CAROLINA SCHNEIDER CHADUD
AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE
DNA FETAL LIVRE NO PLASMA MATERNO
DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA GESTAÇÃO:
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE A COLETA E
ARMAZENAMENTO EM TUBO EDTA E PPT
São Paulo
2013
CAROLINA SCHNEIDER CHADUD
AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE
DNA FETAL LIVRE NO PLASMA MATERNO
DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA GESTAÇÃO:
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE A COLETA E
ARMAZENAMENTO EM TUBO EDTA E PPT
Dissertação apresentada ao Curso de Pós
Graduação da Faculdade de Ciências Médicas
da Santa Casa de São Paulo para obtenção do
Título de Mestre
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Tsutomu Aoki
Co-orientador: Prof. Dr. Luis Claudio de Silva Bussamra
São Paulo
2013
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Chadud, Carolina Schneider
Avaliação da concentração de DNA fetal livre no plasma materno
durante o primeiro trimestre da gestação: estudo comparativo entre a
coleta e armazenamento em tubo EDTA e PPT./ Carolina Schneider
Chadud. São Paulo, 2013.
Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Tsutomu Aoki
1. Diagnóstico pré-natal 2. DNA/sangue 3. Plasma 4. Troca
materno-fetal
BC-FCMSCSP/69-13
DEDICATÓRIA
A minha filha, Maria Luísa, amor da minha vida, pela
compreensão nos momentos em que me ausentei e por me
mostrar que o amor não tem limites. Minha filha querida, você é
e sempre será o meu bem mais valioso.
Aos meus pais, Fernando e Elsa, não somente pelo presente
da vida, mas por todas as lições de vida, por todos os valores e
pela fundamental presença em toda minha trajetória, assim
como pelo apoio incondicional às minhas escolhas. Meu amor
por vocês é eterno.
Ao meu irmão, Vitor, pelas lembranças inesquecíveis de uma
infância muito feliz, pela convivência sempre harmoniosa e
pelos ensinamentos sobre o amor fraternal. Esteja sempre
presente na minha vida.
Ao meu marido, André, amor da minha vida, pela dedicação,
companheirismo e amor diários, mas principalmente por me
ensinar que o verdadeiro sentimento pode superar obstáculos e
se manter inabalável.
Aos meus tios, Ana Lúcia e Fábio, pela estimada e constante
presença em minha vida pessoal e profissional. Sempre
dedicarei um grande amor a vocês.
Ao meu avô, Ihiel (in memorian) por todo o amor, incentivo e
amizade, imprescindíveis para minha formação, mas também
pelo exemplo de dedicação à pesquisa científica e vida
acadêmica. Você sempre será um exemplo para mim.
“Por mais longa que seja a caminhada o mais
importante é dar o primeiro passo”
Vinícius de Moraes
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa, pelo
acolhimento e oportunidade.
À Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo,
berço de meu aprendizado durante a residência médica, por
ensinar-me o verdadeiro sentido do amor ao próximo e respeito
ao ser humano.
Ao Serviço de Medicina Fetal da Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo, por todo o aprendizado e por
fornecer o apoio necessário para a realização deste trabalho.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Tsutomu Aoki, exemplo de
profissional e ser humano; pela oportunidade, confiança e
constante apoio frente aos obstáculos enfrentados no
desenvolvimento desta tese, além do relevante incentivo à vida
acadêmica.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Luis Cláudio de Silva
Bussamra, coordenador do setor de Medicina Fetal da Santa
Casa de São Paulo, pelo acolhimento fraternal; além dos
ensinamentos, oportunidade e incentivo ao crescimento
profissional e vida acadêmica.
Ao Prof. Dr. José Mendes Aldrighi, Diretor do Departamento
de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de São Paulo, pelo
constante incentivo à pesquisa e titulação dos docentes e
confiança em meu trabalho.
Ao Prof. Dr. Antônio Pedro Flores Auge, coordenador do
programa de pós-graduação do Departamento de Obstetrícia e
Ginecologia da Santa Casa de São Paulo, por permitir a
concretização deste sonho.
À CAPES, pelo apoio financeiro durante o tempo de
desenvolvimento da pesquisa.
A RDO, pelo apoio técnico prestado durante o processamento
do material, fundamental para a concretização deste trabalho.
A Prof. Dr. Ciro Dresch Martinhago, competente médico
geneticista, pelo apoio, confiança e incentivo no
desenvolvimento deste projeto.
À Giselle Tedesco e Viviane Andari, companheiras durante a
elaboração desta tese, não só pelo incansável esforço e
trabalho dedicados, mas pela amizade construída.
Por fim, às gestantes, que em momento relevante de suas
vidas, permitiram e contribuíram de forma generosa para o
desenvolvimento desta pesquisa.
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
CCD - charge-coupled devices
CCN - comprimento cabeça - nádega
CT - ciclo de threshold
DNA - ácido desoxirribonucleico
EDTA - ethylenediaminetetracetic acid
FISH - rapid fluorescence in situ hybridization
ml - mililitro
ng - nanograma
NIFTY - The National Institute of Child Health and Human Development Fetal Cell
Isolation Study
pb - pares de base
PCR - protein chain reaction
PPT - plasma preparation tube
rpm - rotações por minuto
WGA - whole genome amplification
∆Rn - baseline corrected normalized fluorescence
µl - microlitro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..............................................................................................
1
1.1 Rastreamento e diagnóstico de aneuploidias fetais na gestação ...........
1
1.2 Revisão Bibliográfica ...............................................................................
3
1.2.1 Células fetais intactas no sangue materno .....................................
3
1.2.2 DNA fetal livre no plasma materno .................................................
5
1.3 Diagnóstico não invasivo pré-natal ..........................................................
7
1.4 Aplicações clinicas ..................................................................................
9
1.5 Técnicas de processamento e enriquecimento de DNA .........................
10
1.6 PCR em tempo real .................................................................................
14
1.7 Tubos EDTA e PPT .................................................................................
17
2. OBJETIVO ....................................................................................................
19
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS ..........................................................................
20
3.1 Critérios e inclusão ..................................................................................
21
3.2 Critérios de exclusão ...............................................................................
21
3.3 Coleta de material ...................................................................................
22
3.4 Processamento do plasma materno ........................................................
22
3.5 Extração de DNA das amostras ..............................................................
23
3.6 Desenho dos primers e sondas TaqMan MGB® ....................................
23
3.7 PCR em tempo real .................................................................................
24
3.8 Controle de contaminação ......................................................................
26
3.9 Análise estatística ....................................................................................
26
3.10 Cálculo amostral ....................................................................................
27
4. RESULTADOS .............................................................................................
28
5. DISCUSSÃO .................................................................................................
32
6. CONCLUSÃO ...............................................................................................
36
7. ANEXOS .......................................................................................................
37
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................
42
FONTES CONSULTADAS ...........................................................................
50
RESUMO ......................................................................................................
51
ABSTRACT ...................................................................................................
52
1. INTRODUÇÃO:
1.1 Rastreamento e diagnóstico de aneuploidias fetais na gestação
O diagnóstico pré-natal é de extrema importância para o manejo de
gestações com anormalidades fetais, além de permitir o planejamento adequado do
parto e de cuidados neonatais específicos (Dhallan et al, 2004).
Aneuploidia é definida como alteração numérica dos cromossomos, afetando
1 em cada 300 recém-nascidos, sendo a causa mais comum de retardo mental
(Sayres, Cho, 2011). A incidência na população geral de doenças resultantes de
uma anomalia genética detectável é de 1 a 2 %, com predomínio das alterações
cromossômicas sobre as gênicas (Wolff et al, 2009).
Estudos
populacionais
mostram
que
a
incidência
de
anomalias
cromossômicas é de aproximadamente 50% em abortamentos espontâneos, 5 a
10% em natimortos e 0,5% em nativivos (Wolff et al, 2009). No momento da
detecção clínica da gravidez, a frequência das cromossomopatias está ao redor de
5%, e ao nascimento de 0,3%, em virtude do processo de seleção negativa natural
dos embriões cromossomicamente anormais. Como evidência de tal seleção
negativa, 50 a 70% dos abortos espontâneos e natimortos apresentam alterações
cromossômicas (Wolff et al, 2009).
Atualmente, existe uma gama de exames disponíveis para o rastreamento
pré-natal de aneuploidias, durante o primeiro trimestre. No entanto, todos
apresentam alguma limitação. Exames não invasivos, como marcadores séricos
maternos (dosagem da fração livre do beta HCG e da proteína plasmática A),
aferição ultrassonográfica da translucência nucal, osso nasal e dopplerfluxometria do
ducto
venoso
são
utilizados
tradicionalmente
para
o
rastreamento
de
cromossomopatias, porém não permitem o diagnóstico definitivo (Evans, Kilpatrick,
2010; Sayres, Cho, 2011).
2
A taxa de detecção de trissomia do cromossomo 21 é de aproximadamente
92 a 96% com o uso destes métodos de rastreamento, com taxa de falso positivo
menor do que 3% (Malone et al, 2005; Nicolaides, 2011). Em relação às outras
alterações cromossômicas, como trissomia do cromossomo 13 e 18 e monossomia
do cromossomo X, a detecção é similar, podendo ser discretamente maior. A taxa de
falso positivo encontra-se ao redor de 5%, o que gera procedimentos invasivos e
riscos desnecessários (Sayres, Cho, 2011; Verweij et al, 2012). Além disso, estes
métodos apresentam especificidade e sensibilidade limitadas, além de só serem
executados em um período da gestação, especificamente entre 11 e 14 semanas
(Lo, Chiu, 2008).
