ROSIMAR REGINA DA SILVA
ALENDRONATO DE SÓDIO, ATORVASTATINA CÁLCICA E FLAVONÓIDES
NA OSTEOPOROSE INDUZIDA POR GLICOCORTICÓIDE
Tese apresentada à Universidade Federal
de Viçosa, como parte das exigências do
Programa
de
Pós-graduação
em
Bioquímica Agrícola, para obtenção do
título de “Doctor Scientiae”.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2006
Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e
Classificação da Biblioteca Central da UFV
T
S586a
2006
Silva, Rosimar Regina da, 1973Alendronato de sódio, atorvastatina cálcica e
flavonóides na osteoporose induzida por glicocorticóide / Rosimar Regina da Silva. – Viçosa :
UFV, 2006.
xxii, 115f. : il. algumas col. ; 29cm.
Orientador: Tânia Toledo de Oliveira.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de
Viçosa.
Referências bibliográficas: f. 90-115.
1. Bifosfonatos - Efeito fisiológico. 2. Estatinas Efeito fisiológico. 3. Flavonóides - Efeito fisiológico.
4. Osteoporose - Tratamento. 5. Glicocorticóides.
6. Ossos - Metabolismo. 7. Rato como animal de
laboratório. I. Universidade Federal de Viçosa. II.Título.
CDD 22.ed. 572.553
ROSIMAR REGINA DA SILVA
ALENDRONATO DE SÓDIO, ATORVASTATINA CÁLCICA E FLAVONÓIDES
NA OSTEOPOROSE INDUZIDA POR GLICOCORTICÓIDE
Tese apresentada à Universidade Federal
de Viçosa, como parte das exigências do
Programa
de
Pós-graduação
em
Bioquímica Agrícola, para obtenção do
título de “Doctor Scientiae”.
APROVADA: 24 de fevereiro de 2006
______________________________
______________________________
Prof. Tanus Jorge Nagem
(Conselheiro)
Prof. Ricardo Junqueira Del Carlo
(Conselheiro)
______________________________
______________________________
Profa. Martha de Oliveira Guerra
Prof. George Henrique Kling de Moraes
________________________________
Profa. Tânia Toledo de Oliveira
(Orientadora)
“Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa,
nunca tem medo e nunca se arrepende”.
(Leonardo da Vinci)
ii
Ao meu querido filho João Lucas, meu
bem mais valioso.
Ao meu esposo Héliton César, que
muito contribuiu para a realização
deste trabalho.
iii
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela sua presença e proteção durante a minha vida e pela graça
concedida para cumprir mais esta etapa.
Aos meus pais, pelo amor, pela dedicação e pelo exemplo de perseverança e
honestidade.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular, pela oportunidade de realizar o curso de Doutorado.
Agradeço de forma especial, a minha orientadora Profª Drª Tânia Toledo de
Oliveira, pelo incentivo, confiança e amizade, por sua competência e orientação na
realização deste trabalho e pelo valioso exemplo de dedicação e profissionalismo.
Ao Prof. Dr. Tanus Jorge Nagem, por participar na concretização de mais uma
etapa da minha formação profissional, pelo apoio e inestimável colaboração na
realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Ricardo Junqueira Del Carlo, pelo apoio e valiosa colaboração na
realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. George Henrique Kling de Moraes, pela participação e pelas
sugestões na finalização deste trabalho e pelos conhecimentos transmitidos durante a
realização do curso.
À Profª Drª Martha de Oliveira Guerra, pela participação na concretização
deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Cláudio César Fonseca, pela contribuição nas análises
histomorfométricas.
iv
Aos Professores do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da
Universidade Federal de Viçosa, pela paciência e pelos conhecimentos transmitidos
durante o curso.
À Maria Aparecida Leão, pela amizade e pela grande ajuda na realização dos
experimentos.
Ao Humberto Doriguêto Gravina, pela valiosa contribuição na realização dos
experimentos.
Ao José Geraldo Pinto, pela ajuda na realização das análises bioquímicas.
À Silvana Ribeiro Garcia, pela orientação nas análises estatísticas.
Aos estagiários do laboratório de Biofármacos pela ajuda na realização dos
experimentos.
A todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização deste
trabalho.
v
CONTEÚDO
LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................
ix
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................
xi
LISTA DE TABELAS..........................................................................................
xiv
RESUMO .............................................................................................................
xvii
ABSTRACT .........................................................................................................
xx
1. INTRODUÇÃO ...............................................................................................
1
2. REVISÃO DE LITERATURA .........................................................................
3
2.1. Tecido ósseo..............................................................................................
3
2.1.1. Remodelação óssea.............................................................................
7
2.2. Osteoporose...............................................................................................
8
2.2.1. Fatores de risco..................................................................................
11
2.2.2. Prevenção e tratamento da osteoporose..............................................
11
2.2.2.1. Cálcio e vitamina D.....................................................................
12
2.2.2.2. Drogas que inibem a reabsorção óssea.........................................
15
vi
2.2.2.2.1. Bifosfonato..........................................................................
15
2.2.2.2.2. Calcitonina...........................................................................
17
2.2.2.2.3. Estrógenos...........................................................................
18
2.2.2.3. Drogas que estimulam a formação óssea......................................
19
2.2.2.3.1. Fluoreto..............................................................................
19
2.2.2.3.2. Paratormônio.......................................................................
20
2.3. As estatinas e o metabolismo ósseo............................................................
22
2.4. Indução de osteoporose por glicocorticóides..............................................
26
2.5. Flavonóides................................................................................................
29
2.5.1. Efeito de flavonóides no metabolismo ósseo........................................
3. MATERIAL E MÉTODOS ..............................................................................
30
40
3.1. Experimento para avaliar o efeito de alendronato de sódio, atorvastatina
cálcica e ipriflavona na osteoporose induzida por dexametasona.................
41
3.2. Experimento para avaliar o efeito de alendronato de sódio isoladamente e
em associação com atorvastatina cálcica, ipriflavona e rutina na
osteoporose induzida por dexametasona.....................................................
41
3.3. Experimento para avaliar o efeito de ipriflavona associada à atorvastatina
cálcica e de rutina isoladamente e em associação com ipriflavona e
alendronato de sódio na osteoporose induzida por dexametasona...............
42
3.4. Coleta de material para análises..................................................................
42
3.4.1. Análise dos constituintes sanguíneos...................................................
42
3.4.2. Análise de proteína no osso.................................................................
43
3.4.3. Histomorfometria................................................................................
43
3.5. Análise estatística.......................................................................................
44
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................
45
vii
4.1. Efeito de alendronato de sódio, atorvastatina cálcica e ipriflavona
isoladamente na osteoporose induzida por dexametasona.......................
45
4.2. Efeito de alendronato de sódio isoladamente e em associação com
atorvastatina cálcica, ipriflavona e rutina na osteoporose induzida por
dexametasona........................................................................................
58
4.3. Efeito de ipriflavona associada à atorvastatina cálcica e de rutina
isoladamente e em associação com ipriflavona e alendronato de sódio
na osteoporose induzida por dexametasona............................................
73
5. CONCLUSÕES ................................................................................................
89
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................
90
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPc
Adenosina monofosfato cíclico
BRU
Unidades de remodelamento ósseo
EDTA
Ácido etilenodiamina tetracético
FIT
The Fracture Intervention Trial
FSH
Hormônio folículo estimulante
GH
Hormônio de crescimento
HMG-CoA
3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A
IGF I
Fator de crescimento semelhante à insulina I
IL
Interleucina
IL-6 (+IL6-sR)
Receptor solúvel para interleucina-6
LDL
Lipoproteína de baixa densidade
LH
Hormônio luteinizante
LIF
Fator inibidor de leucócitos
OPG
Osteoprotegerina
ix
PP
Pirofosfato
PTH
Paratormônio
RANK
Receptor do ativador do fator nuclear Kappa B
RANKL
Receptor do ativador do fator nuclear ligante Kappa B
RNA
Ácido ribonucléico
UFV
Universidade Federal de Viçosa
VDR
Receptor nuclear para a vitamina D
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Microfotografias do osso trabecular normal (a) e osteoporótico (b)....
9
Figura 2 – Fatores que interferem na osteoporose...............................................
10
Figura 3 – Mecanismo de ação das estatinas e bifosfonatos na cascata da
prenilação de proteínas.......................................................................
24
Figura 4 – Aspecto multifatorial da fisiopatologia da osteoporose induzida por
glicocorticóide...................................................................................
28
Figura 5 – Estrutura química da genisteína..........................................................
29
Figura 6 – Estrutura química da daidzeína...........................................................
30
Figura 7 – Estrutura química da ipriflavona.........................................................
30
Figura 8 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G1 (controle) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C)
dias de tratamento..............................................................................
50
Figura 9 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G2 (controle com osteoporose) aos 10 (A),
20 (B) e 30 (C) dias de tratamento.....................................................
51
Figura 10– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G3 (dexametasona + alendronato) aos 10
(A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento..............................................
Figura 11– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G4 (dexametasona + atorvastatina) aos 10
xi
52
(A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento..............................................
53
Figura 12– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G5 (dexametasona + ipriflavona) aos 10
(A),
20
(B)
e
30
(C)
dias
de
54
tratamento.....................................................
Figura 13– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G1 (controle) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C)
dias de tratamento..............................................................................
63
Figura 14– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G2 (controle com osteoporose) aos 10 (A),
20 (B) e 30 (C) dias de tratamento.....................................................
64
Figura 15– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G3 (dexametasona + alendronato) aos 10
(A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento..............................................
65
Figura 16– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G4 (dexametasona + alendronato +
atorvastatina) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento.............
66
Figura 17– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G5 (dexametasona + alendronato +
ipriflavona) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento................
67
Figura 18– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G6 (dexametasona + rutina) aos 10 (A), 20
(B) e 30 (C) dias de tratamento..........................................................
68
Figura 19– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G1 (controle) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C)
dias de tratamento..............................................................................
80
Figura 20– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G2 (controle com osteoporose) aos 10 (A),
20 (B) e 30 (C) dias de tratamento.....................................................
81
Figura 21– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G3 (dexametasona + alendronato +
ipriflavona + rutina) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C) dias de
tratamento....
xii
82
Figura 22– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G4 (dexametasona + ipriflavona + rutina)
aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento...................................
83
Figura 23– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G5 (dexametasona + rutina) aos 10 (A), 20
(B) e 30 (C) dias de tratamento..........................................................
84
Figura 24– Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de
fêmur de ratas do grupo G6 (dexametasona + atorvastatina +
ipriflavona) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento.................
xiii
85
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 –
Valores médios de cálcio sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
46
coleta.....
Tabela 2 –
Valores médios de fósforo sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes
tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
47
coleta....
Tabela 3 –
Valores médios de magnésio sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
48
coleta.....
Tabela 4 –
Valores médios de proteínas não colagenosas em mg/100 mg de osso
de ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas
respectivas épocas de coleta...............................................................
Tabela 5 –
49
Valores médios de proteínas colagenosas em mg/100 mg de osso de
ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas
épocas de coleta.................................................................................
Tabela 6 –
49
Valores médios do número de trabéculas ósseas em pontos
percentuais do fêmur de ratas submetidas a diferentes tratamentos e
avaliadas nas respectivas épocas de coleta..........................................
Tabela 7 –
55
Valores médios de espessura do osso cortical em μm, de ratas
submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas
épocas de coleta.................................................................................
xiv
56
Tabela 8 –
Valores médios de cálcio sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
58
coleta.....
Tabela 9 –
Valores médios de fósforo sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes
tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
59
coleta....
Tabela 10–
Valores médios de magnésio sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
60
coleta.....
Tabela 11–
Valores médios de glicose sérica em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
61
coleta.....
Tabela 12–
Valores médios de proteínas não colagenosas em mg/100 mg de osso
de ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas
respectivas épocas de coleta...............................................................
Tabela 13–
61
Valores médios de proteínas colagenosas em mg/100 mg de osso de
ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas
épocas de coleta.................................................................................
Tabela 14–
62
Valores médios do número de trabéculas ósseas em pontos
percentuais do fêmur de ratas submetidas a diferentes tratamentos e
avaliadas nas respectivas épocas de coleta..........................................
Tabela 15–
69
Valores médios de espessura do osso cortical em μm, de ratas
submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas
épocas de coleta.................................................................................
Tabela 16–
71
Valores médios de cálcio sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
73
coleta.....
Tabela 17–
Valores médios de fósforo sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes
tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
74
coleta....
Tabela 18–
Valores médios de magnésio sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
coleta.....
xv
75
Tabela 19–
Valores médios de glicose sérica em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
76
coleta.....
Tabela 20–
Valores médios de proteínas não colagenosas em mg/100 mg de osso
de ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas
respectivas épocas de coleta...............................................................
Tabela 21–
78
Valores médios de proteínas colagenosas em mg/100 mg de osso de
ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas
épocas de coleta.................................................................................
Tabela 22–
79
Valores médios do número de trabéculas ósseas em pontos
percentuais do fêmur de ratas submetidas a diferentes tratamentos e
avaliadas nas respectivas épocas de coleta..........................................
Tabela 23–
86
Valores médios de espessura do osso cortical em μm, de ratas
submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas
épocas de coleta.................................................................................
xvi
88
RESUMO
SILVA, Rosimar Regina da, D.S., Universidade Federal de Viçosa, Fevereiro de 2006.
Alendronato de sódio, atorvastatina cálcica e flavonóides na osteoporose
induzida por glicocorticóide. Orientadora: Tânia Toledo de Oliveira. Conselheiros:
Ricardo Junqueira Del Carlo e Tanus Jorge Nagem.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência do alendronato de
sódio, atorvastatina cálcica, ipriflavona e rutina isoladamente e em associação, na
osteoporose induzida pela administração de dexametasona (dose de 7mg/kg de peso),
em ratas da linhagem Wistar (Rattus norvegicus albinus). As dosagens de alendronato,
atorvastativa, ipriflavona e rutina foram de 0,02 mg, 0,3 mg, 50 mg e 25 mg,
respectivamente, administradas diariamente por via oral. Após o período de indução da
osteoporose, iniciou-se os tratamentos. No primeiro experimento os animais foram
distribuídos em cinco grupos: G1: controle, G2: controle com osteoporose (animais
receberam
apenas
dexametasona),
G3:
Dexametasona
+
Alendronato,
G4:
Dexametasona + Atorvastatina e G5: Dexametasona + Ipriflavona. No segundo
experimento os animais foram distribuídos em seis grupos: G1: controle, G2: controle
com osteoporose, G3: Dexametasona + Alendronato, G4: Dexametasona + Alendronato
+ Atorvastatina, G5: Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona e G6: Dexametasona +
Alendronato + Rutina. No terceiro experimento os animais foram distribuídos em seis
grupos: G1: controle, G2: controle com osteoporose, G3: Dexametasona + Alendronato
xvii
+ Ipriflavona + Rutina, G4: Dexametasona + Ipriflavona + Rutina, G5: Dexametasona +
Rutina e G6: Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona. Aos 10, 20 e 30 dias, após o
início dos tratamentos, foram coletadas amostras de sangue para dosagens de cálcio,
fósforo, magnésio e glicose; a tíbia esquerda para análise de proteínas colagenosas e de
proteínas não colagenosas e o fêmur esquerdo para análise histomorfométrica. No
primeiro experimento os resultados não mostraram diferenças significativas entre o
grupo controle e o grupo controle com osteoporose, bem como, entre eles e os grupos
tratados, quanto aos valores séricos de cálcio e magnésio; proteínas colagenosas ósseas
e espessura do osso cortical. Ao final do período experimental observou-se uma redução
significativa nos níveis séricos de fósforo, de proteínas não colagenosas ósseas e no
número de trabéculas ósseas no grupo controle com osteoporose quando comparado
com o grupo controle. Observou-se também que todos os grupos tratados apresentaram
aumentos significativos nos níveis de proteínas não colagenosas e que apenas o grupo
tratado com ipriflavona apresentou aumento significativo no número de trabéculas
ósseas, quando comparados com o grupo controle com osteoporose. No segundo
experimento os resultados não mostraram diferenças significativas entre o grupo
controle e o grupo controle com osteoporose, bem como, entre eles e os grupos tratados
no que se refere aos níveis séricos de cálcio, fósforo e magnésio. Para os níveis de
glicose sanguínea observou-se que a dexametasona induziu hiperglicemia e apenas o
grupo que recebeu alendronato em associação à ipriflavona reduziu a glicemia. Para as
proteínas não colagenosas apenas o grupo que recebeu alendronato em associação à
atorvastatina apresentou aumento significativo em relação aos grupos controle. Os
resultados mostraram uma redução significativa nos níveis de proteínas colagenosas no
grupo controle com osteoporose, mas nenhuma alteração foi observada entre ele e os
grupos tratados. Observou-se também uma redução significativa no número de
trabéculas ósseas e na espessura cortical no grupo controle com osteoporose, sendo que
todos os grupos tratados mostraram aumentos significativos no número de trabéculas ao
final do período experimental e que apenas o grupo que recebeu alendronato associado
à ipriflavona, não apresentou diferença significativa na espessura cortical. No terceiro
experimento os resultados não mostraram diferenças significativas entre o grupo
controle e o grupo controle com osteoporose no que se refere aos níveis séricos de
cálcio, fósforo e magnésio; níveis ósseos de proteínas colagenosas e não colagenosas;
sendo que todos os tratamentos reduziram os níveis séricos de cálcio ao final do período
xviii
experimental. Para os níveis de glicose sanguínea, observou-se que a dexametasona
induziu a hiperglicemia e os grupos tratados com alendronato em associação à
ipriflavona e rutina e rutina isoladamente reduziram os valores de glicemia quando
comparados
com
o
grupo
controle
com
osteoporose.
Através
da
análise
histomorfométrica observou-se que a dexametasona reduziu o número de trabéculas
ósseas e que todas as substâncias testadas foram eficazes em aumentar a mesma, exceto
o grupo que recebeu ipriflavona em associação com a rutina. Além disso, a
dexametasona reduziu a espessura cortical e os grupos que receberam alendronato
associado à ipriflavona e rutina e a rutina isoladamente apresentaram aumentos
significativos nesse parâmetro. Diante dos resultados conclui-se que a rutina e a
ipriflavona isoladamente e a ipriflavona utilizada em associação ao alendronato e rutina
foram eficientes em reduzir a glicemia induzida pela dexametasona. Além disso, a
rutina, o alendronato e a ipriflavona isoladamente e em associações foram eficazes em
aumentar o número de trabéculas ósseas e que o alendronato, a atorvastatina e a
ipriflavona, quando administrados isoladamente, e a associação de alendronato com
atorvastatina aumentaram os níveis de proteínas não colagenosas. Deste modo, essas
substâncias usadas isoladamente ou as suas associações, podem ser promissoras no
tratamento da osteoporose induzida por glicocorticóide.
xix
ABSTRACT
SILVA, Rosimar Regina da, D.S., Universidade Federal de Viçosa, February, 2006.
Sodium alendronate, atorvastatin calcic and flavonoids in osteoporosis induced
by glucocorticoids. Adviser: Tânia Toledo de Oliveira. Committee members:
Ricardo Junqueira Del Carlo and Tanus Jorge Nagem.
The objective of this paper is to evaluate the influence of sodium alendronate,
atorvastatin calcic, ipriflavone and rutin in isolation and in combination, in osteoporosis
induced for the administration of dexamethasone (dose of 7mg/kg of weight), in female
Wistar rats (Rattus norvegicus albinus). The dosages of sodium alendronate,
atorvastatin calcic, ipriflavone and rutin, were of 0,02 mg, 0,3 mg, 50 mg e 25 mg,
respectively; and all the substances were administered orally, daily. After the induction
period of osteoporosis, the treatments began. In the first experiment, the animals were
distributed in five groups: G1: control, G2: control with osteoporosis (animal had
received only dexamethasone), G3: dexamethasone + alendronate, G4: dexamethasone
+ atorvastatin and G5: dexamethasone + ipriflavone. In the second experiment, the
animals were distributed in six groups: G1: control, G2: control with osteoporosis, G3:
dexamethasone + alendronate, G4: dexamethasone + alendronate + atorvastatin, G5:
dexamethasone + alendronate + ipriflavone and G6: dexamethasone + alendronate +
rutin. In the third experiment, the animals were distributed in six groups: G1: control,
G2: control with osteoporosis, G3: dexamethasone + alendronate + ipriflavone + rutin,
xx
G4: dexamethasone + ipriflavone + rutin, G5: dexamethasone + rutin and
G6:
dexamethasone + atorvastatin + ipriflavone. By the 10th, 20th and 30th days, after the
beginning of the treatments, samples were collected of blood for dosages of calcium,
phosphorus, magnesium and glucose; of left tibia for collagenous protein and non
collagenous protein analysis and of left femur for histomorphometric analysis. In the
first experiment, the results did not show significant differences between the control
group and the control group with osteoporosis, or even between them and the treated
groups in relation to the levels of calcium and magnesium; collagenous bone protein
and cortical thickness. At the end of the experimental period a significant reduction was
observed in the serum levels of phosphorus, of non collagenous bone protein and in the
number of bone trabeculae in the control group with osteoporosis when compared with
the control group. It was also observed that all the groups treated presented significant
increases in the levels of non collagenous protein and that only the group treated with
ipriflavone presented a significant increase in the number of bone trabeculae, when
compared with the control group with osteoporosis. In the second experiment the results
did not show any significant differences between the control group and the control
group with osteoporosis, or even between them and the groups treated relating to the
serum levels of calcium, phosphorus and magnesium. For the levels of blood glucose it
was observed that dexamethasone induced hyperglycemia and only the group which
received alendronate together with ipriflavone reduced the glycemia. For the non
collagenous proteins only the group which received alendronate together with
atorvastatin presented any significant increase in relation to the control groups. The
results showed a significant reduction in the levels of collagenous protein in the control
group with osteoporosis, but no alteration was observed between it and the treated
groups. A significant reduction was also observed in the number of bone trabeculae and
in the cortical thickness in the control group with osteoporosis, considering that all the
groups treated showed significant increases in the number of trabeculae at the end of the
experimental period and only the group which received alendronate together with
ipriflavone, did not present significant differences in cortical thickness. In the third
experiment the results did not show significant differences between the control group
and the control group with osteoporosis in relation to the serum levels of calcium,
phosphorus and magnesium; bone levels of collagenous protein and non collagenous
protein; considering that all of the treatments reduced the serum levels of calcium by the
xxi
end of the experimental period. For the levels of blood glucose, it was observed that
dexamethasone induced hyperglycemia and the groups treated with alendronate together
with ipriflavone and rutin and rutin in isolation reduced the levels of glycemia when
compared with the control group with osteoporosis. Through histomorphometric
analysis it was observed that dexamethasone reduced the number of bone trabeculae and
that all the substances tested were effective in increasing them, except the group which
received ipriflavone together with rutin. Besides this, dexamethasone reduced cortical
thickness and the groups which received alendronate together with ipriflavone and rutin
and rutin in isolation presented significant increases in this parameter. In the face of
these results it is concluded that rutin and ipriflavone seperately and ipriflavone used
together with alendronate and rutin were effecticve in reducing the glycemia induced by
the dexamethasone. Besides this, rutin, alendronate and ipriflavone seperately and
together were effective in increasing the number of bone trabeculae and that
alendronate, atorvastatin and ipriflavone, when administered seperately, and the
association of alendronate with atorvastatin increase the levels of non collagenous
proteins. In this way, these substances, whether used in isolation or in combination,
could be promising in the treatment of osteoporosis induced by glucocorticoids.
xxii
1. INTRODUÇÃO
O envelhecimento populacional está se dando de forma extremamente rápida.
