Aula de enzimologia
Tema
Reatores enzimáticos
Prof. Adriane M. F. Milagres
Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
Tópicos abordados:
1. Definição
2. Classificação geral dos biorreatores
3. Problemas Operacionais
4. Equaçoes de desempenho de
Reatores enzimáticos
5. Reatores enzimáticos para a hidrólise
de celulose
6. Influencia da inibição pelo produto na
catálise enzimática
Reatores enzimáticos
• O reator enzimático é um recipiente onde
se procede uma reação catalisada por
uma enzima.
• Enzimas solúveis
• Enzimas imobilizadas
Tipos de reatores
1. Contínuo, descontínuos e descontínuo alimentado
2. Enzimas livres:
agitados mecanicamente (STR)
agitados pneumaticamente (coluna de bolhas e air lift)
3. Enzimas imobilizadas em suporte (leito fixo ou leito fluidizado)
Reator de membrana
Reator de Membrana Inerte (IMRCF)
Vantagens:
•
promovem a produção e a separação de produtos
de modo praticamente concomitante.
•
A extração de produtos do meio, que podem
apresentar efeitos tóxicos ou inibitórios às enzimas,
é também uma vantagem importante dos
biorreatores com membranas.
•
As membranas de nanofiltração permitem a
retenção de cofatores enzimáticos, ampliando o
leque de aplicação desses reatores para as
aplicações que envolvem diversas enzimas
intracelulares, que requerem cofatores
Desvantagens
- Decréscimo da atividade com o tempo
- Heterogeneidade das condições de reação
- Obstrução da membrana
Reator de Membrana
Reator de Membrana Catalítica (CMR)
Operação de reatores enzimáticos
Equações de desempenho de Reatores
enzimáticos
Equação geral de balanço de massa:
o que entra – o que sai – convertido = o que cumula
- dS = v
dt
• Reator descontínuo
Reator Contínuo
Equação geral de balanço de massa:
o que entra – o que sai – consumido = o que cumula
A vazão de alimentação (Q), volume total da mistura (Vr),
volume total de liquido é uma função de vazios (V’r = Vr).
QSo – QS = v V’r
(So – S) = v V’r
Q
XSo = v V’r
Q
X = Vr
v
QSo
X = So – S
So
Reator contínuo
Reator contínuo de fluxo pistonado
 V’r =   Vr
SoQ – (SoQ + QdS) = v V’r
-dS = v V’r
Q
-dS = v
dt
V’r = t
Q
XSo – ln (1-x) = Vmax VR
Km
Km Q
XSo – ln (1-x) = Kcat.E . t
Km
Km
Outros fatores que afetam a
performance do reator
Uso de biorreatores enzimáticos
Exemplo 1: Reatores enzimáticos para minimizar a inibição
enzimática durante a hidrólise de lignocelulósicos
Enzimologia da degradação da celulose
Influência da inibição na catálise enzimática
Celobiose é um potente inibidor das celulases, mas a inibição por
este composto pode ser aliviada ajustando a dose de β-glicosidase
• Se o inibidor é o produto (P), este aumenta com o transcorrer da reação.
• A inibição pelo produto é negligenciada no início da reação, mas o produto
glicose causa uma redução da velocidade da reação em hidrolisados
comerciais (100 g/l)
Remoção de glicose do Reator em batelada: modos de condução
1. Remoção de parte do líquido após 24h de reação e adição de tampão novo
2. Remoção de parte do líquido após 24h de reação e adição de enzimas e
tampão novos
3. Remoção de glicose por diálise durante 24-48 h
Remoção de glicose
65%
94%
59%
Comparação do tamanho do reator para conversão de
lignocelulósicos (30%)
Parâmetros cinéticos da enzima: (kcat=12 h−1, KM=0,9 mM, KIG=6,4 mM; Vmax
= 0,23 g/l.h) - Inibição não competitiva
So = 10 g/l
Em um reator CSTR: substituindo os valores na equação abaixo, encontramos
um tempo de residência (Vr/Q) de 13,7 h. Dependendo da vazão escolhida
(por exemplo 1L/h), o volume do reator deverá ser de 13,7 litros.
