenvolvimento de modelos experimentais mais simples e eficientes, que sejam menos propensos às variações das respostas, mas que atendam às complexas exigências do sistema cardíaco (WIECHERT et al., 2003). A relação entre a atividade mecânica, o consumo de Oxigênio (O2) e a utilização de substratos pelo coração pode ser melhor estudada utilizando-se preparações de coração isolado, pois não há ação dos pulmões ou outros tecidos (NEELY et al., 1967) e o coração isolado não está sujeito ao controle do sistema autonômico (CHEN et al., 1987). O coração isolado perfundido é um modelo valioso e de fácil execução (WANG et al., 2002; OLIVEIRA, 2005), sendo reconhecidamente um modelo apropriado para o estudo da função cardíaca (INAMDAR et al., 1994; WIECHERT, 2003), principalmente por causa de sua simplicidade (MARTINS et al., 2000). Atualmente, o coração isolado tem sido largamente utilizado pela indústria farmacêutica como primeira linha de testes de triagem farmacológica (screening) (CURTIS, 1998). A montagem de coração isolado perfundido com solução re-circulante, ou seja, em um circuito fechado de circulação, apresenta a vantagem de necessitar de um volume menor de solução. Esta vantagem é de extrema importância nos estudos que utilizam drogas ou fármacos de alto custo. Para que o sistema de perfusão possa re-circular a solução, é necessária uma bomba de recalque que, no entanto, oferece contato com partes mecânicas móveis, ou bomba peristáltica, que promove a circulação por meio da compressão da mangueira do circuito de circulação. Estas bombas necessitam, por si só, de um determinado volume de solução para poder efetuar sua ação de bombeamento, aumentando o volume de solução efetivamente necessário para perfundir o coração (CANELAS et al., 2003). As bombas peristálticas são reconhecidamente os equipamentos mais utilizados para a circulação de soluções em sistemas fechados de perfusão. Estas necessitam de um ajuste do 12 fluxo a ser utilizado, sendo a solução impulsionada pela aplicação de movimentos peristálticos gerados pelo rotor da bomba (MATOS et al., 2001). A figura 1 ilustra o princípio de funcionamento de uma bomba peristáltica. Figura 1: Princípio de funcionamento das bombas peristálticas (esmagamento do circuito para impelir a solução). Fonte: Circulation Technology Inc, 2006. Ainda, os tubos flexíveis sofrem pressão intermitente dos roletes e, quando submetidos a longos períodos de operação, apresentam gradual queda da vazão por fadiga e deformação, bem como aumento da permeabilidade a gases. O custo destas bombas pode chegar a US$1,500 (MATOS et al., 2001). Além disso, prolongamentos no circuito e o contato com partes mecânicas móveis e fixas favorecem áreas de contaminação. Em vista das limitações técnicas impostas pelas bombas que promovem a recirculação em sistema de perfusão de coração isolado de Langendorff, nos propusemos a desenvolver um sistema de re-circulação que fosse baseado em outro princípio que não fosse o bombeamento de solução, e que viabilizasse a minimização do volume total da solução circulante. Este novo tipo de sistema de re-circulação seria especialmente importante 13 para estudos com fármacos de alto custo, permitindo ampliar a reprodutibilidade dos experimentos. A seguir, serão apresentados os aspectos teóricos relacionados a este trabalho. 14 2 INTRODUÇÃO 2.1 O SISTEMA CARDIOVASCULAR O sistema cardiocirculatório desenvolveu-se ao longo da evolução dos animais para resolver o problema de difusão de O2 e nutrientes entre o ambiente e o interior das células (SILVERTHORN, 2003). Este é um sistema fechado, que nos vertebrados deriva de um sistema ancestral comum, semelhante ao dos cefalocordados, com adição de um coração central, circulação hepática e capilares (AIRES, 1999). A função primordial do coração é agir como uma bomba contrátil, ejetando sangue e mantendo uma pressão adequada para que ocorra a circulação (HOLDEN et al., 1995). O coração de mamífero é uma estrutura complexa, sendo constituído anatomicamente por 4 câmaras, sendo 2 átrios e 2 ventrículos, constituídos por células miocárdicas contráteis. Há também um grupo de células diferenciadas, que formam um tecido especializado na gênese e condução do impulso elétrico por todo tecido cardíaco, e este é modulado por sua inervação simpática e para simpática (GUYTON e HALL, 1997; AIRES, 1999). A figura 2 ilustra a divisão das câmaras e outras estruturas cardíacas. Figura 2: Ilustração das câmaras cardíacas, válvulas e grandes vasos. Fonte: modificado de Netter (1992). 15 Mecanismos especiais do coração mantêm sua ritmicidade e transmitem potenciais de ação por toda musculatura cardíaca (GYUTON e HALL, 1997). Ou seja, juntamente com essa massa muscular contrátil existem estruturas especializadas na gênese e condução da atividade elétrica, constituídas por tecido muscular modificado (AIRES, 1999). Mesmo o coração tendo esta capacidade intrínseca de geração da sua atividade elétrica, quase todas as funções do sistema cardiovascular são reguladas ou moduladas pelo sistema nervoso autônomo, por meio da sua divisão simpática e parassimpática (TAYLOR, 1994). A ação humoral também exerce um papel importante na regulação das funções cardiovasculares, podendo causar arritmias ou alterações hemodinâmicas (KIM et al., 2004). 2.2 O ESTUDO DA FUNÇÃO DO CORAÇÃO O estudo da função do coração é complexo e vários esforços têm sido feitos para criar modelos experimentais mais simples e eficientes, que sejam menos propensos às respostas compensatórias, mas que supram o complexo contexto do funcionamento cardíaco (WIECHERT et al., 2003). Existem diversas maneiras de se realizar os estudos experimentais com o coração. Estudos clínicos são aqueles realizados com seres humanos, o que muitas vezes inviabiliza certos tipos de pesquisa, tais como induções de arritmias, testes de drogas, ou mesmo técnicas de transplante. Para tentar resolver este problema, vários modelos biológicos foram propostos: - Animal In Vivo - Animal com o tórax aberto (Open Chest) - Coração Isolado - Tecido Cardíaco Isolado - Células Cardíacas Isoladas Segundo Su e Narayanan (1992), a inter-relação dos vários fatores que controlam as funções cardíacas tornam difícil, ou quase impossível, estudos das alterações intrínsecas do coração, inclusive as relacionadas ao envelhecimento do miocárdio no organismo intacto. 