UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA
INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
ERIKA FONSECA FERRARI
AÇÃO DA SUPLEMENTAÇÃO CRÔNICA COM CREATINA NA
HIPERREATIVIDADE PULMONAR INDUZIDA POR LPS EM CAMUNDONGOS
São José dos Campos, SP
2009
ERIKA FONSECA FERRARI
AÇÃO DA SUPLEMENTAÇÃO CRÔNICA COM CREATINA NA
HIPERREATIVIDADE PULMONAR INDUZIDA POR LPS EM CAMUNDONGOS
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas da Universidade do Vale do Paraíba,
como complementação dos créditos necessários
para a obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas.
Orientadores: Prof. Dr. Wellington Ribeiro
Profa. Dra. Stella Regina Zamuner
São José dos Campos, SP
2009
Agradecimentos
A Deus, acima de tudo. Reconhecendo e sendo grata a todas as
oportunidades dadas, as bênçãos concedidas durante todo o tempo, aos caminhos
trilhados, aos obstáculos transpostos e ao aprendizado, não somente acadêmico,
mas pessoal e espiritual.
À minha família (minha base!). Ao amor e apoio incondicional da minha Mãe,
ao meu Pai, pelo incentivo e apoio e meu Pai de coração, por estar sempre ao meu
lado.
Ao meu esposo (meu Amor!), que me deu mais um ânimo e um objetivo
nessa reta final.
Aos meus professores, sempre dispostos a ajudar e me fizeram crescer e
amadurecer cientificamente, Prof. Dr. José Carlos Cogo, Profa. Dra. Stella Regina
Zamuner, Prof. Msc. Antonio Carlos Guimarães Prianti Junior e, em especial, ao meu
Orientador Prof. Dr. Wellington Ribeiro.
Aos professores que disponibilizaram seu tempo e seus recursos, Profa. Dra.
Maria Angélica Gargione Cardoso, Prof. Dr. Milton Beltrame Junior e Prof. Dr. Airton
Abrahao Martin.
Ao reitor da Univap, Prof. Dr. Baptista Gargione, à diretora do IP&D, Profa.
Dra. Sandra Maria da Costa, às professoras Dra. Renata Amadei, coordenadora do
programa CAPES/PROSUP e Dra. Cristina Pacheco Soares, coordenadora do curso
de mestrado em Ciências Biológicas.
À Univap e à Instituição de fomento CAPES.
Às funcionárias, sempre dispostas a ajudar (e ajudaram muito!), dona Ivone,
Valéria, Vanessa, dona Neusa, Rúbia e Juliana.
Às minhas amigas, mais que especiais (minhas irmãs!), Natália Mazini
Ribeiro, Roberta Silva Carreiro da Costa, e Kátia Cristiane de Brito Domingues.
Aos meus queridos amigos e colegas, Marcelo de Souza Araújo, Helio
Andrade Gouvêa, Ana Maria Barbosa, Ludmila Guimarães Souza e Ane Carolina
Basso Cabral.
Ao Márcio, motorista do transporte, e ao André, porteiro.
A todos meu imenso agradecimento e carinho!
Um pouco de ciência nos afasta de Deus.
Muito nos aproxima.
(Luis Pasteur)
AÇÃO DA SUPLEMENTAÇÃO CRÔNICA COM CREATINA NA
HIPERREATIVIDADE PULMONAR INDUZIDA POR LPS EM CAMUNDONGOS
Resumo
A Creatina é um constituinte nutricional e comumente utilizado como suplemento
ergonênico. A relevância clínica da suplementação com creatina vem sendo
estudada quanto a sua possível utilização terapêutica, como prova disto podemos
observar os diversos trabalhos realizados em pacientes portadores de diversos
processos fisiopatológicos. Alguns estudos sugerem um papel benéfico da
suplementação com creatina em doenças pulmonares crônicas, mas há evidências
que demonstram que a creatina aumenta a hiperresponsividade pulmonar,
promovendo inflamação local, aumento de fibras colágenas, elastina e
espessamento da musculatura lisa. Um modelo clássico para se estudar a
inflamação pulmonar aguda induzida é através da instilação nasal ou traqueal de
LPS em camundongos. Este trabalho teve como objetivo relacionar a ação da
suplementação crônica creatina nas doses de 0,5 e 2 g/kg e seu efeito sobre o
processo inflamatório agudo em camundongos sensibilizados por LPS. Foi utilizando
como modelo experimental a hiperreatividade pulmonar em camundongos com
análise sobre a migração leucocitária e produção de óxido nítrico no lavado
broncoalveolar e análise histopatológica pulmonar. Os dados demonstram que a
suplementação oral de creatina causou um aumento da hiperreatividade pulmonar,
com aumento da migração de células para o lavado broncoalveolar em relação aos
demais grupos; aumento de neutrofilia em relação ao grupo controle e LPS. A
produção de óxido nítrico não apresentou alteração estatisticamente significativa em
relação aos grupos analisados. A análise histopatológica apresentou expressivas
alterações anatomopatológicas e lesão tecidual pulmonar intensa com denso
agregado celular peribronquial e perivascular, composto, primariamente, por
neutrófilos; hemácias em no interior dos vasos sanguíneos e depositadas nos
alvéolos pulmonares; dano ao epitélio respiratório do bronquíolo terminal; infiltração
e acúmulo de neutrófilos na região do lúmen bronquial e nos espaços alveolares.
Após a indução com LPS observou-se acréscimo nas alterações patológicas
apresentadas além de atelectasia proeminente, diminuição da camada muscular dos
bronquíolos e presença de fibrose na parede arterial. Com bases nesses dados
podemos concluir a administração crônica de creatina nas doses de 0,5 g/kg e 2 g/kg
podem desencadear uma lesão pulmonar mais intensa do que a hiperreatividade
induzida pela instilação intranasal de LPS e que não houve potencialização quando
administrados em conjunto, sugerindo um forte efeito tóxico na administração
crônica de creatina.
Palavras-chave: Creatina, Suplemento Alimentar, Hiperreatividade Pulmonar,
Histologia, LPS.
ACTION OF CREATINE SUPPLEMENTATION ON LUNG HYPERREACTIVITY
LPS INDUCED IN MICE
Abstract
Creatine is a nutritional constituent and usually used as ergogenic supplement. The
clinical relevance of the supplement with creatine comes being studied as a possible
therapeutical use, to prove this, we can observe the many works made in patients
with diverse physiopathologyc processes. Some studies suggest a beneficial role of
the supplementation with creatine in chronic pulmonary disease, but it has evidences
that demonstrate the creatine increases the pulmonary hyperresponsivity, promoting
inflammation, collagen increase, elastin and local smooth muscle thickness. A classic
model to study the induced acute pulmonary inflammation is through the nasal or
tracheal instillation of LPS in mice. This work had as objective to relate the action of
the creatine chronic supplementation in the 0,5 g/kg and 2 g/kg doses and its effect
on the acute inflammatory process in mice sensitized for LPS. It was using as
experimental model the pulmonary hyperreactivity in mice with analysis on the
leukocyte migration and nitric oxide production in the bronchoalveolar lavage and
pulmonary histopathologic analysis. The data demonstrate that the oral
supplementation with creatine caused an increase of the pulmonary hyperreactivity,
with increase of the cells migration to bronchoalveolar lavage in relation to the other
groups; increase of neutrophils in relation to the control and LPS groups. The nitric
oxide production did not present statistical significant alteration in relation to the
analyzed groups. The histopathological analysis presented expressive
anatomopathological alterations and intense pulmonary tissue injury with dense
peribronchial cellular aggregate and to perivascular, composition, primarily, for
neutrophils; red blood cells in the interior of the sanguineous vessels and deposited
in the pulmonary alveoli; damage to the respiratory epithelia of the terminal
bronchiole; infiltration and accumulation of neutrophils in the region of the bronchial
lumen and in the alveolar spaces. After the induction with LPS we observed addition
in the presented pathological alterations beyond prominent atelectasis, reduction of
the bronchioles muscle layer and presence of fibrosis in the arterial wall. With bases
in these data we can conclude the chronic administration of creatine in 0,5 g/kg and
2 g/kg doses can unchain more intense pulmonary injury than the induced
hyperreactivity with LPS intranasal instillation and that it did not have potentialization
when managed in set, suggesting a strong toxic effect in the chronic administration of
creatine.
Key-words: Creatine, Food Supplement, Lung hyperreactivity, Histology, LPS.
Lista de Ilustrações
Figura 1: Resposta patológica provável e local predominante da resposta
inflamatória da via aérea a diferentes estímulos. ............................................................. 19
Figura 2: Síntese da creatina............................................................................................... 24
Figura 3: Estrutura química da creatina, creatinina e fosfocreatina. ............................. 25
Figura 4: Reação de catalisação da enzima creatina quinase na transferência
reversível do grupo fosfato do ATP para o grupo guanidino da creatina produzindo
ADP e fosfocreatina. ............................................................................................................. 26
Figura 5: Esquema do metabolismo de creatina/creatinina produzindo formaldeído.28
Figura 6: Contagem total de células presentes no lavado broncoalveolar. ................. 39
Figura 7: Contagem de neutrófilos presentes no lavado broncoalveolar. .................... 40
Figura 8: Curva padrão da absorbância em 540 nm em relação a concentrações
conhecidas de nitrito. ............................................................................................................ 41
Figura 9: Concentração de nitrito presente no lavado broncoalveolar. ........................ 42
Figura 10: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Controle.................................... 43
Figura 11: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Controle.................................... 44
Figura 12: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Controle.................................... 44
Figura 13: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg. ................... 45
Figura 14: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg. ................... 46
Figura 15: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg. ................... 46
Figura 16: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg........................ 47
Figura 17: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg........................ 48
Figura 18: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg........................ 48
Figura 19: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg........................ 49
Figura 20: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo LPS. .......................................... 50
Figura 21: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo LPS. .......................................... 50
Figura 22: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo LPS. .......................................... 51
Figura 23: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg + LPS. ....... 52
Figura 24: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg + LPS. ....... 52
Figura 25: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg + LPS. ....... 53
Figura 26: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg + LPS. .......... 54
Figura 27: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg + LPS. .......... 54
Figura 28: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg + LPS. .......... 55
Lista de tabelas
Tabela 1: Critério de classificação histológica...........................................................37
Tabela 2: Classificação histológica para determinação da lesão pulmonar. .............56
Lista de Abreviaturas e Siglas
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
cNOS
Óxido Nítrico Sintase Constitutiva
COBEA
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
DPOC
Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
eNOS
Óxido Nítrico Sintase Endotelial
ERO
Espécies Reativas de Oxigênio
FDA
Food and Drug Administration
FER
Fluído Epitelial de Revestimento
H.E.
Hematoxilina e Eosina
IL-1β
Interleucina 1-β
IL-4
Interleucina 4
IL-5
Interleucina 5
IGF-1
Fator de crescimento tipo insulina 1
iNOS
Óxido Nítrico Sintase Induzida
LBA
Lavado Broncoalveolar
LPA
Lesão Pulmonar Aguda
LPS
Lipopolissacarídeo
MBS
Membrana Basal Subepitelial
MLVA
Musculatura Lisa das Vias Aéreas
MMN
Monomorfonucleares
NF-κB
Fator nuclear κB
nNOS
Óxido Nítrico Sintase Neuronal
NOS
Óxido Nítrico Sintase
NOS1
Óxido Nítrico Sintase Neuronal
NOS2
Óxido Nítrico Sintase Induzida
NOS3
Óxido Nítrico Sintase Endotelial
OVA
Ovoalbumina
PMN
Polimorfonucleares
SDRA
Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo
SODS
Superóxido Dismutase
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral α
Sumário
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................... 13
1.1
Objetivo Geral .......................................................................................................... 14
1.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 15
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 15
2.1 Fisiologia Pulmonar........................................................................................................ 15
2.2 Alterações e Patologias do Sistema Respiratório ...........................................................16
2.3 Epidemiologia................................................................................................................. 19
2.4 Imunidade inata .............................................................................................................. 20
2.5 Lipopolissacarídeo.......................................................................................................... 22
2.6 Creatina........................................................................................................................... 23
2.7 Suplementação com creatina .......................................................................................... 25
2.8 Óxido nítrico e estresse oxidativo .................................................................................. 28
2.9 Sinalização celular e migração leucocitária.................................................................... 30
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................... 32
3.1 Animais........................................................................................................................... 32
3.2 Grupos Experimentais .................................................................................................... 32
3.3 Tratamento e Suplementação da Creatina ......................................................................33
3.4 Indução da Inflamação Pulmonar Aguda por LPS .........................................................33
3.5 Protocolo de Anestesia e Eutanásia ................................................................................ 33
3.6 Coleta do Lavado Broncoalveolar .................................................................................. 34
3.7 Coleta e contagem de leucócitos ....................................................................................34
3.8 Determinação da produção de óxido nítrico...................................................................35
3.9 Análise Histológica ........................................................................................................36
3.10 Análise Estatística ........................................................................................................ 37
4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 38
4.1 Contagem de leucócitos no LBA.................................................................................... 38
4.2 Determinação da produção de óxido nítrico...................................................................40
4.3 Análise Histológica ........................................................................................................42
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 57
6 CONCLUSÃO....................................................................................................................... 63
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 65
Anexo: Carta de Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa................................................. 79
13
1 INTRODUÇÃO
A função primária do sistema respiratório é a troca de oxigênio e dióxido de
carbono entre o ambiente e as células do organismo. O sistema respiratório inclui
pulmões e uma série de vias aéreas que os conectam ao ambiente externo. As
alterações ou patologias do sistema respiratório podem ocorrer pela ação de
diversos fatores, tanto intrínsecos, por exemplo, devido a alterações genéticas do
sistema imune, quanto por alterações extrínsecas como o contato com poluição,
tabagismo e contato com microorganismos.
