Exploring the Metabolic and Genetic Control of
Gene Expression on a Genomic Scale
Joseph L. DeRisi, Vishwanath R. Iyer, Patrick O. Brown *
Science 24 October 1997:
Vol. 278. no. 5338, pp. 680 - 686
DOI: 10.1126/science.278.5338.680
Introduçao
•O padrão de genes expressados uma célula
pode prover detalhada informação sobre seu estado.
•Todas as diferenças em uma célula o estado
podem correlacionasse câmbios nos níveis de ARNm
Saccharomyces cerevisiae organismo favorável
Seqüenciado em genoma
Os genes são fácies de reconhecer
Elementos regulatorios cis
perto e são compactos
Mecanismos regulatorios genéticos
Leveduras em médio rico em glicose
Rápido crescimento
Produção de etanol
Quando o açúcar se acaba
etanol
Fonte de carbono
respiração
aeróbica
Cambio de fermentação anaeróbica a respiração aeróbica
Cambio diaúxico
Se correlaciona com amplios câmbios em na
expressão de genes
Involucran processos celulares fundamentais
Tales como metabolismo de carbono
Sintesis de proteína
Armazenamento de carboidratos
DNA microarrays
Caracteriza câmbios em expressão dos genes
Se pode analisar todo o gnoma
O circuito genético regulatorio
Materiais e métodos
•Os marcos abertos de leitura (ORFs) amplificados PCR
•Com um set de primer comerciais
•ADN microarrays 6400 seqüências distintas de ADN
•empreso em slides de vidros
•Com um robot
•Células de levedura de um cultivo em crescimento exponencial
• em médio fresco e crescidas a 30 C por 21 hs
•Logo de 9 hs de crescimento a glicose
começo a escassear em médio
•Se tomarem mostras
•Em 7 intervalos sucessivos de 2 hr cada uno
•E ARNm foi isolado
ADNc se preparo por transcritasa reversa
Em presencia deoxi-uridina
trifosfato marcada (dUTP)
Cy3(verde) Cy5 (vermello)
•E logo hibridizada o microarray
•Se determino intensidade na fluorescência relativa
•para os fluorescentes para cada array
Resultados
Fig. 1. Yeast genome
microarray.
-labeled cDNA (mRNA
expression at the initial
timepoint) is represented as a
green signal, Cy3-dUTP
hybridization of Cy5-dUTPlabeled cDNA (that is, mRNA
expression at 9.5 hours) is
represented as a red signal.
after the diauxic shift
genes induced red
repressed as green spots
yellow spots.
Genes expressed equal
levels before and after the
diauxic shift
Fig. 2. The section of the
array indicated by the gray
box in Fig. 1
Representative genes are labeled.
red spots represent genes that
were induced relative to the initial
timepoint,
green spots represent genes that
were repressed relative to the initial
timepoint.
Crescimento exponencial
médio rico em glicose
Fig. 5. Distinct temporal patterns of induction or repres...
Padrão de expressão
estável
1er intervalo
Tempo 0hs - 2hs células
sin glicose
Níveis de ARNm 19 genes (0.3%)
•maior a 2 vezes (major de 2.7 vezes)
Fig. 4. Coordinated regulation of functionally related ge...
Seguintes intervalos
2hs
9hs
•Aumenta na falta de glicose
Niveles de ARNm
2 vezes 710 genes
4 vezes 183 genes
2 vezes 1073 genes
4 vezes 203 genes
•50% sim função e sim nome
• 400 sim homologia
possíveis funções
Fig. 4. Coordinated regulation of
functionally related ge...
induções
enzima aldeído deshidrogenase (ADL2)
acetil- coenzima A sintasa (ACS1)
Acetil-CoA
ciclo glioxilato
TCA
piruvato decarboxilase PDC1
piruvato carboxilase
redirecionam
piruvato
acetaldehido
oxalacetato
TCA
Gluconeogenesis
Fig. 4. Coordinated regulation of functionally related ge...
PCK1 (fosfoenolpiruvato carboxiquinasa)
FBP1 (fructosa 1,6 bifosfato)
cambio na direção de glicolisis
biosintesis precursores
glicose 6 fosfato
Trealosa sintasa
Glicogênio sintasa
Via de armazenamento
o padrão de expressão observado
foi perfeitamente correla...
Fig. 3. Metabolic
reprogramming
inferred from global
analysis of changes in
gene expression.
Red boxes with white lettering
identify genes whose
expression increases in the
diauxic shift.
Green boxes with dark green
lettering identify genes whose
expression diminishes in the
diauxic shift. The magnitude
of induction or repression is
indicated for these genes.
Black and white boxes
indicate no significant
differential expression (less
than twofold).
