Extensive Association of
Functionally and Cytotopically
Related mRNAs with Puf
Family RNA-Binding Proteins in
Yeast
André P. Gerber, Daniel Herschlag, Patrick O .Brow
Plos Biology - March 2004
Introdução
Dinâmica celular: síntese e
localização das macromoléculas
Fatores de transcrição: regulam o
início da transcrição ao se ligar a
seqüências de DNA próximas aos
genes que serão regulados
E a regulação Pós -transcrição?
 RNA-binding proteins - RPBs participam
dos processos pós transcrição .
 Há centenas de RPBs em genomas de
eucariotos; mas poucos possuem o RNA
alvo identificado.
 Pumilio -Fem-3-binding factor (Puf) : RPB citoplasmática
de Saccharomyces cerevisae
 Puf: proteínas que apresentam seqüências repetitivas de
domínios Pumilio
 Saccharomyces cerevisae : 5 proteínas Puf. Puf1 a Puf5
que podem apresentar de 6 a 8 seqüências repetitivas.
Identificação de mRNAs associados com RBPs específicas
 As proteinas A-tagged Puf foram capturadas com Ig-G
Sepharos e separadas por clivagem com TEV protease
 Os RNAs associados à proteinas foram isolados
 Duas amostras foram utilizadas na análise: RNA total
e RNA isolado por afinidade ao PUF e foi preparado o
cDNA
 Cópias c DNA foram titulados por fluorescência e DNA
microarrays de levedura
Figura 1
Seleção dos alvos das PUFs :
 Seleção das seqüências enriquecidas com fatores
correspondentes aos isolados por afinidade que estavam
pelo menos a dois desvios padrões acima da outras
seqüências.
 Diferentes mRNA = diferentes Pufs
 A identificação das PUFs e seus alvos confirmaram as
funções das interações RNA - proteina
 A lista de RNAs alvos também não foi alterada após
análise estatística
Definição dos RNAs alvos das PUFs
 Em S. cerevisiae : apenas 2 mRNA foram identificados
para as proteínas PUF.
 Puf3 : COX mRNA 3’-UTR (in vitro)
 Puf5p : regulam negativamente a expressão de genes
repórteres, substituindo o HO de endonucleases
Alterações nos genes PUFs de
Saccharomyces cerevisiae
 PUF4 e PUF5: diminuição da longevidade,
PUF1: supressor de mutação em microtúbulos
PUF2 null: aumento de resistência a
cycloheximide e paramomycin
PUFs ausentes: células viáveis
Puf1p e Puf2p

18 % dos genes codificam proteínas associadas à
membrana em Sc
 A maior parte dos Pufps 1 e 2 associam- se a mRNAs para
proteínas associadas à membrana

Proteínas associadas à membrana: funções de transporte
transmembrana e transporte vesicular de protínas.
Puf3p Puf1p e Puf2p
 Está associado à produtos gênicos mitocondrias.
 80% biossíntese de proteínas que apresenta função
estruturais em ribossomos.
 Entre 22 Pufps associadas a mRNAs transcritos de
mitocondrias ; 17 estão envolvidos na respiração e 12 na
translocação mitocondrial.
Puf4p

Associa-se a mRNA envolvidos na síntese ,
processamento e maturação dos ribossomos - nucléolo
Puf5p

 Puf5p : Liga-se a frações de mRNA que codificam
proteínas que participam da modificação covalente de
histonas.
 Puf5p: Liga-se a frações que codificam proteínas
envolvidas na regulação da mitose.
 Conclusões
 A ligação das RBPs ( Pufp) a mRNA permite maior
flexibilidade regulatória que o operon.
 As RBPs demonstraram a possibilidade de se regular
especificamente o local, a tradução e a sobrevivência
do RNAm.
 Muitos dos RNAs que ligam -se a RBPs codificam
proteínas que são ativas em locais celulares
específicos, que formam complexos e participam de
vias celulares.