0
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE FARMÁCIA
RAQUEL PEREIRA DALL’ IGNA
DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE CREMES CONTENDO
IDEBENONA
Itajaí
2013
1
2
RAQUEL PEREIRA DALL’ IGNA
DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE CREMES CONTENDO
IDEBENONA
Monografia apresentada como requisito para
obtenção do título de farmacêutico pela
Universidade do Vale do Itajaí, Centro de
Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Daisy Janice Aguilar
Netz
Co-orientador: Prof. Dr. Tania Mari Bellé
Bresolin
Itajaí, Junho de 2013
3
4
5
6
A Deus por te me oferecido a oportunidade de viver, evoluir a cada dia e
conhecer pessoas que me apoiaram.
Dedico está monografia aos meus pais (Ana Lúcia C. P. Dall’Igna e Nilo José
Dall’Igna), a minha irmã (Aline Pereira Dall’Igna) que com o amor, carinho e com o
companheirismo sempre me apoiaram e nunca
me deixaram desanimar. Suas
palavras nós momentos mais difíceis foram fundamentais para me dar motivação e
força para continuar.
Amo vocês!
7
8
AGRADECIMENTOS
A vida em certos momentos me fez parar, e seguir por outros caminhos. No entanto,
a paixão por essa profissão foi algo que nunca morreu. Mesmo tendo descoberto outros
talentos e aptidões no decorrer da caminhada, ser Farmacêutica é um sonho muito
aguardado.
Em primeiro lugar agradeço a Deus, por nunca ter me abandonado em todos os
desertos que atravessei. Mesmo quando não somos fiéis, Ele permanece fiel. Aleluia!
Agradeço as professoras Daisy Janice Aguilar Netz e Tania Mari Bellé Bresolin, pela
orientação e pela paciência, carinho e pelas muitas explicações que me foram essenciais
para chegar ao fim deste trabalho.
Muito obrigado à todos que contribuíram, seja na parte experimental ou nas
correções. Em primeiro lugar aos professores Renê Artur Ferreira, Vania Foldin, Ruth M.
Lucinda e Ana Elisa de Oliveira e também os colegas Bruno Fonseca dos Santos, Natany
Buratto e em especial ao Fellippe R. Wolff, por ter realizado a parte da determinação do teor
de IDB por CLAE
Agradeço aos meus pais, por toda a paciência nos meus erros (que não foram
poucos) e acertos, por todo amor e por todas as orações em meu favor: Obrigado por terem
me dado “a sorte de um amor tranquilo”. Sua capacidade de amar tende ao infinito. Essa
vitória também é de vocês.
A minha irmã, por ter sido meu apoio constante. Pela torcida, por vibrar com as
minhas conquistas e também a todo o restante da família: os Pereira e os Dall’Igna, que
mesmo não estando próximos fisicamente torcem e vibram com cada conquista minha
Costumo dizer que quem tem amigos, nunca está só. Felizmente, estou longe de ser
uma pessoa sozinha. Não caberia nesse espaço, caso fosse citar um a um os nomes de
todo os que me ajudaram nesse percurso. Portanto meus amigos sintam-se agradecidos.
9
10
De tudo ficarão três coisas: a certeza de que estamos começando, a certeza de que
é preciso continuar e a certeza de que podemos ser interrompidos antes de terminar.
Fazer da interrupção um caminho novo. Fazer da queda um passo de dança. Do
medo, uma escada. Do sonho, uma ponte. Da procura, um encontro.
Fernando Sabino
11
12
DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE CREMES CONTENDO
IDEBENONA
Raquel Pereira DALL’IGNA
Orientadora: Prof. Dra. Daisy Janice Aguilar Netz
Co-orientadora: Prof. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin
Defesa em: Junho de 2013
Resumo:
A Idebenona (IDB) tem sido empregada no tratamento de patologias sistêmicas,
especialmente pelo efeito neuroprotetor e em produtos cosméticos, devido ao grande poder
antioxidante, despigmentante, atuando como ativo antissinais do envelhecimento cutâneo.
Atualmente, a IDB é comercializada em formulações cosméticas, sendo frequentemente
lipossomada e apresentando problemas relacionados à irritação da pele. Portanto, o
presente trabalho visou o desenvolvimento de formulações semissólidas contendo IDB e
QTS, um biopolímero biocompatível, incorporados nas emulsões, na forma de dispersão
coloidal. As formulações foram produzidas pelo método da inversão de fases e as diretrizes
preconizadas pela ANVISA, adaptadas, foram utilizadas para o estudo de estabilidade,
sendo o teor de IDB determinado por CLAE. Assim, a estabilidade físico-química das
formulações compostas por emulsões do tipo O/A contendo 0,5 % (p/p) de IDB, incorporada
na fase oleosa (IDB-FO), na forma convencional ou na fase aquosa acidificada com ácido
acético com QTS formando uma dispersão coloidal (IDB-QTS) ou sem QTS (IDB-ACT) foi
estudada em teste preliminar (de centrifugação e ciclos de congelamento e
descongelamento durante 14 dias), estudo acelerado (90 dias em temperatura de geladeira
e estufa a 40°C) e de tempo real (90 dias em temperatura ambiente). De um modo geral, as
formulações apresentaram-se estáveis quanto ao aspecto organoléptico, após os testes
preliminares. No teste acelerado as formulações apresentaram estabilidade quanto ao
aspecto organoléptico e quanto ao pH, mostrando discreto aumento de viscosidade ao final
do estudo, sendo a formulação que contem IDB-QTS considerada a mais estável e a IDBFO, a menor estável neste aspecto, pois houve diminuição da viscosidade. Todas
apresentaram comportamento tixotrópico, sendo que a IDB-QTS apresentou maior aumento
na tixotropia após 90 dias, indicando a formação de uma rede estruturada na emulsão. O
teor dos cremes foi mensurado em 109,4%. Conclui-se que as formulações desenvolvidas
apresentaram-se adequadas para posterior caracterização do sistema coloidal formado
entre o fármaco e a QTS, e para avaliação biológica do efeito deste sistema.
Palavras-chave: Emulsões. Idebenona. Quitosana.
13
14
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Estrutura e peso molecular da idebenona (A) e da Coenzima Q 10 (B).
Estrutura química da quitosana.........................................................
Fotografias da microscopia óptica das amostras de emulsões (ocular
400 X): A – Base, B – IDB-ACT, C – IDB FO, D – IDB – QTS.......
Aspecto das formulações contendo 0,5% de IDB após os ciclos de
congelamento e descongelamento....................................................
Amostras submetidas ao estudo de estabilidade antes e após 90
dias em cada ambiente: G (geladeira), E (estufa), A (ambiente).
Figura representativa..........................................................................
Perfil de escoamento das amostras A (creme base), B (IDB-FO), C
(IDB-ACT.), D (IDB-QTS durante o estudo de estabilidade de curto
prazo. Temperatura ambiente...........................................................
Cromatograma da amostra IDB QTS mostrando o pico de IDB (11
min.)..................................................................................................
29
33
42
43
45
50
51
15
16
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Características organolépticas das formulações contendo 0,5% de
IDB, após os ciclos de congelamento e descongelamento.................. 43
Tabela 2
Características organolépticas das amostras após o final da
estabilidade preliminar e acelerada(90 dias)........................................
Tabela 3
Valores de pH durante o estudo de estabilidade acelerada das
formulações. Resultados foram expressos pela média das leituras
(n=3) de cada lote (n=3)......................................................................
45
Tabela 4
Tabela 5
46
Valores da viscosidade aparente das formulações no tempo inicial e
final do estudo de estabilidade acelerada..........................................
48
Parâmetros reológicos avaliados no tempo zero e após 90 dias.
Temperatura ambiente.......................................................................
49
17
18
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Composição descritiva das formulações contendo 0,5% de IDB na
fase oleosa (IDB-FO), contendo 0,5% de IDB incorporada na fase
aquosa acidificada (IDB-ACT, e contendo 0,5% de IDB com QTS na
mesma formulação)...........................................................................
37
19
20
LISTA DE ABREVIATURAS
ACT - Ácido Acético
GD - Grau de desacetilação
IDB-ACT- Idebenona com Ac. acético
IDB - Idebenona
IDB-QTS- Idebenona com quitosana
IDB FO - Idebenona fases oleosa
MTT- Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazol
MW - Massa molecular
QTS - Quitosana
TPP - Tripolifosfato de sódio
21
22
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 23
2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 25
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 25
2.2 Objetivos Específicos ...................................................................................... 25
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 27
3.1 Idebenona ......................................................................................................... 27
3.2 Quitosana .......................................................................................................... 31
4 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 35
4.1 Material .............................................................................................................. 35
4.1.1 Reagentes ...................................................................................................... 35
4.1.2 Equipamentos ................................................................................................ 35
4.2 Métodos ............................................................................................................. 36
4.2.1 Preparo da formulação ................................................................................. 36
4.2.2 Avaliação morfológica por microscopia óptica .......................................... 38
4.3 Testes de estabilidade preliminar e acelerada .............................................. 38
4.4. Determinação do teor de IDB nas formulações semissólidas por CLAE....39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 41
5.1. Avaliação do aspecto das formulações......................................................................41
5.2. Estudo de Estabilidade Preliminar..................................................................43
5.3. Estudo de estabilidade acelerada...............................................................................44
5.4 Determinação do teor de IDB nas formulações semissólidas por CLAE.....51
6 CONCLUSÕES ................................................................................................ 53
REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 55
23
23
1 INTRODUÇÃO
A IDB é uma benzoquinona sintética (C19H30O5), introduzida no mercado pela
Takeda Chemicals Industries, em 1986 (WEMPE et al., 2009). Apresenta cor
alaranjada, praticamente insolúvel em água (BUDAVARI, 1996; MARTIN et al.,
2007) e com ponto de fusão de 46 °C (BUDAVARI, 1996; VENKAT et al., 2006). É
um análogo da CoQ10
cuja modificação molecular tornou-a, com relação ao
potencial redox, 100 vezes mais efetiva do que esta (WIELAND et al., 2000).
