UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ – UNIVALI
CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL
CLEDER ALEXANDRE SOMENSI
TRATAMENTO DE EFLUENTES HOSPITALARES: USO DE PARÂMETROS
FÍSICO-QUÍMICOS, MICROBIOLÓGICOS E ECOTOXICOLÓGICOS NA
AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA OZONÓLISE E DA ASSOCIAÇÃO
SONÓLISE/OZONÓLISE
Itajaí, SC
Abril de 2013
CLEDER ALEXANDRE SOMENSI
TRATAMENTO DE EFLUENTES HOSPITALARES: USO DE PARÂMETROS
FÍSICO-QUÍMICOS, MICROBIOLÓGICOS E ECOTOXICOLÓGICOS NA
AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA OZONÓLISE E DA ASSOCIAÇÃO
SONÓLISE/OZONÓLISE
Tese apresentada como requisito parcial para a
obtenção do título de Doutor em Ciência e
Tecnologia Ambiental, na Universidade do Vale do
Itajaí, Centro de Ciências Tecnológicas da Terra e
do Mar.
Orientador: Prof°. Dr. Claudemir Marcos Radetski
Itajaí, SC
Abril de 2013
ii
CLEDER ALEXANDRE SOMENSI
TRATAMENTO DE EFLUENTES HOSPITALARES: USO DE PARÂMETROS
FÍSICO-QUÍMICOS, MICROBIOLÓGICOS E ECOTOXICOLÓGICOS NA
AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA OZONÓLISE E DA ASSOCIAÇÃO
SONÓLISE/OZONÓLISE
Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do título
de Doutor em Ciência e Tecnologia Ambiental e
aprovada pelo Programa de Pós-Graduação em
Ciência e Tecnologia Ambiental, da Universidade do
Vale do Itajaí, Centro de Ciências Tecnológicas da
Terra e do Mar.
Área de Concentração: Tecnologia e Gestão Ambiental
Itajaí, SC, 24 abril de 2013.
Prof°. Claudemir Marcos Radetski, Dr.
Universidade do Vale do Itajaí – Orientador
Prof°. Jean-François Férard, Dr.
Université de Lorraine – France - Membro
Prof°. Maurice Millet, Dr.
Université de Strasbourg – France - Membro
Prof°. Edésio Luiz Simionatto, Dr.
Universidade Regional de Blumenau - Membro
Prof°. Charrid Resgalla Jr., Dr.
Universidade do Vale do Itajaí - Membro
Profa°. Jurandir Pereira Filho, Dr.
Universidade do Vale do Itajaí - Membro Suplente
iii
“Ao cair da tarde deverá banhar-se em água e, ao pôrdo-sol, poderá entrar no acampamento. Fora do
acampamento, terás um lugar onde te possas retirar
para as necessidades. Levarás no equipamento um pá
para fazeres uma fossa, quando saires para fazer as
necessidades.
Antes
de
voltar,
cobrirás
os
excrementos”. (Deuteronômio, 23:12-14).
iv
Dedico este trabalho aos meus pais, incondicionais.
v
AGRADECIMENTOS
A força maior que, independente do seu nome, rege a minha vida.
Ao professor Dr. CLAUDEMIR MARCOS RADETSKI, pela orientação, confiança,
apoio, parceria e disponibilidade em todas as vezes que solicitado para o
desenvolvimento deste trabalho.
Ao professor Dr. EDÉSIO LUIZ SIMIONATTO, meu amigo.
A minha família, em especial aos meus pais ONORIO e ISETE, por apoiarem meus
sonhos, pelo auxílio financeiro e por me amarem sempre.
A LUCIANA, uma parceira incomparável;
Aos colegas do Laboratório de Análise em Combustíveis da FURB, DILAMARA E
RAFAEL, além dos parceiros do laboratório I-503.
Aos colegas da primeira turma do doutorado, CLAUDETE, LUIZ CLÁUDIO, OSCAR
E RENAN.
Aos colegas do Laboratório de Remediação Ambiental (LARA).
A Universidade do Vale do Itajaí e ao corpo docente do PPCTA.
A Universidade Regional de Blumenau - FURB.
Ao Instituto Federal Catarinense (IFC), campus Araquari, pela viabilização de um
horário para a execução das atividades e pela cedência do espaço físico para
realização de parte dos experimentos.
Aos meus colegas de trabalho do IFC Araquari, os quais muitas vezes assumiram
minhas responsabilidades para que pudesse continuar com este trabalho.
Ao CNPq pelo auxílio financeiro.
Aos meus poucos amigos.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização desta
obra.
MUITÍSSIMO OBRIGADO!
vi
RESUMO
Os fármacos já foram detectados em vários compartimentos ambientais, pois grande
parte dos resíduos de fármacos não é removida durante os sistemas de tratamento
de efluentes convencionais (quando existentes). Esses fármacos podem ser
persistentes no meio e causarem efeitos tóxicos em diversos organismos. A
resistência aos antibióticos é outro importante problema da saúde pública oriundo da
utilização exagerada dos antibióticos, sendo que a liberação dos seus resíduos para
o meio-ambiente tem sido cada vez mais reconhecida como fonte de pressão
seletiva que conduz à resistência bacteriana. Outros fármacos que podem causar
impactos ambientais negativos são os citostáticos, os quais são mutagênicos e
genotóxicos, não sendo possível estimar uma concentração ambiental segura para
estas substâncias. Assim, esta pesquisa utilizou processos de oxidação avançada,
i.e., ozonólise e sonólise/ozonólise, em escala de bancada, para o tratamento de
efluentes hospitalares (sintéticos e reais) contaminados com fármacos citostáticos,
avaliando sua eficiência em termos físico-químicos, microbiológicos e
ecotoxicológicos. Algumas variáveis envolvidas nas reações químicas utilizadas
foram verificadas, como a influência do pH, a vazão O 2/O3 e a densidade de
potência do ultrassom. Quando um efluente sintético foi preparado, a associação
mostrou-se mais eficiente na degradação dos citostáticos doxorrubicina e
metotrexato, sendo que os tratamento mostraram-se dependentes do pH. Quando
um efluente real foi utilizado, a associação das técnicas removeu 16 % do COT,
enquanto que a ozonólise removeu apenas 3 %. Para DBO, a eficiência dos
tratamentos de ozonólise e ozonólise/sonólise foi respectivamente de 15 % e 30 %,
enquanto que para DQO, os valores chegaram a 14 % e 33 %. Em termos
microbiológicos, a aplicação da ozonólise/sonólise levou a inviabilização de
microrganismos de forma mais rápida, além de possibilitar e degradação do material
genético plasmídico presente no efluente, o que não foi conseguido pela ozonólise.
A degradação de material genético apresentou-se dependente da densidade de
potência de ultrassom aplicada. As doses de ozônio requeridas para 99,99% de
eficiência na desinfecção via ozonólise e sonólise/ozonólise foram determinadas em
75,75 mg.L.min-1 e 12,98 mg.L.min-1, respectivamente. Com relação às análises
ecotoxicológicas, os dois tratamentos apresentaram a mesma eficiência quando os
efluentes foram testados com a bactéria AliiAliivibrio fischeri e com os peixes Danio
rerio, sendo que para daphnias e algas, a técnica associada foi mais eficiente na
remoção da ecotoxicidade. De maneira geral, a associação sonólise/ozonólise
mostrou-se mais adequada para o tratamento de efluentes hospitalares,
principalmente devido ao potencial de degradação do material genético presente
neste efluente.
Palavras-chave: Efluentes
Desinfecção, Ecotoxicologia.
hospitalares,
Ozonólise,
Sonólise,
Fármacos,
vii
ABSTRACT
Hospital wastewater treatment: use of physico-chemical, microbiological and
ecotoxicological parameters to evaluate ozonolysis and ozonolysis/sonolysis
treatment efficiency.
Pharmaceutical drugs have been detected in various environmental compartments,
since most of these chemicals are not removed during conventional wastewater
treatment systems. These drugs can be persistent in the environment and can cause
toxic effects in several organisms. Antibiotic resistance is another important public
health problem arising from the excessive use of antibiotics, and release of antibiotic
residues to the environment has been increasingly recognized as a source of
selective pressure that leads to bacterial resistance. Other pharmaceuticals present
in hospital wastewaters that can cause negative environmental impacts are
cytostatics, which are mutagenic and genotoxic. Thus, the goal of this work was to
compare efficacity of advanced oxidation processes, i.e., ozonolysis and
sonolysis/ozonolysis to treat hospital wastewater (synthetic and real). The efficacity
was evaluated in terms of physico-chemical, microbiological and ecotoxicological
parameters. Some variables involved in chemical reactions were also verified, as the
pH influence, O2/O3 flow, and ultrasound power density. When a synthetic hospital
wastewater was treated, the sonolysis/ozonolysis combination was more efficient in
the degradation of the cytostatic agents doxorubicin and methotrexate, and the
treatment proved to be pH dependent. When a real effluent was used, the
combination of techniques removed 16% of COT, whereas ozonolysis removed only
3%. For BOD, the efficiency of the treatments were 15% and 30% for ozonolysis and
ozonolysis/sonolysis respectively, while for COD these values have reached 14%
and 33%. In relation to the microbiological disinfection, the use of
ozonolysis/sonolysis association showed higher efficacity than ozonolysis alone, and
the same trend was observed in the case of genetic material degradation. Again,
disinfection and denaturation efficiency appeared to be dependent on the ultrasound
power density applied in the treatment. Doses of ozone required to achieve 99.99%
of microbiological disinfection via ozonolysis and sonolysis/ozonolysis were
determined 75.75 and 12.98 mg L-1min-1, respectively. With respect to the
ecotoxicological analysis, both treatments showed similar efficiency in toxicity
remotion of treated samples when the effluents were tested with bacteria and fish,
while for daphnids and algae, the association ozonolysis/sonolysis was more efficient
than ozonolysis to decrease the ecotoxicity of treated samples. In general, the
association sonolysis/ozonolysis was more efficient for the treatment of hospital
wastewater, meanly due to the high potential to degradate genetic material present
in these wastewaters.
Key-Words: Hospital wastewater,
Disinfection, Ecotoxicology.
Ozonolysis,
Sonolysis,
Pharmaceuticals,
viii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. xi
LISTA DE TABELAS ............................................................................................... xiv
LISTA DE EQUAÇÕES ............................................................................................ xv
SIGLAS E ABREVIAÇÕES ..................................................................................... xvi
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 18
1.1 Hipóteses e Tese ............................................................................................. 20
1.2 Objetivos .......................................................................................................... 21
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 23
2.1
Fármacos e o Meio Ambiente ...................................................................... 23
2.2
Efluentes Hospitalares ................................................................................. 30
2.3
Citostáticos................................................................................................... 33
2.4
Resistência Bacteriana aos Antibióticos (ou outro produto qualquer) .......... 38
2.5
Sistemas de Tratamento de Efluentes ......................................................... 40
2.6
Processos Oxidativos Avançados ................................................................ 44
2.6.1 Ozonólise ..................................................................................................... 47
2.6.2 Ultrassom (Sonólise) .................................................................................... 49
MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 52
3.1
Sistema de Tratamento – Ozonólise e Ozonólise/Sonólise.......................... 52
3.2
O Efluente Hospitalar ................................................................................... 54
3.3 Ensaios de Degradação de Fármacos Citostáticos em Meio Aquoso e
Quantificação do O3/US ......................................................................................... 57
3.3.1
3.4
Análises Cromatográficas dos Citostáticos no Efluente Sintético .......... 58
Tratamento do Efluente Hospitalar: Matéria Orgânica Total ........................ 60
3.4.1 Tratamento do Efluente Hospitalar: Demandas Química e Bioquímica de
Oxigênio (DQO e DBO) ...................................................................................... 62
ix
3.5
Tratamento do Efluente Hospitalar: Desinfecção ......................................... 63
3.5.1
Ensaios de Viabilidade Celular .............................................................. 63
3.5.2
Modelo Cinético e Dosagem de Ozônio para Desinfecção.................... 64
3.6
Tratamento do Efluente Hospitalar: Material Genético ................................. 65
3.6.1
3.7
Extração/Quantificação de ADN Plasmídico e Eletroforese .................. 65
Tratamento de Efluente Hospitalar: Ecotoxicidade ...................................... 67
3.7.1
Ensaios com Aliivibrio fischeri................................................................ 67
3.7.2
Ensaios com Pseudokirchniriella subcaptata ......................................... 68
3.7.3
Ensaios com Daphnia magna ................................................................ 69
3.7.4
Ensaios com Danio rerio ........................................................................ 69
3.8 Análise de Intermediários por Cromatografia Gasosa – Espectrometria de
Massas (CG-EM) ................................................................................................... 70
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 72
4.1 Degradação da Doxorrubicina e do Metotrexato em Meio Aquoso: Eficiência
e Cinética ............................................................................................................... 72
4.1.1
Degradação da Doxorrubicina ............................................................... 73
4.1.2
Degradação do Metotrexato .................................................................. 76
4.1.3
Cinética de Degradação dos Citostáticos .............................................. 80
4.2
Remoção da Matéria Orgânica (COT, DQO e DBO) ................................... 83
4.3
Eficiência na Desinfecção ............................................................................ 87
4.4
Influência dos Tratamentos sobre os Plamídeos Bacterianos ...................... 95
4.5
Ecotoxicidade ............................................................................................... 98
4.6
Análise de Intermediários ........................................................................... 102
CONCLUSÕES ....................................................................................................... 104
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 108
ANEXOS ................................................................................................................. 128
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Porcentagem das classes terapêuticas detectadas no meio
ambiente...............................................................................................23
Figura 2.
Fatores ligados ao aumento na produção e consumo de
medicamentos.......................................................................................26
Figura 3.
Possíveis rotas que possibilitam o acesso dos fármacos ao meio
ambiente...............................................................................................27
Figura 4.
Destinação dada pelos cidadãos alemãos aos “remédios” não
utilizados...............................................................................................28
Figura 5.
Possíveis rotas para entrada e transporte de citostáticos no meio
ambiente...............................................................................................28
Figura 6.
Fatores relacionados à concentração ambiental de
citostáticos............................................................................................29
Figura 7.
Chegada dos citostáticos às ETE’s urbanas.........................................35
Figura 8.
Mecanismos de resistência bacteriana.................................................39
Figura 9.
Sistemas de tratamento utilizados nos diferentes tipos de
efluentes................................................................................................41
Figura 10.
Estratégias para a combinação entre tratamentos químicos e
biológicos..............................................................................................42
Figura 11.
Tecnologias mais recomendadas para tratamento de poluentes
segundo o conteúdo de DQO...............................................................46
Figura 12.
Exemplo de oxidação com O3 via reação direta e indireta....................47
Figura 13.
Região de frequência do som...............................................................49
Figura 14.
Pressão positiva, pressão negativa e nucleação da cavidade
acústica................................................................................................50
Figura 15.
Representação da produção de ozônio por efeito corona....................52
Figura 16.
Piezoeletricidade...................................................................................53
Figura 17.
Diferentes perspectivas do sistema de tratamento de efluentes
hospitalares por ozonólise/sonólise......................................................54
xi
Figura 18.
Aparato experimental utilizado no tratamento do efluente hospitalar...54
Figura 19.
Estrutura química da doxorrubicina e do metotrexato..........................57
Figura 20.
Curva de calibração da doxorrubicina...................................................59
Figura 21.
Curva de calibração do metotrexato.....................................................60
Figura 22.
Espectros UV-Vis da redução da absorbância da doxorrubicina
nas diferentes condições de tratamento...............................................73
Figura 23.
Eficiência na degradação da doxorrubicina submetida a ozonólise
e sonólise/ozonólise em diferentes pH’s...............................................74
Figura 24.
Espectros de absorção obtidos no CLAE a 260 nm para a
degradação da doxorrubicina................................................................76
Figura 25.
Espectros UV-Vis da redução da absorbância do metotrexato nas
diferentes condições de tratamento......................................................77
Figura 26.
Eficiência na degradação do metotrexato nos primeiros doze
minutos quando submetido a ozonólise e sonólise/ozonólise
em diferentes valores de pH.................................................................78
Figura 27.
Espectros de absorção obtidos no CLAE a 302 nm para a
degradação do metotrexato..................................................................80
Figura 28.
Dados cinéticos de segunda ordem obtidos a partir da
degradação da doxorrubicina em pH 7,0, via ozonólise
e sonólise/ozonólise..............................................................................81
Figura 29.
Dados cinéticos de segunda ordem obtidos a partir da
degradação do metotrexato em pH 7,0, via
ozonólise e sonólise/ozonólise..............................................................82
Figura 30.
Valores de DQO e DBO indicativos de tratabilidade do efluente..........86
Figura 31.
Evolução da eficiência dos diferentes tratamentos na desinfecção
do efluente hospitalar............................................................................89
Figura 32.
Placas de Petri semeadas nos diferentes tempos de tratamento
por sonólise (controle)...........................................................................94
Figura 33.
Gel de eletroforese da extração de ADN plasmídico obtido a
partir do efluente hospitalar...................................................................96
Figura 34.
Cromatogramas obtidos por CG-EM a partir do efluente bruto,
ozonizado e sonicado/ozonizado, utilizando hexano na extração
dos analitos.........................................................................................102
xii
Figura 35.
Cromatogramas obtidos por CG-EM a partir do efluente bruto,
ozonizado e sonicado/ozonizado, utilizando diclorometano na
extração dos analitos..........................................................................103
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Intervalo da variabilidade das concentrações de alguns
parâmetros físicos, químicos e microbiológicos em efluentes
hospitalares...........................................................................................32
Tabela 2.
Potencial de oxidação de diferentes agentes oxidantes.......................46
Tabela 3.
Porcentagem da eficiência na remoção do COT pelos diferentes
tratamentos após 10 e 20 minutos........................................................84
Tabela 4.
Eficiência na remoção de COT sob diferentes condições de
tratamento.............................................................................................84
Tabela 5.
DQO, DBO e biodegradabilidade do efluente bruto e após 40
minutos com diferentes condições de tratamento.................................86
Tabela 6.
Quantitativo de UFC’s.mL-1 de efluente hospitalar nos seis
diferentes tratamentos e em 4 intervalos de tempo..............................88
Tabela 7.
Concentração de ozônio no reator em função do tempo e da
temperatura...........................................................................................92
Tabela 8.
Correlação das eficiências de desinfecção dos diferentes
tratamentos realizados..........................................................................92
Tabela 9.
ADN plasmídico presente no efluente bruto e nos efluentes
submetidos aos diferentes tratamentos................................................96
Tabela 10.
Características ecotoxicológicas do efluente bruto enriquecido
com 10 mg.L-1 de doxorrubicina, 30 mg.L-1 de metotrexato e
10 mg.L-1 de docetaxel..........................................................................99
Tabela 11.
Características ecotoxicológicas do efluente tratado via
ozonólise...............................................................................................99
Tabela 12.
Características ecotoxicológicas do efluente tratado por
sonólise/ozonólise.................................................................................99
xiv
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1:
Sonólise da Molécula de Água...................................................50
Equação 2:
Produção de radicais •OH pela associação O3/US:
Reação 1....................................................................................51
Equação 3:
Produção de radicais •OH pela associação O3/US:
Reação 2....................................................................................51
Equação 4:
Cisão Homolítica do Oxigênio Molecular....................................52
Equação 5:
Produção do O3 a partir do radical O• e do O2 molecular...........52
Equação 6:
Potência do Ultrassom Dissolvida segundo o Método
Calorimétrico..............................................................................58
Equação 7:
Modelo Cinético para Desinfecção de Efluentes por Cloração..64
Equação 8:
Modelo Cinético para Desinfecção por Ozonólise e
Sonólise/Ozonólise.....................................................................64
Equação 9:
Regressão Linear para Determinação da CE50 em Ensaios
com Aliivibrio fischeri..................................................................68
xv
SIGLAS E ABREVIAÇÕES
ABNT
Associação Brasileira de Normas Técnicas
ACN
Acetonitrila
ADN
Ácido Desoxirribonucleico
APHA
American Public Health Association
ARN
Ácido Ribonucleico
BCG
Bacillus Calmette-Guerin
CaCO3
Carbonato de Cálcio
CAP
Concentrações Ambientais Previstas
CAS
Chemical Abstracts Service
CE50
Concentração Efetiva Média
CG-EM
Cromatografia Gasosa – Espectrometria de Massas
CH2Cl2
Diclorometano
CL50
Concentração Letal Média
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CO2
Dióxido de Carbono
CONAMA
Conselho Nacional do Meio Ambiente
COT
Carbono Orgânico Total
Cr2O72-
Íon Dicromato
Cr3+
Íon Cromo
DBO
Demanda Bioquímica de Oxigênio
DQO
Demanda Química de Oxigênio
DPD
Dietil-p-fenilenodiamina
EDTA
Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
EPA
Environmental Protection Agency
ETA
Estação de Tratamento de Água
ETE
Estação de Tratamento de Esgoto
FATMA
Fundação Estadual do Meio Ambiente
FD
Fator de Toxicidade
HCl
Ácido Clorídrico
H2O2
Peróxido de hidrogênio
xvi
•HO2-
Radical Hidroperoxil
H2SO4
Ácido Sulfúrico
IARC
International Agency for Research on Cancer
LB
Luria Broth
NaOH
Hidróxido de Sódio
Na2SO4
Sulfato de Sódio Anidro
NDIR
Non-Dispersive Infra-Red
NH4+
Amônio
NKT
Nitrogênio Kjeldahl Total
NPOC
Non-Purgeable Organic Carbon
•OH
Radical Hidroxila
O (3P)
Oxigênio Atômico Tripleto
•O2-
Radical Superóxido
O2
Oxigênio Molecular
O3
Ozônio molecular
P
Fósforo
POA
Processo Oxidativo Avançado
Pt
Platina
R-O2•
Radical Orgânico Peroxil
SDS
Dodecil Sulfato de Sódio
SS
Sólidos Suspensos
SUS
Sistema Único de Saúde
THG
Transferência Horizontal de Genes
Tris
Tris (hidróximetil)-amino-metano
UFC
Unidade Formadora de Colônia
US
Ultrassom
UTI
Unidade de Terapia Intensiva
UV
Ultravioleta
UV-Vis
Ultravioleta - Visível
xvii
1.
INTRODUÇÃO
O crescimento populacional e a demanda por novos produtos levaram ao
aumento, evolução e diversificação do parque industrial mundial, produzindo cada
vez mais substâncias de difícil degradação e que podem ter como destino final o
meio ambiente. Diversos processos de diferentes setores conduzem a formação de
subprodutos (e.g., efluentes) com elevado potencial poluente, muitas vezes não
corretamente tratados devido à defasagem entre o desenvolvimento das tecnologias
de remediação e a velocidade de aparecimento das novas substâncias (e
consequente geração de resíduos) e/ou, até mesmo, pela carência de legislação
específica que regule o descarte destes subprodutos, fatores intrinsecamente
interligados. Ainda, a prioridade pelo desenvolvimento de novos produtos sobrepuja
a remediação ambiental.
Diretamente relacionado à saúde dos seres humanos e associado à evolução
tecnológica alcançada com o atual estágio de pesquisa e desenvolvimento mundial
está uma melhor qualidade de vida e aumento da longevidade, tanto em países
desenvolvidos quanto em países emergentes. Isto é possível graças ao acesso
quase instantâneo às tecnologias, processos e produtos, principalmente quanto aos
novos medicamentos, equipamentos e técnicas cirúrgicas. A síntese e utilização de
medicamentos, fundamentais na melhoria da qualidade de vida da população,
trazem consigo a preocupação da contaminação ambiental por fármacos residuais,
fenômeno ainda não completamente estudado quanto às consequências difíceis de
serem mensuradas.
Com o aumento da população, das cidades, da atividade industrial e das
instituições de saúde públicas e privadas, clínicas médicas, veterinárias, farmácias,
laboratórios de análises clínicas, consultórios odontológicos, bancos de sangue,
bancos de leite e outros estabelecimentos similares, um maior volume de efluentes
contaminados por fármacos residuais vem sendo liberado no meio ambiente, além
de bactérias oriundas dos estabelecimentos de tratamento da saúde, o que prejudica
seriamente a qualidade das águas dos corpos hídricos receptores, inclusive com
18
riscos para a saúde pública (HALLING-SORENSEN et al., 1998; HIRSCH et al.,
1999; TERNES & HIRSCH, 2000; KÜMMERER, 2001).
O possível efeito de resíduos farmacêuticos, principalmente em ambientes
aquáticos, está relacionado principalmente com as características físico-químicas de
cada composto, os quais possuem estrutura química complexa e preparada para ser
persistente, mantendo suas propriedades químicas o bastante para servir a um
propósito terapêutico. Especial atenção é dada para algumas classes de
substâncias, como é o caso dos antibióticos, relacionados com o desenvolvimento
de bactérias multiresistentes (GUARDABASSI et al., 1998; REINTHALER et al.,
2003; TAVARES, 2000), dos hormônios, associados as alterações endócrinas
(LINTELMANN et al., 2003; HALLDIN et al., 1999), e mais recentemente, das drogas
citostáticas, mutagênicas e genotóxicas (FERK et al., 2009; KÜMMERER & ALAHMAD, 2010). Todas estas substâncias, mesmo em baixas concentrações
ambientais (principalmente com relação aos medicamentos citostáticos), podem
trazer riscos à saúde humana, não sendo possível estimar níveis seguros no meio
ambiente.
Para os citostáticos, frente a dados e estimativas da Agência Internacional de
Pesquisa sobre o Câncer (IARC), a qual informa que o impacto global da doença
mais que dobrou em 30 anos, pode-se dizer que a quantidade utilizada de
medicamentos desta natureza venha a crescer substancialmente nos próximos
anos, principalmente em países de baixo e médio desenvolvimento, onde se prevê
que metade dos novos casos da doença seja diagnosticada e onde cerca de dois
terços dos óbitos ocorram (BOYLE & LEVIN, 2008).
Neste sentido, o tratamento dos efluentes hospitalares, importante fonte de
contaminação ambiental, necessita atenção especial devido principalmente a não
eficiência dos sistemas convencionais de tratamento na remoção de resíduos
farmacêuticos (HALLING-SORENSEN et al., 1998). Ainda, a ausência de estudos
sobre a degradação do material genético presente nos efluentes é flagrante, sendo
este um dos objetivos para o desenvolvimento de um tratamento ideal destes
resíduos, visando à minimização dos riscos relacionados à transferência horizontal
de genes (THG), fenômeno que leva ao aumento da resistência bacteriana. Assim,
alternativamente aos processos físico-químicos e biológicos convencionais,
19
encontram-se os Processos de Oxidação Avançada (POA’s) que, mesmo fazendo
uso de diferentes sistemas de reações, caracterizam-se pela geração de radicais
hidroxila (•OH), embora outros mecanismos estejam envolvidos nestes processos,
constituindo uma alternativa aos sistemas de tratamento de efluentes hospitalares.
Em face da realidade dos riscos sobre a saúde pública e sobre o meio-ambiente
implicados na liberação dos efluentes “mal tratados”, desenvolveu-se este trabalho
sobre tratamento de efluentes hospitalares.
1.1 Hipóteses e Tese
Este trabalho de doutoramento partiu da suposição de algumas hipóteses, as
quais permitiram chegar a uma tese:
H1) Algumas classes de fármacos são parcial ou totalmente resistentes a
degradação natural;
H2) Grande parte dos medicamentos são recalcitrantes aos tratamentos de
efluentes convencionais (biodegradação);
H3) Os compostos que mais são detectados no meio ambiente podem estar
dispostos por dois motivos: (a) resistência à degradação natural e/ou (b) grande
quantidade do medicamento que é utilizada nos estabelecimentos de saúde e
residências particulares e que não são tratados quando da liberação ao meioambiente;
H4) Os fármacos dispostos no meio ambiente podem ocasionar a seleção de
bactérias;
H5) Nos efluentes hospitalares existem bactérias multi-resistentes aos
antibióticos.