A hiperreatividade das vias aéreas induzida, através da instilação nasal ou
traqueal de lipopolissacarídeo, em camundongos é um modelo clássico para se
estudar a inflamação pulmonar. Esses modelos experimentais são utilizados com o
intuito de se reproduzir algumas patologias pulmonares, como por exemplo,
síndrome do desconforto respiratório agudo e asma. Geralmente esses modelos
caracterizam-se pelo aumento da permeabilidade vascular, acúmulo e ativação de
neutrófilos e macrófagos, levando-os a liberarem inúmeras citocinas, enzimas
proteolíticas, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e metabólitos do ácido
araquidônico. Vários desses produtos liberados por neutrófilos e macrófagos
ativados atuam como sinalizadores para as células que constituem as vias aéreas
(músculo liso e células epiteliais) e para o parênquima pulmonar (pneumócitos tipo
II). Desta forma estes mediadores promovem a liberação de citocinas e fatores de
crescimento, contribuindo para a manutenção da resposta inflamatória, o que
cronicamente ocasiona o remodelamento das vias aéreas e do parênquima
pulmonar, causando alterações estruturais e funcionais dos pulmões.
A Creatina é um constituinte nutricional encontrado naturalmente em
alimentos de origem animal e sintetizado pelo próprio organismo humano a partir dos
aminoácidos glicina, arginina e metionina. Após a administração, a creatina pode ser
armazenada por uma variedade de células, incluindo células sangüíneas, cérebro e
tecido nervoso, pulmões, músculo cardíaco e retina; entretanto o local de maior
absorção é a musculatura esquelética. Embora a maioria dos estudos com creatina
tenha enfoque no desempenho do exercício físico, evidências recentes indicam que
a suplementação com creatina pode ser útil no tratamento de determinadas
doenças, como distrofia muscular de Duchenne e miastenia gravis.
Outras
pesquisas têm se focado nos marcadores clínicos (como uréia, creatinina, fosfatase
alcalina, albumina, bilirrubina, entre outras) para avaliar os possíveis riscos e danos
teciduais causados
pela suplementação com creatina, associando a sua
suplementação
condições
às
patológicas,
tais
como
cãibras
musculares,
desidratações, disfunções renais e hepáticas e hiperresponsividade pulmonar.
1.1 Objetivo Geral
Analisar o efeito da suplementação crônica de creatina na hiperreatividade
pulmonar em camundongos imunossuprimidos da linhagem Balb/C induzidos com
lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli.
1.2 Objetivos Específicos
•
Analisar o efeito suplementação crônica de duas doses de creatina na resposta
inflamatória em um modelo de hiperreatividade pulmonar induzida por LPS.
•
Observar a presença de alterações anatomopatológicas no tecido pulmonar e
no número de células inflamatórias do lavado broncoalveolar no tratamento
crônico com creatina e na indução com LPS.
•
Mensurar a produção de óxido nítrico através da determinação de nitrito no
lavado broncoalveolar.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Fisiologia Pulmonar
A função primária do sistema respiratório é a troca de oxigênio e dióxido de
carbono entre o ambiente e as células do organismo. O sistema respiratório inclui
pulmões e uma série de vias aéreas que os conectam ao ambiente externo
(CONSTANZO, 2004).
Do ponto de vista funcional, o pulmão pode ser dividido em duas zonas
principais: zona de condução e zona de trocas gasosas. A zona de condução
compreende as vias aéreas extratorácicas (nariz, faringe e laringe) e as
intratorácicas (traquéia, os brônquios, e bronquíolos terminais). A transição entre as
vias de condução e a zona de trocas gasosas caracteriza-se pelo aparecimento de
evaginações alveolares na parede bronquial: esses são os bronquíolos respiratórios
que, em seguida, continuam com os ductos alveolares e os sacos alveolares
(GONZÁLEZ, 2004).
O nariz é a primeira porção das vias aéreas extratorácicas que apresenta
diversas funções, tais como no condicionamento da temperatura e umidade; a
camada mucosa funciona filtrando partículas e impedindo que as mesmas alcancem
as vias aéreas mais distais. O fluxo de muco depura as passagens nasais e as
secreções contêm algumas imunoglobulinas importantes, células inflamatórias e
interferon, que constituem a primeira etapa na defesa do hospedeiro contra
patógenos (LEFF; SCHUMACKER, 1996).
Os brônquios principais possuem grande parte do tecido cartilaginoso com uma
membrana posterior. Entretanto, à medida que os brônquios se ramificam
progressivamente, a distribuição cartilaginosa torna-se descontínua e em placas ao
longo da circunferência do brônquio. Com o prosseguir da arborização, o conteúdo
cartilaginoso dos brônquios diminui e as vias aéreas adotam progressivamente o
arranjo sacular microscópio dos alvéolos. A musculatura lisa envolve toda a via
aérea (GUYTON; HALL, 2006).
A membrana alveolocapilar compreende o epitélio alveolar, o espaço intersticial e
o endotélio capilar. O endotélio alveolar compreende os pneumócitos do tipo I, que
são células grandes e pobres em organelas; os pneumócitos do tipo II, que se
caracterizam por suas estruturas lamelares, e os macrófagos. A membrana capilar
consta de uma membrana basal de fibras de colágeno sobre a qual se estende o
endotélio (GONZÁLEZ, 2004).
A integridade do sistema respiratório é um fator primordial para a sobrevivência
humana, uma vez que as alterações das trocas gasosas ou da contratilidade
muscular afetam diretamente o equilíbrio deste sistema (GERN, 2000).
2.2 Alterações e Patologias do Sistema Respiratório
As alterações ou patologias do sistema respiratório podem ocorrer pela ação de
diversos fatores, tanto intrínsecos, por exemplo, devido a alterações genéticas do
sistema imune, quanto por alterações extrínsecas como o contato com poluição,
tabagismo e contato com microorganismos (HOFFMANN, 2003).
A invasão de um tecido por um microorganismo promove uma infecção ou lesão
tecidual que pode ocorrer por ação direta às células, pela liberação de toxinas que
degradam os componentes teciduais, ou pela indução de mecanismos imunes do
hospedeiro, sendo esta uma resposta do organismo à agressão, podendo esta lesão
ser local ou sistêmica (KUMAR; ABBAS; FASTO, 2005).
Quando o tecido pulmonar apresenta um processo inflamatório intenso ocorre
lesão endotelial com aumento da permeabilidade capilar e edema, desencadeando a
oclusão capilar e isquemia do tecido (D’ACAMPORA et al., 2004). Admiti-se
atualmente que a infecção respiratória modula a inflamação alérgica das vias aéreas
(GERN, 2000).
Alterações na fisiologia do sistema respiratório, quando induzidos por poluentes
ambientais incluindo endotoxinas como lipopolissacarídeos (LPS), podem provocar o
fenômeno de hiperreatividade das vias aéreas (MICHEL et al., 1996), promovendo,
desta forma, lesões pulmonares agudas que são caracterizadas por um intenso
influxo de neutrófilos nos pulmões, aumento da expressão de mediadores
inflamatórios com conseqüente dano ao epitélio e endotélio pulmonar, os quais
resultam em edema pulmonar e deterioração da troca gasosa (WARE; MATTHAY,
2000; NAGASE et al., 2000). A acumulação e a ativação de células inflamatórias nos
locais de deposição antigênica exigem a mobilização, a aderência, passagem
transendotelial, ativação e proliferação de linfócitos T (VARGAFTIG, 1997).
A resposta à inflamação pulmonar como ocorre em pulmões saudáveis é um
mecanismo altamente coordenado e eficiente para a reversão deste processo
fisiopatológico (HALLER et al., 2008).
A inflamação das vias aéreas é uma
característica comum de doenças pulmonares infecciosas. Embora esta resposta
contribua claramente para a redução do número de patógenos obtidos a partir do
local da infecção, uma resposta prolongada pode colaborar ainda mais para o dano
pulmonar
(LEIVA,
RUIZ-BRAVO,
JIMENEZ-VALERA,
2008).
A
regulação
insatisfatória desta resposta pode ser devido a uma inflamação pulmonar tão intensa
quanto a doença pulmonar crônica, em particular a síndrome do desconforto
respiratório agudo (SDRA), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e asma
(JONES, 2005; QUINT; WEDZICHA, 2007).
A asma é uma doença crônica das vias aéreas caracterizada por eosinofilia e
hiperresponsividade das vias aéreas (AKDIS et al., 2006; EDER et al., 2006;
UMETSU; DEKRUYFF, 2006) e envolve interações complexas entre fatores
exógenos (exposições primárias e secundárias à alérgenos, infecções intercorrentes,
estímulos ambientais nocivos) a fatores endógenos determinados geneticamente
(VARGAFTIG, 1997). É caracterizada pelo acúmulo de muco no lúmen das vias
aéreas, edema na mucosa bronquial, aumento da responsividade dos brônquios e
produção aumentada de espécies reativas de oxigênio, resultando em um
desbalanço entre as forças oxidativas e o sistema de defesa antioxidante (DATTI;
DATTI; ANTUNES, 2008; DWORSKI et al., 2000; LEE et al., 2006; KIRKHAM;
RAHMAN, 2006; RAHMAN; MACNEE, 1999; 2000). Os principais fatores
desencadeantes da crise asmática, identificados na prática clínica, são: alérgenos
inalatórios, infecção viral das vias aéreas, poluentes atmosféricos, exercício físico,
mudanças climáticas, alimentos, aditivos, drogas e estresse emocional. Menos
freqüentemente, outros fatores podem contribuir como desencadeante: rinite
alérgica, sinusite bacteriana, polipose nasal, menstruação, refluxo gastroesofágico e
gestação (RODRIGO; RODRIGO; HALL, 2004).
A asma é classicamente definida como uma obstrução reversível ao fluxo de ar,
que se manifesta clinicamente por episódios recorrentes de dispnéia, sibilância,
constrição torácica e tosse. O estreitamento variável das vias aéreas, em
decorrência da inflamação brônquica e do aumento do tônus brônquico, é
responsável pelo aumento da resistência ao fluxo aéreo, hiperinflação pulmonar e
desuniformidade na ventilação/perfusão. Com a progressão da obstrução ao fluxo
aéreo na crise asmática grave, a insuficiência respiratória é conseqüência do
aumento do trabalho respiratório, da troca gasosa ineficaz e da exaustão dos
músculos respiratório. A hiperresponsividade brônquica e obstrução variável do fluxo
aéreo podem ser reversíveis espontaneamente ou com o tratamento (RODRIGO;
RODRIGO; HALL, 2004).
