Avaliação da diversidade
microbiana
Técnicas moleculares
(Independentes de cultivo)
Expressões da diversidade
Avaliação da diversidade microbiana
(métodos independentes de cultivo)
Riqueza
Equitabilidade
número de
grupos presentes
abundância relativa
de cada grupo
• Técnicas que envolvem ácidos nucléicos (RNA ou DNA).
• Essas técnicas permitem avaliar diversidade (quem está ali?)
• O potencial metabólico ou atividade quando genes metabólicos ou seus transcritos sejam
usados nas sondas (o que fazem?)
• Métodos mais diretos e analíticos (como FAME).
Dogma Central da Biologia Molecular
Sequências rRNA são extremamente importantes em estudos filogenéticos porque
são conservadas (evoluiram lentamente) participando na síntese da estrutura dos
ribossomos e de proteínas.
rDNA indica os genes que codificam para o RNA ribossômico.
A maioria dos genes metabólicos são regulados ao nível da transcrição e podem não
ser expressos - potencial metabólico.
Se o transcrito do gene é expresso então ele será expresso e seu produto será
sintetizado - atividade metabólica.
Características dos ácidos nucléicos
• Dois tipos de ácidos: RNA e DNA
• DNA é codificado por 4 blocos intercambiáveis
denominados bases: Adenina, Guanina, Citosina e Timina.
• RNA tem 5 bases diferentes: Adenina, Guanina, Citosina e
Uracila.
Ácido desoxiribonucleico
Deoxyribonucleic Acid
DNA
Pontes de hidrogênio e
interações hidrofóbicas
Porque os estudos de diversidade usam o rDNA?
Gene que codifica para rRNA 16S
Cerca de 1500 pb codificam para a subunidade 16S da molécula de
RNA.
Parte destas sequências são conservadas para a maioria dos seres
vivos: -contém o passado metabólico do último ancestral comum.
Regiões variáveis são usadas na taxonomia - filogenética
rDNA
Estrutura primária (sequência) e
secundária (laços e dobraduras)
ordenam a estrutura terciária
(3D) dos ribossomos.
Mapa de variabilidade de SSU rDNA bacteriano
Vermelho = genes altamente conservados
SSU (small subunit)
16S
Como se replica o DNA?

Abertura da dupla fita via reações químicas simples e reconstituição da
outra metade de cada fita por imersão em uma mistura composta pelas
quatro bases.

Cada base pode se combinar apenas com uma única base complementar.
Portanto, uma base na “fita antiga” (+) define qual base pode ocorrer na
“fita nova” (-)
(Complementaridade das bases)

Dessa forma, após cada abertura da fita, são coletadas do substrato
réplicas completas da fita original, exceto quando ocorrer uma mutação.
Replicação do DNA
O crescimento do DNA ocorre na direção
de 5' para 3'
Vídeo 1
Vídeo2
As duas fitas de DNA estão em direção opostas (anti-paralelas):
- uma das fitas tem a direção exata da sua síntese (5'---3')
- enquanto que a outra está invertida (3'---5').
Esta conformação em fitas anti-paralelas leva à necessidade de mecanismos especiais para a
replicação do DNA.
Sondas de ácidos nucléicos
Sondas
são pequenas porções de DNA (ou RNA) de sequência conhecida
usadas para identificar a presença de DNA complementar na amostra.


Ocorre pareamento espontâneo resultante da complementaridade das bases.
É o princípio das técnicas usadas para detectar e caracterizar genes.
Tecnologia das sondas gênicas é usada para identificar genes individuais ou
sequencias de DNA.

A ligação das fitas (sonda + amostra ) se denomina IBRIDIZAÇÃO.