Segundo estimativas, a proporção de idosos em 2050 deverá alcançar 15% da população
(CHAIMOWICZ, 1997). Com isso a incidência de múltiplas doenças associadas com a
idade, como a osteoporose, tenderá a aumentar (CARNEIRO, 2000).
A osteoporose é definida como uma desordem no tecido ósseo caracterizada
pelo comprometimento da força do osso que predispõe a um aumento no risco de
fraturas. A força do osso reflete a integração da densidade mineral e a qualidade do osso
e é determinada pela interação dos fatores genéticos, hormonais, nutricionais,
ambientais e estilo de vida (MEZQUITA-RAYA et al., 2004). É uma doença
esquelética progressiva, com conseqüências físicas, psicossociais e financeiras. Resulta
de perda óssea assintomática com conseqüente redução da força do osso até que ocorra
uma fratura espontânea ou após um trauma mínimo (GOLD e DREZNER, 1995;
SINAKI, 1998; BENNEL et al., 2000; HACZYNSKI e JAKIMIUK, 2001; SINAKI et
al., 2002).
Nos Estados Unidos observou-se que uma em cada quatro mulheres e um em
cada dez homens acima de cinqüenta anos de idade apresentam osteoporose e 1,5
milhão de pessoas por ano apresentam fraturas (WHO, 1994). Atualmente já são 10
milhões de americanos com osteoporose e outros 18 milhões apresentam perda de massa
óssea (NIH, 2001).
A prevalência de osteoporose e a incidência de fraturas variam segundo gênero
e raça/etnia. Mulheres brancas, com deficiência estrogênica principalmente decorrente
1
da pós-menopausa, de baixo peso e índice de massa corpórea, história familiar de
osteoporose, além de história de fratura pregressa são mais predispostas à perda de
massa óssea (BIRDWOOD, 1996; NIH, 2001).
Na América Latina pouco se conhece sobre a prevalência da doença. No
México, durante o ano de 1998, mais de 24,5 milhões de pessoas foram diagnosticadas
com osteopenia ou osteoporose (MORALES-TORRES e GUTIÉRREZ-UREÑA, 2004).
No Brasil esta patologia atinge 25 a 30% das mulheres brancas durante a pósmenopausa e 40 a 60% dos indivíduos com mais de 60 anos de idade (CARNEIRO,
2001).
Portanto, devido aos altos índices de morbidade e mortalidade associados,
principalmente com fraturas de quadril, tratamentos para prevenir, estabilizar ou
melhorar o quadro de osteoporose tornam-se muito importantes.
Os flavonóides, substâncias que vem sendo pesquisadas nessa patologia, são
compostos naturais encontrados nos alimentos, principalmente nas verduras,
leguminosas, frutas, grãos, sementes, ervas e chá. São produzidos pela rota do
metabolismo secundário em plantas. Várias propriedades farmacológicas têm sido
atribuídas aos flavonóides tais como atividade anticancerígena e na prevenção de
patologias relacionadas com a idade. Recentemente pesquisas têm demonstrado que
esses compostos aumentam a massa óssea, prevenindo a osteoporose (WATTEL et al.,
2004).
Pesquisadores têm demonstrado que o flavonóide rutina e/ou seus metabólitos
inibem a perda óssea trabecular induzida pela ovariectomia nos ratos, reduzindo a
reabsorção óssea e aumentando a atividade osteoblástica (HORCAJADA-MOLTENI et
al., 2000). Além disso, estudos in vitro também demonstraram que os flavonóis
quercetina e rutina reduziram significativamente a reabsorção óssea (RASSI et al.,
2005).
ARJMANDI et al. (2000) observaram em seus experimentos que o tratamento
com a ipriflavona, um flavonóide sintético, mostrou-se efetivo na prevenção da perda
óssea associada a ovariectomia.
Diante desses estudos, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do
alendronato de sódio, da atorvastatina cálcica e dos flavonóides ipriflavona e rutina
isoladamente e em associação na osteoporose induzida pela utilização de
glicocorticóide.
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 – Tecido ósseo
O osso é um tipo de tecido conjuntivo, sendo um dos poucos tecidos que
normalmente se mineralizam (COTRAN et al., 2000).
Anatomicamente, os ossos podem ser classificados em dois tipos: longos
(fêmur, tíbia, úmero) e chatos (ossos do crânio, escápula, mandíbula e bacia). Os ossos
longos caracterizam-se por apresentar duas extremidades mais largas, as epífises, e uma
porção longa entre as duas, a diáfise. A junção entre as epífises e a diáfise constitui as
metáfises, onde ocorre o crescimento. A parte externa dos ossos é constituída por um
tecido calcificado denso, chamado de córtex ou osso compacto, que, na diáfise, confina
a área ocupada pela medula óssea hematopoiética. À medida que nos aproximamos das
metáfises, o córtex torna-se progressivamente mais fino e o espaço interno vai sendo
preenchido por uma rede de trabéculas ósseas finas, constituindo o osso trabecular (ou
esponjoso). O osso trabecular é encontrado na porção interna dos ossos longos, corpos
vertebrais e pelve, sendo mais importante do ponto de vista metabólico que o osso
cortical (CORONHO et al., 2001). Internamente, revestindo o canal medular, há uma
membrana chamada endósteo. O endósteo apresenta uma pronunciada atividade celular
provavelmente devido às forças de flexão e de tração que existem no local e é a
membrana responsável pelo processo de modelamento e remodelamento ósseo.
Externamente, o osso cortical é revestido por uma membrana chamada de
periósteo, composta por duas camadas. A camada externa, que é fibrosa e está em
3
contato direto com os músculos e outros tecidos moles, possui células diferenciadas. A
camada interna possui células osteoprogenitoras indiferenciadas de condrócitos e
osteoblastos (EINHORN, 1995).
Os ossos compactos e trabeculares são constituídos pelo mesmo tipo de matriz
extracelular e pelo mesmo tipo de células, mas diferem quanto à superfície calcificada,
que é da ordem de 90% no osso compacto e de 25% no trabecular. Isso faz com que a
superfície de contato do osso trabecular com o meio externo seja muito maior, definindo
para esse tipo de tecido um papel basicamente metabólico, enquanto o osso compacto
apresenta papel de proteção e sustentação (CORONHO et al., 2001).
Bioquimicamente, o tecido ósseo é definido por uma mistura especial de matriz
orgânica (35%) e elementos inorgânicos (65%) (COTRAN et al., 2000).
Cerca de 90% da matriz orgânica do osso é constituída por colágeno tipo I,
principal produto de secreção dos osteoblastos, e os 10% restantes compreendem
proteoglicanas de baixo peso molecular e proteínas não colagenosas. Entre as proteínas
não colagenosas estão a osteocalcina, específica do tecido ósseo e sintetizadas pelos
osteoblastos, onde sua concentração reflete a formação óssea; a osteopontina, uma
sialoproteína envolvida na mediação da aderência celular e a osteonectina (VARGAS et
al., 1997, EINHORN, 1995), dentre outras. Estudos sugerem que a osteonectina pode
ser um potente inibidor da deposição de hidroxiapatita (ROMBERG et al., 1986).
No tecido ósseo, as moléculas de colágeno estão unidas por três resíduos do
aminoácido hidroxilisina, lisina ou seus derivados, de maneira que cada duas moléculas
de colágeno estão unidas entre si por uma estrutura cíclica fluorescente chamada
piridinolina. Os telopeptídeos (extremidades da cadeia protéica) carboxiterminal e
aminoterminal do colágeno tipo I, cujas cadeias protéicas estão unidas entre si através
da estrutura piridinolínica, são liberados durante a degradação do colágeno tipo I, dando
origem aos telopeptídeos carboxiterminal e aminoterminal do colágeno tipo I. Essas
substâncias circulam no sangue e são excretadas na urina. Níveis elevados de
telopeptídeos carboxiterminal são observados em condições que apresentem uma
reabsorção óssea aumentada como no mieloma múltiplo, nas metástases ósseas, na
artrite reumatóide, no hiperparatiroidismo e na imobilização (VARGAS et al., 1997).
A piridinolina difere da deoxipiridinolina apenas pela presença de um grupo
hidroxila, sendo que a primeira tem distribuição tecidual ampla, enquanto a segunda é
mais específica do tecido ósseo e correlaciona-se melhor com a cinética do cálcio e
histomorfometria óssea. Ao contrário das piridinolinas livres, a avaliação dos
4
telopeptídeos do colágeno tipo I parecem mostrar maior correlação com a dinâmica do
osso. Na urina podem ser dosadas as formas livres de piridinolina e deoxipiridinolina, e
as formas ainda ligadas a telopeptídeos aminoterminais e carboxiterminais do colágeno
tipo I (SARAIVA e LAZARETTI-CASTRO, 2002).
A osteocalcina é a proteína não colagenosa mais abundante do osso e dentina.
Embora sua função específica não seja conhecida, sabe-se que é sintetizada
predominantemente pelos osteoblastos diferenciados, incorporada à matriz óssea
extracelular e relacionada à mineralização da matriz osteóide. A vitamina D está
diretamente relacionada à osteocalcina, uma vez que, estimula a sua síntese (SARAIVA
e LAZARETTI-CASTRO, 2002).
Uma fração (10 a 40%) da osteocalcina intacta recém sintetizada é liberada na
circulação, possuindo uma meia-vida curta, pois é rapidamente hidrolisada no fígado e
rim por metaloproteases. Os fragmentos carboxiterminais são clareados no sangue, onde
permanecem os fragmentos aminoterminais intermediários, sendo esta forma
juntamente com a intacta as mais abundantes da circulação. Podem ser mensuradas por
imunoensaios comercialmente disponíveis e específicos para a forma intacta e, ou,
fragmentos. A osteocalcina é bastante instável in vitro, sendo rapidamente degradada
em temperatura ambiente (SARAIVA e LAZARETTI-CASTRO, 2002). Pesquisadores
têm demonstrado que ocorre uma degradação de 17% em amostras de sangue mantidas
a temperatura ambiente por duas horas, e é provável que esta degradação ocorra também
durante o ensaio (GARNERO e DELMAS, 1998).
A osteopontina é uma glicoproteína fosforilada expressa por células
transformadas, macrófagos, linfócitos T ativados, células epiteliais especializadas e
células ósseas, a qual é encontrada no leite e na matriz mineralizada do osso. A síntese
de osteopontina pelas células ósseas é regulada por fatores de crescimento,
glicocorticóides, (que promovem a formação óssea) hormônio calcitriol e ácido
retinóico (que mediam a reabsorção óssea) (ZHANG et al., 1992).
Com relação à matriz inorgânica do osso, esta tem como principal mineral o
cálcio. O cálcio corporal encontra-se nas formas ionizadas (50%), ligados a proteínas
(40%) e o restante ligado a fosfato e citrato (10%). Cerca de 99% do cálcio corporal são
encontrados no osso, e o 1% restante acha-se circulante no meio extracelular ou no meio
intracelular, regulado pela ação hormonal. A homeostase do cálcio é regulada pelo PTH,
vitamina D (1, 25-diidroxivitamina D ou calcitriol, forma ativa da Vitamina D) e
calcitonina (CORONHO et al., 2001). Os sais cristalinos depositados na matriz orgânica
5
do osso são compostos principalmente por cálcio e fosfato, sendo o principal sal
cristalino a hidroxiapatita (GUYTON e HALL, 2002).
O tecido ósseo contém três tipos de células: os osteoblastos, os osteoclastos e
os osteócitos. Os osteoblastos são células de origem mesenquimal com intensa
capacidade secretora, são responsáveis pela produção de cadeias protéicas precursoras
do colágeno para formação de osteóide, precursor não-calcificado do osso, nos locais
superficiais de crescimento ou remodelagem (LIN, 1996). Além disso, secretam fatores
de crescimento locais, sob influência do GH e fosfatase alcalina óssea, relacionadas com
o processo de mineralização do osso talvez através da neutralização de um inibidor da
deposição mineral (pirofosfato). A membrana plasmática dos osteoblastos é rica em
fosfatase alcalina, cuja atividade é um índice de formação óssea. Os osteoblastos têm
receptores para PTH, vitamina D e estrogênio, mas não para a calcitonina. O estímulo
do PTH, vitamina D, GH e estrogênio induzem os osteoblastos a produzir o IGF I, que
desempenha papel importante na regulação e remodelagem óssea local (MOTTA,
2003).
À medida que os osteoblastos são circundados pela matriz óssea que secretam,
deixam de ser células poligonais e desenvolvem extensões longas e delgadas. Nesse
momento, o metabolismo dessas células se altera, cessam a síntese de matriz óssea e
passam a ser chamadas osteócitos. Os osteócitos situam-se em cavidades ou lacunas no
interior da matriz óssea, mas mantêm comunicação entre si através dos longos
prolongamentos citoplasmáticos, que se intercalam e estabelecem vias de transporte de
nutrientes e metabólitos. Os osteócitos sintetizam pequenas quantidades de matriz para
manter a integridade óssea (MOTTA, 2003).
Os osteoclastos são monócitos fusionados que histologicamente aparecem
como células gigantes, multinucleadas (seis a doze núcleos) encontradas ao longo da
superfície do osso. O papel dos osteoclastos é na reabsorção óssea, com a finalidade de
reparação de uma fratura ou mobilização de íons cálcio, realizada continuamente. O
processo de reabsorção é complexo e depende de características especiais da interface
entre o osteoclasto e a superfície óssea, e um espaço fechado forma-se entre a célula e a
matriz. Nesse espaço, o osteoclasto libera enzimas lisossomais e mantém um pH ácido,
de maneira a possibilitar a dissolução da matriz óssea. A ativação do osteoclasto é
dependente da atividade osteoblástica, sendo sua ação limitada em relação ao tempo.
Portanto, os osteoclastos possuem uma ação oposta aos osteoblastos, reabsorvendo a
matriz óssea (LIN, 1996; COTRAN et al., 2000; CORONHO, 2001; MOTTA, 2003).
6
Essas células produzem depressões de reabsorção recortadas conhecidas como lacunas
de Howship, local onde está sendo reabsorvido ativamente o osso mineralizado
(COTRAN et al., 2000).
È interessante salientar que o osteoblasto, mas não o osteoclasto, apresenta
receptores para PTH e vitamina D; receptores para estrógenos são comuns aos dois tipos
de células, e apenas o osteoclasto apresenta receptores para calcitonina.
SUDA et al. (1995) propuseram um modelo hipotético para explicar o papel
das células do estroma/osteoblastos, estimuladas por fatores sistêmicos ou locais, que
induziriam a formação dos osteoclastos. As células do estroma/osteoblastos apresentam
os seguintes receptores: (a) VDR; (b) sistema proteína quinase A; e (c) via glicoproteína
130. Esses receptores são ativados por diferentes estímulos, ou seja, o VDR pela
vitamina D, o sistema quinase A pelo PTH, PTH – proteína relacionada, IL-I, fator α de
necrose tumoral e prostaglandina E2, enquanto a via da glicoproteína 130 é ativada pela
IL-6 (+IL6-sR), IL-11, oncostatina M e LIF. Quando esses receptores são estimulados,
produzem um fator de diferenciação dos osteoclastos, chamado RANKL, molécula
chave para a formação dos osteoclastos, que se liga à membrana do osteoblasto. O
RANKL reconhece receptores RANK nas células progenitoras dos osteoclastos,
estimulando-as na presença de fator estimulante de colônia de macrófago, determinando
diferenciação em osteoclastos e também incrementando a atividade dos osteoclastos
maduros. A interação entre a RANKL e seu receptor nos osteoclastos é controlada pela
OPG. A OPG é um receptor solúvel da família do fator α de necrose tumoral, que age
inibindo a ligação do RANK ao RANKL, assim impedindo o recrutamento, a
proliferação e a ativação dos osteoclastos tendo efeito inibitório sobre células
precursoras dos osteoclastos. O balanço do sistema OPG/RANKL controla a
remodelação óssea. Alterações na concentração dessas substâncias induzidas por
variações dos níveis de outras citocinas, administração de glicocorticóides ou
deficiência de estrogênio podem induzir um aumento do número e da atividade dos
osteoclastos determinando perda de massa óssea (GONZALEZ, 2000; HOFBAUER et
al., 2000).
2.1.1 – Remodelação óssea
Ao longo da vida, o tecido ósseo é continuamente remodelado em um processo
finamente regulado, chamado de remodelamento ósseo. Esse processo envolve o
7
acoplamento da atividade dos osteoblastos e dos osteoclastos. Esse acoplamento é
determinado por uma constante troca de sinais entre os osteoblastos e osteoclastos
(MUNDY e OYAJOBI, 2003).
O remodelamento ósseo ocorre em pequenas unidades de células chamadas de
BRU, que são observadas em vários sítios das superfícies ósseas. A seqüência de
eventos em um sítio de remodelamento, ou seja, em uma BRU, é a ativação-reabsorçãoformação (MUNDY e OYAJOBI, 2003; PEREIRA e TAVEIRA, 2000).
As superfícies ósseas quiescentes são recobertas por células de superfície ou de
revestimento. Em resposta a um estímulo de reabsorção, as células de superfície se
retraem e expõem a superfície celular; ao mesmo tempo, ocorre a diferenciação,
ativação e migração dos osteoclastos aos sítios de reabsorção (superfície exposta). Os
osteoclastos reabsorvem o osso velho e formam uma lacuna, chamada de lacuna de
Howship. Finalmente, os osteoblastos ocupam o sítio de reabsorção e sintetizam a
matriz
extracelular
(osteóide)
que,
após
um
período
de
amadurecimento
(aproximadamente 10 dias), será mineralizada.
Ao final de cada ciclo de remodelamento, a quiescência é restaurada. O
produto final do remodelamento ósseo é a manutenção da integridade óssea (MUNDY e
OYAJOBI, 2003).
O remodelamento ósseo ocorre tanto no osso cortical quanto no trabecular. Em
situações fisiológicas, a reabsorção e a formação são fenômenos acoplados e
dependentes, e o predomínio de um sobre o outro pode resultar em ganho ou perda de
massa óssea (SARAIVA E LAZARETTI-CASTRO, 2002).
2.2 – Osteoporose
A osteoporose é a doença óssea metabólica mais freqüente, sendo caracterizada
por uma diminuição da massa óssea e deterioração da microarquitetura do tecido ósseo,
com aumento da fragilidade óssea e suscetibilidade a fraturas (CORONHO et al., 2001).
Durante a infância e nos primeiros anos da vida adulta, a massa óssea aumenta,
atingindo um pico por volta dos 25 a 30 anos. Perto de 10% do esqueleto está
continuamente ativo, no processo de remodelação. Após a menopausa, devido à redução
dos estrógenos, algumas mulheres passam a perder massa óssea (GARNERO et al.,
1999). Normalmente a reabsorção óssea promovida pelos osteoclastos ocorre primeiro,
seguida por uma atividade acoplada, apesar de bem mais lenta, da linhagem que forma
8
osso novo, osteoblástica (RUSSO, 2001). Se os osteoblastos “falham” nesta fase, uma
perda progressiva do ciclo de renovação se estabelece.
Mulheres na pós-menopausa perdem, nos primeiros cinco anos após a
menopausa, entre 10% a 15% de osso. Depois deste período a porcentagem diminui,
resultando ao final, perda total de 30% a 40% do pico de massa óssea (RECKER, 1993).
Entre 30 e 40 anos após a menopausa, as mulheres podem ter perdido 35% de seu osso
cortical e 50% de osso trabecular (COTRAN et al., 2000).
No entanto, muitas mulheres não apresentam significativa perda de massa
óssea durante os anos após a menopausa e talvez 25% a 30% das mulheres não
experimentem qualquer fratura ao longo de sua vida. Estas mulheres, provavelmente
atingiram alto pico de massa óssea antes da menopausa, e, ou sofrem menos perda óssea
após a menopausa (WASNICH, 1999).
Figura 1 – Microfotografias do osso trabecular normal (a) e osteoporótico (b)
(MARQUES NETO et al., 1995).
A osteoporose está principalmente relacionada com a deficiência do hormônio
ovariano nas mulheres pós-menopausa (JOHNELL, 1996). O estrógeno tem efeito
direto supressivo sobre a atividade osteoclástica. Normalmente, os receptores de
estrógeno estão presentes nos osteoblastos. Quando o estrógeno se liga aos seus
receptores, mediadores químicos são secretados, inibindo a atividade dos osteoclastos
(IQBAL, 2000). O estrógeno protege o osso contra a ação do PTH e interfere no
aumento da síntese e secreção de diversos agentes que influenciam a formação óssea
(LINDSAY, 1995).