A asma pode ser clinicamente classificada em leve, moderada ou grave e
acometer indivíduos de todas as idades (asma da infância e adolescente, adulto e
idoso), onde até mesmo o biotipo pode ser importante, como a asma do obeso
(CAMPOS, 2009); freqüentemente se apresenta de forma mais suave em pacientes
mais jovens. Entretanto, os vários graus de obstrução do fluxo de ar podem persistir,
a longo prazo, o que resultaria na evolução de um processo moderado a
inteiramente irreversível (REED, 1999; BACKMAN; GREENBERGER; PATTERSON,
1997).
Já a fisiopatologia da asma refratária possui características em comum com a
DPOC. A hipótese de que os estímulos inflamatórios múltiplos são importantes na
patogênese da asma refratária e DPOC está suportado pela observação freqüente
que, quando este ocorre, muitas das características clínicas e patológicas comuns
destacadas previamente tendem a ocorrer. O princípio geral é que a coexistência de
estímulos inflamatórios múltiplos produz uma resposta inflamatória mais severa que
pode igualmente aplicar-se aos estímulos inflamatórios agudos. Este mecanismo
pode ser particularmente importante no desenvolvimento das exacerbações da asma
e de DPOC (PAVORD et al., 2006).
Os efeitos de estímulos inflamatórios múltiplos podem ser apenas aditivos. O
resultado líquido de estímulos inflamatórios diferentes dependerá então sobre: se é
um estímulo inflamatório agudo ou crônico; variações na resposta do hospedeiro aos
estímulos; a extensão a que o estímulo provoca uma resposta inflamatória dominada
por neutrófilos ou eosinófilos; e o local onde a resposta inflamatória predomina
(figura 1). Assim, a hipótese “ataque múltiplo” para a origem da doença severa da via
aérea fornece uma base para a heterogeneidade das características clínicas e
patológicas consideradas na asma refratária e em DPOC (HEANEY; ROBINSON,
2005; KRAFT et al., 1996; BARNES, 2000).
Figura 1: Resposta patológica provável e local predominante da resposta inflamatória da via
aérea a diferentes estímulos.
(PAVORD et al., 2006).
Os possíveis resultados aos múltiplos estímulos inflamatórios dependerão das
variações na resposta do hospedeiro a estes estímulos, do local de maior
intensidade desta resposta inflamatória, da extensão que os estímulos provocam e
da resposta inflamatória com prevalência de eosinófilos ou neutrófilos. Por exemplo,
um mineiro fumante com infecção crônica pela bactéria Helicobacter pylori tenderia a
desenvolver uma doença de pulmão longe do ponto de origem completamente
resistente a corticosteróides, com neutrofilia predominante e com enfisema
extensivo; ao contrário, um mineiro fumante que desenvolvesse a inflamação
eosinofílica da via aérea em resposta a uma sensibilização ocupacional, teria mais
características combinadas (PAVORD et al., 2006).
2.3 Epidemiologia
A asma é uma patologia comum e afeta cerca de 5 a 10 % da população de
adultos; é progressiva e pode evoluir para uma obstrução irreversível em 80 % dos
pacientes idosos; é complexa e, freqüentemente, se agrava devido à coexistência
com outras patologias pulmonares (RODRIGO; RODRIGO; HALL, 2004). Este
prejuízo na função pulmonar resulta em 4 condições patogênicas independentes: 1remodelamento das vias aéreas, especialmente nas pequenas vias, devido à
inflamação linfocítica-eosinofílica que caracterizam a asma; 2- bronquiectasia; 3fibrose pulmonar pós-infecção; e 4- enfisema e bronquite crônica em fumantes
(REED, 1999).
No Brasil, ocorrem anualmente cerca de 350.000 internações por asma,
constituindo-se na quarta causa de hospitalização pelo Sistema Único de Saúde
(SUS), o que corresponde a 2,3 % do total de internações (BRASIL, 2005).
Em muitos países, a mortalidade por asma aumentou a partir de 1960, com dois
picos na incidência: década de 60 e de 80. Atingiu um platô e diminuiu a partir da
década de 90. Essa tendência de declínio parece refletir um melhor manejo da
doença (COMINO, 2004). No Brasil, a mortalidade por asma em adultos jovens
variou de 0,276 a 1,034 / 100.000 ao ano. Houve aumento no período de 1970 a
1992 em crianças e adultos jovens, seguida de estabilização e tendência de
diminuição a partir da metade da década de 90 (CHATKIN et al., 2007).
Estes
pacientes
representam
um
importante
problema
clínico
e
farmacoeconômico, enquanto estes contribuem à maioria de custos da asma com a
hospitalização, as visitas de emergência, a ausência ao trabalho ou a escola e o uso
de medicamentos (CHUNG; GODARD, 1999).
2.4 Imunidade inata
A reação inflamatória é um mecanismo fisiopatológico que ocorre em resposta a
diversas doenças, tais como, traumas, infecções, reações imunitárias a agentes
externos e processos auto-imunes. É representada por um conjunto de reações
locais e sistêmicas, composta por uma série de fenômenos complexos que se
associam e complementam-se, formando uma reação em cadeia, na qual fazem
parte células inflamatórias, como neutrófilos, linfócitos, monócitos/macrófagos, e os
agentes agressores (TEDGUI; MALLAT, 2001).
Os leucócitos polimorfonucleares (PMNs) são as células brancas mais
abundantes nos seres humanos e um componente essencial do sistema imunitário
inato. Os PMNs são tipicamente o primeiro tipo de leucócito recrutado aos locais da
infecção ou áreas da inflamação (KENNEDY; DELEO, 2009). Os neutrófilos
desempenham papéis importantes na patogênese da lesão pulmonar aguda, são
células de vida curta que invadem os tecidos em resposta a uma variedade de
estímulos como, por exemplo, infecções virais e bacterianas. A ingestão desses
microorganismos provoca a produção de espécies reativas de oxigênio e a fusão de
grânulos citoplasmáticos com formação de fagossomos, conduzindo à morte eficaz
dos patógenos ingeridos. A fagocitose desses patógenos acelera a apoptose do
neutrófilo, que promove finalmente a resolução da infecção. Entretanto, alguns
micróbios
bacterianos
patogênicos
(como,
por
exemplo,
Anaplasma
phagocytophilum, Chlamydia pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa)
alteram a apoptose de PMNs para sobreviver e causar desse modo à doença
(DELEO, 2004; RABINOVITCH, 1995; WARE; MATTHAY, 2000).
A inflamação crônica das vias aéreas por eosinófilos, mastócitos e linfócitos é o
principal componente que define a síndrome denominada asma, porém do ponto de
vista patológico existem fenótipos diferentes, podendo ser diferenciada asma
eosinofílica e não eosinofílica (ou neutrofílica) (DOUWES et al., 2002; GIBSON;
SIMPSON; SALTOS, 2001; HALDAR; PAVORD, 2007).
Atualmente o processo inflamatório das vias aéreas apresentando eosinófilos
tem sido aceito como uma característica fundamental da asma. Entretanto, está
aumentando
o
reconhecimento
de
formas
não-eosinofílicas
da
asma,
particularmente nos indivíduos com a asma severa (DOUWES et al., 2002; WENZEL
et al., 1999). A asma não-eosinofílica foi relatada nos pacientes com asma severa e
refratária, dependentes da ingestão de corticosteróides e pode estar associada a
episódios mais freqüentes de intubação e colapsos expiratórios das vias aéreas
(TURNER et al., 1995). Os mecanismos da asma não-eosinofílica e o papel da
inflamação mucosal ainda não é bem compreendido. Os neutrófilos não são
reconhecidos geralmente como parte do processo inflamatório na asma estável;
entretanto, elevados níveis de neutrófilos são vistos na asma refratária severa, e em
exacerbações severas (DOUWES et al., 2002; WENZEL et al., 1997).
2.5 Lipopolissacarídeo
A consciência da complexidade das interações entre o ambiente modificado pelo
homem e os fatores individuais (que incluem a constituição genética, mas não se
restringem a estes) está aumentando rapidamente. Assim, as interações dos
microorganismos e dos alérgenos são de particular interesse (MICHEL et al., 1996).
O LPS é um componente da parede de células bacterianas gram-negativas que
pode ser encontrada no ambiente (como na poeira doméstica) capaz de ativar a
imunidade inata e modificar a expressão da alergia respiratória induzindo efeitos
inflamatórios intensos nas vias aéreas assim como hiperreatividade brônquica
(CHABY et al., 2005; EMPEY et al., 1976; HOLTZMAN et al., 1979; LEFORT et al.,
1998; MICHEL et al., 1996; SIRAGANIAN et al., 1979). Nos últimos anos a
severidade da asma tem sido correlacionada com o índice de LPS na poeira
doméstica (MICHEL et al., 1996).
As endotoxinas causam múltiplas disfunções nos órgãos, incluindo a LPA ou a
sua forma severa, como também a SDRA (WARE; MATTHAY, 2000). Em modelo de
animais experimentais a exposição aguda ao LPS, administrado através da
instilação intranasal ou intratraqueal, foi associada com o desenvolvimento e/ou a
progressão da LPA (VALENCA et al., 2008).
O mecanismo de ação do LPS envolve desde a seqüência oxidativa em algumas
doenças, tais como a sepse, relacionadas à lesão pulmonar (SUNTRES; SHEK,
1996), como também a estimulação da liberação de mediadores pró-inflamatórios
por vários tipos celulares, causando deste modo uma resposta inflamatória
sistêmica, choque, coagulação intravascular disseminada e falência múltipla de
órgãos (BEUTLER, 2002; YAMAMOTO; AKIRA, 2005). Além disso, a administração
intranasal de LPS em camundongos é seguida por outros efeitos relevantes,
incluindo um aumento da resistência basal da via aérea, provavelmente devido ao
aumento do índice de proteínas no lavado broncoalveolar (LBA), indicando o
aumento da permeabilidade vascular (VARGAFTIG, 1997). Estudos anteriores
sugerem que as desordens do metabolismo oxidante-antioxidante exercem um papel
importante no desenvolvimento da LPA por LPS em animais ou nos seres humanos
(GONZALEZ et al., 1996; THIMMULAPPA et al., 2006). Entretanto, tem-se admitido
que, em humanos, o LPS é um fator de risco para a asma (SCHNARE et al., 2001;
RIZZO et al., 1997).
A instilação intranasal ou aerosolização de LPS em camundongos é seguida pela
produção de fator de necrose tumoral (TNF)-α e por um intenso recrutamento de
neutrófilos para o LBA (GONÇALVES DE MORAES et al., 1996). Durante uma
inflamação induzida no pulmão por LPS, ocorre uma acumulação maciça de
neutrófilos que, quando erradicada pela fagocitose do macrófago, é seguida da
apoptose deste. Entretanto, nos casos de extensa apoptose o sistema normal de
remoção dessas partículas pode falhar, resultando em necrose secundária extensa
causada pelo neutrófilo (RYDELL-TÖRMÄNEN; ULLER; ERJEFÄLT, 2006b).
2.6 Creatina
A creatina foi identificada em 1835, pelo cientista francês Michel Chevreu, o qual
relatou ter encontrado um novo constituinte orgânico nas carnes, denominando de
creatina. Em 1847, Justus Liebig foi capaz de confirmar a presença de creatina como
um constituinte regular das carnes e, na mesma época, os pesquisadores Heitz e
Pettenkoffer descobriram uma nova substância presente na urina, mais tarde
identificada como creatinina, um subproduto da creatina (DEMANT; RHODES,
1999).
A Creatina (ácido acético α-metilguanidina), uma amina nitrogenada, é um
nutriente naturalmente encontrado em alimentos de origem animal e também é
sintetizada pelo próprio organismo humano a partir dos aminoácidos glicina, arginina
e metionina (BEMBEN; LAMONT, 2005; KREIDER, 2003; WALKER, 1979). Esse
processo de síntese ocorre através da transferência de um grupo amino da arginina
para a glicina, formando guanidinoacetato e ornitina, através de uma reação
mediada pela enzima glicina amidinotransferase; em seguida, o guanidinoacetato é
metilado pela s-adenosil-metionina, através da ação da enzima guanidinoacetato
metiltransferase, derivando a creatina (figura 2) (FELDMAN, 1999).
Figura 2: Síntese da creatina
(PERSKY; BRAZEAU; HOCHHAUS, 2003)
A creatina pode ser obtida através de uma dieta rica em carne (aproximadamente
5 g de creatina em 1 kg de carne animal) sendo sintetizada no fígado, rins e
pâncreas. Um total de aproximadamente 2 g de creatina é produzido/ou consumido
por dia, com igual contribuição fornecida pela síntese e pela dieta (PERSKY;
BRAZEAU; HOCHHAUS, 2003).