Duas fitas devem ter pelo menos 16-20 bases complementares consecutivas para
formar uma fita estável e complementar.
1. Sondas podem ser marcadas com: radioisótopos, enzimas,
fluorocromo e substratos quimioluminescentes.
2. Hibridização pode ocorrer em suportes sólidos ou líquidos
Sonda é uma “assinatura das sequências genéticas de
um organismo ou um gene”
Tipos de sondas gênicas
1. Sonda funcional - baseada nos genes de uma função
específica.
2. Sonda filogenética - baseada nas sequências das
subunidades rRNA.
3. Sonda de oligonucleotídio - pequena sequência, de
20 a 70 nucleotídios.
Técnicas de hibridização
(detecção de biomoléculas)
Dot-Blot
1.
2.
3.
A amostra (mistura que contém a molécula alvo) é aplicada
pontualmente em uma membrana, depois aquecida para
desnaturar o DNA;
Adiciona-se sondas marcadas;
A amostra é lavada para remoção da sonda não hibridizada e
avalia-se os reagentes.
Método qualitativo,
As vezes difícil de interpretar,
Simplificação dos outros métodos de hibridização.
Hibridização dot-blot
Detecta rapidamente a presença de biomoléculas
Não informa sobre os tamanhos das moléculas
100 %
transgênico
Hibridização dot-blot (DNA–DNA) entre o genoma de milho e um sonda 35S
do CAMV (vírus do mosaico da couve-flor – promotor utilizado em transgenia).
Linha superior: 1=100% transgênico; 2= 10% transgênico; 3= 5% transgênico; 4= 1%
transgênico, 5= 0.5% transgênico; 6= controle negativo.; 7=água
Linha inferior: 1=crioulo B1; 2=crioulo B2; 3=crioulo B3; 4=crioulo A1; 5=crioulo A2; 6=
crioulo A3; 7= milho do Peru, controle negativo.
Southern Blot
1.
Fragments de DNA são separados por eletroforese
2.
O gel da eletroforese é tratado com álcalis para desnaturar a dupla
fita.
3.
Transfere-se por contato o DNA desnaturado para uma membrana
(nitrocelulose ou Nylon)
4.
Fixa-se o DNA na membrana por aquecimento (ou UV)
5.
Aplica-se uma sonda hibridizadora marcada (molécula de DNA
conhecida e idêntica àquela que se quer encontrar).
6.
Lavagem para retirada do excesso de sonda
7.
Revelação por radiografia ou aparecimento de cor, caso a molécula
alvo esteja presente.
Southern Blot
Transferência do DNA para uma membrana
membrana
Baseado no fato que fragmentos de DNA aderem a membranas de nitrocelulose
ou Nylon:
•
•
•
•
A membrana é colocada acima de um gel de agarose e abaixo de um material absorvente.
Com o tempo os fragmentos de DNA se transferem do gel para a membrana por capilaridade.
Após a transferência, a membrana é lavada e os fragmentos expostos a UV ou calor para fixação.
A membrana torna-se uma imagem do DNA presente no gel.
Técnica do Southern Blot
Como são preparados os fragmentos de DNA?
- Enzimas de restrição
Endonucleases (ou enzimas) de restrição
São proteínas que reconhecem sítios
específicos das sequências de nucleotídeos e
clivam ambas as fitas de DNA.
“tesouras moleculares”
Descoberta na década de 70 como um mecanismo
de defesa de bactérias contra bacteriófagos, hoje
é uma ferramenta da biologia molecular para
fabricação de novas moléculas.
Southern Blot – Ex.: teste de paternidade
Mãe: azul
Pai: amarelo
Seus 4 filhos : D1 (filha biológica), D2 (enteada, filha da mãe e exmarido (vermelho), S1 (filho biológico), and S2 (filho
adotivo,não relacionado biologicamente com pais).
Northern Blot
(Utiliza RNA em vez de DNA, propiciando estudos de expressão gênica)
Permite a investigação do peso molecular de um mRNA e avaliar
quantidades relativas de mRNA em diferentes amostras.
1. RNA (RNA total ou apenas mRNA) é separado por eletroforese.
2. O RNA é transferido para membrana especial (nitrocelulose).
3. A amostra é incubada com uma sonda de DNA (ou RNA) fita única marcada.
4. A sonda hibridizará caso ocorra complementaridade formando uma molécula dupla
fita (molécula RNA-DNA).
5. A localização da sonda é revelada por incubação com uma substância que ligada
a enzima converte-se produto colorido ou que exposta a raios X pode ser
revelada.
Northern Blot
Hibridização em solução

Ambos ácido nucléico-alvo e sonda interagem livremente na solução.

Neste caso maior sensibilidade do que em suporte sólido
Requer menos amostra
Sonda deve ser fita única e não deve formar dupla hélice (auto
anelamento).
Adaptável a automação particularmente quando se usam marcadores
quimioluminiscentes.