A Tese proposta neste doutoramento é a seguinte: “a associação de um
processo químico (ozonização) com um processo físico (ultrassom) deve aumentar a
taxa de degradação de fármacos presentes nos efluentes hospitalares e deve
destruir (desnaturar) o material genético da microbiologia presente nestes efluentes,
tornando os efluentes liberados menos impactantes no meio-ambiente”.
20
1.2 Objetivos
- Objetivo geral
Desenvolver um esquema combinado para o tratamento de efluentes
hospitalares, em escala de bancada, baseado em um processo de oxidação
avançada (ozónolise) e um processo físico (ultrassom), com sua eficiência avaliada
por parâmetros físico-químicos, microbiológicos e ecotoxicológicos.
- Objetivos Específicos
1. Propor as condições de tratamento para a degradação de drogas
citostáticas residuais em meio aquoso e para o tratamento de um efluente hospitalar
real proveniente de um hospital de referência no tratamento de câncer, em escala de
bancada;
2. Quantificar de forma preliminar a relação de algumas variáveis envolvidas
nos processos de oxidação avançada, buscando a otimização do sistema para o
tratamento dos efluentes contaminados com citostáticos (sintético), a saber: pH,
tempo de tratamento e eficiência na degradação de drogas citostáticas; fluxo de
O2/O3, densidade de potência do ultrassom (US), tempo de tratamento e eficiência
na remoção de matéria orgânica presente no efluente real; fluxo de O2/O3,
densidade de potência do US, temperatura, tempo de tratamento e eficiência na
desinfecção/degradação de material genético presente no efluente hospitalar;
3. Estabelecer a cinética de degradação de alguns citostáticos utilizados;
4. Verificar a formação de compostos intermediários após tratamento dos
efluentes;
5. Avaliar a eficiência do sistema de tratamento proposto para os efluentes
hospitalares (associação da ozonólise/sonólise) no que tange a degradação de
drogas citostáticas recalcitrantes, remoção de matéria orgânica, desinfecção,
degradação de material genético e redução da ecotoxicidade para diferentes
organismos teste (bactérias, daphnias, algas e peixes).
21
6. Gerar dados visando à ampliação da escala de tratamento, contribuindo
tecnicamente para o desenvolvimento de um sistema de remediação piloto.
22
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1
Fármacos e o Meio Ambiente
Os primeiros estudos sobre a presença de fármacos no ambiente são da
década de 70. Hignite & Azarnoff (1977) analisaram águas residuárias de Estações
de Tratamento de Esgotos (ETE’s) nos Estados Unidos e detectaram a presença de
alguns metabólitos do clofibrato e da aspirina. Desde então, diversos fármacos
foram detectados no meio ambiente. Santos et al. (2010) citaram as diferentes
classes terapêuticas pesquisadas e publicadas em 134 diferentes artigos entre 1997
e 2009, conforme Figura 1.
Figura 1. Porcentagem das classes terapêuticas detectadas no meio ambiente
Fonte: Santos et al., 2010.
23
Neste mesmo trabalho, os autores demonstram que o maior esforço de
detecção dos pesquisadores ao redor do mundo foi com relação aos antibióticos,
perfazendo 18% de todos os estudos. Esta classe de fármacos é sem dúvida a mais
pesquisada frente aos possíveis danos que podem causar no meio ambiente, devido
estes serem utilizados em grande quantidade e praticamente em todos os locais de
atendimento a saúde, além do fato de serem potencialmente inertes ao tratamento
biológico de efluentes. O gráfico da Figura 1 também chama a atenção para os
antineoplásicos que, apesar do esforço dos pesquisadores ter sido menor do que
5% do total de trabalhos (dados não mostrados), estes chegam a 4% do total das
classes terapêuticas detectadas, valor preocupante quando conhecidas as
potencialidades negativas destas substâncias quando dispostas no meio ambiente.
A ocorrência de fármacos residuais no esgoto doméstico e águas naturais é
um importante tópico internacional. Conforme já apresentado, estudos demonstram
que esses fármacos e seus metabólitos estão presentes em ambientes aquáticos em
várias partes do mundo. Kolpin et al. (2002) detectaram antibióticos, como
tetraciclinas, sulfonamidas, macrolídeos, fluoroquinolonas, lincomicina, trimetoprim e
tilosina, em amostras de águas superficiais nos Estados Unidos. Sacher et al. (2001)
reportaram a ocorrência de sulfametoxazol em amostras de águas de subsolo na
Alemanha. Hartig et al. (1999) detectaram antibióticos sulfonamidas (sulfadiazina e
sulfametoxazol) em águas superficiais e efluentes de ETE na Alemanha.
Uma fonte de contaminação ambiental que tem sido observada é
conseqüente da disposição inadequada de resíduos provenientes de indústrias
farmacêuticas (contaminação das águas superficiais pela lixiviação dos “lixões”),
efluentes da rede de esgoto doméstico e, mais freqüentemente, efluentes
provenientes de serviços de saúde. Outra rota de dispersão dos fármacos no
ambiente aquático pode ser devido ao uso do lodo depurado proveniente das ETE’s
para fins agrícolas (HALLING-SORENSEN et al., 1998).
Com relação aos antibióticos, estes também são utilizados como promotores
de crescimento na produção de gado, na produção avícola e são intensamente
usados como aditivos de alimento de peixe na aqüicultura e criação de porcos
(HALLING-SORENSEN et al., 1998). Sendo assim, podem contaminar o solo, águas
de subsolo, águas superficiais e sedimentos. Devido ao uso na cultura de peixes,
24
alguns antibióticos como o cloranfenicol e o oxitetraciclina são detectados em
sedimentos de origem marinha (SMITH & SAMUELSEN, 1996).
Apesar das concentrações individuais dos antibióticos serem baixas, existem
diferentes tipos de antibióticos que quando combinado com outros, podem acarretar
em sérios problemas ambientais e de saúde, no caso de desenvolver resistência em
microorganismos.
Muitos
antibióticos
também
se
mostraram
resistentes
a
degradação natural no meio, podendo permanecer nas águas durante muito tempo
(HALLING-SORENSEN et al., 1998). A população microbiana na água muda quando
expostas aos antibióticos. Em alguns casos, níveis tróficos podem ser totalmente
destruídos, fazendo com que estruturas de comunidades sejam significativamente
alteradas (WOLLENBERGER et al., 2000).
Antibióticos são tóxicos para algas, com CE50 de 12.5 mg.L-1 a 1.6 mg.L-1, e
ainda mais baixa de 0.1 a 0.05 mg.L-1 para algas verdes e azuis (HALLINGSORENSEN et al., 1998). Alguns antibióticos também se mostraram tóxicos aos
crustáceos de água doce (Daphnia magna), destruindo sua habilidade reprodutiva
(WOLLENBERG et al., 2000; BLAISE et al., 2006; FERRARI et al., 2004). Contudo,
o mais proeminente efeito dos antibióticos no meio ambiente é o desenvolvimento de
resistência bacteriana, a qual será aboradada posteriormente.
Assim, pode-se perceber que a contaminação ambiental por fármacos
residuais constitui uma preocupação mundial, com crescente número de trabalhos
nos últimos anos. Estas preocupações relacionam-se também com a elevação do
consumo e fabricação de fármacos, fatores impulsionados por diferentes motivos,
como é o caso de políticas públicas adotadas, inclusive no Brasil, que garantem o
acesso a diferentes medicamentos às famílias de baixa renda, aumentando
significativamente o consumo de algumas classes de fármacos, certamente junto
com uma melhora na qualidade de vida. A Figura 2 apresenta alguns motivos que
favorecem a elevação do consumo de medicamentos.
25
Figura 2. Fatores ligados ao aumento na produção e consumo de medicamentos.
Fonte: Rolim (2005).
Uma vez no meio ambiente, a mobilidade dos fármacos pode ser comparada
com a dos pesticidas, por apresentarem características físico-químicas parecidas
(HALLING-SORENSEN et al., 1998). Assim, após a excreção inalterada e/ou como
metabólitos, os fármacos penetram no sistema de esgoto e são transportados para
as águas subterrâneas e superficiais. Uma vez no meio ambiente, os fármacos
também sofrem alterações, formando subprodutos. As possíveis rotas da entrada de
fármacos no meio ambiente foram demonstradas por Bila & Dezotti (2003), conforme
Figura 3.
26
Figura 3. Possíveis rotas que possibilitam o acesso dos fármacos ao meio ambiente.
Fonte: Bila & Dezotti, 2003.
O problema da entrada de fármacos no meio ambiente também pode ser
abordado de uma perspectiva educacional. A contaminação ambiental por fármacos
é um problema que não é percebido por toda a população, mesmo em países
desenvolvidos. Segundo Eissen & Backhaus (2011), um em cada sete cidadãos
alemães descarta os comprimidos não utilizados via sanitário. Quando se trata de
um “remédio” líquido, quase 50% dos cidadãos descartam possíveis resíduos na
privada (Figura 4).
27
(a)
(b)
Figura 4. Destinação dada pelos cidadãos alemães aos “remédios” não utilizados.
(a) Eliminação dos comprimidos através do vaso sanitário e (b) descarte de
medicamentos líquidos no vaso sanitário.
Fonte: Eissem & Backhaus, 2011.
Claramente é possível afirmar que as decisões individuais da população tem
influência na contaminação ambiental, inclusive por fármacos. Em países
subdesenvolvidos, mesmo na ausência de pesquisas oficiais, a tendência é que este
número seja ainda maior.
Com relação aos fármacos citostáticos, Zhang et al. (2013) desenvolveram
um fluxograma da entrada e transporte destes fármacos no meio ambiente, similar
ao apresentado por Bila & Dezotti (2003).
Figura 5. Possíveis rotas para entrada e transporte de citostáticos no meio
ambiente.
Fonte: Zhang et al., 2013.
28
Independente da forma de acesso ao meio ambiente, os resultados da
entrada
de
fármacos
em
geral
nos cursos
d’água
não
são
totalmente
compreendidos. Isto se deve ao fato de que só recentemente concentrou-se nos
efeitos potenciais dos fármacos. Outra razão é que, associado à diversidade de
medicamentos utilizados, há baixa concentração dos fármacos nos recursos
hídricos, dificultando a utilização dos métodos analíticos para medir essas pequenas
concentrações com segurança. A Figura 6 apresenta alguns fatores relacionados à
concentração de citostáticos no meio-ambiente. As dificuldades analíticas de
trabalhar com matrizes ambientais complexas, como é o caso dos efluentes, é bem
conhecida, não sendo diferentes para os resíduos hospitalares líquidos.
Figura 6. Fatores relacionados à concentração ambiental de citostáticos
Fonte: Zhang et al., 2013.
A principal entrada de fármacos no meio ambiente está relacionada com os
esgotos domésticos, sendo que os efluentes hospitalares também contribuem
29
significativamente para este processo. Estes problemas seriam resolvidos através da
implantação de um sistema avançado de tratamento de efluentes. No Brasil,
segundo as legislações CONAMA 357/2005 e 430/2011, os efluentes hospitalares
devem ser submetidos a algum tratamento específico ou então expurgados na rede
coletora de esgotos, onde certamente serão submetidos aos sistemas convencionais
de tratamento de efluentes, descritos como ineficientes para estes contaminantes
(HALLING-SORENSEN et al., 1998; HIRSCH et al., 1999; MIÈGE et al., 2008). O
descarte na rede coletora de esgotos é predominante em todo o território nacional,
isso quando os efluentes não são diretamente descartados em corpos hídricos
receptores, de forma ilegal (VECCHIA et al., 2009; DORION et al., 2012).
Assim, alguns fatores relacionados à poluição por fármacos residuais são
considerados pontos-chave. Entre eles encontram-se o aumento da resistência
bacteriana, para o caso dos antibióticos, e o potencial carcinogênico dos fármacos
citostáticos, além da ecotoxicidade intrínseca relacionada a cada composto. Estes
fatores serão melhores abordados na sequência deste trabalho.
2.2
Efluentes Hospitalares
O consumo de água nos hospitais varia entre 400 e 1200 litros por dia, por
leito (GAUTAMA et al., 2007). Este consumo é elevado em relação à média de uma
família, que fica em torno de 100 litros por habitante/dia, contribuindo para a geração
de grandes volumes de efluentes nestas instituições (GAUTAMA et al, 2007;
EMANNUEL et al, 2009).
Efluentes hospitalares são considerados misturas complexas e com elevada
diversidade de microrganismos patogênicos (NUÑEZ & MORETTON, 2007;
CHAGAS et al., 2011). Nos serviços de saúde, todas as atividades desenvolvidas
resultam na geração de diferentes tipos de resíduos, sólidos e líquidos. O impacto
que estes resíduos vão causar no meio ambiente, depende basicamente da forma
como os mesmos são gerenciados no interior e fora da instituição. Alguns resíduos
farmacêuticos (um dos tipos gerados nas unidades hospitalares) contêm substâncias
biologicamente ativas. Assim, águas residuárias de hospitais contém uma variedade
30
de substâncias orgânicas tóxicas, como os fármacos residuais citados, além de seus
metabólitos, radionuclídeos, solventes e uma ampla gama de desinfetantes
utilizados nos diferentes setores (KAJITVICHYANUKUL & SUNTRONVIPART,
2006). Alguns efluentes podem conter derivados clorados, fenólicos e sintéticos,
muitas vezes utilizados na assepsia do ambiente hospitalar. Além disso, a microbiota
hospitalar é muito abrangente, podendo-se considerar que a simples análise dos
coliformes fecais pode não fornecer um resultado representativo da real flora
microbiana do efluente (NUNEZ & MORETTON, 2007; CHAGAS et al., 2011). Ainda,
a constituição genética destes microrganismos pode ser alterada por meio dos
efeitos diretos e indiretos das substâncias constituintes dos efluentes hospitalares,
levando
ao
aparecimento
de
bactérias
multiresistentes
aos
antibióticos
(HAWKSHEAD, 2008; DODD, 2012).
Devido à diversidade dos poluentes possivelmente presentes em efluentes
hospitalares, o contato destes com os organismos presentes nos ecossistemas
aquáticos se caracteriza como um risco para os ambientes naturais, ameaçando o
equilíbrio ecológico (WÜRGLER & KRAMERS , 1992; POPOWSKA et al., 2010),
assim,
efluentes
hospitalares,
mesmo
em
pequenas
quantidades,
são
potencialmente perigosos para o meio ambiente. Ademais, pode-se dizer que
organismos
aquáticos,
por
exemplo,
respondem
negativamente
a
baixas
concentrações de muitas substâncias frequentemente encontradas em efluentes
provenientes de serviços de saúde (FERRARI et al., 2004). A ineficiência dos
sistemas de tratamento microbiológicos nas ETE’s hospitalares está relacionada
com
os
efeitos
adversos
dos
contaminantes
sobre
as
comunidades
de
microrgansmos encarregados da degradação dos resíduos.
Com
relação
às
características
(parâmetros
globais)
dos
efluentes
hospitalares, estes são enormemente variáveis, dificultando a expressão de valores
aproximados mesmo para os parâmetros mais fundamentais. Barceló et al. (2012)
revisaram a variabilidade quantitativa de alguns parâmetros físicos, químicos e
microbiológicos em efluentes hospitalares e esgotos urbanos (Tabela 1).
31
Tabela 1. Intervalo da variabilidade das concentrações de alguns parâmetros físicos,
químicos e microbiológicos em efluentes hospitalares e seus correspondentes
valores médios entre colchetes.
Fonte: Barceló et al. (2012)
Parâmetro
Efluente Hospitalar
Esgoto Urbano
pH
6,3 – 9,2 [8]
7,5-8,5
Condutividade, µS.cm-1
297 – 1000 [850]
420 – 1340
Sólidos Suspensos (SS), mg.L-1
120 – 400 [160]
120 – 350
Sólidos Totais Voláteis/SS
0,45 – 0,75 [0,58]
0,65 – 0,80
DQO, mg.L-1
450 – 2300 [650]
500 – 600
DBO5, mg.L-1
150-603 [200]
100 – 400
NKT, mg.L-1
30 – 100 [45]
20 – 70
NH4+, mg.L-1
10 – 68 [30]
12 – 45
P Total, mg.L-1
0,2 – 8 [5]
4 – 10
Cloretos, mg.L-1
80 – 400 [220]
30 – 100
Óleos e graxas, mg.L-1
13 – 60 [25]
50 – 150
Detergente Total*, mg.L-1
3 – 7,2 [4,5]
4–8
Desinfetantes, mg.L-1
2 – 200
-
DQO/DBO5
1,4 – 6,6 [2,5]
1,7 – 2,4
Coliformes Totais,
106 – 109 [106]
107 - 108
Coliformes Fecais,
103 – 107 [105]
106 – 107
Escherichia Coli, NMP.mL-1
103 – 106 [104]
106 – 107
Streptococcus, NMP.mL-1
106 – 109 [106]
103 - 105
* Iônicos e não-iônicos
A complexidade para prever alguns parâmetros é reforçada quando
verificamos que alguns resultados encontrados neste trabalho são diferentes,
mesmo que de maneira sutil, dos apresentados por Barceló et al. (2012). Assim, a
escolha de um tratamento ideal para os efluentes hospitalares deve levar em conta
32
as diferentes complexidades dos sistemas de atendimento a saúde, os quais
possuem efluentes com características distintas, principalmente relacionadas a
compostos mais específicos (e não por parâmetros globais), como é o caso dos
fármacos citostáticos.
2.3
Citostáticos
Até o momento, o impacto ambiental relacionado aos citostáticos não é
categoricamente afirmado por nenhum pesquisador, embora de elevado potencial.
Fármacos citostáticos são aqueles que impedem a multiplicação e o crescimento
das células. São preparados para danificar e/ou inibir a síntese de ADN, além de
interromper a replicação celular. Eles agem de forma não seletiva em todas as
células em crescimento e também possuem potencial carcinogênico, o que implica
que nenhum valor de menor concentração de efeito pode ser estimado. A hipótese é
que, devido ao seu modo de ação, praticamente todos os organismos eucarióticos
são vulneráveis a estas substânicas, sendo a teratogenicidade a maior preocupação
em baixos níveis (ng.L-1)(JOHNSON et al., 2008). Por outro lado, quando
comparados a outros fármacos, sua utilização ainda é pequena, mas tendendo ao
crescimento à medida que a população aumenta e que o acesso aos tratamentos se
popularizam.
Citostáticos são utilizados na quimioterapia de pacientes com câncer, doença
que ocasiona a multiplicação de forma incontrolada das células e propagação de
forma anormal no interior do corpo. A quimioterapia é uma das principais formas de
tratamento de neoplasias. Os agentes quimioterápicos (fármacos citostáticos) são
classificados de acordo com o seu mecanismo de ação, divididos em oito grupos, ou
seja:
inibidores
da
síntese
de
ADN,
inibidores
de
angiogênese,
intercaladores/reticulantes de ADN, reguladores da transcrição ADN-ARN, inibidores
de enzimas, reguladores de genes, inibidores de microtúbulos e outros agentes
antitumorais (ALMEIDA et al., 2005).
33
Com relação à administração em pacientes, as doses geralmente são
calculadas com base na área de superfície do corpo, expressa em mg.m -2. Após a
injeção destes fármacos, ocorrem inúmeras biotransformações em sua estrutura
química (transformações metabólicas), que podem conduzir a formação de
subprodutos ativos ou inativos. As propriedades dos metabólitos estão associadas
as suas características físico-químicas, no entanto estas substâncias são
geralmente mais solúveis em água e consequentemente apresentam maior
mobilidade no meio aquático. Alguns citostáticos são excretados na sua forma
inalterada. Ainda, há poucas informações sobre a degradação e persistências destas
substâncias, sendo que os estudos demonstram baixa biodegradabilidade e elevada
estabilidade ambiental (HALLING-SORENSEN et al., 1998).
Devido à falta de dados físico-químicos para prever a dinâmica dos
citostáticos em águas naturais, juntamente com seus metabólitos, a obtenção de
dados relativos à ecotoxicidade destas substâncias são cruciais na determinação
dos impactos destes sobre os ecossistemas.
A maior parte dos citostáticos é administrada via intravenosa em
estabelecimentos de saúde. No entanto, alguns destes fármacos são administrados
de forma intramuscular, intraóssea, intralesional, tópica ou oral. Cerca de 75% dos
pacientes em tratamento contra o câncer são medicados e então liberados
(JOHNSON et al., 2008; MAHNIK et al., 2007), não ficando hospitalizados, o que
leva a liberação do fármaco e seus subprodutos nos sistemas de coleta de esgotos
urbanos, quando existentes. Nesta guisa, Besse et al. (2012) estimaram a
contribuição de cada tipo de efluente para a contaminação ambiental por
citostáticos, com base nos dados do consumo nacional francês, conforme Figura 7.
34
Figura 7. Chegada dos citostáticos às ETE’s urbanas: contribuição dos efluentes
hospitalares e dos esgotos das cidades.
Fonte: Besse et al., 2012
Este trabalho acima referenciado mostra que do total de fármacos citostáticos
produzidos e entregues aos hospitais e população, estes chegam às ETE’s (e
consequentemente ao meio ambiente), majoritariamente através da poluição difusa
(86,2%). 13,8% dos citostáticos que chegam às ETE’s são devido aos efluentes
hospitalares. De qualquer forma, a introdução de compostos genotóxicos no
ambiente é um fator de risco elevado, podendo ocasionar danos genéticos em
organismos não-alvo, com potencial de ocasionar severas mudanças nos
ecossistemas (WÜRGLER & KRAMERS, 1992). Assim, sistemas de tratamento
avançados devem ser planejados juntos as ETE’s urbanas, além dos ambientes
hospitalates.
Com relação aos citostáticos estudados neste trabalho (i.e., doxorrubicina,
metotrexato e docetaxel) o metabolismo deles no corpo humano é variável, mas
segundo a literatura (MULROY, 2001; JOHNSON et al., 2008), entre 10 e 90% da
dose dos fármacos, incluindo os citostáticos, utilizada por pacientes pode ser
excretada inalterada no meio ambiente. Entre estes fármacos, a doxorrubicina e o
35
metotrexato são tradicionalmente utilizados em todo o mundo frente ao amplo
espectro de neoplasias passíveis de serem combatidas por estas drogas.
Por constituirem alguns dos fármacos citostáticos mais utilizados, algumas
pesquisas analisaram a presença de metotrexato e doxorrubicina em matrizes
aquosas, além da sua ecotoxicidade. Segundo Kosjek & Heath (2011), a
determinação analítica da doxorrubicina é dificultada pela tendência desta
substância em se adsorver a superfícies (e.g., plásticos e vidro). Mesmo assim, após
monitoração durante dois anos, pesquisadores encontraram entre 0,26 e 1,35 µg.L-1
de doxorrubina em um efluente hospitalar (MAHNIK et al., 2007; LENZ et al., 2007).
Martin et al. (2011) utilizando cromatografia líquida acoplada a espectrometria de
massas triplo quadrupolo, encontraram doxorrubicina em concentrações acima de
14 ng.L-1 em efluentes, mostrando uma redução insignificante após tratamento
convencional do efluente.
A doxorrubicina é amplamente utilizada devido ao seu amplo espectro de
ação, como leucemias agudas, linfomas e enorme variedade de tumores sólidos.
Com relação a sua ecotoxicidade, Zounková et al. (2007) determinaram a CE50 para
Daphnia magna, chegando ao valor de 2 mg.L-1. Neste mesmo estudo, entre cinco
citostáticos pesquisados, a doxorrubicina foi o composto mais genotóxico para
bactérias e leveduras. Este composto é um antineoplásico com ação antibiótica
pertencente ao grupo das antraciclinas. Trata-se de um produto natural produzido
por fungos da espécie Streptomyces peucetius ou Streptomyces galilaeus. Ela
danifica o ADN através de intercalação, quelação de íons metálicos ou por geração
de radiciais livres. Um dos metabólitos conhecidos da doxorrubina, o doxorrubicinol,
ainda não foi estudado em matrizes ambientais, portanto não se conhece seus
efeitos quanto à toxicidade mas deve se tratar de uma substância com elevado
potencial toxico, devido a sua origem.
Durante a quimioterapia, a doxorrubicina também pode ser associada ao
citostático docetaxel para o tratamento do câncer de mama (NUSSBAUMER et al.,
2011). O docetaxel é um análogo semi-sintético do paclitaxel, com as mesmas
propriedades terapêuticas e toxicológicas. É derivado do Teixo (Taxus baccata) e
pertence ao grupo de antineoplásicos chamados de taxóides. Trata-se de um
alcaloide vegetal que age pela inibição do fuso mitótico, dimerização da tubulina e
36
estabilização dos túbulos, resultando na perda de viabilidade celular (ALMEIDA et
al., 2005). É indicado para o tratamento de câncer de mama avançado
(concomitantememte com a doxorrubicina), ou em casos de metástase em outros
tipos de tumores. Possui baixa solubilidade em água, sendo provavelmente este o
motivo, associado ao pequeno esforço dos pesquisadores até o momento, por não
ter sido encontrado em efluentes ou corpos aquáticos, assim como não se
conhecem informações ecotoxicológicas desta substância.
Com relação ao metotrexato, este foi encontrado em um efluente hospitalar
na concentração de 1 µg.L-1 (AHERNE et al., 1985) em uma época que pouco se
preocupava com a presença destas substâncias em águas. Castiglioni et al. (2005)
quantificaram metotrexato em ETE’s da Itália na concentração de 12,6 ng.L -1, via
CLAE-EM/EM.
Com um olhar voltado para os efeitos ecotoxicológicos, Henschel et al. (1997)
fez uma extensa avaliação do metotrexato. Daphnia magna sofreu efeito nocivo em
mais de 50% dos indivíduos expostos à concentrações maiores que 1000 mg.L-1.
Algas e peixes apresentaram CE50 sempre maiores do que 10 mg.L-1. Estes
resultados tendem para a baixa toxicidade aguda de diferentes organismos-teste ao
metotrexato. Em um hospital na China, 65 amostras de efluente foram analisadas,
sendo a concentração média de metotrexato encontrada de 17 ng.L -1 em 21,5% das
amostras analisadas (com concentração máxima de 4689 ng.L-1), mas cerca de 80%
das vezes que o metotrexato foi encontrado, ele estava com uma concentração
aproximada de 245 ng.L-1 (YIN et al., 2010).
Segundo Kosjek & Heath (2011), o metotrexato está entre os quatro
citostáticos mais utilizados no mundo e é um análogo do ácido fólico. Trata-se de um
agente antimetabólico que bloqueia bioquimicamente a síntese do ADN (ALMEIDA
et al., 2005). É amplamente utilizado com terapia de manutenção para leucemia
linfoblástica infantil aguda, para coriocarcinomas, linfomas não-Hodgkin e vários
tumores sólidos. Também é administrado para o tratamento de doenças autoimunes, como psoríase, artrite reumatoide e lúpus (NUSSBAUMER et al., 2011).
Quando altas doses de metotrexato são aplicadas durante a quimioterapia, há
formação de um subproduto metabólico, o 7-hidroximetotrexato (KIFFMEYER et al.,
1998). Até o momento, este é o produto mais conhecido proveniente da
37
biotransformação deste citostático, o qual não é biodegradável. Atualmente este
metabólito ainda não foi determinado no meio ambiente, mas devido ao potencial de
ser encontrado até mesmo em quantidades maiores que o metotrexato, estudos
devem ser conduzidos neste sentido, possibilitando a quantificação de seu impacto
ambiental potencial.