Na ingestão de creatina por via oral, a absorção será determinada pelas
propriedades físico-químicas da molécula. Devido à semelhança estrutural da
creatina com os aminoácidos glicina, arginina e metionina, a absorção da creatina é
dependente de transportadores especializados para estes aminoácidos (KARLSSON
et al., 1999). Após a absorção, a creatina plasmática é distribuída para diferentes
tecidos, com aproximadamente 95 % da creatina total encontrada na musculatura
esquelética e os 5 % restantes são armazenados em outros órgãos como coração,
cérebro, pulmões, testículos, fígado e rins (GREEN et al., 1996; IPSIROGLU et al.,
2001).
A creatina e a fosfocreatina (figura 3) são degradadas de forma não
enzimática à creatinina. A creatinina e a creatina são ambas eliminadas do corpo por
via renal (WALKER, 1979).
Figura 3: Estrutura química da creatina, creatinina e fosfocreatina.
(PERSKY; BRAZEAU; HOCHHAUS, 2003; WYSS; KADDURAH-DAOUK, 2000).
2.7 Suplementação com creatina
A creatina quando suplementada na dieta, demonstra vários benefícios
fisiológicos tanto em atletas quanto em animais (como modelos experimentais de
doenças) (PERSKY; BRAZEAU; HOCHHAUS, 2003). Atualmente os suplementos a
base de creatina são comercializados sob diversas formas como pó, tabletes, gel,
líquido, goma de mascar e barras (SOUZA, 2006).
De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) na
Resolução RE nº 109, de 19 de julho de 2002, foi proibida a comercialização de
suplementos a base de creatina no Brasil por estarem em desacordo com o DecretoLei 986 e seus regulamentos (ANVISA, 2006). Porém seu comércio no exterior ainda
é autorizado pela Food and Drug Administration (regulamentação 21 CFR seção
190.6) com restrição apenas para a recomendação de uso para maiores de 18 anos
(FDA, 2006).
A relevância clínica da suplementação com creatina é baseada primariamente no
papel de geração de ATP (PERSKY; BRAZEAU; HOCHAUS, 2003), sendo esta
precursora molecular da adenosina trifosfato, a qual é substrato básico para geração
de energia intracelular (WYSS; KADDURAH-DAOUK, 2000). A disponibilidade da
creatina para as células se dá através da corrente sangüínea e estas a armazenam
como creatina livre e sua forma fosforilada, a creatina fosfato (PUCAR et al., 2001).
Através do aumento da fosfocreatina possibilita-se às células a capacidade de obter
uma melhor e mais rápida conversão de energia diante da demanda (PERSKY;
BRAZEAU; HOCHHAUS, 2003). A fosfocreatina auxilia na manutenção da
homeostase de nucleotídeos de adenina nos tecidos, produzindo/regenerando ATP
(figura 4). O ATP pode ser derivado da oxidação de ácidos graxos, da oxidação de
carboidratos, da glicólise e da fosfocreatina. A oxidação dos ácidos graxos rende
quantidades maiores de ATP, mas em uma taxa mais lenta. Inversamente, a
fosfocreatina pode produzir ATP muito rapidamente, mas apresenta uma menor
capacidade de gerar concentrações maiores de ATP quando comparado com o
metabolismo da gordura e de carboidratos (SAHLIN; TONKONOGI; SÖDERLUND,
1998).
Figura 4: Reação de catalisação da enzima creatina quinase na transferência reversível do
grupo fosfato do ATP para o grupo guanidino da creatina produzindo ADP e fosfocreatina.
(WYSS; KADDURAH-DAOUK, 2000).
Quando uma célula é energeticamente “carregada” através de estímulos
ambientais (por exemplo, exercício ou isquemia), a fosfocreatina é o primeiro
sistema a ser recrutado. Entretanto, devido a sua pequena capacidade, este sistema
é esgotado rapidamente de sua capacidade de geração. A fim de aumentar a
capacidade de geração deste sistema, a suplementação com creatina tem sido
implementada e tem mostrado um aumento das concentrações totais da creatina
(creatina e fosfocreatina) no músculo esquelético e no tecido nervoso. Aumentar a
capacidade de geração permite que uma célula melhore seu controle energético,
assim prevenindo um dano celular ou a morte e melhorando o funcionamento celular
(CASEY et al., 1996; DECHENT et al, 1999; HULTMAN et al., 1996; IPSIROGLU et
al., 2001).
A creatina desempenha um papel importante no metabolismo das proteínas.
Conseqüentemente, parece aumentar a massa magra do corpo e a força nos seres
humanos. Recentemente, houve um grande interesse entre consumidores e
pesquisadores a respeito da aplicação terapêutica da creatina e os benefícios da
utilização da creatina como um suplemento dietético. Em estudos relatou-se que o
uso da suplementação com creatina pode reduzir a fadiga, acelerar a recuperação
de energia, aumentar a força e o crescimento muscular além de regenerar a
capacidade energética produzida pelo ATP para aumentar a quantidade de tempo e
funcionamento do músculo, isto sem afetar o metabolismo de gordura do corpo
(EARNEST et al., 1995; GREENHAFF et al., 1993).
Outra possível abordagem terapêutica é aplicada no tratamento de doenças
musculares, neurológicas e neuromusculares, como falência coronária congestiva,
atrofia muscular, doenças mitocondriais, distrofias musculares, artrite, doença de
Huntington,
esclerose
lateral
amiotrófica,
neuropatias
hereditárias
e
na
neuroproteção (ANDREASSEN et al., 2001; ANDREWS et al., 1998; DOHERTY et
al., 2001; FELBER et al., 2000; HESPEL et al., 2001; KLIVENYI et al., 1999;
KLOPSTOCK et al., 2000; MALCON; KADDURAH-DAOUK; BEAL, 2000; WILLER et
al., 2000). Fuld e colaboradores (2005) verificaram que a creatina se mostrou capaz
de melhorar o quadro clínico de pacientes com obstrução pulmonar crônica
principalmente pelo fortalecimento da musculatura periférica.
Embora os efeitos farmacológicos da creatina tenham sido investigados, o
comportamento da creatina em outros tecidos ainda não está bem esclarecido.
Algumas pesquisas têm se focado nos marcadores clínicos para avaliar os possíveis
riscos e danos teciduais causados pela suplementação com creatina (BIZZARINI;
DE ANGELIS, 2004; ROBINSON et al., 2000; TAES et al., 2003). Outros têm
associado a suplementação de creatina à condições patológicas, como cãibras
musculares, desidratações, disfunções renais e hepáticas (PRITCHARD; KAIRA,
1998; TARNOPOLSKY et al., 2003; ZIEGENFUSS et al., 1998). Vieira e
colaboradores (2007) demonstram que a creatina aumenta a hiperresponsividade
pulmonar, promovendo inflamação local, aumento de fibras colágenas, elastina e
espessamento da musculatura lisa em camundongos imunossuprimidos (Balb/C).
Estudos realizados por Yu e Deng (2000) propuseram um modelo elucidatório para a
possibilidade da toxicidade tecidual causada pela creatina, sendo devido à
conversão química da molécula de creatina em uma molécula de formaldeído,
ocasionando então a lesão tecidual (figura 5).
Figura 5: Esquema do metabolismo de creatina/creatinina produzindo formaldeído.
(YU; DENG, 2000).
2.8 Óxido nítrico e estresse oxidativo
O óxido nítrico (NO) tem sido reconhecido como um modulador essencial da
biologia pulmonar, assim como um mediador importante na inflamação aguda
(NATHAN, 1997). O NO é sintetizado pela chamada óxido nítrico sintase (NOS), da
qual existem duas formas, a formas constitutiva (cNOS), dividindo-se em NOS1,
neuronal (nNOS) e NOS3, endotelial (eNOS); e a induzida (iNOS) ou NOS2.
Enquanto a isoforma cNOS normalmente está presente nas funções de regulação
fisiológica, a isoforma iNOS é expressa diante de um estímulo inflamatório
apropriado, como por exemplo, LPS e citocinas (KLEINERT; SCHWARZ;
FORSTERMANN, 2003).
A iNOS é expressa no parênquima pulmonar sendo intensamente regulada pelo
estímulo inflamatório (NATHAN, 1997). O NO sintetizado pela iNOS é uma espécie
de oxigênio reativo envolvida na regulação da resposta imune, e participa de
diversos tipos de respostas inflamatórias agudas e crônicas, incluindo a asma
brônquica (RICCIARDOLO et al., 2004). Entre muitos mediadores possíveis para a
LPA, o NO, as espécies reativas do oxigênio (ERO), e as citocinas pró-inflamatórias
foram relacionadas à patogênese da lesão pulmonar associada à sepse e a SDRA
(NUMATA et al., 1998). Algumas evidências indicam que grandes quantidades de
NO produzido pela iNOS reagem rapidamente com o radical do superóxido para
formar peroxinitrito (ONOO-) (SITTIPUNT et al., 2001), que é encontrado nas fases
iniciais do choque causado por endotoxinas bacterianas, demonstrando ser um
importante sinalizador de moléculas envolvidas na resposta induzida pelo LPS
(BHATTACHARYYA; BISWAS; DATTA, 2004).
O aumento da expressão de iNOS foi demonstrada in vitro em macrófagos
alveolares de pacientes com SDRA (SITTIPUNT et al., 2001; KOBAYASHI et al.,
1998) e em células epiteliais de pulmão humano expostas à citocinas inflamatórias
(MARKS-KONCZALIK; CHU; MUSGO, 1998).
Nos modelos animais, camundongos com deficiência na produção de iNOS
apresentaram parâmetros menos severos de lesão pulmonar na endotoxemia
sistêmica, quando comparados com animais controle do tipo selvagem (KRISTOF et
al., 1998).
Além disso, as células epiteliais das vias aéreas são outra fonte de ERO, entre
estes tipos celulares poderíamos citar as células epiteliais alveolares do tipo II que
possuem a capacidade de liberar peróxido de hidrogênio (H2O2) e ânion superóxido
(O2-) (RAHMAN, 2005). O processo inflamatório associado ao recrutamento e
ativação de tipos celulares fagocitários (neutrófilos) e células mononucleares
também podem desempenhar uma papel na liberação de ERO, expondo a célula a
um rompimento oxidativo ocasionado, desta forma, lesão das vias aéreas
(LAGENTE et al., 2008). Este excesso de perturbações no equilíbrio entre oxidantes
e antioxidantes resulta no estresse oxidativo (VALENCA et al., 2008).
Os oxidantes são conhecidos por interferir no balanço protease/antiprotease
induzindo a remodelamento das vias aéreas e enfisema (RAHMAN; MACNEE, 1996;
BARNES; SHAPIRO; PAUWELS, 2003). De fato, componentes da matriz pulmonar,
como a elastina e colágeno, podem ser diretamente degrada por oxidantes
(CANTIN; CRYSTAL, 1985), os quais também interferem na síntese de elastina e
reparo tecidual (LAURENT; JANOFF; KAGAN, 1983). O balanço fisiológico de ERO
ultimamente é determinado pela proporção de produção de O2, do metabolismo de
O2 pela superóxido dismutase (SODs) endógena e a retirada da produção de H2O2
via enzimas antioxidantes (catalase ou glutationa peroxidase) (ADLER et al., 1999;
HADDAD, 2002; MILLER; DRUMMOND; SOBEY, 2006).
O estresse oxidativo ocorre quando o fluxo de ERO ou da geração de radicais
livres excede a defesa antioxidante disponível. As células fagocitárias são
provavelmente as que desempenham um papel mais importante na resposta
inflamatória da COPD produzindo ERO (HOIDAL, et al. 1981; MORRISON, et al.
1999).
As ERO são capazes de obter uma variedade de mudanças patológicas,
incluindo peroxidação de lipídeos, proteínas e DNA e a produção de quimioatrativos,
aumentando a hiperreatividade, secreção e permeabilidade vascular em vias aéreas
asmáticas (BARNES, 1990; HENRICKS; NIJKAMP, 2001; ANDREADIS et al., 2003).