A figura 2 mostra um esquema sobre os diversos fatores que interferem no
desenvolvimento da osteoporose.
9
Dieta alimentar
Hábitos de
vida
MENOPAUSA:
- redução no
estrógeno sérico
- aumento da
atividade
osteoclástica
Fatores genéticos
PICO DE MASSA
ÓSSEA
DECLÍNIO DA
MASSA ÓSSEA
Atividade física
Medicamentos
Idade avançada:
- atividade física reduzida
- diminuição da diferenciação das
células osteoprogenitoras em
osteoblastos
- declínio da atividade osteoblástica
- diminuição dos fatores reguladores
locais do crescimento
- diminuição dos receptores de
vitamina D e de sua síntese
OSTEOPOROSE
Figura 2 – Fatores que interferem na osteoporose (NETO e FERNANDES, 2001).
Os roedores estão entre os modelos animais mais utilizados na pesquisa de
osteoporose, sendo o rato, certamente, o mais utilizado. Entretanto outros animais como
primatas, cães, aves e coelhos também têm sido amplamente utilizados. Além destes, o
camundongo aponta como uma perspectiva promissora neste cenário da pesquisa. O rato
tem sido usado há décadas na pesquisa experimental da osteoporose e importantes
contribuições têm sido alcançadas com seu uso como modelo desde o final da década de
1950, quando estudos com este animal demonstraram a habilidade do osteoclasto em
digerir tecido ósseo (SZEJNFELD, 2000).
Estudos experimentais demonstraram que o osso do rato assim como o do
homem, não cresce continuamente durante a sua vida. Em ratas, ocorre um rápido
crescimento até seis meses de idade. Observa-se também um aumento rápido do
comprimento, peso, densidade e conteúdo de cálcio no fêmur de um a três meses de
idade; depois deste período, a razão de crescimento torna-se mais gradual. De seis a
doze meses o crescimento é insignificante e cessa aos dezoito meses (KALU, 1991).
10
2.2.1 – Fatores de risco
Muitos fatores contribuem para o desenvolvimento da osteoporose. A idade, o
sexo e a raça estão entre os principais determinantes da massa óssea e do risco de
fraturas. Além disso, quanto maior a sobrevida do indivíduo, maior é o risco de
desenvolver osteoporose (SZEJNFELD, 2001).
Mulheres são mais suscetíveis à osteoporose do que homens, pois além de
apresentarem perda óssea importante durante a menopausa, possuírem menor densidade
mineral óssea (RIGGS e MELTON, 1986) e terem ossos mais finos e mais leves, têm
maior expectativa de vida, portanto estão mais tempo sob risco (SZEJNFELD, 2001).
Vale ressaltar que as fraturas vertebrais são sete vezes mais comuns em mulheres que
em homens, tendendo a ocorrer duas décadas após a menopausa (MEINÃO et al.,
1998).
Fatores genéticos também são responsáveis pelas variações na massa óssea em
diferentes grupos étnicos e raciais. As mulheres brancas possuem baixos índices de pico
de massa óssea na idade adulta e apresentam maior prevalência de osteoporose. Estimase que 30% de todas as mulheres brancas na pós-menopausa terão pelo menos uma
fratura osteoporótica durante a vida, incidência que aumenta com a idade avançada. A
incidência de fraturas de fêmur em mulheres brancas é duas vezes maior do que em
mulheres negras (SZEJNFELD, 2001).
Além disso, o histórico de fraturas na família, baixo nível de cálcio ou vitamina
D, uso excessivo de álcool, baixo índice de massa óssea no corpo, tabagismo, alta
ingestão de cafeína, estilo de vida sedentário ou imobilização e uso contínuo de
corticosteróide, anticonvulsivante, tiroxina ou heparina (LENCHIK e SARTORIS,
1997, MARQUES NETO et al., 1995) também contribuem para o desenvolvimento da
osteoporose.
2.2.2 – Prevenção e tratamento da osteoporose
A prevenção da osteoporose é a ação mais importante, uma vez que não existe
uma medida efetiva para restaurar a qualidade do osso osteoporótico. A abordagem para
a prevenção inclui maximizar o pico de massa óssea e reduzir a perda óssea associada à
pós-menopausa e à idade. As medidas de prevenção consistem em: ingestão adequada
de cálcio, exercício físico, evitar tabagismo e excesso de álcool, terapia de reposição
11
hormonal na pós-menopausa, ou quando houver contra-indicações à terapia de
reposição hormonal, usar outras opções terapêuticas, como bifosfonatos; suplementação
de vitamina D nos idosos, estratégias para redução de queda nos idosos entre outras
(CORONHO et al., 2001).
A intervenção terapêutica tem como objetivo específico a prevenção de
fraturas, estabilizar ou alcançar um aumento moderado na massa óssea e maximizar a
função física.
2.2.2.1 – Cálcio e vitamina D
Muitos estudos têm demonstrado que com o avançar da idade ocorre declínio
na absorção de cálcio por deficiência de vitamina D e ou redução renal da atividade da
1-α hidroxilase. Sabe-se que o consumo de quantidades adequadas de cálcio é
importante para manutenção da massa óssea. Os ossos são considerados reservas de
cálcio, contendo 99% de todo cálcio do organismo. O cálcio é essencial para toda célula
do corpo, incluindo coração, nervos e músculos (CARVALHO et al., 2002).
A vitamina D é uma vitamina lipossolúvel, formada por um grupo de
compostos que possuem atividade anti-raquitismo, cujos principais compostos são o
ergocalciferol (vitamina D2) e o colecalciferol (vitamina D3). O ergocalciferol, um
esteróide encontrado em vegetais, é derivado do ergosterol, por ação de raios
ultravioleta. O colecalciferol é sintetizado pela ação da luz solar sobre a pró-vitamina
D3, o 7-deidrocolesterol, encontrado na pele de animais (HOLICK, 1994). As vitaminas
D2 e D3 possuem o mesmo potencial biológico em humanos (HOLICK, 1996) e são
comumente denominadas vitamina D.
As principais funções da vitamina D são a manutenção da homeostase do
cálcio e do fósforo no organismo e a mineralização dos ossos. Essa vitamina também
atua em outros tecidos-alvo, não relacionados com a homeostase do cálcio
(PENTEADO, 2003).
A vitamina D também é importante para o osso, por facilitar a absorção de
cálcio e de fósforo, essenciais ao metabolismo ósseo. A deficiência de vitamina D
acarreta redução da absorção de cálcio e conseqüente aumento dos níveis de PTH, o que
promove aumento da reabsorção óssea (CARVALHO et al., 2002). Nos ossos, a maior
função biológica da vitamina D ativa é aumentar a mobilização de estoques de cálcio,
quando a ingestão desse mineral é inadequada, atuando na manutenção dos níveis
12
normais de cálcio no sangue e na reabsorção óssea (LAL et al., 1999; SUDA et al. 1992;
COLLINS e NORMAN, 1991).
Tem sido demonstrado que uma adequada ingestão de cálcio é benéfica para a
massa óssea em qualquer idade. O aumento da ingestão de cálcio maximiza o pico da
massa óssea e reduz a perda óssea na pré-menopausa. A perda óssea nos primeiros três
anos da pós-menopausa é dependente das alterações hormonais e é difícil prevenir sem
a terapêutica de substituição hormonal. No entanto, um estudo demonstrou que a perda
óssea de 2% por ano, verificada no início da pós-menopausa, pode ser reduzida para
0,8% por ano apenas com a suplementação de cálcio, o equivalente a uma redução de
40% (CUMMING, 1990).
De acordo com NIEVES et al. (1998), a suplementação de cálcio na pósmenopausa reduz a perda óssea vertebral em cerca de 40%, e minimiza a perda óssea no
antebraço e no colo do fêmur. Outros estudos na pré-menopausa também demonstraram
que a suplementação diária com sais de cálcio nas doses de 1 grama (PRINCE et al.,
1991) e 1,7 gramas (ALOIA et al., 1994) reduzem a perda óssea.
Um estudo realizado em mulheres com mais de 60 anos de idade com fraturas
vertebrais e que apresentavam ingestão inferior a 1.000 mg de cálcio por dia,
demonstrou que a suplementação diária com 1.200 mg de cálcio durante quatro anos
evitou a perda óssea do antebraço, e reduziu em 59% as novas fraturas vertebrais
(RECKER et al., 1996).
Foi realizado um estudo comparando os resultados da administração de
estrogênios orais na presença e na ausência de suplementação de cálcio. Nos ensaios
clínicos em que houve modificação da dieta ou suplementação de cálcio a quantidade
total diária de cálcio ingerida foi de 1.183 mg, enquanto que naqueles em que não houve
intervenção foi de 563 mg por dia. O aumento anual médio da massa óssea nas
pacientes submetidas à terapia de reposição hormonal, sem suplementação de cálcio, foi
a nível vertebral de 1,3%, do colo do fêmur de 0,9%, e do antebraço de 0,4%. Quando a
terapia hormonal foi acompanhada por ingestão de cálcio observou-se um aumento da
massa óssea superior à soma das partes: 3,3%, 2,4% e 2,1%, respectivamente. Estes
resultados demonstram que a suplementação de cálcio potencializa os benefícios da
terapia estrogênica sobre a massa óssea ao nível da coluna lombar, do colo do fêmur e
do antebraço (NIEVES et al., 1998).
Juntamente com o PTH, a vitamina D exerce papel fundamental na regulação
da concentração extracelular de cálcio. Sua ação primordial é no trato digestivo
13
aumentando a absorção intestinal de cálcio e fósforo. Através de receptores nucleares
encontrados no intestino delgado, a vitamina D aumenta a síntese de proteínas
envolvidas no transporte de cálcio através da mucosa intestinal. No osso,
fisiologicamente atua de forma permissiva na mineralização da matriz protéica óssea.
Frente a níveis reduzidos de cálcio na dieta, sua ação no osso passa a ser indutora da
reabsorção óssea, atuando na manutenção dos níveis normais de cálcio no sangue
(MILLER e PORTALE, 1999, LAL et al., 1999; SUDA et al., 1992).
Nos indivíduos deficientes dessa vitamina, a suplementação aumenta a massa
óssea e diminui o risco de fraturas. Conseqüentemente, nesses casos recomenda-se
suplementação de 400 a 800 UI/dia (LANE e NYDICK, 1999).
Diversas situações podem estar associadas à hipovitaminose D, tais como a
ingestão reduzida da vitamina D, a reduzida exposição ao sol por razões culturais ou por
doença cutânea, a doença crônica hepática ou renal, ou a ingestão de fármacos que
reduzam a ativação ou acelerem a depuração da vitamina D, tais como a fenitoína, a
carbamazepina, o fenobarbital e a rifampicina (HARRIS et al., 1999).
Um grande estudo epidemiológico mostrou que o tratamento com a vitamina D
foi associado com uma redução em 55% das fraturas de quadril nas mulheres idosas
com um reduzido índice de massa corporal (< 20 kg/m2), sugerindo a necessidade de
todas as mulheres idosas serem tratadas com esta vitamina (RANSTAM e KANIS,
1995). Os resultados deste estudo evidenciam a importância de todas as mulheres pósmenopausa receberem doses adequadas de vitamina D. Atualmente parece haver
consenso em considerar a dose diária de 200 UI de vitamina D como insuficiente na
pós-menopausa. DAWSON-HUGHES et al. (1995) demonstraram que nesta dosagem a
vitamina D limita a perda óssea da coluna e do total do esqueleto, mas é inadequada
para minimizar a perda óssea do colo do fêmur.
Um outro estudo realizado em 389 mulheres e homens, com pelo menos 65
anos de idade, demonstrou que a suplementação diária com 500 mg de cálcio e 700 UI
de vitamina D3 durante três anos reduziu a perda óssea no fêmur, na coluna e na
totalidade do esqueleto, assim como a incidência de fraturas não-vertebrais (DAWSONHUGHES et al., 1997). Os resultados deste estudo sugerem que o benefício da
suplementação com cálcio e vitamina D é clinicamente importante na prevenção da
fratura, por isso é recomendada a sua utilização na redução da perda óssea em
indivíduos idosos em ambulatório (LEVINSON e ALTKORN, 1998; STRAUS, 2001).
14
2.2.2.2 – Drogas que inibem a reabsorção óssea
2.2.2.2.1 – Bifosfonato
Os bifosfonatos são análogos sintéticos do pirofosfato, potentes inibidores da
reabsorção óssea mediada por osteoclastos. Estes compostos são extensivamente
utilizados no tratamento de várias doenças ósseas, destacando-se a doença de Paget, a
hipercalcemia maligna, a osteoporose e a doença metastática e osteolítica (RUSSO,
2001; FERNANDES et al., 2005).
Entre os vários compostos denominados bifosfonatos destacam-se o
alendronato, etidronato, pamidronato, clodronato, ibandronato, tiludronato, zoledronato
e risedronato. Todos os bifosfonatos reduzem a excreção urinária dos marcadores
bioquímicos da remodelação óssea (CORONHO et al., 2001).
O mecanismo de ação dos bifosfonatos pode estar relacionado à capacidade de
se fixarem na matriz óssea, pois apresentam uma alta afinidade na ligação aos cristais de
hidroxiapatita; com isso são assimilados pelos osteoclastos e, em seguida, inibindo sua
ação (RIBEIRO e VOLPATO, 2005). A ligação de bifosfonatos aos minerais do tecido
ósseo leva à supressão da reabsorção óssea induzida por osteoclastos tendo uma ação
direta mediada por osteoblastos com atividade anti absortiva (SAHNI et al., 1993;
VITTE et al., 1996).
O alendronato, bifosfonato de terceira geração, foi amplamente estudado e,
devido aos resultados obtidos, é um dos componentes mais utilizados para o tratamento
da osteoporose (CORONHO et al., 2001). Esta droga reduz significativamente a
incidência de todas as fraturas clínicas em pacientes com história de fraturas vertebrais
(DELMAS, 2001). Um estudo recente demonstrou que o tratamento com alendronato
por três anos consecutivos aumentou a densidade mineral óssea vertebral e reduziu o
risco de fraturas vertebrais em mulheres orientais na pós-menopausa com osteoporose
(KUSHIDA et al., 2004).
A apoptose, ou morte celular programada, foi descrita em osteoclastos há
muitos anos e talvez seja a via normal de morte dessas células (RODAN, 1998). O
tempo de vida dos osteoclastos, estimado a partir de estudos histológicos, é de duas a
quatro semanas in vivo e de no máximo duas semanas in vitro. Já foi descrito que os
bifosfonatos aumentam a apoptose de osteoclastos, tanto in vivo quanto in vitro
(HUGHES et al., 1995).
15
Os bifosfonatos contendo nitrogênio como o risedronato, alendronato,
pamidronato e ácido zoledrônico e os não nitrogenados como clodronato e etidronato
causam apoptose de osteoclastos em coelhos. A apoptose dos osteoclastos estaria
envolvida em trocas morfológicas, perda da membrana mitocondrial e ativação de
proteases caspase-3, capazes de clivar substratos peptídicos (BENFORD et al., 2001).
As caspases ocupam função de destaque na execução do programa de morte
celular. Elas estão presentes no citosol sob a forma de pró-enzimas inativas, tornando-se
ativas após clivagem proteolítica à altura de resíduos do ácido aspártico (THOMPSON,
1999).
LIBERMAN et al. (1995) estudaram o efeito do uso de alendronato de sódio
em diferentes doses em 994 mulheres na pós-menopausa com idade de 45 a 80 anos,
com baixa densidade mineral óssea (-2,5 T-score), demonstrando a redução de 21% das
fraturas não vertebrais. Um extenso estudo denominado FIT foi realizado visando
especificamente examinar o efeito da droga em pacientes com alto risco clínico de
desenvolver fraturas e em pacientes com fraturas comprovadas radiologicamente. O
estudo conhecido como FIT 1, com duração de três anos, demonstrou um aumento
médio da densidade mineral óssea de coluna lombar de 8,8% e do fêmur na ordem de
5,9%. Observou-se uma redução de fraturas vertebrais na ordem de 50% e, naqueles
pacientes com uma ou mais fraturas pré-existentes, a redução foi de 90%. No FIT 2
(realizado em 30 centros internacionais), envolvendo 4.432 mulheres na pós-menopausa
com a idade entre 54 e 81 anos com T-score < -1,6 no colo do fêmur, sem fraturas
prévias vertebrais, observou-se que os pacientes que obtiveram melhor resultado em
termos de ganho de massa óssea (aumento da densidade mineral óssea) foram aqueles
que se encontravam no quartil inferior de densidade mineral óssea. A redução de
fraturas de colo do fêmur foi na ordem de 43% no grupo que utilizou a dose diária de
10mg. Efeitos colaterais foram observados em baixos índices (3% de casos de
esofagite).
Além disso, um estudo mostrou que o uso de etidronato em mulheres com
osteoporose na pós-menopausa, na dose de 400 mg/dia durante duas semanas, seguido
por suplementação de cálcio (500 mg/dia por três meses), com repetição do ciclo a cada
três meses durante três anos, proporcionou um ganho de massa óssea vertebral de 5% e
redução de risco de fraturas vertebrais (CORONHO et al., 2001).
Estudos realizados com o risedronato, na dose de 5mg diários, revelou
excelentes resultados em termos de ganho de densidade mineral óssea, redução de
16
fraturas e capacidade de prevenir a perda de massa óssea em homens em uso de
corticosteróides (REGINSTER et al., 2000).
DA PAZ et al. (2001) avaliaram o efeito do 17 β-estradiol e do alendronato na
prevenção da perda óssea em ratos ovariectomizados. Os animais receberam por via
subcutânea 17 β-estradiol na dose de 30 µg/kg de peso corporal ou alendronato na dose
de 0,1 mg/kg de peso corporal. Após 6 semanas de tratamento houve uma redução
significativa na densidade mineral óssea no osso trabecular (fêmur distal) nos ratos
ovariectomizados.
Tanto o alendronato quanto o 17 β-estradiol aumentaram a
densidade mineral óssea, sendo que esse efeito foi mais pronunciado nos animais que
receberam alendronato. A histomorfometria do fêmur distal mostrou uma redução no
volume trabecular no grupo ovariectomizado, e um aumento nos dois grupos tratados,
principalmente no grupo que recebeu alendronato. Entretanto, aumento na espessura
trabecular só foi observado no grupo que recebeu 17 β-estradiol. Além disso, houve
uma redução nos níveis séricos de osteocalcina e de deoxipiridinolina nos dois grupos
tratados. Embora ambas as drogas fossem eficazes em inibir perda óssea, o alendronato,
na dose utilizada, apresentou melhores resultados no que se refere ao aumento da massa
óssea.
2.2.2.2.2 – Calcitonina
A calcitonina é um polipeptídio hormonal com 32 aminoácidos, secretado
principalmente pelas células G da tireóide e está relacionado à manutenção dos níveis
normais de cálcio plasmático e à proteção do osso contra a desmineralização. Elevações
agudas dos níveis de cálcio plasmático estimulam a secreção de calcitonina, que, por
sua vez, exerce seu efeito hipocalcemiante inibindo a ação dos osteoclastos na
reabsorção óssea e retardando a absorção intestinal de cálcio (COIFMAN et al., 1997).
Devido às suas propriedades antiosteoclásticas, antiinflamatória e analgésica,
tem sido amplamente empregada no tratamento de distúrbios clínicos e biológicos
caracterizados por excessiva remodelação óssea, como osteoporose pós-menopausa,
doença de Paget e hipercalcemia maligna (CARSTENS JR e FEINBLATT, 1991; RICO
et al., 1995).
Sabe-se que a calcitonina é usada como inibidor da reabsorção óssea
osteoclástica, proporcionando um aumento discreto na densidade mineral óssea. O
17
mecanismo de ação da calcitonina é a redução da atividade do osteoclasto; portanto, não
altera o seu número. A sua ação se faz através de um receptor específico do osteoclasto
(STOCK et al., 1997; CORONHO et al., 2001).
Um estudo com calcitonina intranasal, na dose de 200 UI/dia, de cinco anos de
duração, duplo-cego, randomizado, controlado com placebo em mulheres na pósmenopausa com uma ou mais fraturas vertebrais, mostrou uma redução no risco de
novas fraturas vertebrais de 36%. Não houve redução no risco de fraturas
extravertebrais (STOCK et al., 1997).
Estudo realizado em pacientes utilizando 100 UI de calcitonina sintética de
salmão associada a 500 mg de cálcio elementar quando comparado com um grupo
utilizando apenas cálcio mostrou que os pacientes que utilizaram calcitonina sofreram
apenas um sexto de fraturas vertebrais (RICO et al., 1992).
2.2.2.2.3 – Estrógenos
Os estrógenos são hormônios que promovem as características femininas,
controle reprodutivo e gravidez, influenciam a pele, os ossos, sistema cardiovascular e
imunidade (TAPIERO et al., 2002). Esses hormônios desempenham um papel
importante na regulação do metabolismo ósseo. Os estrógenos, bem como os
andrógenos têm mostrado inibir os osteoblastos de liberar fatores de estimulação local
da osteoclastogênese. Todavia, redução na concentração desses hormônios na circulação
aumenta a formação de precursores de osteoclastos no osso e assim o número de
osteoclasto maduro (JILKA et al., 1992; WEINSTEIN et al., 2000). O estrógeno
também induz a expressão do gene que codifica a síntese dos receptores para
progesterona nos osteoblastos e, mediado por esse mecanismo, postula-se que ele
estimularia indiretamente a síntese de matriz óssea (RICKARD et al., 2002).