Procedimentos diagnósticos invasivos no pré-natal, como biópsia de vilo
corial, amniocentese e cordocentese, são oferecidos a gestantes acima de 35 anos,
com história familiar de aneuploidias, na presença de malformações fetais, e em
casos de risco elevado em exame morfológico de primeiro trimestre (Bianchi et
al,1997). Estes métodos convencionais de obtenção de material para verificação de
anormalidades fetais – cariótipo - são invasivos e carregam um risco potencial de
perda da gestação de 0,5 a 2%, além de outras complicações obstétricas maternas
e fetais tais como infecção materna, oligoâmnio, corioamnionite, punção de partes
fetais, rotura de membranas ovulares, hemorragia e trabalho de parto prematuro
(Alfirevic et al, 2003; Lo, 2005).
Técnicas
de
imagem
avançadas
–
ultrassonografia
tridimensional,
ecocardiograma fetal, dopplerfluxometria e ressonância magnética fetal – assim
como métodos citogenéticos – cariótipo fetal e FISH (rapid fluorescence in situ
hybridization) ou de biologia molecular – PCR (protein chain reaction), PCR em
tempo real, tecnologia de arrays, amplificação de sinais – oferecem a possibilidade
de diagnóstico pré-natal de diversas malformações estruturais congênitas e
desordens genéticas em famílias de alto risco (Agnieszka et al, 2007). Os casais
considerados de alto risco apresentam na anamnese história de parente de primeiro
grau com doença genética, um dos indivíduos é portador de doença genética,
consanguinidade, passado de abortamento habitual, idade materna avançada,
exposição à radiação ou a substâncias com possível efeito teratogênico ou alteração
em ultrassom morfológico fetal durante a gestação (Pinto Junior, 2002). O
3
diagnóstico precoce intra-útero é essencial para o manejo da gestação, cuidados pré
e pós-natais e tratamento. Além disso, é também crucial para a tomada de decisão
em manter ou interromper a gestação (Agnieszka et al, 2007).
1.2 Revisão bibliográfica
1.2.1 Células fetais intactas no sangue materno
A circulação materna é separada da porção fetal pelas vilosidades
trofoblásticas da placenta. Entretanto, sabe-se da existência do tráfego bidirecional
de células entre mãe e feto (Walknowska et al, 1969; Lo et al, 1989; Lo et al, 1996;
Lo et al, 2000b). Desde o século passado, sabe-se da presença de material fetal em
organismo materno, durante o período gestacional (Walknowska et al, 1969). Além
disso, o número de células fetais que atinge a circulação materna aumenta
exponencialmente com o decorrer da gestação (Kirsch-Volders et al, 1980). A
identificação
de
material
genético
materno,
sobforma
de
DNA
(ácido
desoxirribonucleico) materno livre, ocorreu anos mais tarde, em plasma de cordão
umbilical (Lo et al, 2000b). A partir destas constatações, abriu-se um novo horizonte
para a pesquisa de material genético fetal no sangue periférico materno (Lo et al,
1998a).
Assim, o interesse em buscar alternativas para o diagnóstico pré-natal não
invasivo se tornou foco de diversas pesquisas. Diferentes tipos de células
sanguíneas – eritrócitos, trofoblastos e leucócitos – cruzam a placenta e circulam no
sangue de gestantes (Walknowska et al,1969). Estes diferentes tipos celulares foram
explorados como candidatos em potencial para o diagnóstico pré-natal não invasivo.
Desde meados de 1950, a passagem de eritrócitos entre mãe e feto já era um
fenômeno bem documentado, na proporção de uma célula fetal a cada 50 000
células maternas (Schoder, 1975). A identificação de linfócitos fetais em circulação
materna,a partir do primeiro trimestre de gestação, ocorreu anos mais tarde, sendo
estabelecido um número aproximado de uma célula fetal a cada 500 – 1000 células
maternas (Kirsch-Volders et al, 1980).
Inicialmente, os estudos se concentraram em isolar as células fetais
4
nucleadas do sangue materno, sob a justificativa de que estas continham maior
concentração de DNA fetal, em virtude da existência de material genético
concentrado no núcleo celular (Bianchi et al, 1990; Gaenshirt et al, 1994). Células
fetais são encontradas em quantidade significativamente maior no organismo
materno em gestações de fetos portadores de trissomia do cromossomo 21, em
comparação com fetos euplóides (Bianchi et al, 1997). Este fenômeno está de
acordo com estudos que demonstraram anormalidades patológicas em placentas,
como imaturidade e hidropsia, em casos de trissomia dos cromossomos 13, 18 e 21
(Labbé et al, 1989). Entretanto, após diversas tentativas sem sucesso, buscando
aprimorar técnicas de biologia molecular que aumentassem o poder diagnóstico,
este método foi abandonado. As técnicas de isolamento e enriquecimento celular
são lentas, caras e de difícil implementação em larga escala (Lo et al, 1998a).
As células brancas do sistema imune fetal (CD34+ e CD38+) podem estar
presentes, depositadas no baço e fígado maternos, por mais de vinte anos após o
término da gestação, inviabilizando a aplicação desta técnica pela possibilidade de
interferência de gestações anteriores (Bianchi et al, 1996). Pesquisas recentes
associaram a persistência de células fetais na circulação materna, após o término do
período gestacional, ao desenvolvimento de doenças autoimunes maternas, como
esclerose múltipla (Lo, 2000a).
Em relação às células nucleadas da série vermelha, sua concentração em
sangue materno apresenta oscilação lenta, o que impede a utilização como
marcadores de eventos gestacionais (Lo et al, 1999c). Estudos prévios sobre o
processo de depuração de células fetais do sangue materno concluíram que, em
muitos casos, o tempo necessário pode atingir semanas (Lo et al, 1993; Thomas et
al, 1995). Por fim, a raridade de eritrócitos fetais em amostras de sangue da mãe – 1
– 2/ml de sangue materno – limitou, portanto, a prática e o desenvolvimento dessa
estratégia (Bianchi et al, 1997).
Nas últimas décadas, o isolamento de células fetais em gestantes foi
bastante investigado (Lo et al, 1989). Em 2002, o estudo NIFTY (The National
Institute of Child Health and Human Development Fetal Cell Isolation Study) enfocou
exclusivamente o uso de células fetais, estabelecendo que as técnicas de
enriquecimento e a tecnologia voltada para análise de células intactas não eram
5
viáveis para a prática clínica. Além disso, a sensibilidade para a detecção de
aneuploidias era comparada a de marcadores de rastreamento no sangue materno,
distante do padrão ouro oferecido pelos procedimentos invasivos (Bianchi et al,
2002).
1.2.2 DNA fetal livre no plasma materno
Um estudo da década de setenta constatou pequena quantidade de DNA
presente no soro de indivíduos normais - média de 13 ± 3 ng/ml - e o aumento deste
valor em pacientes portadores de câncer - média de 280 ng/ml (Leon et al, 1977).
A porção acelular do sangue - o plasma – passou a ser objeto de grande
interesse nos estudos após a identificação de DNA tumoral circulando livre no
plasma de pacientes portadores de câncer (Chen et al, 1996). Simultaneamente,
também foi reportada a presença do DNA de indivíduos doadores no plasma dos
pacientes receptores de transplantes de órgãos sólidos (Lo et al, 1998c).
As bases biológicas da liberação de DNA fetal no plasma materno ainda não
foram totalmente esclarecidas. Possivelmente ocorre devido ao contínuo escape de
células fetais através da placenta, que são rapidamente destruídas pelo sistema
imune materno, liberando o DNA fetal livre na circulação (Pertl et al, 2000).
Adicionalmente, a apoptose das células fetais é também um mecanismo envolvido
(Pertl, Bianchi, 2001; Chan et al, 2004; Bischoff et al, 2005), além dos processos de
morte e lise celular (Bianchi, 1998; Angert et al, 2003). Maior quantidade de DNA
livre circulante foi dosada em casos de lúpus eritematoso sistêmico (Davis et al,
1978) e trauma (Lo et al, 2000b). Este fenômeno é atribuído a maiores taxas de
eventos de morte celular que caracterizam estas doenças (Holdenrieder et al, 2005).
Porém, é importante salientar que a principal fonte de DNA fetal livre tem origem no
trofoblasto da placenta, tornando primordial o estudo e compreensão do papel da
placenta na fisiopatologia da gestação normal e patológica (Litton et al, 2009; Tounta
et al, 2011).
Em 1997, Lo e colaboradores descobriram a presença de DNA fetal
circulando livre no plasma e soro de mulheres grávidas (Lo et al, 1997). No mesmo
ano, o achado de DNA circulante em pacientes portadores de câncer e em
indivíduos transplantados impulsionou-o e colaboradores a descrever pela primeira
6
vez a presença de DNA fetal no plasma e soro materno. No mesmo trabalho foi
sugerido que o DNA fetal livre derivado de plasma ou soro materno poderia ser um
recurso alternativo não invasivo de obtenção de material fetal para diagnóstico prénatal. Inicialmente, Lo e colaboradores identificaram a presença de sequências
exclusivas de DNA de fetos masculinos - frações específicas do cromossomo Y - no
plasma e soro de gestantes (Lo et al, 1997).
Em 1998, este mesmo grupo desenvolveu um trabalho com o objetivo de
quantificar a concentração de DNA fetal livre em sangue materno. A detecção de
sequências de DNA fetal é possível em 80% e 70% dos casos, com apenas 10µl de
plasma e soro, respectivamente (Lo et al, 1998a). Foi estimado que o DNA fetal livre
constituísse em média 3,4% (de 0,39 -11,9%) do total de DNA no plasma materno
em gestações de primeiro e segundo trimestre e 6,2% (de 2,33 -11,4%) em
gestações de terceiro trimestre (Lo et al, 1998a). Além disso, a concentração média
de DNA fetal livre em plasma materno é 21,2 vezes maior em comparação ao
número de células intactas (Lo et al, 1998a). Estes estudos preliminares indicam,
portanto, que a maior fração de DNA fetal circula na forma livre em ambiente
materno (Lo et al, 2000b).