Essas alterações acabam por resultar em um aumento da liberação de mediadores
pelo epitélio, os quais são potentes no recrutamento de células do sistema imune
(KIM et al., 2008).
2.9 Sinalização celular e migração leucocitária
Os macrófagos alveolares são a primeira linha de defesa da imunidade inata no
trato respiratório (BERG et al., 1993; STRIETER, BELPERIO, KEANE, 2002). A
ativação direta da transcrição de fator nuclear (NF)-κB, causa uma liberação de
macrófagos por mediadores como fator de necrose tumoral (TNF)-α, quimiocinas, e
a expressão de iNOS (PALSSON-MCDERMOTT, O’NEILL, 2004; VERSTAK,
HERTZOG, MANSELL, 2007; BLACKWELL, CHRISTMAN, 1997). Embora os
macrófagos alveolares sejam considerados responsáveis pelo início da cascata
inflamatória no pulmão, a ativação do NF-κB do epitélio das vias aéreas é suficiente
para promover uma inflamação neutrofílica nas vias aéreas (POYNTER, IRVIN,
JANSSEN-HEININGER, 2003; PARK, CHRISTMAN, 2006).
Células inflamatórias como macrófagos, linfócitos, mastócitos, células B e
eosinófilos têm sido propostos como capazes de desempenhar de forma crítica o
início, desenvolvimento e cronicidade de doenças no trato respiratório. A correlação
entre o número de eosinófilos e a severidade da asma brônquica também tem sido
reportada (WILLIAMS; GALLI, 2000; ELIAS et al., 2003; AKDIS et al., 2006; EDER et
al., 2006; UMETSU; DEKRUYFF, 2006).
Evidencias sugerem que o recrutamento de eosinófilos até o local da inflamação
é um processo multifatorial, envolvendo interação entre os eosinófilos e o endotélio
através da interação de moléculas de adesão e agentes quimiotáticos gerados no
local que direcionou a migração das células até a área inflamada (GONLUGUR;
EFEOGLU, 2004).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
O presente projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da Universidade do Vale do Paraíba, estando em conformidade com as normas
estabelecidas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), sob
protocolo n° A088/CEP/2007 (Anexo).
Foram utilizados 30 (trinta) camundongos Balb-C machos, pesando 20 ± 5 g,
obtidos do biotério do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica da
Universidade de Campinas (CEMIB-UNICAMP) e mantidos no biotério do
Laboratório de Fisiologia e Farmacodinâmica do Instituto de Pesquisa e
Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba (IP&D-UNIVAP), em
condições de ciclo 12h/12h claro/escuro, ração e água ad libitum.
3.2 Grupos Experimentais
O trabalho constou de 6 (seis) grupos experimentais, divididos da seguinte
maneira:
Grupo Controle Salina – Controle (n = 5)
Grupo LPS – LPS (n = 5)
Grupo tratado com Creatina na dose de 0,5 g/kg – Cr 0,5 g/kg (n = 5)
Grupo tratado com Creatina na dose de 2 g/kg – Cr 2 g/kg (n = 5)
Grupo tratado com Creatina na dose de 0,5 g/kg e instilado com LPS – Cr 0,5 g/kg +
LPS (n = 5)
Grupo tratado com Creatina na dose de 2 g/kg e instilado com LPS – Cr 2 g/kg +
LPS (n = 5)
3.3 Tratamento e Suplementação da Creatina
Os tratamentos foram realizados através da administração oral com auxílio de
uma agulha de gavagem. Nos grupos tratados com creatina monohidratada a
suplementação foi realizada diariamente durante um período de 30 dias (VIEIRA et
al., 2007) e as doses adotadas (0,5 g/kg e 2,0 g/kg) foram baseadas nos trabalhos
de Vieira e colaboradores (2007) e Ipsiroglu e colaboradores (2001), sendo
dissolvidas em 0,5 e 1 ml de solução salina 0,9 % (FIOCRUZ, 2005),
respectivamente.
Os grupos Controle e LPS foram tratados diariamente, com mesmo volume de
salina durante o período de 30 dias.
3.4 Indução da Inflamação Pulmonar Aguda por LPS
Os grupos induzidos com LPS (sorotipo 055:B55, Sigma Chemical Co.),
receberam a endotoxina via intranasal, com o auxílio de uma micropipeta automática
de 100 µl, na dose de 10 µg, diluído em 60 µl de salina 0,9 % apirogênica
(DELEUZE et al., 2004). A instilação ocorreu vinte e quatro horas antes da
eutanásia. Estudos anteriores indicam que a inflamação pulmonar e hiperreatividade
brônquica se iniciam em, aproximadamente, 4 horas após a exposição ao LPS,
alcançam concentração máxima em 24 horas com declínio após 48 horas decorridas
da administração (GONÇALVES DE MORAES et al., 1996; SZARKA et al., 1997).
3.5 Protocolo de Anestesia e Eutanásia
Após 24 horas após a indução de LPS nos grupos induzidos e/ou ao término do
período de 30 dias de tratamento, os animais foram previamente analgesiados com
xilazina (40 mg/kg) por via intraperitoneal (i.p.) e em seguida anestesiados com
ketamina (50 mg/kg, i.p.), traqueostomizados e canulados para a coleta do LBA.
Após a coleta do LBA os animais foram eutanasiados com solução de KCl (10 %)
administrado por via intracardíaca para posterior retirada dos pulmões.
3.6 Coleta do Lavado Broncoalveolar
Após sedação, os animais foram traqueostomizados e canulados com uma
cânula de polietileno. Em seguida realizou-se 3 lavagens sucessivas com 0,5 ml de
solução tampão fosfato (PBS) cada, totalizando um volume de 1,5 ml (HOFFMAN,
2008).
Parte do volume recuperado do LBA foi utilizada para contagem de células
inflamatórias e o restante foi centrifugado 1000 rpm por 10 min a 4 °C. O
sobrenadante foi utilizado para determinação de nitrito e nitrato e o precipitado de
células foi ressuspendido para a contagem diferencial de leucócitos (SZARKA, et al.,
1997).
3.7 Coleta e contagem de leucócitos
Para a contagem do número total de células presentes no LBA utilizou-se 20 µl
do LBA coletado e diluído em 380 µl de solução de Turk (0,2 % de cristal de violeta
em 30 % de ácido acético). Logo após, alíquotas desta diluição foram utilizadas para
determinar o número total de leucócitos em câmara de Neubauer, através do
emprego de um microscópio óptico Nikon® OLYMPUS CH30 sob aumento de 400
vezes. Os resultados foram expressos como número total de leucócitos por
cavidade.
Para o valor final da contagem total de leucócitos utilizou-se o seguinte Fator de
Correção:
Valor da contagem x 50 x 105 (Resultado desta multiplicação corresponde ao
valor real). Onde:
•
50 é o valor da diluição (líquido de Turkey)
•
105 é o fator da lavagem da cavidade.
Para a contagem diferencial dos leucócitos do LBA o precipitado de células
obtido após a centrifugação foi ressuspendido em mesmo volume de solução
isotônica de cloreto de sódio (NaCl 0,9 %), uma alíquota de 100 µl da suspensão
celular foi utilizada para preparações de lâminas do citoesfregaço realizadas em
citocentrífuga (FANAEM – Citospim®) a uma velocidade de 800 rpm durante 10
minutos e, posteriormente, coradas com corante hematológico Instant Prov®. A
contagem diferencial das células foi realizada com auxílio de um microscópio óptico
com objetiva de imersão em óleo sob aumento de 1000x, onde foram contadas pelo
menos 100 células, classificadas, com base em critérios morfocitológicos
convencionais, como células monomorfonucleares (MMN) ou polimorfonucleares
(PMN), sendo destacada a presença de neutrofilia (BOZINOVSKI et al., 2004;
CARRICK, et al., 1997; JIN et al., 2007; REUTERSHAN et al., 2005).
3.8 Determinação da produção de óxido nítrico
Os níveis de NO no pulmão foram estimados a partir da determinação de nitrito e
nitrato baseado no método de reação de Griess (GREEN et al., 1982). Em uma
placa de 96 poços uma alíquota de 100 µl da amostra foi adicionada a 100 µl de
reagente de Griess (1 % sulfanilamida em ácido fosfórico 5 % e 0,1 % de
diidrocloreto de naftiletilenodiamina em água; 1:1) e incubado à temperatura
ambiente por 10 minutos seguida da medição da absorbância pela leitura das placas
no comprimento de onda de 540 nm em leitor de Elisa (Biotec®). Os resultados
obtidos em µM foram determinados a partir de uma curva padrão realizada com
nitrito de sódio em concentração de 200 a 0,195 µM. As dosagens e a curva padrão
foram realizadas em duplicata (LI; DONALDSON; MACNEE, 1998).
3.9 Análise Histológica
Após a coleta os pulmões foram pré-fixados através de perfusão de 0,3 ml de
formol 10 %. Imediatamente após a pré-fixação os pulmões foram armazenados,
permanecendo por período mínimo de 24 horas e máximo de 48 horas num
recipiente contendo formol 10 %. Após esse período os pulmões foram submetidos à
rotina histológica comum para emblocamento (TOLOSA et al., 2003). Os pulmões
foram emblocados inteiros e utilizados para a confecção das lâminas histológicas.
Os cortes foram realizados em micrótomo Spencer 820 com 5 µm de espessura e
posteriormente montados sob lâmina para microscopia. A coloração foi realizada
com Hematoxilina-Eosina (H.E.). Os cortes foram observados e fotografados em
microscópio óptico (Nikon Eclipse E200) sistema Cool Pix 5400, e a ampliação
seguiu os padrões comerciais de 40, 100, 400 e 1000x.
A análise anatomopatológica foi realizada com o objetivo de determinar o índice
de lesão no tecido pulmonar. O índice de lesão foi realizado segundo os critérios
descritos por Curtis e colaboradores (1990), como segue:
Seis categorias foram classificadas separadamente em cada corte:
I) a região perivenosa;
II) a região broncoarterial;
III) mudanças no endotélio venoso;
IV) mudanças no endotélio arterial;
V) inflamação na parede arterial; e
VI) as paredes alveolares longe das vasos principais.
A classificação foi baseada na região mais severamente inflamada em cada
corte. Depois que os cortes foram examinados para identificar a resposta máxima
para cada categoria, que foi designada 3+, outro corte representado classes leves e
moderadas
da
inflamação
foram
selecionadas
e
designaram
1+
e
2+,
respectivamente. Os critérios descritivos específicos para o sistema de classificação
são dados na tabela 1; achados normais foram classificados como zero. Os cortes
designados foram usados como uma referência de classificação para os demais
cortes.
Tabela 1: Critério de classificação histológica
(CURTIS et al., 1990)
Regiões Perivenosas
1+ Algumas veias obstruídas por células inflamatórias
2+ A maioria de veias cercadas por uma camada fina (1-5 camadas de células) de células
inflamatórias
3+ A maioria de veias cercadas por uma camada grossa (> 5 camadas de células) de células
inflamatórias
Regiões Periarterial e peribronquial
Mesmos critérios de pontuação adotados para as regiões perivenosas
Mudanças no endotélio venoso
1+ Dispersas células inflamatórias aderentes ao endotélio; células endoteliais lisas
2+ Células endoteliais apresentando hipertrofia; 1-3 veias por seção apresentando sobreposição
e/ou amontoamento de células inflamatórias ao longo do endotélio
3+ Células endoteliais apresentando hipertrofia; >3 veias por seção apresentando sobreposição
e/ou amontoamento de células inflamatórias
Mudanças no endotélio arterial
Mesmos critérios de pontuação adotados para as mudanças no endotélio venoso
Inflamação na parede arterial
0 Ausência de inflamação e fibrose na parede arterial
1+ Presença de inflamação e/ou fibrose na parede arterial
Inflamação da parede alveolar
1+ Aumento do número de células inflamatórias nas paredes alveolares
2+ Como descrito acima acrescido de 1-3 regiões por a corte apresentando exsudado alveolar e
atelectasia
Como acima acrescido >3 regiões por a corte apresentando o exsudado alveolar e
3+ atelectasia
3.10 Análise Estatística
Para todos os dados obtidos foram realizados cálculos de média e erro padrão
da média. As diferenças entre grupos controle e tratados foram analisadas pelo teste
de variança (ANOVA) seguida de teste de Tukey-Kramer para comparação múltipla
onde foram considerados valores significativos para p < 0,05.