Recentemente foi comprovado que a OPG, um membro da família de
receptores para o fator α de necrose tumoral presente nos osteoblastos, inibe a
reabsorção óssea por impedir a diferenciação e a atividade dos osteoclastos
(NAKAMURA et al., 2002; HAYNES et al., 2001). O estrógeno estimula a síntese de
OPG e postula-se que essa seja uma das explicações pela qual a ação principal do
estrógeno sobre o osso seja a de inibir a reabsorção óssea (LIAO et al., 2002).
O estrógeno estimula a produção de calcitonina, que previne a remoção de
cálcio do osso (RICHART e LINDSAY, 1984). O osso trabecular tende a ser mais
18
sensível do que osso cortical a variações nos níveis de estrógeno. A redução dos níveis
de estrógeno tem sido relacionada à alta incidência de fraturas vertebrais. Vale lembrar
que as vértebras são constituídas primariamente de osso trabecular (RIGGS e
MELTON, 1983).
2.2.2.3 – Drogas que estimulam a formação óssea
2.2.2.3.1 – Fluoreto
O flúor (fluoreto de sódio e monofluorofosfato) é um potente estimulador da
formação de osso trabecular. No entanto, a dose efetiva é muito próxima da dose tóxica
e há controvérsias a respeito da qualidade do osso formado, pois pode haver formação
de osso fluorado, o que limita sua utilização. Também existem relatos de osteomalácia
associada ao seu uso. Para minimizar os efeitos citados acima, o flúor deve ser
administrado associado ao cálcio e à vitamina D. Outros efeitos colaterais incluem
náuseas, vômitos, epigastralgia, diarréia, melena e artralgia. A dose recomendada é de
0,5 a 1 mg/kg/dia, porém são necessários maiores estudos clínicos que comprovem sua
eficácia no tratamento da osteoporose. No Brasil, sua forma isolada não está disponível
comercialmente, podendo ser utilizado na forma de polivitamínicos (SZEJNFELD,
1995; PINTO NETO et al., 2002).
Estudos realizados por FARLEY et al. (1983) demonstraram que os fluoretos
podem influenciar diretamente a atividade das células osteoblásticas. Estes autores
observaram que concentrações micromolares de fluoretos aumentam a proliferação e a
atividade de fosfatase alcalina em células ósseas derivadas de embrião de galinha. Além
disso, observou-se que fluoreto aumenta o crescimento e a mineralização da cultura
óssea. Observações similares foram encontradas em células ósseas humanas derivadas
do osso trabecular de cabeça de fêmur (WERDEGAL et al., 1988). A fosfatase alcalina
é um marcador de formação óssea.
Entretanto, outros estudos utilizando fluoretos têm demonstrado resultados
negativos sobre a proliferação de osteoblastos humanos. Os autores sugerem que esses
resultados ocorrem porque os osteoblastos derivados de ossos de animais experimentais
ou pacientes osteoporóticos tratados com fluoreto exibem uma maior capacidade para
proliferar in vitro, com isso conclui-se que, in vivo, o fluoreto pode atuar indiretamente
sobre a síntese local de alguns fatores de crescimento ou exercer uma ação preferencial
19
sobre a subpopulação de células osteoblásticas. Com relação a esta hipótese, foi
sugerido que precursores de osteoblastos são mais sensíveis à ação de fluoreto que
osteoblastos maduros (CAVERZASIO et al., 1998).
Em adição ao seu efeito mitogênico sobre células como osteoblastos, o fluoreto
tem mostrado influenciar o processo de diferenciação e formação das células ósseas.
Muitos estudos têm mostrado um aumento na atividade da fosfatase alcalina em células
osteoblásticas em resposta ao fluoreto (CAVERZASIO et al., 1998). Além disso, efeito
estimulatório sobre a produção de osteocalcina foi observado em células estromais
derivadas de medula humana (KASSEM et al., 1994). Estas observações estão de
acordo com estudos in vivo indicando um aumento na formação óssea em indivíduos
tratados com fluoreto com um correspondente aumento desses dois marcadores da
diferenciação de células osteoblásticas. Estudos também têm demonstrado que fluoreto
aumenta seletivamente o transporte de fosfato inorgânico dependente de sódio em
células osteoblásticas. Não obstante, estudos in vitro demonstraram que a presença de
fosfato inorgânico aumenta a resposta mitogênica induzida por fluoreto em cultura de
células de galinha (CAVERZASIO et al., 1998).
2.2.2.3.2 – Paratormônio
O PTH é um hormônio polipeptídico com 84 aminoácidos sintetizado nas
glândulas paratireóides a partir de um precursor, o pré-pró-paratormônio, sendo um dos
responsáveis pelo controle da calcemia e o mais importante na regulação das alterações
agudas das concentrações extracelulares de cálcio. A seqüência dos primeiros 34
aminoácidos na extremidade amino-terminal é responsável pela sua atividade biológica.
Além da molécula intacta do PTH, são secretados fragmentos amino-terminais, carboxiterminais e a sua porção média (POTTS, 2001, BRACCO et al., 2003).
Após a sua síntese, o PTH permanece armazenado em vesículas de secreção e
pode ser metabolizado no meio intracelular, sendo que os fragmentos amino-terminais
são degradados e os fragmentos carboxi-terminais de tamanhos variados são liberados
para a circulação, juntamente com a forma ativa (MARX, 2000). O PTH tem uma meia
vida de aproximadamente 2 minutos, sendo que a sua metabolização ocorre na maior
parte no fígado (70%), rins (20%) e em menor quantidade em outros tecidos, como o
tecido ósseo (POTTS, 2001). Os fragmentos carboxi-terminais, entretanto, são
20
excretados pelo rim e possuem meia-vida mais prolongada, com efeito biológico ainda
não esclarecido (GRACITELLI et al., 2002).
Uma elevação dos níveis plasmáticos de PTH está envolvida na fisiopatologia
da perda óssea na osteoporose senil, como conseqüência da deficiência de vitamina D
(RIGGS et al., 1998).
A ação do PTH se dá diretamente no rim e no osso e indiretamente no trato
digestivo, sempre resultando em incremento dos níveis séricos de cálcio. No rim,
através de receptores específicos nos túbulos contorcidos distais, o PTH determina a
reabsorção de cálcio e magnésio e a excreção de fosfato e bicarbonato. Este órgão é
particularmente responsável pelos ajustes mais rápidos da calcemia (POTTS, 2001).
No osso, age sobre a reabsorção, regulando a liberação de cálcio e fosfato para
o líquido extracelular. Embora os osteoclastos sejam os responsáveis por essa última
ação, diferentemente dos osteoblastos, essas células não possuem receptores específicos
para o PTH. Portanto, a reabsorção óssea osteoclástica estimulada pelo PTH decorre da
liberação de fatores parácrinos pelos osteoblastos, ou ainda pelo estímulo de expressão
de proteínas de membrana nos osteoblastos, que estimulam o amadurecimento e
atividade dos osteoclastos (POTTS, 2001). As ações do PTH no osso variam de acordo
com as suas concentrações plasmáticas. Em níveis fisiológicos, esse hormônio tem um
efeito ósseo anabólico. A secreção intermitente do PTH associa-se com aumento do
osso trabecular e cortical em ratas (GUINESS-HEY e HOCK, 1984) e com a
manutenção e/ou aumento da massa óssea trabecular em humanos (ROSEN e
DONAHUE, 1996). Já a sua secreção contínua e/ou aumentada apresenta efeito
catabólico, ocorrendo perda de massa óssea como, por exemplo, pode ser observado no
hiperparatireoidismo primário sintomático.
No trato digestivo, o PTH controla indiretamente a absorção intestinal de cálcio
e fósforo, através da regulação da atividade da enzima 25(OH)D-1α-hidroxilase renal e
conseqüente síntese de vitamina D (BROWN et al., 1993).
As concentrações de cálcio ionizado no líquido extracelular são os principais
determinantes da secreção do PTH. Modificações dos níveis séricos de cálcio resultam
em respostas rápidas da secreção desse hormônio. A detecção de variações na calcemia
ocorre através de sensores de cálcio presentes nas paratireóides, que consistem em
receptores protéicos localizados na superfície da membrana das células principais
(BROWN et al., 1993).
21
As ações diferenciadas do PTH sobre a formação e reabsorção óssea têm sido
intensamente estudadas e novos aspectos sobre sua ligação com o receptor e as vias de
sinalização intracelular nos osteoblastos têm sido descritas. Os receptores de PTH foram
identificados no tecido ósseo, nos osteoblastos e nos seus precursores, as células
progenitoras pluripotentes de linhagem mesenquimal (SWARTHOUT et al., 2002). Nos
osteoclastos ou em seus precursores não se identificou até o momento nenhum receptor
de PTH, o que nos leva a concluir que todos os efeitos desse hormônio sobre a
reabsorção óssea são intermediados pelos osteoblastos (STREWLER, 2001).
Ao mesmo tempo que o PTH estimula a reabsorção óssea para manter as
concentrações plasmáticas de cálcio, já mantém garantida a recuperação deste tecido
ósseo pelos osteoblastos, mantendo o equilíbrio entre formação e reabsorção (CALVI et
al., 2001).
A ativação dos osteoblastos pelo PTH resulta na expressão de genes
importantes para a degradação da matriz, a produção de fatores de crescimento e a
estimulação e recrutamento dos osteoclastos. Seus efeitos biológicos conhecidos se
fazem através de um receptor de membrana acoplado à proteína G. A maioria dos
efeitos sobre os osteoblastos é mediada pelo receptor acoplado à proteína Gs, que
estimula a adenil-ciclase elevando as concentrações de AMPc e o sistema da proteínaquinase A, enquanto que o receptor acoplado à proteína Gq ativa a fosfolipase C, a
proteína-quinase C e o metabolismo dos inositóis-fosfatos. O equilíbrio entre esses dois
sistemas permite o efeito biológico global do PTH (GOLTZMAN, 1999).
2.3 – As estatinas e o metabolismo ósseo
As estatinas são inibidoras por competição da HMG-CoA redutase, enzima
implicada na conversão de acetato em ácido mevalônico na cadeia de reações químicas,
que ocorrem para a síntese de colesterol. Com a redução da quantidade de colesterol
formado no hepatócito ocorre maior síntese de receptores de membrana que captam
lipoproteínas ricas em colesterol, as quais se reduzem na circulação (WITZTUM, 1995;
MAEDA et al., 2003). Portanto essas drogas são utilizadas na redução dos níveis de
colesterol no sangue e na prevenção de doenças cardiovasculares. Dentre
os
vários
compostos denominados estatinas incluem a atorvastatina, a fluvastatina, a pravastatina,
a mevastatina e a simvastatina.
22
Alguns pesquisadores acreditam que as estatinas possam, também, ter uma
ação sobre o tecido ósseo, agindo nos osteoclastos, reduzindo a reabsorção e nos
osteoblastos, aumentando a formação óssea (WADA et al., 2000).
Recentemente as estatinas estão sendo relacionadas aos efeitos protetores na
perda óssea. Entretanto, os mecanismos pelos quais as estatinas podem afetar o
metabolismo ósseo são pouco esclarecidos. VIERECK et al. (2005) avaliaram o efeito
da atorvastatina na produção RANKL e da OPG, os quais são essenciais para a biologia
celular dos osteoclastos. Enquanto RANKL aumenta a formação e a ativação do
osteoclasto, desse modo, promovendo a perda óssea, a OPG age como um receptor
solúvel e antagoniza os efeitos do RANKL. Em osteoblastos humanos, a atorvastatina
aumentou os níveis de RNA mensageiro de OPG e a secreção dessa proteína, sendo que
o máximo de efeito ocorreu na dose de 10(-6) M. Os experimentos indicaram que o
efeito estimulatório dose-dependente da atorvastatina sobre os níveis de RNA
mensageiro de OPG ocorre após 24 horas e sobre a secreção de OPG, após 48 a 72
horas. Além disso, a atorvastatina anulou o efeito inibitório dos glicocorticóides sobre a
produção de OPG. O tratamento com atorvastatina em osteoblastos humanos aumentou
a expressão de marcadores de diferenciação osteoblástica, osteocalcina e fosfatase
alcalina. Os dados sugerem que a atorvastatina aumenta a diferenciação osteoblástica e
a produção de OPG, o que pode contribuir para a redução da perda óssea.
A ação das estatinas sobre os osteoclastos não está ainda bem estabelecida.
Sabe-se que as estatinas atuam numa etapa da síntese de colesterol, bloqueando a
conversão de HMG-CoA em ácido mevalônico. A partir disto, acredita-se que a
formação de geranil pirofosfato e farnesil pirofosfato, metabólitos posteriores nesta
cascata, ficaria deficiente, inibindo a prenilação de proteínas (inclusão de um grupo
prenil lipídico na proteína). A prenilação é fundamental na regulação do metabolismo
dos osteoclastos e sua inibição resulta em maior apoptose dessas células. Esta hipótese
foi levantada baseando-se na ação dos bisfosfonatos sobre o metabolismo do colesterol.
Os bisfosfonatos inibem diretamente a síntese de farnesil pirofosfato, impedindo a
prenilação das proteínas e, conseqüentemente, reduzindo a reabsorção óssea (Figura 3)
(CUMMINGS e BAUER, 2000; ROGERS, 2004).
TANRIVERDI et al. (2005) avaliaram o efeito de risedronato isoladamente (5
mg/dia) e risedronato (5 mg/dia) em associação com a atorvastatina (20 mg/dia) em 120
mulheres hipercolesterolêmicas na pós menopausa, com osteoporose ou osteopenia.
Após seis meses de terapia, os pesquisadores observaram que o grupo que recebeu o
23
risedronato em associação com a atorvastatina apresentou aumento significativamente
maior na densidade mineral óssea da coluna lombar (1,58% contra 0,75%, p < 0,05),
mas não encontraram nenhuma diferença na densidade mineral óssea do quadril. Além
disso, a terapia com o risedronato em associação com a atorvastatina melhorou o perfil
lipídico no soro (LDL e colesterol total). Os autores concluíram que as estatinas
apresentam efeitos aditivos modestos em relação aos bifosfonatos em melhorar a
densidade mineral óssea da coluna lombar em mulheres hipercolesterolêmicas na pósmenopausa com osteoporose ou osteopenia, mas relatam a necessidade de se realizar
novos estudos em longo prazo com tamanho de amostra adequado para avaliar os
efeitos da estatina isoladamente ou em associação, no metabolismo ósseo, com objetivo
de prevenir o desenvolvimento de fraturas.
HMG - CoA
ESTATINAS
Mevalonato
Dietilalil – PP
Isoprenil – PP
Geranil – PP
BIFOSFONATO
Inibição da Farnesil – PP sintase
Farnesil – PP
Prenilação protéica
COLESTEROL
Geranilgeranil – PP
Figura 3 – Mecanismo de ação das estatinas e bifosfonatos na cascata da prenilação de
proteínas (BRAGA JR et al., 2002).
24
Pesquisadores avaliaram o efeito da atorvastatina sobre a densidade mineral
óssea de ratos ovariectomizados com oito semanas de idade. Seis semanas após a
realização da cirurgia os animais receberam veículo, atorvastatina, 17 β-estradiol e o
PTH humano. O tratamento com o 17 β-estradiol (10 μg/kg) por 12 semanas aumentou
significativamente a densidade mineral óssea lombar, enquanto a atorvastatina (2
mg/kg) não apresentou nenhum efeito. A combinação da atorvastatina com o 17 βestradiol aumentou significativamente a densidade mineral óssea da vértebra lombar e
da área de metáfise femural quando comparada com os grupos que receberam 17 βestradiol ou da atorvastatina isoladamente. Baixas dosagens de PTH humano (1 g/kg)
não alteraram a densidade mineral óssea lombar ou femural, enquanto doses mais
elevadas (17,5 μg/kg) aumentaram significativamente a densidade mineral óssea. A
administração de atorvastatina em associação com PTH humano (1-34) (1 μg/kg)
durante oito semanas aumentou significativamente a densidade mineral óssea da
vértebra lombar e da área de metáfise do fêmur. Estes resultados demonstraram que a
administração crônica de atorvastatina parece aumentar a densidade mineral óssea da
vértebra lombar e da área de metáfise do fêmur dos ratos ovariectomizados tratados com
doses submáxima de 17 β-estradiol e de PTH humano (1-34) (KAWANE et al., 2004).
REID et al. (2001) avaliando dados de fraturas de um ensaio clínico controlado
e randomizado sobre o efeito das estatinas na mortalidade por doença coronariana, não
encontraram evidências de redução de fraturas. Os autores sugerem que um pequeno
efeito das estatinas na redução de fraturas não pode ser totalmente excluído, mas é
improvável que elas tenham eficácia clínica significante na redução do risco de fraturas.
BJARNASON et al. (2001) num estudo que avaliou o efeito metabólico da
fluvastatina e vitamina C nos parâmetros de marcadores da remodelação óssea,
randomizaram 68 mulheres pós-menopausa com osteoporose e hipercolesterolemia para
o tratamento por 12 semanas com fluvastatina (dose de 40 mg) + vitamina C (dose de
500 mg) ou apenas vitamina C. Foram avaliados os marcadores bioquímicos de
formação óssea (osteocalcina e fosfatase alcalina total) e da reabsorção óssea
(telopeptídeos carboxiterminais do colágeno tipo I sérico e urinário). Os autores
observaram que a fluvastatina associada à vitamina C não aumentou os marcadores de
formação óssea. Quanto aos marcadores de reabsorção, houve uma redução significativa
quando comparados com os parâmetros iniciais, porém, não houve diferenças nesses
25
marcadores no grupo tratado e não-tratado. Diante desses dados, os autores concluíram
que a fluvastatina não teve influência nos parâmetros de remodelação óssea.
VIERECK et al. (2005) ao avaliarem o efeito da atorvastatina em osteoblastos
humanos observaram que esse medicamento aumentou a expressão de marcadores de
diferenciação osteoblástica, osteocalcina e fosfatase alcalina.
MÉIER et al. (2000) estudaram a associação entre fraturas e o uso de estatinas.
Eles avaliaram 91.611 pacientes com idade entre 50 e 89 anos que foram divididos em
três grupos: grupo 1, constituído de indivíduos que receberam pelo menos uma
prescrição de estatina, fibrato ou qualquer outra droga lipídio redutora; grupo 2, de
pacientes com diagnóstico de hiperlipidemia que não receberam nenhuma prescrição de
droga lipídio redutora; e o grupo 3 que compreendeu 50.000 indivíduos sem diagnóstico
de hiperlipidemia e sem prescrição de droga lipídio redutora em nenhum momento. Eles
seguiram cada paciente desde a primeira prescrição, até o indivíduo desenvolver fratura,
abandonar o estudo ou morrer. Os autores observaram uma redução significativa no
risco de fratura, que chegou a 45% para todos os tipos de fratura e atingiu 88% no caso
de fratura de quadril, naqueles pacientes que receberam alguma prescrição de estatina
durante sua vida.
2.4 – Indução de osteoporose por glicocorticóides
Os glicocorticóides são hormônios de natureza esteróidica que atuam em uma
variedade de órgãos e sistemas. O produto natural, cortisol ou hidrocortisona, é
considerado o principal hormônio do córtex supra renal, e, a partir de modificações
introduzidas em sua molécula, foram sintetizados inúmeros derivados com atividade
glicocorticóide maior e mais prolongada, cujas indicações terapêuticas são amplas e
variadas (CORONHO et al., 2001).
Os glicocorticóides apresentam vários efeitos sobre a resposta imune em vários
locais
e
possuem
propriedade
antiinflamatória
e
imunossupressiva
quando
administrados terapeuticamente (PATSCHAN et al., 2001). Além disso, os
glicocorticóides estão associados com perda óssea e um subseqüente aumento de
fraturas em humanos. Estes efeitos sobre o tecido ósseo podem ser devido a inúmeros
fatores, incluindo aumento da eliminação de cálcio renal e diminuição da absorção de
cálcio intestinal. Um balanço negativo de cálcio devido a mudanças no transporte de
cálcio renal e intestinal é responsável pelo hiperparatireoidismo secundário em
26
pacientes tratados com glicocorticóide (BIKLE e PILLAI, 1993; KLEIN et al., 1977;
LUKERT e RAISZ, 1990; REID, 1997). Embora os mecanismos precisos permaneçam
obscuros, a eliminação urinária aumentada de cálcio que ocorre em resposta ao
glicocorticóide, provavelmente é uma conseqüência da reabsorção tubular diminuída
(REID, 1997; REID e IBBERTSON, 1987). Isto pode ser um efeito a longo prazo, uma
vez que, uma única dose de prednisolona aumenta os níveis de cálcio do soro mas não
altera significativamente o nível de cálcio urinário (YONEMURA et al., 1999).
Os glicocorticóides interferem no metabolismo do cálcio em diferentes locais,
como intestino, rins e unidades de remodelação óssea, produzindo um balanço negativo
constante desse íon. No trato gastrointestinal, a influência mais evidente é a diminuição
de sua absorção, através da inibição do transporte ativo transcelular secundário ao
antagonismo sobre a vitamina D. Entretanto, parece existir uma associação entre os
níveis de glicocorticóides e a absorção de cálcio pelo duodeno, de tal forma que doses
baixas aumentam enquanto doses elevadas reduzem sua absorção. A corticoterapia
também influencia negativamente o metabolismo renal de cálcio, aumentando a sua
excreção urinária, devido à redução da reabsorção tubular renal (SEGAL e LANE,
1997).
Como previamente relatado sempre se acreditou que o hiperparatireoidismo
secundário acelera o desenvolvimento de osteoporose induzida por glicocorticóide. O
efeito estimulatório direto de glicocorticóides sobre a síntese e secreção de PTH tem
sido observado in vitro: administração de dexametasona aumenta a secreção de PTH de
células da paratireóide de cultura bovina e a secreção de PTH estimulada por cortisol de
culturas de glândulas de paratireóide de rato (AU, 1976; SUGIMOTO et al., 1989).