Rápido: resultado em poucas horas.
Hibridização em solução
Biochips
(Análise do perfil de expressão de comunidades)
Microarranjos de
DNA
“DNA microarrays”
Coleção de porções de DNA
aderidas a suportes sólidos
(vidro, plástico ou silicone)
formando um conjunto que
visa monitorar a expressão de
múltiplos genes.
Biochips: microarranjos de DNA

Um chip de DNA é um biosensor que analisa informações genéticas.

Utiliza a complementaridade das 4 bases (A, T, G , C) no qual A emparelha
com T e G emparelha com C através de pontes de H.

Sequências de DNA contendo genes conhecidos (SONDAS de DNA) são
colocadas num suporte em microsítios (alguns μm de diâmetro) e arranjados
em filas.

Genes extraídos de amostras e amplificados (PCR) são colocados no chip
de DNA, possibilitando que caracteristicas como a presença de genes
mutantes ou especificos sejam detectados através da hibridização.

Importante para amostras ambientais, diagnóstico de doenças (câncer).
Como um biochip é produzido?



Usa DNA, RNA ou oligonucleotídeos.
Também podem ser de proteínas e de anticorpos.
Permite a realização de milhares de reações biológicas de
uma só vez.
Etapa 1: produção de sondas

Usando técnicas convencionais, como PCR e síntese
bioquímica, fitas de DNA específicas (sondas) são obtidas e
purificadas.
Existe ampla variedade de
sondas no mercado
Etapa 2: preparação dos pontos de ligação

Usam-se robótica e nano-manufactura para colocar em vidro ou
plástico os receptáculos (substratos) das sondas de DNA.
Etape 3: integração das sondas

Utiliza-se uma variedade de processos (eletroforese até ligação
usando robótica) para aderir o material genético ao substrato.

Condições de assepsia total nesta etapa (salas esterilizadas) para
impedir contaminações.
Chip de DNA
Hibridização in situ
 Alvo:
ácido nucléico em células intactas.
 Fornece
informação sobre a presença de DNA específico
e sua distribuição ou localização em tecidos ou
superfícies.
 Sondas
devem ser suficiente pequenas para atingir o DNA.
 Podem
usar marcadores radioativos ou fluorescentes.
 Requer
experiência para interpretação.
Hibridização in situ com fluorescência (FISH)
Fluorescent In Situ Hybridization - FISH
• Bactérias do grupo alvo
aparecem em vermelho.
• Restantes bactérias
aparecem em azul
(cores artificiais)
Combinação de FISH com DAPI
Permite a detecção simultânea do
sinal da sonda de DNA e sua
localização no cromossomo.
• Azul: corante DAPI
• Vermelho: Grânulos internos
indicando bactérias ativas em
processo respiratório
.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) é um
corante fluorescente que se liga fortemente com o
DNA.
Reação de amplificação do DNA – PCR
(amplificação gênica)

O objetivo é fazer um número elevado de cópias de um gene ou sequência.
Células são separadas e lisadas
DNA dupla fita é separado em fita única.

Iniciadores (primers) são adicionados (pequenos fragmentos de DNA, 2-30 nucleotídios)
Primers são segmentos complementares aqueles que flanqueiam a sequência alvo
Apenas os segmentos DNA alvo entre os primers serão replicados

Cada ciclo térmico de PCR consiste de 3 etapas:
– Desnaturação do DNA alvo (separação das fitas): 94 °C
– Anelamento por abaixamento da temperatura: 55 °C
– Extensão quando primers iniciam a síntese de DNA com uma DNA polimerase: 72 °C