4 RESULTADOS
4.1 Contagem de leucócitos no LBA
Através do estímulo dado pelo LPS é possível produzir uma reposta
inflamatória aguda com presença de células PMN e MMN presentes no LBA.
A migração leucocitária foi avaliada após 30 dias de tratamento nos grupos
controle (salina); induzido com LPS (salina + LPS); suplementados com creatina
(nas doses de 0,5 g/kg e 2 g/kg) e suplementados com creatina e induzidos com
LPS (0,5 g/kg + LPS e 2 g/kg + LPS). A contagem do número total de leucócitos que
migraram para o LBA foi feita após o intervalo de 24 horas do último tratamento
(grupos controle e creatina nas doses de 0,5 g/kg e 2 g/kg) ou após a instilação
intranasal de LPS (nos grupos LPS e Creatina nas doses de 0,5 g/kg e 2 g/kg +
LPS).
Na figura 6 estão expressos os resultados do experimento, podendo-se
verificar a ação do LPS e/ou administração crônica de creatina sobre a migração
leucocitária no LBA de camundongos (contagem total). Nos grupos tratados com
creatina em ambas as doses com ou sem induzido com LPS e no grupo LPS houve
um aumento estatisticamente significativo da migração em relação ao grupo
controle. Também se pode verificar um aumento estatisticamente significativo nos
grupos tratados com creatina na dose de 2 g/kg com ou sem indução com LPS em
relação aos grupos LPS e suplementados com creatina na dose de 0,5 g/kg com ou
sem indução por LPS.
3000
*#
*#
2000
1000
*
*
*
LP
S
C
r2
g
+
,5
g
C
r0
+
LP
S
g
C
r2
,5
g
C
r0
ol
tr
on
C
LP
S
0
e
Número de células do LBA (x106 )
Leucócitos Totais
Grupos
Figura 6: Contagem total de células presentes no lavado broncoalveolar.
Contagem total de células presentes no lavado broncoalveolar após 30 dias de tratamento com salina
(grupos controle e LPS) ou creatina (grupos Cr 0,5g/kg; Cr 2g/kg; Cr 0,5g/kg + LPS e Cr 2g/kg + LPS)
e após 24 horas da instilação intranasal com LPS (grupos LPS; Cr 0,5g/kg + LPS e Cr 2g/kg + LPS).
Os dados representam a média ± EPM de 5 experimentos. * p< 0, 01 quando comparados aos grupos
controle; # p< 0, 001 quando comparados aos grupos LPS e tratados com creatina na dose de 0,5
g/kg com ou sem indução com LPS.
A contagem diferencial dos leucócitos, presentes no LBA, mostrou uma
diminuição de células MMN e, como característica da indução por LPS, intensa
neutrofilia (dentre as células PMN), conforme classicamente descrito na literatura.
Na figura 7 nota-se um aumento estatisticamente significativo na migração de
neutrófilos para o LBA nos grupos LPS e suplementados com creatina nas doses de
0,5 g/kg e induzidos com LPS e 2 g/kg com ou sem indução com LPS em relação ao
grupo controle. Embora o grupo induzido por LPS sem suplementação tenha
apresentado maior proporção de neutrófilos (90 %), em relação ao volume de células
recrutadas para o LBA este apresentou um menor número quando comparado aos
grupos suplementados com creatina nas doses de 2 g/kg com ou sem indução com
LPS e no grupo creatina na dose de 0,5 g/kg e induzidos com LPS.
2000
#
*
#
1500
*
1000
*
*
500
+
g
C
r2
+
,5
g
C
r0
LP
S
LP
S
g
C
r2
,5
g
C
r0
on
C
LP
S
ol
e
0
tr
Número de neutrófilos no LBA (x106 )
Neutrófilos
Grupos
Figura 7: Contagem de neutrófilos presentes no lavado broncoalveolar.
Contagem de neutrófilos presentes no lavado broncoalveolar após 30 dias de tratamento com salina
(grupos controle e LPS) ou creatina (grupos Cr 0,5g/kg; Cr 2g/kg; Cr 0,5g/kg + LPS e Cr 2g/kg + LPS)
e após 24 horas da instilação intranasal com LPS (grupos LPS; Cr 0,5g/kg + LPS e Cr 2g/kg + LPS).
Os dados representam a média ± EPM de 5 experimentos. * p< 0, 001 quando comparados ao grupo
controle; # p< 0,001 quando comparados aos grupos LPS e tratados com creatina na dose de 0,5 g/kg
com ou sem indução com LPS.
4.2 Determinação da produção de óxido nítrico
A partir dos valores de conhecidos determinados na curva padrão e da leitura
da absorbância em 540 nm foi construída uma reta padrão, representada na
figura 8.
absorbância em 540 nm
y = 0,01 . x + 0,0813
2
R = 0,9971
2,0
Absorbância
1,5
1,0
0,5
0,0
0
50
100
150
200
Concentração (µM)
Figura 8: Curva padrão da absorbância em 540 nm em relação a concentrações conhecidas de
nitrito.
Curva padrão realizada com nitrito de sódio em concentrações de 200 a 0,195 µM. As amostras
foram analisadas em duplicata e a leitura do espectro de absorção foi realizada com auxílio de leitor
de Elisa a 540 nm. R2 = correlação entre os pontos disponíveis da reta de regressão.
A determinação da concentração de nitrito foi calculada pela relação entre
concentração e absorbância estabelecida na equação da reta padrão. A
concentração de nitrito se mostrou diminuída nos grupos LPS, Cr 0,5g/kg, Cr 2 g/kg
e 0,5g/kg + LPS e aumentada no grupo Cr 2g/kg, entretanto a variação entre os
grupos não foi estatisticamente significativa (figura 9).
Dosagem de NO
Concentração de NO (µM)
15
10
5
LP
S
g/
kg
r2
C
C
r0
,5
C
g/
kg
r2
+
+
LP
S
g/
kg
g/
kg
C
r0
,5
LP
S
C
on
tr
ol
e
0
Grupos
Figura 9: Concentração de nitrito presente no lavado broncoalveolar.
Dosagem de óxido nítrico presente no LBA após 30 dias de tratamento com salina (grupos controle e
LPS) ou creatina (grupos Cr 0,5g/kg; Cr 2g/kg; Cr 0,5g/kg + LPS e Cr 2g/kg + LPS) e 24 horas da
instilação intranasal de LPS (grupos LPS; Cr 0,5g/kg + LPS e Cr 2g/kg + LPS). As amostras foram
incubadas por 10 minutos com reagente de Griess à temperatura ambiente, analisadas em duplicata
e a leitura do espectro de absorção foi realizada com auxílio de leitor de Elisa a 540 nm. Os dados
representam a média ± EPM de 5 experimentos.
4.3 Análise Histológica
O tecido pulmonar do grupo controle se mostrou íntegro e com suas
características morfológicas preservadas. A figura 10 mostra uma fotomicrografia
ótica do tecido pulmonar onde se identifica: o bronquíolo segmentar; bronquíolos
propriamente ditos; bronquíolo terminal dividindo-se em bronquíolos respiratórios
(ramos curtos de paredes delgadas), e sua ramificação em ductos alveolares de
onde emergem os sacos alveolares; e arteríolas.
Em um maior aumento (figuras 11 e 12) podemos visualizar que permanecem
preservadas as estruturas do epitélio respiratório simples, com células ciliadas do
bronquíolo terminal; alvéolos e paredes alveolares; e arteríolas com células
endoteliais lisas.
Figura 10: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Controle.
Observam-se: bronquíolo segmentar (BS); bronquíolo propriamente dito (BL); bronquíolo terminal
(BT); bronquíolo respiratório (BR); ducto alveolar (DA); arteríolas (AL); e sacos alveolares (SA). (H.E.
100x; Foto: FERRARI, E.F.).
Figura 11: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Controle.
Observam-se: bronquíolo terminal (BT); bronquíolo respiratório (BR); epitélio respiratório (ER); ductos
alveolares (DA); sacos alveolares (SA); alvéolos (AV) e arteríolas (AL). (H.E. 400x; Foto: Ferrari,
E.F.).
Figura 12: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Controle.
Observam-se: bronquíolo propriamente dito (BL); epitélio respiratório (ER); e alvéolos (AV). (H.E.
1000x; Foto: FERRARI, E.F.).
Nos animais suplementados cronicamente com creatina na dose de 0,5 g/kg o
tecido pulmonar não apresentou alterações morfológicas. Na figura 13 podem ser
identificadas as estruturas: bronquíolos segmentar, bronquíolo terminal e bronquíolo
respiratório; ductos e sacos alveolares; epitélio respiratório ciliado; presença de
cartilagem hialina nas proximidades do brônquio segmentar; vênulas, artérias e
arteríolas.
Em maior aumento (figura 14) visualizam-se os bronquíolos propriamente
ditos com seu epitélio respiratório íntegro e células ciliadas; e os sacos alveolares e
alvéolos sem alterações. Há presença de cartilagem nas proximidades dos
bronquíolos e arteríolas com presença de hemácias em seu interior, mas sem
mudanças no endotélio arterial. Também pode ser observado um pequeno acúmulo
de neutrófilos depositados na região peribroncovascular.
Na figura 15 nota-se também presença de pequena fibrose na região
peribroncovascular, através do acúmulo de colágeno, sendo característica preliminar
de inflamação da parede arterial.
Figura 13: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg.
Observam-se: bronquíolo segmentar (BS); bronquíolo terminal (BT); bronquíolo respiratório (BR);
ductos alveolares (DA); sacos alveolares (SA); epitélio respiratório (ER); cartilagem (CA); vênula (VE);
artérias (AP) e arteríolas (AL). (H.E. 100x; Foto: FERRARI, E.F.).
Figura 14: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg.
Observam-se: bronquíolo propriamente dito (BL); epitélio respiratório (ER); cartilagem (CA); sacos
alveolares (SA); alvéolos (AV); arteríolas (AL); hemácias ( ) e acúmulo de neutrófilos ( ). (H.E.
400x; Foto: FERRARI, E.F.).
Figura 15: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg.
Observam-se: bronquíolo propriamente dito (BL); epitélio respiratório (ER); arteríola (AL), hemácias
( ) e colágeno (cabeça de seta). (H.E. 1000x; Foto: FERRARI, E.F.).
Nos animais suplementados cronicamente com creatina na dose de 2 g/kg
identificamos expressivas alterações anatomopatológicas no tecido pulmonar. Na
figura 16 observamos um denso agregado celular peribronquial e perivascular,
composto, primariamente, por células inflamatórias PMN; as arteríolas e vênulas
possuem hemácias em seu interior sendo, algumas, ocluídas por completo.
Na figura 17 visualizamos o epitélio respiratório do bronquíolo terminal com
células danificas sem as ciliações características, e a presença de hemácias
depositadas nos alvéolos pulmonares. Na figura 18 e 19 podemos identificar a
infiltração e acúmulo de neutrófilos na região do lúmen bronquial e nos espaços
alveolares.
Figura 16: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg.
Observam-se: bronquíolo propriamente dito (BL); artéria (AP); arteríolas (AL); vênula (VE); septo (SE)
sacos alveolares (SA), acúmulo de neutrófilos ( ) e hemácias ( ). (H.E. 100x; Foto: FERRARI,
E.F.).
Figura 17: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg.
Observam-se: bronquíolo terminal (BT); bronquíolo respiratório (BR); epitélio respiratório (ER); sacos
alveolares (SA); alvéolos (AV); arteríolas (AL); acúmulo de neutrófilos ( ) e hemácias ( ). (H.E.
400x; Foto: FERRARI, E.F.).
Figura 18: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg.
Observam-se: bronquíolo propriamente dito (BL); epitélio respiratório (ER) e acúmulo de neutrófilos
( ). (H.E. 1000x; Foto: FERRARI, E.F.).
Figura 19: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg.
Observam-se: acúmulo de neutrófilos dispersos na região alveolar ( ). (H.E. 1000x; Foto: FERRARI,
E.F.).
No grupo onde a hiperreatividade pulmonar aguda foi induzida com LPS, o
tecido pulmonar apresentou poucas alterações morfológicas, porém há presença de
hemorragia intensa e consistente nos vasos sanguíneos (figura 20) e também
hemácias nos alvéolos pulmonares (figura 21).