Além dos citostáticos, outra classe de fármacos que perturba/modifica o
material genético dos organismos são os antibióticos. Estas duas classes de
fármacos tem o potencial de levar os microorganismos a se tornarem resistentes
frente a estes compostos, desde que seus sistemas metabólicos consigam
detoxificar estes medicamentos. Este aspecto importante da resistência microbiana
aos antibióticos é tratada a seguir.
2.4
Resistência Bacteriana aos Antibióticos (ou outro produto qualquer)
A resistência bacteriana está relacionada principalmente ao uso irracional de
antimicrobianos na atenção primária em saúde e no ambiente hospitalar. A principal
implicação econômica da resistência antimicrobiana é a diminuição da eficácia do
tratamento com antibióticos, exigindo o uso de fármacos cada vez mais onerosos
que são praticamente inacessíveis para muitos programas de atenção primária em
saúde (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2006). O consumo de antibióticos,
entretanto, certamente continuará crescendo. O resultado da presença de
concentrações maiores de antibióticos nos sistemas de esgotos irá acarretar em
impactos significativos no meio aquático.
Segundo HALLING-SORENSEN (1998), três fatores vêm contribuindo para o
desenvolvimento da resistência bacteriana: i) mutação em genes comuns que
estenderam seus espectros de resistência, ii) transferência horizontal de genes
resistentes entre diversos microrganismos, e iii) aumento das pressões de seleção
(concentrações significativas de antibióticos) que influenciam no desenvolvimento de
organismos resistentes. Com relação à pressão na seleção de bactérias sensíveis a
certo tipo de antibiótico, pode existir uma bactéria que seja resistente a ele por
mutação natural. Assim, o antibiótico com sua ação nociva sobre as bactérias
38
sensíveis presentes no meio irá proporcionar que somente a bactéria resistente
persista, promovendo a seleção desta bactéria resistente.
Mais especificamente, são cinco os mecanismos que viabilizam a resistência
bacteriana, conforme Figura 8.
Observando a Figura 8, pode-se perceber que estes mecanismos podem
evoluir espontaneamente ou ainda serem adquiridos através da THG de outras
bactérias (TAYLOR et al., 2011; JUHAS et al., 2009).
Figura 8. Mecanismos de resistência bacteriana: (1) exclusão da toxina pela
membrana celular, (2) modificação intracelular e/ou desativação do antimicrobiano,
(3) extrusão do antimicrobiano, (4) redução da sensibilidade da célula alvo e (5)
sequestro intracelular. Ácidos nucleicos exógenos podem ser obtidos através de um
vírus (A, transdução), diretamente do meio ambiente como ADN nu (B,
transformação) ou através do contato célula-célula com outras bactérias (C,
conjugação). Antimicrobianos: ampicilina (AMP), coumermicina (CMA), Rifampicina
(RIF), Tetraciclina (TET) e Vancomicina (VAN).
Fonte: Taylor et al., 2011.
Segundo Taylor et al. (2011), uma vez que um organismo se torna resistente
em um ambiente onde esta resistência o leva a uma vantagem seletiva, a expansão
clonal do organismo resistente pode ocorrer. Ainda, segundo estes mesmos autores,
a resistência aos antimicrobianos não ocorre apenas devido à exposição dos
microrganismos a estas substâncias em clínicas, comunidades e sistemas agrícolas,
mas também pode ocorrer através da evolução dos mecanismos obtida através do
contato com outros poluentes ou contaminantes ambientais, que por oportunidade
conferiram resistência também aos antimicrobianos.
39
Os plasmídeos são reconhecidamente os principais envolvidos na THG
(Figura 8), a qual é considerada como a razão primária no desenvolvimento da
resistência aos antibióticos (KOONIN et al., 2001; OECD, 2010). Segundo Kruse &
Sørum (1994), a conjugação e a transferência de plasmídeos de resistência é um
fenômeno que é relativo ao meio ambiente e pode ocorrer entre cepas bacterianas
de origem humana, animal e de peixes, mesmo na ausência de antibióticos. Assim,
na presença do antimicrobiano, o potencial para ocorrer este fenômeno é mais
pronunciado.
A seleção ambiental é suceptível de ser a força dominante para a composição
genética das comunidades bacterianas (ZHANG et al., 2009). Esta pressão seletiva
atua como um acelerador dos processos de THG, a qual ocorre devido a
persistência de alguns produtos no meio ambiente que favorecem este processo,
como é o caso dos antimicrobianos residuais (VAN ELSAS & BAILEY, 2002). Assim,
a contaminação do meio ambiente por agentes bacterianos patogênicos resistentes
a agentes antimicrobianos é uma ameaça real, não apenas como um originador de
doenças, mas também como uma fonte a partir da qual os plasmídeos podem
facilmente se espalhar para outros patógenos de diversas origens (KRUSE &
SØRUM, 1994; DODD, 2012), podendo assim ameaçar a saúde humana (TERNES,
1998) por acarretar em dificuldades no manejo de infecções, além de aumentar os
custos dos sitemas de saúde e dos hospitais.
Portanto, é necessária uma remoção eficiente desses fármacos residuais e
material genético que pode levar a resistência bacteriana, principalmente em
efluentes domésticos e de serviços de saúde.
2.5
Sistemas de Tratamento de Efluentes
Devido à complexidade dos efluentes em geral, entre eles os hospitalares, e a
diversidade de compostos possivelmente presentes nestes resíduos, cada estudo de
viabilidade de tratamento deve ser realizado de maneira isolada, ou seja, os
processos desenvolvidos devem ser direcionados a um tipo particular de efluente
uma vez que não existem procedimentos padronizados que possam ser aplicados
40
no tratamento de um grande número de efluentes. Em função deste fato, muitas
alternativas têm sido estudadas (PRÜSS et al., 1999). De maneira geral, procura-se
uma alternativa que permita não somente a remoção de substâncias alvo, mas sim a
completa mineralização. Neste sentido, Freire et al. (2000) apresentam um
fluxograma com algumas técnicas utilizadas para o tratamento de efluentes,
conforme Figura 9.
TRATAMENTO DE EFLUENTES
INDUSTRIAIS
FÍSICO
BIOLÓGICO
Aeróbio
Anaeróbio
Enzimático
QUÍMICO
Decantação
Filtração
Incineração
POA
Fotocatálise
Ozonização
Eletroquímico
Adsorção
Fenton
Figura 9. Sistemas de tratamento utilizados nos diferentes tipos de efluentes,
podendo incluir os hospitalares.
Fonte: Freire et al. (2000)
Excluindo-se os sistemas de filtração e decantação que dificilmente serão
desnecessários ou substituídos, principalmente quando relacionados aos efluentes
brutos, começam as dúvidas quanto ao tratamento a ser escolhido para uma matriz
ambiental específica, como é o caso dos efluentes hospitalares.
O tratamento biológico de matrizes contaminadas é frequentemente a
alternativa mais econômica quando comparado com outras opções de tratamento. A
habilidade de um composto em submeter-se à degradação biológica é dependente
de uma variedade de fatores, tais como sua concentração, estrutura química,
disponibilidade e toxicidade. O pH ou a presença de compostos inibidores também
pode afetar a degradação biológica.
Embora muitas moléculas orgânicas sejam
degradadas prontamente, muitas outras moléculas orgânicas sintéticas e naturais
são biorrecalcitrantes (ADAMS et al., 1994).
Conforme já mencionado, o processo de tratamento de qualquer tipo de
amostra depende de suas características próprias. A Figura 10 apresenta um
esquema que pode auxiliar o planejamento do tratamento de tipos diferentes
41
amostras, baseado na biodegradabilidade do efluente (biodegradável, parcialmente
biodegradável e não biodegradável).
Efluente
Não
Biodegradável
Fracamente
Biodegradável
Biodegrabilidade
Processos
Químicos
Alto
Não
Biodegradável
Sim
Processos de
Tratamento
Biológico
Nível de
Orgânicos
Baixo
Processos de
Tratamento
Químico
Figura 10. Estratégias para a combinação entre tratamentos químicos e biológicos.
Fonte: Adaptado de Al-Momami (2003).
Uma amostra biodegradável pode ser tratada diretamente pelo processo
biológico, assim, este aspecto é interessante do ponto de vista econômico, visto que
os custos dos processos biológicos são muito menores (SCOTT & OLLIS, 1996;
MATTHEWS et al., 1991). Os custos nos investimentos para a implantação dos
processos biológicos são aproximadamente cinco a vinte vezes menores do que
para os processos químicos, como ozonização, enquanto que os custos para
operação são cerca de três a dez vezes menores (MARCO et al., 1997).
Para amostras parcialmente biodegradáveis, existem duas alternativas
possíveis e a seleção de uma ou outra novamente depende das características da
amostra. A amostra que contém elevado nível de matéria orgânica pode ser
inicialmente levada ao tratamento biológico para eliminação de todos os compostos
biodegradáveis, sendo então posteriormente tratada por processos químicos. Na
segunda etapa os compostos biorecalcitrantes podem ser mineralizados totalmente
ou oxidados a produtos mais biodegradáveis. Neste caso, novamente é empregado
o processo biológico para finalização do tratamento. Com respeito às amostras não
biodegradáveis, uma solução potencialmente viável é a integração dos processos de
42
tratamento químicos e biológicos (BELTRÁN et al, 1997; MARCO et al., 1997;
HEINZLE et al., 1996; TAKAHASHI et al., 1994).
Em um processo químico inicial, os compostos tóxicos ou não biodegradáveis
seriam eliminados até o ponto onde não existisse nenhuma inibição devido à
toxicidade ou a não biodegradabilidade. Um segundo passo é o tratamento
biológico. Vários estudos demonstraram a eficiência na oxidação de compostos
orgânicos poluentes através da integração dos processos químicos e biológicos
(LEDAKOWICS & GONERA, 1999; BERTO et al., 2009; AL-MOMAMI, 2003; SCOTT
& OLLIS, 1996).
Os efluentes hospitalares, em função de sua relação DBO/DQO, tendem a ser
biodegradáveis, no entanto apresentam o problema dos fármacos residuais, os quais
não são mensurados por estes parâmetros globais.
É importante salientar também que, dependendo do modo de tratamento
escolhido, baseado nas Figuras 9 e 10, será necessário mais um tratamento
adicional, para desinfecção e degradação do material genético presente nos
efluentes que são o alvo deste estudo, além dos possíveis fármacos residuais.
Levando em consideração que cada sistema de tratamento possui alguma
potencialidade mais acentuada, deve-se lembrar que provavelmente este será
ineficiente em relação a uma ou mais propriedades dos efluentes. Neste sentido,
sistemas de tratamento combinados podem ser mais apropriados para alguns tipos
de resíduos, como é o caso da sonólise/ozonólise aqui proposta.
Com relação aos sistemas de tratamento químicos, estes ainda são fontes de
extensivas pesquisas aplicadas a diferentes tipos de resíduos, necessitando
otimização em quase todos os processos. Mais recentemente, alguns sistemas de
tratamento também são descritos, além daqueles apontados na Figura 9,
constituindo-se como alternativas para o tratamento de efluentes. Entres estes é
possível citar as reações de catálise heterogênea, a aplicação de ultrassom
(sonólise) e a oxidação por ar úmido. Outras técnicas, embora menos convencionais
e em evolução, incluem as radiações ionizantes, microondas, plasma pulsante e o
reagente ferrato. Todos estes processos citados fazem parte dos Processos
Oxidativos Avançados (POA’s), os quais serão abordados na sequência,
principalmente quanto à ozonólise e a sonólise.
43
2.6
Processos Oxidativos Avançados (POA’s)
Nos últimos 30 anos, as pesquisas relativas ao desenvolvimento dos
Processos de Oxidação Avançada foram imensas especialmente por dois
motivos: a diversidade de tecnologias envolvidas e as áreas de potencial aplicação.
Dentro deste contexto, a remediação de resíduos líquidos foi certamente o maior
foco das pesquisas sobre a aplicação dos POA’s.
Os POA’s têm se apresentado como uma alternativa eficiente para o
tratamento de efluentes utilizando reações de oxidação iniciadas por radicais
hidroxilas (HO•), deixando estas técnicas com elevado potencial para levar a
completa destruição de contaminantes orgânicos, convertendo-os em dióxido de
carbono, água e sais inorgânicos (ANDREOZZI et al., 1999; BADAWY et al., 2009;
HOIGNÈ & BADER, 1976; KLAVARIOTI et al., 2009; LEGRINI et al., 1993; USEPA,
1998). Os POA’s vêm sendo muito estudados e empregados, por exemplo, no
tratamento de efluentes têxteis (RADETSKI et al., 2002), inclusive em escala piloto
(SOMENSI et al., 2010). Estes processos também vêm sendo utilizados no
tratamento de efluentes hospitalares (BERTO et al., 2009; MARTINS et al., 2009),
buscando, entre outros, a desinfecção (CHIANG et al., 2003; ÖNCÜ et al., 2011).
Assim como outros tipos de tratamento, o sucesso depende da matriz
ambiental a ser tratada. Neste sentido, pode-se aplicar um método isoladamente ou,
em muitos casos, proporcionar a associação de duas ou mais técnicas de oxidação
avançada no intuito de obter uma maior eficiência na remoção de resíduos
recalcitrantes aos tratamentos convencionais, como é o caso de alguns fármacos e
seus metabólitos, além do material genético bacteriano, o qual responsável pelo
aumento da resistência destes microrganismos no meio ambiente. Pode-se também
empregar um processo de oxidação avançada como pré-tratamento para converter
compostos
inicialmente
biorecalcitrantes
em
compostos
mais
facilmente
biodegradáveis (KLAVARIOTI et al., 2009), conforme esquema apresentado na
44
Figura 9. Nos últimos anos, as pesquisas relacioanadas aos POA’s vêm se
intensificando com relação à remediação de efluentes líquidos contaminados por
fármacos, seja de maneira isolada ou combinada (VASCONCELOS et al., 2009;
BADAWY et al., 2009; BERTO et al., 2009; MARTINS et al., 2009; GROS et al.,
2010; NADDEO et al., 2009b; VERLICCHI et al., 2010). Martins et al. (2009) estudou
a degradação da Amoxicilina em efluente hospitalar, através do processo fotoFenton, além da redução da demanda química de oxigênio e da toxicidade, com
resultados promissores mas ainda incompletos sobre o tratamento deste composto.
Conforme Badawy et al. (2009), o processo Fenton-biológico, degradou grande parte
dos fármacos cloranfenicol, diclofenaco, ácido salicílico e paracetamol, além da
redução de outros parâmetros físico-químicos. Ainda, outros autores aplicaram a
ozonólise na degradação de fármacos residuais e matrizes aquosas (IKEHATA et
al., 2006; VASCONCELOS et al., 2009), sendo este um dos POA’s mais utilizados
até hoje. Os métodos baseados na oxidação química, quando desenvolvidos
apropriadamente, fornecem a completa eliminação dos poluentes, enquanto que
aqueles que apenas fazem uso dos processos de separação de fase deixam como
conseqüência o problema da disposição final dos resíduos (FERNANDEZ-ALBA,
2002).
Embora façam uso de diferentes sistemas de reações, os POA’s
caracterizam-se por possuírem um mesmo aspecto químico: a produção de radicais
hidroxila (•OH). A versatilidade destas técnicas é também aumentada pelo fato das
diferentes possibilidades de produção do radical •OH, dependendo da especificidade
do tratamento necessário (USEPA, 1998; LEGRINI et al., 1993). O potencial de
oxidação do radical hidroxila é elevado quando comparado a outros agentes
oxidantes, conforme Tabela 2, o que justifica parte da eficiência destas técnicas.
45
Tabela 2. Potencial de oxidação de diferentes agentes oxidantes.
Fonte: NOGUEIRA & GUIMARÃES, 1998.
Espécie
Potencial de Oxidação (V)
Flúor
3,03
Radical hidroxila
2,80
Ozônio
2,07
Peróxido de hidrogênio
1,78
Permanganato
1,68
Ácido hipobromoso
1,59
Dióxido de cloro
1,57
Ácido hipocloroso
1,49
Cloro
1,36
Bromo
1,09
Iodo
0,54
Outro aspecto importante a considerar na aplicação dos POA’s é a carga de
matéria orgânica presente na amostra, em geral expressa como DQO (demanda
química de oxigênio). Conforme Andreozzi et al. (1999), amostras com valores de
DQO abaixo de 10.000 mg.L-1 podem ser tratadas com estas técnicas. A Figura 11
apresenta diferentes tratamentos segundo o conteúdo de DQO.
Oxidação
Supercrítica
Processos de
Oxidação Via
Úmida
Processos de
Oxidação
Avançada
10000 mg.L-1
150000 mg.L-1
Incineração
500000 mg.L-1
-1
Concentração de poluentes orgânicos (mg.L )
Figura 11. Tecnologias mais recomendadas para tratamento de poluentes segundo
o conteúdo de DQO.
Fonte: ANDREOZZI et al., 1999.
46
Mesmo assim, elevadas quantidades de matéria orgânica em suspensão
geralmente são removidas através de decantação/coagulação, além do tratamento
biológico.
Conforme anteriormente mencionado, a ozonólise constitui-se em uma das
técnicas mais empregadas até o momento. Quanto à associação de diferentes
métodos, alguns trabalhos (NADDEO et al., 2009b; NING et al., 2009; SONG et al.,
2007) apontam para resultados promissores quando a ozonólise é associada a
aplicação de ultrassom de baixa frequência, fenômeno conhecido por sonólise, o
qual também leva a um aumento na geração de radicais hidroxilas, além de outros
fenômenos que serão melhor abordados a seguir. O ozônio associado à aplicação
de ultrassom pode causar um efeito sinérgico positivo, reduzindo a quantidade
necessária de reagentes e até mesmo diminuir o custo operacional do tratamento de
águas. As técnicas são descritas a seguir.
2.6.1 Ozonólise
Em condições ambientais, o ozônio existe na forma de um gás incolor e de
odor característico, detectável em concentrações tão baixas quanto 0,02 a 0,05 ppm.
O gás ozônio é altamente corrosivo e tóxico. O ozônio pode reagir em soluções
aquosas de duas maneiras distintas (HOIGNE & BADER, 1976):
- Oxidação direta dos compostos por ação do ozônio molecular (O3(aq));
- Oxidação dos compostos via radical hidroxila, produzido durante a decomposição
do ozônio.
A Figura 12 exemplifica os dois mecanismos de reação.
(a)
(b)
Figura 12. Exemplo de reação direta (a) do ozônio com a matéria orgânica e
exemplo de reação indireta (b).
47
Apenas a segunda forma de oxidação é considerada como pertencente ao
grupo dos Processos de Oxidação Avançada, mesmo que em algumas
circunstâncias os dois modos de atuação deste gás estejam presentes
simultaneamente. Os dois mecanismos de oxidação competem entre si pelo
substrato (isto é, pelos compostos a oxidar). A oxidação direta com ozônio em meio
aquoso é relativamente lenta (comparada à oxidação via radical livre), mas a
concentração do ozônio aquoso é relativamente elevada. Por outro lado, apesar da
velocidade de reação do radical hidroxila ser muito elevada, a concentração dos
radicais sob circunstâncias normais de ozonização é relativamente pequena
(GOGATE & PANDIT, 2004). O pH tem influência direta sobre a estabilidade do
ozônio (GOGATE & PANDIT, 2004; IKEHATA et al., 2006):
- em circunstâncias ácidas, a oxidação direta com ozônio molecular é de importância
primária;
- em circunstâncias de pH elevado, é favorecida a produção do radical livre hidroxila.
Devido à alta instabilidade da molécula de ozônio, esta deve ser gerada no
ponto de aplicação. É geralmente formado pela combinação de um átomo de
oxigênio com uma molécula de oxigênio. Esta reação é muito endotérmica e requer
considerável fonte de energia (USEPA, 1999).
Dentre os diferentes processos utilizados para a geração de ozônio, o mais
difundido é o método de descarga por efeito corona, sendo atualmente utilizado em
praticamente todos os ozonizadores disponíveis comercialmente (ALMEIDA et al.,
2004). Através deste método, o ozônio é gerado pela passagem de ar ou oxigênio
puro entre dois eletrodos submetidos a uma elevada diferença de potencial.
Os principais parâmetros que influenciam a produção de ozônio são a tensão
e a freqüência da corrente elétrica, assim como a qualidade e a pureza do gás
utilizado. As freqüências variam de 60 a 1000 Hz. As altas freqüências apresentam
melhores rendimentos e são aplicadas nas instalações que requerem produções
elevadas. As tensões usualmente aplicadas variam de 20 000 a 30 000 Volts (a 60
Hz) e de 10 000 a 20 000 Volts (a 400 Hz). Para efeito de economia, o ar é o mais
utilizado como vetor de oxigênio, mas a concentração de ozônio na corrente gasosa
não ultrapassa 40 g.m-3 sendo uma concentração ótima econômica situada em torno
de 20 g.m-3. Com oxigênio puro, as concentrações econômicas são da ordem de 60
48
a 70 g.m-3, mas é possível atingir até 130 g.m-3, sempre nas condições normais de
temperatura e pressão (CHERNICHARO et al., 2001).
2.6.2 Ultrassom (Sonólise)
Ultrassom é o nome dado às ondas sonoras com freqüências superiores as
ondas audíveis pelo homem, ou seja, maiores que 16 kHz. De maneira simplificada,
o ultrassom pode ser divido em dois tipos. Primeiro, ultrassom de baixa amplitude e
alta freqüência (entre 1 e 10 MHz) e segundo, ultrassom de alta amplitude e baixa
freqüência (entre 16 kHz e 1 MHz). Esta segunda classificação geralmente envolve
os efeitos da onda ultra-sônica no meio aplicado (LORIMER & MASON, 1987).
Através da Figura 13 pode-se relacionar a frequência do ultrassom em relação à
sensibilidade do ouvido humano.
FREQUÊNCIA DE SOM (Hz)
0
101
102
103
104
105
ONDAS MÉDIAS
216 Hz
GAFANHOTO 7kHz
OUVIDO HUMANO
16 Hz – 16 kHz
POTÊNCIA
20 kHz – 100 kHz
106
107
ONDAS DE RÁDIO
LIMITE DE AUDIÇÃO DO MORCEGO
70 kHz
ALTA FREQUÊNCIA
1 →
10 MHz
Figura 13. Região de frequência do som.
Fonte: Martines et al., 2000.
Transformações físicas e químicas podem ocorrer devido à interação de
radiação com a matéria. Assim, a produção de ultrassons em meio líquido é
baseada no processo de criar, aumentar e implodir cavidades de vapor e gases,
processo chamado de cavitação acústica. Na cavitação, durante a etapa de
compressão a pressão é positiva, enquanto que a expansão resulta em pressão
negativa, constituindo-se em um ciclo de compressão-expansão que gera as
cavidades (MARTINES et al., 2000). Num líquido com partículas sólidas dispersas,
os gases são adsorvidos nos poros das partículas, conforme Figura 14.
49
Figura 14. Pressão positiva (A), pressão negativa (B) e nucleação da cavidade
acústica (C).
Fonte: Martines et al., 2000.
Observando-se a Figura 14, na etapa de compressão (A) os gases ou
vapores, no interior da cavidade, são comprimidos para o interior da partícula, sendo
que na etapa de expansão (B) esses gases ou vapores são dirigidos para fora da
partícula. A cavidade aumenta de tamanho em direção ao interior do líquido, separase da partícula permanecendo um núcleo na cavidade (C). A origem da cavitação se
deve ao fato que, durante a expansão, os gases adsorvidos no líquido ao redor da
cavidade ou na interface, evaporam-se resultando na expansão da cavidade. Ciclos
periódicos de compressão e expansão causam aumento do tamanho da cavidade. A
cavidade ao atingir um tamanho crítico implode-se, liberando grande quantidade de
calor e pressão (MARTINES et al., 2000), fenômeno que pode produzir pressões
locais de até 1000 atm e temperaturas de 5000 K (FLINT & SUSLICK, 1991), num
curto período de tempo e em pontos localizados do líquido, mas podendo promover
a ativação de reações químicas como, por exemplo, a geração de radicais hidroxila
(sonólise), conforme equação 1 (WUNKANG & HOFFMANN, 1998).
H2O
•OH + H•
(1)
No entanto, além da sonólise, as elevadas pressões e temperaturas podem
ocasionar a degradação das substâncias orgânicas presentes nos efluentes,
50
realizando a remediação através de diferentes mecanismos (NADDEO et al., 2010;
NADDEO et al., 2009b; WEAVERS et al., 2000).
Com relação à associação do ultrassom a ozonólise, Naddeo et al. (2009b)
afirmam que a degradação provocada pelo ozônio é reforçada pela cavitação, o que
leva a produção de radicais livres adicionais, além daqueles que seriam gerados
normalmente pela ozonólise, fenômeno que, juntamente com as elevadas pressões
e temperaturas ocasionadas pelo colapso das bolhas de vapor, proporcionam uma
melhor eficiência no tratamento de efluentes. Assim, a associação ozônio/ultrassom
leva a uma sinergia positiva entre os processos, e.g. conforme equações 2 e 3
(WUNKANG & HOFFMANN, 1998), não se caracterizando pela simples soma das
eficiências das técnicas isoladas.
O2 + O (3P)
O3
O (3P) + H2O
(2)
•OH
(3)
Nesta guisa, a degradação de compostos orgânicos vem sendo testada pela
associação sonólise/ozonólise. Zhang et al. (2006) estudaram a degradação do
alaranjado de metila pela ação do ozônio com ultrassom, mostrando sinergia positiva
na destruição deste composto. Estes autores mostraram também que a taxa de
descoloração desta substância foi maior com o aumento da energia do ultrassom e
fluxo/concentração do ozônio. A molécula do alaranjado de metila apresentou
degradação preferencialmente via reação com ozônio molecular, o que foi
observado pela adição de um capturador de radicais hidroxila, o carbonato de sódio
(ZHANG et al., 2006), o que evidencia que a degradação com ultrassom associado
também é realizada pelos fenômenos relacionados a cavitação acústica e não
somente via radicais.
Poucos
fármacos
foram
estudados
quanto
à
degradação
por
sonólise/ozonólise. Naddeo et al. (2009b) estudaram a degradação do diclofenaco
por ozonólise, sonólise e também pelos métodos combinados. Os três tratamentos
apresentaram alguma eficiência na degradação deste fármaco, no entanto, a
combinação sonólise/ozonólise foi mais eficiente que os métodos isolados, após 40
minutos
de
tratamento,
resultados
que
seguem
as
tendências
até
aqui
apresentadas.
51
3.
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1
Sistema de Tratamento – Ozonólise e Ozonólise/Sonólise
As unidades fundamentais que constituem o sistema de tratamento de
efluentes estruturado neste trabalho são: um gerador de ozônio, um gerador de
ultrassom (disruptor celular) e um reator onde ocorre a injeção de ozônio e a
aplicação do ultrassom (US). Com relação ao ozonizador (Dist Ltda., Florianópolis,
SC), este produz descargas elétricas com eletrodos de alta tensão (descarga
corona), onde então o oxigênio puro passa entre os eletrodos sendo assim
submetido à elevada diferença de potencial (aproximadamente 10 kV), produzindo
ozônio conforme as equações 4 e 5.
O2 → O• + O•
(4)
O• + O2 → O3
(5)
A Figura 15 representa a produção de ozônio nos eletrodos do gerador.
Figura 15. Representação da produção de ozônio por efeito corona.
Fonte: Balakrishnan et al., 2002.