Concentrações baixas de esteróides sexuais na circulação em mulheres após a
menopausa ou ovariectomizadas levam ao aumento da perda óssea. Entretanto,
reposição hormonal pode prevenir essas mudanças. Na ausência de reposição hormonal,
a osteoporose pode se desenvolver como um resultado de uma redução na formação
óssea e estimulação na reabsorção óssea (DUCY et al., 2000; SCHOT e SCHUURS,
1990; WEINSTEIN et al., 2000). O efeito inibitório dos glicocorticóides sobre a síntese
e secreção de hormônios sexuais contribui para a osteoporose induzida por
glicocorticóides.
Os glicocorticóides modificam a atividade metabólica e proliferativa das
células ósseas. Eles inibem a osteoblastogênese e osteoclastogênese e reduzem a meia
vida dos osteoclastos. Eles também são potentes repressores da função osteoblástica e
27
provavelmente estimuladores da maturação dos osteoclastos. Em conjunto, estas
mudanças conduzem à osteoporose induzida por glicocorticóide, principalmente devido
à formação óssea reduzida. Um aumento na reabsorção óssea parece estar menos
envolvido (PATSCHAN et al., 2001).
↑ Mecanismo de
reabsorção
Alterações no
metabolismo
mineral
↓ Ação da Vitamina D
↓ Absorção de cálcio
↑ Excreção renal de cálcio
Distúrbios
endócrinos
Hipófise: ↓ LH, FSH, GH
Gônadas:
↓
testosterona,
estradiol
↑ PTH
OSTEOPOROSE
↓ Osteoprotegerina
↑ RANKL
Tecido ósseo
GLICOCORTICÓIDE
D3
↓ Mecanismo de
formação óssea
↑ Apoptose de osteoblastos
↓ Fatores de crescimento
Tecido ósseo
Figura 4 – Aspecto multifatorial da fisiopatologia da osteoporose induzida por
glicocorticóide (LANNA et al., 2003).
Além disso, a corticoterapia prolongada produz, habitualmente, uma tendência
à diminuição da tolerância aos carboidratos, podendo, em alguns casos, resultar em
hiperglicemia de jejum e glicosúria. Contribui para a redução da tolerância aos
carboidratos a presença de resistência periférica à ação da insulina, documentada pela
elevação dos níveis basais de insulina, resultando em longo prazo, em hiperplasia das
células β pancreáticas. Dessa maneira, como os glicocorticóides estimulam a produção
de glicose mas diminuem sua utilização periférica, pacientes em uso crônico de doses
farmacológicas de glicocorticóides habitualmente apresentam-se intolerantes aos
carboidratos (com teste oral de tolerância à glicose ou curva glicêmica alterada) e, até
mesmo, com diabetes mellitus clinicamente manifesto, com hiperglicemia de jejum e
glicosúria, naqueles geneticamente predispostos (CORONHO, 2001).
28
2.5 – Flavonóides
Os flavonóides são compostos polifenólicos encontrados nos alimentos,
principalmente nas verduras e frutas (NIJVELDT et al., 2001). São derivados do grupo
benzo-γ-pirano e possuem um esqueleto de 15 átomos de carbono. Por possuírem largo
espectro de atividades biológica e farmacológica, têm recebido ampla atenção dos
pesquisadores desde a década de 90 (METODIEWA et al., 1997). São denominados
fitoquímicos, devido à origem vegetal, sendo considerados princípios ativos em muitas
plantas (REPETTO e LLESUY, 2002).
Mais de seis mil diferentes flavonóides foram identificados dentro da maior
classe de flavonóides que incluem flavonóis, flavonas, flavanonas, catequinas,
antocianinas, isoflavonas, diidroflavonóis e chalconas. Esses compostos são absorvidos
no trato gastrintestinal de homens e animais e são excretados intactos ou como
metabólitos na urina e fezes (NIJVELDT et al., 2001; COOK e SAMMAN, 1996;
PETERSON e DWYER, 1998).
Os flavonóis mais comuns são o kaempferol, a quercetina e a miricetina, e
entre eles o mais importante é sem dúvida a rutina (3-rutinosil-quercetina) composto
com atividade biológica (BOBBIO e BOBBIO, 1992).
As isoflavonas estão presentes principalmente em produtos à base de soja, mas
também em outros grãos como na ervilha, feijão e seus derivados e em legumes
(LIGGINS et al., 2000). Entre elas destacam-se a genisteína (Figura 5), a daidzeína
(Figura 6) e a gliciteína.
O
HO
OH
O
OH
Figura 5 – Estrutura química da genisteína
29
O
HO
O
OH
Figura 6 – Estrutura química da daidzeína
A ipriflavona (7-isopropoxiisoflavona) é um derivado sintético não hormonal
produzido comercialmente da daidzeína (Figura 7).
O
CH3
H3C
O
O
Figura 7 – Estrutura química da ipriflavona.
Os nutricionistas estimam que a ingestão média de flavonóides em uma dieta
normal é de 1–2 g por dia (HAVSTEEN, 2002) e por serem consumidos em grandes
proporções dentro de uma dieta humana regular, esses compostos desempenham um
importante papel na saúde humana.
2.5.1
– Efeito dos flavonóides no metabolismo ósseo
Nos últimos anos tem-se declarado que os fitoestrógenos seriam alternativas
naturais à terapia de reposição hormonal na menopausa. Os fitoestrógenos encontrados
em várias plantas comestíveis podem ter efeitos estrogênicos e antiestrogênicos.
Estudos epidemiológicos, comparando a população asiática versus ocidental, têm
sugerido que uma dieta rica em fitoestrógenos melhoraria os sintomas da menopausa e
protegeria contra câncer de mama, perda óssea e doenças cardiovasculares.
Conseqüentemente existe um movimento global incentivando o consumo de alimentos
30
ricos em fitoestrógenos, dentre eles os flavonóides, e de comprimidos de extratos
concentrados de isoflavonas (CLAPAUCH et al., 2002).
As primeiras evidências do efeito benéfico dos fitoestrógenos nos ossos vêm da
observação de que populações que ingeriam altos teores de soja em sua dieta natural
apresentavam menores índices de fratura do colo do fêmur que outras populações que
não tinham esse hábito (SOMEKAWA et al., 2001; MEI et al., 2001).
Os fitoestrógenos são compostos de estruturas não esteroidais, porém
semelhantes ao estrógeno; presente em frutas, vegetais e grãos, e apresentam baixa
atividade estrogênica (SILVA et al., 2003; LIGGINS et al., 2000). Os tipos mais
comuns são as cumestranas, lignanas e isoflavonas. Em humanos, os fitoestrógenos
apresentam tanto os efeitos estrogênicos, como os efeitos antiestrogênicos, dependendo
da concentração de estrógeno endógeno circulante e dos seus receptores estrogênicos. A
soja é rica em isoflavonas, principalmente a genisteína e a daidzeína, que são os
compostos fitoestrógenos com maior evidência de atividade estrogênica, e estão sendo
pesquisados para o tratamento dos sintomas da menopausa (SILVA et al., 2003).
A freqüência da osteoporose varia nas populações em diferentes regiões
geográficas, com menor incidência em mulheres asiáticas que as dos países ocidentais.
Mulheres japonesas têm menor risco de sofrerem fraturas de quadril que mulheres
brancas. Postula-se que tal fato se deva a fatores como estatura, exercícios físicos,
equilíbrio e o tipo de dieta adotada, incluindo consumo de fitoestrógenos e cálcio. Um
estudo que comparou a taxa de fraturas em Hong Kong e nos Estados Unidos,
demonstrou que, em Hong Kong, aos 85 anos, observa-se uma taxa de 1/3 das fraturas
observadas nos Estados Unidos (CLAPAUCH et al., 2002).
DEYHIM et al. (2003) realizaram um estudo com o objetivo de avaliar o efeito
de fitoestrógenos e flavonóides na perda óssea que ocorre no período pós-menopausa.
Foram utilizados ratos ovariectomizados, os quais foram divididos em três grupos:
ovariectomizado, ovariectomizado + 0,575 mg de isoflavona/g de proteína dietética
(0,96 mg/dia) e ovariectomizado + 1,15 mg de isoflavona/g de proteína dietética (1,92
mg/dia). A ovariectomia reduziu a densidade óssea da quarta vértebra lombar, tíbia e
fêmur e aumentou a excreção urinaria de cálcio. De acordo com os resultados obtidos
pode-se concluir que a suplementação de isoflavona na dieta nas duas dosagens não
afetou a densidade mineral óssea e nem os outros parâmetros relacionados ao
metabolismo ósseo, como por exemplo, cálcio total no soro, cálcio ionizado no soro,
magnésio no soro e excreção de cálcio e magnésio na urina. Os autores sugerem que a
31
dosagem de isoflavona usada não foi suficiente para alterar os parâmetros analisados e
que os níveis de suplementação de isoflavona que previne perda óssea, observada por
outros pesquisadores, foram em dosagens superiores aos administrados neste estudo (50
mg por kg de peso corporal).
Evidências indicam que os flavonóides se ligam aos receptores beta do
estrogênio, estimulam in vitro a síntese protéica de células da linhagem osteoblástica e
seu uso por mulheres na pós-menopausa aumenta a concentração de osteocalcina
(marcador de formação óssea oriunda dos osteoblastos), o que reflete também num
aumento da atividade osteoblástica (MOREIRA, 2004).
Estudos realizados por FANTI et al. (1998) demonstraram um incremento dos
níveis séricos de osteocalcina em ratas ooforectomizadas, com o uso de genisteína,
sendo que os níveis de D-piridinolina (marcador da atividade osteoclástica)
permaneceram inalterados. Tal fato sugere uma ação essencial da genisteína na
formação óssea e não anti-reabsortiva, como a ação dos estrogênios. Entretanto, estes
estudos não apresentam o mecanismo de ação destas substâncias.
HEAD (1999) relataram sobre os efeitos do flavonóide ipriflavona no
metabolismo ósseo. A ipriflavona é um flavonóide sintético obtido a partir da daidzeína
e vem sendo pesquisado como um grande promissor na prevenção e no tratamento da
osteoporose e de outras desordens do metabolismo ósseo. O tratamento com ipriflavona
já vem sendo utilizado como uma terapia alternativa de reposição hormonal, uma vez
que possui efeito estrogênico. Estudos têm demonstrado ainda que ela é eficaz na
prevenção de perda de massa óssea associada com o uso crônico de esteróides,
imobilização, ovariectomia, osteodistrofia renal. Também vem sendo pesquisado na
doença de Paget, hiperparatireoidismo e otosclerose.
Pesquisas sobre a farmacocinética da ipriflavona mostram que ela é
metabolizada no fígado e excretada na urina. Alimentos parecem favorecer a sua
absorção. Quando fornecidos a voluntários (homens) na dose de 200 mg/kg de peso
corporal, 80% da dose administrada foi absorvida após o almoço. Em cães e gatos sete
metabólitos foram identificados no plasma. O seu tempo de meia vida em humanos foi
de 9,8 horas para a ipriflavona e de 2,7 a 16,1 horas para os seus metabólitos (HEAD,
1999; REGINSTER, 1993).
O mecanismo de ação da ipriflavona parece ser superior à de outros
medicamentos disponíveis para a prevenção e tratamento da osteoporose, prevenindo a
perda de massa óssea. Substâncias que tem efeitos benéficos na prevenção da
32
reabsorção óssea podem prevenir a atividade osteoclástica quando fornecida em longo
prazo. Tratamentos com fármacos anti-reabsortivos incluem estrógenos, cálcio,
bifosfonatos e calcitonina. Já o fluoreto de sódio, fragmentos anabólicos do PTH, fator
de crescimento ligado à insulina demonstraram atividade de formação óssea (HEAD,
1999).
Pesquisas também têm demonstrado que os metabólitos da ipriflavona inibem a
reabsorção óssea (GIOSSI et al., 1996). Além disso, pesquisas in vitro mostraram que
todos os metabólitos da ipriflavona foram capazes de inibir a reabsorção óssea
estimulada por PTH. BONUCCI et al. (1992) relataram que a atividade osteoclástica
estimulada pelo PTH resultou em hipercalcemia e que esta foi inibida por
suplementação dose-dependente de ipriflavona em ratos.
NOTOYA et al. (1993) pesquisaram os efeitos da ipriflavona sobre a inibição
da reabsorção óssea em camundongos. O mecanismo envolvido incluiu tanto a inibição
da ativação de osteoclastos maduros quanto a formação de novos osteoclastos. Quando
a ipriflavona foi combinada com vitamina K em meio celular, uma inibição mais
acentuada da reabsorção óssea foi observada, sendo que tanto a ipriflavona quanto a
vitamina K parecem possuir mecanismos de ação semelhantes. Além disso, a
ipriflavona parece estimular a atividade da fosfatase alcalina, um indicador de formação
óssea. Os autores concluíram que o efeito inibitório da ipriflavona sobre a reabsorção
óssea é similar ao da vitamina K, mas os mecanismos para a atividade osteoblástica são
diferentes.
Os efeitos da ipriflavona sobre a estrutura cristalina também vêm sendo
pesquisados. Observou-se que certos medicamentos, como o fluoreto de sódio,
aumentam a densidade óssea, mas modificam a estrutura cristalina tornando o osso mais
frágil (RIGGS et al., 1990). Estudo realizado em ratos, onde se utilizou doses de 200400 mg/kg/dia de ipriflavona durante 12 semanas mostraram que não houve alterações
na estrutura cristalina do osso. Os pesquisadores concluíram que há um efeito positivo
da ipriflavona na densidade mineral óssea e isto parece estar associado com um
aumento na formação de cristais de apatita (GHEZZO et al., 1996). Além disso, um
estudo realizado em ratos tratados com ipriflavona mostrou um aumento de 50% na
resistência à fratura sem nenhuma alteração na composição mineral ou cristalinidade do
tecido ósseo (CIVITELLI et al., 1995).
A ipriflavona parece não agir diretamente através dos receptores de estrogênio.
Aproximadamente 10% da ipriflavona absorvida é convertida em daidzeína (produto
33
ativo) no organismo. A falta de ação estrogênica foi observada através de um estudo
com 15 mulheres na pós-menopausa utilizando 600 a 1000 mg de ipriflavona por dia
durante 21 dias, avaliando-se os níveis de hormônio luteinizante, hormônio folículo
estimulante e prolactina além da citologia vaginal. Os resultados encontrados apontaram
para a ausência de qualquer ação estrogênica (PETILLI et al., 1995; MELIS et al.,
1992).
Estudos também demonstraram que a ipriflavona inibiu a atividade
osteoclástica e a secreção de PTH. Foi também observado aumento nos níveis de
fosfatase alcalina e na formação de colágeno com a utilização de cinco metabólitos da
ipriflavona in vitro (NOTOYA et al., 1993). Sabe-se que o PTH estimula a reabsorção
óssea para manter as concentrações plasmáticas de cálcio (CALVI et al., 2001). A
fosfatase alcalina, por sua vez, é um marcador da formação óssea.
Vários possíveis mecanismos têm sido sugeridos para explicar os efeitos
benéficos das isoflavonas da soja no tecido ósseo, os quais podem ajudar a prevenir o
desenvolvimento da osteoporose. Tem sido sugerido que os osteoblastos e os
osteoclastos são células alvo para a ação da genisteína e da daidzeína. Estudos em
cultura de células semelhantes a osteoblastos sugerem que genisteína combina com
receptores de estrógenos e exerce seus efeitos pelo mesmo mecanismo que este
hormônio. Por outro lado, ela pode também exercer efeitos por outros mecanismos,
independentes de receptores para estrógenos (WILLIAMS et al, 1998).
Alguns pesquisadores têm relatado que a genisteína inibe a topoisomerase II,
interferindo assim, com a progressão do ciclo celular, enquanto que outros sugerem que
a genisteína ativa receptores peptídicos ligados à membrana, iniciando outros efeitos
independentes de estrógenos. Por exemplo, os osteoclastos são dependentes da atividade
de receptores de proteína tirosina kinase, então os inibidores de proteína tirosina kinase
são candidatos à prevenção da osteoporose. A genisteína e a daidzeína, isoflavonas
naturais, são inibidoras de proteína tirosina kinase e poderiam agir por este mecanismo
(WILLIAMS et al., 1998).
Outros estudos foram realizados com o objetivo de investigar os efeitos das
isoflavonas daidzina e genistina, precursoras da genisteína e daidzeína, na perda óssea
em ratas ovariectomizadas alimentadas com dietas deficientes em cálcio. As isoflavonas
foram administradas oralmente nos animais por quatro semanas. Os ossos do fêmur
destes animais apresentaram redução significativa na densidade, força de quebra, cinzas,
peso e conteúdo de cálcio e fósforo quando comparados com os animais não
34
ovariectomizados. Estas mudanças foram prevenidas nos animais que receberam
daidzina e genistina na dose de 50mg/kg/dia durante quatro semanas e nos animais que
receberam uma estrona subcutânea (7,5 μg/kg/dia) como controle positivo. A
ovariectomia causou atrofia do útero e aumentou a taxa de excreção urinária de
pirinolina e desoxipirinolina. Isto foi prevenido pela administração de daidzina e
estrona, não ocorrendo com a genistina. O efeito preventivo do tratamento com daidzina
na perda óssea em ratas ovariectomizadas parece ser devido à supressão do turnover do
osso, sendo que a genistina possui um mecanismo diferente da daidzina (ISHIDA et al.,
1998).
Foi realizado um estudo controlado com placebo, em 98 mulheres com
diagnóstico de osteoporose, onde se utilizou 200 mg de ipriflavona três vezes ao dia.
Após dois anos de tratamento o grupo placebo perdeu em média 3,5% da massa óssea,
enquanto no grupo que recebeu ipriflavona não apenas houve estabilização da perda
como também um discreto incremento na massa óssea (ADAMI et al, 1997). Além
disso, um grupo de 28 mulheres italianas com idade superior a 65 anos, com
osteoporose e evidência radiológica de pelo menos uma fratura vertebral, foi tratado
com 600 mg de ipriflavona e 1000 mg de cálcio. Após 12 meses houve um aumento de
6% na densidade mineral óssea do rádio distal no grupo que recebeu ipriflavona e
nenhuma alteração no grupo placebo (PASSERI et al, 1992).
ARJMANDI et al. (2000) realizaram uma pesquisa com objetivo de comparar e
contrastar alguns dos mecanismos protetores do osso realizados pela ipriflavona com
àqueles do 17 β-estradiol na deficiência de hormônio ovariano. Quarenta e oito ratos
Sprague-Dawley com 95 dias foram distribuídos em quatro grupos: controle,
ovariectomizados,
ovariectomizados
+
ipriflavona
(100
mg/kg
peso/dia)
e
ovariectomizados + 17 β-estradiol (10 μg/kg peso/dia). De acordo com os resultados
obtidos, os pesquisadores concluíram que tanto o tratamento com ipriflavona quanto
com 17 β-estradiol preveniram completamente a perda da densidade óssea do fêmur
induzida pela ovariectomia. Entretanto, ao contrário do 17 β-estradiol, a ipriflavona não
reduziu o aumento da atividade da fosfatase alcalina no soro ou as concentrações de
fator de crescimento ligado à insulina e proteína de ligação de fator de crescimento
ligado à insulina. Com relação à análise histomorfométrica, observou-se que a taxa de
formação óssea mais elevada ocorreu nos animais tratados com ipriflavona. Isto indica
que a ipriflavona é mais efetiva na prevenção da perda óssea associada à ovariectomia.
35
Os mecanismos pelos quais a ipriflavona protege o osso, na deficiência de hormônio
ovariano, podem ser diferentes daqueles exercidos pelo 17 β-estradiol e podem envolver
aumento na taxa de formação óssea.
YAMAGUCHI e GAO (1998) estudaram, in vitro, os efeitos da genisteína e da
genistina sobre os componentes ósseos em tecidos femurais obtidos de ratas fêmeas em
idade avançada. Estes tecidos foram cultivados por 24 horas em um meio contendo ou
veículo ou genisteína (10
-8
– 10
-5
M) ou genistina (10
-7
– 10
-5
M). A presença de
genisteína e genistina causou um aumento significativo na atividade da fosfatase
alcalina, no conteúdo de DNA e cálcio nos tecidos. O efeito da genisteína foi maior que
o da genistina. A presença de sulfato de zinco (10
-5
M) causou um aumento
significativo na atividade da fosfatase alcalina elevada pela genisteína e nos conteúdos
de DNA e cálcio, o que não ocorreu com a genistina. Então estes resultados sugerem
que a genisteína e a genistina possuem efeito anabólico no metabolismo ósseo em
tecidos femorais de ratas em idade avançada e que o efeito da genisteína é aumentado
pela presença do zinco, um elemento traço essencial.
ANDERSON et al. (1998) ao avaliarem o efeito da genisteína no tecido ósseo
de ratas ovariectomizadas encontraram resultados consistentes com os de outras
pesquisas descritas na literatura em células isoladas e tecidos reprodutivos. Doses mais
baixas de genisteína agem similarmente a estrógenos com um efeito benéfico ao tecido
ósseo, mas em doses elevadas, podem exercer efeitos potencialmente adversos às
funções celulares das células e tecidos ósseos.
Estudos têm demonstrado que ratos ovariectomizados tratados com genisteína
ou daidzeína apresentaram aumento no peso seco do fêmur, na densidade mineral óssea
na taxa de formação óssea e redução na taxa de reabsorção óssea quando comparadas
com ratos ovariectomizados não tratados com estes isoflavonóides (ANDERSON et al.,
1998; BLAIR et al., 1996; ISHIDA et al., 1998; FANTI et al., 1998).
HORCAJADA-MOLTENI et al. (2000) avaliaram o efeito de rutina sobre o
metabolismo ósseo de ratas ovariectomizadas. Trinta ratos Wistar com três meses de
idade foram divididos em três grupos: grupo controle (animais não ovariectomizados
alimentados com dieta padrão), grupo ovariectomizado (dieta padrão) e grupo
ovariectomizados + rutina (dieta padrão + 0,25% de rutina). Após 90 dias, tanto a
excreção urinária de deoxipiridinolina (marcador da reabsorção óssea) quanto a
calciúria estavam mais elevadas nos animais do grupo ovariectomizado do que nos
animais dos grupos ovariectomizados + rutina e controle. Além disso, a concentração de
36
osteocalcina no plasma (um marcador da atividade osteoblástica) foi mais elevada nos
ratos do grupo ovariectomizado + rutina do que nos ratos do grupo controle. Estes
resultados indicam que a rutina (e/ou seus metabólitos), inibem a perda óssea trabecular
induzida pela ovariectomia nos ratos, reduzindo a reabsorção óssea e aumentando a
atividade osteoblástica.