A análise quantitativa do tráfego bidirecional de material genético entre mãe
e feto ocorreu anos mais tarde, em um trabalho publicado por Lo e colaboradores
em 2000. Embora a detecção de células nucleadas e DNA materno livre na
circulação fetal seja de aproximadamente 24% e 30%, respectivamente, na direção
oposta, ou seja, as células nucleadas e o DNA fetal livre na circulação materna
apresentam taxa de detecção de 26% e 100%, respectivamente (Lo et al, 2000b).
Existe, portanto, uma impressionante diferença na taxa de detecção entre DNA fetal
no plasma materno (100%) e DNA materno no plasma do cordão umbilical (30%).
Uma possível explicação seria a existência da placenta, como estrutura de interface
entre a circulação materna e fetal, e que seria a grande fonte responsável pelo
controle da liberação do material genético fetal (Lo et al, 2000b; Wataganara et al,
2005).
7
1.3 Diagnóstico não invasivo pré-natal
Uma alternativa aos métodos tradicionais de diagnóstico pré-natal seria o
uso do material genético fetal, o DNA fetal, existente na circulação materna. O
diagnóstico pré-natal não invasivo é uma meta procurada há bastante tempo na
história da genética humana (Lo et al, 1998a). Durante a gravidez, a circulação entre
mãe e feto é separada parcialmente pela membrana placentária. Porém, o tráfego
bidirecional de células eritrocitárias, através das vilosidades trofoblásticas, foi
comprovado cientificamente, aumentando as possibilidades de um potencial método
para o diagnóstico pré-natal não invasivo (Lo et al, 1996).
A concentração do DNA fetal no soro e plasma das gestantes aumenta
gradativamente durante a gestação (Lo et al, 1998a, Zhong et al, 2001). Além disso,
a detecção da sequência Y de DNA fetal no organismo materno é possível a partir
da quinta semana de gestação (Thomas et al, 1995).
A concentração de DNA fetal livre aumenta linearmente com o avanço da
gestação, com taxa de crescimento de 16 genomas fetais por ml de sangue materno
no primeiro trimestre para 80 no terceiro trimestre de gestação, atingindo o pico nas
últimas oito semanas de gestação (Zhong et al, 2000; Wright, Burton, 2009; Tounta
et al, 2011). Portanto, existe um aumento equivalente a 29,3% a cada semana no
terceiro trimestre de gestação (Chan et al, 2003).
A análise de DNA fetal livre no plasma materno não é afetada pela
persistência de células fetais de gestações anteriores (Bianchi et al, 1996). Além
disso, sua concentração é estável no plasma materno (Angert et al, 2003) e a
depuração deste material é rápida, com meia vida de 16,3 minutos – média de 4 a
30 minutos (Lo et al, 1999c). A ausência de DNA fetal em plasma materno
proveniente de outras gestações já está comprovada (Smid et al, 2003b).
Com base nestes dados, o turn over de DNA fetal circulante foi estudado e
concluiu-se que o DNA fetal é liberado constantemente na circulação materna, com
média de 2,24 X 104 cópias por minuto (Lo et al, 1999c). Os rins desempenham
importante papel no clearance de DNA fetal pelo organismo materno, uma vez que
este material fetal foi identificado em urina de mulheres gestando fetos masculinos
(Lo, 2000a).
8
O uso de DNA fetal no plasma materno passou a ser uma alternativa
promissora para o diagnóstico pré-natal não invasivo e precoce. Desde então,
diversos avanços nesta direção têm sido feitos. A detecção de sequências
exclusivamente fetais, como marcadores do cromossomo Y e sequências RHD, no
DNA fetal circulante, tornou possível a determinação na prática clínica do sexo e
fator RH fetais (Lo et al, 1989; Lo et al, 1998b). A abordagem com DNA fetal livre é,
portanto, um recurso melhor do que o uso de células intactas fetais para diagnóstico
não invasivo na gestação (Bischoff et al, 2002).
No entanto, o uso do DNA fetal livre para a detecção de anormalidades
cromossômicas em fetos ainda é limitado pela pequena porcentagem de DNA fetal
livre que é recuperado do plasma das gestantes (Dhallan et al, 2004). A fração de
DNA fetal recuperada representa aproximadamente 5 a 10% do total de DNA
circulante no plasma materno em gestações de primeiro e terceiro trimestre
respectivamente (Lo et al, 1998a). A eficiência da extração de DNA está diretamente
relacionada com a capacidade de detecção de sequências de DNA, ou seja, com a
técnica utilizada (Johnson et al, 2004).
O objetivo mais almejado no diagnóstico não invasivo pré-natal ainda é a
detecção de aneuploidias (Litton et al, 2009). Assim, ainda é necessário que novas
pesquisas desenvolvam caminhos alternativos, com o objetivo de aumentar a
detecção da fração fetal que compõe o DNA circulante no sangue de gestantes,
permitindo melhor assistência no período pré-natal em casos de suspeita de
alterações cromossômicas fetais.
Para um teste com DNA fetal livre se tornar disponível comercialmente
visando a triagem pré-natal, é mandatório que este seja confiável, viável e acessível
para implementação em larga escala (Sayres, Cho, 2011). Ademais, qualquer
método não invasivo deve ser preciso o suficiente para dispensar a confirmação
futura por procedimento invasivo, além de ser mais barato do que os procedimentos
invasivos em uso atualmente (Hahn et al, 2011).
9
1.4 Aplicações clínicas
A detecção qualitativa de sequências de DNA fetal tem implicação prática
em diagnósticos moleculares pré-natais de sexagem fetal associada a doenças
ligadas ao sexo (Lo et al, 1997; Costa et al, 2002a; Sesarini et al, 2009; Tounta et al,
2011); genotipagem do gene RhD (Lo et al, 1998b; Sesarini et al, 2009; Tounta et al,
2011), desordens autossômicas recessivas, como distrofia miotônica (Amicucci et al,
2000; Tounta et al, 2011), acondroplasia (Saito et al, 2000; Tounta et al, 2011) e
doença de Huntington (Tounta et al, 2011) ou desordens monogênicas, como a
fibrose cística e hemoglobinopatias (Chiu et al, 2001; Chiu et al, 2002; Keymolen et
al, 2007; Tounta et al, 2011).
A sensibilidade na avaliação do sexo fetal foi definida ao redor de 95%, com
especificidade de aproximadamente 99%, independentemente do trimestre da
gestação, indicando que este é um bom método para a rotina pré-natal, a partir de
cinco semanas de gestação, em casos de risco para doenças gênicas ligadas ao X,
genitália ambígua e hiperplasia adrenal congênita materna (Sekizawa et al, 2001;
Tounta et al, 2011; Wright et al, 2012). O uso do diagnóstico não invasivo do sexo
fetal, em casos de pré-natal com risco para doenças ligadas ao sexo, diminui para
metade o número de procedimentos invasivos, com implicação tanto no custo
quanto em taxas de complicação e perdas gestacionais (Sekizawa et al, 2001).
A detecção quantitativa focou amplamente na mensuração de DNA fetal no
plasma materno utilizando gestações normais como referência. Diferenças relativas
têm sido reportadas em casos de trissomia dos cromossomos 13, 18 ou 21 (Pertl et
al, 2000; Spencer et al, 2003; Jorgez et al, 2007); pré-eclâmpsia (Zhong et al, 2001;
Sekizawa et al, 2004; Leung et al, 2001); parto prematuro (Leung et al, 1998; Farina
et al, 2005); e abortamento (Lau et al, 2000).
Diversos estudos têm indicado a influência de certas desordens na liberação
de DNA fetal na circulação materna, corroborando a hipótese do papel primordial da
placenta como barreira seletiva neste processo (Leung et al, 1998; Lo et al, 1998a;
Pertl, Bianchi, 2001; Zhong et al, 2001; Leung et al, 2001; Spencer et al, 2003;
Sekizawa et al, 2004; Bischoff et al, 2005; Litton et al, 2009). Em gestações
complicadas por préeclâmpsia há um aumento significativo de material genético fetal
10
encontrado no plasma materno (Lo et al, 1999a; Leung et al, 2001; Zhong et al,
2001; Sekizawa et al, 2004). Em fetos portadores de trissomia do cromossomo 13,
18 e 21 também foi observado um grande aumento de DNA fetal (Lo et al, 1999b;
Pertl et al, 2000; Spencer et al, 2003; Jorgez et al, 2007), podendo se elevar em até
seis vezes (Bianchi et al, 1997); assim como em casos de parto prematuro (Leung et
al, 1998; Farina et al, 2005), abortamento (Lau et al, 2000), hiperêmese gravídica
(Sugito et al, 2003), processos invasivos da placenta (Sekisawa et al, 2002),
crescimento fetal restrito (Tounta et al, 2011), hemorragia feto-materna (Tounta et al,
2011) e polidrâmnio (Tounta et al, 2011). Portanto, a mensuração de DNA fetal
também pode ser um possível marcador para a predição de desordens maternas e
fetais durante o pré-natal, já que a disfunção placentária progressiva se manifesta
por maiores taxas de apoptose das células trofoblásticas, com consequente
aumento da concentração de DNA fetal livre circulante (Litton et al, 2009).
Menores concentrações de DNA fetal estão associadas a maiores taxas de
sucesso na terapia de tocólise, sugerindo o uso da concentração de DNA fetal como
screening para diferenciação entre falso trabalho de parto e trabalho de parto
prematuro (Pertl, Bianchi, 2001). A aplicação da concentração de DNA fetal livre em
gestações gemelares ainda não está bem estabelecida (Smid et al, 2003a).