Ozonizadores por efeito corona apresentam maiores taxas de conversão do
oxigênio em ozônio (ALMEIDA et al., 2004). O rendimento do ozonizador utilizado
neste trabalho não foi mensurado, no entanto, deve variar entre 6 e 14% (m/m)
(BALAKRISHNAN et al., 2002; ALMEIDA et al., 2004), conforme características dos
equipamentos comercializados, abastecidos com oxigênio puro. Neste trabalho o
52
interesse recaiu mais nas quantidades de ozônio presentes no meio reacional. A
entrada de oxigênio foi controlada por um medidor de vazão tipo rotâmetro (0 a 10
L.min-1).
O disruptor celular (Soni-Tech do Brasil®, São Paulo, SP) utilizado possui um
gerador de alta tensão e frequência nominal de 20 kHz, potência de 500 W e
controle de amplitude de 0 a 100%. Acoplado ao gerador está o transdutor, o qual
possui um conversor constituído por cerâmicas piezoelétricas. Estas cerâmicas,
quando na ausência de interferência externa, possuem dipolos elétricos em sua
estrutura cristalina. A existência deste dipolo faz com que a estrutura cristalina se
deforme na presença do campo elétrico, o que caracteriza o efeito piezoelétrico
(Figura 16). Desta forma, o transdutor converte a energia elétrica em energia
mecânica. A ponta do transdutor possui 0,635 cm de diâmetro e é feita de titânio.
Figura 16. Tensão alternada produz oscilações nas dimensões da estrutura
cristalina devido ao realinhamento das moléculas polarizadas (piezoeletricidade).
O reator onde o tratamento foi realizado é feito de vidro, o qual possui volume
máximo de 350 mL e formato cônico (16 cm de altura, 6 cm de diâmetro superior e 3
cm de diâmetro inferior), ficando em suspensão. O ozônio é injetado pela parte
inferior do reator através de um borbulhador micro-poroso de cerâmica. O ultrassom
foi aplicado pela parte superior, mergulhando a ponteira do transdutor no efluente.
No topo do reator foi adaptado um sistema de coleta de ozônio residual, ligando o
mesmo a uma solução de iodeto de potássio a 4%. O sistema estruturado é
apresentado na Figura 17.
53
Figura 17. Diferentes perspectivas do sistema de tratamento de efluentes
hospitalares por ozonólise/sonólise.
A Figura 18 denomina cada constituinte do sistema de tratamento de
efluentes hospitalares, numa perspectiva frontal.
Figura 18. Aparato experimental utilizado no tratamento do efluente hospitalar (1 –
gerador de ultrassom; 2 – transdutor; 3 – gerador de ozônio; 4 – cilindro de oxigênio;
5 – injetor de ozônio; 6 – reator cônico).
3.2
O Efluente Hospitalar
O efluente utilizado neste estudo foi proveniente de um hospital localizado no
estado de Santa Catarina, sendo este de médio porte a alta complexidade em
oncologia, ortopedia e gestação de alto risco, público e referência no tratamento de
54
câncer segundo o Sistema Único de Saúde (SUS) brasileiro. Trata-se de um hospital
com 17.000 m2 de área, que possui 250 leitos, 13 destinados a pacientes com
câncer, atendendo, em média 200 pacientes por dia, com os mais diversos tipos de
doenças.
O hospital possui os seguintes setores: Comissão de Controle de Infecção
Hospitalar, Clínica Cirúrgica, Cozinha e Lactário, Centro de Diagnóstico por Imagem,
Psiquiatria, Clínica Médica, Agência Transfusional, Oncologia, Centro Obstétrico (4
salas), Maternidade, Centro de Incentivo ao Aleitamento Materno, Unidade de
Cuidados Intermediários Neonatal, Internação, UTI Adulto, Clínica de Convênios e
Particulares, UTI Neonatal/Pediátrica, Quimioterapia, Pediatria, Pronto Socorro,
Ambulatório de Oncologia, Centro Cirúrgico (5 salas), Departamento Pessoal,
Farmácia, Serviço de Arquivo Médico e Estatística, Administração, Faturamento,
Financeiro, Assessoria de Comunicação, Informática e Manutenção.
Os efluentes comuns, basicamente com origem nos setores administrativos,
são separados dos efluentes contaminados. Os efluentes contaminados produzidos
no hospital (quimioterapia, ambulatório de oncologia, centros cirúrgicos, leitos,
banheiros, etc.) são destinados a um tanque de equalização (local de coleta das
amostras), com posterior acesso a fossa séptica e desinfecção com hipoclorito de
sódio, sendo então expurgados para a rede coletora de esgotos.
Entre os fármacos utilizados no hospital, encontram-se vários citostáticos,
antibióticos, anti-inflamatórios, hormômios, entre outros, de diferentes classes, todos
certamente fazendo parte do efluente final. Os citostáticos utilizados no hospital são
todos aqueles preconizados pelo Sistema Único de Saúde (SUS), os quais, segundo
o hospital em questão, são: fluororacil, paclitaxel, gosserrelina, doxorrubicina,
dacarbazina,
citarabina,
gencitabina,
ciclofosfamida,
etoposido,
cisplatina,
oxaliplatina, docetaxel, vincristina, carboplatina, bleomicina, irinotecano, ifosfamida,
vinorelbina, alfa intereron, vimblastina, metotrexato, onco BCG, rituximab, fosfato de
fludarabina, daunorrubicina, teniposido, fulvestranto, cloridrato de mitoxantrona,
mitomicina,
cladribina,
topotecano,
asparaginase,
dactinomicina,
carmustina,
bevacizumabe e bortezomib. Dois dos fármacos abordados neste trabalho, ou seja,
a doxorrubicina e o metotrexato, segundo dados da farmácia do hospital estudado,
55
estão entre os mais utilizados, com cerca de 5500, 3500 mg/mês, respectivamente.
Cerca de 100 mg ao mês de docetaxel é utilizado neste hospital.
Com relação aos antibióticos, são utilizados: cloranfenicol, cefazolina,
oxacilina,
amoxicilina,
ceFDriaxona,
gentamicina,
metronidazol,
piperaciclina,
vancomicina,
tetraciclina,
meropenema,
ciprofloxacino,
sulfametoxazol
e
clindamicina. Somente alguns dos citostáticos e antibióticos relacionados com o foco
principal deste estudo, i.e., genotoxicidade e/ou mutagenicidade, e relacionados com
a possibilidade de ocasionar a pressão seletiva bacteriana (i.e., antibióticos) foram
avaliados neste estudo.
O trabalho com o efluente real inicia-se com a coleta deste resíduo no tanque
de equalização do hospital citado, onde o efluente foi disposto em recipientes de
vidro esterilizados. Imediatamente após a coleta, as amostras foram levadas ao
laboratório e armazenadas sob refrigeração (4ºC), por até 48 horas, quando
destinadas aos ensaios microbiológicos e de DBO. Para os testes ecotoxicológicos,
as amostras foram utilizadas nas primeiras 24 horas ou então congeladas por até 7
dias. O restante das amostras foi acidificado com HCl (pH ˂ 2) e então conservados
sob refrigeração (4ºC), por até 28 dias (APHA, 2005; EPA, 2007), para as análises
de DQO e COT.
Inicialmente, visando melhor conhecer as características microbiológicas do
efluente bruto, 100-200 µL deste efluente foram semeados, em triplicata, em seis
diferentes placas com solução sólida, rica em nutrientes (LB, Luria Broth) (MILLER,
1972) (conforme item 3.6.1) cada uma contaminada com um diferente fármaco, a
saber:
doxorrubicina,
metotrexato,
cloranfenicol,
amoxicilina,
gentamicina
e
tetraciclina. As placas foram incubadas a 30°C durante 24-48 horas, sendo então
constatadas células viáveis bacterianas nas placas com doxorrubicina, metotrexato,
cloranfenicol e amoxicilina. Os citostáticos podem ocasionar mutações em bactérias.
Nas placas com amoxicilina, as bactérias desenvolveram-se normalmente. Nas
placas com cloranfenicol, o número de células viáveis reduziu consideravelmente,
restando algumas colônias resistentes. A constatação de bactérias resistentes que
foram expostas a agentes citostáticos e mutagênicos e aos antibióticos justificaram a
escolha deste efluente neste estudo.
56
3.3
Ensaios de Degradação de Fármacos Citostáticos em Meio Aquoso e
Quantificação do Ozônio/Ultrassom
Inicialmente, testes de degradação foram realizados com dois fármacos
citostáticos (doxorrubicina e metotrexato) em solução aquosa (água Milli-Q),
buscando dados sobre a eficiência do sistema de tratamento proposto na
degradação destas substâncias no efluente sintético em diferentes tempos e pH’s.
Determinou-se a cinética de degradação nas diferentes condições e verificou-se a
relação entre as variáveis (eficiência, pH e tempo). A Doxorrubicina (C27H29NO11),
CAS 23214–92-8, foi adquirida do Laboratório Químico Farmacêutico Bérgamo
(Taboão da Serra, SP), como Rubidox®. O Metotrexato (C20H22N8O5), CAS 59–05-2,
foi gentilmente cedido pelo Laboratório Libra do Brasil (Porto Alegre, RS), como
Litrexate®. A estrutura química destes fármacos é demonstrada na Figura 19.
O
H 2N
O
OH
N
N
O
CH3
OH
N
N
NH
N
OH
O
H 2N
O
O
OH
O
OH
H 3C
NH2
O
(A)
O
CH3 OH
OH
(B)
Figura 19. Estrutura química da doxorrubicina (A) e do metotrexato (B).
A partir destes fármacos de referência foram preparadas as soluções aquosas
de cada fármaco, individualmente, com concentrações iguais e equivalentes a 30
µg.mL-1 e volume total de 2 L para cada citostático. Cada solução foi então dividida
em cinco partes iguais (0,4 L cada), tendo cada uma das partes seu pH corrigido
para diferentes valores, ou seja, 3, 5, 7, 9 e 11, imediatamente antes dos testes de
degradação. Assim que foi corrigido o pH, as amostras foram submetidas
individualmente aos tratamentos (i.e., ozonólise e sonólise/ozonólise), com volume
de 0,2 L cada teste, por um tempo máximo de 20 minutos para a doxorrubicina e 21
57
minutos para o metotrexato. O pH das amostras foi corrigido com HCl 1,0 M ou
NaOH 1,0 M (reagentes com pureza analítica, PA). Nesta etapa, em todos os testes
a vazão O2/O3 utilizada foi de 1 L.min-1, submetendo a solução a ser tratada a 0,5
mg.L-1 de O3, medido espectrofotometricamente a 551 nm, correspondente ao
produto da reação entre iodeto e dietil-p-fenilenodiamina (DPD) (GOTTSCHALK et
al., 2010). Quando o ultrassom foi aplicado nestes testes, o gerador operou a uma
amplitude de 50%, sendo a densidade de potência (intensidade de energia/volume
reacional) equivalente a 70 W.L-1, determinada pelo método calorimétrico
(RATOARINO et al., 1995), que avalia a taxa de elevação da temperatura devido a
conversão da energia ultrassônica em calor, determinando-se a potência dissolvida
(Pdiss) de acordo com a equação 6:
Pdiss = m . C . (dT/dt)0
(6)
onde “m” é a massa do líquido, “C” é o calor específico do líquido e (dT/dt)0 é a
inclinação inicial da curva em um gráfico da temperatura versus o tempo. Antes do
início da medição, as temperaturas do líquido e do reator eram as mesmas.
Assegurou-se também que a leitura da temperatura fosse independente da
localização do termopar no líquido.
3.3.1 Análises Cromatográficas dos Citostáticos no Efluente Sintético
Para acompanhamento da degradação dos citostáticos foram realizadas
varreduras espectrofotométricas progressivas na região do UV-Visível com um
espectrofotômetro Cary 100 Win (Varian Inc.). Ao final dos tratamentos, as amostras
também foram submetidas a análises por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), utilizando-se um cromatógrafo ProStar 210 (Varian Inc.), equipado com uma
coluna ChromSpher C-18 e detector UV.
Para determinação da doxorrubicina, leituras em 253 nm (λmax) foram
realizadas durante 20 minutos, em intervalos de 2 minutos. Ao final, a doxorrubicina
58
foi quantificada por CLAE através da comparação da área do pico com uma curva
padrão de calibração (5 a 30 µg.mL-1, em triplicata), conforme Figura 20.
Figura 20. Curva de calibração da doxorrubicina (R2 = 0,99)
Nestas análises de doxorrubicina por CLAE, um modo isocrático de eluição foi
realizado durante 10 minutos, sendo a fase móvel constituída por acetonitrila:fosfato
monobásico de sódio 0,05M em pH 3,0 (50:50 v/v, 1 mL.min. -1), com detecção em
260 nm (FAHMY et al., 2004). Nestas condições, o tempo de retenção do analito foi
o mesmo em todas as amostras com diferentes pHs.
Na determinação do metotrexato, as varreduras UV-Vis foram realizadas
durante 21 minutos, em intervalos de 3 minutos, verificando-se a redução da
absorbância em 302 nm (λmax). Quando o pH da solução aquosa de metotrexato é
modificado, há constante alteração no λmax, conforme verificação dos espectros
obtidos em diferentes varreduras UV-Vis, fenômeno ocasionado por alterações no
equilíbrio químico da substância. Assim, antes da varredura no UV-Vis, 1,5 mL da
amostra foi diluída em 1,5 mL de água Milli-Q para neutralizar (mesmo que
parcialmente) o pH durante a leitura, possibilitando homogeneidade nos espectros
gerados. A quantificação do metotrexato foi realizada com o mesmo procedimento
aplicado as amostras de doxorrubicina, utilizando como fase móvel um sistema de
solventes contendo metanol:ácido acético a 2% em água (80:20 v/v, 1 mL.min. -1.),
durante 15 minutos. As variações no tempo de retenção do analito para os diferentes
pH’s das amostras não foram significativas. A curva de calibração (5 a 30 µg.mL-1,
em triplicata) é apresentada na Figura 21, sendo que o λmax segue a Lei de LambertBeer (VERMA & SYED, 2010).
59
Figura 21. Curva de calibração do metotrexato (R2 = 0,99)
Nos ensaios de degradação do metotrexato, terc-butanol foi utilizado como
capturador de radicais hidroxila, visando a confirmação de algumas hipóteses sobre
o mecanismo reacional (os resultados são apresentados no item 4.1.2), sendo este
reagente de pureza analítica.
3.4
Tratamento do Efluente Hospitalar: Matéria Orgânica Total
Os primeiros testes com o efluente hospitalar foram realizados em seis
diferentes condições, determinadas a partir dos resultados encontrados nos estudos
de degradação das drogas citostáticas (efluente sintético), com pH natural (6,0),
durante 20 minutos, onde o carbono orgânico total (COT) foi quantificado, além do
efluente bruto, na metade e ao final dos tempos de tratamentos. Foram associadas
duas vazões de O2/O3 (1 e 2 L.min-1) com duas densidade de potência do US (70 e
100 W.L-1), resultando em 4 tratamentos associados diferentes. Além disso, a
ozonólise também foi testada de forma individual, nas duas vazões apresentadas. A
melhor remoção de COT foi próxima a 9%, para a associação O 2/O3 (2 L.min-1) com
US 70 W.L-1. Frente à baixa remoção de matéria orgânica, um novo desenho
experimental foi idealizado, aumentando-se o tempo de tratamento para 40 minutos,
além de testar a eficiência da técnica em três diferentes pH’s, ou seja, 3, 7 e 9. Para
esta nova bateria de testes, o efluente hospitalar foi coletado e então seu pH foi
60
corrigido (HCl 1,0 M ou NaOH 1,0 M) imediatamente antes dos testes de
degradação. Foram realizados três tratamentos em cada pH, ou seja, a ozonólise
(2,0 L.min-1), sonólise/ozonólise (70 W.L-1 / 2,0 L.min-1) e sonólise/ozonólise (100
W.L-1/2,0 L.min-1 e). O COT foi analisado ao final dos tratamentos (resultados são
apresentados no item 4.2). É importante salientar que em nenhum teste de
tratamento associado (sonólise/ozonólise) realizado neste trabalho houve controle
da temperatura, ou seja, sempre que o US foi associado houve aquecimento do
sistema.
Para as medições de COT, as amostras foram filtradas e diretamente
inseridas em um analisador de carbono orgânico total marca SHIMADZU, modelo
TOC – VCPH (Shimadzu Corp., Japão). A análise de COT neste equipamento ocorre,
resumidamente, através da subtração do carbono inorgânico do carbono total
contido na amostra, obtendo-se a concentração de COT. Primeiro, ácido clorídrico
(HCl) é adicionado a amostra aquosa para a conversão de carbono inorgânico à
CO2. Em seguida é realizado um borbulhamento com o gás de arraste (O2) na
mistura de amostra e ácido, que faz com que o CO2 convertido seja removido da
amostra em solução. O carbono remanescente na amostra é o carbono orgânico não
purgável (NPOC-não volátil). A concentração de NPOC contida na amostra é
oxidada através da combustão catalítica (Pt) para formação de CO 2. Este gás é
resfriado, desumidificado e carregado através de um purificador de halogênio e pelo
detector NDIR. O CO2 é detectado e o NDIR emite um sinal gerando um pico. A área
do pico gerado é proporcional à concentração de NPOC contida na amostra. A
concentração de COT é obtida por interpolação utilizando curvas analíticas (área do
pico x concentração) feitas anteriormente por injeções de padrões (SHIMADZU,
2003). As curvas de calibração foram obtidas pela injeção de padrões QHEMIS,
utilizando-se cinco pontos na faixa de 50 a 500 mg.L -1, com leituras em triplicata. As
leituras das concentrações nas amostras foram realizadas em triplicata.
61
3.4.1 Tratamento do Efluente Hospitalar: Demandas Química e Bioquímica de
Oxigênio (DQO e DBO)
A eficiência da ozonólise (2 L.min-1) e da sonólise/ozonólise (100 W.L-1 e 2
L.min-1) foi também verificada em termos de DQO e DBO, quando estes parâmetros
foram comparados entre os efluentes bruto e tratados durante 40 minutos.
A DQO dos efluentes foi determinada pelo método HACH 8000, sendo os
resultados definidos pelo consumo de O2 por litro de amostra (expressos em mg.L-1).
Neste procedimento, a amostra é submetida ao aquecimento por duas horas em
meio ácido (H2SO4) e na presença de um oxidante forte, o dicromato de potássio. A
reação de oxidação dos compostos orgânicos reduz o íon dicromato (Cr 2O72-) ao íon
cromo (Cr3+), verde. Para verificação de 0-1500 mg.L-1, mede-se a quantidade de
Cr3+ remanescente. Os reagentes que determinam a DQO também contém prata e
mercúrio. A prata é o catalisador e o mercúrio é utilizado para complexar cloretos
interferentes. A leitura das amostras foi feita em um espectrofotômetro HACH,
modelo DR 2010.
As análises de DBO foram realizadas segundo o método DBOTrack, onde o
consumo de oxigênio é mensurado (mg.L-1). Nestes ensaios, o efluente é colocado
nas garrafas âmbar do aparelho, as quais são acopladas ao equipamento e
conectadas por suas tampas com o tubo de vinil nos manômetros eletrônicos.
Dentro da garrafa, acima da amostra, existe ar (21% O 2). Assim, as bactérias na
amostra usam o oxigênio do ar continuamente para oxidar a matéria orgânica
presente na amostra e, com o consumo de O 2, há uma queda na pressão dentro da
garrafa com esta amostra. É esta queda na pressão que é medida pelo
equipamento, convertendo para mg.L-1. Durante o período de testes (neste caso 5
dias), a amostra foi agitada continuamente por uma barra magnética no interior do
recipiente. Essa agitação constante ajuda a transferir o O2 do ar para a amostra,
auxiliando a simular as condições naturais. O CO2 produzido pelos microrganismos
oxidando a matéria orgânica é removido pela adição de hidróxido de lítio no copo
interno da borracha, colocado em cada garrafa de amostra. Estes ensaios são
condizentes com metodologias padrão (APHA, 1995).
62
3.5
Tratamento do Efluente Hospitalar: Desinfecção
Inicialmente, para verificar a eficiência do tratamento na desinfecção do
efluente hospitalar, seis diferentes condições foram testadas, durante 20 minutos, ou
seja, foram associadas duas vazões de O2/O3 (1 e 2 L.min-1) com duas densidade de
potência do US (70 e 100 W.L-1), resultando em quatro tratamentos associados
diferentes. Novamente a ozonólise também foi testada individualmente, com as
mesmas vazões utilizadas durante a associação das técnicas. A eficiência dos
tratamentos foi avaliada pela redução de células viáveis (conforme item 3.5.1) em
diferentes tempos, isto é, 5, 10, 15 e 20 minutos, comparando-se com o efluente
bruto.
Com base nos resultados preliminares, as duas melhores condições de
tratamento associado (i.e. 2 L.min-1/70 W.L-1 e 2 L.min-1/100 W.L-1), além da melhor
condição de ozonólise individual (2 L.min-1) foram novamente realizadas, agora com
duração de 40 minutos, no intuito de se verificar a dose de ozônio aplicada, bem
como avaliar o tempo necessário para desinfecção. Nestes testes, a viabilidade
celular foi monitorada (conforme item 3.5.1) em 5, 10, 15, 20, 30 e 40 minutos, assim
como as concentrações de ozônio (conforme item 3.3). Para verificar a dose do
desinfetante necessária, um modelo cinético de desinfecção foi aplicado, conforme
item 3.5.2.
3.5.1 Ensaios de Viabilidade Celular
As amostras foram semeadas em placas de Petri contendo meio de cultura
LB (Luria Broth) sólido (triptona 10 g.L-1, extrato de levedura 5 g.L-1, NaCl 10 g.L-1 e
ágar 15 g.L-1) (MILLER, 1972). Volumes de 100 a 200 µL de efluente bruto ou dos
efluentes tratados foram semeados diretamente ou previamente submetidas à
diluição em solução salina estéril (NaCl 0,9% (p/v), em séries decimais de 10-1 a
10-3. As placas foram mantidas em estufa a 30°C por 24 a 48 horas. Após o
crescimento das colônias foi realizada a contagem em unidades formadoras de
63
colônias (UFC) por mL de efluente. Todos esses experimentos foram efetuados em
triplicata.
3.5.2 Modelo Cinético e Dosagem de Ozônio Requerida para a Desinfecção
A eficiência da desinfecção por ozônio depende da concentração de O 3 e do
tempo de contato. Collins & Elleck apud Chiang et al. (2003), desenvolveram um
modelo cinético (equação 7) para a desinfecção de efluentes por cloração, utilizando
a fórmula empírica:
S = N1 / N0 = (C x T / b)n
(7)
onde, S = fração de bactérias sobreviventes; N1 = número de bactérias depois da
adição do desinfetante (hipoclorito ou dióxido de cloro); N0 = número inicial de
bactérias no efluente; C = concentração do desinfetante, mg.L-1; T = tempo de
contato, min; b = intercepto onde N1 / N0 = 1,0 e n = inclinação da curva de
correlação. Uma linha reta é obtida a partir de um gráfico duplo-log para este
relacionamento. Majumdar apud Chiang et al. (2003) também aplicou este modelo
para obter a eficiência de desativação de um poliovírus em água, por ozonólise.
Segundo este modelo (equação 8), a eficiência da desinfecção pode ser obtida pela
relação da eficiência de desativação em função de C x T (concentração x tempo de
contato), segundo a fórmula empírica:
C x T = k x Sm
(8)
Onde, m = -1/n, k = b. Este modelo foi utilizado neste estudo para determinar a
eficácia da desinfecção do efluente hospitalar via ozonólise e sonólise/ ozonólise.
64
3.6
Tratamento do Efluente Hospitalar: Material Genético
O material genético presente no efluente hospitalar apresenta elevado
potencial para provocar o aumento da resistência bacteriana por diversos motivos já
descritos na revisão bibliográfica. Nesta guisa, a eficiência dos três tratamentos mais
eficientes em termos de desinfecção foi avaliada no que diz respeito à degradação
de plasmídeos presentes no efluente, através da comparação do material genético
das amostras de efluente bruto e tratados. Antes da verificação da eficiência da
ozonólise (2 mL.min-1) e das duas condições de sonólise/ozonólise (70 e 100 W.L-1 /
2 L.min-1), três experimentos controle foram realizados. O primeiro experimento
controle consistiu em submeter 0,2 L de efluente bruto a um gradiente de
aquecimento, até 57 ºC e tempo final de 40 minutos, igualmente ao que ocorre
quando o US é utilizado nos tratamentos associados e com potência de 100 W.L-1
(densidade de potência máxima aplicada neste trabalho). Os outros dois controles
foram realizados submetendo-se a mesma quantidade de efluente a sonólise, no
intuito de verificar se apenas o US é capaz se desinfetar o efluente utilizado, durante
o mesmo tempo testado nos tratamentos associados. Em ambos os controles, após
40 minutos, restaram células viáveis (houve ligeira redução), demonstrando que a
temperatura e a sonólise não são as únicas responsáveis pelos efeitos encontrados
ao final dos tratamentos (item 4.3). As metodologias de extração e quanticação dos
plasmídeos é demonstrada na sequência.
3.6.1 Extração/Quantificação de ADN Plasmídico e Eletroforese
A preparação de plasmídeos foi feita por hidrólise alcalina, baseada no
método descrito por Birnboim & Doly (1979) e Sambrook et al. (1989). Uma alíquota
de 50 mL do efluente bruto, além de alíquotas de igual volume dos efluentes
tratados nas três diferentes condições foram centrifugadas a 10.000×g, durante 15
minutos, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi
ressuspenso em 500 μL de GET (glucose 50 mmol.L-1, EDTA 10 mmol.L-1 pH 8,0,
Tris-HCl 25 mmol.L-1 pH 8,0) e transferido para um tubo de microcentrífuga. Foram
65
adicionados a esta suspensão bacteriana 200 μL de solução de lise (SDS 1%, NaOH
0,2 mol.L-1), homogeneizado por inversão e mantido em gelo por 5 minutos. Após
este período de tempo foram adicionados 200 μL de acetato de sódio 3,0 mol.L-1 pH
5,5. O lisado bacteriano foi homogeneizado por inversão e mantido em gelo por 10
minutos, seguido pela centrifugação a 13.000×g por 10 minutos. A fase aquosa foi
transferida para outro tubo e o ácido nucléico precipitado pela adição de 1,2 volumes
de etanol 96% (v/v) à temperatura ambiente. O precipitado foi coletado por
centrifugação a 13.000×g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado foi lavado com 500 μL de etanol 80% (v/v) e centrifugado nas mesmas
condições descritas. O sobrenadante foi novamente descartado e o ADN seco a
temperatura ambiente e dissolvido em 40 μL de água ultrapura. Os plasmídeos
isolados foram quantificados por espectrofotometria (SAMBROOK et al., 1989),
medindo-se a absorbância no comprimento de onda 260 nm (A 260) (BARBAS, 2007).
As bases nitrogenadas da dupla fita de ADN apresentam uma absorção máxima no
comprimento de onda de 260 nm. Neste comprimento de onda, um coeficiente de
extinção (E0,1%;
1cm)
igual a 20 indica que o ADN, em uma concentração de 1
mg.mL-1, terá uma absorbância (A260nm) igual a 20. Desde que a relação entre a
concentração de ADN e A260nm é linear até o valor de 2,0, a concentração do ADN
em solução pode ser determinada. A presença de proteínas, ARN, detergentes e
solventes orgânicos na preparação podem interferir nas medidas. Uma vez que os
máximos de absorção de ADN e proteínas ocorrem respectivamente à 260 e 280
nm, uma medida aproximada da pureza do ADN isolado pode ser obtida
determinando-se a relação A260nm /A280nm.
