Ciência Animal, 13(2):79-87, 2003
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PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES OVINOS
(In vitro production of sheep embryos)
Juliana Bezerra LIMA VERDE, Davide RONDINA, Vicente José de Figueirêdo FREITAS
Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução
Faculdade de Veterinária – Universidade Estadual do Ceará
Av. Paranjana, 1700 – 60.740-000 – Fortaleza,CE
RESUMO
Nos últimos anos, tem ocorrido um crescente interesse nas tecnologias de produção in vitro
(PIV) de embriões para uma mais rápida disseminação de germoplasma superior em ovinos,
devido a problemas encontrados nos programas de superovulação e transferência de embriões
nesta espécie. Embora a eficiência da PIV tenha aumentado, o número de embriões e o
desenvolvimento a termo ainda continuam baixos. Este trabalho revisa o progresso obtido na
otimização da maturação in vitro (MIV), fecundação in vitro (FIV) e sistemas de cultivo in vitro
(CIV) em ovinos. A aquisição de um maior número de informações sobre a maturação de
oócitos e os requerimentos para cultivo nesta espécie torna-se crítico para otimizar a eficiência
de técnicas modernas de reprodução.
PALAVRAS-CHAVE: Ovino; embrião; produção in vitro.
ABSTRACT
In the last several years, there has been an increasing interest in in vitro embryo production
(IVP) technologies for faster propagation of superior germplasm in sheep because of some
problems with superovulation and embryo transfer programs in this species. Although the IVP
efficiency has improved, embryo yield and development to term are still low. This paper
reviews the progress made in optimizing the in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization
(IVF), and in vitro culture (IVC) systems in sheep. The acquisition of more information on
oocyte maturation and culture requirements in this species is critical to optimize the efficiency
of advanced reproductive strategies.
KEY WORDS: Sheep; embryo; in vitro production.
INTRODUÇÃO
A indústria de produtos de origem ovina é afetada primariamente pela qualidade e
disponibilidade de alimento, pelo manejo dispensado aos animais e pela sua genética. Aliado a
estes fatores, destaca-se também a eficiência reprodutiva, que é um ponto crítico em sistemas de
produção de carne, pele ou lã. Contudo, no Brasil, esse aspecto é insatisfatório devido às
condições desfavoráveis às quais muitos animais são submetidos. Em contrapartida, há uma
forte demanda dos produtos de origem ovina pelos mercados interno e externo. Para reduzir a
distância entre a demanda e a produção é necessário aumentar os índices reprodutivos e
promover o progresso genético na espécie. No entanto, a produção de um grande número de
animais de qualidade superior, em um curto espaço de tempo, torna-se de difícil execução
através do uso das técnicas reprodutivas convencionais.
Técnicas recentes têm possibilitado novas maneiras de acelerar o ganho genético e
aumentar o potencial produtivo de ovinos. Dentre essas técnicas, destacam-se a inseminação
artificial (IA) e a transferência de embriões (TE). Mais recentemente, a produção in vitro (PIV)
de embriões apresentou-se como mais uma alternativa para o aumento do potencial reprodutivo
de ovinos (WANG et al., 1998), caprinos (IZQUIERDO et al., 1999) e bovinos (DODE &
ADONA, 2001).
Deste modo, a maturação (MIV) e fecundação in vitro (FIV) de oócitos recuperados de
ovários de abatedouro ou por laparoscopia (animais vivos), seguidos do cultivo in vitro (CIV),
são etapas necessárias para produção em larga escala de embriões na espécie ovina. A PIV de
embriões ovinos envolve três etapas: maturação de oócitos primários oriundos de grandes
folículos antrais, fecundação de oócitos secundários maturos, utilizando sêmen congelado ou
fresco, e cultivo dos embriões por mais de uma semana até a formação de blastocistos, que
podem ser transferidos para receptoras ou crioperservados para uso futuro (COGNIÉ et al.,
2003).
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Esta revisão tem por objetivo abordar o progresso obtido nas pesquisas que vêm sendo
realizadas na área de PIV de embriões ovinos, bem como apresentar protocolos já definidos para
esta finalidade.
Colheita dos oócitos
O número de oócitos de boa qualidade colhidos de um ovário é um ponto importante na
PIV de embriões. Os oócitos destinados à FIV podem ser colhidos de uma das seguintes fontes:
ovidutos logo após a ovulação, folículos maturos antes da ovulação ou de folículos imaturos ou
atrésicos presentes em animais mortos (abatedouro) ou vivos (WANI, 2002).
Em geral, a maior parte dos oócitos utilizados para a PIV de animais domésticos é
oriunda de abatedouros. Após a colheita, os ovários podem ser levados ao laboratório em
solução salina a 0,9% contendo 100 UI de penicilina G-potássica e 100 µg/mL de sulfato de
estreptomicina (WANG et al., 1998) ou em solução salina fosfatada de Dulbecco a 30-35oC
(PUGH et al., 1991), a 20oC ((SLAVIK et al., 1992) ou a temperatura ambiente (WANI et al.,
2000), sem nenhum prejuízo à maturação dos oócitos. O intervalo entre a colheita dos ovários e
a obtenção dos oócitos, sem efeitos deletérios, varia de uma a duas horas (PUGH et al., 1991),
três a quatro horas (WANI et al., 1999) ou até cinco horas (WANG et al., 1998). Estes ovários
são seccionados e liberam grandes quantidades de oócitos primários (AGRAWAL et al., 1995).
A idade do animal não possui qualquer efeito no número e na qualidade dos oócitos
colhidos (WANI et al., 1999) ou na taxa de maturação e fecundação (O'BRIAN et al., 1997).
Contudo, as taxas de blastocistos obtidas utilizando-se oócitos oriundos de ovelhas adultas são
significativamente superiores quando comparadas às recém-púberes, não havendo porém
diferenças nas taxas de gestação (O'BRIAN et al., 1997). A utilização de doadoras jovens tem
efeito considerável por acelerar o ganho genético e diminuir o intervalo entre gerações. Apesar
da utilização de oócitos de abatedouros apresentar custo mais baixo para um programa de PIV,
esta prática não assegura a procedência genética dos embriões produzidos.
Oócitos maturados in vivo podem ser obtidos por técnicas cirúrgicas (NAQVI &
GULYANI, 1999) ou por laparoscopia (KÜHHOLZER et al., 1997). Estes métodos são de
elevado custo e o número de oócitos recuperados por ovário é menor. No entanto, uma
vantagem é que o animal submetido à colheita é de origem conhecida e pode ser utilizado por
várias vezes sem problemas de aderência.
A técnica de ovum pick-up (OPU) combinada com a MIV e FIV é um método de
colheita de oócitos por laparoscopia ou ultra-sonografia que não depende de tratamento
hormonal, devido à presença de folículos de diferentes tamanhos no ovário em qualquer
momento do ciclo. Nos últimos anos diferentes sondas de aspiração folicular e diferentes
pressões de vácuo têm sido utilizadas com o intuito de manter a integridade das células do
cumulus (KÜHHOLZER et al., 1997; ALBERIO et al., 2002) (Fig. 1). A laparoscopia é pouco
invasiva, quando comparada à laparotomia, e mais rápida, reduzindo o estresse do animal. A
OPU por laparoscopia foi primeiramente descrita por SNYDER & DUKELOW (1974), que
aspiraram 21 folículos e recuperaram seis oócitos. Vinte anos depois, BALDASSARE et al.
(1994) realizaram laparoscopias em 46 ovelhas superovuladas com uma recuperação oocitária
de 82%.
A habilidade para se identificar oócitos capazes de produzir um elevado número de
estruturas fecundadas, antes da FIV, é um fator importante para programas de PIV. Os oócitos
de maior diâmetro produzem altas taxas de mórulas e blastocistos (ARLOTTO et al., 1992). A
maioria dos pesquisadores trabalham selecionando oócitos de acordo com os critérios propostos
por LEIBFRIED & FIRST (1979) para a espécie bovina, que classificaram essas estruturas em:
a) Excelente (classe I): cumulus e corona radiata completos e citoplasma homogêneo;
b) Bom (classe II): mais de duas camadas de células do cumulus;
c) Regular (classe III): uma camada de células do cumulus ou cumulus incompleto;
d) Ruim (classe IV): sem células do cumulus e/ou oócito degenerado.
Em ovinos, resultados obtidos utilizando a técnica de recuperação oocitária por OPU
foram descritos por TERVIT (1996). Quando a mesma é realizada 24 horas após o final do
tratamento gonadotrófico, uma média de seis oócitos por ovelha são selecionados para FIV,
resultando em 1,1 blastocisto (BALDASSARE et al., 1996). KÜHHOLZER et al., 1997
obtiveram uma taxa de colheita de oócitos de 67,9% quando utilizaram a OPU para recuperação
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oocitária. Já ALBERIO et al. (2002), utilizando a mesma técnica, obtiveram uma taxa de
colheita de 33,6%.
Figura 1: Colheita de oócitos através de ovum pick-up (OPU), guiada por ultra-sonografia, em pequenos
ruminantes (Adaptado de GRAFF et al., 1999).
Maturação in vitro
A aquisição da competência de desenvolvimento do oócito ocorre continuamente ao
longo da foliculogênese e a influência do tamanho e da atresia folicular na competência do
desenvolvimento foram revistos por MERMILLOD et al. (1999). Contudo, dada a
heterogeneidade natural dos oócitos imaturos utilizados para PIV, a maturação oocitária pode
ser influenciada, dentre outros fatores, pelos componentes do meio e as várias condições de
cultivo (COGNIÉ et al., 2003).
Durante o período de maturação, muitas mudanças na organização do citoplasma são
observadas, tais como um contínuo aumento do estoque lipídico, redução do complexo de
Golgi, rearranjo das motocôndrias e alinhamento dos grânulos corticais ao longo do oolema. O
aumento do estoque lipídico está provavelmente relacionado com o pool energético para o
oócito suportar o desenvolvimento após a fecundação até o estádio de blastocisto
(MERMILLOD et al., 1999).
Diferentes fontes de gonadotrofinas exógenas, tais como FSH e LH (COGNIÉ et al.,
1991), hMG (WANI et al., 2000), eCG (MUZARMADIEV et al., 1983) ou hCG e estradiol
(SHORGAN et al., 1990), são utilizadas no meio de maturação de oócitos ovinos. No entanto, a
adição de hormônios ainda é uma controvérsia, pois alguns trabalhos não encontraram
diferenças significativas no número de oócitos que chegaram à metáfase II ou oócitos que
formaram blastocistos na presença ou ausência de gonadotrofinas exógenas (O'BRIAN et al.,
1994).
O meio TCM-199 suplementado com FSH e 17β-estradiol (100 ng/mL) induziu um
aumento significativo na produção de blastocistos (GULER et al., 2000). O possível
envolvimento do 17β-estradiol na maturação oocitária citoplasmática é explicado pelo fato de
que seu uso inadequado exacerbou anormalidades na clivagem de embriões, causando falhas na
formação de blastocistos (OUSSAID et al., 1999).
Também foi relatada a utilização de soro fetal bovino (WANG et al., 1998; BYRNE et
al., 2000), soro de ovelha em estro (NAQVI et al., 2001), fluido folicular humano, fluido de
grandes e pequenos folículos de ovelhas (ZHU et al., 1999), bem como heparina (PTAK et al.,
1999) nos protocolos de MIV.
A relação entre o uso de glutationa e a competência no desenvolvimento de oócitos
bovinos foi confirmada em oócitos ovinos maturados na presença de cisteamina como precursor
da glutationa (DE MATOS et al., 1999).
Para MIV em ovinos, o fluido folicular recuperado de grandes folículos ( > 4 mm) pode
ser utilizado como suplemento do meio de maturação à base de TCM-199 com 100 ng de oFSH
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e seu efeito positivo é alcançado quando o fluido é oriundo de folículos não atrésicos ou de
folículos estimulados por gonadotrofinas (COGNIÉ et al., 1995).
A presença de FSH ou do fator de crescimento epidermal (EGF) no meio de maturação
estimulou a retomada da meiose e aumentou as taxas de clivagem após FIV (BYRNE et al.,
2000). Sabe-se também que o fluido folicular possui efeito adicional na ação do FSH e do EGF
no desenvolvimento de oócitos, indicando a presença de moléculas reguladoras (COGNIÉ et al.,
2003). A presença de células do cumulus parece ter importância no desenvolvimento e
maturação de oócitos ovinos. Durante a maturação do oócito, estas células apresentam um papel
regulatório que pode ser observado durante o processo de clivagem (WANI, 2002).
GULER et al. (2000) observaram uma taxa de maturação oocitária completa
(condensação da cromatina em metáfase II) de 59% quando utilizaram TCM-199 como meio de
maturação. Deste percentual, foram obtidas taxas de clivagem de 46 e 69%, sem e com a
suplementação de FSH, respectivamente. Os autores chegaram a uma produção de 12% de
blastocistos. ALBERIO et al. (2002) obtiveram taxas de maturação oocitária, clivagem e
produção de blastocistos de 84,8%, 72,2% e 22,5%, respectivamente, quando utilizaram TCM199 como meio de maturação, além da adição do soro de ovelha em estro no meio de
fecundação.
Capacitação espermática
Para que ocorra a fecundação, torna-se necessário que os espermatozóides a serem
utilizados para esta finalidade estejam aptos a ultrapassar a zona pelúcida e penetrar no oócito
maturo.
O espermatozóide de mamíferos sofre uma série de mudanças bioquímicas e biofísicas
antes da fecundação. Essas mudanças são denominadas "capacitação espermática". A
capacitação envolve a remoção do material que reveste o espermatozóide, adquirido durante o
trânsito epididimário ou por ocasião da exposição ao plasma seminal ou ainda, pela remoção do
colesterol, resultando no aumento da permeabilidade da membrana ao cálcio. In vitro, a lavagem
do espermatozóide antes da incubação acelera a capacitação. A mudança na motilidade
espermática (hipermotilidade) ocorre após sua exposição a um meio fortemente iônico. Isso se
reflete no aumento da taxa de motilidade e, conseqüentemente, no aumento do consumo de
oxigênio, semelhante ao que ocorre in vivo. Os componentes iônicos do meio influenciam a
motilidade espermática, a capacitação, a integridade do acrossoma e a habilidade do
espermatozóide em penetrar no oócito. O início desta hiperatividade é acompanhada pela saída
de H+ intracelular causando um aumento de pH intracelular (PARRISH et al., 1989). Dessa
forma, a maioria dos protocolos de FIV em ovinos são realizados em um pH entre 7,4 e 8,0
(WANI, 2002).
Proteínas são componentes essenciais ao meio utilizado para a capacitação espermática.
A adição de 20% de soro de ovelha em estro ou BSA (4 mg/mL) tem sido preconizada para a
capacitação espermática em ovinos (WANI et al., 2000). A heparina, que é um potente ativador
da capacitação espermática no touro, não age de forma eficaz na capacitação do espermatozóide
ovino quando adicionada ao soro (COGNIÉ & BARIL, 2002). No entanto, NAQVI et al.
(2001), utilizando heparina em meio de capacitação para sêmen ovino, obtiveram 65,8% de
oócitos fecundados. Já a cafeína deprime as taxas de fecundação quando se utiliza sêmen fresco
em ovinos e o seu sinergismo com a heparina afeta negativamente as taxas de clivagem nesta
espécie (NAQVI & MADAN, 1997).
O sêmen usado em protocolos de FIV pode ser fresco ou congelado/descongelado no
momento de sua utilização (MORRIS et al., 2003). Em ambos os processos deve-se realizar a
separação dos espermatozóides móveis dos mortos e adicionar o meio de fecundação em
quantidade suficiente para que alcance uma concentração desejável, geralmente em torno de 1 x
106 espermatozóides/mL (GULER et al., 2000; ALBERIO et al., 2002). Espermatozóides com
boa motilidade são separados dos mortos e daqueles com baixa motilidade através da técnicas
de swim-up (SLAVIK et al., 1992; WATSON et al., 1994; WANI et al., 2000) ou gradiente de
Percoll (COGNIÉ et al., 2003) seguido de centrifugação. Espermatozóides epididimários
oriundos de carneiros em abatedouros têm sido utilizados com sucesso, algumas horas após sua
morte, para FIV de oócitos ovinos (WANI et al., 2000). O sêmen fresco de ovino foi utilizado
com sucesso para FIV após capacitação com cálcio ionóforo A23187 em solução BO (protocolo
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desenvolvido para coelhos por BRACKETT & OLIPHANT, 1975) contendo 0,6% de BSA e
cafeína (WANG et al., 1998; ZHU et al., 1999).
Fecundação in vitro
O sucesso da FIV depende tanto do protocolo de maturação oocitária como da
capacitação espermática. O tempo de interação oócito-espermatozóide, o meio utilizado, a
temperatura e a concentração espermática possuem importante papel no sucesso desta técnica.