Pesquisadores avaliaram os efeitos de concentrações nanomolares de
quercetina e rutina sobre o desenvolvimento e atividade de osteoclastos in vitro
comparando com os efeitos do 17 β-estradiol. Células não aderentes da medula óssea
suína foram cultivadas durante 11 dias em fatias de dentina na presença de 10nM de
vitamina D, com ou sem 10nM de quercetina, 10 nM de rutina ou 10 nM de 17 βestradiol. Os osteoclastos desenvolveram-se na presença de vitamina D, mas seu
número foi significativamente reduzido pela quercetina, rutina e 17 β-estradiol. Assim
como o 17 β-estradiol, ambos os flavonóis reduziram significativamente a reabsorção
óssea. Os osteoclastos e as células progenitoras de osteoclastos contêm receptor de
estrógeno alfa (ERalfa), ERbeta e proteínas RANK. Tanto a rutina quanto a quercetina
aumentaram a proteína nuclear ERbeta e diminuíram a proteína ERalfa das células
progenitoras de osteoclastos. Além disso, rutina reduziu a proteína RANK, enquanto o
17 β-estradiol e a quercetina promoveram apoptose por clivagem da caspase-8 e
caspase-3. Todos os efeitos dos flavonóis foram revertidos quando se utilizou um
antagonista do estrógeno na concentração de 1nM. Assim, as propriedades antireabsortiva dos flavonóis em estudo são mediadas principalmente pelos receptores de
estrógeno, através da inibição da proteína RANK ou ativação de caspases (RASSI et al.,
2005). As caspases ocupam função de destaque na execução do programa de morte
celular. Elas estão presentes no citosol sob a forma de pró-enzimas inativas, tornando-se
ativas após clivagem proteolítica à altura de resíduos do ácido aspártico (THOMPSON,
1999).
PINTO (2004) estudou o efeito do bifosfonato alendronato de sódio (na dose
de 0,2 mg/kg), da estatina atorvastatina cálcica (na dose de 1,2 mg/kg) e do flavonóide
ipriflavona (na dose de 100 mg/kg) na osteoporose induzida pelo glicocorticóide
dexametasona em ratas da linhagem Wistar. A influência desses fármacos foi avaliada
pelos marcadores bioquímicos de remodelação óssea, tais como, teores de cálcio e
fósforo sérico e de fosfatase alcalina óssea e análise histomorfométrica, visualizando-se
a densidade trabecular óssea. De acordo com os resultados obtidos observou-se que
37
todas as substâncias avaliadas apresentaram resultados significativos no aumento da
densidade trabecular óssea, destacando-se que o bifosfonato apresentou o melhor
resultado, sendo alcançados níveis de densidade trabecular óssea semelhantes aos dos
animais normais.
CHIBA et al. (2003) realizaram um ensaio biológico para avaliar o efeito de
hesperidina, α-glicosilhesperidina e 17 β-estradiol sobre a perda óssea em ratos
ovariectomizados, um modelo animal de osteoporose pós-menopausa. Quarenta ratos,
fêmeas, com oito semanas de idade foram distribuídos em cinco grupos: grupo 1:
animais controle operado (não ovariectomizados) que se alimentaram de dieta padrão
(AIN-93G), grupo 2: animais ovariectomizados alimentados com dieta padrão, grupo 3:
animais ovariectomizados alimentados com dieta padrão + hesperidina (dose de
0,5g/100g de ração); grupo 4: animais ovariectomizados alimentados com dieta padrão
+ α-glicosilhesperidina (dose de 0,7g/100g de ração) e grupo 5: animais
ovariectomizados alimentados com dieta padrão + 17 β-estradiol (dose de 0,03 μg/dia).
Após quatro semanas os ratos foram sacrificados e foram coletados o fêmur, útero,
fígado e amostras de sangue. Nos ratos ovariectomizados, a densidade mineral óssea do
fêmur foi menor que o do grupo controle não ovariectomizado. Nos grupos que
receberam hesperidina ou α-glicosilhesperidina, essa perda foi significativamente
reduzida.
As
concentrações
de
cálcio,
fósforo
e
zinco
do
fêmur
foram
significativamente maiores nos grupos que receberam hesperidina e 17 β-estradiol
quando comparados com o grupo ovariectomizado. As análises histomorfométricas
mostraram que o volume e a espessura do osso trabecular na metáfise distal do fêmur
estavam reduzidas nos ratos ovariectomizados, sendo que α-glicosilhesperidina
preveniu significativamente a perda óssea. Além disso, a hesperidina e 17 β-estradiol
reduziram o número de osteoclastos da metáfise femural nos ratos ovariectomizados. A
hesperidina também reduziu os níveis de lipídios no soro e fígado quando comparados
com o grupo ovariectomizado alimentado com dieta controle. Esses resultados sugerem
um possível papel dos flavonóides na prevenção de patologias como osteoporose e
doenças cardiovasculares.
AGNUSDEI et al. (1992) avaliaram o efeito de ipriflavona (600 mg/dia)
associada ao cálcio (1000 mg/dia) em pacientes com osteoporose pós-menopausa. Após
um ano de estudo, observou-se que o grupo que recebeu ipriflavona apresentou um
aumento na densidade mineral do rádio distal e nos níveis séricos de osteocalcina
38
quando comparados com o grupo controle (que recebeu apenas o cálcio). Os resultados
desse trabalho indicam que a ipriflavona é capaz de aumentar a densidade mineral óssea
em mulheres na pós-menopausa.
39
3. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito de
alendronato de sódio, atorvastatina cálcica e flavonóides ipriflavona e rutina
isoladamente e em associação sobre o metabolismo ósseo de ratas da linhagem Wistar
(Rattus norvegicus albinus), com 50 dias de idade, pesando em média 150 gramas e
com osteoporose induzida pela utilização do glicocorticóide dexametasona.
Os animais foram provenientes do Biotério do Centro de Ciências Biológicas e
da Saúde da UFV, Viçosa, Minas Gerais. Os experimentos, as dosagens bioquímicas do
plasma e as dosagens de proteínas colagenosas e proteínas não colagenosas dos ossos
foram realizadas no Laboratório de Biofármacos do Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular da UFV. As análises histopatológicas foram realizadas no
Laboratório de Histopatologia do Departamento de Veterinária da UFV.
Em todos os experimentos os animais foram acondicionados em gaiolas
coletivas contendo em cada uma seis animais, em ambiente climatizado, com ciclo
claro/escuro de 12 horas, onde permaneceram por um período de adaptação de cinco
dias, recebendo ração comercial (Labina - Purina®) e água “ad libitum”. Após o período
de adaptação, teve início o processo de indução da osteoporose, que consistiu na
administração de dexametasona (DECADRON®, fosfato dissódico de dexametasona 4mg/ml, conteúdo 2,5 ml), por via intramuscular, na dose de 7mg/kg de peso corporal,
uma vez por semana, durante cinco semanas em todos os animais à exceção do grupo
controle (ração), que continuou recebendo água e ração “ad libitum”, durante todo o
período experimental.
40
As dosagens de alendronato de sódio, atorvastativa cálcica, ipriflavona e rutina
utilizadas nos experimentos foram de 0,02 mg, 0,3 mg, 50 mg e 25 mg,
respectivamente, sendo que todas essas substâncias foram administradas diariamente
por via oral.
3.1 Experimento para avaliar o efeito de alendronato de sódio, atorvastatina
cálcica e ipriflavona na osteoporose induzida por dexametasona
Para a realização desse experimento foram utilizadas 90 ratas. Após o período
de indução da osteoporose, os animais foram distribuídos aleatoriamente em cinco
grupos, contendo cada um dezoito animais:
G1 = Ração (Controle)
G2 = Ração + Dexametasona (Controle com osteoporose)
G3 = Ração + Dexametasona + Alendronato de sódio
G4 = Ração + Dexametasona + Atorvastatina cálcica
G5 = Ração + Dexametasona + Ipriflavona
3.2 Experimento para avaliar o efeito de alendronato de sódio isoladamente e em
associação com atorvastatina cálcica, ipriflavona e rutina na osteoporose
induzida por dexametasona
Para a realização desse experimento foram utilizadas 108 ratas. Após o período
de indução da osteoporose, os animais foram distribuídos aleatoriamente em seis
grupos, contendo cada um dezoito animais:
G1 = Ração (Controle)
G2 = Ração + Dexametasona (Controle com osteoporose)
G3 = Ração + Dexametasona + Alendronato de sódio
G4 = Ração + Dexametasona + Alendronato de sódio + Atorvastatina cálcica
G5 = Ração + Dexametasona + Alendronato de sódio + Ipriflavona
G6 = Ração + Dexametasona + Alendronato de sódio + Rutina
41
3.3 Experimento para avaliar o efeito ipriflavona associada à atorvastatina cálcica
e de rutina isoladamente e em associação com ipriflavona e alendronato de
sódio na osteoporose induzida por dexametasona
Para a realização desse experimento foram utilizadas 108 ratas. Após o período
de indução da osteoporose, os animais foram distribuídos aleatoriamente em seis
grupos, contendo cada um dezoito animais:
G1 = Ração (Controle)
G2 = Ração + Dexametasona (Controle com osteoporose)
G3 = Ração + Dexametasona + Alendronato de sódio + Ipriflavona + Rutina
G4 = Ração + Dexametasona + Ipriflavona + Rutina
G5 = Ração + Dexametasona + Rutina
G6 = Ração + Dexametasona + Atorvastatina cálcica + Ipriflavona
3.4 Coleta de material para análises
A partir da data de início do tratamento, aos 10, 20 e 30 dias, seis animais de
cada grupo foram eutanasiados por sobredosagem anestésica de Zoletil 50®, via
intramuscular, na dose de 20 mg/kg de peso corporal.
Foram coletados, então, de cada animal, 5 ml de sangue por punção cardíaca,
para quantificação bioquímica dos níveis séricos de cálcio, magnésio, fósforo e glicose,
sendo que a última foi dosada apenas no segundo e terceiro experimento.
Após a eutanásia foram coletados o fêmur esquerdo para análise
histopatológica e a tíbia esquerda para análise de proteínas colagenosas e proteínas não
colagenosas.
3.4.1
Análise dos constituintes sanguíneos
Após a coleta, o sangue foi acondicionado em tubos de ensaio e logo a seguir
as amostras foram centrifugadas a 7100 xg por 15 minutos à temperatura ambiente, para
obtenção do soro.
42
Para determinar as concentrações plasmáticas de cálcio, magnésio, fósforo e
glicose, foi utilizado o equipamento de dosagens multiparamétrico de bioquímica
(Alizé) e “kits” da marca BioMèrieux.
3.4.2
Análise de proteínas no osso
Para a análise das proteínas colagenosas e proteínas não colagenosas, os ossos
foram desengorduradas com éter etílico por 10 horas, em aparelho de Soxhlet. Em
seguida, foram pesados e colocados em sacos plásticos, etiquetados e acondicionados
em congelador até o momento das análises.
Para extração das proteínas não colagenosas, os ossos foram desmineralizados
com volumes constantes de 5,0 mL de EDTA, sal dissódico, 0,5 moles/L, pH 8,2, de
acordo com HAUSCHKA e GALLOP (1977). Esse procedimento foi repetido a cada 8
horas durante 3 dias. Os extratos de EDTA obtidos foram utilizados na determinação
dos teores de proteínas não colagenosas, utilizando a albumina sérica bovina como
padrão (BRADFORD, 1976).
Após desmineralizados, os ossos foram lavados com água destilada para
eliminar o EDTA, secos em estufa (80ºC), pesados e utilizados na determinação dos
teores de proteínas colagenosas. Este método foi proposto por Berthelot para estimar o
teor de nitrogênio, sendo modificado por Pezemek e Nielsen (GUIMARÃES, 1993). O
teor de proteínas colagenosas foi obtido multiplicando-se o teor de nitrogênio pelo fator
6,25.
3.4.3
Histomorfometria
Logo após a eutanásia, procedeu-se a dissecação do fêmur esquerdo, tomando-
se o cuidado de se manter a região epifisária. Os ossos foram colocados em formol
tamponado à 10%, durante 72 horas para fixação e, posteriormente, descalcificado em
solução de ácido fórmico/citrato de sódio, incluído em parafina e processado
rotineiramente para estudo histológico em microscopia de luz. Obteve-se um corte
longitudinal de cada fêmur, de quatro micrômetros (4 цm) de espessura em micrótomo
histológico rotativo (Spencer, Modelo 820) dotado de navalha descartável. Logo após,
os cortes foram montados sobre lâmina de vidro e corados com hematoxilina e eosina.
43
Para cálculo do número de trabéculas, foi obtida uma imagem amostral de osso
trabecular, contida na região subcondral, de cada corte histológico, em microscópio
óptico equipado com câmara digital (TCL-984 P). Estas imagens foram analisadas em
monitor de microcomputador de 14 polegadas, com aumento final de 200 vezes. Uma
gradícula composta por 100 interseções foi aplicada sobre a imagem para a mensuração.
Estas intersecções foram computadas como pontos coincidentes à trabecula óssea ou ao
espaço intertrabecular (cavidade medular). Realizou-se três repetições, sendo, assim,
para cada animal, computados um total de 300 pontos, perfazendo, portanto, 1800
pontos por grupo de seis animais de cada tratamento. Desta forma, obteve-se o
percentual do número de trabéculas ósseas dos animais experimentais.
Para avaliar a espessura do osso cortical, o mesmo foi medido desde a
superfície periosteal até a superfície endosteal, com auxílio de uma régua acoplada a
ocular microscópica com aumento de 10x associado a objetiva de 4x. Foram realizadas
20 medições e o valor final para cada animal foi determinado através da média dos
valores obtidos, expressa em micrômetros.
3.5 Análise estatística
Os experimentos foram instalados no delineamento inteiramente casualizado,
com cinco (primeiro experimento) ou seis (segundo e terceiro experimento) tratamentos
em seis repetições.
Procedeu-se à análise de variância dos dados e nos casos em que a interação
tratamentos x tempos foi significativa, efetuou-se o desdobramento da mesma. As
médias dos grupos tratados foram comparadas entre si por meio do teste de Tukey, a 5%
de probabilidade. Cada grupo tratado foi comparado com os grupos controle (G1 e G2)
pelo teste de Dunnett, considerando 5% de significância. O efeito do tempo foi
analisado por meio do teste F.
44
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Efeito de alendronato de sódio, atorvastatina cálcica e ipriflavona isoladamente
na osteoporose induzida por dexametasona
Os resultados obtidos para cálcio, fósforo e magnésio no soro sanguíneo de
ratas encontram-se nas Tabelas 1, 2 e 3, respectivamente. Durante todo o período
experimental não houve diferença significativa nos níveis séricos de cálcio entre os
grupos controle, bem como, entre eles e os grupos tratados (Tabela 1). Resultados
semelhantes foram encontrados por DEYHIM et al. (2003). Ao avaliarem o efeito de
isoflavonas no metabolismo ósseo de ratas ovariectomizadas, esses pesquisadores não
observaram alterações nos níveis sanguíneos de cálcio total, cálcio ionizado, magnésio e
excreção de cálcio e magnésio na urina.
PINTO (2004) também não encontrou alterações significativas nos níveis
séricos de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina quando avaliou o efeito de alendronato de
sódio (dose de 0,2 mg/kg), atorvastatina cálcica (dose de 1,2 mg/kg) e ipriflavona (dose
de 100 mg/kg) em ratas com osteoporose induzida pela utilização de dexametasona.
A concentração sanguínea de cálcio permanece notavelmente constante.
Quando a concentração de cálcio no sangue é muito baixa, o PTH e/ou a vitamina D
normalizam a concentração pela mobilização de cálcio do osso, aumentam a absorção
intestinal e estimulam sua reabsorção nos rins. Por outro lado, quando a concentração de
cálcio no sangue é muito alta, a calcitonina assegura que o cálcio seja deslocado de
volta para o osso ou excretado pela urina. Dessa forma, níveis sanguíneos geralmente
45
não refletem o estado nutricional em relação ao cálcio (COZZOLINO, 2005;
OLIVEIRA et al., 2003).
Tabela 1 – Valores médios de cálcio sérico em mg/dL de ratas submetidas a diferentes
tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Média
% de variação em
relação à:
G1
G2
10,50
10,66
10,78 a
10,34 a
10,59 a
+1,52
+2,67
-1,52
+0,86
Época de coleta (dias)
Tratamentos
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
10
20
30
11,22
11,81
12,46
11,14
10,85
10,39
10,36
10,38
10,32
11,32
9,90
9,82
9,32
9,56
9,60
+1,13
-3,00
-0,66
Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Aos 20 e 30 dias de experimento observou-se uma redução significativa nos
níveis séricos de fósforo no grupo controle com osteoporose quando comparado com o
grupo controle (Tabela 2). Quando comparado com o grupo controle com osteoporose,
observa-se que aos 20 dias de experimento, houve um aumento significativo apenas no
grupo tratado com ipriflavona (+31,23%). Ao final do período experimental todos os
grupos tratados aumentaram significativamente a fosfatemia.
Os glicocorticóides têm uma ação multifatorial no tecido ósseo. Diminuem a
formação óssea, reduzem a absorção do cálcio intestinal e aumentam a excreção do
cálcio renal, levando a um hiperparatireoidismo secundário (CORONHO, 2001). O teor
de fosfato inorgânico no plasma circulante é influenciado pelo PTH, absorção intestinal,
funcionamento renal e metabolismo ósseo. O PTH exerce sobre a fosfatemia uma
influência oposta à exercida sobre a calcemia, isto é, tende a reduzir a fosfatemia, por
aumentar a excreção renal de fosfato, a despeito de causar mobilização do mesmo a
partir dos ossos (OLIVEIRA et al., 2003). Isto poderia explicar a redução nos níveis
séricos de fósforo observado no grupo controle com osteoporose (-22,04%) quando
comparados com o grupo controle, ao final do período experimental.
46
Tabela 2 – Valores médios de fósforo sérico em mg/dL de ratas submetidas a diferentes
tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de coleta
(dias)
Tratamentos
Média
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
20
30
% de variação em relação à:
G1
G2
3,80
5,47
5,38 a
5,37 a
4,36 b
+43,95 *
+41,58 *
+41,32 *
+14,74 *
-1,65
-1,83
-20,29 *
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
4,67 ab
3,97 bc
3,82 bc
3,10 c
5,21 a
-14,99 *
-18,20 *
-33,63 *
+11,56 *
-3,78
-21,91 *
+31,23 *
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
4,99 a
3,89 b
4,65 ab
4,46 ab
4,83 ab
-22,04 *
-6,81 *
-10,62 *
-3,21
+19,54 *
+14,65 *
+24,16 *
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
A Tabela 3 mostra os valores médios de magnésio sérico. Durante todo o
período experimental houve um aumento significativo na magnesemia no grupo
controle com osteoporose quando comparado com o grupo controle. Aos 20 dias, apenas
o grupo tratado com atorvastatina apresentou uma redução significativa (-13,61%)
quando comparado com o grupo controle com osteoporose, sendo que ao final do
período experimental nenhuma alteração significativa foi observada nos grupos tratados.
Os rins de indivíduos normais são capazes de excretar rapidamente grandes
quantidades de magnésio absorvido da dieta ou mesmo daquele injetado. Mesmo depois
de ingestão considerada alta, os níveis no sangue em geral ficam constantes
(COZZOLINO, 2005), o que justificaria os resultados encontrados nos diferentes
tratamentos ao final do período experimental.
47
Tabela 3 – Valores médios de magnésio sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de coleta
(dias)
Tratamentos
Média
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
20
30
% de variação em relação à:
G1
G2
2,68
3,59
3,27 b
3,79 a
3,52 ab
+33,96 *
+22,01 *
+41,42 *
+31,34 *
-8,91 *
+5,57 *
-1,95
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
0,6
3,16
3,07 ab
2,73 b
3,28 a
+371,64 *
+358,21 *
+307,46 *
+389,55 *
-2,85
-13,61 *
+3,80
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
0,95
2,88
3,13 a
2,91 a
2,93 a
+203,16 *
+229,47 *
+206,32 *
+208,42 *
+8,68
+1,04
+1,74
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Aos 10, 20 e 30 dias de experimento observa-se uma redução significativa nos
níveis de proteínas não colagenosas no grupo que recebeu dexametasona (-40,41%)
quando comparado com o grupo controle (Tabela 4). Ao final do período experimental,
houve aumentos significativos nos níveis dessa proteína óssea nos grupos tratados com
alendronato (+43,15%), atorvastatina (+43,15%) e ipriflavona (+41,10%) quando
comparados com o grupo controle com osteoporose.
Esse resultado é bastante satisfatório uma vez que na osteoporose ocorre um
aumento da perda de massa óssea e conseqüentemente redução das proteínas que estão
presentes na matriz orgânica do osso. Os resultados apresentados na Tabela 4 mostram
nitidamente menor perda de proteínas ósseas não colagenosas em todos os tratamentos.
Uma vez que o alendronato, a atorvastatina e a ipriflavona se mostraram
eficientes em aumentar os níveis ósseos de proteínas não colagenosas, isso pode indicar
que essas substâncias foram efetivas em estimular a síntese de tecido ósseo.