A separação de fragmentos de ADN ou plasmídeos íntegros foi feita por
eletroforese em gel de ágar 1% (p/v) em tampão TBE (Tris base 90 mmol.L-1; ácido
bórico 90 mmol.L-1; EDTA 20 mmol.L-1 pH 8,0), contendo brometo de etídeo 0,5
μg.mL-1. A corrida eletroforética foi realizada no mesmo tampão e na mesma
concentração descrita acima. Para aplicação em gel as amostras de ADN foram
misturadas a 0,2 volume de solução contendo SDS 1% (p/v), EDTA 1,8 mmol.L-1 pH
8,0; Tris-HCl 65 mmol.L-1 pH 8,0 e glicerol 50% (v/v), e a corrida realizada a 5 V.cm-1
de gel por 1-2 horas (SAMBROOK et al., 1989). As bandas foram visualizadas sob
luz ultravioleta (312 nm) em transiluminador (UVP, Inc. Upland, CA USA).
66
3.7
Tratamento de Efluente Hospitalar: Ecotoxicidade
Ozonólise (2 L.min-1) e sonólise/ozonólise (100 W.L-1 e 2 L.min-1) foram
avaliados pela eficiência na remoção da toxicidade. Neste caso, o efluente hospitalar
foi previamente contaminado com três citostáticos amplamente utilizados no
hospital, a doxorrubicina, o metotrexato e o docetaxel. A degradação da
doxorrubicina e do metotrexato já havia sido estudada anteriormente em meio
aquoso como um dos objetivos específicos desta tese que deu origem a uma
publicação (SOMENSI et al., 2012), no entanto buscou-se aqui obter a eficiência da
degradação quando estes citostáticos estão presentes em um efluente real,
avaliando-se agora a ecotoxicidade para os efluentes antes e após o tratamento. As
concentrações dos citostáticos preparadas no meio foram iguais a 10, 30 e 10
mg.L-1, respectivamente para a doxorrubicina, o metotrexato e o docetaxel. A
Doxorrubicina foi acrescentada ao efluente a partir do fármaco comercial Rubidox®,
enquanto que o Metotrexato foi proveniente do fármaco Litrexate®. Docetaxel foi
adicionado a partir da solução injetável comercializada como Doxelib ®, gentilmente
cedida pelo Laboratório Libra do Brasil (Porto Alegre, RS).
Inicialmente avaliou-se a redução da toxicidade para Aliivibrio fischeri, em
efluentes tratados durante 20 e 40 minutos. Com os resultados preliminares, optouse por um tempo de tratamento de 20 minutos para a avaliação com outros
organismos de diferentes níveis tróficos, ou seja, Pseudokirchniriella subcaptata,
Daphnia magna e Danio rerio.
3.7.1 Ensaios com Aliivibrio fischeri
Os testes de inibição da luminescência bacteriana com Aliivibrio fischeri foi
realizado de acordo com a norma ABNT.NBR 15411-2 (ABNT, 2007). O tempo de
exposição foi de 30 minutos e as concentrações testadas foram iguais a de 0,19%,
0,39%, 0,78%, 1,56%, 3,12%, 6,25%, 12,50%, 25,00% e 50,00%, além do controle.
O sistema é estático e possui duas replicas para cada diluição, incluindo o controle.
A temperatura foi mantida a 15 ( 1 C) e o pH estava entre 6,0 e 8,0. O feito
67
observado é a inibição da bioluminescência bacteriana, mensurado em um
luminômetro modelo Lumistox 300 (Dr. Bruno Lange, Düsseldorf, Germany). A
bactéria Aliivibrio fischeri (NRLL B-11177) foi produzida, liofilizada e estocada a 20oC. Quando necessário, as amostras dos efluentes tiveram sua salinidade
ajustada antes das diluições. A análise estatística do ensaio baseia-se no efeito
perda de bioluminescência em função da concentração da amostra objeto da
exposição. O parâmetro CE50 foi calculado através do método de regressão linear,
conforme equação 9.
log Ct = b log t + log a
(9)
onde, Ct é a fração da amostra na mistura testada (em %), b corresponde ao valor
da inclinação da reta, t é o valor da luminescência da mistura depois do contato de
30 minutos e a equivale ao valor do intercepto da reta. Neste caso, a determinação
dos valores das concentrações efetivas foi feito pelo software incorporado ao
luminômetro.
3.7.2 Ensaios com Pseudokirchniriella subcaptata
Os testes de inibição do crescimento algáceo foram realizados de acordo com
a
norma
ABNT.NBR
12648
(ABNT,
2005),
utilizando
algas
da
espécie
Pseudokirchniriella subcaptata. Os efluentes foram filtrados em papel filtro de fibra
de vidro 0,45 µm (Millipore, EUA) para facilitar a absorção de luz pelas algas. Três
testes de algas para cada amostra de efluente foram realizados com três repetições
por concentração. De acordo com Knie & Lopez (2004), a medição da quantidade de
algas iniciais informa sobre a quantidade inicial de organismos presentes na amostra
e a medição final informa se a amostra inibiu ou estimulou o crescimento das algas.
O controle negativo foi constituído de 20 mL de meio de cultura e 2 mL de algas,
sem adição de efluente. As demais amostras foram preparadas com as seguintes
concentrações dos efluentes filtrados: 1,56%, 3,12%, 6,25%, 12,50%, 25,00%,
50,00% e 100,00%. Em seguida foi adicionado 2 mL da cultura algácea em cada
68
diluição e, após este procedimento, foi medida a clorofila in vivo de cada amostra no
Fluorímetro Turner Designs Aquafluor Handheld Fluorometer (CA, USA). A cultura
de algas foi mantida na incubadora com agitação constante de 100 rpm, com
iluminação contínua de 70 µEm-2s-1 (lâmpadas fluorescentes brancas frias) a 23 ±
2°C. Após 72 h de incubação, a fluorescência foi medida, sendo que a diferença de
fluorecência foi usada como parâmetro de cálculo da CE50, determinada em papel
semi-log.
3.7.3 Ensaios com Daphnia magna
O teste de imobilização de 48 h com Daphnia magna foi realizado em
conformidade com a metodologia da ABNT-NBR 12713 (ABNT, 2004). Foram
utilizados 10 indivíduos neonatos (menos de 24 h de idade) em cada teste, com 30
mL de solução-teste à 20 ± 2°C. Os organismos-teste foram mantidos em meio de
cultura apropriado e sob fotoperíodo de 12 horas por dia, controlado por timer
eletrônico. Três ensaios diferentes (com três repetições por diluição) foram
realizados para cada amostra. Cada teste consistiu de cinco concentrações do
efluente (6,25%, 12,50%, 25,00%, 50,00%e 100,00%), além de um grupo controle.
Dicromato de Potásio foi usado como controle positivo. A concentração efetiva
mediana foi verificada de acordo com a imobilidade ou mortalidade de 50% dos
indivíduos expostos, através do programa computacional Trimmed SpearmanKarber.
3.7.4 Ensaios com Danio rerio
Foi usado como organismo-teste o peixe de águas tropicais Danio rerio,
conhecido como paulistinha ou peixe-zebra. O teste foi realizado conforme a
metodologia da ABNT-NBR 15088 (ABNT, 2004). Os peixes juvenis foram
adquiridos em piscicultura para comércio de peixes ornamentais. Após serem
trazidos ao laboratório, os peixes foram aclimatados em reservatório preenchido com
69
água da rede de abastecimento desclorada pela adição de tiossulfato de sódio.
Efetuou-se a renovação semanal de 30% do volume de água e os peixes
permaneceram em observação durante 10 dias. A dureza total e o pH foram
observados e anotados, corrigindo-se o pH quando necessário com solução de HCl
2N. Manteve-se o pH entre 7,0 e 7,6 e a dureza total em torno 40 e 48 mg de
CaCO3 L-1. Os ensaios foram realizados em recipiente de 5 litros, sendo utilizados 5
peixes por recipiente. Foram testadas três concentrações (25,00%, 50,00% e
100,00%), além do controle. A alimentação dos peixes foi suspensa 24 horas antes
do início dos ensaios, sendo observada a mortalidade e o comportamento dos
peixes após 24 e 48 horas. Como o oxigênio dissolvido da amostra estava abaixo do
limite aceitável, as soluções-teste foram mantidas sob aeração por 12 horas antes
dos testes e durante todo o tempo de exposição. As concentrações medianas letais
(CL50) foram determinadas por meio da metodologia por plotagem em papel Probit.
3.8
Análise de Intermediários por Cromatografia Gasosa – Espectrometria
de Massas (CG-EM)
Na tentativa de identificar subprodutos da degradação de compostos
presentes no efluente hospitalar, algumas análises por CG-EM foram conduzidas em
amostras de efluente bruto e tratato via ozonólise (2 L.min-1) e sonólise/ozonólise
(100 W.L-1/2 L.min-1). Os resultados são apresentados no Capítulo 4, os quais
também
possibilitam
a
comparação
da
eficiência
da
ozonólise
com
a
sonólise/ozonólise. Os analitos presentes nas amostras foram submetidos à
extração líquido-líquido, conforme descrito: transferiu-se 1 L de efluente para um
funil de separação, acrescentou-se 20 mL de diclorometano (CH2Cl2) e agitou-se
suavemente durante 2 minutos, abrindo-se periodicamente o funil para aliviar a
pressão. Aguardou-se cerca de 10 minutos para a separação de fases e então o
extrato/solvente foi recolhido. Este procedimento foi repetido por três vezes. Às
frações recolhidas foi adicionado sulfato de sódio anidro (Na 2SO4) para remoção de
água residual, com posterior filtração. A amostra foi submetida à concentração em
70
evaporador rotatório à pressão reduzida. O extrato foi removido e aferido para 1 mL
com acetonitrila (ACN) e então submetida a análise por CG-EM.
Este procedimento de extração líquido-líquido também foi efetuado para as
mesmas amostras de efluente (bruto e tratados) utilizando-se n-hexano como
solvente, variando-se a polaridade dos solventes e possibilitando a extração de
espécies químicas diferentes.
Um cromatógrafo VARIAN, modelo CP – 3800, acoplado a um espectrômetro
de massas modelo SATURN 2000 foi utilizado nas leituras. O equipamento operou
com o injetor a temperatura de 250 °C. O forno foi programado com temperatura
inicial de 100 °C por dois minutos, elevando-se a temperatura em 15 °C.min-1,
chegando-se a 270 °C, mantendo-se por 24 minutos. O gás de arraste empregado
foi Hélio com fluxo constante de 2,5 mL.min-1.
71
4.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1
Degradação da Doxorrubicina e do Metotrexato em Meio Aquoso:
Eficiência e Cinética
Ozônio molecular (O3) e radicais hidroxila (•OH) estão envolvidos na
degradação química quando a ozonólise é utilizada nos processos de tratamento,
sendo que a espécie química prevalecente depende do pH do meio reacional
(GOGATE & PANDIT, 2004). O aumento do pH irá resultar em uma maior produção
de radicais hidroxila, mas outros radicais e espécies de oxigênio ativo também estão
envolvidos, como superóxidos (•O2-), oxigênio tripleto (O 3P), radical orgânico peroxil
(R-O2•) e radicais hidroperoxil (•HO2-) (OPPENLÄNDER, 2003). De acordo com
Ikehata et al. (2006), as reações com ozônio molecular são seletivas para moléculas
orgânicas com propriedades nucleofílicas, como duplas ligações entre carbonos,
anéis aromáticos e grupos funcionais que contenham enxofre, nitrogênio, fósforo e
átomos de oxigênio. Em contrapartida, as reações envolvendo radicais hidroxila são
não-seletivas para vários compostos ogânicos e inorgânicos,
agindo através da
abstração de hidrogênios, reações radical-radical, adição eletrofílica e reações de
transferência de elétrons, eventualmente levando a completa mineralização de
compostos orgânicos (OPPENLÄNDER, 2003; IKEHATA et al., 2006; LEGRINI et al.,
1993).
Com relação à estrutura química do dois fármacos citostáticos, verifica-se que
a doxorrubicina tem um perfil eletrofílico, enquanto que o metotrexato apresenta-se
mais equilibrado. Assim, podem ser necessárias diferentes condições de tratamento
no intuito de alcançar uma maior eficiência na degradação dos citostáticos. Por esta
razão, os dados cinéticos de degradação da doxorrubicina e do metotrexato foram
obtidos em diferentes valores de pH.
72
4.1.1 Degradação da Doxorrubicina
A Figura 22 apresenta as varreduras (UV-Visível) das amostras de
doxorrubicina nos diferentes intervalos de tempo e durante as diferentes condições
de tratamento.
Figura 22. Espectros UV-Vis da redução da absorbância da doxorrubicina nas
diferentes condições de tratamento, i.e., A = pH 3,0, B = pH 5,0, C = pH 7,0, D = pH
9,0, 1 = ozonólise e 2 = sonólise/ozonólise, (a) zero minutos e (k) 20 minutos.
73
A partir da redução da absorbância em 253 nm foi construído o gráfico (Figura
23) que apresenta a eficiência da degradação da doxorrubicina quando submetida
aos dois tratamentos, ou seja, a ozonólise (1 L.min-1) e a sonólise/ozonólise (70
W.L-1 e 1 L.min-1) em diferentes valores de pH.
-1
50
O3 (0,5 mg.L )
45
O3 (0,5 mg.L ) + US
-1
40
Eficiência Degradação (%)
35
30
25
20
15
10
5
0
3
5
7
9
pH
Figura 23. Eficiência na degradação da doxorrubicina submetida a ozonólise e
sonólise/ozonólise em diferentes pHs.
Em primeiro lugar, pode-se observar na Figura 23 que a baixa eficiência de
degradação da doxorrubicina pela ozonólise está associada à baixa concentração de
ozônio na solução (0,5 mg.L-1) e ao período de tratamento relativamente curto (20
minutos). No entanto, estes dados foram suficientes para comparar a eficiência dos
processos e para gerar os dados cinéticos de degradação. Segundo, é importante
ressaltar que a degradação foi mais eficiente em valores elevados de pH. Conforme
anteriormente mencionado, a eletronegatividade dos átomos de oxigênio presentes
na molécula de doxorrubicina facilitam a captação de hidrogênio por radicais
hidroxila, sendo este processo que inicia a degradação do composto, o que será
mais efetivo em valores elevados de pH. A terceira observação da Figura 23 é que o
processo combinado (sonólise/ozonólise) é mais eficiente na degradação da
doxorrubicina, em todos os valores de pH, do que a ozonólise individualmente
aplicada. É importante salientar que alguns testes foram realizados utilizando
unicamente a sonólise, durante 40 minutos, a qual resultou em valores desprezíveis
74
de degradação. Comparada à ozonólise, a associação dos processos aumentou a
taxa de degradação em 47,5% em pH 3,0, 39,2% em pH 5,0, 24,5% em pH 7,0 e
17,0% em pH 9,0. A sonólise de uma solução aquosa leva à formação e colapso de
bolhas, fenômeno conhecido como cavitação, que gera localmente temperaturas e
pressões elevadas. Além disso, quando estas bolhas entram em colapso, o vapor
d’água (sob estas condições extremas) sofre uma dissociação térmica formando
espécies radicais altamente reativas (e.g., •H e •OH e, na presença de oxigênio,
HO2•) (WEAVERS et al., 2000; NADDEO et al., 2009b; NING et al., 2009; ROOZE et
al., 2011). Ainda, quando líquidos borbulhados com a mistura O 2/O3 são sonicados,
a decomposição térmica do O3(g) nas bolhas de cavitação leva a um maior
rendimento na formação de radicais •OH e H2O2 (DESTAILLATS et al., 2000). Como
a sonólise aumenta a formação das espécies radicais e considerando-se que estas
espécies estão envolvidas na degradação da doxorrubicina, a combinação
sonólise/ozonólise é mais eficiente que a ozonólise aplicada individualmente. Esta
diferença é mais pronunciada quando as condições de pH não favorecem a
formação de espécies radicalares, isto é, em valores de pH mais baixos. Em valores
de pH mais elevados, onde a formação natural de radicais é favorecida, a
contribuição da sonólise na eficiência de degradação é menos efetiva, conforme
dados da Figura 23.
Do ponto de vista prático, pensando na aplicação real do tratamento, uma
densidade de potência pequena (70 W.L-1) foi utilizada, o que é importante em
termos de custo do tratamento (MAHAMUNI & ADEWUYI, 2010).
Com relação às amostras em pH 11,0, verificou-se que a doxorrubicina foi
totalmente auto degradada nesta condição, o que foi confirmado através dos
espectros UV-Vis e dos cromatogramas obtidos por CLAE.
Nos outros valores de pH, as intensidade de absorção após os tratamentos de
degradação são demonstradas nos cromatogramas (Figura 24), tanto para a
ozonólise quanto para a sonólise/ozonólise.
75
(d)
(e)
DOXO
DOXO
(c)
DOXO
(b)
DOXO
DOXO
Resposta (mlivolts)
(a)
Tempo (minutos)
(A)
(e)
DOXO
(d)
DOXO
(c)
DOXO
(b)
DOXO
DOXO
Resposta (mlivolts)
(a)
Tempo (minutos)
(B)
Figura 24. Espectros de absorção obtidos no CLAE a 260 nm, para as soluções
padrão de doxorrubicna (a) e para as amostras degradadas em pH 3,0 (b), 5,0 (c),
7,0 (d) e 9,0 (e) depois de 20 minutos de tratamento por ozonólise (A) e
sonólise/ozonólise (B).
4.1.2 Degradação do Metotrexato
A Figura 25 apresenta as varreduras (UV-Visível) das amostras de
metotrexato nos diferentes intervalos de tempo e durante as diferentes condições de
tratamento.
76
Figura 25. Espectros UV-Vis da redução da absorbância do metotrexato nas
diferentes condições de tratamento, i.e., A = pH 3,0, B = pH 5,0, C = pH 7,0, D = pH
9,0, E = 11,0, 1 = ozonólise e 2 = sonólise/ozonólise, (a) zero minutos e (h) 21
minutos.
77
A partir da redução da absorbância em 302 nm foi contruído o gráfico da
Figura 26, que apresenta a eficiência na degradação do metotrexato quando
submetido aos dois tratamentos, ou seja, a ozonólise (1 L.min-1) e a
sonólise/ozonólise (70 W.L-1 e 1 L.min-1) em diferentes valores de pH.
100
80
60
Eficiência na
Degradação (%)
40
20
Tempo
(min.)
12
0
9
6
3
3
3
5
5
7
7
9
11
9 11
pH
Figura 26. Eficiência na degradação do metotrexato nos primeiros doze minutos
quando submetido a ozonólise ( ) e sonólise/ozonólise ( ) em diferentes valores de
pH.
O primeiro resultado relevante é a melhor eficiência na degradação do
metotrexato quando comparado a doxorrubicina. A segunda observação é com
relação ao aumento na eficiência de degradação com o aumento do pH. Terceiro, a
ozonólise foi ligeiramente mais eficiente que a associação sonólise/ozonólise na
degradação do metotrexato em pH ácido, enquanto que em pH neutro e alcalino, a
associação foi mais eficiente ao final do tratamento. Comparado à ozonólise, a
técnica associada de tratamento O3/US foi 2,7% mais eficiente em pH 7,0, 11,8% em
pH 9,0 e 13,4% em pH 11,0, enquanto que em pH 3,0 e 5,0, a degradação foi
semelhante após 12 minutos de tratamento. Ao final dos tratamentos, após 21
78
minutos, estes apresentaram degradação semelhante em todas as condições de pH
testados. Portanto, todos os resultados indicam que o tratamento combinado foi
mais eficiente que o método individual provavelmente devido à elevação na
concentração dos radicais oxidantes. Ainda, o aquecimento do meio reacional pelo
US promove um decréscimo na solubilidade do ozônio, o qual é compensado pela
geração dos radicais pelo ultrassom, mas a diferença na eficiência dos tratamento
decresce significativamente. Em pH ácido, a formação de radicais por ultrassom
diminuem a concentração de ozônio molecular, diminuindo a degradação do método
combinado. Neste período da reação, o aquecimento pelo US do meio reacional
pode promover outros mecanismos de degradação, como um aumento dos
fenômenos de cavitação/pirólise. Novamente é importante salientar que, conforme
resultados de alguns testes utilizando unicamente a sonólise, durante 40 minutos,
esta técnica isolada resultou em valores desprezíveis de degradação.
É evidente que em pH ácido o metotrexato degrada via ozônio molecular no
início da reação. Para confirmar estes resultados, uma nova bateria de testes de
degradação foi realizada em pH 3,0 e 5,0, adicionando ao meio reacional o tercbutanol, conhecido capturador de radicais. Os resultados destes novos testes
mostraram que as duas metodologias de degradação tem eficiência similar em
baixos valores de pH, de acordo com a hipótese que a sonólise age
fundalmentalmente como geradora de radicais. A intensidade de absorção
observada nos cromatogramas do CLAE na amostra padrão e depois dos
tratamentos é demonstrada na Figura 27.
79
Resposta (mlivolts)
(f)
(e)
(d)
(c)
(b)
(a)
Tempo (minutos)
Resposta (mlivolts)
(A)
(f)
(e)
(d)
(c)
(b)
(a)
Tempo (minutos)
(B)
Figura 27. Espectros de absorção obtidos no CLAE a 302 nm, para as soluções
padrão de metotrexato (a) e para as amostras degradadas em pH 3,0 (b), 5,0 (c), 7,0
(d), 9,0 (e) e 11,0 (f), depois de 21 minutos de tratamento por ozonólise (A) e
sonólise/ozonólise (B).
4.1.3 Cinética de Degradação dos Citostáticos
Devido à variedade e complexidade das reações envolvidas nas oxidações
abordadas neste trabalho (particularmente para a associação sonólise/ozonólise),
apenas as tendências cinéticas obtidas para as condições específicas testadas
neste estudo são apresentadas. Assim, a concentração do oxidante foi considerada
80
constante durante os tratamentos, ao contrário da concentração do citostático que é
variável. Neste caso, uma aproximação de pseudo primeira ordem (plot de ln
Abst/Abst0 em função do tempo) não mostrou linearidade em qualquer pH e em
nenhum método de tratamento. Assim, consideramos a oxidação dos citostáticos
como reações de segunda ordem. Neste caso, a plotagem de 1 / (Abs t/Abst0) versus
o tempo mostrou relação linear para todos os dados obtidos.
Von Gunten (2003) relatou que a cinética das reações de ozônio com
compostos orgânicos e inorgânicos é tipicamente de segunda ordem, ou seja, de
primeira ordem tanto para o ozônio quanto para as concentrações de contaminantes.
A Figura 28 apresenta o gráfico obtido pela plotagem dos dados como
cinética de segunda ordem, para a degradação da doxorrubicina em pH 7,0.
2,0
Dados obtidos experimentalmente
1,6
Linha de tendência
Dados obtidos experimentalmente
Linha de tendência
1,8
1,5
1,6
1/(Abs t/Abs 0)
1/(Abs t/Abs 0)
1,4
1,3
1,2
1,4
1,2
1,1
1,0
1,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0
Tempo (minutos)
(A)
5
10
15
20
Tempo (minutos)
(B)
Figura 28. Dados cinéticos de segunda ordem obtidos a partir da degradação da
doxorrubicina em pH 7,0, via ozonólise (A) e sonólise/ozonólise (B)
A partir da Figura 28, a constante de velocidade para a degradação da
doxorrubicina calculada para a ozonólise em pH 7,0 foi igual a 0,0267 min -1 (R2 =
0,997), enquanto que a constante de velocidade para a degradação por
sonólise/ozonólise foi de 0,0427 min-1 (R2 = 0,995). Comparando-se a constante de
velocidade para os dois métodos de degradação, o processo combinado é 59,2%
mais rápido que a ozonólise individual. Quando os tratamentos foram realizados nos
pH’s 3,0, 5,0 e 9,0, as constantes de velocidade da sonólise/ozonólise foram,
81
respectivamente, 76,2, 82,6 e 37,2% maiores que os valores obtidos para a
ozonólise individual.
A Figura 29 apresenta a plotagem dos dados como cinética de segunda
ordem da degradação do metotrexato em pH 7,0.
8
Dados obtidos experimentalmente
Dados obtidos experimentalmente
10
Linha de tendência
Linha de tendência
7
8
6
1/(Abs t/Abs 0)
1/(Abs t/Abs 0)
5
4
3
6
4
2
2
1
0
0
0
3
6
9
12
15
18
21
Tempo (minutos)
(A)
0
3
6
9
12
15
18
21
Tempo (minutos)
(B)
Figura 29. Dados cinéticos de segunda ordem obtidos a partir da degradação do
metotrexato em pH 7,0, via ozonólise (A) e sonólise/ozonólise (B)
A partir da Figura 29, a constante de velocidade de degradação do
metotrexato por ozonólise, em pH 7,0, foi calculada em 0,3373 min -1 (R2 = 0,994),
enquanto que para a sonólise/ozonólise o valor obtido foi 0,4163 min-1 (R2 = 0,994),
isto é, um valor 23,4% mais elevado. Para a degradação deste citostático pelo
método associado O3/US e em pH 3,0, 5,0, 9,0 e 11,0, a constante da velocidade de
degradação foi, respectivamente, 10,3, 4,5, 78,6 e 58,3% mais elevada que os
valores obtidos para a ozonólise individual.
Os dados das Figuras 28 e 29 mostraram que, independentemente do
mecanismo da reação envolvida da degradação dos dois fármacos citostáticos, a
associação sonólise/ozonólise conduz claramente a um significativo aumento do
desempenho global da degradação, resultados consistentes com vários outros
estudos com diferentes micropoluentes orgânicos (NING et al., 2009; INCE &
TEZCANLI, 2001).
De acordo com Ning et al. (2009), os fenômenos responsáveis pelo aumento
da eficiência obtida na combinação sonólise/ozonólise são provavelmente os
seguintes: o ozônio dissolvido ou pequenas bolhas de gás atuam como núcleos para
82
que ocorra a cavitação; aumento na transferência de massa a partir do ozônio
gasoso; mais radicais são introduzidos pelas reações em cadeia provenientes da
decomposição do ozônio e a pirólise das substâncias orgânicas devido a elevadas
pressões e temperaturas transientes associadas à cavitação.
Os dados obtidos com este estudo de degradação preparada em água Milli-Q
(efluente sintético) permitem algumas considerações práticas sobre a degradação
dos citostáticos doxorrubicina e metotrexato. O composto mais recalcitrante neste
estudo, a doxorrubicina, foi degradada com a elevação do pH para 11,0, onde
nenhum vestígio deste fármaco foi encontrado em nossas análises por CLAE. Na
prática, o ajuste do pH de um efluente real para a degradação de um único poluente
pode ser inviável por representar custos de tratamento. Levando em consideração
que a concentração de doxorrubicina utilizada nestes ensaios iniciais foi elevada e
que a dose de ozônio / densidade de potência do US foi pequena, além de que o
método associado teve suas maiores eficiências em pH neutro e alcalino, optar-se-á
por realizar o tratamento do efluente real sem correção de pH (em torno de 7,0),
simplificando o sistema de tratamento. Este raciocínio também se aplica para a
degradação do metotrexato, o qual foi facilmente degradado em qualquer condição,
permitindo que o tratamento de efluentes contaminados com este fármaco seja
realizado sem necessidade de correção do pH. Além disso, ajustes na vazão O 2/O3
e na densidade de potência foram realizados nos testes com o efluente real,
buscando-se otimizar o sistema de tratamento. Os resultados da otimização do
tratamento no efluente real são apresentados a seguir.
4.2
Efluente Hospitalar: Remoção da Matéria Orgânica (COT, DQO e DBO)
O primeiro desenho experimental resultou em seis diferentes tratamentos, ou
seja: (1) ozonólise (1 L.min-1), (2) ozonólise (2 L.min-1), (3) sonólise/ozonólise (70
W.L-1 e 1 L.min-1), (4) sonólise/ozonólise (100 W.L-1 e 1 L.min-1), (5)
sonólise/ozonólise (70 W.L-1 e 2 L.min-1) e (6) sonólise/ozonólise (100 W.L-1 e 2
L.min-1). O efluente bruto apresentou uma concentração de COT igual a 316,6
83
mg.L-1, sendo que a eficiência na remoção do COT para estes primeiros ensaios é
apresentada na Tabela 3.