16 2.3 MODELOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO IN VITRO DO CORAÇÃO Os modelos de estudo com coração in vitro, como é o caso do coração isolado perfundido, têm a vantagem de não sofrer a ação do sistema nervoso central e ação hormonal de outros sistemas (AN et al., 2002). Os modelos experimentais com corações isolados têm sido amplamente utilizados em estudos para a compreensão dos mecanismos fisiológicos do coração, compreensão de mecanismos fisiopatológicos de diversas patologias, estudos da resposta cardíaca frente à estímulos externos e estudos farmacológicos na atividade cardíaca (INAMDAR et al., 1994). Comumente, corações de pequenos mamíferos, como ratos, coelhos e cobaias, têm sido largamente utilizados em modelos de estudos de lesão miocárdica na reperfusão pósisquemia (DI-NÁPOLI et al., 1998, WANG et al., 2001). A utilização de animais como modelo experimental ainda não foi totalmente esgotada em estudos fisiológicos e patofisiológicos (WANG et al., 2002). A tabela 1 relaciona alguns estudos e preparações biológicas utilizadas com modelos animais. Tabela 1: Estudos e preparações biológicas utilizadas com animais experimentais. Estudo Preparação Animal Utilizado Autor(es) Ano Lesão Miocárdica – Farmacologia Coração Isolado Galinha McCallum et al. 1989 Fisiologia Coração Isolado Sapo Knight et al. 1989 Lesão Miocárdica – Farmacologia Coração Isolado Rato – SpragueDawley Li et al. 1996 Farmacologia Coração Isolado Rato – Wistar Rett et al. 1997 Fisiologia – Farmacologia Coração Isolado Rato –Wistar Vassallo et al. 1998 Fisiologia – Farmacologia Tecido Atrial Isolado Rato – Wistar Bassani et al. 1999 Fisiopatologia Coração Isolado Rato – Wistar De-Angelis et al. 2000 Fisiologia Coração Isolado Rato Kaneko et al. 2000 Eletrofisiologia Células Ventriculares Rato – Wistar Gomes et al. 2001 Eletrofisiologia Coração Isolado Rato – Wistar Sabo et al. 2001 17 Eletrofisiologia Tecido Atrial Isolado Rato – Wistar Godoy et al. 2002 Farmacologia Coração Isolado Rato Assis et al. 2003 Fisiologia Coração Isolado Porco Petrucci-Jr et al. 2003 Lesão Miocárdica – Farmacologia Coração Isolado Coelho – Norfolk Souza et al. 2004 Lesão miocárdica In Vivo Cão Sant’Ana-Jr et al. 2005 2.4 O ESTUDO DO CORAÇÃO ISOLADO A montagem experimental com coração isolado mais utilizada em pesquisas é a de Langendorff. O modelo clássico de Langendorff, proposto em 1895 para estudo do coração, permite medidas da função cardíaca em condições relativamente fisiológicas (WIECHERT et al., 2003), uma vez que neste modelo o coração é mantido sob pressão de perfusão constante de solução (An et al., 2002). Assim, há mais de um século, Langendorff introduziu uma técnica clássica que se tornou uma montagem convencional, tanto para o ensino, quanto para pesquisa da função cardíaca (INAMDAR et al., 1994). O desenvolvimento do coração isolado perfundido foi um processo de estudo que se arrastou por mais de 100 anos. Dificilmente qualquer outro procedimento metodológico tenha tomado tanto tempo para se aprimorar, ou tenha tido tanta riqueza de resultados para o conhecimento dos princípios sobre a função miocárdica, regulação do fluxo coronariano e metabolismo cardíaco (ZIMMER, 1998). O pioneiro nas pesquisas de órgãos isolados foi Carl Ludwig, que juntamente com outros fisiologistas, estava determinado a provar que somente as forças físicas e químicas eram responsáveis pelos processos fisiológicos. Em 1846, Ludwig e Wild, um aluno seu, conectaram a aorta de um animal morto com a artéria carótida de um animal vivo (doador), mantendo a perfusão coronária do animal receptor. Esta preparação de coração podia até ser estimulada, mas não era possível parar os batimentos e depois reanimar a função do coração (ZIMMER, 1998). O próximo passo foi realizado por Carl Ludwig e Elias Cyon, que retiraram o coração e mantiveram-no completamente isolado por um longo período de tempo. O animal utilizado foi o sapo, que tinha a vantagem de não ter circulação coronariana e ter apenas um ventrículo. Esta montagem está ilustrada na figura 3. Os problemas com a utilização de corações de 18 mamíferos já eram conhecidos desde 1846 por Wild e Ludwig. Assim, os estudos realizados até 1880 eram com coração isolado de sapo. Figura 3: Montagem experimental para coração isolado de sapo, desenvolvida por Carl Ludwig e Elias Cyon. Fonte: Adaptado de Zimmer, 1998, p. 205. Um grande progresso foi obtido por Henry Newell Martin, ao conseguir usar corações de mamíferos, com um modelo de preparação de coração-pulmão. Inicialmente, um gato ou cão anestesiado e curarizado era artificialmente ventilado, e a circulação sistêmica era excluída, exceto por uma cânula na artéria subclávia esquerda, que era conectada à um manômetro. Todo sangue ejetado pelo ventrículo esquerdo era bombeado para as coronárias. A circulação coronariana acabava no átrio direito, escoando para o ventrículo direito, e bombeado, via artéria pulmonar, para um pulmão e ser oxigenado, retornando ao coração 19 esquerdo (ZIMMER, 1998). A montagem experimental de Martin está ilustrada na figura 4. Figura 4: Montagem experimental para coração-pulmão de mamífero, desenvolvida por Henry Newell Martin. Fonte: Adaptado de Zimmer, 1998, p. 207. Dando continuidade, Oscar Langendorff foi o responsável por retirar o coração de mamíferos, perfundí-los e mantê-los vivos por várias horas. Ele, sem dúvida, fez uma grande distinção entre o seu método e o método de Martin, atraindo a atenção e mostrando toda a relevância de seu método. 