Embora considerada não tóxica em humanos (BARKWORTH et al., 1984 apud
WIELAND et al., 2000) e nem mutagênica em modelo animal (GEROMEL et al.,
2002), apresenta irritação quando em contato com a pele e olhos. De acordo com
um estudo de permeação em orelha de porco e em melanócitos de rato, o metabólito
acídico da IDB é o responsável pela toxicidade in vitro e pela irritação na pele
(WEMPE et al., 2009).
Graças a seu poder antioxidante (PIGNATELLO; ITRAVAIA; PUGLISSI,
2006), a IDB tem sido empregada e proposta para o tratamento de patologias
sistêmicas, especialmente as neurodegenerativas, como a Ataxia de Friedreich (Di
PROSPERO et al., 2007; FILLA; RINALDI, 2010) e em aplicações tópicas, como
inibidor da melanogênese. Em estudo realizado por Martin et al. (2007), utilizando
células derivadas de melanoma humano com capacidade de síntese de melanina, a
IDB inibiu a síntese de melanina de forma dose-dependente.
Devido sua importante atividade biológica, tem sido empregado em produtos
cosméticos, pois é capaz de proporcionar proteção oxidativa superior a ativos
clássicos como o ácido alfa tocoferol, N6-furfuryladenine ubiquinona, ácidoascórbico, ácido lipóico (índices de 95% para a IDB e 80%, 68%, 55%, 52% e 41%
para os outros, respectivamente), apresentando excelentes resultados em estudos
clínicos (com 0,5 e 1,0% de IDB) no tratamento de sinais do fotoenvelhecimento
cutâneo, com redução significativa de linhas de expressão (27 a 29%), aumento da
hidratação (37%), diminuição de Interleucina IL-1b, Il-6 e metaloproteinase MMP-1,
além de aumento de colágeno I (Mc DANIEL et al., 2005a,b).
24
Atualmente a IDB é comercializada na forma de lipossomas e algumas
indústrias cosméticas relatam utilizar este fármaco nanoencapsulado, segundo
informações dos rótulos. É o caso do produto Prevage®, da marca Elisabeth Arden,
que contém 0,5% de idebenona lipossomada. Quando incorporada em lipossomas
peguilados, em estudo de Paolino et al. (2009), em comparação com o fármaco livre,
foi capaz de diminuir, em culturas de astrócitos, o efeito tóxico em até 10 vezes,
tendo, entretanto, sua disponibilidade biológica diminuída.
A quitosana (QTS), obtida a partir da desacetilação alcalina da quitina, é um
polímero de baixo custo, baixa toxicidade, biodegradável e não alergênico
(ALENCASTRE et al., 2006). Amorin et al. (2009) demonstraram a eficiência de
nanopartículas de QTS reticuladas com TPP, na incorporação de IDB, por spray
dryer, as quais foram capazes de aumentar a estabilidade da IDB (em estudo de 45
dias, houve perda de 6% na forma de nanopartícula e 60% na forma livre),
preservando a sua atividade antioxidante (decréscimo de 3% contra cerca de 40%
para o fármaco livre) e diminuindo o potencial irritante do fármaco na pele (estudo in
vitro em células L929). Além disso, a coloração alaranjada intensa do fármaco foi
minimizada após a incorporação nas nanopartículas, favorecendo o emprego em
formulações tópicas. Porém em estudos prévios, a incorporação deste sistema em
formulações semissólidas com teor final de 0,5% de IDB mostrou-se inviável devido
à elevada carga de polímero a ser incorporada e as características necessárias de
fluidez das formulações finais (BURATTO et al., 2010).
Portanto, o presente trabalho visou o desenvolvimento de uma emulsão de
uso tópico contendo 0,5% de IDB incorporada na formulação após a formação de
uma dispersão coloidal com a QTS em meio aquoso acidificado com ácido acético e
reticulação com TPP. Foram desenvolvidos estudos de caracterização da emulsão
resultante por microscopia óptica além de outras características físicas e físicoquímicas e teor de IDB incorporado, por CLAE, cuja metodologia foi adaptada de
Amorin et al. (2009) com sucesso, permitindo a quantificação do fármaco nos
cremes. A formulação foi submetida à estudo de estabilidade preliminar, acelerado e
em tempo real durante 90 dias.
25
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver e avaliar a estabilidade físico-química de cremes contendo
idebenona.
2.2 Objetivos Específicos
- Realizar estudos de pré - formulação de cremes contendo IDB e IDB – QTS;
- Analisar a estabilidade física e físico-química das formulações semissólidas em
estudo de estabilidade acelerado e em tempo real;
- Determinar o teor de IDB nas formulações semissólidas por CLAE.
26
27
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Idebenona
A idebenona é um composto sintético, com estrutura análoga à da coenzima
Q10 (CoQ10) (GEROMEL et al., 2010), a qual tem sido empregada em medicamentos
e cosméticos devido ao seu potencial antioxidante, ou seja, em função de atuar na
supressão da atividade dos radicais livre, os quais são compostos altamente
reativos, predominantemente oxigenados, gerados nos tecidos do organismo
humano, a partir do metabolismo e de agentes externos. Esses compostos, quando
não são mantidos sob controle, contribuem para a degradação da matriz
extracelular, oxidação de lipídeos, hidroxilação de polissacarídeos e desnaturação
de proteínas, causando inflamações, injúrias, envelhecimento dos tecidos e por
conseguinte, muitas patologias, como as doenças cardiovasculares e em muitos
tipos de câncer (BARBER; HARRIS, 1994).
O impacto do estresse oxidativo sobre a pele, especialmente o gerado pela
radiação ultravioleta, poluentes ambientais e ozônio é muito importante. O ozônio
reage principalmente com lipídios e proteínas das camadas mais superficiais.
Embora a radiação ultravioleta (UVA e UVB) consiga penetrar mais profundamente a
pele e iniciar o estresse foto-oxidativo, os lipídios e proteínas superficiais ficam
expostos a doses mais altas, com maior dano. Dentre os lipídios, o esqualeno é um
dos alvos principais, sendo degradado a hidroperóxido de esqualeno. Embora seja
gerado este metabólito reativo, considera-se o esqualeno como a primeira barreira
antioxidante da pele (THIELE et al., 2007).
Entretanto, é importante salientar que algumas espécies radicalares
são importantes para as imunidades natural e adquirida, uma vez que são agentes
oxidantes potentes, como o óxido nítrico, isolado ou associado ao radical superóxido
(peroxinitrito) e o ácido hipocloroso, os quais possuem importante ação bactericida
(RATNAM et al. 2006).
Para retardar ou prevenir os efeitos do estresse oxidativo, o organismo atua
através de mecanismos de defesa antioxidante, que são classificados em
enzimáticos e não-enzimáticos. O primeiro constitui a barreira de defesa endógena a
agir contra os ataques das espécies reativas de oxigênio e do nitrogênio, evitando o
28
acúmulo de ânion radical superóxido e do peróxido de hidrogênio, sendo este
sistema constituído por diversas enzimas, destacando-se a superóxido dismutase, a
catalase e a glutationa peroxidase (RATNAM et al., 2006).
O sistema não - enzimático é acionado principalmente através de compostos
que agem na detoxificação das espécies reativas, doando seus elétrons para as
moléculas de radicalares, interrompendo sua reatividade. As frutas e vegetais são as
principais fontes destes compostos, dentre as moléculas de compostos antioxidantes
destacam-se as Vitaminas E e C. A vitamina E é um antioxidante lipídico,
encontrada nas membranas das lipoproteínas e em tecidos como fígado, rins e
tecido adiposo adrenal. E capaz de estabilizar camadas lipídicas da epiderme e de
inibir a peroxidação lipídica em animais. Já a vitamina C ou ácido ascórbico é uma
vitamina hidrofílica, essencial na síntese de colágeno, que atua como um
antioxidante in vivo e age contra danos causados pela exposição solar. Os
carotenóides compreendem uma família de compostos naturais, são pigmentos
encontrados em alimentos de origem vegetal, com as colorações amarela,
alaranjada e vermelha. Os principais carotenóides presentes nos alimentos são o
betacaroteno, licopeno, glutationa, quercetina e luteína, estes desativam radicais
livres e interagem com espécies reativas inibindo os processos oxidativos
(VANNUCCHI et al., 1998; GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007;
MATSUMOTO, 2008).
A idebenona (Fig. 1A) é um composto sintético pertencente à classe das
quinonas. Esta classe inclui um grande número de substâncias de ocorrência
natural, encontradas nos fungos, plantas, animais e bactérias, sendo de maior
destaque a ubiquinona ou coenzima CoQ10 (Fig. 1B). De um modo geral,
apresentam as seguintes propriedades: sofrem oxidação, são eletrófilas e coloridas,
devido à absorção de radiação ultravioleta e visível. A CoQ10 atua na produção de
energia, dentro da mitocôndria e como antioxidante. Entretanto, o tratamento com
esta quinona apresenta uma limitação clínica: a cadeia alquílica lipofílica limita sua
absorção. Por esta razão, análogos foram sintetizados, os quais apresentam maior
capacidade de absorção e efeitos benéficos. É o caso da idebenona (2 - (10hidroxidecil) -5,6-dimetoxi-3-metil-ciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona), a qual possui
menor lipofilicidade, em função de apresentar na cauda alquílica com ao invés de 10
repetições de isoprenóides, uma cadeia alquílica com 10 carbonos com um grupo
29
hidroxila no final. Foi sintetizada pela empresa Takeda Pharmaceutical Company,
especialmente para o tratamento da doença de Alzheimer e para promover aumento
da memória e das funções cognitivas (OKAMOTO et al., 1988).
Figura 1 – Estrutura e peso molecular da idebenona (A) e da Coenzima Q10 (B).
A
B
MW=338,45
MW=863,36
: Mc Daniel (2005a)
A IDB, em estudo em ratos, após a administração oral, atravessou a barreira
hemato-encefálica, sendo distribuída rapidamente com um pico em torno de 15
minutos após, com concentração correspondente a 0,5% da dose. Os principais
metabólitos, denominados de QS-4, QS-6 e QS-10. Em humanos, a administração
de 30-50 mg evoca níveis plasmáticos de 300-400 mg/L após 1 a 2 horas (NAGAI et
al., 1985).
Haefeli (2012) estudou o mecanismo de ação da IDB, tendo relatado que a
mesma atua por vários aspectos moleculares importantes: interações, a nível de
mitocôndria, com a cadeia de transporte de elétrons, interagindo, de modo complexo
com enzimas desta cadeia (piruvato, succinato), aumentando ou inibindo complexos
que mediam a respiração celular, modificando o metabolismo de ácido araquidônico,
bloqueando canais de Ca2+ e estimulando a produção de NGF (fator de crescimento
neural), uma pequena proteína que é importante para o crescimento, manutenção e
sobrevivência de determinadas células nervosas.
O efeito antioxidante foi descrito por Zhai et al (2008), que ao estimar esta
atividade encontrou para a IDB a 3% mostrou resultados de atividade muito
superiores à da vitamina E (30 mM de IDB foram tão eficazes quanto 213 mM de vit.
E). Abdel Baky et al (2010) relataram uma diminuição na lipoperoxidação em função
do aumento dos níveis das enzimas antioxidantes glutationa, superóxido dismutase
e de catalase, atuando de modo competitivo com a CoQ10 e também na oxidação de
NADH.
30
Embora
sendo
considerada,
de
acordo
com
o
fabricante
atual
(TAKEDA/SANTHERA) e em ensaios clínicos um fármaco seguro (BODMER et al.,
2009), não tóxico para humanos (BARKWORTH et al., 1984 apud WIELAND et al.,
2000), nem mutagênico em modelo animal (GEROMEL et al., 2002),
trabalhos
recentes expressam a preocupação em relação à sua toxicidade (LUSTYIK;
O´LEARY, 1990; WEMPE et al., 2009). De acordo com Haefeli (2012), os primeiros
utilizaram concentrações muito altas, não alcançadas in vivo (superiores a 75 mM) e
o segundo, o qual utilizou no ensaio de viabilidade células MTT, as quais interferem
diretamente com a IDB.
A despeito da controvérsia quando da toxicidade em uso oral, é comprovado
que a IDB proporciona irritação quando em contato com pele e olhos. Wempe et al.
(2009), realizaram estudo de permeação da IDB e de um éster (IDB linoleato) em
modelo animal, em orelha de porco e a citotoxicidade em células de melanoma de
ratos (B16:F10), em ensaio MTT, relacionando, no modelo in vitro, o efeito irritante
ao metabólito acídico da IDB. A IDB foi permeada, em torno de 4 horas, através da
pele de orelha de porco e foi, na sua maior parte, metabolizada, resultando um
metabólico acídico, considerado o causador do efeito irritante. O derivado foi
metabolizado somente numa pequena fração, sem entretanto causar efeito irritante.
É importante salientar que o efeito irritante da IDB, na pele, em formulações
cosméticas lipossomadas, foi demonstrado em vários relatos de caso, mesmo
quando lipossomada (FLEMING; WHITE; WHITE, 2008; Mc ALEER; COLLINS,
2008). Assim, verificou-se que mesmo lipossomada permenece o desafio na busca
da diminuição do potencial irritante dérmico, fato que muitas vezes induz a
descontinuidade do emprego da IDB tópica.
O emprego tópico da IDB é proposto em função de sua atividade antioxidante,
o que a torna capaz de atuar no combate aos radicais livres e aos sinais do
fotoenvelhecimento, uma vez que também apresenta a capacidade de inibição da
tirosinase, minimizando a presença, na pele, de manchas actínicas. Tais aspectos
biológicos foram avaliados por Mc Daniels et al. (2005 a,b), que compararam, em
modelo in vitro, a ação antioxidante da IDB com antioxidantes clássicos, lipofílicos e
hidrofílicos (Vit. E, Kinetin, ubiquinona, ácido-ascórbico e ácido lipóico), tendo sido
evidenciada a superioridade da IDB. Foi verificada capacidade de atuar na inibição
da ação inflamatória, pela diminuição de Interleucina IL-1b, Il-6 , no aumento da
31
capacidade antioxidantes (inibição da metaloproteinase MMP-1). Também em
ensaios clínicos a IDB apresentou excelentes resultados, uma vez que quando
administrada nas concentrações de 0,5%-1,0% foi capaz de atuar promovendo
significativa reversão de linhas de expressão (em torno de 28%), aumento da
hidratação (37%) e no aumento do colágeno tipo I. Em estudo realizado por Martin
et al. (2007) utilizando células derivadas de melanoma humano com capacidade de
síntese de melanina, a IDB inibiu. Assim, em função da grande capacidade
antioxidante e dos importantes resultados clínicos na pele, é reconhecida a
importância da aplicação tópica da IDB na prevenção e na reversão dos sinais do
fotoenvelhecimento. Entretanto, como anteriormente descrito, o uso contínuo é
desfavorecido em função do potencial irritante da mesma. Visando minimizar este
aspecto, Amorim e colaboradores (2010) avaliaram a eficiência de nanopartículas de
QTS reticuladas com tripolifosfato de sódio (TPP), na incorporação de IDB, com
secagem por spray dryer, o que proporcionou o incremento da estabilidade na
magnitude de 10 vezes superior a do fármaco livre, preservando a sua atividade
antioxidante in vitro e diminuindo o potencial irritante do fármaco em modelo in vitro
(Agarose overlay). A IDB, classificada como apresentando “reatividade severa”, após
a incorporação nas nano partículas apresentou drástica redução em sua reatividade
frente às células L929. Estes resultados revelam o potencial do nanosistema
formado com a QTS como carreador da IDB em formulações de uso tópico ou nasal,
sendo essa última via de interesse, uma vez que evitaria o significativo metabolismo
de primeira passagem sofrido pelo fármaco quando administrado por via oral.
3.2 Quitosana
Em termos de materiais poliméricos naturais, como os polissacarídeos, o
Brasil é um país privilegiado por apresentar fontes renováveis desses recursos e
com potencial para desenvolver novos produtos de interesse na área farmacêutica e
cosmética. Polissacarídeos podem ser processados para a formação de sistemas
micro e nanoparticulados, utilizadas na vetorização de fármacos e possuem
vantagens sobre os polímeros sintéticos por serem biodegradáveis, biocompativeis,
além de poderem possuir receptores específicos em certas células (LEMARCHAND
et al., 2004; AJUN et al.; 2009).
32
A quitosana (QTS), que é um polissacarídeo derivado da quitina, isolado pela
primeira vez em 1859, teve aplicação inicial, nos países orientais, para o tratamento
de
queimaduras
e
na
cicatrização
de
feridas.
Estudos
mostram
sua
biocompatibidade, uma vez que não manifestou reações alérgicas quando utilizado
na forma de implantes, topicamente ou mesmo em uso oral (COSTA SILVA; Dos
SANTOS; FERREIRA, 2006).
A QTS possui semelhança estrutural com a celulose, porém com a presença
de grupamentos amínicos livres, compostos pelas unidades monoméricas de β(1→4)- 2-amino-2-desoxi-D-glicose e β-(1→4)-2-acetamida-2-desoxi-D-glicose. Este
polímero natural possui uma estrutura cristalina altamente organizada, sendo
insolúvel em meio aquoso e na maioria dos solventes orgânicos, tendo baixa
reatividade química. Entretanto, pode ser facilmente solubilizado em soluções de
ácidos fracos diluídos, devido à protonação de seus grupamentos amino, sendo o
ácido acético o solvente mais empregado. Agentes reticulantes, como glutaraldeído,
etilenoglicol diglicil éter, ácido sulfúrico e TPP são utilizados para aumentar sua
estabilidade química e para promover resistência mecânica (LARANJEIRA; de
FÁVARE (2009).
A QTS ocorre em baixíssima escala em alguns fungos pertencentes aos
gêneros Mucor e Zygomicetes (LOPES, 2007) ou pode ser obtida através da
desacetilação
alcalina
da
quitina
proveniente
da
casca
de
crustáceos
(THARANATHAN; KITTUR, 2003).
A massa molecular média da QTS comercial está situada na faixa de 1,0 x 10
a 1,2 x 106 Da, dependendo do grau de desacetilação, da presença de impurezas e
do método de preparação (LARANJEIRA; de FÁVARE (2009). A Figura 2 ilustra a
estrutura química da QTS.
A QTS possui várias características que a tornam atraente para a utilização
em cosméticos. Pertencente à classe dos biopolímeros chamados de hidrocolóides,
a QTS se destaca por apresentar carga global positiva em pH biológico, ou seja,
apresenta se como um polímero policatiônico, enquanto a maioria dos hidrocolóides
apresentam-se negativamente carregados nas mesmas condições (POLYMAR et al,.
2008). Este aspecto de carga é capaz de proporcionar maior adesão da formulação
na pele, uma vez que a carga global desta tende a se apresentar ligeiramente
aniônica, caráter acentuado em cabelos danificados (NAKANO, 2006).
33
Figura 2 – Estrutura química da quitosana
Fonte: Laranjeira; de Fávare (2009)
Devido as suas propriedades, a adição da QTS em formulações
dermocosméticas pode aumentar a compatibilidade da formulação com a pele,
promover
espessamento
de
fase
aquosa
ou
estabilização
da
emulsão
(RODRÍGUEZ; ALBERTENGO; AGULLÓ, 2002)
Em protetores solares, a QTS reduz a perda dos filtros UV decorrente da ação
da água ou suor. Essa propriedade melhora a tolerância da pele ao protetor e
protege contra o ressecamento da mesma. A QTS forma um filme sobre a pele que
reduz a quantidade de luz ultravioleta absorvida pela pele, aumentando o fator de
proteção solar. Em batons, a QTS (utilizada nas concentrações de 0,05% a 1%)
aumenta a resistência dos filtros UV e de substancias lipofílicas ativas, protegendo a
pele contra o ressecamento (POLYMAR, 2013)
A QTS pode ser quimicamente modificada sendo por isso uma das vantagens
mais interessantes a sua grande versatilidade, podendo ser empregada em
diferentes formas cosméticas, tais como pós, beads, nanopartículas, géis, crenesgéis, emulsões e soluções (ANCHISI; MELONI; MACCIONI, 2006; LARANJEIRA; De
FÁVARE, 2009). Finalizando, a QTS é uma substância considerada segura para o
organismo humano; consequentemente, adequada para o emprego em aplicações
médicas, farmacêuticas e cosméticas (KUMAR et al., 2006; RINAUDO, 2006).
34
35
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1. Reagentes
-Ácido acético PA, Biotec
-Ácido etilenodiaminatetracético (EDTA), Próton Química
-Água destilada e água ultrapura grau I Milli Q
Álcool cetílico, All chemistry
-Álcool cetoestearilico, Henrifarma
-Butilhidroxitolueno (BHT), All Chemistry
-Dipropilenoglicol, Alpha Química
-Emulium Delta, Gateffossé
-Glicerina, ALL Chemistry
-Idebenona, Attivos Magistrais
-Metanol Grau HPLC, J.T Backer
-Metilparabeno, Vetec
-Monoestearato de Glicerila, All Chemistry
-Oleato de decila, Quimper
-Óleo de silicone, All Chemistry
-PEG 1000, Pharma Special
-Phenonip, Pharma Special
-Quitosana, Purifarma, previamente purificada e caracterizada de acordo com
Fonseca-Santos (2010).
-Triglicerídeos dos ácidos cáprico/caprílico, All Chemistry
-Tripolifosfato de sódio, PA, Sigma
-Tween® 80, Henrifarma
4.1.2. Equipamentos
-Agitador mecânico - Fisatom, 713D
-Agitador Ultraturrax – Quimis
-Centrífuga - Fanem, 206 R
36
-Cromatógrafo (Shimadzu®, SPD-10AVP, equipado com detector tipo diode array
SPD M 10A VP, software Class VP (versão 5.032), sistema de bomba (LC 10AD
VP), sistema controlador (SCL 10AVP), sistema de válvulas (SCV 10AC-VP) e
sistema de injeção manual (looping de 20 µL));
-Estufa – Fanem, 502 C
-Geladeira – Bosch
-Microscópio óptico – Olympus, BX 50
-pHmetro digital –Digimed, D20
-Viscosímetro Rotacional – HAAKE, VT 550-Sensor PK 1 1o
4.2 Métodos
4.2.1. Preparo da Formulação
Anteriormente ao preparo das emulsões, foi realizada a solubilização da QTS
em meio ácido. Para isso foram pesados 1,0 g de QTS previamente purificada e
caracterizada (FONSECA-SANTOS, 2010) e solubilizada em 90 mL de solução de
ácido acético 0,05 M (v/v), pH 4,0. Esta mistura foi mantida sob agitação constante
(400 rpm) por aproximadamente 24 horas em agitador mecânico. Após este período,
submeteu-se à agitação em ultraturrax por 1 min (6000 rpm). Foram adicionados 675
mg de IDB, previamente solubilizada em álcool etílico (2,0 mL) e 3-4 gotas de
Tween 80, para obter-se 0,5% de IDB na emulsão. Esta mistura foi novamente
submetida ao ultraturrax por 1 min a 6000 rpm. Após, a suspensão coloidal obtida foi
mantida sob agitação mecânica (aprox. 350-400 rpm) por um período de 4 horas.
Após, foram adicionados, gota a gota, 1,5 mL do agente reticulante, TPP a 2% (m/v),
sendo esta mantida em agitação (400 rpm) até o momento da incorporação na
emulsão.
Foram elaboradas 3 diferentes variações de formulações, conforme mostre o
quadro 1: a primeira contendo IDB a 0,5% incorporada na fase aquosa ácida
(composta pela dispersão de QTS em ácido acético 0,05 M) a qual foi denominada
de IDB-QTS, a segunda, contendo IDB incorporada na fase oleosa (IDB-FO) e a
terceira, adicionando a IDB na fase oleosa mas usando como veículo de fase
aquosa a solução de ácido acético 0,05 M (denominada de IDB-ACT) e o controle
37
negativo, denominada de Base. Em todas as formulações o pH foi corrigido, se
necessário, para estar entre 4,5 a 5,0.
O método de preparo das emulsões foi o da inversão de fases, com o
aquecimento das fases aquosa e oleosa na faixa de 75-80°C, até ser atingida a
temperatura, sendo vertida a fase aquosa sobre a oleosa, mantendo-se a agitação
em banho maria por aproximadamente 1 minuto e após, em agitador mecânico, a
1000 rpm por 10 min, sendo seguida por agitação manual suave por mais 5 minutos.
Este procedimento foi seguido em função da orientação do fabricante da base
Emulium Delta®. A composição total da base está informado no Quadro 1.
Quadro 1 – Composição descritiva das formulações contendo 0,5% de IDB na fase
oleosa (IDB-FO), contendo 0,5% de IDB incorporada na fase aquosa
acidificada (IDB-ACT), e contendo 0,5% de IDB com QTS na mesma
formulação (IDB-QTS).
Formulações/Ingredientes (%)
Componentes
Base
IDB-FO
IDB-ACT
IDB-QTS
Função
Idebenona
-
0,5
0,5
0,5
Ativo
Emulium Delta
5,0
5,0
5,0
5,0
Emulsionante
Monoestearato de
4,0
4,0
4,0
4,0
Emulsionante
Alcool cetílico
1,0
1,0
1,0
1,0
Espessante
Alcool cetoestearílico
2,0
2,0
2,0
2,0
Espessante
Phenonip
0,5
0,5
0,5
0,5
Conservante
TG ác.cáprico/caprílico
3,0
3,0
3,0
3,0
Emoliente
Oleo de silicone
1,0
1,0
1,0
1,0
Emoliente
Oleato de decila
1,0
1,0
1,0
1,0
Emoliente
BHT
0,1
0,1
0,1
0,1
Antioxidante
Dipropilenoglicol
2,0
2,0
2,0
2,0
Umectante
EDTA
0,1
0,1
0,1
0,1
Quelante
Metilparabeno
0,1
0,1
0,1
0,1
Conservante
Glicerina
6,0
6,0
6,0
6,0
Umectante
Tween 80
0,5
0,5
0,5
0,5
Tensoativo
PEG 1000
0,5
0,5
0,5
0,5
Umectante
Quitosana
-
-
-
0,74
Espessante
Glicerila
TPP
Água Destilada
0,022
qsp 45 g
qsp 45 g
qsp 45g
qsp 45 g
Veículo
38
4.2.2. Avaliação morfológica das emulsões por Microscopia Óptica
A análise microscópica das emulsões desenvolvidas foi procedida da seguinte
forma: foram pesados aproximadamente 150 mg de formulação e diluída em 5 mL
de água destilada com agitação suave até se obter uma mistura homogênea. Desta
mistura foi utilizada 1 gota, a qual foi cuidadosamente colocada sobre a lâmina, e
sobre esta foi depositada a lamínula. A observação do aspecto das emulsões foi
realizada em microscópio óptico com aumento de 400 X. Com o auxílio de uma
câmara fotográfica foi capturada a imagem visualizada no microscópio.
4.3 Teste de estabilidade preliminar e acelerada
Estes testes, preconizados pela ANVISA (BRASIL, 2004) foram realizados
utilizando-se os seguintes ensaios:
4.3.1 Teste de Centrifugação
Previamente aos estudos de estabilidade, as amostras foram submetidas a
centrifugação e para isso foram pesados aproximadamente 2,0 g de cada amostra e
colocadas em um frasco cônico Eppendorf, o qual foi submetido à centrifugação por
15 minutos a 3500 rpm, à temperatura ambiente (BRASIL, 2004). Após o teste, foi
observado o aspecto das formulações, com relação a possível cremeação ou
separação de fases.
4.3.2 Determinação do valor do pH
Foi determinado em potenciômetro inserindo o eletrodo diretamente na
diluição aquosa 1:10. Para homogeneização da amostra foi utilizado vórtex durante
1 minuto.
4.3.3 Ciclo de congelamento e descongelamento
O ciclo de congelamento e descongelamento foi realizado acondicionando as
amostras em frascos polietileno, de fundo duplo, as quais foram submetidas a 6
ciclos de congelamento e descongelamento, durante 12 dias, nas temperaturas de 5 °C ± 2 °C e 40 °C ± 2 °C, alternadamente, perfazendo no total 6 ciclos (BRASIL,
2004).
39
4.3.4 Estabilidade acelerada
Amostras de 15 gramas das emulsões consideradas estáveis após o estudo
preliminar de estabilidade foram submetidas a diferentes condições de temperatura:
ambiente (não controlada) ao abrigo da luz (tempo real), estufa (40 ºC± 2,0 ºC) e
geladeira (5 ºC ± 2,0 ºC) (estudo acelerado). As amostras foram analisadas, nos
tempos 0, 8, 15, 30, 60 e 90 dias, quanto aos seguintes parâmetros: caracteres
organolépticos (cor, odor, textura, brilho, homogeneidade, presença de separação
de fases/precipitações), pH e comportamento reológico, itens preconizados no Guia
para Estudos de Estabilidade de Produtos Cosméticos, da ANVISA (BRASIL, 2004).
As análises foram realizadas em triplicata.
4.3.5 Análise reológica
A viscosidade, o índice de comportamento de fluxo e a tixotropia foram
determinados em viscosímetro modelo rotacional acoplado ao termo controlador em
uma temperatura de 25 ºC, empregando sensor cone/placa (PK 1 1), taxa de
cisalhamento entre 0,1300 e 80,00 1/s, rampa de velocidade placa de paralelo
controlada coletando 100 pontos em cada etapa, por um período de 300 s cada. A
análise do índice de fluxo foi estabelecida utilizando-se todos os pontos do
reograma, baseando-se na equação da Lei da Potência, o ponto de ruptura na
equação de Bingham, utilizando-se na curva ascendente valores entre 0,01 e 0,5.
Os dados foram obtidos com o Software RheowinJob® e analisados com o Rheowin
Data®.
4.4 Determinação do teor de IDB nas formulações semissólidas por CLAE
O doseamento por CLAE foi realizado pelo acadêmico Fellippe Wolff em
cromatógrafo (Shimadzu) empregando coluna Phenomenex® 250 mm x 4,6 cm,
empacotada com octadecilsilano quimicamente ligado à sílica porosa, de 5 m de
diâmetro, temperatura do forno de 30 °C. A fase móvel consistiu de metanol:água
40
na proporção de 80:20, com fluxo de 1 mL/min, com detecção em 279 nm. O método
foi adaptado de Amorin e colaboradores (2009) que validaram a metodologia para
análise do teor de IDB em nanopartículas de QTS.
Para a execução do ensaio foi empregado o método da padronização externa,
com o preparo de uma solução referência do pó de IDB, comparando a sua
concentração e área com a área do pico do analito das soluções amostra.
A solução referência foi preparada empregando a IDB mantida em
dessecador pesando-se exatamente cerca de 10 mg e transferindo para balão
volumétrico de 100 mL. Foi adicionado 50 mL de metanol grau HPLC, sonicado por
15 minutos e completado o volume com água, aguardando a temperatura retornar a
25 °C para ajuste do menisco. A solução foi homogeneizada e transferiu-se 1,25 mL
para um segundo balão de 25 mL e completado o volume com a mistura
metanol:água 8:2 (concentração final de 5 μg/mL). Filtrou-se em membrana de
0,45µm e injetou-se em sextuplicata no cromatógrafo.
As soluções amostra foram preparadas pesando-se exatamente cerca de 1,0
g de creme a 0,5% de IDB (em triplicata escolhendo porções diferentes) em um
bequer de 50 mL, adicionando 40 mL de metanol:água 1:1 e sonicando por 20 min a
50
°C. Transferiu-se quantitativamente para um balão volumétrico de 50 mL e
completou-se o volume com o mesmo solvente, aguardando a temperatura retornar
a 25 °C para ajustar o menisco. Sonicou-se novamente por 20 min a 50
°C,
homogeneizou-se e foi transferido 1,5 mL para eppendorf, equilibrando-os em uma
balança e centrifugando a 13.000 rpm por 15 min em temperatura próxima de 4 °C.
Transferiu-se 0,5 mL do sobrenadante para um balão volumétrico de 10 mL e
completou-se o volume com metanol:água 8:2. Filtrou-se em membrana de 0,45 µm
e injetou-se em duplicata no cromatógrafo (conc. teórica 5 μg/mL).
41
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste trabalho foram desenvolvidas e avaliadas emulsões contendo IDB
associada ou não à QTS. A escolha deste fármaco deveu-se a sua importante
atividade biológica antioxidante e aos desafios que permanecem no tocante a
diminuição de sua irritação dérmica, aspecto que determina para muitos pacientes a
descontinuidade da aplicação tópica (FLEMING; WHITE; WHITE, 2008; Mc ALEER;
COLLINS, 2008).
As formulações desenvolvidas no presente trabalho foram baseadas em
trabalhos anteriores do grupo (BURATO et al., 2010). Várias formulações foram
testadas, incorporando nanopartículas de QTS contendo IDB, sem sucesso, devido
à excessiva quantidade de material sólido necessário a fim de alcançar 0,5% de IDB
no creme. Partiu-se para a incorporação da IDB previamente misturada com a QTS
na forma de uma suspensão coloidal, contendo TPP como agente reticulante.
Optou-se pelo emprego de bases/tensoativos não iônicos, devido ao caráter
catiônico da QTS. A fim de avaliar a influência da QTS no desempenho das
emulsões, esta foi omitida das formulações IDB-FO e IDB-ACT. A incorporação da
IDB previamente dispersa em meio aquoso ácido, sem a QTS também foi avaliada.
5.1 Avaliação do aspecto das formulações
5.1.1 Analise morfológica
As formulações desenvolvidas foram submetidas à analise microscópica (Fig.
3) a fim de melhor compreender a formação do sistema emulsionado e o aspecto do
fármaco nos sistemas.
Por esta análise verificou-se que as emulsões apresentam glóbulos esféricos,
com diâmetro das gotículas aferidas na sua maioria menor do que 10 µm. Na
formulação IDB - QTS observou-se a presença de gotículas esféricas e também de
pequenos aglomerados de gotículas menores. Não foi observada a presença de
cristais de IDB ou qualquer outro material particulado nas formulações sugerindo que
o fármaco tenha sido incorporado completamente solubilizado nas formulações.
42
Figura 3 – Fotografias da microscopia óptica das amostras de emulsões (ocular 400
X),: A- Base, B – IDB-ACT, C – IDB FO, D – IDB – QTS.
5.1.2 Análise organolépticas
As características organolépticas das formulações desenvolvidas foram
descritas como: i) Creme base (controle negativo) de cor branca, com alto brilho,
textura homogênea e leve, não aerada; odor suave, típico dos componentes da
base;
aspecto
sensorial
característico
de
baixa
oleosidade,
ausência
de
pegajosidade, alta espalhabilidade e deslizamento, sem presença de resíduo ou
travamento; ii) IDB-FO: cor amarela mais intensa, típica da coloração da IDB, textura
homogênea, com alto brilho, textura leve, não aerada, odor típico dos componentes
da base; iii) IDB-ACT: cor amarela, típica da coloração da IDB, textura homogênea,
com alto brilho, textura leve, não aerada e odor levemente ácido; iv) IDB-QTS: cor
amarela, típica da coloração da IDB, textura homogênea, com alto brilho, textura
leve, não aerada em uma das replicatas e levemente aerado em 2 replicatas; odor
levemente ácido. A aeração deveu-se ao fato desta amostra ficar por um tempo
maior sob agitação de 1000 rpm (20 ao invés de 10 min). Esta variação foi
necessária para proporcionar maior consistência a formulação.
43
5.1.3 Ciclo de congelamento-Descongelamento
Uma vez que as formulações desenvolvidas apresentaram-se visualmente
estáveis após sofrerem a centrifugação, foram submetidas aos ciclos de
congelamento e descongelamento e depois, ao estudo acelerado. Na Figura 4 é
mostrada uma figura 4 das amostras após serem submetidas aos ciclos de
congelamento e descongelamento. Todas permaneceram estáveis quanto aos
parâmetros analisados, conforme informa a Tabela 1, com modificação apenas no
brilho e na textura no caso da IDB-FO.
Figura 4 – Aspecto das formulações contendo 0,5% de IDB após os ciclos de
congelamento e descongelamento.
BASE
IDB-FO
IDB-ACT
IDB-QTS
Tabela 1 - Características organolépticas das formulações contendo 0,5% de IDB, após os
ciclos de congelamento e descongelamento.
Amostra
Base
IDB-ACT
Brilho Homogeneidade
LM
M
NA
NA
Textura
Odor/cor
LM
NA
NA/NA
NA/NA
IDB-FO
M
NA
LM
NA/ LM
IDB-QTS
M
NA
LA
NA/ LM
NA= não alterado, LM= levemente modificado, M=modificado, LA=levemente aerado
Comparando-se o aspecto organoléptico das bases no tempo zero, ou seja,
24 horas após o preparo e no tempo final, ou seja, após os 7 ciclos de congelamento
e descongelamento conclui-se que não houve alteração importante quanto ao
aspecto organoléptico das amostras, estando estas aptas a seguir com as demais
avaliações.
5.2 Estudo de Estabilidade Preliminar
44
Após 24 horas de preparo, as amostras foram submetidas ao teste de
centrifugação. É reconhecido que a força da gravidade atua sobre os produtos,
fazendo com que suas partículas se movam no seu interior. A centrifugação produz
estresse na amostra, antecipando possíveis instabilidades, que poderão ser
visualizadas, no caso de emulsões, na forma de precipitados, separação de fases ou
coalescência (BRASIL, 2008).
5.3 Estudo de estabilidade acelerada
Vários fatores podem afetar a estabilidade físico-química de um sistema
emulsionado. Destacam-se o tipo e a concentração de agentes emulsionantes, a
compatibilidade entre os excipientes e o(s) ativo(s), a relação de volume de fases, o
modo de preparo (especialmente no que se refere à temperatura e velocidade de
agitação
empregados)
assim
como
as
condições
de
armazenamento
e
contaminação por micro-organismos.
5.3.1 Aspectos organolépticos
Na Tabela 2 estão descritas as alterações organolépticas visualizadas nas
amostras após o período de 90 dias, no estudo de estabilidade acelerada (estufa e
geladeira) e em tempo real (ambiente). A Figura 5 apresenta as características de
amostra representativas dos 3 lotes desenvolvidos após estudo de estabilidade
acelerada e em tempo real (90 dias). Salienta-se que o aspecto sensorial foi mantido
em todas as amostras contendo IDB, com pequenas alterações da cor, no brilho, na
textura e um ligeiro aumento de consistência mostrando adequada estabilidade.
45
Tabela 2 - Características organolépticas das amostras após o final da estabilidade
acelerada e de tempo real (90 dias).
Formulações
Brilho
Textura
Cor
Odor
Homogeneidade
A
G
E
A
G
E
A
G
E
A
G
Creme base
NA NA NA NA
NA
NA
NA NA NA NA NA
IDB FO
LM LM LM LM
LM
LM/LS LM LM LM NA NA
IDB Ac. Acético
LM NA LM LM
NA
LM
NA NA LM NA NA
IDB + QTS
NA NA LM LM LM/LA LM/LA NA NA NA NA NA
Legenda : A (ambiente) G (geladeira) E (estufa); NA= não alterado; LM = levemente
E
NA
NA
NA
NA
modificado; M= modificado; I= intensamente modificado; LA= levemente Aerado;
LS- levemente modificado
Figura 5. Amostras submetidas ao estudo de estabilidade antes e após 90 dias em cada
ambiente: G (geladeira), E (estufa), A (ambiente). Figura representativa.
5.3.2 pH
Alterações
no
pH
de
uma
formulação
podem
estar
relacionadas
principalmente à degradação de compostos ou com a contaminação microbiana.
Especialmente no caso da diminuição, pode ser um indicativo de oxidação de
formação de hidroperóxidos na fase oleosa ou ainda da hidrólise de triglicerídeos, o
que pode acarretar a formação de ácidos graxos (MASMOUI et al., (2005).
46
Analisando-se os valores encontrados na verificação do pH (Tabela 3), notase que houve alteração do pH ao longo do período de estudo de estabilidade,
ficando entretanto abaixo de 10% em quase todas as amostras.
A amostra base teve sua alteração máxima na temperatura ambiente, com
10,1% de incremento, com pH de 4,53. IDB-ACT apresentou menor estabilidade da
geladeira, com aumento de 14,68% (5,80) em 60 dias, tendo maior estabilidade na
temperatura ambiente, mas ainda ligeiramente superior a 10% (pH 4,6). IDB-FO teve
o pH inicial de 4,4 e a alteração máxima situada em 4,55, inferior a 10%. A amostra
contendo QTS, com pH inicial de 4,94 apresentou maior incremento no ambiente
geladeira, com pH 5,5, (10,12%).
Tabela 3. Valores de pH durante o estudo de estabilidade acelerada das formulações.
Resultados foram expressos pela média das leituras (n=3)
pH
Amostra
Ambiente
Geladeira
T zero
T 90
4,53 (± 0,37)
5,03 (± 1,02)
4,40 (± 0,30)
4,40 (± 0,20)
3,59
4,43 (± 1,01)
5,80 (± 1,32)
4,60 (± 1,09)
IDB-FO
4,4 (± 0,26)
4,55 (± 0,21)
4,2 (± 0,12)
4,2 (±0,21)
IDB-QTS
4,94 (± 0,26)
4,83 (± 0,05)
5,5 (± 1,09)
4,6 (±0,35)
Base
IDB-ACT
T 90
Estufa
T 90
De acordo com Corrêa et al. (2005), é aceitável uma variação de pH em torno
de 10%. Entretanto, os autores estabelecem como pH ideal entre 5,5 e 6,5,
classificados por estes como compatíveis com a pele, uma vez que valores baixos
de pH podem estar relacionados ao aparecimento de irritação dérmica cumulativa.
Entretanto, vários autores tem enfocado o aspecto do pH e a função de
barreira da pele, considerando que o pH em torno de 4 a 5 seria o pH mais indicado,
capaz de normalizar o aumento do pH decorrente da idade cronológica
(WIECHERS, 2008; BLAAK; WOHLFART; SCHURER, 2011). Outro aspecto
relevante na escolha de um pH mais ácido foi a manutenção da solubilidade da
47
quitosana na emulsão, uma vez que a mesma poderia precipitar em pH acima de
5,5.
5.3.3 Aspectos reológicos
Estudos sobre a reologia de formulações farmacêuticas de uso tópico têm se
tornado cada vez mais frequente em pesquisas realizadas pela comunidade
científica, uma vez que a reometria pode representar uma importante ferramenta
para a obtenção de informações quanto à caracterização, a aceitabilidade e ao
desempenho de um produto durante a aplicação, assim como é útil também na
avaliação da estabilidade. Estudos reológicos caracterizam as manifestações das
forças que ocorrem no sistema, podendo ser relacionadas a processos como
floculação, sedimentação, cremeação e coalescência (TADROS, 2004; CORRÊA et
al., 2005).
A viscosidade (viscosidade em uma determinada taxa de deformação) é um
parâmetro reológico que indica a resistência de um determinado material em fluir,
determinada pela taxa de deformação sob determinada pressão de cisalhamento
empregada. De um modo geral está associada à consistência do material, sendo
este aspecto importante tanto no aspecto sensorial e de aplicação da formulação,
como também está relacionado com a capacidade do material em se manter estável
frente a variações ambientais, como a temperatura e o deslocamento (REBELLO,
2005). Na tabela 4 estão indicados os valores encontrados para as formulações com
relação aos valores de viscosidade absoluta.
De modo geral, a viscosidade aumentou após 90 dias de armazenamento, em
todos os ambientes, para todas as formulações, com exceção do creme IDB-FO
(Tabela 4).
A
formulação
Base
apresentou
um
aumento
na
viscosidade
de
aproximadamente 27% na temperatura ambiente, 11% na condição de resfriamento,
e permaneceu quase inalterado na estufa.
A inclusão de ácido acético na fase aquosa (IDB-ACT) conferiu à formulação
um valor inicial de viscosidade inferior (0,704 Pa.s) (semelhante ao creme IDB-QTS).
Passados 90 dias, notou-se incremento da viscosidade de aproximadamente 100%,
50% e 78,5% na temperatura ambiente, geladeira e estufa, respectivamente,
enquanto o creme IDB-QTS sofreu um aumento de viscosidade de 4,2%, 12,60% e
48
aproximadamente
20%
na
temperatura
ambiente,
geladeira
e
estufa,
respectivamente, mostrando-se o mais estável de todos, quanto a este parâmetro.
Tabela 4 - Valores da viscosidade das formulações no tempo inicial e final do estudo de
estabilidade acelerada
Viscosidade aparente (Pa.s) média (± desvio padrão)
Formulações
Base
IDB-ACT
IDB-FO
IDB-QTS
Ambiente
Geladeira
Estufa
T zero
T 90 dias
T 90 dias
T 90 dias
1,068
1,359
1,184
1,060
(*)
(± 3,39)
(± 3,68)
(± 1,2)
0,708
1,431
1,068
1,264
(± 1,08)
(± 2,18)
(± 208)
(± 5,50)
1,003
0,850
0,835
0, 835
(± 15,0)
(± 1,70)
(± 1,66)
(± 1,95)
0,690
0,719
0,777
0,828
(± 3,0)
(± 1,32)
(± 1,27)
(± 2,00)
* unicata
O creme IDB-FO apresentou valor inicial de 1,003 Pa.s, um pouco inferior à
formulação base. Após 90 dias em temperatura ambiente, este valor foi de 0,850
Pa.s, ou seja um decréscimo de aproximadamente 15%. Na geladeira e na estufa
sofreram também leve aumento, na faixa de 15%.
Observou-se que a inclusão de QTS foi capaz de alterar a propriedade
reológica, proporcionando uma formulação com viscosidade inicial menor, ou seja,
com maior fluidez e facilidade de espalhabilidade na aplicação e ao mesmo tempo,
mais estável após o armazenamento nas condições do teste.
Observou-se também que, no aspecto sensorial o creme IDB-QTS mostrou-se
menos oleoso. Este aspecto deve ter sido favorecido pela formação de um sistema
49
gel-creme, onde o polímero foi capaz de proporcionar estabilidade provavelmente
pela capacidade de um pequeno aumento da viscosidade da fase aquosa e também
por estabilização estérica das gotículas (JUMAA et al., 2002)
Na Tabela 5 estão relacionados os parâmetros reológicos avaliados nas
amostras no tempo inicial e tempo final, na temperatura ambiente. Todas as
amostras apresentaram fluxo caracterizado como pseudoplástico, uma vez que os
valores do índice de escoamento ou fluxo são menores do que 1 (MARTIN, 1993).
Entretanto, observou-se a existência do tempo de cedência (ponto de ruptura) em
todas as amostras, fato que confere a estas a capacidade de apresentar resistência
inicial ao escoamento. A amostra de creme base apresentou o maior valor inicial de
tempo de cedência (27,82 Pa) enquanto a formulação de IDB-ACT apresentou o
menor valor (11,73 Pa) e a formulação com QTS um valor intermediário (20,95 Pa).
Quanto à tixotropia, o maior aumento, após 90 dias foi apresentado pelo creme IDBQTS (cerca de 82%, contra cerca de 8-13% para as demais formulações) (Tabela 6).
Provavelmente isto de deve ao efeito do polímero QTS, o qual pode formar uma
rede organizada com o tempo de armazenamento.
Tabela 5 Parâmetros reológicos avaliados no tempo zero e após 90 dias em
Temperatura ambiente.
Formulações
Índice de fluxo
Ponto de
Tixotropia
ruptura (Pa)
(Pa.s)
T zero
T90
T0
T90
T0
T90
Creme base
-0,6015
-0,6106
27,82
15,43
1301
1462
IDB-FO
0,5254
0,5914
19,54
30,33
1648
1759
IDB-ACT
-0,5750
-0,5667
11,73
16,69
1427
1549
IDB- QTS
-0,6789
-0,6760
20,95
11,42
957,7
1750
Com relação ao perfil de escoamento, pode-se observar o efeito de histerese
em todos os reogramas (Figura 6), sendo este menos aparente na amostra de 90
dias do creme IDB-QTS. Este efeito confirma que as formulações apresentam
comportamento dependente do tempo e a área de histerese é uma indicação do
comportamento denominado de tixotrópico (OLIVEIRA, SOUZA, MONTEIRO, 2008)
Del Blanco e colaboradores (1999) estudaram a capacidade de quitosanas
com diferentes graus de desacetilação como agentes emulsificantes e como
50
doadores de viscosidade. Os autores avaliaram formulações com diferentes
concentrações e concluíram que formulações contendo 1% de QTS, utilizada como
único agente doador de consistência e emulsificante é capaz de proporcionar
emulsões estáveis, de gotículas esféricas, homogêneas e viscosas. Este
polieletrólito é capaz de estabilizar as gotículas em função da formação de uma
película viscoelástica, sendo capaz de manter as moléculas da fase interna com
menor mobilidade, e também, por ser um polímero carregado, pelo mecanismo
eletro-estérico (RODRÍGUEZ, ALBERTENGO, AGULLÓ, 2002).
Figura 6 - Perfil de escoamento das amostras A (creme base), B (IDB-FO), C (IDB-ACT.), D
(IDB-QTS durante o estudo de estabilidade acelerada. Temperatura ambiente.
T zero
T 90 dias
Viscosidade (Pa.s)
A
Viscosidade (Pa.s)
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
100
0
20
Taxa de cisalhamento (s-1)
Viscosidade aparente (Pa.s)
16
14
Viscosidade aparente (Pa.s)
B
12
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
40
60
80
100
80
100
Taxa de cisalhamento (s-1)
80
100
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
20
Taxa de cisalhamento (s-1)
40
60
Taxa de cisalhamento (s-1)
IDB Ac. Ac. T zero
ácido acético 90 dias
25
C
14
20
12
10
15
Viscosidade (Pa.s)
Viscosidade aparente (Pa.s)
16
8
6
4
2
0
10
5
0
0
20
40
60
80
0
100
20
40
60
80
100
QTS+
IDB
90 dias (s-1)
Taxa de
cisalhamento
25
14
20
12
Viscosidade (Pa.s)
D
Viscosidade aparente (Pa.s)
QTS
IDB T inicial
Taxa
de cisalhamento
(s -1)
15
10
8
Série1
10
5
0
Série1
6
4
2
0
0
20
40
60
Taxa de cisalhamento (s-1)
80
100
0
20
40
60
Taxa de cisalhamento (s- 1)
80
100
51
5.4 Determinação do teor de IDB nas formulações semissólidas por CLAE
Em testes preliminares observou-se que a espectrofotometria de absorção no
UV não é adequada para estas amostras devido à elevada absorbância da base no
comprimento de onda de escolha para análise da IDB. Foram testadas várias
metodologias de extração da IDB dos cremes, sem sucesso. Portanto, optou-se pelo
emprego de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para o doseamento do
fármaco nos cremes, uma vez que esta técnica permite a separação dos
componentes da formulação e análise quali e quantitativa do fármaco.
O método desenvolvido foi adaptado de Amorin e colaboradores (2009),
empregando-se a mesma coluna, fase móvel e comprimento de onda de detecção,
porém com um método de extração diferenciado daquele empregado pelos autores,
para a extração da IDB das nanopartículas de QTS secas por spray dryer. No
presente trabalho, procedeu-se a uma extração por ultrassom e calor, seguido de
centrifugação a frio, como descrito na metodologia. O emprego desta metodologia
necessita ainda ser validado, porém demonstrou ser seletivo para a IDB presente no
creme (Figura 7) com excelente resolução do fármaco (eluindo em 11 min) em
relação aos demais componentes da base que absorvem no mesmo comprimento
de onda e elevar mais precocemente.
10,745
Figura 7 - Cromatograma da amostra IDB QTS mostrando o pico de IDB (TR 11 min)
AU
0,030
0,020
0,010
0,000
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
Minutes
9,00
10,00
11,00
12,00
13,00
14,00
15,00
Empregando esta metodologia, verificou-se que o teor de IDB no creme IDBQTS foi de 109,4%, dentro da faixa de 90-110% previamente estabelecida. Esta
metodologia apresentou linearidade na faixa de 2-15 µg/mL, com coeficiente de
correlação (r) de 0,99975 (dados não mostrados). Este método necessita ser
validado quanto à sua precisão, exatidão e robustez.
52
53
6 CONCLUSÕES
Foram desenvolvidas formulações semissólidas de IDB incorporadas na fase
oleosa, de modo convencional e incorporada na fase aquosa, composta por uma
dispersão coloidal de QTS seguida de reticulação com TPP, esta última com aspecto
opalescente, característico de um nanosistema. Estas formulações foram aprovadas
em estudo de estabilidade preliminar, acelerado e de longa duração quanto às
características físicas e físico-químicas e foi desenvolvido um método por CLAE para
a sua quantificação, o qual necessita ser posteriormente validado segundo normas
oficiais. Tais formulações podem ser avaliadas em estudos posteriores de
citotoxicidade in vitro, a fim de analisar o papel da QTS na diminuição do potencial
irritante do fármaco, empregando uma metodologia de produção dos cremes, de fácil
escalonamento, apresentando uma potencial alternativa prática e econômica aos
sistemas lipossomados atualmente existentes, os quais apresentam ainda
problemas de irritação da formulação.
Os resultados apresentam potencial de inovação na área cosmética
representando uma alternativa prática e de fácil escalonamento, em relação aos
produtos baseados em lipossomas, atualmente comercializados, sob patente
(BIRGIT; EBERHARD; FALKO, 2002). O aproveitamento da QTS, um derivado da
quitina, que representa um sub-produto da atividade pesqueira, abundante nas
regiões litorâneas, oportuniza mais uma aplicação para este biopolímero,
estimulando o setor industrial de excipientes nacionais, na futura elaboração de um
produto cosmético estável, seguro e de fácil obtenção em aumento de escala.
54
55
REFERÊNCIAS
ABDEL BAKY N. A.; ZAIDI, Z. F.; FATANI, A. J.; SAYED-AHMED, M. M.; YAQUB, H.
Nitric oxide pros and cons: The role of L-arginine, a nitric oxide precursor, and
idebenone, a coenzyme-Q analogue in ameliorating cerebral hypoxia in rat. Brain
Res. Bull., v. 83, n. 1-2, p. 26-56, 2010.
AJUN, W.; YAN, S.; LI, G.; HUILI, L.; Preparation of aspirin and probucol in
combination loaded chitosan nanoparticles and in vitro release study. Carbohydr.
Polym., v. 2009, 75, n. 4, p. 566-574.
AMORIM, A. F. V. Preparação, caracterização e aplicação de derivados de
quitosana. 207p. Tese (Doutorado em Química) – Universidade Federal do Ceará,
Ceará, 2002.
AMORIM, C. M. Nanopartículas de Quitosana e N-Carboximetilquitosana na
Incorporação do Antioxidante Idebenona. Dissertação de mestrado. Programa de
Mestrado em C. Farmacêuticas – UNIVALI, Itajaí, 2009, 121 p.
AMORIM, C. M.; COUTO, A. G.; NETZ, D. J. A.; FREITAS, R. A.; BRESOLIN, T. M.
B. Stability-indicating LC-PDA Method for Determination of Idebenone in
Nanoparticles based on Chitosan and N-Carboxymethylchitosan. Chromatographia,
v. 70, p. 1411-1415, 2009.
AMORIM, C. M.; COUTO, A. G.; NETZ, D. J. A.; FREITAS, R. A.; BRESOLIN, T. M.
B. Antioxidant Idebenone-Loaded Nanoparticles Based on Chitosan and NCarboxymethylchitosan. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med., v. 1, p. 1-14, 2010.
ANCHISI, C.; MELONI, N. C.; MACCIONI, A. M. Chitosan beads loaded with
essential oils in cosmetic formulations. J. Cosmet. Sci., v. 57, p. 105-214, 2006.
BARBER, D. A.; HARRIS, S. R. Oxigen free radicals and antioxidants: a review. Am.
Pharm., v. NS34, n. 9, p. 26-35, 1994.
BARKWORTH, M.F., DYDE, C.J., JOHNSON, K.I., SCHENELLE, K. An early phase I
study to determine the tolerance, safety and pharmacokinetics of idebenone following
multiple oral doses. Arzneimittelforschung, v.35, p. 1704- 1707, 1984.
BLAAK, JUNGER; WOHLFART, RAINER; SCHURER, Y.NANNA., Treatment of
Aged Skin with a pH 4 Skin Product Normalizes Increased Skin Surface pH and
Improves Barrier Function: Care Results of a Pilot Study. J. Cosmet. Dermat. Sci.
Applic., v. 1. p. 50-58, 2011.
BODMER, M. VANKAN, P.; DREIER, M.; KUTZ, K. W.; DREWE, J.
Pharmacokinetics and metabolism of idebenone in healthy male subjects. Eur. J.
Clin. Pharmacol., v, 55, n. 5, p. 493-501, 2009.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de Estabilidade de
Produtos Cosméticos. 1. Ed., Brasília: ANVISA, 2004, 52 p.
56
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de
controle de qualidade de cosméticos, 2.a Ed., rev., Brasília: ANVISA, 2008, 120 p.
BUDAVARI, S. The index Merk, 20. ed: Estados Unidos: Merk, p.877, 1996.
BURATTO, N. A.; FONSECA-SANTOS, B.; NETZ, D. J. A.; FREITAS, R.A.;
BRESOLIN, T M.B. Otimização do processo de obtenção de nanopartículas de
quitosana contendo idebenona por co-secagem em spray dryer e préformulação de emulsões antioxidantes tópicas contendo idebenona
incorporada em nanopartículas de quitosana reticulada. IX Seminário de
Iniciação Científica da UNIVALI, Anais.Itajaí, 2010.
CLARK, G.L., SMITH, A.F. X-Ray Diffraction Studies of Chitin, Chitosan, and
Derivatives, J. Phys. Chem., v. 40, p.863-879, 1936.
CORRÊA, N. M.; CAMARGO JÚNIOR, F. B.; IGNÁCIO, R. F.; LEONARDI, G. R.
Avaliação do comportamento reológico de diferentes géis hidrofílicos. Rev. Bras.
Ciênc. Farm., v. 41, n.1, p. 73-78, 2005.
COUTO, D. S.; HONG, Z.; MANO, J. F. Development of bioactive and biodegradable
chitosan-based injectable systems containing bioactive glass nanoparticles. Acta
Biomater., v. 5, p.115–123, 2009.
COSTA-SILVA, H. S. R.; Dos SANTOS, K. S. C.; FERREIRA, E. I. Quitosana:
derivados hidrossolúveis, aplicações farmacêuticas e avanços. Quim. Nova, v. 29, n.
4, p. 776-785, 2006.