Tabela 3. Eficiência (%) na remoção do COT do efluente hospitalar pelos diferentes
tratamentos após 10 e 20 minutos.
Tratamento/Tempo (min.)
10
20
Ozonólise (1 L.min-1)
2,08
2,74
Ozonólise (2 L.min-1)
5,02
7,07
Sonólise/Ozonólise (70 W.L-1 e 1 L.min-1)
1,13
2,71
Sonólise/Ozonólise (100 W.L-1 e 1 L.min-1)
1,89
3,44
Sonólise/Ozonólise (70 W.L e 2 L.min )
3,31
6,82
Sonólise/Ozonólise (100 W.L-1 e 2 L.min-1)
7,10
8,90
-1
-1
Como nenhum método foi consideravelmente eficiente na remoção de COT,
uma nova bateria de testes foi preparada, aumentando-se o tempo de tratamento
para 40 minutos, além de alterações no pH (A = pH 3,0, B = pH 7,0 e C = pH 9,0).
Nesta etapa, nove diferentes tratamentos foram realizados, ou seja: (A1) ozonólise
(2 L.min-1), (A2) sonólise/ozonólise (70 W.L-1 e 2 L.min-1), (A3) sonólise/ozonólise
(100 W.L-1 e 2 L.min-1), (B1) ozonólise (2 L.min-1), (B2) sonólise/ozonólise (70 W.L-1
e 2 L.min-1), (B3) (100 W.L-1 e 2 L.min-1), (C1) ozonólise (2 L.min-1), (C2) (70 W.L-1 e
2 L.min-1), (C3) (100 W.L-1 e 2 L.min-1). O efluente bruto apresentou uma
concentração de 137,4 mg.L-1, sendo que a eficiência na remoção do COT (%) é
apresentada na Tabela 4.
Tabela 4. Eficiência (%) na remoção de COT do efluente hospitalar sob diferentes
condições de tratamento, após 40 minutos.
Tratamento*
Eficiência
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
19,74 22,19 21,10 3,02 12,66 16,20 6,38 11,05 15,30
* Nove tratamentos: (A1) ozonólise (2 L.min-1), (A2) sonólise/ozonólise (70 W.L-1 e 2
L.min-1), (A3) sonólise/ozonólise (100 W.L-1 e 2 L.min-1), (B1) ozonólise (2 L.min-1),
(B2) sonólise/ozonólise (70 W.L-1 e 2 L.min-1), (B3) (100 W.L-1 e 2 L.min-1), (C1)
ozonólise (2 L.min-1), (C2) (70 W.L-1 e 2 L.min-1), (C3) (100 W.L-1 e 2 L.min-1).
84
Todos os resultados apresentados nas Tabelas 3 e 4 demontram que a
redução de COT foi pouco significativa, indicando que a ação direta ou indireta (via
radicais) foi incapaz de levar a completa mineralização da matéria orgânica presente
no efluente hospitalar, provavelmente devido a baixa concentração de ozônio
dissolvido no meio, além da sua seletividade em oxidar compostos orgânicos. Cui et
al. (2011) demonstraram que a associação sonólise/ozonólise (35 kHz e 2 L.min -1)
removeu cerca de 1% do COT relacionado a soluções com substâncias orgânicas
complexas (ácido tânico e ácido húmico). Com relação ao tratamento de efluentes
brutos, o rendimento da ozonólise é inversamente proporcional à quantidade de
matéria orgânica em suspensão, pois a mesma impede que o gás atinja as
moléculas orgânicas localizadas no interior do agregado sólido (NADDEO et al.,
2009a; GOTTSCHALK et al., 2010). Ainda, conforme Almeida et al. (2004), a
ozonólise é um processo que apresenta grande potencial para remediação de
efluentes farmacêuticos, devido à capacidade do processo em remover compostos
refratários como os tipicamente encontrados neste efluente, no entanto a eficiência
de remoção de COT é pequena. Mesmo que de forma pouco significativa, em todos
os tratamentos a associação sonólise/ozonólise levou a uma maior remoção da
matéria orgânica, condizente com dados da literatura (SONG et al., 2007). Em pH
7,0 e 9,0, a eficiência na remoção de COT foi melhorada quanto maior a densidade
de potência do US aplicada, ou seja, 27,96 e 38,46% mais eficiente para os
tratamentos com o US em 100 W.L-1, comparados com aqueles em 70 W.L-1.
Os resultados em pH 3,0 são questionáveis pois quando a correção do pH foi
realizada, foi percebido que houve ligeira coagulação/floculação do material em
suspensão/dissolvido, o que pode ter ocorrido pela presença de algum coagulante
com ação ótima em meio ácido. Por consequência, este material que ficou em
suspensão foi retirado via filtração, mascarando os resultados da remoção de
matéria orgânica pela oxidação química.
Devido ao pH 7,0 ser o mais próximo do pH dos efluentes hospitalares, além
de apresentar a melhor remoção do COT pela técnica associada, a eficiência dos
tratamentos B1 e B3 foi comparada em termos de DBO e DQO. A Tabela 5
apresenta os valores de DBO e DQO dos efluentes, relacionando estas informações
com a biodegradabilidade das amostras.
85
Tabela 5. DQO, DBO e Biodegradabilidade do efluente bruto e após 40 minutos
com diferentes condições de tratamento.
DBO
DQO
Razão DBO/DQO
Efluente Bruto
719,4
1390
0,51
Tratamento B1
610
1188
0,51
Tratamento B3
500
923
0,54
Analisando-se a tabela 5, a remoção da DBO foi 15,20% e 30,49% para a
ozonólise e sonólise/ozonólise, respectivamente. Com relação à DQO, as reduções
foram de 14,53% e 33,59%. Outra observação importante é que, através da relação
DBO/DQO, pode-se perceber que o efluente aumenta a quantidade de matéria
orgânica susceptível ao tratamento biológico (METCALF & EDDY, 1991). Pode-se
enfatizar que o efluente hospitalar analisado pode sofrer biodegradação natural pois
a relação DBO/DQO foi de 0,51 e valores desta relação maiores que 0,4 indicam
uma biodegradabilidade natural de parte das amostras, enquanto valores menores
que 0,4 indicam baixa biodegradabilidade, conforme Figura 30.
.
Figura 30. Valores de DQO e DBO indicativos de tratabilidade do efluente.
Fonte: Jardins & Canela, 2004.
86
A remoção da matéria orgânica total ou química/bioquímicamente degradável
ainda é um desafio para a ozonólise, principalmente quando aplicada a matrizes
residuais complexas, como é o caso dos efluentes hospitalares. No entanto, a
associação com a sonólise proporcionou uma melhor remoção destes compostos,
sendo que a complementação desta técnica por um tratamento biológico pode ser
averiguada, com potencial de utilização. Nesse sentido, a sonólise acarreta uma
desagregação física dos sólidos em suspensão, aumentando a área superficial da
matéria orgânica susceptível de sofrer oxidação pelo contato com ozônio, levando a
uma
maior
eficiência
na
degradação
química
(NADDEO
et
al.,
2009b;
GOTTSCHALK et al., 2010)
4.3
Eficiência na Desinfecção
Como a eficiência na remoção de COT não foi expressiva, a otimização das
técnicas de tratamento propostas neste trabalho foi continuada, agora direcionada
para a eficiência das diferentes condições de tratamento na desinfecção e
desnaturação do material genético presente no efluente hospitalar. Novamente, seis
diferentes experimentos foram executados durante 20 minutos, ou seja: (1)
ozonólise (1 L.min-1), (2) ozonólise (2 L.min-1), (3) sonólise/ozonólise (70 W.L-1 e 1
L.min-1), (4) sonólise/ozonólise (100 W.L-1 e 1 L.min-1), (5) sonólise/ozonólise (70
W.L-1 e 2 L.min-1) e (6) sonólise/ozonólise (100 W.L-1 e 2 L.min-1). As quantidades de
UFC’s durante os tratamentos são apresentadas na Tabela 6:
87
Tabela 6. Quantitativo de UFC’s.mL-1 de efluente hospitalar nos seis diferentes
tratamentos e em 4 intervalos de tempo.
Tempo/Tratamento
5 min.
10 min.
15 min.
20 min.
Ozonólise (1 L.min-1)
Incontáveis
Incontáveis
Incontáveis
Incontáveis
Ozonólise (2 L.min-1)
Incontáveis
Incontáveis
Incontáveis
Incontáveis
Sonólise/Ozonólise
(70 W.L-1 e 1 L.min-1)
Incontáveis
Incontáveis
Incontáveis
Incontáveis
Sonólise/Ozonólise
(100 W.L-1 e 1 L.min-1)
Incontáveis
Incontáveis
7000
3100
Sonólise/Ozonólise
(70 W.L-1 e 2 L.min-1)
Incontáveis
Incontáveis
2520
303
Sonólise/Ozonólise
(100 W.L-1 e 2 L.min-1)
Incontáveis
6000
160
70
Em todos os tratamentos, após 20 minutos de contato do desinfetante, ainda
restaram colônias viáveis, levando a um novo desenho experimental. Assim, as duas
melhores condições de tratamento associado (i.e. 2 L.min-1 70 W.L-1 e 2 L.min-1 / 100
W.L-1), além da melhor condição de ozonólise individual (2 L.min -1) foram novamente
realizadas em uma nova amostra de efluente, agora com duração de 40 minutos, no
intuito de verificar a dose de ozônio aplicada, o que não foi possível frente a não
quantificação das colônias viáveis em todos os tempos, bem como avaliar o tempo
necessário para desinfecção. A evolução na desinfecção é apresentada na Figura
31, em seis intervalos de tempo diferentes.
88
5000
O3
Viabilidade Celular (UFC mL
-1
)
O3 + US 70 W L
-1
O3 + US 100 W L
4000
-1
3000
2000
1000
0
0
10
20
30
40
Tempo de Tratamento (min.)
Figura 31. Evolução da eficiência dos diferentes tratamentos na desinfecção do
efluente hospitalar.
Comparando-se com os primeiros testes de desinfecção e, mesmo
verificando-se que a quantidade inicial de colônias viáveis no efluente hospitalar era
menor, o processo de desinfecção foi mais lento, provavelmente devido a maior
quantidade de material em suspensão presente nesta segunda amostra de efluente.
Materiais em suspensão funcionam como escudos para as bactérias (CHIANG et al.,
2003). Observando-se a Figura 31 pode-se perceber que a associação O3/US
apresentou melhor efeito sinérgico positivo quanto maior a densidade de potência do
US aplicada. Os três tratamentos, após 40 minutos, proporcionaram a desinfecção
total do efluente. No entanto, após 20 minutos, a ozonólise aplicada individualmente
foi 42,53% eficiente na desinfecção, contra 82,53 e 92,18% quando associada a
sonólise em 70 e 100 W.L-1, respectivamente.
Os resultados mostraram um efeito de desinfecção dos efluentes, sendo que
o número de bactérias diminui de maneira dependente do tempo para todos os
tratamentos testados. No entanto, quando o efluente foi tratado via ozonólise, o
número de bactérias viáveis permaneceu elevado por um maior período de tempo,
89
mostrando que a associação sonólise/ozonólise, independente da intensidade de
potência no meio, é mais eficiente na inativação de bactérias. Estudos mostraram
que o ozônio é eficaz tanto contra bactérias gram positivas quanto gram negativas
(GREENE et al., 1993). Algumas células bacterianas entraram em colapso dentro de
60 minutos, além de ruptura celular severa após 90 minutos de tratamento com
ozônio. A eficácia de desinfecção em termos de viabilidade celular de uma cultura
bacteriana é fortemente dependente da concentração de ozônio e do tempo de
contato, sugerindo que, se a quantidade adequada de ozônio for aplicada, este é
eficaz na desinfecção, destruindo a membrana celular bacteriana, produzindo
dispersão intracelular e eventualmente causando a ruptura celular (THANOMSUB et
al., 2002). O ultrassom também é um desinfetante reconhecido por ser capaz de
inativar bactérias e aglomerados bacterianos através de diferentes efeitos físicos,
químicos e mecânicos resultantes da cavitação acústica (JOYCE et al., 2003). A
associação do ozônio com ultrassom de baixa frequência e alta intensidade também
é relatada como eficiente da desinfecção do efluente proveniente de uma ETE
(DAHL, 1976). Outros estudos também demonstraram sinergismo positivo da
associação das técnicas, mas não há resultados demonstrando com segurança o
mecanismo de ação conjunta O3/US na desinfecção, além da necessidade de
aprofundamento na questão custo/benefício.
A associação sonólise/ozonólise foi demonstrada como sendo sempre mais
eficiente que a utilização de ozônio sozinho (JYOTI & PANDIT, 2003; BOTT &
TIANGING, 2004). Jyoti & Pandit (2004) demonstraram que a associação do ozônio
com ultrassom (aplicado de maneira similar a este trabalho), resultou em uma
melhor desinfecção que outros métodos associados, como US/H 2O2. A elevada taxa
de desinfecção é atribuída à produção de radicais hidroxila e oxigênio nascente,
produzidos durante a decomposição do ozônio. Estas substâncias podem atacar
compostos orgânicos nas membranas celulares dos microrganismos, resultando em
sua ruptura, afetando a viabilidade celular e, consequentemente, alcançando a
desinfecção. Como a concentração dos radicais é dependente da dose de ozônio,
maiores concentrações tem levado a uma melhor eficiência na desinfecção (DAHL,
1976; JYOTI & PANDIT, 2004). Jyoti & Pandit (2004) alcançaram 100% de eficiência
90
com 2 mg.L-1 de O3 durante 60 minutos, associado ao ultrassom (22 kHz, 240 W),
com concentrações iniciais máximas de microrganismos na ordem de 8000 UFC.mL 1
. Além dos radicais e do oxigênio nascente, existem outras teorias para explicar o
efeito sinérgico positivo. Segundo Dahl (1976), o ultrassom proporciona a
desagregação de flocos de microrganismos, tornando as células mais susceptíveis
aos fenômenos que ocorrem nas circunvizinhanças, como a cavitação e/ou
alterações nas concentrações dos oxidantes. Ainda, o fenômeno da cavitação, que
envolve a formação, crescimento e colapso violento de bolhas de vapor no meio
líquido, elevando a pressão e temperatura local, afeta a viabilidade das células e
microrganismos (JYOTI & PANDIT, 2003). Outra hipótese é a ruptura transitória de
ligações químicas entre os componentes moleculares da membrana celular,
resultando no aumento da permeabilidade de substâncias em geral, como os
oxidantes (moleculares e/ou radicais) (BOUCHER et al., 1967). Conforme Boucher et
al. (1967), o ultrassom permite a penetração mais rápida do O 3 no microrganismo
por uma melhor transferência gás/líquido (i.e., transferência de massa), fenômeno
diretamente ligado à presença de radicais, que destroem as paredes celulares e são
reconhecidamente os principais responsáveis pela eficiência do tratamento (JYOTI &
PANDIT, 2004; JYOTI & PANDIT, 2003).
Quando
uma
concentração
crítica
dos
radicais
é
atingida,
uma
inativação/desinfecção muito rápida das bactérias é observada (JYOTI & PANDIT,
2004; CHIANG et al., 2003). Antes desta queda súbita, a eficiência da desinfecção
por ozônio depende da concentração de O3 e do tempo de contato, o que pode ser
mensurado conforme as equações 7 e 8 já apresentadas. A Tabela 7 apresenta as
concentrações de O3 nos diferentes tempos e tratamentos. As variações de
temperatura também são demonstradas, as quais certamente influenciam na
concentração de ozônio no meio reacional.
91
Tabela 7. Concentração de ozônio no reator em função do tempo e da temperatura.
Tratamentos
O3 + US 70 W.L-1
O3
Tempo (min.)
O3 + US 100 W.L-1
Concentração de O3 (mg/L) / Temperatura do efluente (°C)
5
0,4 / 23
0,3 / 23
0,3 / 28
10
0,4 / 23
0,3 / 28
0,3 / 35
15
0,4 / 23
0,4 / 32
0,3 / 38
20
0,5 / 23
0,4 / 36
0,4 / 45
30
0,5 / 23
0,5 / 43
0,4 / 51
40
0,6 / 23
0,5 / 47
0,5 / 57
Para o caso da ozonólise (temperatura constante), com o passar do tempo há
um aumento na saturação do O3 no meio líquido. No caso da associação da
ozonólise/sonólise, essa saturação é menor por causa do aumento da temperatura e
por causa da destruição do O3 pelo ultrassom. Aplicando estes resultados ao modelo
cinético proposto por Collins & Elleck apud Chiang et al. (2003), as eficiências de
desinfecção para os 3 diferentes tratamentos são demonstradas na Tabela 8,
juntamente com sua correlação:
Tabela 8. Correlação das eficiências de desinfecção dos diferentes tratamentos
realizados.
Tratamento
Eficiência na
Coeficiente de
desinfecção, CT
correlação, R
(1) O3
0,733 x S-0,505
0,73
(2) O3 + US 70 W/L
0,467 x S-0,471
0,82
(3) O3 + US 100 W/L
0,284 x S-0,415
0,92
As dosagens de ozônio obtidas a partir da eficiência (a eficiência desejada é
aplicada diretamente na equação do modelo cinético) na desinfecção para os
diferentes tratamentos para remoção de 99% das bactérias foi de:
- ozonólise: 7,5 mg.L-1.min-1 (75,75 mg.L-1.min-1 para 99,99% de desinfecção);
92
- ozonólise/sonólise (70 W.L-1): 4,08 mg.L-1.min-1 (37,75 mg.L-1.min-1 para 99,99%
de desinfecção);
- ozonólise/sonólise (100 W.L-1): 1,92 mg.L-1.min-1 (12,98 mg.L-1.min-1 para 99,99%
de desinfecção).
Mesmo cientes de que a desinfecção não foi ocasionada unicamente pela
ozonólise (no caso dos tratamentos 2 e 3), os valores obtidos demonstram um
aumento significativo na velocidade de desinfecção juntamente com uma diminuição
da dose de O3 necessária para este efeito quando comparado à eficiência da
ozonólise pura. Assim, nossos resultados demonstram que a sonólise (70 W.L -1)
associada a ozonólise reduziu a dose de ozônio necessária para desinfecção em
52,80%, enquanto que a maior densidade de ultrassom utilizada neste estudo (100
W.L-1) foi suficiente para diminuir 82,86% da quantidade de ozônio. Isso demonstra
que o fluxo de O2 que alimenta o gerador de ozônio pode ser investigado
(possivelmente diminuido) quando se associa o O3/US, obtendo-se o mesmo
resultado aqui apresentado com um menor consumo do reagente e/ou em um menor
tempo de tratamento.
Thanomsub et al. (2002) expôs diferentes culturas de bactérias (Escherichia
coli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis) a concentração de
0,167 mg.L.min-1 de ozônio, sendo este método eficiente após 30 minutos para todos
os microrganismos presentes em quantidades equivalentes a 10 5 UFC.mL-1. Em
quantidades superiores, mesmo após 150 minutos de tratamento, não houve total
desinfecção. Os resultados alcançados em nosso trabalho foram superiores a
desinfecção de água potável, onde Katzenelson (1978) determinou a dose de ozônio
entre 0,006 e 0,020 mg.L-1.min-1. No entanto, neste trabalho a eficiência na
desinfecção foi considerada 99%, sendo que em nosso trabalho os valores
considerados foram de 99 e 99,99%. No caso de se requerer uma taxa maior de
desinfecção, haverá uma diferença significativa na dosagem requerida do oxidante,
pois há um crescimento exponencial na quantidade de O3 necessária para aumentar
alguns decimais na porcentagem de desinfecção.
Com relação às placas-controle, semeadas com efluente submetido a um
gradiente de aquecimento (até 57 °C), apesar da redução das células viáveis, as
mesmas ainda apresentaram atividade reprodutiva ao final de 40 minutos, o que
93
demonstra que a elevação da temperatura não é o principal fator que leva à
desinfecção. Da mesma forma, os dois tratamentos-controle relacionados ao
ultrassom não foram eficientes na remoção de todas as colônias viáveis, conforme
acompanhamento da evolução quantitativa dos tratamentos (Figura 32).
A
B
Figura 32. Placas de Petri semeadas nos diferentes tempos de tratamento por
sonólise (controle). A = 70 W.L-1 e B = 100 W.L-1. Tempo: Diluição e Volume
Plaqueado: 5 min.: 1:10 e 100 µL. 10 min.: 1:10 e 200 µL. 15 min.: 1 e 100 µL. 20
min.: 1 e 100 µL. 30 min.; 1 e 200 µL. 40 min.: 1 e 400 µL.
Joyce et al. (2003) aplicaram ultrassons de baixa frequência (20 e 38 kHz) e
alta potência (180 e 240 W.L-1), por até 15 minutos, em soluções estoque de Bacillus
subtilis, resultando em desaglomeração e inviabilização bacteriana, sendo que na
taxa de desinfecção superior, no final do tratamento ainda se observaram colônias
94
viáveis. Em outro estudo em que o ultrassom foi utilizado (20 kHz) individualmente
na desinfecção de esgoto doméstico, mostrou-se que aproximadamente 52% da
eficiência foi atribuída a elevação da temperatura, 36% por fenômenos associados a
tensões mecânicas resultantes da cavitação e 12% não foi caracterizado (MADGE &
JENSEN, 2002).
É sabido que a elevação da temperatura proporciona a morte dos
microrganismos, porém não chega a degradar o material genético presente no meio,
pois este pode estar protegido do calor. Como outros tipos de tratamento oxidativos
ou térmicos, a ozonólise e a sonólise/ozonólise aqui testadas podem levar a ruptura
celular e possivelmente a liberação de todo conteúdo citoplasmático, incluindo
plasmídeos que podem carregar genes passíveis de transmitirem a informação
genética veiculada pelos mesmos com relação à sobrevivência dos organismos
(mutados ou não ou, ainda, resistentes aos antibióticos ou não). Assim, a
quantificação de material genético (nuclear ou dos plasmídeos) foi realizada no
intuito de verificar se os tratamentos possuem influência sobre a desnaturação do
material genético susceptível de transmitir/portar informações genéticas para os
organismos presentes no meio receptor dos efluentes hospitalares.
4.4
Influência dos Tratamentos sobre os Plamídeos Bacterianos
A respeito da presença de material genético (i.e., plamídeos) com possíveis
genes de resistência a antibióticos no efluente hospitalar, testou-se o efeito dos
tratamentos sobre a integridade do material genético presente nos efluentes tratados
e bruto, os quais podem ser visualizados na Figura 33. Mais uma vez optou-se por
verificar a eficiência do tratamento de ozonólise isolado e do tratamento associado,
em duas diferentes configurações de ultrassom (diferentes densidades de potência).
95
1
2
3
4
Figura 33. Gel de eletroforese da extração de ADN plasmídico obtido a partir do
efluente hospitalar. As amostras foram analisadas por meio de gel de agar 1% (m/v)
e o ADN foi visualizado sob luz UV (312 nm) após coloração com brometo de etídio.
Linhas: 1 – efluente bruto, 2 – efluente submetido a sonólise/ozonólise (2 L.min -1 e
100 W.L-1), 3 – sonólise/ozonólise (2 L.min-1 e 70 W.L-1) e 4 – ozonólise (2 L.min-1).
Os plasmídeos foram extraídos do efluente bruto e dos efluentes submetidos
às diferentes condições de tratamento, conforme mostrado. Em todas as condições
testadas não foram observadas células viáveis após 40 minutos de tratamento,
entretanto, os resultados da eletroforese mostram que o tratamento por ozonólise
não foi capaz de destruir os plasmídeos em comparação com o efluente bruto
(Figura 33, linhas 4 e 1). Os plasmídeos provenientes das quatro corridas
eletroforéticas foram quantificados, assim como a pureza das amostras foi
determinada, conforme resultados apresentados na Tabela 9.
Tabela 9. ADN plasmídico presente no efluente bruto e nos efluentes submetidos
aos diferentes tratamentos.
[ADN] (µg.mL-1)
Pureza da amostra (A260/A280)
Efluente bruto
2097,5
1,86
O3
2066,5
1,81
O3 + US 70 W.L-1
763
1,80
O3 + US 100 W.L-1
390,5
1,81
Tratamento
96
Os resultados mostram que a associação sonólise/ozonólise foi mais eficaz
na desnaturação do material genético, independente da densidade de potência no
meio reacional, sugerindo que esta condição de tratamento pode ser mais segura
para este tipo de efluente. A relação A260/A280 demonstra que o ADN isolado não
está contaminada de forma significativa por proteínas, o que corrobora com a
eficiência do tratamento associado com relação à destruição do material genético
plasmídico.
A transferência gênica entre bactérias ocorre, principalmente, por conjugação
e por transdução, que permitem a passagem de material genético para indivíduos da
mesma espécie, de espécies diferentes e até mesmo de gêneros diferentes
(GRIFFITHS et al., 2000), cujos termos específicos são transferência gênica vertical
ou horizontal (também denomindada de lateral). Destaca-se a importância dos
plasmídeos nesse processo, através do processo de conjugação. Ainda, o ambiente
poluído por esgotos hospitalares pode ser favorável à expressão desses plasmídeos
e à troca de material genético entre as bactérias devido a grande presença de
matéria orgânica (DODD, 2012; SO et al., 2012).
Segundo Öncü et al. (2011), a ozonólise (0,9 mg.L-1) foi capaz de degradar
100% do ADN plasmídico presente em uma amostra padrão preparada com
concentração inicial de 6,4 µg.mL-1, após 1 minuto de exposição. Apesar da
eficiência na degradação do material genético em um pequeno tempo de exposição,
deve-se considerar que o estudo foi conduzido em água Milli-Q, ou seja, na ausência
de outras substâncias que competem pelo oxidante (ÖNCÜ et al., 2011). Outra
observação pertinente é que a concentração de material genético utilizada pelos
autores é muito inferior ao encontrado neste estudo utilizando um efluente hospitalar
real, conforme dados da Tabela 7. Ainda com relação a estes dados, percebe-se
que nenhum dos métodos utilizados proporcionaram a degradação completa do
material genético, mas a técnica associada de ozonólise/ultrassom foi muito superior
em eficiência, degradando 81,4 e 63,6% do material genético plasmídico (O 3/US 100
W.L-1 e O3/US 70 W.L-1, respectivamente). A ozonólise degradou apenas 1,48% do
ADN presente na amostra. O ozônio tem como alvo principal a membrana
bacteriana, com reações subsequentes envolvendo componentes intracelulares,
proteínas e ADN (KOMANAPALLI & LAU, 1996). O ozônio causa danos ao ADN
97
através de reações moleculares (O3) e radicalares (•OH) (ZEE et al., 1987). Neste
sentido, mesmo na ausência de trabalhos que evidenciem danos ao material
genético causados pela associação sonólise/ozonólise, pode-se afirmar que este
método
apresenta
sinergia
positiva
na
degradação
de
ADN
plasmídico,
possivelmente devido a elevação na concentração de radicais (principalmente
hidroxila), além de não podermos desconsiderar todos os outros fenômenos já
descritos, como a cavitação e os seus efeitos, os quais possivelmente estiveram
envolvidos nas reações devido a considerável diferença na eficiência dos
tratamentos.