2.4.1 A Montagem Experimental de Langendorff Os experimentos originais de Langendorff foram realizados, em sua maioria, em gatos, e também em coelhos e cães. Para a perfusão era utilizado sangue sem fibrinogênio, das mesmas espécies estudadas. O elemento chave daquela montagem era a cânula de perfusão, 20 que era inserida na aorta do coração, e este ficava suspenso dentro de uma câmara. A cânula estava conectada a uma garrafa que continha sangue, e era constantemente abastecida por um reservatório logo acima. Tanto a câmara onde estava o coração, quanto a garrafa de sangue, estavam imersos em água, que podia ser aquecida por um bico de Bunsen; o fluxo do coração escoava em um outro reservatório (ZIMMER, 1998). A montagem original de Langendorff está ilustrada na figura 5. Figura 5: Montagem experimental para coração isolado de mamífero, desenvolvida por Oscar Langendorff. Fonte: Adaptado de Zimmer, 1998, p. 208. Uma das primeiras e mais surpreendentes observações de Langendorff foi que o coração isolado, que na sua visão parecia estar morto ou morrendo, podia recuperar sua atividade pela reperfusão. O coração recuperava o automatismo e mantinha-se por horas. Assim, em 1895, Langengorff descreveu um modelo de coração isolado de mamífero perfundido de um modo retrógrado através da aorta por uma coluna de Ringer-lactato. Esta preparação foi o primeiro modelo para estudo direto da ação farmacológica de diferentes substâncias no coração (TROUVE e NAHAS, 1985). De acordo com Trouve e Nahas (1985), a freqüência cardíaca era a única variável que podia ser mensurada com alguma precisão. A força de contração, ou função inotrópica, e fluxo coronariano foram difíceis de serem medidos com estabilidade e precisão. Nos anos seguintes, o fluxo coronariano foi medido aproximadamente por meio de amostras do 21 gotejamento. A força de contração do miocárdio ou a pressão podiam ser medidas de três maneiras: • Transdutor de força; • Medidas da pressão de uma coluna de líquido de um balão inserido no ventrículo; • Medidas da pressão intraventricular por médias de um cateter inserido na câmara ventricular. A técnica introduzida por Langendorff envolve a canulação da aorta, o que submete o coração a uma circulação retrógrada, isto é, o líquido a ser perfundido entra pela aorta, passa pelas coronárias, átrio direito, ventrículo direito e sai pelas aberturas finais nas artérias pulmonares (INAMDAR et al., 1994). Segundo Inamdar et al. (1994), vários estudos foram feitos para analisar as vantagens e desvantagens do modelo de perfusão retrógrada de Langendorff. Estes estudos levaram às várias modificações, tais como o envolvimento de sistemas computadorizados para aquisição, armazenamento e processamento dos dados experimentais, as quais melhoram a técnica no que se refere aos ensaios eletrofisiológicos e hemodinâmicos. Atualmente, vários estudos têm sido realizados com corações isolados, utilizando a técnica descrita por Langendorff, acrescida de melhoramentos, como é o caso do trabalho realizado por Assis et al. (2003), cuja montagem experimental segue o proposto de Langendorff, e está ilustrada na figura 6. A maioria dos estudos utiliza solução de perfusão sem hemoglobina, como é o caso da solução de Krebs-Henseleit (KH), que requer uma alta tensão de O 2 e alta taxa de perfusão no fluxo coronariano. Contudo, os experimentos que utilizam a solução de perfusão de KH têm a vantagem de ter baixo custo, simplicidade e ainda evitam a formação de trombos (BENDJELID et al., 2003). Existem diversas maneiras de preparar a montagem experimental com o coração isolado. Uma maneira é anestesiar o animal por inalação de agentes anestésicos ou injeção intravenosa ou intraperitoneal de agentes; ou realizar a concussão cerebral ou decapitação (SUTHERLAND e HEARSE, 2000). 22 Figura 6: Montagem experimental utilizada em trabalhos atuais, seguindo os princípios propostos por Langendorff em 1895. Fonte: Assis et al., 2003, p. 84. Goes et al. (1993) realizaram um estudo com corações isolados para demonstrar a influência de agentes anestésicos no metabolismo celular, capaz de causar arritmias. Por outro lado, segundo Sutherland e Hearse (2000) a decapitação ou concussão causam uma maior ação das catecolaminas e outros fatores circulantes. A tabela 2 relaciona alguns estudos e os métodos de remoção do coração. Tabela 2. Métodos de sacrifício para remoção do coração do animal em alguns estudos. Caracterização do Estudo Método de sacrifício do animal Autor(es) Ano Fisiologia - Farmacologia Decapitação Schmidlin et al. 1992 Fisiologia Decapitação Su e Narayanan 1992 Fisiologia Anestesia profunda Ahmad et al. 1996 23 Fisiologia Concussão Cerebral Süzer et al. 1997 Fisiologia Anestesia Boucher et al. 1998 Fisiologia Anestesia Felaco et al. 2000 Eletrofisiologia Concussão Cerebral Godoy et al. 2002 Lesão Miocárdica – eletrofisiologia Anestesia Yamaguchi et al. 2003 Fisiologia - Farmacologia Anestesia Dobsak et al. 2003 2.4.2 Circulação Retrógrada A preparação do coração isolado, de acordo com o modelo de Langendorff, envolve a canulação da aorta, que deve ser fixada a um reservatório de perfusão contendo solução devidamente oxigenada. Esta solução é então distribuída em um sentido retrógrado pela aorta. O fluxo pode ser constante, oferecido por meio de bomba de recalque ou bomba peristáltica; ou pode ser utilizada uma coluna de perfusão (pressão hidrostática), que geralmente varia entre 60-100mmHg. Em ambos os casos a válvula aórtica é forçada a romper-se e a solução passa diretamente para o óstio coronário, perfundindo também toda a massa ventricular esquerda, e sendo drenada para o átrio direito pelo seio coronário, deixando o coração pelas aberturas das artérias pulmonares (INAMDAR et al., 1994; SUTHERLAND e HEARSE, 2000). 2.4.3 Circulação Aberta versus Circulação Fechada (ou Re-circulação) Embora exista uma grande variedade, as preparações de coração isolado são baseadas em adaptações do modelo descrito originalmente descrito por Langendorff. Este modelo pode, de maneira simplificada, ser resumido como sendo um reservatório de solução de perfusão, uma coluna de perfusão, uma câmara de perfusão, e sistemas de coleta de dados, como transdutores de pressão, força, etc. (SUTHERLAND e HEARSE, 2000). Neste modelo mais simples, a solução de perfusão é desprezada após perfundir o coração. A figura 7 ilustra um esquema da montagem de Langendorff, com circulação aberta ou não re-circulante, ou seja, a solução é desprezada após perfunfir o coração. 