Na figura 20 observam-se os bronquíolos segmentar, terminal, respiratório e
bronquíolo propriamente dito; também podemos identificar claramente os ductos e
sacos alveolares; vênulas, artéria e; arteríolas. Já nas figuras 21 e 22 verificamos,
em maior aumento, que a estrutura das células do epitélio respiratório bem como
dos alvéolos permanece íntegra, porém há presença de fibrose na região
peribroncovascular.
Figura 20: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo LPS.
Observam-se: bronquíolo segmentar (BS); bronquíolo terminal (BT); bronquíolo respiratório (BR);
bronquíolo propriamente dito (BL); ductos alveolares (DA); sacos alveolares (SA); vênula (VE); artéria
(AP); arteríolas (AL) e hemácias ( ). (H.E. 100x; Foto: FERRARI, E.F.).
Figura 21: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo LPS.
Observam-se: bronquíolo propriamente dito (BL); epitélio respiratório (ER); sacos alveolares (SA);
alvéolos (AV); arteríolas (AL); hemácias ( ) e acúmulo de neutrófilos ( ). (H.E. 400x; Foto:
FERRARI, E.F.).
Figura 22: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo LPS.
Observam-se: bronquíolo propriamente dito (BL); epitélio respiratório (ER); alvéolos (AV); hemácias
( ) e colágeno (cabeça de seta). (H.E. 1000x; Foto: FERRARI, E.F.).
Nos animais suplementados cronicamente com creatina na dose de 0,5 g/kg e
expostos ao LPS nota-se uma perda da arquitetura morfofuncional, com
degeneração dos sacos alveolares (figura 23) e epitélio respiratório (figuras 24 e 25).
Na figura 23 podem-se observar os bronquíolos terminal, respiratório e
propriamente dito, os ductos e sacos alveolares, artéria e arteríolas com presença
hemácias nas proximidades e lúmen arterial.
Na figuras 24 e 25 podemos verificar um acúmulo de neutrófilos nas paredes
alveolares da região peribronquial, diminuição da camada muscular dos bronquíolos,
desarranjo alveolar e acúmulo de hemácias e neutrófilos nos alvéolos e lúmen
arterial.
Figura 23: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg + LPS.
Observam-se: bronquíolo terminal (BT); bronquíolo respiratório (BR); ductos alveolares (DA);
bronquíolo propriamente dito (BL); artéria (AP); arteríola (AL); sacos alveolares (SA) e hemácias ( ).
(H.E. 100x; Foto: FERRARI, E.F.).
Figura 24: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg + LPS.
Observam-se: bronquíolo segmentar (BS); bronquíolo propriamente dito (BL); artéria (AP); alvéolos
(AV); hemácias ( ) e neutrófilos ( ). (H.E. 400x; Foto: FERRARI, E.F.).
Figura 25: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 0,5 g/kg + LPS.
Observam-se: bronquíolo propriamente dito (BL); alvéolos (AV) e acúmulo de neutrófilos (
1000x; Foto: FERRARI, E.F.).
). (H.E.
No grupo tratado cronicamente com creatina na dose de 2 g/kg e induzidos a
hiperreatividade pulmonar aguda com LPS verificamos intensa desestruturação da
arquitetura morfofuncional pulmonar, um desarranjo dos sacos alveolares, intenso
acúmulo de neutrófilos na região peribroncovascular e atelectasia proeminente
(figura 26). Entretanto, não pode ser visualizado neste aumento presença de
hemácias nos vasos sanguíneos ou alvéolos. Podemos identificar os bronquíolos
segmentar, propriamente dito, terminal e respiratório; ductos e sacos alveolares,
vênula e arteríolas.
Na figura 27 nota-se a diminuição da camada muscular dos bronquíolos e
perda da ciliação do epitélio respiratório; há intenso acúmulo de neutrófilos na região
peribrônquica e presença de fibrose na parede arterial. Apesar da intensidade da
reação foi observada apenas uma pequena quantidade de hemácias nos alvéolos,
sem hemorragia ou obstrução vascular.
Figura 26: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg + LPS.
Observam-se: bronquíolo segmentar (BS); bronquíolo propriamente dito (BL); bronquíolo terminal
(BT); bronquíolo respiratório (BR); ductos alveolares (DA); sacos alveolares (SA); vênula (VE);
arteríolas (AL) e acúmulo de neutrófilos ( ). (H.E. 100x; Foto: FERRARI, E.F.).
Figura 27: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg + LPS.
Observam-se: bronquíolo propriamente dito (BL); epitélio respiratório (ER); arteríola (AL); alvéolos
(AV); hemácias ( ); acúmulo de neutrófilos ( ) e colágeno (cabeça de seta). (H.E. 400x; Foto:
FERRARI, E.F.).
Figura 28: Fotomicrografia do tecido pulmonar Grupo Creatina 2 g/kg + LPS.
Observam-se: bronquíolo propriamente dito (BL); epitélio respiratório (ER); alvéolo (AV) e acúmulo de
neutrófilos ( ). (H.E. 1000x; Foto: FERRARI, E.F.).
Na tabela 2 estão apresentados os critérios analisados na determinação da
lesão tecidual seguindo os parâmetros de classificação histológica descritos por
Curtis e colaboradores (1990) e a respectiva pontuação alcançada pelo grupo
experimental.
Pode-se constatar que, exceto o grupo Cr 0,5 g/kg, todos os grupos
analisados apresentaram diferenças significativas em relação ao grupo controle. Os
grupos suplementados com creatina na dose de 2 g/kg com ou sem indução da
hiperreatividade com LPS apresentaram resultados similares de lesão tecidual
pulmonar, alcançando a pontuação máxima dos critérios analisados e diferenças
significativas em relação aos grupos suplementados com 0,5 g/kg com ou sem
indução com LPS e o grupo LPS sem suplementação.
O grupo suplementado com 0,5 g/kg de creatina e instilados com LPS exibiu
maiores danos teciduais quando comparados ao grupo suplementado sem indução
da hiperreatividade e ao grupo somente induzido por LPS, sendo estatisticamente
significativos.
No grupo induzido com LPS sem suplementação, os danos teciduais
encontrados tiveram classificação intermediária de lesão tecidual, apresentando
diferença significativa também em relação ao grupo suplementado com creatina na
dose de 0,5 g/kg.
Tabela 2: Classificação histológica para determinação da lesão pulmonar.
Classificação qualitativa das alterações histológicas encontradas no pulmão após o tratamento
durante 30 dias com salina (controle e LPS) ou creatina nas doses de 0,5 g/kg e 2 g/kg e após 24
horas da indução com LPS (grupos LPS e creatina nas doses de 0,5 g/kg e 2 g/kg + LPS). A
pontuação e descrição dos critérios analisados estão descritos na tabela 1. Os dados representam a
média ± E.P.M. de 3 experimentos. p<0,01 * quando comparados ao grupo controle; # quando
comparados ao grupo Cr 0,5 g/kg; ● quando comparados ao grupo LPS; α quando comparados ao
grupo Cr 2 g/kg; β quando comparados ao grupo Cr 0,5 g/kg + LPS.
Inflamação na parede
alveolar
Controle
0
0
0
0
0
0
0
Cr 0,5 g/kg
0
0
0
0
1*
0
1
Cr 2 g/kg
3*#●
3*#●
3*#●
3*#●
1*
3*#●
16
LPS
1*#
2*#
1*#
1*#
1*
1*#
7
Região perivenosa
Grupos
experimentais
Cr 0,5 g/kg + LPS 1*
Cr 2 g/kg + LPS
Região periarterial e
peribronquial
Inflamação na parede
arterial
Mudanças no endotélio
arterial
Mudanças no endotélio
venoso
Critérios analisados
3*
#α
#●β
2*
#α
3*
#● β
1*
#α
3*
#● β
2*
#α
3*
#● β
1*
1*
Pontuação
total da lesão
2*
#● α
10
3*
#● β
16
5 DISCUSSÃO
O pulmão é o principal órgão que funciona como porta de entrada no corpo para
poluentes inalados. A interação dos poluentes com as células do trato respiratório
podem fornecer informações a respeito da toxicidade e da natureza do poluente
capaz de induzir uma resposta inflamatória (HENDERSON, 2005).
A resposta inflamatória endógena do organismo após exposição às endotoxinas
promove alterações diretas e indiretas sobre as células, causando lesões, alterando
suas funções, deflagrando a síntese, liberando ou ativando a cascata de mediadores
inflamatórios (D’ACAMPORA et al., 2004). As células afetadas liberam mediadores
no fluído epitelial de revestimento, que podem ser detectados através de lavagens
com salina no trato respiratório. O fluído do LBA conterá indicadores bioquímicos e
citológicos (biomarcadores) da resposta celular ao poluente inalado. O fato de que
estes indicadores podem ser determinados fornece meios de desenvolver uma curva
dose-resposta para a toxicidade de inalação do agente de interesse, fornecendo
assim um nível de exposição sem efeitos tóxicos para finalidades regulatórias
(HOFFMAN, 2008). A contagem de células totais e diferenciais no LBA é um
indicativo padrão de resposta inflamatória no trato respiratório, sendo os macrófagos
pulmonares as células predominantes (> 90 %) em animais saudáveis. Já os
neutrófilos, raramente encontrados, são indicativos de uma resposta inflamatória
aguda e intensa (HENDERSON, 2005). Um aumento da permeabilidade capilar e
edema, também pode ser verificado, levando a oclusão capilar e isquemia
(D’ACAMPORA et al., 2004).
Atualmente a creatina monohidrato é um dos suplementos dietéticos orais mais
utilizados. A ingestão de creatina em doses suprafisiológicas tornou-se difundida e
está sendo utilizada não somente por atletas profissionais ou por atletas escolares
da elite, mas também por crianças, adolescentes e idosos (BEMBEN; LAMONT,
2005). A suplementação com creatina também é utilizada em várias situações
clínicas, tais como a falência coronária congestiva, aterosclerose, doenças neurodegenerativas e doenças neuromusculares (ANDREASSEN et al., 2001; ANDREWS
et al., 1998; HESPEL et al., 2001).
Neste estudo observou-se uma intensa migração celular para o LBA nos grupos
induzidos com LPS e também nos suplementados com creatina nas doses de 0,5
g/kg e 2 g/kg. Vários estudos têm demonstrado que o LPS induz um influxo de
leucócitos para os espaços aéreos com pico de neutrofilia variando entre 8 e 36
horas após a indução (CORTELING; WYSS; TRIFILIEFF, 2002; LI; DONALDSON;
MACNEE, 1998; RYDELL-TÖRMÄNEN; ULLER; ERJEFÄLT, 2006a,b). Estes
achados são descritos também no processo de inflamação crônica, conforme
relatado por Douwes e colaboradores (2002), os quais observaram um padrão de
hiperresponsividade das vias aéreas caracterizado por neutrofilia e não somente por
eosinófilos. Corroborando desta forma com os resultados observados neste trabalho,
os quais apresentaram um padrão de resposta característico de uma exacerbação
severa, devido ao elevado nível de neutrófilos encontrados, tais quais são vistos na
asma refratária severa (WENZEL et al., 1997).
Uma vez que a hipótese dos estímulos inflamatórios múltiplos são importantes na
patogênese da inflamação pulmonar crônica (PAVORD et al., 2006) podemos
presumir que a constatação do estado inflamatório promovida através da migração
total de células para o LBA e acúmulo de neutrófilos nas vias aéreas em nossos
experimentos atuaram de forma significativa nos animais suplementados com
creatina e induzidos com LPS. Desta forma, notou-se uma intensa inflamação no
tecido pulmonar não somente na administração conjunta ao LPS, mas também na
administração isolada do suplemento.
Atualmente a enzima iNOS tem sido relacionada à mediação e regulação de
processos inflamatórios na sepse, conduzindo uma excessiva liberação de óxido
nítrico (NO). Os níveis aumentados de NO no soro de pacientes com sepse levam a
crer que há uma correlação entre estes níveis e a severidade da doença. Esses
resultados sugerem que a expressão da iNOS em espaços alveolares possa estar
relacionada à patogênese da SDRA, especialmente seguida pela sepse e
mortalidade elevada (KOBAYASHI et al., 1998). A quantificação de NO no sistema
biológico é dificultada devido à sua curta meia vida no organismo. O NO do tecido
pulmonar é rapidamente oxidado a nitrito e/ou nitrato pelo oxigênio. Desta forma,
muitos trabalhos utilizam a reação de Griess para a determinação dos níveis de
óxido nítrico presentes no sobrenadante do LBA (DUGUET et al., 2001; GREEN et
al., 1982; KOARAI et al., 2002; KOBAYASHI et al., 1998; TORRE et al., 1999). Este
sistema permite a redução quantitativa do nitrato e elimina automaticamente a
interferência de outros compostos normalmente encontrados no soro e no LBA.