O DNA fetal plasmático é, portanto, um método valioso e acessível para
obtenção de material genético fetal, aplicável para diagnóstico e acompanhamento
pré-natal (Lo et al, 2000a).
1.5 Técnicas de processamento e enriquecimento de DNA
Apesar do plasma e soro materno conterem DNA fetal livre, o plasma é o
material de escolha para uso em diagnóstico pré-natal, pois a concentração de DNA
materno misturado ao fetal é menor (Sesarini et al, 2010). Uma importante limitação
na detecção de sequências de DNA fetal é o fato de que este material se encontra
misturado ao material genético materno, o que gera interferência – background - na
recuperação do material de interesse para o estudo cromossômico do feto (Bianchi,
1998). O principal obstáculo para a extração eficiente do material genético fetal é,
portanto, o processo de diferenciação e separação do DNA fetal, já que a fração
11
materna representa 90 a 97% do total de DNA circulante e coexiste com a fração
fetal no plasma (Lo et al, 1998a).
A detecção de DNA fetal livre apresenta, portanto, os seguintes desafios
técnicos: a concentração de DNA fetal livre no sangue materno é relativamente
baixa; a concentração total de DNA fetal livre apresenta variação individual; a
concentração de DNA fetal livre apresenta relação de aproximadamente 1: 20 do
total de DNA total livre; o feto herda metade do genoma da mãe (Wright, Burton,
2009).
Como a utilidade do diagnóstico pré-natal não invasivo depende da
habilidade em separar e analisar o material genético misturado ao sangue materno,
a fração de DNA fetal livre pode ser aumentada por meio do enriquecimento da
fração fetal de DNA, ou pela diminuição da fração materna de DNA livre –
background – como esquematizado na Figura 1 (Lo, Chiu, 2008).
DNA fetal % =
DNA fetal
DNA fetal + DNA materno
DNA fetal % =
DNA fetal
DNA fetal +
DNA fetal % =
DNA materno
DNA fetal
DNA fetal + DNA materno
DNA fetal % =
DNA fetal
DNA fetal + DNA materno
Fonte: Lo, Chiu, 2008
FIGURA 1: Ilustração esquemática com as possíveis abordagens visando o
aumento da fração fetal de DNA
12
As técnicas utilizadas para detecção de DNA fetal livre na circulação
materna são mais simples, rápidas e confiáveis em comparação as utilizada para
detecção de células intactas fetais (Pertl, Bianchi, 2001; Bianchi et al, 2002).
Diferentes métodos de processamento podem afetar drasticamente a quantidade de
DNA que é detectado pelo PCR em tempo real no sangue materno (Chiu et al, 2001;
Johnson et al, 2004; Gonzáles-González et al, 2005; Chiu et al, 2005).
Em relação ao uso de protocolos de centrifugação, independente da
velocidade utilizada, não existe associação com dano em células sanguíneas, nem
tampouco a falsos aumentos na concentração de DNA livre da amostra submetida
ao processo (Chiu et al, 2001; Lui et al, 2002).
Dhallan e colaboradores adicionaram formaldeído à amostra de plasma
materno com o objetivo de aumentar a recuperação da fração fetal, por meio da
estabilização das células maternas e diminuição da lise celular (Dhallan et al, 2004).
Porém, outros grupos tentaram reproduzir a mesma técnica sem sucesso (Benachi
et al, 2005).
Quando o ácido fetal de interesse é exclusivo do concepto a demanda por
métodos de enriquecimento se torna desnecessária (Go et al, 2011). Um exemplo
disso seria a identificação de frações de DNA fetais (marcadores epigenéticos), em
locus que exibissem sinais epigenéticos feto-especificos, analisando diferentes
status de metilação do DNA entre a mãe e o feto (Jones, Takai, 2001; Chim et al,
2005; Tsui et al, 2010). A epigenética abrange processos, como a metilação de
DNA, que alteram o fenótipo, porém sem alterações na sequência do DNA (Sesarini
et al, 2010; Lim et al, 2011). Desde a descoberta do primeiro marcador epigenético
fetal, outros marcadores já foram descritos (Chiu et al, 2007; Tong et al, 2010). Os
marcadores epigenéticos fetais podem ser empregados tanto para análise qualitativa
como quantitativa do DNA fetal no plasma materno (Tsui et al, 2010). A detecção de
DNA fetal não metilado apresentou baixa sensibilidade (Poon et al, 2002). A principal
limitação ao uso da metilação do DNA está no método utilizado para detectar os
marcadores de metilação, baseado na conversão de bissulfite. O uso deste método
resulta em destruição de 95% do DNA (Grunau et al, 2001). Este fato pode levar a
resultado falso – negativo, principalmente em gestações de primeiro trimestre, em
função da redução do DNA fetal na amostra (Tounta et al, 2011).
13
Por este motivo, as pesquisas foram desviadas para marcadores
epigenéticos independentes da conversão de bissulfite, como a sequência
RASSF1A. Esta técnica, no entanto, requer importante manipulação, o que a torna
pouco viável para a prática clínica (Tounta et al, 2011).
Os fragmentos de DNA materno são maiores do que os de origem fetal
durante a gestação. Já foi demonstrado, pela análise por PCR, que o DNA fetal livre
circula sob a forma de fragmentos de até 300 pb (pares de base) em comparação ao
materno, que apresenta tamanho consideravelmente maior (Chan et al, 2004).
Portanto existe uma distribuição de diferentes tamanhos de DNA no plasma de
mulheres grávidas, abrindo a possibilidade de enriquecimento fetal por meio do
fracionamento de DNA. Esta técnica também é limitada, demorada e susceptível a
contaminação, não sendo útil como ferramenta diagnóstica isolada, mas sim como
método auxiliar de outras técnicas (Chan et al, 2004; Jorgez, Bischoff, 2009; Hahn,
Zimmermann, 2010; Go et al, 2011).
Outra maneira de se identificar a porção do cromossomo de origem fetal é
pela análise da proporção de variação genética nos alelos em um determinado ócus.
Porém só pode ser usada se o feto for heterozigoto para o ócus em análise (Lo,
Chiu, 2008). Uma opção para genes presentes de forma homozigota, em casos de
trissomia, seria a análise pelo PCR digital (Lo et al, 2007).
Atualmente, diversas novas tecnologias, como PCR digital, sequenciamento
massivo paralelo e a amplificação de todo o genoma – WGA (Whole genome
amplification) – tem se apresentado com alternativa para contornar o problema da
baixa concentração de DNA fetal livre no organismo materno. O PCR digital tem a
capacidade de detectar fragmentos menores de DNA livre, quando comparado com
a técnica de PCR em tempo real (Sikora et al, 2010). Porém, estes métodos são de
alto custo, lentos, de baixa produtividade, e ainda não foram submetidos à avaliação
em larga escala para permitir sua aplicação como rotina (Hanson, Ballantyne, 2005;
Chiu et al, 2010; Tsui et al, 2010; Chiu et al, 2011; Hahn et al, 2011; Tounta et al,
2011; Tsui, Lo, 2012).
14
1.6 PCR em tempo real
A
partir
do
desenvolvimento
de
técnicas
de
biologia
molecular,
especialmente com o advento da reação de PCR, poderosas ferramentas de
identificação de sequências genéticas fetais no sangue periférico materno, passaram
a ser empregadas (Lo et al, 1996). O PCR permite o sequenciamento de genomas, a
expressão de genes em sistemas recombinantes, o estudo de genética molecular, a
determinação rápida da paternidade e o diagnóstico rápido de doenças infecciosas.
O PCR em tempo real representa um avanço tecnológico, já que está técnica
apresenta
a
capacidade
de
gerar
resultados
quantitativos,
permite
o
acompanhamento da reação e apresenta resultados de forma precisa e rápida, em
comparação ao PCR que apresenta resultados apenas de forma qualitativa (Pertl,
Bianchi, 2001).
O método PCR em tempo real é uma tecnologia de inovação que permite
mensurar a taxa de acúmulo de amplificação através da detecção de fluorescência
emitida a cada ciclo da reação (Heid et al, 1996). Este processo é baseado numa
relação quantitativa entre o número de DNA-alvo presente no início da reação de
PCR e o montante de produto amplificado durante a fase exponencial da reação.
Dentre os vários sistemas suportados pela PCR em tempo real, o mais
utilizado é o TaqMan®, que utiliza um oligonucleotídeo marcado (sonda), uma
molécula fluorescente (fluoróforo) e outra de apagamento intamolecular (quencher),
além do par de oligo iniciadores (primers), utilizados na PCR comum. Portanto,
quando a sonda se liga na sequência-alvo, o fluoróforo e o quencher são separados
e a fluorescência pode ser mensurada pela máquina, através de uma câmera CCD
(charge-coupled devices) que capta o sinal de cada ciclo (Fig. 2).
15
FIGURA 2: Sistema TaqMan® para PCR em tempo real.
Com a emergência de uma nova tecnologia de sondas chamada TaqMan®
MGB™ (minor groove binder) foi possível amplificar regiões muito pequenas do
genoma (70 pb), deixando esse sistema de detecção mais sensível e com a
possibilidade
lidade do uso de várias sondas – multiplex (Kutyavin et al,
al 2000). Assim, este
sistema pode ser útil para a detecção de várias regiões na mesma reação.
O conceito chave para se entender a reação de PCR em tempo real é o ciclo
de threshold (CT). Inicialmente, se determinam
determina os níveis de ruído fluorescente (linha
de base ou baseline),
), e a partir desta
desta referência o CT é definido. Compreende-se
Compreende
por
linha de base o intervalo entre 3 a 5 ciclos, precedentes ao primeiro ciclo que se
inicia o sinal fluorescente de amplificação. O CT ocorre quando a fluorescência
ultrapassa a linha de threshold,
threshold a qual pode ser fixa ou determinada pelo operador.