Genes relacionados
funcionalmente
Ciclo acido tricarboxilico- glioxilato
Genes relacionados al citocromo C
Armazenamento de carboidratos
Genes relações sintesis de proteínas
Decrescimento
coordenado
Proteínas ribosômais
ARNt sintetasa
95% genes
Fatores de elongações, traduções e
finalizações
Ex genes mitocôndrias ribossômicos
aumento na biogêneses mitocôndrias
2 vc
Padrões de expressão
Agrupamentos de genes por sua função
Mecanismo regulatorio
Inferir
padrões similar deexpressão
7 genes se induziram tardiamente
Genes reprimidos por glicose
(5B)
5 genes compartem uma seqüência
ativadora águas arriba
o elemento de resposta a na fonte de carbono
CSRE (carbon source response element)
2 genes
ACR1 gen essencial para na atividade de ACS1
IDP2( isocitrato desidrogenase) no ten CSRE
Slide 23
Elementos de resposta a estresse (STRE)
(5C)
motivo CCCT
elemento ativador
águas arriba (UAS rpg)
Proteínas ribosômais
(5F)
7 genes
Corrobora
RAP1
4.4 veces
expressão de proteínas ribosômais
Slide 24
Genes codificam fatores de transcrição
149 genes
SIP4
HAP4
3 vc ( ativador
transcricinal e regulador global da expressão
dos genes respiratorios)
8 vc (ativador da transcrição unem a ADN )
interação com snf1p
o regulador maestro
da repressão de glicose
•o padrão de expressão observado foi perfeitamente
correlacionado com os dados prévios
•ADN microarrays
•permite caracterizar as consecuencias metabolicas
por câmbios no medio de cultura
•Permite caracterizar as vias regulatorias
•Outorga uma ferramenta para explorar o padrão
de expressão a escale genómica
Fig. 4. Coordinated regulation of functionally related
genes.
The curves represent the average induction or repression ratios for all the genes in each indicated group. The
total number of genes in each group was as follows: ribosomal proteins, 112; translation elongation and initiation
factors, 25; tRNA synthetases (excluding mitochondial synthetases), 17; glycogen and trehalose synthesis and
degradation, 15; cytochrome c oxidase and reductase proteins, 19; and TCA- and glyoxylate-cycle enzymes,
24.
Fig. 5. Distinct temporal patterns of induction or
repression help to group genes that share regulatory
properties.
(A) Temporal profile of the cell density, as measured by OD at 600 nm and glucose
concentration in the media.
(B) Seven genes exhibited a strong induction (greater than ninefold) only at the last
timepoint (20.5 hours). With the exception of IDP2, each of these genes has a CSRE UAS.
There were no additional genes observed to match this profile.
(C) Seven members of a class of genes marked by early induction with a peak in mRNA levels at 18.5 hours.
Each of these genes contain STRE motif repeats in their upstream promoter regions.
(D) Cytochrome c oxidase and ubiquinol cytochrome c reductase genes. Marked by an induction coincident
with the diauxic shift, each of these genes contains a consensus binding motif for the HAP2,3,4 protein
complex. At least 17 genes shared a similar expression profile.
(E) SAM1, GPP1, and several genes of unknown function are repressed before the diauxic shift,
and continue to be repressed upon entry into stationary phase.
(F) Ribosomal protein genes comprise a large class of genes that are repressed upon depletion
of glucose. Each of the genes profiled here contains one or more RAP1-binding motifs upstream
of its promoter. RAP1 is a transcriptional regulator of most ribosomal proteins.
ACS1 Acetyl-coA synthetase isoform, expressed during
growth on nonfermentable carbon sources and under aerobic
conditions
PDC1 Major of three pyruvate decarboxylase isozymes,
key enzyme in alcoholic fermentation, decarboxylates
pyruvate to acetaldehyde; subject to glucose-, ethanol-,
and autoregulation; involved in amino acid catabolism
PCK1 (fosfoenolpiruvato carboxiquinasa)
Phosphoenolpyruvate carboxykinase, key enzyme in
gluconeogenesis, catalyzes early reaction in
carbohydrate biosynthesis, glucose represses
transcription and accelerates mRNA degradation,
regulated by Mcm1p and Cat8p, located in the cytosol
FBP1 (fructosa 1,6 bifosfato) cambio na direção de
glicolisis biosintesis de precursores glicose 6 fosfato
Fructose-1,6-bisphosphatase, key regulatory enzyme in
the gluconeogenesis pathway, required for glucose
metabolism
ACR1 Mitochondrial succinate-fumarate transporter,
transports succinate into and fumarate out of the
mitochondrion; required for ethanol and acetate
utilization
IDP2 Cytosolic NADP-specific isocitrate
dehydrogenase, catalyzes oxidation of isocitrate to
alpha-ketoglutarate; levels are elevated during growth
on non-fermentable carbon sources and reduced during
growth on glucose
RAP1 (repressor activator protein 1) DNA-binding
protein involved in either activation or repression of
transcription, depending on binding site context
HAP4 Subunit of the heme-activated, glucoserepressed Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-binding complex, a
transcriptional activator and global regulator of
respiratory gene expression; provides the principal
activation function of the complex (
SIP4 C6 zinc cluster transcriptional activator that binds
to the carbon source-responsive element (CSRE) of
gluconeogenic genes; involved in the positive regulation
of gluconeogenesis; regulated by Snf1p protein kinase;
localized to the nucleus
SNF1 AMP-activated serine/threonine protein kinase found in
a complex containing Snf4p and members of the
Sip1p/Sip2p/Gal83p family; required for transcription
of glucose-repressed genes, thermotolerance, sporulation,
and peroxisome biogenesis. Transcriptional regulation is an
important mechanism
for controlling carbon metabolism
in Saccharomyces cerevisiae.