Em nosso trabalho observamos que houve uma diminuição da concentração de
NO no LBA obtido e ausência de diferenças significativas entre os grupos controle,
suplementados com creatina e/ou induzidos com LPS. Possivelmente esses
resultados possam ter sido influenciados devido à interação com outras espécies
reativas de oxigênio, ou ao excesso de lavagens para a coleta do LBA, informações
que corroboram com os achados por Valença e colaboradores (2008) e Hoffman
(2008). Estes mesmos autores também evidenciaram uma diminuição da
concentração de NO ao compararem camundongos expostos a fumaça de cigarro e
LPS em relação ao grupo controle, sugerindo que a disponibilidade biológica do NO
endógeno ou exógeno possa ter sido influenciada por outras EROs presentes na
fumaça (RAIJ; DEMASTER; JAIMES, 2001).
Outra técnica comumente utilizada na determinação de NO é através da cultura
in vitro de macrófagos alveolares obtidos no LBA, onde podem ser requeridas
numerosas lavagens e a realização de massagens no pulmão entre a instilação do
líquido da lavagem e sua retirada (HENDERSON, 2005). Li, Donaldson e MacNee
(1998) realizaram comparações de determinação de óxido nítrico in vivo e in vitro e
verificaram que os níveis de nitrito aumentaram no LBA após a instilação com LPS.
O potencial dos leucócitos em cultura para produzir NO também foi aumentado pela
instilação com LPS, apresentando níveis elevados no sobrenadante de células
obtidas no LBA e mantidas em cultura por 24 horas, mostrando-se uma técnica mais
apurada na determinação de menores variações na quantidade de nitrito da
amostra. Há também a possibilidade de empregar técnicas que verificam a
expressão da enzima iNOS, como imunohistoquímica, imunofluorescência e Western
blott (BARON et al., 2004; KOARAI et al., 2002; NUMATA et al., 1998; XIA et al.,
2007). Podemos sugerir, portanto, que o emprego de uma técnica de determinação
de NO mais refinada e com um limite de detecção mais baixo seja indicada, nos
levando a crer na possibilidade de obtenção de valores significativos nos grupos
experimentais, bem como a confirmação dos dados através de técnicas
complementares de base molecular.
Em condições normais, os leucócitos alveolares desempenham um papel
importante na defesa do pulmão contra uma possível lesão ou infecção, porém em
certas situações podem contribuir para a lesão pulmonar. A fagocitose de partículas
tóxicas/patógenos pode ocasionar a morte do neutrófilo com conseqüente liberação
de fatores quimiotáticos que induzem a migração de fibroblastos para essa região,
estimulando nova síntese de colágeno (LEFF; SCHUMACKER, 1996).
Na avaliação histológica realizada em nosso estudo, observamos que a creatina
promoveu, mesmo isoladamente sem indução com LPS, alterações morfológicas
características e patologias severas com descaracterização da arquitetura pulmonar.
Observamos, também, presença intensa de neutrófilos nas regiões peribronquial e
alveolares. Esses achados são comuns aos processos inflamatórios apresentados
na asma e em pacientes com DPOC, promovendo alterações na morfologia do
órgão, envolvendo as vias aéreas periféricas. Deste modo, nestas condições
inflamatórias do pulmão, os leucócitos PMN migram para dentro das vias aéreas,
sendo possível observar anomalias brônquicas do tecido pulmonar, como aumento
da metaplasia epitelial e aumento do número de neutrófilos (mas não no número do
eosinófilos) na mucosa brônquica (BARNES, 2000, BOUSQUET et al., 2000;
JEFFERY, 2001; SAETTA et al., 1998).
É comum na exposição ao LPS o desenvolvimento de uma massiva inflamação
pulmonar, com infiltração celular, dano endotelial e aumento da permeabilidade
alveolar, hemorragia, alveolite, bronquiolite, podendo em estágios crônicos induzir à
necrose (LI; DONALDSON; MACNEE, 1998; KNAPP et al., 2006; RYDELLTÖRMÄNEN; ULLER; ERJEFÄLT, 2006a; SZARKA et al., 1997; VERNOOY et al.,
2002). Al-Banna e colaboradores (2008), utilizando infecção bacteriana com
instilação intranasal de Campylobacter jejuni em camundongos Balb/C, verificaram
alterações histopatológicas com hemorragia intensa e consistente, inflamação
intersticial com infiltração de neutrófilos para os espaços alveolares seguida de
macrófagos, edema e broncopneumonia caracterizada pela presença de macrófagos
nos bronquíolos e espaços alveolares. Esses dados estão de acordo com os
encontrados em nosso trabalho, mas pudemos observar que a inflamação produzida
foi inferior a observada nos animais que receberam suplementação com creatina e
que os efeitos tóxicos desta não foram potencializados quando na administração
conjunta com o LPS.
Vieira e colaboradores (2007), em estudos prévios, analisaram o efeito da
suplementação via oral de creatina na resposta inflamatória pulmonar em modelo de
inflamação pulmonar crônica em camundongos previamente sensibilizados com
ovoalbumina (OVA), via intraperitoneal e aerosolizada. Os autores iniciaram a
suplementação apenas após 20 dias de sensibilização com OVA, na dose de 0,5
g/kg 5 vezes por semana e verificaram que a administração de creatina induz
inflamação
das
vias
aéreas,
remodelamento
e
hiperresponsividade
em
camundongos não sensibilizados e também aumenta os efeitos da sensibilização
com OVA. Observaram um aumento significativo na densidade de eosinófilos no
LBA e nas paredes das vias aéreas, na hiperresponsividade e também na proporção
do volume de elastina e fibras colágenas e espessamento da musculatura lisa,
sugerindo que essas alterações sejam mediadas pelo aumento observado na
liberação de IL-4, IL-5 e IGF-1. O IGF-1 atua na ativação de fibroblastos em modelos
experimentais de inflamação pulmonar alérgica in vivo e em fibroblastos in vitro
(CHETTY; CAO; NIELSEN, 2006; YAMASHITA et al., 2005). Esses dados apóiam os
achados em nosso estudo. Embora não tenha sido realizada coloração específica
para quantificação de fibras colágenas, pudemos observar que a suplementação
com creatina desencadeou uma inflamação nas paredes das vias aéreas com
presença de áreas de fibrose e colágeno, sugerindo análises posteriores para
quantificação deste.
Em um estudo semelhante, realizado com suplementação com arginina
(aminoácido precursor na síntese de creatina) foi demonstrado que este pode ser
relacionado à patologia da asma. Elevados níveis de arginase I e II foram
encontrados no tecido pulmonar em modelos experimentais de asma em roedores e
em células do lavado broncoalveolar de pacientes asmáticos, levando a um aumento
do tônus das vias aéreas, produção de muco, remodelamento e aumento da
produção de colágeno (COMAN, YAPLITO-LEEA; BONEH, 2008; ZIMMERMAN et
al., 2003; MAARSINGH et al., 2006; VERCELLI, 2003; KING; ROTHENBERG;
ZIMMERMANN, 2004).
Vários trabalhos têm sugerido uma explicação para a toxicidade apresentada na
suplementação com creatina. Yu e Deng (2000) propuseram uma via de conversão
química da molécula de creatina em uma molécula de formaldeído. Também é
possível
que
a
suplementação
com
creatina
promova
um
aumento
do
armazenamento de creatina fosfato pelas células inflamatórias, resultando em um
período mais prolongado de ativação ou retardando o processo de apoptose,
perpetuando o estado inflamatório (PUCAR et al., 2001). Vieira e colaboradores
(2007) sugerem que a toxicidade possa estar parcialmente relacionada com o
aumento da disponibilidade de L-arginina.
Outro fator de grande importância na patogênese da DPOC, não somente devido
aos efeitos prejudiciais diretos, mas também pela participação dos mecanismos
celulares e moleculares que controlam a inflamação pulmonar é o estresse oxidativo
(RAHMAN; ADCOCK, 2006). Este estresse resulta em um desequilíbrio oxidanteantioxidante (um excesso de oxidantes e/ou uma redução dos antioxidantes) que
incluem a inativação oxidativa de antiproteinases, lesão epitelial dos espaços aéreos
e aumentado do número de células inflamatórias, tais como macrófagos e neutrófilos
(VAN DER VAART et al., 2004). Com o estresse oxidativo, os produtos da
peroxidação lipídica podem ativar mecanismos da sinalização, aumentando desta
forma o processo inflamatório nas vias aéreas (RAHMAN; ADCOCK, 2006). De
acordo com os dados histológicos do nosso trabalho, onde se observou a
degeneração de componentes de membranas celulares, podemos sugerir que estes
apontam para uma relação entre a lesão celular e a suplementação com creatina
possivelmente desencadeada pelo stress oxidativo e relacionada com a ativação da
iNOS.
Este estudo demonstrou que a suplementação crônica de creatina em
camundongos Balb/C desencadeou uma alveolite aguda e consolidação da
inflamação
peribronquial
caracterizada
pelo
recrutamento
de
leucócitos
inflamatórios, com predominância de neutrofilia mesmo em camundongos não
sensibilizados. Os dados obtidos mostraram que a administração crônica de creatina
na dose de 2 g/kg pode desencadear uma lesão pulmonar mais intensa do que a
hiperreatividade induzida pela instilação intranasal de LPS e que não houve
potencialização quando administrados em conjunto, sugerindo um forte efeito tóxico
na administração crônica de creatina.
6 CONCLUSÃO
Com base nesses dados podemos concluir que a administração crônica com
creatina na dose de 0,5 g/kg promoveu:
•
aumento da migração leucocitária para o LBA com predominância de
neutrófilos, sendo estes também encontrados depositados no tecido pulmonar
da região peribroncovascular e
•
pequeno índice de fibrose na região peribroncovascular.
Quando
induzida
hiperreatividade
pulmonar
aguda
com
LPS,
após
a
suplementação de 0,5g/kg de creatina, promoveu:
•
aumento significativo da migração em relação ao grupo LPS com
predominância de neutrofilia;
•
acúmulo de neutrófilos nas paredes alveolares da região peribronquial;
•
perda da arquitetura morfofuncional do tecido pulmonar com degeneração dos
sacos alveolares e epitélio respiratório;
•
diminuição da camada muscular dos bronquíolos,
•
desarranjo alveolar e
•
acúmulo de hemácias e neutrófilos nos alvéolos e lúmen arterial.
Quando na administração crônica da dose de 2 g/kg de creatina verificou-se que
houve:
•
aumento significativo da migração com predominância de neutrofilia;
•
expressivas alterações anatomopatológicas e lesão tecidual pulmonar intensa
com denso agregado celular peribronquial e perivascular, composto,
primariamente, por neutrófilos;
•
hemácias no interior dos vasos sanguíneos e depositadas nos alvéolos
pulmonares;
•
dano ao epitélio respiratório do bronquíolo terminal;
•
infiltração e acúmulo de neutrófilos na região do lúmen bronquial e nos
espaços alveolares e
•
lesão tecidual pulmonar intensa, alcançando a pontuação máxima dos
critérios analisados.
Após a indução com LPS observou-se acréscimo nas alterações patológicas
apresentadas pelo grupo suplementado com 2g/kg de creatina sem indução da
hiperreatividade, além de:
•
atelectasia proeminente;
•
diminuição da camada muscular dos bronquíolos e
•
presença de fibrose na parede arterial.
Outros experimentos são sugeridos para a confirmação da correlação dosedependente da concentração de creatina e a toxicidade apresentada.
Em relação aos níveis produção de óxido nítrico, a suplementação crônica com
creatina e a indução com LPS não alterou os valores significativamente através
método de análise escolhido, sugerindo a utilização de técnicas mais apuradas e a
avaliação da expressão da enzima sintetizadora, iNOS, para comprovação dos
dados obtidos.
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Anexo: Carta de Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa