INSTRUÇÕES DE USO
Ensaio ThromboType®1
(HPA 1)
REF
THROMBOTYPE1
IVD
ThromboType1 Reagentes
E-Gel 48
INDICE
UTILIZAÇÃO ................................................................................................................................................................. 2
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO .......................................................................................................................................... 2
PRINCÍPIO ..................................................................................................................................................................... 2
REAGENTES ................................................................................................................................................................. 2
PRECAUÇÕES .............................................................................................................................................................. 2
ATENÇÃO ..................................................................................................................................................................... 3
COLHEITA DA AMOSTRA ............................................................................................................................................ 3
PROCEDIMENTO .......................................................................................................................................................... 3
Material fornecido ..................................................................................................................................................... 3
Material Adicional Necessário .................................................................................................................................. 4
Procedimento do Teste ............................................................................................................................................ 4
CONTROLO DE QUALIDADE ...................................................................................................................................... 8
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS ...................................................................................................................... 8
LIMITAÇÕES ................................................................................................................................................................. 8
CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE PERFORMANCE ......................................................................................... 9
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................................................. 9
Ensaio ThromboType1
1
303479.IFUPT REV D
UTILIZAÇÃO
A
O ensaio ThromboType1 é um ensaio para a determinação molecular de HPA-1 (Pl ) usando a amplificação por PCR de ADN
genómico humano.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
A
Os aloantigénios plaquetários humanos (HPAs), em particular o HPA-1 (PL ) estão associados a alterações de aminoácidos nas
glicoproteínas plaquetárias. Embora não alterem a função destas proteínas, as modificações alteram as conformações locais das
proteínas. Os determinantes antigénicos resultantes podem ser alvo de anticorpos originando respostas aloimunes e autoimunes
que causam doenças hemorrágicas que podem ser letais tais como a refratariedade à transfusão de plaquetas, , púrpura póstransfusicional e trombocitopénia neonatal aloimune. Até à data, os métodos serológicos de tipagem plaquetária HPA-1 têm sido
limitados pela ausência de aloantisoros bem caracterizados e pela escassez de plaquetas em doentes trombicitopénicos. Contudo,
com os avanços na imunogenética plaquetária é agora possível genotipar indivíduos para as diferenças nucleotídicas individuais que
caracterizam os alelos dos HPA-1.
O ensaio ThromboType1 é uma alternativa aos testes plaquetários serológicos e um auxiliar do matching HLA na selecção de
plaquetas compatíveis para receptores aloimunizados. O ensaio ThromboType1 contém os reagentes necessários para efectuar uma
amplificação por PCR específica de alelos em ADN genómico isolado e identificar o genótipo individual para HPA-1 utilizando um gel
de agarose como etapa final.
PRINCÍPIO
O ensaio utiliza uma reacção de PCR com primers específicos de alelo na qual o produto de amplificação apenas é produzido se o
alelo estiver presente. Estas amplificações determinam a presença de alelos para os polimorfismos plaquetários HPA-1: HPA-1ª
A1
A2
(PL ) ou HPA-1b (PL ) em amostras de ADN. Primeiro o ADN genómico é isolado da amostra usando um dos muitos kits
comerciais ou técnicas validadas que produzem ADN genómico com elevado grau de pureza. A amostra de ADN é amplificada
usando os tubos e reagentes de amplificação fornecidos. Após a amplificação, pipeta-se uma aliquota de cada reacção para um
poço de um gel de agarose. Uma electroforese de 15 – 20 minutos separa os produtos PCR por tamanho. O gel é então examinado
sob luz UV. A presença de uma banda PCR de tamanho correcto indica a presença do alelo na amostra de ADN. As bandas dos
primers de controlo interno demonstram que as condições de cada tubo PCR foram as correctas. O gel pode ser fotografado como
registo permanente do ensaio.
REAGENTES
Número máximo de testes por kit:

Ensaio ThromboType1:
24 testes por kit
Todos os reagentes devem ser armazenados como indicado nos respectivos rótulos.
REF
PT
1a/1b
404566
Tubos de Primers HPA: tubos PCR com primers específicos de alelo liofilizados na superfície interna.
Os tubos estão armazenados em sacos reseláveis. Prontos a usar.
1a: Tubos rosa com tampa rosa.
1b: Tubos amarelos com tampa amarela.
LAD
404542
ADN 100 bp: ADN de cadeia dupla em fragmentos, começando em 100 pares de bases (bp) e
aumentando em escalas de 100 bp para 1000 bp, em tampão Tris. Pronto a usar.
PR
404549
2X Reagente PCR: Tampão Tris-KCl contendo cloreto de magnésio, primers de oligonucleotídos,
deoxinucleotidos trifosfato livres (dNTPs), e outros componentes. Diluir antes de usar.
E-Gel
404607
E-Gel 48 Gel: gel de agarose (4%) usado para a separação dos produtos PCR. Pronto a usar.
PRECAUÇÕES






Não usar reagentes turvos ou contaminados.
Não utilizar os reagentes para além do seu prazo de validade.
Não usar géis com aspecto partido ou seco
Os tubos de PCR e reagentes contidos no kit não devem ser usados com qualquer outro tipo de teste.
A substituição dos componentes por outros que não sejam fornecidos no kit pode conduzir a resultados inconsistentes ou
errados.
Devido às diferenças entre termocicladores pode ser necessário o laboratório estabelecer parâmetros ajustáveis ao programa de
ciclos de temperatura para obter resultados válidos.
Ensaio ThromboType1
2
303479.IFUPT REV D


Não isolar amostras de ADN a partir de sangue heparinizado. A heparina pode interferir com a amplificação PCR.
A reacção de PCR é patenteada pela Roche Molecular Systems e F. Hoffman LaRoche Ltd. Para informação sobre licenças
para efectuar uma amplificação por PCR contactar (nos EUA) o Director de licenciamento na Roche Molecular Systems, Inc.,
1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, ou (fora dos EUA) o gestor do licenciamento do PCR, F. Hoffmann-La Roche
Ltd, Grenzacherstr.124, CH-4070 Basel, Suiça.

Boas Préticas Laboratoriais para a Amplificação por PCR
A forte capacidade da reacção de PCR na amplificação de sequências de ADN torna-a especialmente sensível a contaminações
mesmo por pequenas quantidades de ADN externo. Assim, devem ser feitos todos os esforços para evitar a introdução prévia
de material amplificado nas amostras teste. Estas contaminações cruzadas podem ser reduzidas separando fisicamente as
áreas de pré-amplificação das áreas de pós-amplificação, de preferência em salas separadas. Pode ser usada uma câmara
biológica na preparação do ADN para minimizar a formação de aerossóis potencialmente contaminantes. Uma câmara isolada
na área de pré-amplificação pode oferecer um melhor controlo no espaço de preparação das reacções de PCR-. Para a pósamplificação, executar todo o processo sobre plástico com papel absorvente para evitar derrames. Este deve ser eliminado
como lixo perigoso. Cada área de trabalho deve ter o seu conjunto de pipetadores. A partilha de qualquer equipamento entre as
duas áreas deve ser evitada e qualquer equipamento da área “pós” deve ser limpo com agente inactivador de ADN (por
exemplo, lixívia a 10% fresca) antes de ser transferido para a área “pré”. Usar pontas novas em cada pipetagem. Usar vestuário
diferente nas duas áreas e mudar frequentemente de luvas. Finalmente, ao efectuar o ensaio colocar o controlo do kit e o
controlo ambiental (controlo negativo-água em vez de ADN genómico) depois das amostras.
ATENÇÃO



Ao terminar o ensaio, eliminar o material como lixo perigoso e descontaminar o material não descartável com lixívia 10% ou outro
agente inactivador de ADN.
A fonte de UV usada para visualizar as bandas do produto PCR emite uma forte luz ultravioleta que pode danificar os olhos e pele.
Usar sempre roupas de protecção e óculos bloqueadores de UV ou máscara ao operar com fonte de UV.
O E-Gels contém uma pequena quantidade de brometo de etídeo como marcador de ADN. O brometo de etídeo é um conhecido
mutagénio humano. Não abrir as cassetes de gel. Deitar fora todos os componentes, quando usados, de acordo com os
regulamentos locais.
COLHEITA DA AMOSTRA
Isolar o ADN com um método validado ou com um kit comercial com esse fim.
Resuspender o ADN em água estéril ou Tris 10 mM, pH 8.0 – 9.0. As amostras não devem ser rehidratadas em soluções com mais
de 0.5 EDTA mM ou outros agentes que possam interferir com a PCR.
o
As amostras de ADN podem ser processadas imediatamente após isolamento ou armazenadas num congelador a menos de –20 C
por um longo período (um ano ou mais) sem afectar os resultados. O ensaio ThromboType para amostras congeladas (-20°C)
diluídas em tampão Tris/EDTA (10 mM Tris, pH 8.0 – 9.0/0.5 mM EDTA) e armazenadas em tubos de rosca com tampa anelar
mostraram uma concordância de 100% com resultados de sequenciação de ADN com essas mesmas amostras. Mais informação
sobre a estabilidade das amostras quando congeladas está disponibilizada pelos dois produtores de kits de isolamento de ADN,
(sítios da Gentra Systems e QIAgen ).
As amostras de ADN devem estar entre 10 –100 ng/μL, com uma razão de 260 nm/280 nm entre 1.60 e 1.90.
A presença de excesso de proteína contaminante ou ARN, heparina, EDTA ou outros agentes pode interferir com a amplificação por
PCR do ADN purificado.
PROCEDIMENTO
NOTA: Os frascos podem conter mais reagente do que o descrito nas etiquetas. Assegure-se da correcta medição dos reagentes
através da utilização de um dispositivo apropriado, quando fizer as diluições.
Material fornecido
Armazenamento a 2-8°C
1.
2.
3.
Três sacos resseláveis, cada um contendo
A1

8 x HPA-1a (PL ) Tubos de Amplificação (rosa com tampa rosa)
A2

8 x HPA-1b (PL ) Tubos de Amplificação (amarelo com tampa amarela)
2 x 450 L 2X Reagente PCR
1 x 200 L 100 bp DNA Ladder
Ensaio ThromboType1
3
303479.IFUPT REV D
FS
4.
5.
NCT
3 x seladores
Tubos Controlo Negativo: um saco reselável com 1x8 tubos PCR vazios para efectuar as amplificações do
controlo negativo.
Armazenamento a 15-25°C
1.
3 x 4% E-Gel 48
Material Adicional Necessário
Para a reacção de PCR

Taq Polimerase, nativa ou recombinante, 5U/μL. Não usar outras polimerases termoestáveis ou preparações de taq polimerase
“hot start”.

Termociclador programável com bloco para tubos PCR de 0.2 mL.

Protectores de silicone

Micropipetas ajustáveis a volumes 1 – 1,000 µL estéreis e pontas descartáveis.

Água livre de ADN e ADN-ase

Banho de gelo ou blocos frios para tubos de 0.6 mL ou 1.5 mL e tubos PCR de 0.2 mL PCR

Suporte de tubos PCR (0.2 mL)

Vórtex

Tubos de microcentrifugação cónicos de polipropileno com fecho de pressão (0.5 - 1.7 mL), livres de ADN e ADN-ase

Lixívia a 10% ou outro agente inactivador de ADN
Para a Electroforese e Análise

E-Base Motherbase

Suporte de tubos PCR (0.2 mL)

Micropipetas ajustáveis a volumes 1 – 20 µL estéreis e pontas descartáveis.

Papel absorvente

Fonte de UV

Lixívia a 10% ou outro agente inactivador de ADN

Água desionizada ou destilada

Sistema de documentação de gel
Opcional

Micropipetas ajustáveis a volumes 5 µL e 10 µL estéreis e pontas descartáveis.

Pipeta electrónica ou pipeta com capacidade de dispensar 20-25 µL e pontas estéreis
Procedimento do Teste
Início
1.
Isolar o ADN genómico de todas as amostras a serem testadas. Cada amostra deve ter uma concentração de ADN na gama dos
10 – 100 ng/µL e uma razão A260 nm/A280 nm entre1.60 e 1.90.
2.
Programar um termociclador com o programa de PCR do ensaio ThromboType1. O programa é o seguinte:
94 C
o
30 segundos
94 C
o
57 C
o
72 C
o
1 segundo
30 segundos
10 segundos
6 ciclos
94 C
o
65 C
o
72 C
o
1 segundo
30 segundos
10 segundos
27 ciclos
o
12 segundos
72 C
o
4C
NOTA:
Manter
Este programa de ciclos foi desenvolvido no ABI PE9700 a correr em Max mode. Devido às diferenças entre
termocicladores cada instrumento tem de ser validado amplificando amostras conhecidas para estabelecer a
performance. Se as bandas forem fracas aumentar o tempo dos tempos de annealing inicialmente em 3 seconds, e em
seguida de de 1 seg , até que o produto seja aceitável. Se aparecerem bandas arrastadas, fracas, ou bandas de primer
diméricas, reduzir ambos os tempos de annealing inicialmente em 3 segundos, e em seguida de 1 segundo até que estas
deixem de aparecer.
Ensaio ThromboType1
4
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PCR
3.
Ligar o termociclador previamente para que as temperaturas requeridas sejam atingidas. Verificar o programa de ciclos para
assegurar que não foi alterado.
4.
Manter a Taq polimerase e o 2X Reagente de PCR em gelo ou em bloco frio.
5.
Preparar as superfícies de trabalho antes de usar limpando-as com lixívia 10% ou outro agente inactivador de ADN.
6.
Determinar o número de testes a executar. O total deve incluir todas as amostras desconhecidas a serem testadas mais um
A1
controlo negativo (água). Cada amostra necessita um (1) de cada tipo de tubo de Amplificação – um 1a (PL , rosa com tampa
A2
rosa) e um 1b (PL , amarelo com tampa amarela) - um total de dois (2) por amostra. O controlo negativo requer pelo menos um
tubo controlo negativo.
7.
Estabelecer um mapa com a sequência dos tudos de PCR mostrando as posições de cada tubo para cada amostra.
8.
Remover os tubos de Amplificação do kit, separar o número necessário para o ensaio, e colocá-los em gelo ou bloco frio de para
tubos de PCR (0.2 mL) de acordo com o esquema mostrado no mapa anterior. Colocar os restantes tubos no(s) saco(s)
reselável e armazenar a 2 - 8°C.
9.
Remover os Tubos Controlo Negativo do kit, e separar pelo menos um tubo para um ensaio. Colocar o(s) tubos(s) no bloco frio.
o
Colocar os restantes tubos no saco reselável e armazenar a 2 - 8 C.
NOTE: Se for inserido mais de um controlo negativo para um ensaio, os volumes indicados em baixo para a preparação do PCR
têm de se reajustados para o(s) tubo(s) extra.
10. Um método é descrito em baixo. Para cada amostra é preparado um master mix individual que inclui todos os componentes
necessários; uma aliquota de 25 μL de cada mix é então pipetada para um tubo de primer 1a e um tubo de primer 1b. É também
preparado um mater mix separado para o controlo negativo e 25 µL deste mix são pipetados para o(s) tubo(s) PCR de controlo
negativo.
Pode ser desenvolvido um protocolo alternativo pelo utilizador desde que este resulte num mix de amplificação que forneça por
tubo de PCR:




12.5 μL 2X Reagente de PCR
Taq Polimerase 0.5 Unidades
40 – 400 ng de ADN genómico humano (80 – 200 ng recomendados)
Água livre de ADN a um volume final de 25 µL
Tal protocolo tem de ser validado pelo utilizador com amostras positivas e negativas conhecidas.
11. Preparar um master mix para cada amostra.
a)
b)
Marcar um tubo de microcentrifuga para cada amostra de ADN, um para o controlo negativo, e um para preparar a diluição
da Taq.
Preparar a diluição da Taq polimerase a 0.5 Units/μL em água livre de ADN. Cada master mix de amostra necessita de
2.4 μL e o controlo negativo necessita de 1.6 μL. Usar a tabela em baixo como referência.
Ensaio ThromboType1
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Diluição da Taq polimerase
A
B
# Amostras
Taq Diluída
2
1.0 L Taq
9.0 L água
10 L
3
1.2 L Taq
10.8 L água
12 L
4
1.6 L Taq
14.4 L água
16 L
5
1.8 L Taq
16.2 L água
18 L
6
2.0 L Taq
18.0 L água
20 L
7
2.4 L Taq
21.6 L água
24 L
8
2.6 L Taq
23.4 L água
26 L
Para mais de 8 amostras usamse múltiplos ou combinações dos
volumes acima indicados.
c)
Preparar os Master Mixes como descrito na Tabela 2.
Master Mix para amostra individual de ADN
Volume de Água
2X Reagente
PCR
Taq Polimerase
(0.5 U/μL)
AmostraADN
Volume Total de
Master Mix
18 μL
30 μL
2.4 μL
9.6 μL
60 μL
d)
e)
f)
Preparar um master mix para controlo negativo combinando 20 μL 2X Reagente PCR + 1.6 μL Taq polimerase (0.5 U/μL) +
18.4 μL água livre de ADN.
Colocar a tampa em todos os master mixes, e misturar em vórtex durante 3 – 5 segundos.
Pipetar 25 μL de cada master mix de amostra para um tubo de primer 1a e para um tubo de primer 1b.
Pipetar 25 μL do master mix de controlo negativo para o(s) tubos(s) PCR de controlo negativo.
12. Cobrir todos os tubos com um selador adequado aos tubos de PCR.
13. Examinar os tubos de PCR após selados. Remover quaisquer bolhas no fundo dos tubos de PCR. Quaisquer gotas
remanescentes devem ser diluídas no volume de reacção o que pode ser feito batendo com os tubos na bancada ou com uma
breve centrifugação numa centrifuga de placas.
NOTA: É fundamental que não haja bolhas na base dos tubos de PCR e que não existam quaisquer gotículas nas paredes dos
tubos de PCR. A existência destas pode resultar na perda de amplificação específica de alelo.
o
14. Iniciar o programa do ensaio ThromboType1 no termociclador. Assim que o bloco atingir os 70 C, parar o programa. Transferir
os tubos do gelo ou bloco frio para o termociclador e colocar uma ou mais tiras de tubos de PCR vazios no bloco oposto aos
tubos do ensaio.
15. Colocar um amortecedor de silicone sobre o selador para cobrir cada tubo; assegurar o alinhamento correcto do amortecedor e
a sua manutenção com o termociclador aquecido.
Ensaio ThromboType1
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NOTA: É importante manter a pressão no selador dos tubos de PCR para evitar fugas durante os passos de altas temperaturas do
programa. Para o conseguir, devem ser colocados tubos de PCR vazios extra no bloco à volta dos tubos do ensaio de
forma a que a tampa aquecida esteja suportada em todas as extremidades quando está fechada. O amortecedor de silicone
ajuda a manter a pressão adequada e compensa pequenas variações no peso dos tubos de PCR.
16. Resumir o programa de ciclos. O programa leva ~ 55 minutos.
o
17. Quando o termociclador atingir o ultimo passo do programa (a manutenção a 4 C), remover os tubos do termociclador e
transferi-los para um suporte de tubos de PCR. Se a electroforese não for feita imediatamente, armazenar os tubos no frigorífico
o
o
(2 a 8 C) até 3 dias ou no congelador a menos de –20 C até 7 dias.
Detecção
NOTA: Os passos de detecção têm de ser efectuados numa área separada da utilizada como área de pré-PCR. Os dispositivos
não devem ser partilhados entre estas áreas para evitar contaminações.
18. Preparar a área de trabalho com papel absorvente e instalar o E-Base Motherbase, água desionizada, 100 bp ADN ladder ou
marcador de peso molecular, e pipetadores neste local.
19. Se os tubos de PCR estiverem congelados, remover do congelador e deixar descongelar antes de usar.
NOTA: O procedimento a seguir descreve a detecção num único E-Gel que pode comportar até 3 amostras. Se tiverem sido
amplificadas mais de 3 amostras, os produtos terão de ser corridos em mais geis para a detecção.
20. Remover o E-Gel da sua embalagem e remover os pentes. Se necessário, limpar a placa superior com um pano do laboratório
húmido. Marcar com um marcador.
21. Transferir o gel para baixo dos dois eléctrodos na E-Base Motherbase e instalar o gel de maneira que os seus eléctrodos façam
contacto com os eléctrodos do dispositivo.
22. Pipetar 10 L de água desionizada para cada poço necessário para cada produto de PCR (2 poços para cada amostra mais um
para cada controlo negativo. Não adicionar água aos 4 poços exteriores (marcados M) para o 100 bp ADN ladder.
NOTE: Pode ser usado um poço exterior (marcado com M) para controlo negativo se todos os outros poços forem usados para
amostras.
23. Para cada amostra, furar o selador de cada tubo de PCR com a ponta da pipeta nova. Pipetar 5 μL de cada produto no poço
apropriado do gel. Não furar o selador de um tubo de PCR até o produto estar pronto a ser transferidos para um gel.
NOTA: Uma pipeta multi-canal de pequeno volume torna mais rápido o carregamento das amostras e diminui a possibilidade de
erro no carregamento.
NOTA: Para cada amostra, pipetar as os produtos de amplificação a e b para cada polimorfismo em poços adjacentes do gel ajuda
na interpretação dos resultados.
24. Furar o selador do controlo negativo e pipetar 5 μL do produto para o respectivo poço.
25. Pipetar 15 L de 100 bp ADN em cada um dos quatro poços exteriores (marcados M) reservados para o controlo negativo.
NOTA: Todas as amostras corridas em gel devem ser sempre delimitadas por linhas contendo a marcador de peso molecular de
ADN de 100 bp de forma a que as bandas do produto possam ser determinadas com rigor.
26. Ligar a Motherbase. Aparecerá uma luz vermelha e o contador iluminar-se-á. Usar o botão de energia (direita) para ligar o modo
EG (em vez do modo EP).
27. Usar o botão da esquerda para selecionar o cronómetro para 17 minutos.
NOTA: Pode-se obter uma separação adequada de bandas fazendo correr o gel durante 15 minutos. Contudo, a separação das
bandas é melhorada se for de 17-20 minutos. Não correr por mais de 20 minutos.
28. Pressionar o botão de energia (direita) para iniciar a electroforese. A luz vermelha passará a verde durante o processo.
29. No final da electroforese a luz verde passará a uma luz vermelha intermitente e soará um alarme. Pressionar o botão de energia
para parar o processo. A luz vermelha intermitente ficará fixa. Desligar o dispositivo e remover o gel da Motherbase.
30. Levar o gel para a fonte UV para observar as bandas produto. O gel deve ser visto e registado em vinte minutos. Se se desejar
um registo do ensaio deve ser tirada uma fotografia do gel usando um sistema de documentação de géis.
Ensaio ThromboType1
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303479.IFUPT REV D
CONTROLO DE QUALIDADE
O controlo interno produz um produto de 85 bp se a reacção PCR for carregada com ADN humano amplificável de 40 ng ou mais .
Esta banda deve aparecer em todas as linhas para qualquer amplificação excepto o controlo negativo. Contudo, a amplificação
específica de alelo compete com o controlo PCR interno; o produto do controlo interno pode ser ténue ou ausente em todas as
linhas positivas para um alelo. Assim, a ausência da banda de controlo interno de uma linha na qual aparece uma banda específica
de alelo não é motivo de preocupação. Contudo, se se tiver colocado ADN num tubo PCR e não se observarem bandas controlo ou
específicas de alelo na sua linha, há forte possibilidade de falha na amplificação. Tais falhas podem ser resultado da deterioração de
um reagente, de um termociclador incorrectamente programado, amostra de ADN fracamente purificada, quantidade insuficiente de
amostra de ADN na reacção de PCR, ou falha ao colocar um reagente durante a preparação do PCR. Para estas amplificações os
resultados são inválidos. Estas amostras devem ser testadas novamente, de preferência com ADN fresco.
O marcador de peso molecular 100 bp ADN Ladder é um indicador de tamanho objectivo para as bandas de produtos PCR; os poços
com o 100 bp ADN Ladder devem ser incluídos em todas as electroforeses. As bandas do 100 bp ADN Ladder devem aparecer
nítidas e bem separadas. Qualquer ensaio em que estas bandas apareçam esbatidas ou comprimidas umas nas outras deve ser
repetido. Os resultados não devem ser reportados.
As bandas de dímeros de primers podem-se formar com certas amostra de ADN e termocicladores. Estas bandas de menos de 85 bp
não afectam a tipagem com o ensaio ThromboType1. Se as bandas dos dímeros de primers forem uma preocupação, os
ajustamentos ao programa de ciclos descrito na secção de programação do termociclador podem minimizar o seu aparecimento.
A linha controlo negativo (água) não deve ter nenhuma banda de produto PCR, específica de alelo ou controlo interno. A presença
de quaisquer linhas de produtos PCR específicos nas linhas controlo negativo é indicativa de um erro técnico ou reagente
contaminado. Os resultados são inválidos e o ensaio deve ser repetido. Os resultados não devem ser reportados.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
A presença de uma banda específica de tamanho correcto numa linha é um resultado positivo para esse alelo. Os tamanhos dos
produtos de PCR para o ensaio ThromboType1 estão indicados em baixo. A ausência de uma banda de produto específico de alelo
de uma linha indica a ausência desse alelo da amostra (resultado negativo). A banda controlo interno está presente como indicação
de uma amplificação bem sucedida. Um produto PCR sem a banda controlo e sem a banda específica de alelo indica falha na
amplificação. A amostra tem de ser testada novamente para esse alelo.
Produto
HPA-1
Controlo
Tamanho do Produto PCR (bp)
124
85
Notar que para qualquer amostra as amplificações 1a e 1b produzem relativamente a mesma quantidade de produto PCR se o alelo
estiver presente. As amostras heterozigóticas devem produzir bandas de produto 1a e 1b de intensidade semelhante. Uma amostra
na qual uma banda específica de alelo é fraca comparada com a outra banda específica de alelo para um sistema provavelmente
não é heterozigótica. A banda fraca é provavelmente devida a um erro técnico ou “read-through”. “Read-through” é uma amplificação
de baixo nível pelos primers específicos de alelo de uma amostra de ADN sem esse alelo. Tais amostras devem ser novamente
ensaiadas usando uma quantidade menor de ADN. Após o reensaio o aparecimento, no tubo em questão, de uma banda de
intensidade semelhante à do alelo alternado indica um resultado positivo para a reacção em questão e a amostra deve ser tipada
como positiva para o alelo, um verdadeiro heterozigótico. Este resultado sugere um erro técnico como causa do resultado
originalmente suspeito. O aparecimento de uma banda fraca após o reensaio indica um verdadeiro “read-through” ou falso positivo; a
amostra deve ser classificada como negativa para aquela alelo.
LIMITAÇÕES






O ensaio ThromboType1 contém material para a amplificação de sequências em ADN genómico pela reacção de amplificação
em cadeia pela polimerase e a subsequente detecção qualitativa de sequências de HPA-1 específicas de alelo por electroforese
em gel de agarose. Variações desconhecidas nas sequências génicas relevantes podem afectar negativamente os resultados.
Para assegurar os melhores resultados com o ensaio ThromboType 1, as amostras de ADN devem ter uma concentração entre
10 ng/L e 100 ng/µL com uma razão de A260/A280 de 1.60 – 1.90. Uma fraca amplificação pode ser resultado da adição de
uma quantidade insuficiente de ADN à reacção de PCR, ou de uma amostra de ADN fracamente purificada.
Os resultados falso negativos podem ser consequência de amostras manuseadas inadequadamente, erros de procedimento,
inibidores da amplificação, ou ADN genómico não adequado como amostra ou de uma incorrecta mistura do ADN genómico no
master mix, especialmente ao adicionar o ADN directamente aos tubos PCR. Neste caso, as bandas controlo podem ou não
encontrar-se ainda presentes e a amplificação específica de alelo pode falhar.
A contaminação na transferência de ácidos nucleicos, excesso de AND genómico nas amplificações, ou a não utilização das
temperaturas indicadas pode originar resultados falso positivos.
Este ensaio foi desenvolvido com ADN humano adulto. Não foi validado para amostras pré-natais.
Este ensaio demonstrou uma correcta performance quando executado em termocicladores ABI PE9700, 9600, e 2720 e o MJ
Research (agora BioRad) ou Mini-termociclador com tampa aquecida e o Mastercycler EP da Eppendorf. Para utilização do
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ensaio noutros termocicladores pode ser necessário ajustar alguns dos parâmetros de ciclos. Os termocicladores devem ser
calibrados e mantidos de acordo com as instruções do fabricante.
CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE PERFORMANCE
Rigor
O rigor do ensaio ThromboType1 foi estabelecido por três estudos comparativos diferentes:
Comparação do ensaio ThromboType1 e PAT
A comparação de métodos foi efectuada entre o ensaio ThromboType1 e o ensaio PAT. Resumidamente, o genótipo HPA 1a/b foi
determinado para 15 amostras usando o ensaio ThromboType1 e o ensaio PAT (n = 30 resultados). A distribuição dos alelos para
as amostras foi a seguinte: oito HPA – 1 a/a; três HPA – 1 b/b; e quatro HPA – 1 a/b. Os resultados mostraram concordância de
100% entre os dois métodos.
Comparação do ensaio ThromboType1 e Sequenciação de ADN
A sequenciação de ADN foi efectuada para determinar o genótipo HPA – 1a/b de 46 amostras com a seguinte distribuição alélica: 33
HPA – 1a/a; quatro HPA – 1 b/b; e nove HPA – 1 a/b. As amostras também foram testadas no ensaio ThromboType 1. Os resultados
do ensaio ThromboType1 mostraram concordância de 100% com os resultados obtidos por sequenciação de ADN.
Comparação do ensaio ThromboType1 e um ensaio de tipagem molecular de ADN
Para o estudo foram usadas trinta e seis amostras com a seguinte distribuição de alelos: vinte e duas HPA – 1 a/a; sete HPA – 1 b/b;
e sete HPA – 1 a/b. As amostras foram testadas com o ensaio ThromboType1 e por um outro método de tipagem molecular por PCR
numa avaliação externa independente (n = 72). A análise dos resultados mostrou concordância entre o método comparativo e o
ensaio ThromboType1.
Precisão do Ensaio
Foi determinada a reprodutibilidade do ensaio ThromboType1. Foram testadas três amostras em duplicado representando uma gama
de alelos com o ensaio ThromboType1 em nove dias separados. Os resultados mostraram uma concordância de100% entre os
duplicados e os resultados diários.
REFERÊNCIAS
1.
2.
3.
4.
A1
a
Williamson LM, et. al.; “The Natural History of Fetomaternal Alloimmunization to the Platelet-specific Antigen HPA-1a (PL , Zw )
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thrombocytopenia”; Transfusion 2004, vol 44: 1220 – 1225
Newman PJ, et. al.; J Clin Invest 1989; vol. 83(5):1778-81
Skogen B, et. al.; Transfusion 1994; vol. 34:955-960
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