24 Figura 7: Esquema da montagem experimental de Langendorff. Fonte: Adaptado de Sutherland e Hearse, 2000, p.3. Normalmente, os estudos metabólicos são desenvolvidos em modelos experimentais in vitro com solução de perfusão não-recirculante para coração, o que demanda grandes volumes de solução perfundida (BENDJELID et al., 2003). Uma outra maneira de se realizar a montagem é promover uma re-circulação da solução de perfusão, ou seja, após perfundir o coração, a solução é levada para o reservatório de perfusão, para novamente perfundir o coração. Este sistema é principalmente usado quando a solução de perfusão é o próprio sangue. comercialmente. A figura 8 ilustra um sistema com re-circulação, disponível 25 Figura 8: Dispositivo comercial (Radnoti Simple Myocite/langendorff -Isolated Heart System) para montagem experimental de Lagendorff, que utiliza a re-circulação da solução de perfusão por meio de bomba peristáltica. Fonte: Adaptado de Radnoti Glass Technology, 2006. 2.5 CUIDADOS COM A MONTAGEM Em um artigo publicado em 1904, Heymans e Kochmann já descreviam a importância de se manter constantes a temperatura e a pressão de perfusão nas montagens experimentais com coração isolado de mamíferos (HEYMANS e KOCHMANN, 1904). Além disso, diversos fatores podem ser os responsáveis por uma instabilidade, ou mesmo fracasso, na execução de estudos com o coração isolado. Segundo Sutherland e Hearse (2000), os problemas mais comuns com a montagem são: 26 • Dificuldade para isolar o coração do animal (dificuldade técnica, demora e/ou lesão direta das estruturas cardíacas); • Erros no preparo da solução de perfusão; • Contaminação da montagem; • Contaminação da solução de perfusão ou seus componentes. Em vista dos problemas e dificuldades associados à contaminação da montagem e da solução de perfusão, vale lembrar que o sistema de re-circulação utilizando vácuo proposto neste trabalho é especialmente importante para estudos com drogas ou fármacos de alto custo, permitindo ampliar a reprodutibilidade e a qualidade dos experimentos. 2.6 OBJETIVOS 2.6.1 Geral Desenvolver e testar um sistema de re-circulação de solução por sucção a vácuo para uma montagem experimental de Langendorff. 2.6.2 Específicos • Minimizar o custo da montagem experimental em relação às montagens disponíveis comercialmente. • Minimizar o volume total de solução de perfusão circulante no sistema, utilizando um princípio de re-circulação diferente dos disponíveis atualmente no mercado. • Testar o desempenho da montagem experimental em experimentos com coração isolado de rato. 27 3 MÉTODOS 3.1 PRINCÍPIO DE FUNCIONAMENTO DA MONTAGEM A figura 9 ilustra a representação esquemática da montagem. A montagem experimental constitui-se de um sistema de perfusão para corações isolados (Langendorff) de rato em sistema fechado, e com circulação por meio de uma única bomba de vácuo. De maneira simplificada, a re-circulação da solução da câmara C para o reservatório B, que provê solução ao coração isolado, se dá através da câmara de vácuo A. Num primeiro momento, o vácuo gerado na câmara A suga o excesso de solução da câmara C. Num segundo momento, o vácuo da câmara A é “desligado” e a solução cai por gravidade para o reservatório B. Figura 9: Esquema da montagem experimental para perfusão de coração isolado em circuito fechado. Câmara de vácuo (A); reservatório de perfusão (B); câmara de perfusão (C). 28 3.2 MONTAGEM EXPERIMENTAL O desenvolvimento do projeto e a montagem experimental foram realizados no Laboratório de Eletrofisiologia Cardíaca (LEC) do Núcleo de Pesquisas Tecnológicas (NPT) da Universidade de Mogi das Cruzes (UMC). Na montagem experimental, os dispositivos fundamentais utilizados para constituir o sistema de re-circulação foram: - Compressor de ar (adaptado para gerar vácuo): marca MULT-HOBBY (modelo p600 Plus). A finalidade deste aparelho foi manter o nível de solução e promover a circulação da solução no sistema. - Torneira de 3 vias acoplada à um motor giratório: a torneira de 3 vias foi acoplada ao eixo de um motor giratório com 3 rotações por minuto (rpm), ficando ligado constantemente, com a finalidade de abrir a passagem de vácuo para o sistema ou permitir a entrada de ar externo no sistema, de modo intermitente. - Válvula Passiva: esta válvula foi desenvolvida no próprio laboratório, tendo como finalidade permitir a passagem da solução de uma câmara para outra. A válvula consiste de um cilindro plástico de 1,5cm de altura e 1,5cm de diâmetro. Esta válvula é conectada no final da Câmara A, e permite o gotejamento da solução desta câmara para o Reservatório B. A porção superior interna deste cilindro é revestida por um material de borracha anatomicamente moldada para encaixar uma esfera de 1,2 cm de diâmetro que fecha um orifício de entrada de ar, e permite a adequada vedação do ar. Este orifício fica na parte central da borracha de revestimento superior e tem 2 mm de diâmetro. A porção inferior do cilindro tem uma abertura de 1,0 cm de diâmetro, para permitir o gotejamento da solução, e ao mesmo tempo impedir que a esfera passe do cilindro para o reservatório B. A esfera é de material plástico, com 1,2cm de diâmetro e peso de 0,78 g. Seu funcionamento é passivo, dependendo diretamente da posição em que a torneira de 3 vias se encontra. A seguir fazemos uma descrição do funcionamento deste sistema de re-circulação. 3.3 DETALHAMENTO DO FUNCIONAMENTO DA MONTAGEM EXPERIMENTAL O funcionamento do sistema de circulação fechada proposto pode ser descrito da seguinte forma: 29 - Inicialmente, o reservatório B é preenchido com solução fisiológica de KH, com temperatura de 34ºC. Esta solução é carbogenada (95% de O2 e 5% de CO2) constantemente para manter o pH em 7,4; - O reservatório B funciona como um “cata-bolhas”, não permitindo a passagem de bolhas de ar para o coração, e servindo ainda como uma via de infusão de drogas ou coleta de solução para análises; - O reservatório B fica aberto, permitindo a passagem constante de solução para perfundir o coração na câmara C. - O coração é isolado do tórax do animal e canulado pela aorta, para ser perfundido na câmara C; - Na câmara C existe um sistema de sucção (vácuo) para manter o nível da solução constante, além de um reservatório externo que contém água aquecida por uma resistência elétrica para manter a temperatura constante; - A bomba de vácuo funciona constantemente, porém conectada a torneira de 3 vias; - A torneira de 3 vias está ligada a um motor, que a faz girar (3 rpm). Assim, existem duas situações possíveis: ora o vácuo é gerado na câmara A; ora o ar externo entra na câmara A, dependendo da posição da torneira de 3 vias; - Na primeira situação (quando o vácuo é gerado na câmara A), a válvula passiva se fecha, promovendo uma sucção no excesso de solução da câmara C; - Em seguida, ocorre a segunda situação, na qual o vácuo é fechado e o ar externo entra na câmara A. Neste momento, a válvula passiva se abre, permitindo o gotejamento da solução da câmara A para a câmara B; - Ao longo do tempo, o processo se repete constantemente, transportando o excesso de solução da câmara C para a câmara A, e permitindo a passagem da solução da câmara A para a câmara B. Deste modo, o funcionamento do sistema pode ser esquematicamente dividido em 2 momentos: 1. Entrada de solução na câmara A; 2. Saída de solução da câmara A para o reservatório B. Para a compreensão destes dois eventos, que tornam possível a re-circulação da solução utilizando apenas uma bomba de vácuo, é fundamental analisar o funcionamento das partes individuais do sistema de re-circulação desenvolvido. 30 3.3.1 Funcionamento da Torneira de 3 Vias A torneira de 3 vias fica acoplada ao eixo giratório de um motor, que fica ligado constantemente. Cada uma das 3 vias está conectada a uma parte do sistema, sendo uma via conectada à bomba de vácuo; outra via conectada a câmara A; e a outra via simplesmente aberta ao ar ambiente. A figura 10a ilustra as conexões da torneira de 3 vias. Deste modo, existem 2 situações que interferem diretamente no funcionamento do sistema: 1. Vácuo aberto e ar externo fechado. 2. Vácuo fechado e ar externo aberto. No momento em que o vácuo está aberto e o ar externo fechado, o vácuo é gerado na câmara A, promovendo o fechamento passivo da válvula, por sucção, e sugando o excesso de solução da câmara C. A figura 10b ilustra a situação em que o vácuo está aberto e a entrada de ar externo fechada. Quando o vácuo está fechado e o ar externo aberto, há entrada de ar ambiente na câmara A, abertura da válvula por gravidade, e escoamento da solução da câmara A para a câmara B. A figura 10c ilustra a situação em que o vácuo está fechado e a entrada de ar externo aberta. (a) (b) (c) Figura 10: Funcionamento da torneira de 3 vias. (a) Representação esquemática das conexões da torneira de 3 vias; (b) Vácuo aberto e ar externo fechado; (c) Vácuo fechado e ar externo aberto. 31 3.3.2 Funcionamento da Válvula Passiva Esta válvula está na base da câmara A, e permite o gotejamento da solução para o reservatório B, quando está aberta. Sua abertura ocorre quando a torneira de 3 vias fecha o vácuo e permite a entrada de ar externo na câmara A. Seu fechamento ocorre por sucção, quando o vácuo é gerado na câmara A, estando a torneira de 3 vias com vácuo aberto e a entrada de ar externo fechada. As figuras 11a e 11b ilustram o funcionamento da válvula passiva. (a) (b) Figura 11: Representação esquemática do funcionamento da válvula passiva. 11(a) Válvula aberta, permitindo o gotejamento para o reservatório B. 11(b) Válvula fechada por meio de sucção do vácuo gerado na câmara A. 3.4 TESTES DA MONTAGEM A foto da montagem experimental completa, inclusive com o sistema de captação dos sinais está ilustrada na figura 12. Foram realizados testes de bancada com a montagem sem o coração e com o coração in vitro. Estes testes tiveram o intuito de verificar a estabilidade do sistema, bem como verificar o comportamento da atividade funcional do coração na própria montagem experimental. 32 Figura 12: Foto da montagem experimental completa. Câmara de vácuo (A); reservatório de solução (B); câmara de perfusão (C); válvula passiva (1); coluna de perfusão (2); torneira de 3 vias acoplada ao motor giratório (3); eletrodos de captação de eletrograma (4); compressor de ar adaptado para gerar vácuo (5); osciloscópio (6); amplificador de sinal (7). 33 3.4.1 Testes de Estabilidade Os testes de estabilidade foram realizados sem o coração isolado para verificar a capacidade que a montagem apresentava em manter-se em funcionamento, sem que houvesse a falta de solução circulante no reservatório de perfusão (B), ou o acúmulo de solução na câmara de perfusão (C). O sistema foi considerado estável quando foi capaz de manter a solução re-circulando por um tempo de 120 min (2 horas). Assumimos este valor tendo em vista que o tempo máximo tipicamente esperado para se observar o efeito da adição (ou remoção) de um fármaco à solução de perfusão é de 40 min, o que perfaz um total de no mínimo 80 min para testar o efeito de um fármaco e sua reversibilidade. Os volumes de perfusão testados foram de 20, 50, 100 e 200 ml, e os fluxos de perfusão variaram de 5 a 25 ml/min para cada um dos volumes testados, ou seja, 5, 10, 15, 20 e 25 ml/min. A tabela 3 mostra os volumes e fluxos de perfusão testados para verificar a estabilidade da montagem, sem o coração isolado. Tabela 3. Volumes e fluxos de perfusão testados na montagem, sem o coração isolado. Volumes de perfusão (ml) Fluxos de Perfusão Testados (ml/min) 20 5 10 15 20 25 50 5 10 15 20 25 100 5 10 15 20 25 200 5 10 15 20 25 3.4.2 Testes do Coração In Vitro na Montagem Foram realizados testes experimentais utilizando o coração isolado de 14 ratos Wistar adultos machos, provenientes do biotério de animais para pesquisa da Universidade de Mogi das Cruzes. Os animais, com idade aproximada de 120 dias, peso de aproximadamente 275 g foram criados em condição de temperatura controlada a 22°C ± 2°C, ciclo de luz invertido, alimentação ad libitum, e mantidos em caixas com 4 a 5 animais. Os experimentos tinham o intuito de verificar o comportamento do coração isolado na 34 montagem, com dois volumes de perfusão diferentes, sendo 100ml e 200ml. Os animais foram sacrificados por concussão cerebral, sendo o coração imediatamente removido do tórax, transportado até a montagem em solução aquecida de KH e canulado pela aorta. Iniciou-se então a perfusão retrógrada, e a contagem do tempo do experimento. Os animais foram divididos em 3 grupos: • grupo com 5 animais, no qual a circulação foi realizada de forma aberta, ou seja, sem a re-circulação da solução de perfusão (grupo “aberta”); • grupo com 5 animais, no qual foi realizada a circulação fechada (re-circulação, com um volume total de solução de perfusão de 100ml (grupo “fechada 100ml”); • grupo com 3 animais, no qual também foi realizada a re-circulação da solução, porém o volume total de solução foi dobrado, ou seja, 200ml (grupo “fechada 200ml”). Para avaliar os efeitos da circulação fechada sobre os parâmetros avaliados, e a possível irreversibilidade destes efeitos, foi realizado experimento com um único coração, no qual a circulação aberta foi realizada por 60 min e em seguida a circulação foi fechada (volume de re-circulação de 200 ml) por 30 min e então, novamente aberta. Este experimento foi denominado “aberta-fechada-aberta”. 