Cada ciclo resulta no dobro das sequências alvo (dura cerca de 60-90 seg). Geralmente
usam-se 30 ciclos.
Taq polimerase
É
uma enzima termoestável isolada da bactéria Thermus
aquaticus, que habita em regiões hidrotermais.
 "Taq
polimerase" é uma abreviatura de Thermus Aquaticus
Polimerase.
É
geralmente usada no PCR porque é razoavelmente barata e
pode suportar as condições da técnica (temperatura de
desnaturação).
PCR
PCR
O que fazer com PCR?
• Amplificar genes 16S rDNA diretamente de
amostras ambientais.
• Usar primers específicos de certos grupos:
detecção específica
• Detectar genes funcionais quando sua sequência é
conhecida.
Métodos moleculares
Sondas gênicas
Hibridização
Biochips
PCR
Perspectivas - O futuro?
Técnicas independentes de cultivo são essenciais, mas são
lentas e trabalhosas.
Como torná-las mais rápidas para utilizar em análises de
comunidades microbianas?
Amostras
ambientais
Processador
automático
Diversidade microbiana,
atividade, potencial
metabólico,...
•Aumentar automação
•Uso da robótica
•Tecnologia de microarranjos de DNA
Expressões da diversidade
A diversidade refere-se tanto ao número (riqueza) de
diferentes categorias biológicas quanto à abundância relativa
(equitabilidade) dessas categorias.
Inclui variabilidade ao nível local (diversidade alfa), entre
habitats (diversidade beta) e entre paisagens (diversidade
gama).
Expressões da diversidade
Medidas objetivas
Diversidade de Margalef
(Diversidade alfa)
É um índice simples que considera somente o número de espécies (n-1) e o
logarítmo do número total de indivíduos.
D = (n-1)/ln N
onde: n é o número de espécies amostradas; N é o número total de indivíduos em
todas as espécies.
2 = baixa diversidade
> 5 = alta diversidade
Outros índices: Diversidade de Gleason
Diversidade de Menhinick
Diversidade de Shannon-Wiener
Índices de heterogeneidade
Modelos de distribuição de abundância
Modelos estatísticos que permitem observar variabilidade (número de
espécies) e a equitatividade (distribuição da abundância relativa)
Log-normal
Série geométrica
Broken stick
Série logarítmica
Modelos de abundância
Abundância
Broken stick
Log normal
Série log
Série geométrica
Sequência das espécies
Características dos modelos:
Série geométrica: pressupõe comunidades onde uma espécie preencheria um nicho e as
demais ocupariam proporcionalmente frações de nicho remanescentes. Adequado para
comunidades pobres e em estágios iniciais de sucessão.
Série logarítmica: representa comunidades governadas por um único recurso, com os
nichos remanescentes da ocupação de uma espécie sendo ocupados aleatoriamente.
Comunidades mais maduras, em estágio mais avançado de sucessão.
Broken stick: sugere uma comunidade com alta equitabilidade (heterogeneidade),
regulada por fatores ambientais pouco variáveis. Modelo baseado em interações
competitivas entre espécies de uma comunidade.
Log normal: modelo satisfatório para a maioria das comunidades. Resultado do Teorema
Central do Limite, que prevê a soma de muitos fatores independentes com pequenos
efeitos.
Embora os modelos descritos possibilitem uma descrição
mais completa dos dados de diversidade, há a necessidade
de se empregar modelos de ajustamento, que podem ser
trabalhosos e demorados. Além disso, as comunidades
estudadas podem não se enquadrar em nenhum dos
modelos. Neste sentido, os índices de diversidade provêm
uma alternativa adequada para as medidas de diversidade
(Magurran, 1988).
Sumário
Diversidade tem dois componentes:
- Variabilidade e Abundância relativa
Etapas no cálculo:
1. Identificar o número de espécies
2. Avaliar o número ou biomassa dentro de cada espécie
3. Usar estes valores nas expressões
Pode-se calcular em diferentes níveis de complexidade:
- genético, espécies e comunidades
As técnicas tem sensibilidades diferentes e incluem:
- técnicas dependentes de cultivo
- técnicas independentes de cultivo
FIM
Próxima aula:
Estudos de caso
1
cDNA
Fazer cópia do mRNA na forma de DNA
2
Enzimas de restrição
Cortar o DNA em pontos específicos, fragmentando-o
3
DNA ligase
Ligar fragmentos de DNA
4
Vetores
Transportadores de DNA para as células de forma a
assegurar sua replicação
5
Plamídios
Tipo de vetor
6
Transferência gênica
Colocar um gene em uma célula
7
Marcadores genéticos
Para identificar células que foram transformadas
8
Placas réplica
Fazer cópias exatas de colônias bacterianas em
placas
9
PCR
Técnica de amplificação de DNA
10
Sondas de DNA
Identificar e marcar um pequena porção de DNA
que contenha um seqüência específica.
11
Shotgun
Pesquisar um gene particular no genoma total
12
Genes antisense
Parar a expressão de um gene na célula
13
Eletroforese
Separar fragmentos de DNA