Di PROSPERO, N. A.; BAKER, A.; JEFFRIES, N., FISCHBECK, K. H. Neurorogical
effects of high-dose idebenone in patients with Friedreich´s ataxia: a randomized,
placebo-controlled trial. Lancet Neural, v. 6, p. 878-886, 2007.
FILLA, A.; RINALDI, C. Idebenone and Friedreich Ataxia. Encycloped. Movem.
Disordens, p. 63-66, 2010.
FLEMING, J. D.; WHITE, J. M.; WHITE, I. R. Allergic contact dermatitis to
hydroxydecyl ubiquinone: a newly described contact allergen in cosmetics. Contact
Dermat., v. 58, n.4, p. 245, 2008.
FONSECA-SANTOS, B. Avaliação do potencial de nanopartículas de quitosana
contendo idebenona como sistema de liberação modificada de fármacos.
arpesentação oral. IX Seminário de Iniciação Científica da UNIVALI, Anais. Itajaí,
2010.
FURUSAKI, E.; UENO, Y.; SAKAIRI, N.; NISHI, N.; TOKURA, S. Facile preparation
and inclusion ability of a chitosan derivative bearing carboxymethyl-β-cyclodextrin.
Carbohyd. Polym., v. 29, n. 1, p. 29–34, 1996.
GEROMEL, V.; DARIN, N.; CHRÉTIEN, D.; BÉNIT, P.; DELONLAY, P.; ROTIG, A.;
MUNNICH, A.; RUSTIN, P. Coenzyme Q10 and IDB in the therapy of respiratory
57
chain diseases: rationale and comparative benefits. Mol. Genet. Metab., p. 21-30,
2002.
GUARATINI, T.; MEDEIROS, M. H. G.; COLEPICOLO, P. Antioxidantes na
manutenção do equilíbrio redox cutâneo: uso e avaliação de sua eficácia. Quím.
Nova, v. 30, n. 1, jan./fev. 2007.
HAEFELI. R. H. Molecular Effects of idebenone. 2012. 178 f. Tese de DoutoradoPhilosophisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Basel, Basel, 2012.
JUMAA, M.; FURKERT, F. H.; MULLER, B. W. A new lipid emulsion formulation with
high antimicrobial efficacy using chitosan. Eur. J. Pharmac. Biopharm., v. 53, p.
115-123, 2002.
LARANJEIRA, M. C. M.; De FÁVARE, V. T. Quitosana: biopolímero funcional com
potencial industrial biomédico. Quim. Nova, n. 3, p. 672-678, 2009.
LUSTYIK, G.; O'LEARY, J. J. Effects of idebenone on mitogen-induced proliferation
of human lymphocytes. Arch. Gerontol. Geriatr., v. 11, n. 3, p. 307-317, 1990.
LOPES, C. C. Obtenção de um novo derivado de quitosana a partir da vanilina
como proposta de matriz para encapsulamento da L-dopa. 47p. Monografia
(Licenciatura em Química) – Universidade Estadual do Ceará, Ceará, 2007.
MARTIN A. N (1993). Physical Pharmacy. 4th ed. Philadelphia, Penn: Lea &
Febiger; pp. 268.
MARTIN, L. R.; GABRIEL, M. Z.; ELIAS, D. J. M.; HERVOY, I. K. Use of IDB for the
preparation of topically-applied depigmentation composition and
corresponding composition. Disponível em:
http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?IA=WO2005065670&wo=2005065670&DISPLA
Y=STATUS> Acesso em: mai 2007.
MASMOUDI, H.; Le DREAU, Y.; PICCERELLE, P.; KISTER, J. The evaluation of
cosmetic and pharmaceutical emulsions aging process using classical techniques
and a new method: FTIR. Int. J. Pharm., v. 289, p. 117-131, 2005.
MATSUMOTO, R.L.T. Atividade Antioxidante do chá verde (Ilex paraguariensis).
2008. 103f. Dissertação (Mestrado em Saúde Publica) – Nutrição, Universidade de
São Paulo Faculdade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Mc ALLER, M. A.; COLLINS, P. Allergic contact dermatitis to hydroxydecylibiquinone
(idebenone) following application of anti-ageing cosmetic cream. Contact Dermat., v.
59 (3), p. 178-179, 2008.
MC DANIEL , D.H.; NEUDECKER, B.A.; DINARDO,J.C.; LEWIS,J.A.; MAIBACG, H.
(B), Clinical efficacy assessment in photodamage skin of 0,5% and 1,0% idebenone
J. Cosmet. Dermatol., p. 167-173, jun, 2005.
58
MUZZARELLI, R. A. A. Chitosan-based dietary foods. Carbohydr. Polym., v.29,
p.309-316, 1996.
NAGAI Y, NARUMI S, NAGAOKA A, NAGAWA Y. In vivo electrochemical detection
of 5-hydroxyindoles in the dorsal hippocampus of anesthetized rats treated with
idebenone (CV-2619). Jpn. J. Pharmacol., v. 37(2), p.222-5, 1985.
NAKANO, A. K. Comparação de danos induzidos em cabelos de tres etnias por
diferentes tratamentos. 2006. 52 f. Dissertação (Mestrado) - Unicamp, Campinas,
SP, 2006.
OGAWA, K. Effect of heating an aqueous suspension of chitosan on the crystallinity
and polymorphs. Agric. Biol. Chem., v 55, n.9, p.2375-2379,1991.
OGAWA, K. at al. Dependence on the preparation procedure of the polymorphism
and crystallinity of chitosan membranes. Biosci. Biotech. Biochem., v.56. n.6, p
858-862, 1992.
OKAMOTO K.; WATANABE, M.; MORIMOTO, H.; IMADA, I. Synthesis, metabolism,
and in vitro biological activities of 6-(10-hydroxydecyl)-2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4benzoquinone (CV-2619)-related compounds. Chem. Pharm. Bull., v. 36, n.1,
p.178-89, 1988.
OLIVEIRA, M.; SOUZA, M. A.; MONTEIRO, T. Caracterização reológica de sorvetes;
Ciênc. Tecnol. Alim., v. 28, n.3, p. 592-598, 2008.
PIGNATELLO, R.; ITRAVAIA, V. D.; PUGLISSI, G. A Calorimetric evolution of the
interaction of amphiphilic pro drugs of IDB with a biomembrane model. J. Colloid
Interf. Sci., v. 267, p. 626-635, 2006.
POLYMAR. Aplicações da quitosana em cosméticos. Disponível em:
http://www.polymar.com.br/materiaprima/arquivos/quitosana_comestico.pdf>. Acesso
em: 07 mar. 2013.
RATNAM, V.; ANKOLA, D. D.; BHARDWAJ, V.; SAHANA, D. K.; KUMAR, M. N. V.
R. Role of antioxidants in prophylaxis and therapy: a pharmaceutical perspective. J.
Controled Release, v. 113, p.189-207, Jul. 2006.
RAVI KUMAR, M. N. V. A review of chitin and chitosan applications. Reactive
Functional Polym., v. 46, p. 1-27, 2000.
REBELLO, T. F. S. O. Operador e a Reologia. Cosmet. Toiletries (Brasil). p.32, v.
17, p. 32, 2005.
RINAUDO, M. Chitin and chitosan: properties and application. Prog. Polym. Sci.,
v.31, p.603-632, 2006.
59
RODRÍGUEZ, M. S.; ALBERTENGO, L. A.; E.AGULLÓ, E. Emulsificaton capacity of
chitosan. Carbohydr. Polym., v. 48, p. 271-276. 2002
SUN, Y. Free radicals, antioxidant enzymes, and carcinogenesis. Free Rad. Biol.
Med., v.8, n.6, p. 583-599, 1990.
THARANATHAN R.N.; KITTUR F.S. Chitin – The undisputed biomolecule of great
potential. Crit. Rev. Food Sci. Nutrit., v. 43, n. 1, p. 61–87, 2003.
THIELE, J.; BARLAND, C. O.; GHADIALLY, R.; ELIAS, P. M. Permeabilidade e
barreiras antioxidantes da epiderme senescente. In: GILCHREST, B. A.;
KRUTMANN, J. GILCHREST, B. A.; KRUTMANN, J. Envelhecimento cutâneo. Rio
de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 2007. p. 86-103.
VANNUCCHI, H.; MOREIRA, E.; DA CUNHA, D.F.; FRANCO, M.V.M.J.;
BERNARDES,; M.M.; JORDÃO JR, A.A. papel dos nutrientes na peroxidação lipídica
e no sistema de defesa antioxidante. Medicina, v. 31, p. 31-44, 1998.
VENKAT, R.; ANKOLA, D. ; BHARDWAJ, V.; SAHANA, D. K.; KUMAR, R. Role of
antioxidants in prophylaxis and therapy: A pharmaceutical perspective. J.
Controlled Release, v.113, n. 3, p. 189-207, 2006.
VITALI, L.; LARANJEIRA, M. C. M.; FÁVERE, V. T.; GONÇALVES, N. S. Quim.
Nova, v. 31, p. 1400, 2008.
WEMPE, M. F.; LIGHTNER, J. W.; ZOELLER, E. L.; RICE, P. J. Investigating
idebenone and linoleate metabolism: in vitro pig ear and mouse melanocyte studies.
J. Cosmet. Dermatol., v.8, n.1, p. 81-73, 2009.
WIELAND, E.; OELLRICH, M.; BRAUN, F.; SCHUTZ, E. C-fos and c-jun mRNA
Expression in pig liver model of ischemia/perfusion: Effect of extended cold storage
and antioxidante idebenone. Clin. Biochem., v. 33, p. 285-289, jun, 2000.
WIECHERS, J. W. Formulation at pH 4-5: how lower pH benefits the skin and
formulation. Cosmet. Toiletries, v.123, n.2, p.60-70, 2008.
ZHAI, H.; CORDOBA-DIAZ, M.; WA, C.; HUI, X.; MAIBACH, H.. Determination of the
antioxidative capacity of an antioxidant complex and idebenone: an in vitro rapid and
sensitive method. J. Cosmet. Dermatol., v. 7, n. 2, p. 96-100, 2008.