Em um reator de fluxo pistonado: substituindo os valores na equação abaixo,
encontramos um tempo de residência (Vr/Q) de 11,6 h. Dependendo da vazão
escolhida (por exemplo 1L/h), o volume do reator deverá ser de 11,6 litros.
Exemplo 2: Uso de reator em batelada e contínuo para
a hidrólise da lactose por β-galactosidase imobilizada
•
Enzima: Validaset derivada de Kluyveromyces lactis, com 50,000 ONPGU/g
(o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside Units/g) e 30 g/l de proteína
•
Suporte: 4 gramas de Amberlite IRC-50 (carga negativa) foi pesado em um
tubo. O suporte foi lavado e tratado com 10 ml de polyetilenimina (carga
positiva) (100 mg/ml) sob agitação por 2 h. É feita a adição de 10 ml de
2.5% glutaraldeído em pH 7,0 (ligante para reagir com os amino grupos da
proteína).
•
Imobilização: 4 ml de lactase e 6 ml de tampão fosfato 50 mM (pH 7.0)
foram adicionados ao suporte.
Hidrólise da lactose em reator de batelada
Enzima solúvel
Hidrólise da lactose em reator contínuo
xSo + Km x/(1-x) = Vmax . t
Exemplo 3: Uso de reator plug-flow para a hidrólise da
lactose por β-galactosidase imobilizada
O que se pensa quando se usa um biorreator?
Como varia a vazão de alimentação?
F varia no decorrer do processo devido as próprias variações na atividade enzimática.
È muito comum que a vazão de alimentação tenha um decréscimo exponencial.
F1- vazao inicial; t* é o tempo de meia-vida da enzima
Equação para determinação da produção da enzima
quando o decréscimo da vazão for exponencial
Fixando a Produção total (Pt) pode-se determinar o tempo de produção (tp)
Questao de prova – entrega até o dia 9/09.
Assumindo que a enzima imobilizada é apropriada para uma aplicação
industrial e que o processo continuo possa ser escalonado, quantos
litros de substrato pode ser tratado em uma coluna de 1000 litros? Qual
deveria ser a dimensão da coluna? A vazão de alimentação? A
quantidade de enzima imobilizada?
Para responder essas perguntas voces irao escolher um
processo de conversao enzimatica, verificar os parametros
cineticos da enzima, verificar se há algum tipo de inibição,
escolher um metodo de imobilização, comparar a
quantidade de substrato que pode ser hidrolisado pela
enzima em operação continua e descontinua, discutir as
vantagens
e
desvantagens
do
reator
continuo
especialmente aqueles relacionados a conversao de
substrato versus tempo de operação.
Material para leitura:
1. Andric, P., Meyer, AS, Jensen, PA, Dam-Johansen, K Reactor design for
minimizing production inhibition during enzymatic lignocellulose hydrolysis II
Quantification of inhibition and suitability of membrane reactors Biotechnology
advances 28 (2010) 407-425
2. Andric, P., Meyer, AS, Jensen, PA, Dam-Johansen, K Effect and Modeling of
Glucose Inhibition and In Situ Glucose Removal During Enzymatic Hydrolysis of
Pretreated Wheat Straw Appl Biochem Biotechnol (2010) 160:280–297
3. LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W. Biotecnología
Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos. São Paulo, SP, Ed.
Edgard Blucher LTDA, 2001. vol. 3. 593p.
4. J.M. OboH n, M.R. Castellar, J.L. Iborra, A. ManjoHn*
Beta-Galactosidase immobilization for milk lactose hydrolysis: a simple
experimental and modelling study of batch and continuous reactors.
Biochemical Education 28 (2000) 164}168
5. Y.GE, H.ZHOU, W. KONG, Y. TONG,S. WANG, and W.Li Immobilization of
Glucose Isomerase and Its Application in Continuous Production of High
Fructose Syrup Applied Biochemistry and Biotechnology Vol. 69, 1998