4.5
Ecotoxicidade
Os testes de toxicidade são ferramentas desejáveis para avaliar a qualidade
das águas e a carga poluidora de efluentes, uma vez que somente as análises
físico-químicas tradicionalmente realizadas, como DQO, DBO, COT, concentrações
de metais e de outras substâncias de caráter orgânico ou inorgânico, cujos limites
encontram-se estabelecidos nas legislações ambientais, não são capazes de
distinguir entre as substâncias que afetam os sistemas biológicos e as que são
inertes no ambiente e, por isso, não são suficientes para avaliar o potencial de risco
ambiental dos contaminantes (FERRARI et al., 2004; EMMANUEL et al., 2005;
BLAISE et al., 2006; PANDARD et al., 2006).
Testes ecotoxicológicos também tem sido aplicados na avaliação do impacto
potencial de efluentes hospitalares reais, bem como para a avaliação da eficiência
dos sistemas de tratamento convencionais e avançados (FERRARI et al., 2004;
EMMANUEL et al., 2005; BLAISE et al., 2006).
Conhecidas as sensibilidades específicas de cada bioindicador e, a partir dos
intervalos de confiança de cada organismo (vide Anexos Figuras 1A a 4A),
apresenta-se a seguir os resultados obtidos nos testes ecotoxicológicos. A Tabela
10 caracteriza o efluente bruto, enriquecido com os fármacos citostáticos, quanto à
ecotoxicidade para os quatro diferentes organismos teste:
98
Tabela 10. Características Ecotoxicológicas do Efluente Bruto Enriquecido com 10
mg.L-1 de doxorrubicina, 30 mg.L-1 de metotrexato e 10 mg.L-1 de docetaxel.
CE50/CL50
IC CE50/CL50
FD
Aliivibrio fischeri
1,7%
1,25% - 2,22%
256
Pseudokirchniriella subcaptata
6,2%
5,40% - 6,91%
64
Daphnia magna
70,7%
64,72% - 76,69%
2
Danio rerio
35,4%
30,74 - 39,97%
4
Após tratamento do efluente bruto, caracterizado ecotoxicológicamente na
Tabela 10, os efluentes tratados por ozonólise e sonólise/ozonólise são
apresentados nos mesmos termos do efluente bruto, conforme Tabelas 11 e 12,
respectivamente.
Tabela 11. Características Ecotoxicológicas do Efluente Tratado via Ozonólise.
CE50/CL50
IC CE50/CL50
FD
Aliivibrio fischeri
-
-
1
Pseudokirchniriella subcaptata
17,1%
15,04% - 19,34%
32
Daphnia magna
70,7%
64,72% - 76,69%
2
Danio rerio
30,8%
26,76% - 34,79%
8
Tabela 12. Características
Sonólise/Ozonólise
Ecotoxicológicas
do
Efluente
Tratado
CE50/CL50
IC CE50/CL50
FD
Aliivibrio fischeri
-
-
1
Pseudokirchniriella subcaptata
58,2%
51,06% - 65,30%
8
Daphnia magna
89,1%
81,54% - 96,63%
2
Danio rerio
26,8%
23,29% - 30,28%
8
por
Novamente de forma comparativa, o tratamento com ozonólise que já tinha
apresentado menor eficiência do que o tratamento associado (O 3/US) em termos de
remoção de COT e desinfecção, apresentou menor eficiência em termos de
99
detoxificação dos efluentes tratados expostos a 3 tipos de organismos vivos:
bactérias, algas, daphnias.
Algumas observações importantes podem ser obtidas através da análise das
Tabelas 10, 11 e 12. Primeiro, para o bioindicador Aliivibrio fischeri, os dois
tratamentos eliminaram totalmente a toxicidade do efluente bruto, ou seja, as
bactérias não apresentaram redução da bioluminescência mesmo quando em
contato com as amostras puras, sem diluição. Segundo, conforme resposta das
microalgas, os efluentes tratados ainda apresentaram toxicidade, mas houve
considerável redução da mesma. É possível perceber que o tratamento associado
foi, no mínimo, 164% mais eficiente na remoção da toxicidade, considerando-se os
limites superior e inferior dos intervalos de confiança para ozonólise e
sonólise/ozonólise, respectivamente. Com relação às daphnias, apenas o tratamento
associado conseguiu reduzir, mesmo que modestamente, a toxicidade do efluente
hospitalar. Para os peixes, os tratamentos de ozonólise e ozonólise/sonólise são
equivalentes quando se observa o Intervalo de Confiança dos resultados.
Conforme legislação do Estado de Santa Catarina, segundo Portaria
017/2002 da Fundação Estadual do Meio Ambiente (FATMA, 2002), a qual
estabelece os limites máximos de toxicidade aguda para efluentes de diferentes
origens, os fatores máximos de toxicidade para efluentes hospitalares devem ser 4 e
1 para Aliivibrio fischeri e Daphnia magna, respectivamente. Neste sentido o
tratamento proposto nesta pesquisa estaria muito próximo ao recomendado quando
se observa a CE50 do tratamento associado, analisando-se os resultados para
Daphnia magna. Os resultados com Aliivibrio fischeri atendem a legislação.
Para uma matriz ambiental complexa, como é o caso dos efluentes
hospitalares, a identificação das substâncias responsáveis pela toxicidade das
amostras, sejam elas tratadas ou não, é uma tarefa de elevada complexidade,
principalmente por não se conhecerem todos os integrantes presentes no efluente,
além da necessidade de instrumentação analítica específica. Neste trabalho, mesmo
conhecendo-se
algumas
substâncias
presentes
no
efluente
(metotrexato,
doxorrubicina e docetaxel), até o momento não foi possível à determinação de
possíveis resíduos das mesmas, após tratamentos. É provável que, conforme
concentrações iniciais do metotrexato e da doxorrubicina, além dos dados cinéticos
100
de degradação já apresentados neste trabalho, que os tratamentos tenham
alcançado 100% de eficiência na degradação destas substâncias. O mesmo não
pode ser suposto para o docetaxel devido à ausência de dados de degradação desta
substância pelos métodos aqui empregados.
As daphnias apresentaram a menor sensibilidade entre todos os organismosteste utilizados, provavelmente devido ao modo de ação dos citostáticos, os quais
podem manifestar apenas efeitos não específicos, como a narcose apolar, intervindo
no crescimento dos organismos e não apresentando elevada toxicidade aguda. Em
solução aquosa, Zounková et al. (2007) demonstraram que a doxorrubicina é um dos
citostáticos mais tóxicos para este microcrustáceo quando comparada a outros
fármacos citostáticos. O mesmo estudo também demonstrou que a doxorrubicina é
toxica para microalgas da espécie Pseudokirchneriella subcapitata. Henschel et al.
(1997) verificou a ecotoxicidade do metotrexato em diferentes testes (bactérias,
algas, crustáceos, ciliados e peixes), demonstrando toxicologia para todos os
organismos, apresentando teratogenicidade em embriões de peixe e uma CE50 de
85 mg.L-1 após 48 h de exposição e efeitos de toxicidade aguda em ciliados
Tetrahymena pyriformis com uma CE50 de 45 mg.L-1 após 48 h de exposição.
Villegas-Navarro et al. (1997) estudaram a toxicidade de efluentes
hospitalares para Daphnia magna., sendo que dois hospitais (entre três estudados)
produziram efluentes tóxicos para este bioindicador.
Em se tratando de amostras de natureza química complexa, como é o caso
de efluentes industriais, os quais são constituídos por uma variedade de substâncias
químicas, seria analítica e economicamente inviável detectar, identificar e quantificar
todas as substâncias presentes, mesmo que os padrões de emissão fossem
estabelecidos para cada uma delas. Além disso, somente com a identificação e a
quantificação dessas substâncias não seria possível estimar os efeitos que elas
apresentam sobre a biota, uma vez que a atividade biológica de uma substância
pode depender de suas interações com os outros componentes do efluente,
incluindo aqueles que não são tóxicos mas que afetam as propriedades químicas ou
físicas do sistema e, consequentemente, as condições de vida dos organismos.
Assim, é impossível identificar uma única substância como responsável por um
determinado efeito tóxico (COSTA et al., 2008).
101
Mesmo assim, algumas tentativas de identificação de substâncias foram
realizadas, utilizando-se a CG-EM, conforme segue.
4.6
Análise de Intermediários
Embora compostos específicos, principalmente fármacos citostáticos, venham
sendo na sua grande maioria qualificados e quantificados em efluentes por extração
em fase sólida com posterior análise por CLAE-EM/EM (ZHANG et al., 2013),
buscou-se neste estudo, verificar o perfil de degradação do efluente hospitalar pelas
diferentes técnicas de tratamento aqui propostas, procurando a identificação das
substâncias por CG-EM, conforme disponibilidade de metodologias já publicadas e
limitações de sensibilidade dos equipamentos disponíveis. A Figura 34 apresenta os
cromatogramas do efluente bruto e dos efluentes tratados por ozonólise e
sonólise/ozonólise, após 40 minutos de tratamento, utilizando hexano na extração
dos analitos.
Figura 34. Cromatogramas obtidos por CG-EM a partir do efluente bruto (A),
ozonizado (B) e sonicado/ozonizado (C), utilizando hexano na extração dos analitos.
No mesmo sentido, a Figura 35 demonstra os cromatogramas do efluente
bruto e dos efluentes tratados durante 40 minutos, utilizando neste caso
diclorometano na extração dos analitos.
102
Figura 35. Cromatogramas obtidos por CG-EM a partir do efluente bruto (A),
ozonizado (B) e sonicado/ozonizado (C), utilizando diclorometano na extração dos
analitos.
Independente
caracterizado
por
do
solvente
CG-EM
utilizado,
apresentaram
os
maior
extratos
do
variedade
efluente
de
bruto
substâncias
(observação visual dos picos nos cromatogramas) quando em comparação com os
efluentes tratados. Também é visível, principalmente quando hexano foi utilizado na
extração, que a associação sonólise/ozonólise proporcionou melhor degradação dos
compostos diversos, o que é condizente com os resultados obtidos na degradação
das drogas citostáticas, conforme apresentado neste trabalho. Especificamente, o
pico com tempo de retenção 15,343 min,, segundo a espectroteca Nist 98, é o ácido
N-hexadecanóico (99% de semelhança). Aparentemente este composto foi
altamente degradado pelo método associado O3/US. Com relação ao pico em
18,500 min. (entre vários picos), o composto é provavelmente o 2-[2-[4(1,1,3,3(tetrametilbutil)fenóxi]etóxi]etanol (Nist 98 - 99% de semelhança), o qual
também parece que foi degradado pela associação O3/US. O pico em 19,345 min é
o fosfato 2-butóxi-etanol (Nist 98 - 99% de semelhança), o qual deixou de existir
após o efluente ser tratado pelo método associado.
103
5.
CONCLUSÕES
Os dados sobre os estabelecimentos de saúde que tratam seus efluentes
(algumas
vezes
denominados
erroneamente
de
esgotos) são
alarmantes,
perfazendo cerca de 2,4% segundo um estudo publicado por Vecchia et al. (2009), o
que com certeza é representativo da realidade brasileira. Para reverter esta
realidade, o primeiro passo, depois da sensibilização do problema é o
estabelecimento de normas federais e estaduais relativas ao gerenciamento dos
efluentes líquidos, como já existente para os resíduos sólidos. Este gerenciamento
possibilitará chegar a problemas mais específicos, tais quais a eficiência de
destruição de resíduos fármacológicos e seus subprodutos metabólicos e a
desinfeção total de microorganismos presentes nestes efluentes. Caso outros
estudos também venham a comprovar a dissociação entre os processos de
desinfecção e de desnaturação do material genético, então haverá a necessidade de
se pensar em métodos de tratamentos mais avançados que destruam todo material
genético presente nestes efluentes, mas também presentes nos lodos gerados nas
estações de tratamento dos efluentes hospitalares.
Nos sistemas de tratamento de efluentes hospitalares que se servem de
processos microbiológicos, uma atenção maior terá que ser dirigida para os
microorganismos presentes nestes processos de biodegradação, pois os mesmos
poderão ser “genotecas” (i.e., depósito de genes) relativos à multirresistência aos
antibióticos, pois estes organismos estarão em contato com os resíduos de
antibióticos (possibilidade de adquirir resistência por mutações próprias) e com
organismos já mutados que poderão transferir estes genes para os microorganismos
ainda sem resistência. O pior cenário que se desenha desse meio/contexto é o
aparecimento de uma “super-bactéria” resistente a todos os fármacos existentes.
Contudo, deve ser salientado que os estudos atuais já demonstram indícios deste
cenário catastrófico devido ao desleixo generalizado para uma importante questão
que é o gerenciamento de resíduos hospitalares líquidos. Estas questões só serão
melhor compreendidas por estudos complementares, os quais também poderão
analisar as eficiências, em termos de desnaturação do material genético, dos
104
tratamentos aplicados.
Neste sentido e mais especificamente, esta tese procurou contribuir para o
desenvolvimento de um sistema de tratamento para os efluentes hospitalares
contaminados com fármacos citostáticos, buscando otimizar a eficiência de um
processo oxidativo avançado, ou seja, a ozonólise, associando a esta técnica a
aplicação de ultrassom (sonólise), avaliando o sistema proposto em termos físicoquímicos, microbiológicos e ecotoxicológicos.
O sistema de tratamento apresentou-se eficiente na degradação de fármacos
citostáticos, principalmente quando associado (sonólise/ozonólise) demonstrando
que a taxa de degradação de alguns citostáticos é dependente do pH do meio
reacional. O citostático doxorrubicina mostrou-se mais resistente à degradação, no
entanto, a elevação do pH para 11,0 pode acarretar na degradação desta
substância.
Com relação ao efluente hospitalar, vários aspectos podem ser abordados.
De maneira geral, os tratamentos apresentaram alguma eficiência no que tange a
todos os parâmetros estudados, mais pronunciadamente em termos de degradação
do material genético, para o tratamento associado.
Neste sentido, gestores dos estabelecimentos de saúde devem estar atentos
com relação à eficiência dos sistemas de tratamento de efluentes utilizados, uma
vez que estes efluentes são propícios para o surgimento de bactérias resistentes
aos antimicrobianos. O nível de conhecimento atual deixa claro que os fármacos
residuais e os seus metabólitos, assim como todo o material genético que sai das
estações de tratamento devem ser destruídos. Os poderosos processos de oxidação
disponíveis, mas raramente utilizados, para o tratamento de águas residuárias (e.g.,
ozonólise) apresentam elevado poder de desinfecção. No entanto, nossos
resultados mostraram que o material genético (i.e., ADN de plasmídeos) ainda está
presente após 40 minutos de tratamento com ozônio (0,5 mg.L -1, fluxo de 2 L.min-1).
Este ADN plasmídico pode ser responsável pela THG, contribuindo para o
aparecimento de novas estirpes de bactérias resistentes aos antibióticos. Os nossos
resultados demonstraram também que a associação sonólise/ozonólise é mais
eficaz na desinfecção e degradação do material genético presente nos efluentes
assim como na remoção de matéria orgânica, avaliada aqui em termos de DBO,
105
DQO e COT. Os resultados evienciam que a densidade de potência do ultrassom
está relacionada com a eficiência do tratamento com relação a todos os parâmetros
físico-químicos e microbiológicos. A elevação na densidade de potência possibilitou
uma maior remoção da matéria orgânica, assim como viabilizou uma maior
degradação do ADN plasmídico. No entanto, pode-se dizer que desinfecção não
deve ser sinônimo para degradação do material genético, uma vez que a ozonólise
mostrou-se um poderoso agente desinfectante, no entanto não oxidou o material
genético presente neste efluente, nas condições de aplicação já mencionadas.
Estudos adicionais devem ser realizados com outras técnicas para melhorar o
conhecimento sobre esta importante questão de saúde pública e ambiental.
Estes resultados obtidos permitem afirmar que a tese proposta no início do
doutoramento, a qual era a de que “a associação de um processo químico
(ozonização) com um processo físico (ultrassom) deve aumentar a taxa de
degradação de fármacos presentes nos efluentes hospitalares e deve destruir
(desnaturar) o material genético da microbiologia presente nestes efluentes,
tornando os efluentes liberados menos impactantes no meio-ambiente” foi
confirmada e está em concordância com o atual estágio de conhecimento sobre a
qualidade dos efluentes hospitalares.
Ainda, o emprego de métodos associados parece reduzir a formação de subprodutos tóxicos, conforme resultados dos testes ecotoxicológicos, além dos ensaios
via cromatografia gasosa, os quais indicam a redução dos subprodutos formados.
Testes de toxicidade crônica também devem ser realizados para melhor avaliar as
baixas concentrações das diversas substâncias perigosas presentes nos efluentes,
como é o caso dos citostáticos.
No que tange o tratamento de efluentes em escala piloto ou real, banhos
ultrasônicos podem ser utilizados para a desinfecção, mas devem ter sua eficiência
avaliada em termos de degradação do material genético.
Ademais, tendo em conta a complexidade da degradação oxidativa, estudos
mais detalhados devem ser conduzidos para elucidar os mecanismos químicos
envolvidos nestes processos. De maneira geral, este trabalho será de grande valia
para o desenvolvimento de um sistema piloto de tratamento de efluentes
contaminados com citostáticos, bem como auxiliará na estruturação de um sistema
106
que vise à degradação de substâncias que podem levar ao surgimento de bactérias
multiresistentes, as quais estão diretamente associadas à saúde pública,
principalmente em ambientes hospitalares.
107
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Adams, C. D.; Scanlan, P. A.; Secrist, N. D. Oxidation and Biodegradability
Enhancement
of
1,4-Dioxane
Using
Hydrogen
Peroxide
and
Ozone.
Environmental Science & Technology, 28, 11, 1812–1818, 1994.
Aherne, G. W.; English, J.; Marks, V. The role of immunoassay in the analysis of
microcontaminants in water samples. Ecotoxicology and Environmental Safety, 9,
1, 79–83, 1985.
Almeida, E; Assalin, M. R; Rosa, M. A; Duran, N. Tratamento de Efluentes
Industriais por Processos Oxidativos Avançados na Presença de Ozônio.
Química Nova, 27, 5, 818-824, 2004.
Almeida, V. L.; Leitão, A.; Reina, L. C. B.; Montanari, C. A.; Donnici, C. L.; Lopes, M.
T. P. Câncer a Agentes Antineoplásicos Ciclo-Celular Específicos e CicloCelular Não Específicos que Interagem com o DNA: Uma Introdução. Química
Nova, 28, 1, 118-129, 2005.
Al-Momami, F. Combination of photo-oxidation processes in the biological
treatment. Doctoral Thesis, Universitat de Barcelona, Facultat de Quimica,
Barcelona, 2003.
American Public Health Association, American Water Works Association, Water
Pollution Control Federation, Standard Methods for the Examination of Water And
Wastewater, 19th ed., Section 8220, Washington, DC, 1995.
American Public Health Association. American Water Works Association, Water
Pollution Control Federation, Standard methods for the examination of water and
watwater, 21th ed. Washington, DC, 2005.
108
Andreozzi, R.; Caprio, V.; Insola, A.; Martota, R. Advanced oxidation processes
(AOP’s) for water purification and recovery. Catalysis Today, 53, 51-59, 1999.
Associação Brasileira de Normas Técnicas - ABNT. NBR 12648. Ecotoxicologia
aquática - Toxicidade crônica - Método de ensaio com algas. (Chlorophyceae).
Rio de Janeiro, 2005. 24p.
Associação Brasileira de Normas Técnicas - ABNT. NBR 12713. Ecotoxicologia
aquática - Toxicidade aguda - Método de ensaio com Daphnia spp. (Cladocera,
Crustacea). Rio de Janeiro, 2004. 16 p.
Associação Brasileira de Normas Técnicas - ABNT. NBR 15088. Ecotoxicologia
aquática – toxicidade aguda – método de ensaio com peixes. São Paulo, 2004.
19 p.
Associação Brasileira de Normas Técnicas - ABNT. NBR 15411-3: Determinação
do efeito inibitório de amostras de água sobre a emissão de luz de Aliivibrio
fischeri (Ensaio de bactéria luminescente) Parte 3: Método utilizando bactérias
liofilizadas. Rio de Janeiro, 2007. 18 p.
Badawy, M. I.; Wahaab, R. A.; El-Kalliny, A. S. Fenton-biological treatment
processes
for
the removal
of some
pharmaceuticals from industrial
wastewater. Journal of Hazardous Materials, 167, 567-574, 2009.
Balakrishnan, P. A; Arunagiri, A; Rao, P. G. Ozone generation by silent electric
discharge and its application in tertiary treatment of tannery effluent. Journal of
Electrostatics, 56, 1, 77-86, 2002.
Barbas, C.F. III; Burton, D.R.; Scott, J. K.; Silverman, G.J. Quantification of DNA
and RNA. Cold Spring Harbor Protoc., 2007.
109
Barceló, D. Emerging Organic Contaminants and Human Health. Hdb Env. Chem.
Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2012.
Beltrán, F. J.; García-Araya, J. F.; Alvarez, P. Impact of chemical oxidation on
biological treatment of a primary municipal wastewater. 1. Effects on cod and
biodegradability. Ozone: Science & Engineering, 19, 6, 495-512, 1997.
Berto, J.; Rochenbach, G. C.; Barreiros, M. A. B.; Corrêa, A. X. R.; Peluso-Silva, S.;
Radetski, C. M. Physico-chemical, microbiological and ecotoxicological
evaluation of a septic tank/Fenton reaction combination for the treatment of
hospital wastewaters. Ecotoxicology and Environmental Safety, 72, 4, 1076–1081,
2009.
Besse, J. P.; Latour, J. F.; Garric, J. Anticancer drugs in surface waters: What
can we say about the occurrence and environmental significance of cytotoxic,
cytostatic and endocrine therapy drugs? Environment International, 39, 1, 73–
86, 2012.
Bila, D. M.; Dezotti, M. Fármacos no meio ambiente. Química Nova, 26, 523-530,
2003.
Birnboim, H. C; Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research, 7, 6, 1513–1523, 1979.
Blaise, C.; Gagné, F. ; Eullaffroy, P. ; Férard, J.-F. Ecotoxicity of selected
pharmaceuticals of urban origin discharged to the Saint-Lawrence river
(Québec, Canada): a review. Brazilian Journal of Aquatic Science and Technology,
10, 29–51, 2006.
Bott, T. R. Tianging, L. Ultrasound enhancement of biocide efficiency. Ultrasonics
Sonochemistry, 11, 323–326, 2004.
110
Boucher, R. M. G.; Pisano, M. A.; Tortora, G.; Sawicki, E. Synergistics effects in
sonochemical sterilization. Applied Microbiology, 15, 6, 1257–1261, 1967.
Boyle, P.; Levin, B. (editors). World Cancer Report, IARC Press, Lyon, France,
2008.
Brasil, 2005. Resolução CONAMA n° 357, de 17 de março de 2005. Dispõe sobre a
classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento,
bem como estabelece as condições e padrões de lançamento de efluentes. Data da
legislação: 17/03/2005 – Publicação DOU: 18/03/2005, Seção I. Diário Oficial da
União, Brasília.
Brasil, 2011. Resolução CONAMA n° 430, de 13 de maio de 2011. Dispõe sobre as
condições e padrões de lançamento de efluentes, complementa e altera a
Resolução no 357, de 17 de março de 2005, do Conselho Nacional do Meio
Ambiente-CONAMA. Data da legislação: 13/05/2011 – Publicação DOU: 16/05/2011,
DOU no 92. Diário Oficial da União, Brasília.
Castiglioni, S.; Bagnati, R.; Calamari, D.; Fanelli, R.; Zuccato, E.; A multiresidue
analytical method using solid-phase extraction and high-pressure liquid
chromatography tandem mass spectrometry to measure pharmaceuticals of
different therapeutic classes in urban wastewaters. Journal of Chromatography
A, 1092, 206-215, 2005.
Chagas, T. P. G.; Seki, L. M.; Cury, J. C.; Oliveira, J. A. L.; Dávila, A. M. R.; Silva, D.
M.; Asensi, M. D. Multiresistance, beta-lactamase-encoding genes and bacterial
diversity in hospital wastewater in Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Applied
Microbiology, 111, 572–581, 2011.
111
Chernicharo, C. A. L.; Daniel, L. A.; Sens, M.; Coraucci Filho, B. Pós-Tratamento de
Efluentes Anaeróbios por Sistemas de Desinfecção. In: Chernicharo, C. A. L.
(Coord.). Pós-tratamento de Efluentes de Reatores Anaeróbios. Belo Horizonte:
Segrac
Editora
e
Gráfica
Ltda.,
2001.
http://www.finep.gov.br/prosab/livros/ProsabCarlos/Cap-7.pdf,
Disponível
em:
capturado
em:
22/02/2013.
Chiang, C; Tsai, C; Lin, S; Huo, C; Lo, K. V. Disinfection of Hospital Wastewater
by Continuous Ozonization. Journal of Environmental Science and Health Part A –
Toxic/Hazardous Substances & Environmental Engineering, A38, 12, 2895-2908,
2003.
Costa, C. R.; Olivi, P.; Botta, C. M. R.; Espindola, E. L. G. A toxicidade em
ambientes aquáticos: discussão e métodos de avaliação. Química Nova, 31, 7,
1820-1830, 2008.
Cui, M.; Jang, M.; Cho, S.; Elena, D.; Khim, J. Enhancement in mineralization of a
number of natural refractory organic compounds by the combined process of
sonolysis and ozonolysis (US/O3). Ultrasonics Sonochemistry, 18, 773–780, 2011.
Dahl, E. Physicochemical Aspects of Disinfetion of Water by Means of
Ultrasound and Ozone. Water Research, 10, 677–684, 1976.
Destaillats, H.; Colussi, A. J.; Joseph, J. M.; Hoffmann, M. R. Synergistic effects of
sonolysis combined with ozonolysis for the oxidation of azobenzene and
methyl orange. The Journal of Physical Chemistry A, 104, 8930–8935, 2000.
Dodd, M. C. Potential impacts of disinfection processes on elimination and
deactivation of antibiotic resistance genes during water and wastewater
treatment. Journal of Environmental Monitoring, 14, 1754-1771, 2012.
112
Dorion, E.; Severo, E.; Olea, P.; Nodari, C.; Guimaraes, J. F. Hospital
environmental and residues management: Brazilian experiences. Journal of
Environmental Assessment Policy and Management, 14, 3, 1250018, 2012.
Eissen, M.; Backhaus, D. Pharmaceuticals in the environment: an educational
perspective. Environmental Science and Pollution Research, 18, 1555–1566, 2011.
Emmanuel, E.; Perrodin, Y.; Blanchard, J.M.B.; Keck, G.; Vermande, P.
Ecotoxicological risk assessment of hospital wastewater : a proposed
framework for raw effluents discharging into urban sewer network. Journal of
Hazardous Materials, 117, 1-11, 2005.
Environment Protection Authority of South Australia - EPA. EPA Guidelines:
Regulatory monitoring and testing Water and wastewater sampling, 35 p.
Adelaide, South Australia, ISBN 978-1-921125-47-8, 2007.
Fahmy, O. T.; Korany, M. A; Maher, H. M. High performance liquid
chromatographic determination of some co-administered anticancer drugs in
pharmaceutical preparations and in spiked human plasma. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 34, 1099–1107, 2004.
Ferk, F.; Misík, M.; Grummt, T.; Majer, B.; Fuerhacker, M.; Buchmann, C.; Vital, M.;
Uhl, M.; Lenz, K.; Grillitsch, B.; Parzefall, W.; Nersesyan, A.; Knasmüller, S.
Genotoxic effects of wastewater from an oncological ward.
Mutation
Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 672, 2, 69-75, 2009.
Fernández-Alba, A. R.; Hernando, D.; Agüera, A.; Cáceres, J.; Malato, S. Toxicity
assays: a way for evaluating AOPs efficiency. Water Research, 36, 4255-4262,
2002.