3.4.2.1 Solução de Perfusão Para a realização dos ensaios com o coração isolado foi utilizada solução fisiológica de Krebs-Henseleit com a seguinte composição (em mM): NaCl 126,4, KCl 4,6, KH 2PO4 1,2, MgSO4 1,2, NaHCO3 13,6, Glicose 11,11, saturada com 95% de O2 e 5% de CO2 (carbogênio), com pH 7,4 a 34º C. 3.5 PARÂMETROS AVALIADOS A partir do início da contagem do tempo de experimento foram avaliados, a cada 10 minutos, 3 parâmetros, sendo eles a freqüência cardíaca, a pressão ventricular esquerda e o fluxo. Também foi registrado o tempo total que a montagem permaneceu com o coração isolado em atividade. A freqüência cardíaca foi obtida através dos sinais da atividade elétrica cardíaca captados por 2 eletrodos (Ag/AgCl) de captação e 1 eletrodo (Ag/AgCl) de referência 35 (registro eletrográfico). Para a amplificação dos sinais foi utilizado um amplificador diferencial construído no próprio laboratório, com ganho de 10.000x, banda passante de 5 a 100 Hz e filtro Notch 60Hz. Os sinais foram observados em um osciloscópio da marca Tektronix (modelo TDS 210). A pressão gerada no ventrículo foi registrada por meio de um transdutor de pressão (Narco Bio-Systems, modelo P100B), com amplificação do sinal em 10x. O amplificador do transdutor de pressão também foi construído no próprio laboratório. O sistema de captação do eletrograma e da pressão está ilustrado na figura 13. Figura 13: Câmara de perfusão e sistema de aquisição do eletrograma cardíaco e pressão ventricular. O fluxo de perfusão do coração foi obtido pela contagem das gotas de solução de perfusão no “cata-bolhas” instalado no reservatório de perfusão (B), durante 1 minuto. O tempo de viabilidade do coração em um experimento foi obtido a partir do momento de sua canulação na montagem até o momento em que este não exibisse mais atividade mecânica. 36 3.6 APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS Os testes de estabilidade da montagem foram analisados dentro de um período de 2 horas, o qual foi arbitrariamente escolhido como sendo ideal para manutenção do coração nos experimentos. Os resultados de cada fluxo ajustado (5, 10, 15, 20 e 25 ml/min) para cada um dos volumes de perfusão (20, 50, 100 e 200 ml) foram expressos dentro deste intervalo. Caso o sistema re-circulante funcionasse inadequadamente (acúmulo ou falta de solução em um dos reservatórios) em um tempo inferior a 2 horas, este era considerado instável. Para os testes com coração isolado, montamos gráficos exibindo a freqüência cardíaca, pressão ventricular, taxa de perfusão em função do tempo de experimento e, o tempo total de experimento para cada um dos grupos estudados (aberta, fechada 100 ml, fechada 200 ml e aberta-fechada-aberta). 37 4 RESULTADOS 4.1 TESTES DE ESTABILIDADE Para um volume de perfusão de 20 ml, o sistema manteve-se estável por 2 horas com fluxos de 5, 10 e 15 ml/min. A partir de fluxos de 20ml/min o sistema perdeu sua estabilidade por apresentar ausência de solução no reservatório de perfusão (B). Para um volume de perfusão de 50ml, o sistema manteve-se estável com fluxos de 5, 10, 15 e 20 ml/min, apresentado falta de solução no reservatório de perfusão (B) para fluxos maiores que 25ml/min. Já com volumes de perfusão de 100 e 200 ml, o sistema manteve-se estável (por mais de 2 horas) com fluxos de 5 a 25 ml/min. Estes testes iniciais foram capazes de comprovar que o sistema pode manter-se estável por mais de 2 horas, com fluxo de 25ml/min para volumes de perfusão superiores a 100ml, ou mesmo volumes menores, desde que o fluxo também seja menor. A partir destes resultados, ou seja, da garantia que a montagem experimental era capaz de manter a solução circulando em um circuito fechado por mais de 2 horas, pode-se dar início aos testes experimentais com coração isolado de rato. 4.2 TESTES DO CORAÇÃO IN VITRO NA MONTAGEM Em relação ao tempo total de experimento, o grupo “aberta” permaneceu com o coração em atividade por um tempo médio de 114 min (±13,4); o grupo “fechada 100ml” permaneceu por um tempo médio de 56 min (±5,5); e o grupo ”fechada 200ml” por um tempo médio de 96,7 min (±11,5). Estes resultados estão ilustrados na figura 14. O comportamento da freqüência média cardíaca ao longo do tempo de experimento no grupo “aberta” variou de 121,5 bpm a 144,7 bpm. Neste grupo, a freqüência média cardíaca ficou entre 144,7 bpm (±32,9) no início do experimento e 142 bpm (±23,5) no final de 2 horas. 38 Tempo de atividade do coração na montagem Figura 14. Tempo de atividade do coração isolado na montagem experimental em cada um dos 3 grupos estudados (“aberta”, “fechada 100ml” e “fechada 200ml”). O grupo “fechada 100ml” apresentou uma queda acentuada da freqüência cardíaca sendo necessário interromper os experimentos antes do tempo estipulado (2 horas). Neste grupo, a freqüência média caiu de 166,4 bpm (±34,6) no início do experimento para 21,0 (± 21,0) bpm depois de 60 minutos. O grupo “fechada 200ml” também apresentou uma queda da freqüência média cardíaca, de 179,6 (±19,1) para 71,4 (±0,0) em um tempo aproximado de 96 min, sendo mais acentuada após 60 minutos de experimento. Este grupo também não atingiu o tempo estipulado de 2 horas. O experimento no qual foi realizada a circulação aberta-fechada-aberta houve uma queda menos pronunciada da freqüência cardíaca até cerca de 60 minutos, de 200 bpm para 166 bpm, e em seguida uma queda mais acentuada até o final do experimento, chegando a 39 73,2 bpm no final de 2 horas. O comportamento da freqüência média cardíaca de cada grupo está ilustrado na