A linha de threshold deve ser determinada na fase exponencial da curva para
resultados mais precisos, já que se presume que esta fase seja caracterizada pela
p
eficiência máxima da reação (Fig.
(Fig 3).
16
FIGURA 3: Conceitos
os básicos de PCR em tempo real.
A partir do princípio de que a PCR em tempo real reflete o número de cópias
do DNA-molde,
molde, quanto maior a concentração deste DNA, ou quanto maior o número
de
cópias
iniciais,
mais
precocemente
vai
aparecer
à
fluorescência
e
consequentemente, menor será o valor obtido do CT.
Outra definição importante em PCR em tempo real é o ∆Rn (baseline
corrected normalized fluorescence),
fluorescence), que nada mais é que a fluorescência final
emitida após a amplificação menos a fluorescência basal emitida
emitida naturalmente pela
reação e os reagentes. Quanto maior o ∆Rn
Rn mais robusta e eficiente foi a reação.
reaç
O
valor do ∆Rn
Rn depende de vários fatores, dentre os mais importantes estão
est
o
desenho dos primers e a sonda, a eficiência da reação, concentração de primers e
sonda e o conjunto de todos os reagente, ou seja, reflete diretamente a eficácia com
que a reação foi realizada.
O uso do PCR em tempo real com objetivo de quantificar o DNA fetal
plasmático, baseado na identificação de sequências Y específicas, apresentou
apres
95 a
17
100% de sensibilidade e 100% de especificidade (Bischoff et al, 2002; Zolotukhina et
al, 2005).
O PCR em tempo real é utilizado para a maioria destas análises porque este
método é automatizado, oferece dados em tempo real e, por ser um sistema
fechado, é menos susceptível a contaminação. Além disso, é uma metodologia que
mostra resultados quantitativos, justificando seu emprego na maioria dos estudos
com objetivo de determinar a concentração de DNA fetal livre em plasma materno
(Sikora et al, 2010). Além disso, é sensível o suficiente para detectar o DNA de uma
única cópia (Pertl, Bianchi, 2001).
1.7 Tubos EDTA e PPT
Os tubos para coleta de material hematológico são transparentes, incolores,
estéreis e,por serem herméticos são usados para coleta de sangue a vácuo (e
outras coletas), garantindo a esterilidade da amostra.
Existe uma variedade de tubos, com características distintas, o que os
diferencia quanto ao seu emprego.
O tubo EDTA (Ethylenediaminetetracetic acid) contém um anticoagulante, o
EDTA K2, jateado na parede interna.
Já o tubo PPT (Plasma Preparation Tube) também é um sistema a vácuo
com anticoagulante EDTA, porém possui um gel separador. Usado nos casos em
que é necessário o envio de plasma EDTA a partir do tubo original de coleta. A
presença do gel separador impede o contato entre as células presentes no sangue
materno e o plasma contendo o DNA fetal livre ao contrário do tubo EDTA que
contém apenas anticoagulante.
Diante das limitações expostas, nós decidimos investigar uma técnica
alternativa de coleta e armazenamento do sangue periférico materno, que permitisse
maior taxa de recuperação do DNA fetal livre. Sabemos que a maior parte do DNA
livre presente no plasma de gestante provém do próprio organismo materno (Lo et
18
al, 1998a; Fernando et al, 2010), em decorrência dos processos de apoptose
(Bischoff et al, 2005), morte e lise celular (Angert et al, 2003). Portanto, qualquer
fator que atuasse diminuindo estes processos, após a coleta da amostra de sangue
periférico materno, poderia diminuir a quantidade de DNA livre materno misturada ao
DNA fetal livre fetal, aumentado, portanto, a taxa relativa de DNA fetal livre.
Neste estudo nós construímos a hipótese de que por meio da inibição da lise
celular após a coleta de amostra de sangue materno em tubo PPT, uma maior
porcentagem de DNA fetal livre seria recuperada durante o processamento deste
material. Essa comparação entre a taxa de recuperação da fração fetal nos dois
diferentes tubos de coleta do plasma materno é inédita e não encontramos nenhuma
referência na literatura médica disponível.
19
2. OBJETIVO
O estudo visa comparar a concentração de DNA fetal livre em plasma
materno durante o primeiro trimestre de gestação, obtido em dois diferentes tubos:
EDTA e PPT.
20
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
Foram selecionadas para participar deste estudo as gestantes que
apresentavam os critérios de inclusão propostos neste protocolo, selecionadas no
Setor de Medicina Fetal do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa
Casa de Misericórdia de São Paulo, no período entre dezembro de 2011 e outubro
de 2012.
As
pacientes
selecionadas
foram
avaliadas
inicialmente
com
ultrassonografia obstétrica precoce (até 14 semanas), para a confirmação da idade
gestacional, por meio da medida do CCN (comprimento cabeça-nádega). Após, foi
realizada ultrassonografia morfológica de primeiro trimestre (entre 11 e 14 semanas),
com o objetivo de afastar possíveis malformações fetais. O sexo fetal foi confirmado
em exame morfológico de segundo trimestre (entre 20 e 24 semanas), ocasião em
que também foi realizada uma segunda avaliação da morfologia fetal. Os fetos sem
alteração morfológica nas duas ultrassonografias morfológicas foram considerados
normais. Não houve nenhum caso de óbito fetal durante o período de
acompanhamento dos fetos selecionados.
A coleta dos casos foi iniciada após a aprovação da Comissão Científica do
Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de Misericórdia de São
Paulo e do Comitê de Ética e Pesquisa da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia
de São Paulo – projeto n° 295/11 (Anexo 1).
Após esclarecimento verbal sobre todos os procedimentos necessários à
pesquisa, foi solicitada a assinatura de um termo de consentimento livre e
esclarecido e o preenchimento de um questionário com dados demográficos
(Anexos 2 e 4).
21
3.1 Critérios de inclusão
- gestação de primeiro trimestre (até 14 semanas), segundo a data da última
menstruação, confirmada por meio da medida do CCN em ultrassonografia
obstétrica precoce
- gestação única
- ausência de malformação fetal
- ausência de doenças clínicas crônicas ou obstétricas maternas
- fetos do sexo masculino
As gestações gemelares não foram incluídas neste trabalho, pois a
concentração de DNA fetal ainda não está bem estabelecida nestes casos. Os fetos
com malformação fetal, independentemente da idade gestacional, não foram
incluídos na casuística, devido possibilidade da associação com cromossomopatias.
Sabe-se que gestações complicadas por cromossomopatia fetal apresentam
maiores concentrações de DNA fetal livre, o que seria um fator de viés.
Qualquer afecção materna, clínica ou obstétrica, que curse com a
possibilidade de insuficiência placentária, como hipertensão arterial crônica, diabetes
mellitus, tireoidopatias, doença hipertensiva específica da gestação e infecções
congênitas (toxoplasmose, rubéola, citomegalovirose, sífilis, infecção pelo vírus da
imunodeficiência humana) foi excluída da casuística, pois poderia levar a um
aumento da concentração de DNA fetal plasmático, em relação às gestações não
patológicas.
3.2 Critérios de exclusão
- perda de seguimento após a realização da coleta do material
- falha técnica durante o processamento das amostras de sangue materno
- constatação de malformação fetal durante seguimento ultrassonográfico
22
- constatação de feto do sexo feminino em ultrassonografia de segundo
trimestre
3.3 Coleta de Material
Foram coletados 10 ml do sangue de uma veia da região antecubital do
antebraço das pacientes, em dois diferentes tubos, sendo um EDTA (BD
Vacutainer® Plus Plastic K2EDTA Tubes – referência 367861) e outro PPT (BD
Vacutainer® PPT™ Plasma Preparation Tube - referência 362788), a fim de se
extrair o DNA fetal livre no plasma materno (Fig. 4).
FIGURA 4: Imagem do tubo PPT e do tubo EDTA, respectivamente.
3.4 Processamento do Plasma Materno
As amostras de sangue coletadas no tubo PPT foram submetidas,
imediatamente após a coleta, a centrifugação a 3000 rpm (rotações por minuto) por
10
minutos
e
encaminhadas
ao Laboratório
RDO
Diagnósticos
Médicos,
devidamente identificadas e refrigeradas. As amostras do tubo EDTA foram
centrifugadas apenas no laboratório mencionado, uma vez que não possuem gel
separador.
Os plasmas dos tubos PPT e EDTA foram divididos em alíquotas em
23
microtubos de PCR de 2 ml (Axygen) e re-centrifugados em micro-centrífuga a
14.000 rpm por 10 minutos. Posteriormente, o sobrenadante foi retirado e estocado
em novos microtubos de PCR de 2 ml e estocados a -20°C até o processo de
extração de DNA. A duração do processo entre a coleta do material e o
processamento do plasma materno foi inferior a quatro horas, em todos os casos
incluídos na casuística.
3.5 Extração de DNA das amostras
O DNA fetal livre foi extraído do sangue materno, automaticamente, por meio
do robô de extração Qiacube (Qiagen) seguindo o protocolo QiaAmp MinElute Spin Large body-fluid samples, disponível eletronicamente no site do fabricante, com o
uso do Kit comercial de extração QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). O produto da
extração foi eluído em 60µl de Buffer de eluição.
O produto da extração foi estocado a -20°C até a aplicação dos ensaios
moleculares.
3.6 Desenho dos primes e sondas TaqMan MGB®,
A escolha da região genômica como o desenho dos primers e sondas são
fundamentais para o sucesso e eficiência de uma reação em multiplex. Foi escolhida
uma região genômica para realizar as reações de PCR em duplex. Esta região
genômica alvo é específica do cromossomo Y, chamada TSPY (DYS-14). A região
do marcador DYS-14, amplifica apenas quando o DNA é do sexo masculino. Tratase de uma região que possui 20 a 30 cópias no cromossomo Y, diferente de outras
regiões como SRY que possui apenas uma cópia. Essa característica eleva a
sensibilidade da reação, pois se houver um dano no DNA na região escolhida pode
não haver amplificação. Em uma região de múltiplas cópias, além de existir várias
cópias iniciais, se houver um dano em uma dessas cópias, existem as outras para
serem amplificadas.
Os primers e sondas foram desenhados através do programa Primer
24
Express 2.0 (Applied Biosystems) nas condições sugeridas pelo fabricante. Para
PCR em tempo real usando o sistema TaqMan MGB®, amplicons pequenos (50150pb) rendem tipicamente resultados mais consistentes e sinais robustos. Após o
desenho dos oligos, os mesmos foram submetidos à análise do BLAST e In-Silico
PCR para checar a especificidade dos mesmos. O BLAST e In-Silico PCR são
ferramentas
da
biotecnologia
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/;
disponíveis
livremente
na
internet
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr),
pelas
quais se confere a similaridade de regiões do DNA para se saber a especificidade
das mesmas. Os primers e sondas utilizados bem como informações sobre seu
produto estão dispostos na Tabela 1.
TABELA 1: Primers e sondas
REGIÃO
PRIMERS
SONDA
FRAGMENTOS
F-5’-TGCTGTTATGGGCAACCCTAA-3’
βGLOBINA
(VIC)TGAAGGCTCATGGCAAG
74 pb
(FAM)TCCTTCTCAGTGTTTCTT
77 pb
R-5’-GAGCCAGGCCATCACTAAAGG-3’
5’-AGAGCGTCCCTGGCTTCTG-3’
TSPY
5’-GAGAGCACCTCTCCACTAGAAAGG-3’
3.7 PCR em Tempo Real
As reações (ensaios moleculares) foram realizadas em máquina de PCR em
tempo real (7500 Real Time PCR System - Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA) utilizando o sistema TaqMan®para detecção do produto de amplificação.
Para a ciclagem foram utilizados os seguintes parâmetros: volume de reação
de 25µl; incubação inicial a 50ºC por 2 minutos, o primeiro passo de denaturação foi
de 10 minutos a 95ºC e posteriormente, 45 ciclos de PCR em dois passos:
25
denaturação a 95ºC por 15 segundos, seguido de temperatura de anelamento a
60°C por 60 segundos (Fig. 5).
Os retângulos superiores mostram a temperatura em graus Celsius,
e nos retângulos inferiores o tempo em minutos.
FIGURA 5 - Condições de ciclagem realizadas pela PCR em tempo real em
célula única.
Foram realizadas as reações de PCR em tempo real. Do volume total de
25µl, aproximadamente 10µl eram do DNA extraído do plasma materno, 12,5µl de
Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems - PN 4304437), sistema
composto de reagentes necessários para a realização da atividade 5’nucleásica,
como enzima AmpliTaq Gold; Enzima AmpErase UNG; dNTPs com dUTP; referência
passiva e buffer, e para a região TSPY 400nM de primers e 150nM para a sonda.
Para completar o volume final de cada reação, foi utilizada água pura estéril (SigmaAldrich -Water).
A fluorescência contínua foi monitorada no passo de anelamento de cada
primer específico em sua sequência alvo. Neste caso, cada alelo do genoma possui
seu primer específico que emite uma coloração diferente para cada alelo. O
threshold foi fixado em 0.10 em todas as reações para padronização dos resultados
(Ct). A duração média de uma reação de 45 ciclos é de 1hora e 50 minutos.
26
Os dados da análise foram gerados segundo o software SDS v1.4 21
(Applied Biosystems).
3.8 Controle de Contaminação
O preparo dos reagentes da PCR foi realizado dentro de um fluxo laminar, o
qual é restrito de outras atividades, com material único para essa manipulação. Todo
o material como pipetas e superfície onde foram realizadas as reações, foi mantido
apenas para o projeto, e foram manipulados com luvas sem talco. A
descontaminação das superfícies de trabalho foi realizada antes de cada reação
com álcool 70% ou com água sanitária a 10%. O profissional que realizou as
reações sempre esteve munido de máscara e toca. Após o término e análise de
cada reação, todo material foi descartado, evitando qualquer contaminação com
material já amplificado (no caso PCR). Em nenhum momento os tubos de PCR
foram abertos após a reação.
3.9 Análise estatística
A análise estatística foi realizada no programa SPSS (Statistical package for
Social Sciences), versão 13.0, através do teste t pareado.
Foi adotado o teste t pareado em virtude do poder deste em definir o nível de
semelhança ou diferença entre dois momentos de uma mesma amostra ou
população, pois estuda as diferenças entre duas situações de uma mesma
população.
Além disso, permite a realização de duas medidas feitas na mesma unidade
experimental desde que exista uma correlação entre elas, ou seja, as amostras são
dependentes.
27
3.10 Cálculo amostral
O cálculo amostral foi realizado pelo setor de estatística da Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. Para um poder
estatístico de 80%, com intervalo de confiança de 90%, a amostra deve ser
constituída por 42 casos.
28
4. RESULTADOS
O número de casos colhidos totalizou 62 gestantes, sendo que deste total,
apenas 24 foram de fetos do sexo masculino, o que corresponde
corresponde a 38,70%. O
restante correspondeu a 28 fetos do sexo feminino (45,16%) e 10 casos descartados
descart
por falha técnica
ica (16,12%), como mostrado na Figura 6.
6
MASCULINOS
FEMININOS
DESCARTADOS
etalhamento do total de casos colhidos.
FIGURA 6: Detalhamento
A amostra utilizada para o trabalho foi constituída apenas dos fetos
masculinos, e totalizou, portanto, 24 casos (Anexo 3).
Doss casos excluídos por falha técnica,
t
sete ocorreram por hemólise do
material no tubo EDTA, um por falha de alíquotas, um por falha na amplificação do
DNA fetal e um por contaminação do material.
A análise dos dados demográficos mostrou que a idade das gestantes variou
de 17 a 35 anos, com média de 26,04 anos. Dos 24 casos incluídos, 16 pacientes
eram primigestas e 8 pacientes eram secundigestas. Não houve nenhum caso com
grau de parentesco entre os pais.
29
TABELA 2: Análise da amostra em relação à idade gestacional.
IDADE GESTACIONAL
Intervalo de confiança
95%
Idade gestacional média
11,08
Mediana
12,00
Desvio padrão
2,302
Idade gestacional mínima
6
Idade gestacional máxima
14
Variação
8
Fonte: Serviço de Medicina Fetal do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia
da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo
Os valores obtidos de DNA fetal coletado em tubo EDTA e PPT foram
expressos pelo CT, obtido por PCR em tempo real (Fig. 7).
FIGURA 7: Distribuição gráfica dos valores obtidos de CT.
30
As amostras colhidas em tubo EDTA tiveram valores médios de CT
correspondente a 30,2354, com intervalo de confiança de 95%.
Em relação às amostras colhidas em tubo PPT, o valor médio do CT foi de
30,0846, também com intervalo de confiança de 95%.
TABELA 3: Análise da amostra colhida em tubo PPT, expressa por CT.
CT PPT
95%
Intervalo de confiança
Ct ppt médio
30,0846
Mediana
30,2350
Desvio padrão
1,05933
Ct ppt mínimo
27,08
Ct ppt máximo
32,61
Variação
5,53
Fonte: Serviço de Medicina Fetal do Departamento de Obstetrícia e
Ginecologia da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo
TABELA 4: Análise da amostra colhida em tubo EDTA, expressa por CT.
CT EDTA
Intervalo de confiança
95%
Ct edta médio
30,2354
Mediana
30,0650
Desvio padrão
0,96368
Ct edta mínimo
28,01
Ct edta máximo
32,09
Variação
4,08
Fonte: Serviço de Medicina Fetal do Departamento de Obstetrícia e
Ginecologia da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo
31
TABELA 5: Análise comparativa entre os valores de CT das amostras colhidas em
tubo EDTA e PPT.
CT EDTA x CT PPT
MÉDIA
N
DESVIO PADRÃO
CT EDTA
30,2354
24
0,19671
CT PPT
30,0846
24
0,21624
Fonte: Serviço de Medicina Fetal do Departamento de Obstetrícia e
Ginecologia da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo
p = 0,357
A partir do exposto acima, podemos observar que o valor absoluto do CT
obtido no material colhido em tubo EDTA foi maior do que o obtido em tubo PPT. O
CT, como já explicado, representa um sinal da reação de PCR em tempo real, e
quanto menor for este valor obtido, significa que maior quantidade de DNA fetal livre
estava presente naquela amostra. Porém, não houve significância estatística nesta
diferença de valores obtidos entre a coleta realizada em tubo PPT e EDTA, pois o p
foi maior do que 0,05.
32
5. DISCUSSÃO
A descoberta do DNA fetal livre na circulação materna abriu um novo
horizonte de pesquisas na busca do diagnóstico pré-natal não invasivo (Lo et al,
1997). O DNA fetal livre fetal é uma ferramenta valiosa para o diagnóstico pré-natal
não invasivo, porém o seu uso ainda não está concretizado na prática obstétrica. O
uso da tecnologia de PCR em tempo real permite acessar com sucesso o DNA fetal
para determinação do sexo fetal e status Rh,como rotina durante o pré-natal (Lo et
al, 1989; Lo et al, 1997;Lo et al, 1998b; Costa et al, 2002a; Sesarini et al, 2009;
Tounta et al, 2011). O principal fator limitante para a aplicação desta tecnologia em
outros diagnósticos é a concentração total de DNA livre presente no plasma das
gestantes, a maior parte proveniente do próprio organismo materno (Lo et al,1998a;
Fernando et al, 2010). Portanto, ainda existem desafios técnicos a serem
ultrapassados antes da viabilização desta opção como diagnóstico pré-natal de
rotina. Além disso, a quantidade de DNA circulatório varia consideravelmente em
indivíduos normais e saudáveis (Zhong et al, 2001; Hahn et al, 2001).
A placenta exerce papel fundamental como intermediadora da passagem de
células fetais para a circulação materna, que somado ao processo de apoptose das
células trofoblásticas, dará origem ao DNA fetal livre (Litton et al, 2009; Tounta et al,
2011). Este órgão, exclusivo da gravidez, é a grande fonte responsável pelo controle
da liberação do material genético fetal (Lo et al, 2000b; Wataganara et al, 2005).
Portanto, a integridade e o bom funcionamento da placenta é um fator
fundamental de interferência na concentração de DNA fetal livre. Qualquer doença
clínica e/ou obstétrica materna que evolua com alteração vascular placentária, como
hipertensão arterial crônica, doença hipertensiva específica da gestação e diabetes
mellitus, poderia alterar quantitativamente a detecção de DNA fetal livre no plasma
materno. Diante disso, neste trabalho optamos por só incluir as gestantes sem
qualquer alteração clínica e/ou obstétrica no momento da coleta do material, como
33
prevenção de viés nos resultados.
As gestações gemelares também não foram incluídas no trabalho, pois
imaginamos que haveria aumento da concentração de DNA fetal livre por maior
quantidade de massa placentária e consequentemente de células trofoblásticas,
além de maior quantidade de células intactas na circulação materna. Ademais, a
aplicação da concentração de DNA fetal livre em gestações gemelares ainda não
está bem estabelecida (Smid et al, 2003a).
Os fetos portadores de malformação detectada por ultrassonografia
morfológica não foram incluídos na amostra pelo alto risco de associação com
cromossomopatias. Já está bem estabelecido em diversos trabalhos o aumento da
concentração de DNA fetal livre em gestações de fetos portadores de trissomia do
cromossomo 13, 18 e 21 (Pertl et al, 2000; Spencer et al, 2003; Jorgez et al, 2007).
O DNA total livre aumenta no decorrer da gestação, e este fenômeno é
atribuído a apoptose das células fetais (Pertl, Bianchi, 2001; Chan et al, 2004;
Bischoff et al, 2005), além dos processos de morte e lise celular (Bianchi, 1998;
Angert et al, 2003). Estes processos também atuam após a coleta do sangue
materno, dentro do próprio tubo de coleta (Chiu et al, 2001; Angert et al, 2003).
Apesar da concentração de DNA fetal livre ser menor no primeiro trimestre
de gestação, todos os casos incluídos neste trabalho foram de gestações até 14
semanas. Optamos por realizar a pesquisa nesta idade gestacional por entendermos
a importância do diagnóstico precoce durante o período pré-natal, para o
planejamento do pré-natal, parto e cuidados pós-natais com o recém-nascido
(Agnieszka et al, 2007). Além disso, a idade gestacional precoce favorece a tomada
de decisão entre manter ou interromper o curso da gestação, preserva a saúde
clínica, obstétrica e psicológica materna, além de ser meta procurada desde o início
das pesquisas.
Diante destas limitações, nós intuímos que o uso do tubo PPT seria uma
possível forma de diminuir o contato entre a porção celular materna e o plasma
materno - porção que carrega o DNA fetal livre. Assim, após o início dos processos
de degradação celular o DNA materno livre extra, produzido por estes fenômenos,
ficaria isolado da fração fetal, aumentando a concentração relativa do DNA fetal livre
34
em relação ao materno.
Entretanto, muitas variantes atuam na concentração total de DNA livre e,
consequentemente, na concentração relativa do DNA fetal livre (Angert et al, 2003).
Investigações anteriores mostraram que o tempo entre a flebotomia e o
processamento do material afeta a concentração de DNA livre no plasma materno
(Chiu et al, 2001; Angert et al, 2003). Outro grupo constatou que a concentração
total de DNA livre no sangue materno, colhido em tubo EDTA, permaneceu estável
em temperatura ambiente por até 4 horas após a coleta do material (Angert et al,
2003; Barrett et al, 2011). Aumentos na concentração de DNA livre foram
observados entre 6 a 24 horas da flebotomia (Angert et al, 2003). No período entre
24 e 72 horas da coleta existe um aumento significativo na concentração de DNA
total e, portanto, uma diminuição na proporção de DNA fetal (Angert et al, 2003;
Barrett et al, 2011). Todas estas afirmações se relacionam a degradação das células
maternas após a coleta de sangue. Os processos de apoptose, morte e lise celular
liberam quantidade expressiva de DNA materno, que se mistura ao DNA fetal,
dificultando ainda mais a detecção da fração fetal de material genético.
O protocolo de processamento de material também é uma importante
variável na taxa de detecção do DNA fetal livre em plasma materno (Johnson et al,
2004). O método de PCR, o tipo de reagente empregado, o fabricante dos
instrumentos utilizados na extração de DNA, além do marcador padronizado para
identificação do DNA fetal (Johnson et al, 2004).
A comparação entre a taxa de detecção de DNA fetal livre em material
colhido em tubo EDTA e PPT é inédita. Não encontramos na literatura nenhum
trabalho anterior nesta linha de pesquisa que pudesse ter sido adotado como
referência durante o desenvolvimento desta pesquisa.
Em nosso trabalho, o processamento do material foi iniciado precocemente,
em menos do que 4 horas após a coleta, o que pode ter exercido influência na etapa
da detecção do DNA pelo PCR em tempo real. Se o material coletado tanto no tubo
EDTA quanto no PPT fosse submetido à espera de algumas horas antes de se
iniciar o processamento, talvez no tubo EDTA os processos de apoptose pudessem
ter exercido influência negativa no momento da detecção do DNA fetal livre.
35
Portanto, a taxa de detecção do DNA fetal livre no tubo EDTA poderia ter sido
significativamente menor em relação à do tubo PPT, caso o tempo entre a coleta e o
processamento fosse maior.
Atualmente, os centros genéticos tendem a ser regionalizados, distante,
portanto, de muitas outras localidades. Na prática clínica, sabe-se que uma amostra
de sangue colhido em localidade distante pode ter um transporte de dias até chegar
ao local onde será feito o processamento do material (Barrett et al, 2011). Portanto,
em situações em que se sabe que o material levará mais do que oito horas para
iniciar o processamento, seria interessante a coleta em tubo que diminuísse o
contato do material fetal com o materno, a fim de melhorar a taxa de detecção do
DNA fetal (Barrett et al, 2011).
O Brasil é um país grande e com centros de desenvolvimento e pesquisa
bastante regionalizados. A partir disso, em localidades mais distantes, o tempo entre
a coleta e o processamento do sangue materno certamente ultrapassaria 24 horas.
Isso nos faz pensar que deveríamos testar a nossa hipótese, portanto, em intervalo
maior do que um dia entre a coleta e o processamento do material, o que seria mais
aplicável à realidade do nosso país.
O tubo PPT, apesar de custar três vezes mais do que o EDTA, ainda seria
uma alternativa bastante barata como método de enriquecimento de DNA fetal. A
estimativa de valor do tubo PPT é de aproximadamente US$0,50. Além disso, o tubo
PPT é um material universal, facilmente encontrado independentemente da região e
se caracteriza por ser um sistema fechado, o que contorna a questão da
contaminação do sangue por manipulação em tubos abertos e seringas de coleta.
Apesar dos nossos resultados não se mostrarem expressivos nesta etapa,
nós ainda acreditamos que podemos alcançar resultados concordantes com a nossa
hipótese, se o tempo entre a coleta e o processamento do material for superior a 24
horas, usando a mesma metodologia descrita aqui. Portanto, por este ter sido um
projeto inédito, foi necessária esta primeira etapa para que as arestas da
metodologia pudessem ser aparadas e o projeto aprimorado.
36
6. CONCLUSÃO
A coleta do sangue periférico materno em tubo PPT não melhorou a taxa de
detecção da concentração do DNA fetal livre quando comparado ao tubo EDTA.
37
7. ANEXOS
Anexo 1: Parecer emitido pelo Comitê de ética em Pesquisa da Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo.
38
Anexo 2: Termo de consentimento livre e esclarecido
Você está sendo convidada para participar, como voluntária, de uma pesquisa.
Depois da explicação de todas as etapas da pesquisa, caso aceite participar, você
deverá assinar ao final deste documento, em duas vias. Uma delas é sua e a outra é
do pesquisador (médico) responsável. Caso você não aceite participar deste estudo,
não haverá nenhum prejuízo no seu tratamento.
O nome da pesquisa é “Avaliação da concentração de DNA fetal livre no plasma
materno durante o primeiro trimestre: estudo comparativo entre as técnicas
EDTA e PPT”. O objetivo do estudo será comparar a melhor técnica de coleta e
armazenamento de DNA fetal no sangue das gestantes. O DNA é uma substância
que representa o material genético de cada pessoa e está presente em todo nosso
corpo, inclusive no sangue das veias do braço. As mulheres grávidas têm, o seu
próprio DNA e o DNA do seu bebê, misturados no seu sangue, durante o período da
gestação. Atualmente usamos o DNA do bebê para descobrir alguma alteração
genética, como exemplo a síndrome de Down. Mas para conseguir este DNA do
bebê os médicos devem realizar procedimentos invasivos durante a gestação, como
a coleta de células da placenta, de líquido amniótico e de sangue do cordão
umbilical, o que pode trazer algumas complicações para a mãe e para o bebê. Com
essa pesquisa queremos descobrir uma forma de conseguir coletar o DNA do bebê
através do sangue do braço da mãe para evitar estes procedimentos.