113
Ferrari, B.; Mons, R.; Vollat, B.; Fraysse, B.; Paxeus, N.; Lo Giudice, R.; Pollio, A.;
Garric, J. Environmental risk assessment of six human pharmaceuticals: are
the current environmental risk assessment procedures sufficient for the
protection of the aquatic environment? Environtal Toxicology and Chemistry, 23,
1344–1354, 2004.
Flint, E. B.; Suslick, K. S. The Temperature of Cavitation. Science, 253, 1397-1399,
1991.
Freire, R. S.; Pelegrini, R.; Kubota, L. T.; Rurán, N.; Peralta-Zamora, P. Novas
Tendências para o Tratamento de Resíduos Industriais contendo Espécies
Organocloradas. Química Nova, 23, 4, 504-511, 2000.
Fundação Estadual do Meio Ambiente de Santa Catarina - FATMA. Portaria
número 017/2002. Estabelece os Limites Máximos de Toxicidade Aguda para
efluentes de diferentes origens e dá outras providências. 18/04/2002.
Gautama, A. K.; Kumarb, S.; Sabumon, P. C. Preliminary study of physicochemical treatment options for hospital wastewater. Journal of Environmental
Management, 83, 298–306, 2007.
Gogate, P. R.; Pandit, A. B. A review of imperative technologies for wastewater
treatment I: oxidation technologies at ambient conditions. Advances in
Environmental Research, 8, 501–551, 2004.
Gottschalk, C.; Libra, J. A.; Saupe, A. Ozonation of Water and Waste Water – A
Practical Guide to Understanding Ozone and its Applications, Second,
completely, revised and updated edition. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,
Weinheim, Germany, 2010, p. 150.
114
Greene, A. K.; Few, B. K.; Serafini, J. C. A comparison of ozonation and
chlorination for the disinfection of stainless steel surfaces. Journal of Dairy
Science, 76, 3617–3620, 1993.
Griffiths, A. J. F.; Wessler, S. R.; Lewontin, R. C.; Carroll, S. B. Introdução à
Genética. 7ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. p. 194-197, 344-345, 2000.
Gros, M.; Petrovic, M.; Ginebreda, A.; Barcelo, D. Removal of pharmaceuticals
during wastewater treatment and environmental risk assessment using hazard
indexes. Environmental International, 36, 15-26, 2010.
Guardabassi, L.; Petersen, A. J. O.; Dalsgaard, A. Antibiotic resistance in
Acinetobacter spp. Isolated from sewers receiving waste effluent from a
hospital and a pharmaceutical plant. Applied and Environmental Microbiology, 64,
3499-3502, 1998.
Halldin, K.; Berg, C.; Brandt, I.; Brunström, B. Sexual behavior in Japanese quail
as a test end point for endocrine disruption: effects of in ovo exposure to
ethinylestradiol and diethylstilbestrol. Environmental Health Perspectives, 107,
11, 861–866, 1999.
Halling-Sorensen, B.; Nielsen, S. N.; Lanzky, P. F.; Ingerslev, F.; Lutzhof, C. H.;
Jorgensen, S. E. Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in
the environment – a review. Chemosphere, 36, 357-393, 1998.
Hartig, C.; Storm, T.; Jekel, M. Detection and identification of sulphonamide
drugs in municipal waste water by liquid chromatography coupled with
electrospray ionisation tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography
A, 854, 1-2, 163-173, 1999.
115
Hawkshead, J. J. Hospital wastewater containing pharmaceutically active
compounds and drug-resistant organisms: a source of environmental toxicity
and increased antibiotic resistance. Journal of
Residuals Science and
Technology, 5, 51-60, 2008.
Heinzle, E.; Kut, O. M.; Stockinger, H. Ozonation of wastewater containing Nmethylmorpholine-N-oxide. Water Research, 30, 8, 1745-1748, 1996.
Henschel, K. P.; Wenzel, A.; Diedrich, M.; Fliedner, A. Environmental hazard
assessment of pharmaceuticals. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 25,
220–225, 1997.
Hignite, C.; Azarnoff, D. Drugs and drug metabolites as environmental
contaminants: Chlorophenoxyisobutyrate and salicylic acid in sewage water
effluent. Life Sciences, 20, 2, 337-341, 1977.
Hirsch, R.; Ternes, T.; Haberer, K.; Kratz, K. Occurrence of Antibiotics in the
Aquatic Environment. Science of the Total Environment, 225, 109-118, 1999.
Hoignè, J.; Bader, H. The role of hydroxyl radical reaction in ozonation
processes in aqueous solutions. Water Research, 10, 5, 377-386, 1976.
Ikehata, K.; Naghashkar, N. J.; El-Din, M. G. Degradation of aqueous
pharmaceuticals by ozonation and advanced oxidation processes: A review.
Ozone: Science & Engineering, 28, 353–414, 2006.
Ince, N. H.; Tezcanli, G. Reactive dyestuff degradation by combined sonolysis
and ozonation. Dyes and Pigments, 49, 145–153, 2001.
Jardim, W. F.; Canela, M. C. Fundamentos da Oxidação Química no Tratamento
de Efluentes e Remediação de Solos. Caderno Temático, Volume 1. (Instituto de
Química. Laboratório de Química Ambiental). 10p. Campinas/SP. UNICAMP, 2004.
116
Johnson, A. C.; Jurgens, M. D.; Williams, R. J.; Kummerer, K.; Kortenkamp, A.;
Sumpter, J. P. Do cytotoxic chemotherapy drugs discharged into rivers pose a
risk to the environment and human health? An overview and UK case study.
Journal of Hydrology, 348, 1-2, 167-175, 2008.
Joyce, E.; Phull, S. S.; Lorimer, J. P.; Mason, T. J. The development and
evaluation of ultrasound for the treatment of bacterial suspensions. A study of
frequency, power and sonication time on cultured Bacillus species. Ultrasonics
Sonochemistry, 10, 315–318, 2003.
Juhas, M.; Van Der Meer, J. R.; Gaillard, M.; Harding, R. M.; Hood, D. W. Crook, D.
Genomic islands: tools of bacterial horizontal gene transferand evolution.
FEMS Microbiology Reviews, 33, 376–393, 2009.
Jyoti, K. K.; Pandit, A. B. Effect of cavitation on chemical disinfection efficiency.
Water Research, 38, 2249–2258, 2004.
Jyoti, K. K.; Pandit, A. B. Hybrid cavitation methods for water disinfection:
simultaneous use of chemicals with cavitation. Ultrasonics Sonochemistry, 10,
255–264, 2003.
Kajitvichyanukul, P.; Suntronvipart, N. Evaluation of biodegradability and
oxidation degree of hospital wastewater using photo-Fenton process as the
pretreatment method. Journal of Hazardous Materials, B138, 384–391, 2006.
Katzenelson, E. Inactivation of viruses and bacteria in water by use of ozone.
Journal (American Water Works Association), 66, 725–729, 1978.
Kiffmeyer,
T.;
Götze,
H-J.;
Jursch,
M.;
Lüders,
U.
Trace
enrichment,
chromatographic separation and biodegradation of cytostatic compounds in
surface water. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 361, 2, 185-191, 1998.
117
Klavarioti, M.; Mantzavinos, D.; Kassinos, D. Removal of residual pharmaceuticals
from aqueous systems by advanced oxidation processes. Environmental
International, 35, 402-417, 2009.
Knie, J. L. W.; Lopes, E. W B. Testes Ecotoxicológicos: Métodos, técnicas e
aplicações. FATMA/GTZ, Florianópolis, Brasil, 2004, 289 p.
Kolpin, D. W.; Furlog, E. T.; Meyer, M. T.; Thurman, E. M.; Zaugg, S. D.; Barber, L.
B.; Buxton, H. T. Pharmaceuticals, Hormones, and Other Organic Wastewater
Contaminants in U.S. Streams, 1999−2000:
A National Reconnaissance.
Environmental Science & Technology, 36, 1202, 2002.
Komanapalli, I. R.; Lau, B. H. S. Ozone-induced damage of Escherichia coli K-12.
Applied Microbiology and Biotechnology, 46, 5-6, 610-614, 1996.
Koonin, E. V.; Makarova, K. S.; Aravind, L. Horizontal gene transfer in
prokaryotes: quantification and classification. Annual Review of Microbiology, 55,
709–742, 2001.
Kosjek, T.; Heath, E. Occurrence, fate and determination of cytostatic
pharmaceuticals in the environment. Trends in Analytical Chemistry, 30, 7, 2011.
Kruse, H.; SØrum, H. Transfer of Multiple Drug Resistance Plasmids between
Bacteria of Diverse Origins in Natural Microenvironments. Applied and
Environmental Microbiology, 60, 11, 4015-4021, 1994.
Kümmerer, K. Drugs in the environment: emission of drugs, diagnostic aids and
disinfectants into wastewater by hospitals in relation to other sources - a
review. Chemosphere, 45, 957-969, 2001.
118
Kümmerer, K.; Al-Ahmad, A. Estimation of the cancer risk to humans resulting
from the presence of cyclophosphamide and ifosfamide in surface water.
Environmental Science and Pollution Research, 17, 2, 486-496, 2010.
Ledakowics. S.; Gonera, M. Optimization of oxidant dose for combined chemical
and biological treatment of textile wastewater. Water Research, 33, 1, 2511-2516,
1999.
Legrini, O.; Oliveros, E.; Braun, A. M. Photochemical processes for water
treatment. Chemical Reviews. 93, 671–698, 1993.
Lenz, K. Mahnik, S. N.; Weissenbacher, N.; Mader, R. M.; Krenn, P.; Hann, S.;
Koellensperger, G.; Uhi, M.; Knasmüller, S.; Ferk, F.; Bursch, W.; Fuerhacker, M.
Monitoring, removal and risk assessment of cytostatic drugs in hospital
wastewater. Water Science & Technology, 56, 12, 141–149, 2007.
Lintelmann, J.; Katayama, A.; Kurihara, N.; Shore, L.; Wenzel, A. Endocrine
Disruptors in the Environment (IUPAC Technical Report). Pure and Applied
Chemistry, 75, 5, 631-681, 2003.
Lorimer, J. P.; Mason, T. J. Sonochemistry Part 1 – The Physical Aspects.
Chemical Society Reviews, 16, 239-274, 1987.
Madge, B. A.; Jensen, J. N. Disinfection of Wastewater Using a 20-kHz
Ultrasound Unit. Water Environment Research, 74, 2, 159-169, 2002.
Mahamuni, N. N.; Adewuyi, Y. G. Advanced oxidation processes (AOPs)
involving ultrasound for waste water treatment: A review with emphasis on
cost estimation. Ultrasonics Sonochemistry, 17, 990–1003, 2010.
119
Mahnik, S. N.; Lenz, K.; Weissenbacher, N.; Mader, R. M.; Fuerhacker, M. Fate of 5fluorouracil, doxorubicin, epirubicin, and daunorubicin in hospital wastewater
and their elimination by activated sludge and treatment in a membrane-bioreactor system. Chemosphere, 66, 30-37, 2007.
Marco, A.; Esplugas, S.; Saum, G. How and why combine chemical and
biological processes for wastewater treatment. Water Science and Technology,
35, 321-327, 1997.
Martines, M. A. U.; Davolos, M. R.; Jafelicci Jr., M. O efeito do ultra-som em
reações químicas. Química Nova, 23, 251-256, 2000.
Martín, J.; Camacho-Muñoz, D.; Santos, J. L.; Aparicio, I.; Alonso, E. Simultaneous
determination of a selected group of cytostatic drugs in water using highperformance liquid chromatography–triple-quadrupole mass spectrometry.
Journal of Separation Science, 34, 22, 3166–3177, 2011.
Martins, A. F.; Mayer, F.; Confortin, E. C.; Frank, C. S. A Study of Photocatalytic
Processes Involving the Degradation of the Organic Load and Amoxicilin in
Hospital Wastewater. Clean, 37, 365-371, 2009.
Matthews, R. W. Phooxidative degredation of coloured organics in water using
supported catalysts. Water Research, 25, 10, 1169-1176, 1991.
Metcalf, E.; Eddy, B. Wastewater Engineering - Treatment, Disposal and Reuse,
3rd ed., McGraw Hill Editions, Nova York, 1991.
Miège, C.; Choubert, J. M.; Ribeiro, L.; Eusèbe, M.; Coquery, M. Removal efficiency
of pharmaceuticals and personal care products with varying wastewater
treatment processes and operating conditions. Conception of a database and
first results. Water Science and Technology, 57, 49-56, 2008.
120
Miller, J. H. Experiments in molecular genetics. New York: Cold Spring Harbor,
1972.
Mulroy, A. When the cure is the problem. Water Environment Technology, 13, 3136, 2001.
Naddeo, V.; Belgiorno, V.; Kassinos, D.; Mantzavinos, D.; Meric, S. Ultrasonic
degradation,
mineralization
and
detoxification
of
diclofenac
in
water:
Optimization of operating parameters. Ultrasonics Sonochemistry, 17, 179–185,
2010.
Naddeo, V.; Belgiorno, V.; Landi, M.; Zarra, T.; Napoli, R. M. A. Effect of sonolysis
on waste activated sludge solubilisation and anaerobic biodegradability.
Desalination, 249, 762–767, 2009a.
Naddeo, V.; Belgiorno, V.; Ricco, D.; Kassinos, D. Degradation of diclofenac
during sonolysis, ozonation and their simultaneous application. Ultrasonics
Sonochemitry, 16, 790–794, 2009b.
Ning, B.; Graham, N. J. D.; Lickiss, P. D. A comparison of ultrasound-based
advanced oxidation processes for the removal of X-ray contrast media. Water
Science and Technology, 60, 2383–2390, 2009.
Nogueira, R. F. P.; Guimarães, J. R. Processos Oxidativos Avançados: uma
alternativa para o tratamento de efluentes. Engenharia Sanitária e Ambiental, 3, 3,
97-100, 1998.
Nuñez, L.; Moretton, J. Disinfectant-resistant bacteria in Buenos Aires city
hospital wastewater. Brazilian Journal of Microbiology, 38, 644-648, 2007.
Nussbaumer, S.; Bonnabry, P.; Veuthey, J-L.; Fleury-Souverain, S. Analysis of
anticancer drugs: A review. Talanta, 85, 2265– 2289, 2011.
121
OECD, Safety Assessment of Transgenic Organisms, Volume 4: Organization for
Economic Cooperation and Development Consensus Documents, Paris, 2010.
Öncü, N. B.; Menceloğlu, Y. Z.; Balcıoğlu, I. Comparison of the Effectiveness of
Chlorine, Ozone, and Photocatalytic Disinfection in Reducing the Risk of
Antibiotic Resistance Pollution. Journal of Advanced Oxidation Technologies, 14,
2, 196-203, 2011.
Oppenländer, T. Photochemical Purification of Water and Air: Advanced
Oxidation Processes (AOPs) - Principles, Reaction Mecanisms, Reactor
Concepts. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim, Germany, 2003.
Pandard, P.; Devillers, J.; Charissou, A-M.; Poulsen, V.; Jourdain, M-J.; Férard, J-F.;
Grand, C.; Bispo, A. Selecting a battery of bioassays for ecotoxicological
characterization of wastes. Science of The Total Environment, 363, 114-125, 2006.
Popowska, M.; Miernik, A.; Rzeczycka, M.; Lopaciuk, A. The Impact of
Environmental Contamination with Antibiotics on Levels of Resistance in Soil
Bacteria. Journal of Environmental Quality, 39, 1679–1687, 2010.
Prüss, A.; Giroult, E.; Rushbrook, P. Safe Management of Wastes from Health
Care Activities, vol. 9. World Health Organization, Geneva, 1999.
Radetski, C. M.; Rosa, S. M. C.; Rosa, E. V. C.; Souza Sierra, M. M.; Simionatto, E.
L. Ozonation of Textile Wastewater: Physico-Chemical and Phytotoxic Aspects.
Environtal Technology, 23, 537-545, 2002.
Ratoarino, R.; Contamine, F.; Wilhelm, A. M.; Berlan, J.; Delmas, H. Power
measurement in sonochemistry. Ultrasonics Sonochemistry, 2, S43-S47, 1995.
122
Reinthaler, F. F.; Feierl, G.; Wüst, G.; Haas, D.; Ruckenbauer, G.; Mascher, F.;
Marth, E. Antibiotic resistance of E. coli sewage and sludge. Water Research, 37,
1685-1690, 2003.
Rolim, P. Panorama da Indústria Farmacêutica. “Comunicação Pessoal”. (Curso
de Especialização em Atenção Farmacêutica. Centro de Ciências da Saúde.
Departamento de
Ciências
Farmacêuticas.
Laboratório de Tecnologia
dos
Medicamentos). Recife, UFPE, Universidade Federal de Pernambuco, 2005.
Rooze, J.; Rebrov, E.V.; Schouten, J.C.; Keurentjes, J.T.F. Effect of resonance
frequency, power input, and saturation gas type on the oxidation efficiency of
an ultrasound horn. Ultrasonics Sonochemistry, 18, 209–215, 2011.
Sacher, F.; Lange, F. T.; Brauch, H.; Blankenhorn, I. Pharmaceuticals in
groundwaters; analytical methods and results of a monitoring program in
Baden-Württemberg, Germany. Journal of Chromatography A, 938, 1-2, 199-210,
2001.
Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning a laboratory manual. 2
ed. New-york: Cold Spring Harbor, 1989.
Santos, L. H. M. L. M.; Araújo, A. N.; Fachini, A.; Pena, A. Ecotoxicological aspects
related to the presence of pharmaceuticals in the aquatic environment. Journal
of Hazardous Materials, 175, 45-95, 2010.
Scott, J.; Ollis, D. Engineering Models of Combined Chemical and Biological
Processes. Journal of Environmental Engineering, 122, 12, 1110–1114, 1996.
Shimadzu, PC – Controlled Total Organic Carbon Analyser - TOC – VCPH/CPN &
TOC – Control V SoFDware. Manual do Usuário. 394p. Shimadzu Corporation –
Analytical & Measuring Instruments Division, Kyoto, Japan, 2003.
123
Smith, P.; Samuelsen, O. B. Estimates of the significance of out-washing of
oxytetracycline from sediments under Atlantic salmon sea-cages. Aquaculture,
144, 17, 1996.
So, J. H.; Kim, J.; Bae, I. K.; Jeong, S. H.; Kim, S. H.; Lim, S. K.; Park, Y. H.; Lee, K.
Dissemination of multidrug-resistant Escherichia coli in Korean veterinary
hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 73, 195-199, 2012.
Somensi, C. A.; Simionatto, E. L.; Bertoli, S. L.; Wisniewski Jr., A.; Radetski, C. M.
Use of Ozone in a pilot-scale plant for textile wastewater pré-treatment:
Physico-chemical efficiency, degradation by-products identification and
environmental toxicity of treated wastewater. Journal of Hazardous Materials,
175, 235-240, 2010.
Somensi, C. A.; Simionatto, E. L.; Dalmarco, J. B.; Gaspareto, P.; Radetski, C. M. A
comparison between ozonolysis and sonolysis/ozonolysis treatments for the
degradation of the cytostatic drugs methotrexate and doxorubicin: Kinetic and
efficiency approaches. Journal of Environmental Science and Health, Part A, 47,
1543–1550, 2012.
Song, S.; Xia, M.; He, Z.; Ying, H.; Lü, B.; Chen, J. Degradation of p-nitrotoluene
in aqueous solution by ozonation combined with sonolysis. Journal of
Hazardous Materials, 144, 532–537, 2007.
Takahashi, N.; Nakai, T.; Satoh, Y.; Katoh, Y. Variation of biodegradability of
nitrogenous organic compounds by ozonation. Water Research, 26, 1563-1570,
1994.
Tavares, W. Bactérias gram-positivas problemas: resistência do estafilococo,
do enterococo e do pneumococo aos antimicrobianos. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, 33, 281-301, 2000.
124
Taylor, N. G. H.; Verner-Jeffreys, D. W.; Baker-Austin, C. Aquatic systems:
maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance? Trends in Ecology
and Evolution, 26, 6, 278-284, 2011.
Ternes, T. A.; Hirsch, R. Occurrence and Behavior of X-ray Contrast Media in
Sewage Facilities and the Aquatic Environment. Environmental Science &
Technology, 34, 2741-2748, 2000.
Ternes, T. A. Occurrence of drugs in German sewage treatment plants and
river. Water Research, 32, 3245-3260, 1998.
Thanomsub, B.; Anupunpisit, V.; Chanphetch, S.; Watcharachaipong, T.; Poonkhum,
R.; Srisukonth, C. Effects of ozone treatment on cell growth and ultrastructural
changes in bacteria. The Journal of General and Applied Microbiology, 48, 193–
199, 2002.
United
States
Environmental
Protection
Agency
-
USEPA.
Advanced
Photochemical Oxidation Processes. EPA/625/R-98/007. ORD, Washington, DC,
1998.
United States Environmental Protection Agency - USEPA. Alternative desinfectants
and oxidants guidance manual. EPA/815-R-99-014, Office of Water, Washington,
DC., 1999.
Van Elsas, J. D.; Bailey, M. J. The ecology of transfer of mobile genetic
elements. FEMS Microbiology Ecology, 42, 187-197, 2002.
Vasconcelos, T. G.; Kümmerer, K.; Henriques, D. M.; Martins, A. F. Ciprofloxacin in
hospital effluent: Degradation by ozone and photoprocesses. Journal of
Hazardous Materials, 169, 1154-1158, 2009.
125
Vecchia, A. D.; Thewes, M. R.; Harb Naime, R.; Spilki, F. R. Diagnóstico sobre a
situação do tratamento do esgoto hospitalar no Brasil. Revista Saúde e
Ambiente / Health and Environment Journal, 10, 65-70, 2009.
Verlicchi, P.; Galletti, A.; Petrovic, M.; Barceló, D. Hospital effluents as a source of
emerging pollutants: An overview of micropollutants and sustainable treatment
options. Journal of Hydrology, 389, 416–428, 2010.
Verma, J. K; Syed, H. Spectrophotometric Method for Determination of
Methotrexate,
Sildenafil
Citrate
and
Trimetazidine
Dihydrochloride
in
Pharmaceutical Formulations. Journal of Pharmacy Research, 3, 615-617, 2010.
Villegas-Navarro, A.; Santiago, M. R.; Pérez, F. R.; Torres, R. R.; Abularach, T. D.;
Reyes, J. L. Determination of LC50 from Daphnia magna in treated industrial
waste waters and non-treated hospital effluents. Environment International, 23, 4,
535-540, 1997.
Von Gunten, U. Ozonation of drinking water: Part I. Oxidation kinetics and
product formation. Water Research, 37, 1443–1467, 2003.
Weavers, L. K.; Malmstadt, N.; Hoffmann, M. R. Kinetics and mechanism of
pentachlorophenol degradation by sonication, ozonation, and sonolytic
ozonation. Environmental Science & Technology, 34, 1280–1285, 2000.
Wollenberger, L.; Halling-Soerensen, B.; Kusk, K. O. Acute and Chronic Toxicity of
Veterinary Antibiotics to Daphnia magna. Chemosphere, 40, 723-730, 2000.
World Health Organization. Fact sheet on Environmental Sanitation. Epidemic
Diarrhoeal Diseases Control. Geneva, World Health Organization, 2006.
126
Wunkang, J.; Hoffmann, M. Kinetics and Mechanism of the Sonolytic Destruction
of Methyl tert-Butyl Ether by Ultrasonic Irradiation in the Presence of Ozone.
Environmental Science & Technology, 32, 3194-3199, 1998.
Würgler, F. E.; Kramers, P. G. N. Environmental-effects of genotoxins
(ecogenotoxicology). Mutagenesis, 7, 321-327, 1992.
Yin, J.; Shao, B.; Zhang, J.; Li, K. A Preliminary Study on the Occurrence of
Cytostatic Drugs in Hospital Effluents in Beijing, China. Bulletin of Environmental
Contamination and Toxicology, 84, 39–45, 2010.
Zee, J. V. D.; Dubbelman, M. A. R.; Steveninck, J. V. The Role of Hydroxyl
Radicals in the Degradation of DNA By Ozone, 2, 4-6, 279-284, 1987.
Zhang, H.; Duan, L.; Zhang, D. Decolorization of methyl orange by ozonation in
combination with ultrasonic irradiation. Journal of Hazardous Materials, B138,
53–59, 2006.
Zhang, J.; Chang, V. W. C.; Giannis, A.; Wang, J. Removal of cytostatic drugs
from aquatic environment: A review. Science of the Total Environment, 445–446,
281–298, 2013.
Zhang, X. X.; Zhang, T.; Fang, H. H. P. Antibiotic resistance genes in water
environment. Applied Microbiology and Biotechnology, 82, 397–414, 2009.
Zounková, R.; Odráska, P.; Dolezalova, L.; Hilscherova, K.; Marsalek, B.; Blahá, L.
Ecotoxicity and Genotoxicity Assessment of Cytostatic Pharmaceuticals.
Environmental Toxicology and Chemistry, 26, 10, 2208–2214, 2007.
127
ANEXOS
CARTAS DE CONTROLE DAS SENSIBILIDADES DOS ORGANISMOS USADOS
NOS TESTES DE ECOTOXICIDADE
1a) Aliivibrio fischeri (ABNT NBR 15411, 2006), os ensaios são validados quando os
valores de inibição da luminescência estão entre 20 e 80 %, sendo estes os limites
inferior e superior, respectivamente. A substância-teste utilizada é o Cr6+, na forma
de dicromato de potássio (K2Cr2O7). A Figura 1A apresenta a inibição de
luminescência dos organismos em diferentes períodos.
Figura 1A. Carta de sensibilidade do bioindicador Aliivibrio fischeri ao Cr6+.
A partir da carta de sensibilidade, a inibição média calculada da
luminescência foi de 38,84%, com desvio padrão de 10,86%. Assim, o intervalo de
confiança do teste foi calculado em 27,96%.
1b) Pseudokirchniriella subcaptata (ABNT NBR 12648, 2005) os ensaios são
validados quando os valores da CE50 variam dentro da faixa estabelecida pela
norma, ou seja, +/- 2 desvios-padrão em relação à média. A substância-teste
utilizada é o Cr6+, na forma de dicromato de potássio (K2Cr2O7). A Figura 2A
apresenta os desvios-padrão em relação à média nos diferentes ensaios.
128
Figura 2A. Carta de sensibilidade de Pseudokirchniriella subcaptata ao Cr6+.
A partir da carta de sensibilidade, a CE50 média dos ensaios foi calculada em
0,98 mg.L-1, com desvio padrão de 0,12 mg.L-1, chegando-se a um intervalo de
confiança de 12,24%.
1c) Daphnia magna (ABNT NBR 12713, 2004) os ensaios são validados quando os
valores da CE50 variam dentro da faixa estabelecida pela norma, ou seja, +/- 2
desvios-padrão em relação à média, utilizando a substância-teste Cr6+, na forma de
dicromato de potássio (K2Cr2O7). A Figura 3A apresenta os desvios-padrão em
relação à média.
129
Figura 3A. Carta de sensibilidade do bioindicador Daphnia magna ao Cr6+.
A CE50 média dos ensaios foi determinada em 1,18 mg.L -1, com desvio
padrão de 0,10 mg.L-1 e intervalo de confiança de 8,47%.
1d) Danio rerio (ABNT NBR 15088, 2004) seguem exatamente os mesmo padrões
dos testes apresentados para algas e daphnias. A Figura 4A apresenta os desviospadrão em relação à média.
Figura 4A. Carta de sensibilidade do bioindicador Danio rerio ao Cr6+.
A CE50 média dos ensaios foi determinada em 196,25 mg.L -1, com desvio
padrão de 25,60 mg.L-1 e intervalo de confiança de 13,04%.
130