48
Tabela 4 – Valores médios de proteínas não colagenosas em mg/100mg de osso de ratas
submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
coleta
Época de coleta (dias)
Média
Tratamentos
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
10
20
30
2,61
1,59
2,08
2,09
2,13
2,46
1,27
2,05
2,06
2,35
2,29
1,53
2,13
2,13
1,71
2,45
1,46
2,09 b
2,09 b
2,06 b
% de variação em
relação à:
G1
G2
-40,41*
-14,69*
-14,69*
-15,92*
+43,15*
+43,15*
+41,10*
Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Evidências indicam que os flavonóides se ligam aos receptores β do
estrogênio, estimulam in vitro a síntese protéica de células da linhagem osteoblástica e
seu uso por mulheres na pós-menopausa aumentam a concentração de osteocalcina, o
que reflete também um aumento da atividade osteoblástica (MOREIRA, 2004).
Para os níveis médios de proteínas colagenosas ósseas observa-se que não
houve diferença significativa entre os grupos controle, bem como, entre eles e os grupos
tratados (Tabela 5).
Tabela 5 – Valores médios de proteínas colagenosas em mg/100g de osso de ratas
submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
coleta
Média
% de variação em
relação à:
G1
G2
33,03
36,12
35,08 a
35,43 a
35,60 a
+9,36
+6,21
+7,27
+7,78
Época de coleta (dias)
Tratamentos
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
10
20
30
34,44
37,65
32,26
30,81
33,85
35,89
38,65
37,01
39,65
37,97
28,75
32,06
35,98
35,84
34,98
-2,88
-1,91
-1,44
Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
49
As Figuras 8, 9, 10, 11 e 12 mostram os cortes histológicos da região do terço
proximal do fêmur esquerdo dos animais aos 10, 20 e 30 dias de experimento,
respectivamente. As setas brancas mostram a região trabecular e as setas pretas a
cavidade medular. A Figura 9 mostra uma redução trabecular óssea, identificada
principalmente pelo menor número de trabéculas ósseas nos animais que receberam
dexametasona, o que evidencia o efeito desse glicocorticóide na indução da
osteoporose. Além disso, observa-se que todos os tratamentos foram eficazes em
aumentar o número de trabéculas ósseas, ao longo do período experimental (Figuras 10,
11 e 12).
A
B
C
Figura 8 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G1 (controle) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C) dias de
tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
50
A
B
C
Figura 9 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G2 (controle com osteoporose) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C)
dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
51
A
B
C
Figura 10 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G3 (dexametasona + alendronato) aos 10 (A), 20 (B) e
30 (C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de
200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
52
A
B
C
Figura 11 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G4 (dexametasona + atorvastatina) aos 10 (A), 20 (B) e
30 (C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de
200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
53
A
B
C
Figura 12 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G5 (dexametasona + ipriflavona) aos 10 (A), 20 (B) e 30
(C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de
200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
54
A redução no número de trabéculas ósseas pode ser comprovada pelos
resultados apresentados na Tabela 6, onde observa-se uma redução significativa no
número de trabéculas ósseas nos animais do grupo controle com osteoporose durante
todo o período experimental. Esse resultado comprova a eficácia da dexametasona na
indução da osteoporose.
Tabela 6 – Valores médios do número de trabéculas ósseas em pontos percentuais do
fêmur de ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas
respectivas épocas de coleta
Época de coleta
(dias)
Tratamentos
Média
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
20
30
% de variação em relação à:
G1
G2
59,00
28,50
20,83 b
31,50 a
29,50 ab
-51,69 *
-64,69 *
-46,61 *
-50,00 *
-26,91 *
+10,53 *
+3,51
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
57,50
19,67
28,17 b
50,67 a
36,50 b
-65,79 *
-51,01 *
-11,88
-36,52 *
+43,21 *
+157,60 *
+85,56 *
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
59,50
31,33
34,50 b
36,50 b
43,33 a
-47,34 *
-42,02 *
-38,66 *
-27,18 *
+10,12
+16,50
+38,30 *
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Estudos histomorfométricos com osteoporose induzida por glicocorticóides
têm demonstrado uma redução na formação óssea a nível tecidual e celular, resultando
numa redução do volume ósseo e na espessura trabecular. Em adição, um aumento no
turnover e, ou reabsorção óssea tem sido observado em muitos estudos, particularmente
em associação com a utilização de altas doses de glicocorticóides (CARBONARE et al.,
2001; LOCASCIO et al., 1998).
Quando comparados com o grupo controle com osteoporose, observa-se um
aumento significativo no número de trabéculas nos animais tratados com atorvastatina
(+10,53%) aos 10 dias de experimento. Já aos 20 dias de tratamento, todos os grupos
55
tratados apresentaram aumentos significativos e aos 30 dias de tratamento, apenas a
ipriflavona (+38,30%) foi eficaz em aumentar o número de trabéculas ósseas.
Vários trabalhos têm demonstrado que a ipriflavona aumenta a densidade
mineral óssea em humanos e animais com osteoporose. CIVITELLI et al. (1995)
avaliaram o efeito da ipriflavona, durante um mês, (dose 200 ou 400 mg/kg) sobre as
propriedades biomecânicas e composição mineral óssea. Na dose mais elevada a
ipriflavona melhorou as propriedades biomecânicas dos ossos quando comparadas com
o grupo controle, sugerindo uma maior capacidade de suportar stress mecânico. Esses
dados foram confirmados pelos estudos de força de impacto que demonstraram um
gasto maior de energia para fraturar o osso dos animais tratados com ipriflavona na dose
de 400 mg/kg. Com relação aos níveis de cálcio, fósforo e magnésio nos ossos,
nenhuma alteração foi observada entre os animais tratados com ipriflavona e os do
grupo controle. Além disso, nessa dosagem houve um aumento na densidade mineral
óssea, o que demonstra que o tratamento com ipriflavona aumentou a densidade óssea e
melhorou as propriedades biomecânicas dos ossos sem alterar a composição mineral.
Com relação à espessura do osso cortical, nenhuma alteração significativa foi
observada entre os grupos controle, bem como, entre eles e os grupos tratados (Tabela
7).
Tabela 7 – Valores médios de espessura do osso cortical em μm, de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Tratamentos
Época de coleta (dias)
Média
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Ipriflavona (G5)
10
20
30
133,38
128,72
93,51
121,44
123,29
144,92
118,44
184,59
146,57
153,65
145,11
126,97
137,35
135,51
129,98
141,14
124,71
138,48 a
134,51 a
135,64 a
% de variação em
relação à:
G1
G2
-11,64
-1,88
-4,70
-3,90
+11,04
+7,86
+8,76
Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Embora vários trabalhos demonstrem uma correlação positiva entre a utilização
de alendronato e ipriflavona no metabolismo ósseo, resultados semelhantes aos
encontrados neste trabalho foram observados por AKAHOSHI et al. (2005). Esses
pesquisadores avaliaram o efeito do alendronato (na dose de 1 mg/kg de peso/dia)
56
isoladamente ou associado à vitamina D ativa em mini porcos com osteoporose induzida
por glicocorticóides. Para estudar o efeito dessas substâncias no metabolismo ósseo eles
avaliaram a espessura trabecular e cortical, sendo que nenhuma diferença significativa
foi observada entre o grupo tratado com glicocorticóide (grupo controle) e os grupos
que receberam alendronato e/ou vitamina D.
57
Efeito de alendronato de sódio isoladamente e em associação com atorvastatina
cálcica, ipriflavona e rutina na osteoporose induzida por dexametasona
Aos 20 dias de tratamento, observou-se uma redução significativa na calcemia
no grupo tratado com alendronato associado à atorvastatina (+23,44%) em relação ao
grupo controle com osteoporose. Ao final do período experimental, nenhuma alteração
significativa foi observada entre os grupos controle, bem como, entre eles e os grupos
tratados (Tabela 8).
Tabela 8 – Valores médios de cálcio sérico em mg/dL de ratas submetidas a diferentes
tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
Média
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
20
30
% de variação em
relação à:
G1
G2
13,57
13,70
12,55 a
12,58 a
12,13 a
11,72 a
+0,96
-7,52
-7,30
-10,61
-13,63
-8,39
-8,18
-11,46
-14,45
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
11,88
9,00
9,75 b
11,11 a
10,22 ab
9,67 b
-24,24 *
-17,93 *
-6,48
-13,97
-18,60 *
+8,33
+23,44*
+13,56
+7,44
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
12,57
12,17
12,12 a
12,38 a
12,53 a
12,40 a
-3,18
-3,58
-1,51
-0,32
-1,35
-0,41
+1,73
+2,96
+1,89
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
OLIVEIRA et al. (2003) encontraram resultados similares quando avaliaram o
efeito do flavonóide rutina nas dosagens de 20, 40 e 60 mg sobre os níveis sanguíneos
de cálcio, fósforo e cloreto em coelhos da raça Nova Zelândia. Os resultados desse
trabalho demonstraram que independente das dosagens utilizadas, a rutina não alterou a
58
calcemia nesses animais. Com relação ao fósforo apenas os coelhos fêmeas que
ingeriram 20 mg de rutina apresentaram redução significativa na fosfatemia.
Para os níveis séricos de fósforo, nenhuma alteração significativa foi observada
entre os grupos controle, bem como, entre eles e os grupos tratados, aos 30 dias de
experimento (Tabela 9).
Tabela 9 – Valores médios de fósforo sérico em mg/dL de ratas submetidas a diferentes
tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
Média
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
20
30
% de variação em
relação à:
G1
G2
3,82
5,09
4,33 a
3,50 b
3,45 b
4,05 ab
+33,25 *
+13,35 *
-8,38
-9,69
+6,02
-14,93 *
-31,24 *
-32,22 *
-20,43 *
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
4,68
4,88
5,83 a
5,42 ab
5,11 ab
4,72 b
+4,27
+24,57 *
+15,81 *
+9,19 *
+0,85
+19,47 *
+11,07 *
+9,19 *
-3,28
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato + Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
4,98
4,99
4,77 a
4,72 a
4,92 a
4,68 a
+0,20
-4,22
+4,78
-1,20
-6,02
-4,41
-5,41
-1,40
-6,02
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Com relação aos níveis séricos de cálcio e fósforo, resultados semelhantes aos
encontrados nesse trabalho foram relatados por VALENTE et al. (1994) quando
avaliaram o efeito de ipriflavona (600 mg/dia) em mulheres na pós-menopausa com
baixa densidade mineral óssea. Todas as pacientes receberam suplementação de cálcio
(1g/dia). Após 12 meses de tratamento nenhuma alteração significativa foi observada
nos níveis séricos de cálcio, fósforo, osteocalcina e fosfatase alcalina e nos níveis de
cálcio, fosfato e hidroxiprolina urinária. Entretanto, houve um aumento na densidade
59
mineral óssea nas mulheres que receberam ipriflavona, enquanto as mulheres do grupo
placebo apresentaram uma redução na mesma.
Durante todo o período experimental não houve diferença significativa nos
níveis séricos de magnésio entre os grupos controle, sendo que apenas o grupo tratado
com alendronato associado à ipriflavona apresentou redução significativa na
magnesemia (-11.61%), quando comparado com o grupo controle com osteoporose
(Tabela 10).
Tabela 10 – Valores médios de magnésio sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de coleta (dias)
Tratamentos
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato +
Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato +
Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
Média
% de variação em
relação à:
G1
G2
10
20
30
2,72
2,82
3,02
2,69
0,67
0,80
0,93
0,97
0,95
1,02
0,94
0,93
1,45
1,55
1,63 a
1,53 ab
+6,90
+12,41 *
+5,52
+5,16
-1,29
2,52
0,70
0,90
1,37 b
-5,52
-11.61*
2,78
0,68
0,80
1,42 ab
-2,07
-8,39
Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Para os níveis séricos de glicose, observou-se um aumento significativo no
grupo controle com osteoporose (+37,57%) em relação ao controle. Os resultados
também demonstram que a associação de alendronato e ipriflavona (-31,85%) foi eficaz
em reduzir os níveis de glicemia em ratas com osteoporose induzida pela utilização de
dexametasona (Tabela 11).
Sabe-se que a corticoterapia prolongada pode levar a uma hiperglicemia. Além
disso, há uma relação entre o diabetes mellitus e a osteoporose. A redução da massa
óssea foi descrita tanto em portadores de diabetes mellitus tipo 1 quanto em portadores
de diabetes mellitus tipo 2. Os mecanismos fisiopatológicos relacionados à perda óssea
no diabetes mellitus parecem incluir redução da atividade osteoblástica, alteração do
metabolismo de fósforo e cálcio, redução da síntese colágena ou produção reduzida de
IGF-I e insulina. Alguns estudos sugerem que pacientes com mau controle metabólico e
longo tempo de evolução do diabetes mellitus tipo 1 apresentam maior risco de
osteopenia (VARGAS et al., 2003).
60
Tabela 11 – Valores médios de glicose sérica em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de coleta (dias)
Média
Tratamentos
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato +
Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato +
Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
% de variação em
relação à:
G1
G2
10
20
30
151,22
202,93
206,80
204,62
121,93
181,07
115,30
131,72
193,32
257,73
194,93
221,70
155,49
213,91
172,34 ab
186,01 ab
+37,57*
+10,84
+19,63
-19,43
-13,04
129,88
138,60
168,84
145,77b
-6,25
-31,85*
213,63
157,63
206,10
192,45a
+23,77*
-10,03
Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Aos 10, 20 e 30 dias de experimento, nenhuma alteração significativa foi
observada nos níveis ósseos de proteínas não colagenosas entre os grupos controle
(Tabela 12). Quando comparado com o grupo controle com osteoporose, observa-se que
o grupo tratado com alendronato associado à atorvastatina apresentou aumento
significativo nesse parâmetro (+29,37%).
Tabela 12 – Valores médios de proteínas não colagenosas em mg/100mg de osso de
ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas
épocas de coleta
Época de coleta (dias)
Média
Tratamentos
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato
Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato
Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
% de variação em
relação à:
G1
G2
10
20
30
+
1,59
1,77
1,43
1,86
1,27
1,16
1,15
1,74
1,53
1,36
1,32
1,96
1,46
1,43
1,30 c
1,85 a
-2,05
-10,96
+26,71 *
-9,09
+29,37 *
+
1,64
1,57
1,61
1,61 ab
+10,27
+12,59
1,93
1,27
1,47
1,56 bc
+6,85
+9,09
Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Com relação aos níveis ósseos de proteínas colagenosas, observa-se uma
redução significativa no grupo controle com osteoporose em relação ao grupo controle
(-26,98%); sendo que um aumento significativo foi observado no grupo tratado com
61
alendronato (+16,87%) quando comparado com o grupo controle com osteoporose
(Tabela 13).
Tabela 13 – Valores médios de proteínas colagenosas em mg/100mg de osso de ratas
submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
coleta
Época de coleta (dias)
Tratamentos
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato +
Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato +
Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
Média
% de variação em
relação à:
G1
G2
10
20
30
34,44
23,17
29,35
26,64
35,89
22,22
27,05
24,11
28,75
26,97
28,18
26,73
33,03
24,12
28,19 a
25,83 b
-26,98 *
-14,65
-21,80 *
+16,87 *
+7,09
25,32
25,50
28,74
26,52 b
-19,71 *
+9,95
27,27
28,25
22,76
26,08 b
-21,04 *
+8,13
Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Estudos
demonstraram
que
os
glicocorticóides
suprimem
a
função
osteoblástica, inibindo a replicação celular, a síntese de colágeno e de proteínas não
colagenosas (LANNA et al., 2003). Esses resultados explicam a redução nos níveis
ósseos de proteínas colagenosas no grupo que recebeu dexametasona. Entretanto, o
tratamento com alendronato aumentou os níveis dessa proteína, demonstrando a eficácia
desse medicamento em estimular a síntese de tecido ósseo.
PEDRAZZONI et al. (1995) avaliaram o efeito do alendronato (5 mg/dia
durante 2 dias) e do clodronato (600 mg/dia durante 2 dias) em pacientes com
osteoporose e doença de Paget. Após a administração do bifosfonato os pacientes foram
monitorados durante 28 dias. Os pesquisadores observaram uma redução acentuada nos
níveis urinários de hidroxiprolina, piridinolina livre e telopeptídeos aminoterminal do
colágeno tipo I em todos os pacientes, sendo que a redução mais acentuada ocorreu aos
7 e 14 dias após a administração dos medicamentos.
Esses resultados demonstraram que o alendronato e o clodronato reduzem a
degradação de colágeno, uma vez que os telopeptídeos aminoterminal do colágeno tipo
I são liberados durante a degradação do colágeno tipo I, circulam no sangue e são
excretados na urina. Portanto, esses dados justificariam os maiores níveis de proteínas
colagenosas encontradas nos ossos dos animais que receberam alendronato.
62
As Figuras 13, 14, 15, 16, 17 e 18 mostram os cortes histológicos da região do
terço proximal do fêmur esquerdo dos animais aos 10, 20 e 30 dias de experimento,
respectivamente. As setas brancas mostram a região trabecular e as setas pretas a
cavidade medular. Ao avaliar os cortes histológicos do grupo que recebeu dexametasona
observou-se uma redução no número de trabéculas ósseas acompanhada por um
aumento na cavidade medular (Figura 14). Além disso, os cortes histológicos dos
animais tratados com as diferentes substâncias e associações, apresentados nas Figuras
15, 16, 17 e 18, evidenciaram um aumento no número de trabéculas. Esses resultados
podem ser comprovados mediante os dados apresentados na Tabela 14.
A
B
C
Figura 13 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G1 (controle) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C) dias de
tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
63
A
B
C
Figura 14 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G2 (controle com osteoporose) aos 10 (A), 20 (B) e 30
(C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de
200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
64
A
B
C
Figura 15 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G3 (dexametasona + alendronato) aos 10 (A), 20 (B) e
30 (C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de
200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
65
A
B
C
Figura 16 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G4 (dexametasona + alendronato + atorvastatina) aos 10
(A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal.
Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
66
A
B
C
Figura 17 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G5 (dexametasona + alendronato + ipriflavona) aos 10
(A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal.
Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
67
A
B
C
Figura 18 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G6 (dexametasona + rutina) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C)
dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
68
Durante todo o período experimental houve uma redução significativa no
número de trabéculas ósseas no grupo que recebeu dexametasona, quando comparado
com o grupo controle (Tabela 14). Várias pesquisas têm demonstrado que os
glicocorticóides reduzem a massa óssea. Um estudo com duração de 3 semanas,
realizado com o objetivo de avaliar o efeito da dexametasona no metabolismo ósseo,
demonstrou que essa droga reduz a espessura e o número de trabéculas no fêmur distal.
Além disso, houve uma redução nos níveis séricos de osteocalcina, marcador de
formação óssea, em todos os ratos tratados com dexametasona (McLAUGHLIN et al.,
2002).
Tabela 14 – Valores médios do número de trabéculas ósseas em pontos percentuais do
fêmur de ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas
respectivas épocas de coleta
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato +
Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato +
Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
20
30
Média
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato +
Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato +
Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato (G3)
Dexametasona + Alendronato +
Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato +
Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
% de variação em relação à:
G1
G2
58,83
22,50
35,67 a
36,67 a
-61,75 *
-39,37 *
-37,67 *
+58,53 *
+62,98 *
35,67 a
-39,37 *
+58,53 *
31,17 bc
-47,02 *
+38,53 *
57,83
22,17
39,00 b
27,50 c
.
-61,66 *
-32,56 *
-52,45 *
.
.
+75,91 *
+24,04
34,17 bc
-40,91 *
+54,13 *
50,50 a
-12,68
+127,79 *
59,50
27,33
53,67 a
42,83 b
.
-54,07 *
-9,80
-28,02 *
.
.
+96,38 *
+56,71 *
37,50 b
-36,97 *
+37,21 *
45,83 abc
-22,97 *
+67,69 *
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
69
Aos 10 dias de tratamento, observou-se que houve aumento significativo no
número de trabéculas em todos os grupos tratados. Aos 20 dias de tratamento apenas os
grupos que receberam alendronato, alendronato associado à ipriflavona e rutina
isoladamente foram eficazes em aumentar a mesma. Ao final do período experimental
todos os grupos tratados aumentaram o número de trabéculas, sendo que o resultado
mais pronunciado foi observado no grupo tratado com alendronato (+96,38%).
Resultados semelhantes foram encontrados por DA PAZ et al. (2001). Estes
pesquisadores avaliaram o efeito do 17 β-estradiol (30 µg/kg) e do alendronato (0,1
mg/kg), via subcutânea, na prevenção da perda óssea em ratas ovariectomizadas. Ao
final do período experimental observou-se uma redução significativa na densidade
mineral óssea e no volume trabecular nas ratas ovariectomizadas. Tanto o alendronato
quanto o 17 β-estradiol aumentaram a densidade mineral óssea e o volume trabecular,
sendo que esse efeito foi mais pronunciado nos animais que receberam alendronato. Os
pesquisadores concluíram que nas doses utilizadas, o alendronato foi mais eficaz na
prevenção da perda óssea.
Pesquisadores avaliaram o efeito da atorvastatina na produção do RANKL e de
OPG em osteoblastos humanos. Enquanto o RANKL aumenta a formação e a ativação
do osteoclasto, desse modo, promovendo a perda óssea, a OPG age como um receptor
solúvel e antagoniza os efeitos do RANKL. A atorvastatina aumentou os níveis de RNA
mensageiro de OPG e a secreção dessa proteína, sendo que o máximo de efeito ocorreu
na dose de 10-6 M. Além disso, a atorvastatina anulou o efeito inibitório dos
glicocorticóides sobre a produção de OPG. O tratamento com atorvastatina em
osteoblastos humanos aumentou a expressão de marcadores de diferenciação
osteoblástica, osteocalcina e fosfatase alcalina. Os dados sugerem que a atorvastatina
aumenta a diferenciação osteoblástica e a produção de OPG (VIERECK et al., 2005), o
que pode contribuir para a redução da perda óssea
Com relação à espessura do osso cortical (Tabela 15), observou-se que o grupo
controle com osteoporose apresentou uma redução significativa em relação ao grupo
controle (-18,24%), sendo que os grupos tratados com alendronato, alendronato
associado à atovastatina e rutina isoladamente foram eficazes em aumentar a mesma. De
acordo com esses resultados, podemos observar que o tratamento com a dexametasona
alterou o metabolismo ósseo, reduzindo a espessura do osso cortical do fêmur das ratas
ao passo que a rutina, alendronato e o alendronato associado à atorvastatina reverteram
esse efeito.