figura 15. Fechada 100ml Fechada 200 ml Aberta Aberta-Fechada-Aberta 220 FREQUÊNCIA CARDÍACA (bpm) 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 TEMPO DE EXPERIMENTO (minutos) Freqüência cardíaca média Figura 15. Freqüência cardíaca média (com erro padrão) nos grupos “aberta”, “fechada 100ml”, “fechada 200ml” e no experimento “aberta-fechada-aberta” ao longo do tempo de experimento. Tanto a pressão ventricular esquerda, quanto a perfusão tiveram um comportamento semelhante ao longo dos experimentos. No grupo “aberta” a pressão variou entre 30,2 mmHg (±3,2) no início e 17,2 mmHg (±6,6) no final de 2 horas. A perfusão inicial foi de 6,1 ml/min (±1,0) e 3,9 ml/min (±0,1) no final. Ambas apresentaram uma tendência de estabilização após cerca de 50 minutos. No grupo “fechada 100ml” houve uma queda acentuada da pressão e da perfusão até 60 minutos, quando o experimento foi interrompido. A pressão caiu de 21,4 mmHg (±9,5) para 4,2 mmHg (±2,1), e a perfusão caiu de 6,9 ml/min (±2,3) para 0,9 ml/min (±0,5). 40 As figuras 16 e 17 ilustram, respectivamente, o comportamento da pressão ventricular média esquerda e da perfusão média ao longo do tempo nos experimentos. No grupo “fechada 200ml” houve uma queda, menos pronunciada em relação ao grupo “fechada 100ml”, da pressão e da perfusão até cerca de 70 minutos. A pressão caiu de 29,9 mmHg (±1,1) para 22,9 mmHg (±3,6). A perfusão caiu de 6,8 ml/min (±0,9) para 3,9 ml/min (±0,8). Após 70 minutos, tanto a pressão, quanto a perfusão, tiveram uma queda acentuada até a finalização do experimento. A pressão foi de 22,9 mmHg (±3,6) para 4,9 mmHg (±0,0), e a perfusão, de 3,9 ml/min (±0,8) para 0,5 ml/min (±0,0). No experimento com circulação aberta-fechada-aberta a pressão e a perfusão tiveram uma queda até o final do experimento. A pressão inicial, de 33,6 mmHg caiu para 4,9 mmHg, e perfusão, de 6,8 ml/min para 0,8 ml/min. Fechada 100ml Fechada 200ml Aberta Aberta-Fechada-Aberta PRESSÃO VENTRICULAR (mmHg) 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 TEMPO DE EXPERIMENTO (minutos) Pressão ventricular esquerda média Figura 16. Pressão ventricular esquerda média (com erro padrão) nos grupos “aberta”, “fechada 100ml”, “fechada 200ml” e no experimento “aberta-fechada-aberta” ao longo do tempo de experimento. 41 Fechada 100ml Fechada 200ml Aberta Aberta-Fechada-Aberta PERFUSÃO (ml/min) 8 6 4 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 TEMPO DE EXPERIMENTO (minutos) Perfusão média Figura 17. Perfusão média (com erro padrão) nos grupos “aberta”, “fechada 100ml”, “fechada 200ml” e no experimento “aberta-fechada-aberta”.ao longo do tempo de experimento. Os valores obtidos também foram normalizados para que se pudesse fazer uma análise da relação entre comportamento das variáveis estudas. Assim, para cada grupo (circulação aberta, circulação fechada 100ml e circulação fechada 200ml) foi construído um gráfico normalizado, com os valores da freqüência cardíaca, pressão ventricular esquerda e perfusão, em função do tempo do experimento. As figuras 18, 19 e 20 ilustram estes valores, para cada um dos grupos, respectivamente. 42 CIRCULAÇÃO ABERTA FREQUÊNCIA-PRESSÃO-PERFUSÃO (Normalizadas em relação a t=10min) 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 FREQUÊNCIA PRESSÃO PERFUSÃO 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 120 DURAÇÃO DO EXPERIMENTO (min) Figura 18. Normalização dos valores de freqüência cardíaca, pressão ventricular e perfusão para o grupo com circulação aberta. FREQUÊNCIA-PRESSÃO-PERFUSAÕ (Normalizadas em relação a t=10min) CIRCUITO FECHADO (VOLUME=100ml) 1,0 0,8 FREQUÊNCIA PRESSÃO PERFUSÃO 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 120 DURAÇÃO DO EXPERIMENTO (min) Figura 19. Normalização dos valores de freqüência cardíaca, pressão ventricular e perfusão para o grupo com circulação fechada (volume = 100ml). 43 CIRCULAÇÃO FECHADA (VOLUME=200ml) FREQUÊNCIA-PRESSÃO-PERFUSÃO (Normalizadas em relação a t=10min) 1,4 1,2 1,0 FREQUÊNCIA PRESSÃO PERFUSÃO 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 120 DURAÇÃO DO EXPERIMENTO (min) Figura 20. Normalização dos valores de freqüência cardíaca, pressão ventricular e perfusão para o grupo com circulação fechada (volume = 200ml) 44 5 DISCUSSÃO O sistema de re-circulação a vácuo desenvolvido e testado neste trabalho foi idealizado para mitigar limitações técnicas impostas pelas bombas de circulação, para minimizar custos e para minimização do volume total da solução circulante. As montagens experimentais com coração isolado, normalmente utilizam um fluxo constante de perfusão através de bombas de infusão ou por meio de bombas peristálticas (SUTHERLAND e HEARSE, 2000). Contudo, no que se refere ao processo de re-circulação da solução de perfusão para montagem de Langendorff, ainda tem-se mantido principalmente a utilização de bombas de infusão, as quais exibem características positivas em relação à precisão na perfusão mas que, por outro lado, também exibem diversas limitações. Nestas bombas, conforme mencionado na introdução deste trabalho, a solução é impulsionada pela aplicação de movimentos peristálticos gerados pelo rotor da bomba, sofrem gradual queda de vazão por fadiga e deformação, bem como permeabilidade a gases e, adicionalmente, podem chegar a U$1,500 (MATOS et al., 2001). Além disso, prolongamentos no circuito e o contato com partes mecânicas móveis e fixas favorecem áreas de contaminação. A tabela 5 mostra alguns estudos realizados com sistema fechado de circulação de solução de perfusão, os tipos de bombas utilizados e os seus custos, em dólares. Tabela 4. Alguns estudos com coração isolado que utilizaram circulação fechada. A tabela indica o tipo de solução usada para perfusão e o dispositivo de re-circulação de solução utilizado nestes estudos e o custo destes dispositivos. Solução de Perfusão Dispositivo de Re-circulação Autor e Ano Custo do Dispositivo* (U$) KH Bomba peristáltica (505 Harvard Apparatus) Neely et al., 1967 599,00 KH Bomba peristáltica (Masterflex Cole Parmer) Truove e Nahas, 1985 380,00 Sangue Bomba peristáltica (Manostat Varistaltic Pump) Schwarse et al., 1991 395,00 Sangue Bomba peristáltica Deng et al., 1994 ≅ 320,00 Sangue Bomba peristáltica Martins et a.l, 2000 ≅ 320,00 KH (Bio-Console Medtronic Inc.) Hill et al., 2005 1.000,00 KH Dispositivo à Vácuo (compressor / torneira de 3 vias / motor giratório) Presente estudo 30,00 * Valores em dólares, cotados em junho de 2006. 