Independente do tipo de sêmen utilizado para este fim, geralmente adicionam-se os
espermatozóides em meio de fecundação contendo de 10 a 30 oócitos maturos. Este processo na
espécie ovina pode durar 6 horas (WANG et al., 1998), 6 a 10 horas (ZHU et al., 1999), 17
horas (MORRIS et al., 2003), 18 horas (GULER et al., 2000), 20 horas (ALBERIO et al., 2002)
ou 20 a 24 horas (BYRNE et al., 2000). Para uma melhor avaliação deste processo, estudos são
necessários para determinar se, reduzindo o tempo de interação oócito-espermatozóide, ocorre a
diminuição dos danos produzidos pelos espermatozóides, melhorando as taxas de implantação
após transferência, semelhante ao que ocorre em humanos (GIANAROLI et al., 1996).
A temperatura de incubação dos oócitos em conjunto com os espermatozóides podem
variar segundo os autores: 37oC (MORRIS et al., 2003), 38,5oC (GULER et al., 2000) e 39,5oC
(COGNIÉ et al., 2003). No entanto, todos esses autores utilizaram uma atmosfera de 5% de
CO2.
SLAVIK et al. (1992) descreveram a utilização de TCM-199 enriquecido com heparina
como meio de fecundação para oócitos ovinos. WALKER et al. (1994) concluíram que a
utilização de fluido sintético de oviduto (SOF) adicionado de 2% de soro de ovelha em estro é
um modelo adequado para um sistema de FIV em ovinos. Outros autores utilizaram o TCM199 como meio de fecundação, modificando para 5% a concentração do soro de ovelha em estro
(WANG et al., 1998) ou para 1% (NAQVI et al., 1999).
COGNIÉ et al. (2003) utilizaram o meio SOF adicionado de 10% de soro de ovelha e
0,5 µg/mL de heparina. A solução BO acrescida de 5 mg/mL de BSA também foi utilizada na
FIV de ovinos, promovendo uma taxa de fecundação de 90% (ZHU et al., 1999). Outros meios
já foram propostos com esta finalidade: TCM-199 (SLAVIK et al., 1992), Ham F-10 e Ham F12 (WANI, 2002) e Tyrode (WATSON et al., 1994).
Os presumíveis zigotos podem ser avaliados 24 (ALBERIO et al., 2002) a 45 horas
(WANG et al., 1998) após a FIV. CROZET (1986) observou uma alta incidência de polispermia
(27%) em embriões ovinos fecundados in vitro.
Cultivo in vitro de embriões
O aprimoramento das condições de cultivo para embriões de ovinos é necessário para
melhorar sua viabilidade após a manipulação. Isso permite que os embriões sejam devidamente
avaliados antes de serem transferidos para receptoras.
Embriões ovinos são normalmente cultivados em meios suplementados com soro de
ovelha (MURZAMADIEV et al., 1983), BSA (GARDNER et al., 1994), soro humano
(WALKER et al., 1992) ou soro fetal bovino (WANI, 2002).
Alguns laboratórios utilizam meio SOF suplementado com 5 a 10% de soro fetal bovino
por dois a três dias após a fecundação para promover uma alta viabilidade embrionária após a
transferência (COGNIÉ, 1999).
A glicose em meio de cultivo é benéfica para o desenvolvimento in vitro do embrião.
Contudo, zigotos ovinos tem se desenvolvido em meio contendo lactato e/ou piruvato sem
glicose (WALKER et al., 1992). O meio SOF modificado, suplementado com 20% de soro
humano, foi mais efetivo no desenvolvimento de blastocistos ovinos quando do uso de baixas
concentrações de glicose: 1,5 mM vs 2,3 mM (THOMPSON et al., 1992).
ZHU et al. (1999) utilizaram para o cultivo de embriões ovinos o TCM-199 com
piruvato de sódio e soro fetal bovino. Nessas condições, foi obtida uma taxa de 64,8% de
blastocistos.
A adição de aminoácidos específicos no meio de cultivo facilita o desenvolvimento
embrionário. Contudo, o efeito benéfico decresce com a duração do cultivo, já que a utilização
dos aminoácidos pelo embriões produz níveis elevados de amônia, que por sua vez inibem o
desenvolvimento de blastocistos e suas clivagens (GARDNER et al., 1994).