70
Tabela 15 – Valores médios de espessura do osso cortical em μm, de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de coleta (dias)
Tratamentos
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato
(G3)
Dexametasona + Alendronato +
Atorvastatina (G4)
Dexametasona + Alendronato +
Ipriflavona (G5)
Dexametasona + Rutina (G6)
Média
% de variação em
relação à:
G1
G2
10
20
30
133,38
115,04
137,93
144,91
118,34
127,65
145,11
112,79
137,53
141,13
115,39
134,37 a
-18,24*
-4,79
+16,45*
135,32
163,93
140,62
146,62 a
+3,89
+27,06*
123,48
130,17
141,98
131,88 b
-6,55
+14,29
132,99
139,49
134,53
135,67 a
-3,87
+17,58*
Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Várias pesquisas demonstram que o turnover e a reabsorção óssea estão
aumentados nos estágios avançados de terapia com glicocorticóide, visto que a redução
na formação óssea é predominante nesse período. Entretanto estudos prospectivos têm
demonstrado uma rápida perda óssea e um aumento no risco de fraturas durante os
primeiros meses de terapia com glicocorticóide, que pode ser explicado com base no
baixo turnover e formação óssea (VAN STAA et al., 2000).
VEDI et al. (2005) avaliaram, através da análise histomorfométrica, o osso
cortical de 14 pacientes (nove mulheres e cinco homens) com idade entre 18 e 48 anos,
tratados com glicocorticóides. Os resultados demonstraram que a porosidade do osso
cortical aumentou nos pacientes que fizeram essa terapia em longo prazo. Os autores
relatam que esses resultados são devido a um aumento na reabsorção óssea durante os
estágios finais de terapia com glicocorticóide, em combinação com uma redução, a
longo prazo, da formação óssea.
O alendronato de sódio é uma droga que inibe o turnover e a reabsorção óssea,
sendo usada no tratamento da osteoporose pós-menopausa (PYTLIK et al. 2004;
BROULIK et al., 2005). PYTLIK et al. (2004) avaliaram o efeito do alendronato de
sódio (dose de 3 mg/kg de peso/dia) isoladamente e em associação com o retinol, sobre
a remodelação óssea de ratas ovariectomizadas. Foram avaliados o ganho de peso, o
conteúdo de mineral na tíbia, fêmur e vértebras, além da espessura do osteóide,
crescimento transversal do endósteo e periósteo, área da cavidade da medula óssea e do
osso cortical. Os resultados demonstraram que o alendronato de sódio inibiu alterações
71
no metabolismo ósseo que ocorrem com a ovariectomia. Quando administrado em
associação com o retinol, o efeito do alendronato foi atenuado.
FOLDES et al. (1988) estudaram o efeito da ipriflavona (dose de 40 mg/kg de
peso durante oito semanas) em ratos. Com relação às análises histológicas e
histomorfométricas os pesquisadores observaram que o tratamento com ipriflavona
reduziu a reabsorção óssea e aumentou a espessura cortical. Além disso, a redução na
densidade trabecular óssea foi menos aparente na metáfise e na diáfise. Os autores
concluíram
que
o
tratamento
não
preveniu
significativamente os efeitos da mesma.
72
a
osteoporose,
mas
reduziu
Efeito de ipriflavona associada à atorvastatina cálcica e de rutina isoladamente
e em associação com ipriflavona e alendronato de sódio na osteoporose
induzida por dexametasona
A Tabela 16 mostra os valores médios de cálcio sérico. Aos 10 e 30 dias de
tratamento observa-se que não houve diferença significativa na calcemia entre os grupos
controle. Com relação aos grupos tratados, estes apresentaram uma redução significativa
na calcemia quando comparada com o grupo controle com osteoporose.
Embora vários trabalhos não relatem alterações na calcemia em animais
tratados com ipriflavona (CIVITELLI et al., 1995; VALENTE et al., 1994, PINTO,
2004), alendronato e atorvastatina (PINTO, 2004), observamos uma redução na
calcemia em todos os grupos tratados ao longo do período experimental.
Tabela 16 – Valores médios de cálcio sérico em mg/dL de ratas submetidas a diferentes
tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
Média
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona +
Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona (G6)
13,45
13,30
9,22 a
-1,12
-31,45 *
-30,68 *
8,75 a
8,79 a
9,07 a
-34,94 *
-34,65 *
-32,57 *
-34,21 *
-33,91 *
-31,80 *
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona +
Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona (G6)
11,88
9,15
9,12 a
-22,98 *
-23,23 *
-0,33
9,94 a
9,50 a
10,37 a
-16,33 *
-20,03 *
-12,71 *
+8,63
+3,83
+13,33
12,57
12,17
10,20 a
-3,18
-18,85 *
-16,19 *
10,08 a
8,54 b
10,33 a
-19,81 *
-32,06 *
-17,82 *
-17,17 *
-29,83 *
-15,12 *
20
30
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona +
Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona (G6)
% de variação em relação
à:
G1
G2
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
73
Aos 10 dias de tratamento houve um aumento significativo nos níveis séricos
de fósforo no grupo controle com osteoporose (+33,25%). Ao final do período
experimental, os grupos tratados com alendronato associado à ipriflavona e rutina
(+52,51%) e ipriflavona associada à rutina (+48,50%) apresentaram elevações
significativas nos níveis séricos desse mineral (Tabela 17).
Tabela 17 – Valores médios de fósforo sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
Média
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona +
Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona (G6)
3,82
5,09
6,86 b
+33,25 *
+79,58 *
+34,77 *
8,06 ab
6,44 b
8,72 a
+110,99 *
+68,59 *
+128,27 *
+58,35 *
+26,52
+71,32 *
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona +
Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona (G6)
4,68
4,88
7,51 a
+4,27
+60,47 *
+53,89 *
8,09 a
7,57 a
8,28 a
+72,86 *
+61,75 *
+76,92 *
+65,78 *
+55,12 *
+69,67 *
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona +
Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona (G6)
4,98
4,99
7,61 a
+0,20
+52,81 *
+52,51 *
7,41 a
4,43 b
5,96 ab
+48,80 *
-11,04
+19,68
+48,50 *
-11,22
+19,44
20
30
% de variação em relação
à:
G1
G2
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Embora a maior parte dos estudos demonstre uma redução nos níveis séricos de
fósforo com a administração de ipriflavona ou glicocorticóides (CIVITELLI et al.,
1995; OLIVEIRA et al., 2003) resultados similares aos encontrados nesse trabalho
foram observados por ZANCHETTA et al. (1997). Esses pesquisadores avaliaram o
efeito da utilização do pamidronato na dose de 200mg/dia em mulheres com
osteoporose pós-menopausa e observaram tendência a um discreto aumento nos níveis
74
séricos de fosfato. Além disso, a calcemia apresentou-se com valores normais sendo que
nenhum episódio hipocalcêmico foi relatado.
A Tabela 18 mostra os valores médios dos níveis séricos de magnésio.
Nenhuma alteração significativa foi encontrada nos diferentes grupos aos 20 e 30 dias
de tratamento.
Tabela 18 – Valores médios de magnésio sérico em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
% de variação em relação à:
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
20
30
Média
G1
G2
2,72
1,05
1,04 b
-61,40 *
-61,76 *
-0,95
0,86 b
0,68 b
1,70 a
-68,38 *
-75,00 *
-37,50 *
-18,10
-35,24
+61,90 *
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
0,67
0,80
0,82 a
+19,40
+22,39
+2,50
0,65 a
0,77 a
1,08 a
-2,99
+14,93
+61,19
-2,99
-3,75
+35,00
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
0,95
1,02
1,18 a
+7,37
+24,21
-.
+15,69
0,75 a
0,72 a
0,81 a
-21,05
-24,21
-14,74
-26,47
-29,41
-20,59
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Como já citado, é difícil determinar o estado de magnésio porque os níveis
séricos desse mineral permanecem constantes mesmo quando se tem uma grande
variação na dieta. Além disso, outros pesquisadores têm demonstrado uma tendência à
manutenção de níveis normais de magnesemia, quando avaliaram o efeito da ipriflavona
75
sobre as propriedades biomecânicas dos ossos de ratos adultos (CIVITELLI et al.,
1995).
De acordo com a Tabela 19, observa-se que ao final do período experimental
houve um aumento significativo na glicemia no grupo controle com osteoporose
(+53,25%) em relação ao grupo controle. Com relação aos grupos tratados, nota-se que
os animais que receberam alendronato associado à ipriflavona e rutina e rutina
isoladamente apresentaram redução significativa na glicemia aos 10 e 30 dias de
tratamento, o que demonstra a eficácia dessas substâncias no tratamento de
hiperglicemia induzida pela utilização de glicocorticóide.
Tabela 19 – Valores médios de glicose sérica em mg/dL de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
20
30
Média
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
% de variação em relação à:
G1
G2
151,22
280,45
129,88 a
+85,46 *
-14,11
-53,69 *
185,82 ab
206,48 b
236,17 b
+22,88
+36,54
+56,18 *
-33,74 *
-26,37 *
-15,79
121,93
138,60
98,00 c
.
+13,67
-19,63
.
.
-29,29
180,52 b
275,48 a
154,62 bc
+48,05 *
+125,93 *
+26,81
+30,25
+98,76 *
+11,56
193,32
296,27
168,84 a
+53,25 *
-12,66
-43,01 *
250,64 b
214,53 ab
226,40 ab
+29,65 *
+10,97
+17,11
-15,40
-27,59 *
-23,58
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
76
O tratamento com glicocorticóides principalmente em altas doses induz
resistência à insulina (RUZZIN et al., 2005) o que levaria ao aumento na glicemia,
como observado nos animais que receberam tratamento com essa droga.
REDDY et al. (2001) estudaram a integridade estrutural do fêmur e da tíbia de
ratos com diabetes induzida por estreptozotocina. Os resultados demonstraram que o
estado diabético está associado com deterioração mecânica do osso, resultando em ossos
com integridade biomecânica inferior. A integridade biomecânica do osso é um dos
mais importantes fatores relacionados com o risco de fratura.
Os produtos finais de glicação avançada estão associados a um número de
condições degenerativas crônicas especialmente com o diabetes, e tem sido
relacionados com a reabsorção óssea (MIYATA et al., 1997). Estudos realizados por
CERVANTES-LAUREAN et al. (2005), demonstraram que a rutina e os seus
metabólitos inibem a formação de produtos finais de glicação avançada, induzidas pela
glicose, no colágeno I in vitro, o que poderia contribuir para os efeitos benéficos à
saúde associados com o consumo de rutina.
A Tabela 20 mostra os valores médios de proteínas não colagenosas nos
diferentes grupos ao longo do período experimental. Mediante esses resultados
observa-se que não houve diferença significativa entre os grupos controle. No que se
refere aos grupos tratados, nenhuma alteração foi observada ao final do período
experimental.
77
Tabela 20 – Valores médios de proteínas não colagenosas em mg/100mg de osso de
ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas
épocas de coleta
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
20
30
Média
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
% de variação em relação à:
G1
G2
1,59
1,77
1,69 ab
+11,32
+6,29
-4,52
1,57 ab
1,37 b
1,82 a
-1,26
-13,84
+14,47
-11,30
-22,60 *
+2,82
1,26
1,16
1,65 a
-7,94
30,95 *
+42,24 *
1,51 ab
1,30 b
1,63 a
+19,84 *
+3,17
+29,37 *
+30,17 *
+12,07
+40,52 *
1,52
1,35
1,31 a
-11,18
-13,82
-2,96
1,52 a
1,36 a
1,45 a
0
-10,53
-4,61
+12,59
+0,74
-4,61
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Com relação aos valores médios de proteínas colagenosas, observa-se que aos
10 e 20 dias de experimento houve uma redução significativa nos níveis ósseos dessa
proteína no grupo controle com osteoporose (-32,72% e -38,09%, respectivamente). Ao
final do período experimental nenhum aumento significativo foi observado nos
diferentes grupos tratados, quando comparados com o grupo controle com osteoporose
(Tabela 21).
78
Tabela 21 – Valores médios de proteínas colagenosas em mg/100mg de osso de ratas
submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de
coleta
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
20
30
Média
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona
+
Atorvastatina
+
Ipriflavona (G6)
% de variação em relação à:
G1
G2
34,44
23,17
25,19 b
-32,72 *
-26,86 *
+8,72
24,38 b
13,57 c
28,73 a
-29,21 *
-60,60 *
-16,58
+5,22
-41,43 *
+24,00
35,89
22,22
25,90 a
-38,09 *
-27,84 *
+16,56 *
23,55 ab
17,18 b
24,22 ab
-34,38 *
-52,13 *
-32,52 *
+5,99
-22,68 *
+9,00
28,75
26,97
28,38 ab
-6,19
-1,29
+5,23
28,24 ab
21,50 b
30,16 a
-1,77
-25,22 *
+4,90
+4,71
-20,28 *
+11,83
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
CIVITELLI et al. (1995) relataram que o tratamento com a ipriflavona não
alterou significativamente os níveis séricos de fosfatase alcalina ou de telopeptídeos do
colágeno tipo I, dois marcadores de reabsorção óssea. Portanto, isso poderia justificar os
melhores níveis de proteínas colagenosas encontrada nesse experimento nos grupos que
receberam ipriflavona.
79
As Figuras 19, 20, 21, 22, 23 e 24 mostram os cortes histológicos da região do
terço proximal do fêmur esquerdo dos animais aos 10, 20 e 30 dias de experimento,
respectivamente. As setas brancas mostram a região trabecular e as setas pretas a
cavidade medular. Ao avaliar os cortes histológicos do grupo que recebeu dexametasona
observou-se novamente uma redução no número de trabéculas ósseas acompanhada por
um aumento na cavidade medular (Figura 20). Além disso, os cortes histológicos dos
animais tratados com as diferentes substâncias e associações, apresentados nas Figuras
21, 22, 23 e 24, evidenciaram um aumento no número de trabéculas ósseas.
A
B
C
Figura 19 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G1 (controle) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C) dias de
tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
80
A
B
C
Figura 20 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G2 (controle com osteoporose) aos 10 (A), 20 (B) e 30
(C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de
200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
81
A
B
C
Figura 21 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G3 (dexametasona + alendronato + ipriflavona + rutina)
aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte
longitudinal. Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
82
A
B
C
Figura 22 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G4 (dexametasona + ipriflavona + rutina) aos 10 (A), 20
(B) e 30 (C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal.
Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
83
A
B
C
Figura 23 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G5 (dexametasona + rutina) aos 10 (A), 20 (B) e 30 (C)
dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal. Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
84
A
B
C
Figura 24 – Microfotografia de osso trabecular (esponjoso) do terço proximal de fêmur
de ratas do grupo G6 (dexametasona + atorvastatina + ipriflavona) aos 10
(A), 20 (B) e 30 (C) dias de tratamento. Coloração HE. Corte longitudinal.
Aumento de 200x.
Seta branca – trabécula óssea.
Seta preta – cavidade medular.
85
Durante todo o período experimental houve uma redução significativa no
número de trabéculas ósseas no grupo que recebeu dexametasona, quando comparado
com o grupo controle (Tabela 22). Além disso, todas as substâncias testadas
aumentaram significativamente o número de trabéculas ósseas, quando comparadas com
o grupo controle com osteoporose.
Tabela 22 – Valores médios do número de trabéculas ósseas em pontos percentuais do
fêmur de ratas submetidas a diferentes tratamentos e avaliadas nas
respectivas épocas de coleta
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona
(G6)
20
30
Média
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona
(G6)
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona
(G6)
% de variação em relação à:
G1
G2
58,83
28,50
42,67 b
-51,56 *
-27,47 *
+49,72 *
38,67 b
52,83 a
42,50 b
-34,27 *
-10,20
-27,76 *
+35,68 *
+85,37 *
+49,12 *
57,50
19,67
56,17 a
-65,79 *
-2,31
+185,56 *
40,00 b
38,17 b
38,17 b
-30,43 *
-33,62 *
-33,62 *
+103,36 *
+94,05 *
+94,05 *
59,50
30,83
55,17 a
-48,18 *
-7,28
+78,95 *
39,83 b
43,50 b
43,17 b
-33,06 *
-26,89 *
-27,45 *
+29,19 *
+41,10 *
+40,03 *
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
Resultados semelhantes foram encontrados por PINTO (2004) quando avaliou
o efeito do alendronato + atorvastatina, alendronato + ipriflavona e atorvastatina +
ipriflavona em ratas com osteoporose induzida por dexametasona. As doses de
alendronato, atorvastatina e ipriflavona utilizadas foram de 0,1mg/kg, 0,6 mg/kg e
86
50mg/kg, respectivamente. Através da avaliação da densidade trabecular óssea se
observou um aumento da mesma em todos os tratamentos efetuados, sendo que as
associações contendo alendronato de sódio apresentaram elevadas taxas de restauração
tecidual óssea, alcançando valores superiores aos do grupo dos animais normais.
Pesquisas têm demonstrado que a rutina atua no metabolismo ósseo.
HORCAJADA-MOLTENI et al. (2000) avaliaram o efeito de rutina sobre o
metabolismo ósseo de ratas ovariectomizadas. No final do período experimental, tanto
a excreção urinária de deoxipiridinolina (marcador da reabsorção óssea) quanto a
calciúria estavam mais elevadas nos animais do grupo ovariectomizado do que nos
grupos ovariectomizados que receberam rutina e no grupo controle. A concentração de
osteocalcina do plasma foi mais elevada nas ratas do grupo ovariectomizado que
recebeu rutina quando comparado ao grupo controle. Estes resultados indicam que a
rutina (e/ou seus metabólitos), inibem a perda óssea trabecular induzida pela
ovariectomia nas ratas, reduzindo a reabsorção óssea e aumentando a atividade
osteoblástica.
KAWANE et al. (2004) avaliaram o efeito de atorvastatina (dose de 2
mg/kg/dia) isoladamente e em associação com o 17 beta-estradiol e o PTH humano em
ratas ovariectomizadas. Os resultados demonstraram que a combinação da atorvastatina
com o 17 beta-estradiol aumentou significativamente a densidade mineral óssea da
vértebra lombar e da área de metáfise femural quanto comparada com os grupos que
receberam 17 beta-estradiol ou atorvastatina isoladamente.
Ao final do período experimental, observa-se uma redução significativa na
espessura do osso cortical no grupo controle com osteoporose (-22,27%). Com relação
aos grupos tratados, apenas o grupo que recebeu alendronato associado à ipriflavona e
rutina (+44,22%) e o grupo que recebeu rutina isoladamente (+40,78%) apresentaram
aumentos significativos nesse parâmetro quando comparados com o grupo controle com
osteoporose (Tabela 23).
87
Tabela 23 – Valores médios de espessura do osso cortical em μm, de ratas submetidas a
diferentes tratamentos e avaliadas nas respectivas épocas de coleta
Época de
coleta
(dias)
Tratamentos
10
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona
(G6)
20
30
Média
% de variação em relação à:
G1
G2
133,38
115,04
155,98 a
-13,75
+16,94 *
+35,59 *
135,02 b
148,90 a
149,09 a
+1,23
+11,64
+11,78
+17,37 *
+29,43 *
+29,60 *
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona
(G6)
144,92
118,34
144,92 a
-18,34
0
+22,46
138,03 a
129,40 a
133,96 a
-4,75
-10,71
-7,56
+16,64
+9,35
+13,20
Controle (G1)
Controle com osteoporose (G2)
Dexametasona + Alendronato + Ipriflavona
+ Rutina (G3)
Dexametasona + Ipriflavona + Rutina (G4)
Dexametasona + Rutina (G5)
Dexametasona + Atorvastatina + Ipriflavona
(G6)
145,11
112,79
162,67 a
-22,27 *
+12,10
+44,22 *
125,71 c
158,79 ab
132,11 bc
-13,37
+9,43
-8,96
+11,45
+40,78 *
+17,13
Em cada tempo, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
* Estatisticamente diferente do controle (G1 ou G2) pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade.
MAZZUOLI et al. (1992) avaliaram o efeito do tratamento com ipriflavona
sobre a remodelação óssea no hiperparatireoidismo primário. Nove pacientes (6
mulheres e 3 homens) receberam por via oral, 1200 mg/dia de ipriflavona dividida em 3
doses diárias. Todos os pacientes foram tratados por 21 dias, sendo que em 5 deles o
tratamento foi prolongado para 42 dias. Os resultados demonstraram que a ipriflavona
afeta a remodelação óssea inibindo a reabsorção sem afetar a formação do osso.
Portanto, a ipriflavona é indicada no tratamento das doenças metabólicas do osso
caracterizadas por um aumento no turnover ósseo.
88
5. CONCLUSÕES
A partir dos dados obtidos neste trabalho conclui-se que nenhuma das
substâncias avaliadas afetou os níveis séricos de magnésio, fósforo e proteínas
colagenosas. Uma redução significativa nos níveis séricos de cálcio foi observada nos
grupos que receberam alendronato associado à ipriflavona, ipriflavona associada à
rutina e atorvastatina associada à ipriflavona; além disso, observou-se uma redução
significativa no grupo tratado com rutina, entretanto a relação cálcio/fósforo se manteve
adequada.
O alendronato, a atorvastatina e a ipriflavona, quando administrados
isoladamente, e a associação de alendronato com atorvastatina aumentaram os níveis de
proteínas não colagenosas. A rutina e a ipriflavona isoladamente e a associação de
ipriflavona com alendronato e rutina foram eficazes em reduzir a glicemia induzida pela
dexametasona. Através da análise histomorfométrica observou-se que a rutina, o
alendronato e a ipriflavona isoladamente e em associações foram eficazes em aumentar
o número de trabéculas ósseas.
Deste modo, essas substâncias usadas isoladamente ou as suas associações,
podem ser promissoras no tratamento da osteoporose induzida por glicocorticóide.
89
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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