45 A montagem desenvolvida neste estudo utiliza um sistema de sucção da solução de perfusão por meio de um compressor de ar adaptado para gerar vácuo. Este sistema não envolve a utilização de bombas peristálticas ou bombas de recalque e não oferece contato com partes mecânicas que sofrem esmagamento. Adicionalmente, não há até o momento na literatura relatos de sistemas que promovam a re-circulação de soluções utilizando este método. Os testes em bancada do sistema de re-circulação a vácuo desenvolvido neste trabalho mostraram que este pode manter-se estável por no mínimo 2 horas, com fluxos de até 25ml/min para volumes de perfusão superiores a 100 ml, ou mesmo volumes menores, desde que o fluxo também seja menor. Outro problema com modelos experimentais de coração isolado é o grande volume de solução de perfusão necessário, de acordo com o equipamento utilizado (SUTHERLAND e HEARSE, 2000). De acordo com Bendjelid et al (2003), as montagens de coração isolado (in vitro) que utilizam perfusão não re-circulante requerem grandes volumes de perfusão, inviabilizando alguns tipos de estudos. O volume total de solução de perfusão utilizada nas montagens com circulação aberta (sem re-circulação) depende do tempo total do experimento, podendo ultrapassar 2 litros em experimentos com mais de 2 horas. No grupo “aberta”, o volume de solução utilizada nos experimentos foi cerca 1,5 litros. Em sistemas fechados (com re-circulação), este valor é de cerca de 1 litro, como descrito por Chen (1987) e Silva (2003). Como o sistema se mostrou eficaz com volumes a partir de 100 ml, esta diferença representa uma redução de 90% no volume total re-circulante, ou 80% para um volume de 200 ml. Adicionalmente, os dados experimentais obtidos com corações isolados mostraram que, em relação ao grupo “aberta”, há uma diminuição importante da freqüência cardíaca, da pressão ventricular esquerda e da perfusão depois de 20 min do início dos experimentos para volumes re-circulantes de 100 ml e, depois de 60 min para volumes de 200 ml. Assim, os resultados indicam que experimentos que necessitam de volumes menores de solução (pelo alto custo de drogas, por exemplo), podem ser realizados neste sistema, nos primeiros 60 minutos de funcionamento, com um volume de solução de 200 ml. A diminuição dos parâmetros avaliados pode estar relacionada ao efeito cumulativo de algum substrato liberado pelo próprio coração (por exemplo, catecolaminas liberadas pelas terminações nervosas seccionadas; formação de radicais livres; etc.). Segundo Stutherland e 46 Hearse (2000), a concussão cerebral e decapitação como técnica de sacrifício causam uma maior liberação de catecolaminas e outros fatores circulantes. Em estudo realizado por Pasini et al. (1999), verificou-se que há uma liberação de lactato e creatino-fosfoquinase pelo coração isolado, mas segundo o autor, estes substratos não afetaram os parâmetros funcionais do coração isolado. Por outro lado, o volume total de solução de perfusão não foi descrito no referido trabalho. O experimento com circulação aberta-fechada-aberta, apesar de ter sido feito em um único coração isolado, sugere que o possível efeito cumulativo de substratos é irreversível, visto que após abrirmos novamente a circulação, os parâmetros continuaram a cair. Ainda em relação às limitações das montagens para Langendorff comercialmente disponíveis, deve-se levar em consideração o custo destes equipamentos. A empresa norteamericana Radnoti Glass Technology disponibiliza sua lista de preços na internet. A montagem para corações isolados (Langendorff), sem as bombas para a re-circulação custa US$ 5.182,00. O sistema completo, com as bombas, custa US$ 10.891,22, ou seja, um acréscimo de US$ 5.709,22 (valores em dólares, cotados em maio de 2006). O equipamento desenvolvido no presente estudo tem um custo total, incluindo o compressor de ar para gerar vácuo, os equipos, a torneira de 3 vias e o motor giratório, inferior a US$ 100,00. Isto representa 1% do valor de um sistema disponível comercialmente. Além disso, o sistema desenvolvido apresenta como vantagem a sua versatilidade de uso. O sistema é fácil manuseio e não utiliza mecanismos eletrônicos para seu funcionamento. Por outro lado, o gotejamento da solução na válvula passiva está exposto ao ar ambiente, o que poderia inviabilizar outros tipos de ensaios, como por exemplo, aqueles com substâncias voláteis, ou que tenham suas características alteradas pelo contato com ar ambiente. O sistema também não permite o controle do fluxo da perfusão do coração, o que poderia ser interessante em alguns tipos de estudos. 47 6 CONCLUSÕES O dispositivo proposto neste trabalho tem a vantagem de ser de baixo custo, não oferecer à solução circulante contato com partes mecânicas de compressão, como é o caso das bombas de infusão ou bombas peristálticas, podendo ser utilizada com baixos volumes de solução de perfusão, de acordo com a necessidade e o tempo do experimento. Assim, a montagem experimental proposta se mostrou eficiente para a realização de experimentos e estudos com coração isolado (Langendorff), realizando a re-circulação da solução de maneira adequada, mas sem a necessidade de altos investimentos. No entanto, novos estudos com tempos e volumes de perfusão diferentes são necessários para avaliar possíveis alterações no sistema de re-circulação, como por exemplo alterações decorrentes de alguma substância inibitória cumulativamente liberada pelo próprio tecido cardíaco (ex: acetilcolina) na solução re-circulante. Esperamos que este novo tipo de sistema de re-circulação possa ser útil para outros estudos, inclusive com fármacos de alto custo, permitindo ampliar a reprodutibilidade dos testes experimentais. 48 REFERÊNCIAS AHMAD, M.; ZEITLIN, I.J.; PARRAT, J.R.; KOLAR, F. Kinin release from normally perfused and ischaemic isolated rat hearts: effect of strain. Immunopharmacology, v. 33, p. 297-298, 1996. AIRES, M.M. 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