Esse estudo não trará malefício para a sua saúde, saúde do seu parceiro e saúde do
seu bebê. Além disso, participar deste estudo não significa que o seu bebê tenha
alguma doença. Durante o estudo será mantido sigilo absoluto sobre todos os seus
dados e resultados. Você poderá retirar este consentimento e abandonar o estudo
no momento em que desejar sem prejuízo para o seu atendimento, sem danos
financeiros ou morais.
Os procedimentos necessários para contribuir com esta pesquisa será fornecer
amostra do seu sangue, que será colhido de uma veia do seu braço. Durante este
procedimento você poderá sentir dor, e após a coleta do sangue pode se observado
inchaço, hematoma (mancha roxa) e, mais raramente, infecção no local onde a
agulha será colocada no seu braço.
Caso aceite participar desta pesquisa, esteja ciente que nenhum tipo de pagamento
ou gratificação será fornecido pelo Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da
Santa Casa de São Paulo, o que reforça o caráter voluntário da sua participação
neste estudo.
39
Eu,_________________________________________________________________
fui suficientemente informada a respeito deste estudo. Discuti com a Dra Carolina
Schneider Chadud, médica responsável pelo estudo sobre a minha decisão em
participar. Ficaram claros para mim quais são os objetivos, os procedimentos que
serão realizados, desconforto, riscos, garantia de sigilo e esclarecimentos
permanentes. Ficou claro também que a minha participação é isenta de despesas e
remuneração. Entendi também que este estudo não apresenta nenhum risco para a
minha saúde, saúde do meu parceiro e para a saúde do meu bebê.
A minha assinatura neste termo de consentimento livre e esclarecido dará a
autorização ao Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de São
Paulo para utilizar estes dados obtidos nesta pesquisa, sempre preservando a minha
privacidade e a confidencialidade dos mesmos.
São Paulo, _____ de ________________ 20____.
Nome da Paciente: _________________________________________________
RG: ___________________________
Médico responsável: Carolina Schneider Chadud
CRM: 120612
RG: 33603719-3
Telefone de contato: (11) 50842702 / (11) 50823039
40
Anexo 3: Tabela de pacientes
Nº IDENTIFICAÇÃO IDADE GESTACIONAL CT EDTA CT PPT
(SEMANAS)
IDADE PARIDADE
(ANOS)
1
MJL
11
29,73.
29,41.
17
0
2
SMC
13
30,50.
30,71.
27
I
3
RSA
8
29,64.
29,64.
19
I
4
ESL
14
29,44.
30,21.
26
0
5
CV
12
29,02.
28,57.
30
0
6
CLMNO
13
29,97.
30,26.
28
0
7
JCS
8
30,33.
30,41.
25
I
8
LJAC
11
29,74.
30,28.
31
0
9
FRR
12
31,75.
30,54.
35
I
10
PRMHP
11
30,91.
29,94.
28
0
11
KDL
12
30,39.
29,90.
24
0
12
DAD
13
29,48.
30,13.
33
I
13
JS
12
30,16.
29,64.
17
0
14
MSL
7
31,48.
30,64.
26
0
15
TSC
12
29,45.
28,60.
18
0
16
FMS
7
30,62.
32,61.
27
I
17
LBG
12
32,09.
30,77.
18
0
18
MMO
12
29,65.
30,72.
20
0
19
SSA
13
29,90.
30,03.
31
I
20
SAT
12
29,58.
29,21.
33
0
21
MVC
12
28,01.
27,08.
32
I
22
VDM
6
31,41.
30,54.
23
0
23
JNO
9
31,38.
31,17.
29
0
24
VCMA
14
31,02.
31,02.
28
0
41
Anexo 4: Questionário – pesquisa de material genético fetal em sangue materno
RG atendimento S. Casa:_______________ Nº Registro na pesquisa:_________
Nome da gestante: ___________________________________________Idade:____
Nome do parceiro: ___________________________________________Idade: ____
Telefone para contato: (
)_____________________ (
) __________________
Endereço:___________________________________________________________
___________________________________________________________________
Email: ______________________________________________________________
Grau de parentesco do casal: ( ) não existe
Tipo sanguíneo da gestante: ( ) O
( ) existe. Qual? ______________
( ) A
( )B
( ) Rh-
( ) Rh+
Teve gestações anteriores?
( ) sim
( ) não
Quantos (as)?
menino( )
menina ( )
Já teve aborto?
( ) sim
( ) não
Quantas vezes? ( ) 1
( )2
( )3
( ) AB
( ) Mais de 3
( ) Nunca
DUM:___________________ DPP: _______________________________________
Idade gestacional atual (em semanas): ____________________________________
Feto:
( ) único
Sexo do feto: ( ) não sabe
( ) gemelar
( ) trigemelar
( ) menina
( ) menino
Tem algum parente com deficiências física ou mental? ( ) sim
( ) não
Quem?______________________________________________________________
Qual deficiência? _____________________________________________________
Observação:_________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
42
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Objetiva, 2001.
51
RESUMO
CHADUD CS.“Avaliação da concentração de DNA fetal livre no plasma materno
durante o primeiro trimestre da gestação: estudo comparativo entre a coleta e
armazenamento em tubo EDTA e PPT”. 2013. Tese de Mestrado. Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo.
DNA fetal livre é encontrado na circulação materna, correspondendo à fração de 3 a
6 % do total de DNA.
O objetivo deste trabalho foi comparar a concentração de DNA fetal livre detectado
no plasma materno, após coleta de sangue periférico de gestantes durante o
primeiro trimestre de gestação, obtido em dois diferentes tubos EDTA e PPT.
Foi realizado um estudo prospectivo, em gestações entre 5 e 14 semanas, com fetos
únicos, do sexo masculino e sem malformação fetal detectada em ultrassonografia
morfológica. Amostras de 10 ml de sangue periférico materno foram coletadas em
tubo EDTA e PPT. O plasma foi extraído das duas amostras e submetido à reação
de PCR em tempo real, utilizando o sistema TaqMan®. A identificação da fração
fetal ocorreu por meio da região TSPY (DYS -14), exclusiva do cromossomo Y.
A concentração de DNA fetal foi expressa por valores de CT (ciclo de threshold),
obtidos durante a reação de PCR em tempo real e os resultados do CT entre os dois
tubos foram comparados pelo teste t pareado. O CT médio obtido no tubo PPT
correspondeu a 30,08 e no tubo EDTA a 30,23. Não houve diferença
estatisticamente significante nos valores encontrados de CT entre os tubos PPT e
EDTA.
O tubo EDTA é usado rotineiramente para coleta de sangue periférico, contém
anticoagulante e é um sistema fechado. O tubo PPT também é um sistema fechado
e contém um gel separador em seu interior, que isola a porção celular da porção
acelular do sangue materno. Como o DNA fetal livre se encontra na porção acelular
– plasma – do sangue materno, nós construímos a hipótese de que através da
inibição do contato do plasma com a porção celular do sangue materno, menos DNA
materno se misturaria ao fetal, melhorando a taxa de recuperação do mesmo nas
amostras colhidas em tubo PPT.
Atribuímos estes resultados ao fato do intervalo entre a flebotomia e o
processamento do material ter sido inferior a 4 horas, o que não permitiu a ação dos
processos de apoptose e lise celular na amostra colhida em tubo EDTA.
Palavras chave: Diagnóstico pré-natal, DNA/sangue , Plasma, Troca materno-fetal
52
ABSTRACT
CHADUD CS. “Determination of free fetal DNA in maternal plasma during the
first trimester of pregnancy: a comparative study between the collection and
storage in EDTA and PPT tubes”. 2013. Tese de Mestrado. Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo.
Free fetal DNA in the maternal circulation is found, corresponding to the fraction of 3
to 6% of the total DNA.
The aim of this study was to compare the concentration of free fetal DNA in maternal
plasma detected after collecting peripheral blood of pregnant women during the first
trimester of gestation, obtained in two different tubes, EDTA and PPT.
We conducted a prospective study in pregnancies between 5 and 14 weeks with
single male fetuses, without fetal malformation detected on ultrasound morphology.
Samples of 10 ml of maternal peripheral blood were collected in EDTA and PPT
tube. The plasma was extracted from the two samples and subjected to PCR
reaction in real time using the TaqMan ® system. The identification of fetal fraction
occurred through the region TSPY (DYS -14), exclusive of chromosome Y.
The concentration of fetal DNA was expressed as CT values (cycle threshold),
obtained during the PCR reaction in real time and the results of the CT between the
two tubes were compared by paired t test. The obtained average CT PPT
corresponded to 30.08 and in EDTA tube to tube 30.23. There was no statistically
significant difference in the CT.
The EDTA tube is used routinely to collect peripheral blood, contains anticoagulants
and is a closed system. The tube PPT is also a closed system containing a
separating gel inside, which isolates the cellular portion of the acellular portion of the
maternal blood. As the free fetal DNA is in the acellular portion of the maternal blood
- plasma - we have built the hypothesis that by inhibiting the contact of the plasma
with the cellular portion of maternal blood, less maternal DNA would mix to fetal DNA,
improving the recovery rate in samples collected in tube PPT.
We attribute these results to the fact that the interval between phlebotomy and
processing of the material have been less than four hours, which did not allow the
action of the processes of apoptosis and cell lysis in the sample collected in EDTA
tube.
Key-words: Prenatal diagnosis, DNA / Blood, Plasma, Exchange maternal-fetal