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O cultivo dos embriões pode ser realizado em atmosfera de 5% de CO2 (NAITANA et
al., 1996; WANG et al., 1998) ou com utilização de mistura de gases: 5% de CO2, 5% de O2 e
90% de N2 (BYRNE et al., 2000; GULER et al., 2000; COGNIÉ et al., 2003; MORRIS et al.,
2003); sendo o segundo protocolo o mais indicado. Usualmente, cerca de 50% do meio de
cultivo é trocado a cada dois dias e a adição de soro fetal bovino às gotas com os embriões é
realizada após 24 horas do início do cultivo (BYRNE et al., 2000; GULER et al., 2000). O
cultivo de embriões em grupos, quando comparado com o individual, resulta no aumento da
formação de blastocistos, mostrando que os embriões ovinos devem produzir fatores que
estimulam a clivagem in vitro (GARDNER et al., 1994).
Alguns sistemas de cultivo ainda utilizam a metodologia proposta por BRINSTER
(1963) com gotas de meio sob óleo de parafina em placas. O óleo possui a dupla função de
evitar a desidratação e a entrada de microorganismos. Também foi demonstrado que embriões
cultivados em microgotas de meio sob óleo de parafina clivam mais facilmente que aqueles
cultivados em meio sem óleo (WALKER et al., 1992). Os prováveis contaminantes tóxicos do
óleo são eliminados através de gradativas passagens em solução salina.
A eficiência do cultivo de embriões ovinos nos estádios iniciais até oito células pode ser
incrementada pelo co-cultivo destes embriões em presença de monocamadas de células do
oviduto (GANDOLFI & MOOR, 1987) ou vesículas trofoblásticas (REXROAD JR &
POWELL, 1988). O co-cultivo de embriões ovinos também melhora seu desenvolvimento in
vitro (WATSON et al., 1994).
A fim de avaliar a eficiência do cultivo in vitro (Fig. 2), é observado o desenvolvimento
até o estádio de blastocisto, o que se dá por volta dos seis a oito dias de cultivo (BYRNE et al.,
2000). Também pode ser utilizada a contagem das células por embrião, em torno dos sete dias
de cultivo, para confirmação do estádio de desenvolvimento, assim como a presença ou
ausência da massa celular interna (GULER et al., 2000).
A
B
C
D
Figura 2: Sequência do desenvolvimento embrionário ovino: oócito maturo (A), embrião de oito células
(B), blastocisto (C), blastocisto em eclosão (D) (Adaptado de WANG et al., 1998).
Transferência de embriões produzidos in vitro
Os trabalhos que envolvem a PIV de embriões ovinos, chegando até a transferência
propriamente dita para receptoras previamente preparadas, são relativamente escassos. ZHU et
al. (1999) obtiveram uma taxa de fecundação de 90%. O percentual que se desenvolveu até os
estádios de mórula e blastocisto foi de 64,8%. Os embriões oriundos do cultivo (n = 61) foram
transferidos para 20 receptoras, resultando em uma taxa de gestação de 50%. Onze crias
nasceram, resultando em uma taxa de sobrevivência embrionária ao parto de 18% (Fig. 3).
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100
Percentual
80
60
40
20
0
Fec
Mo/Bl
SEG
SEP
Parâmetro observado
Figura 3: Eficiência da produção in vitro de embriões ovinos da fecundação ao parto. Fec (fecundação),
Mo/Bl (mórula/blastocisto), SEG (sobrevivência embrionária na gestação), SEP (sobrevivência
embrionária ao parto) (Adaptado de ZHU et al., 1999).
Considerações finais e perspectivas
A PIV de embriões ovinos possui um grande potencial para desenvolver em direção à
produção em larga escala e para aplicações em outras biotecnologias da reprodução, tais como a
transgênese e a clonagem. No entanto, a etapa de MIV ainda mostra-se como o principal
entrave, necessitando de maiores estudos.
No Brasil, existem poucos grupos trabalhando com a PIV de embriões ovinos. Esses
grupos estão localizados quase que exclusivamente nas regiões Sudeste e Sul. Torna-se também
interessante que outros grupos de pesquisa sejam criados na região Nordeste, levando-se em
consideração o potencial produtivo e a importância da espécie para essa região.
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