UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
BRUNA PROISS FENNER DA COSTA
SÍNTESE DE DIAZABICICLOS A PARTIR DE AZIRIDINAS
CHALCÔNICAS DE INTERESSE BIOLÓGICO
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
BRUNA PROISS FENNER DA COSTA
SÍNTESE DE DIAZABICICLOS A PARTIR DE AZIRIDINAS
CHALCÔNICAS DE INTERESSE BIOLÓGICO
Dissertação submetida à Universidade do Vale do
Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa.
Itajaí, Fevereiro de 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
C824
Costa, Bruna Proiss Fenner da, 1988Síntese de diazabiciclos a partir de aziridinas chalcônicas de interesse
biológico / Bruna Proiss Fenner da Costa. 2015.
118f. ; il., tab. ; fig.
Apêndice
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em
Ciências Farmacêuticas.
“Orientador : Prof . Dr . Rogério Corrêa”
Bibliografia : p. 107-118
1. Arizidinas. 2. Biofarmacêutica. 3. Diazabiciclos. 4. Química
farmacêutica. 5. Produtos naturais. 6. Fitoterapia. I.Título.
CDU: 615.32
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
SÍNTESE DE DIAZABICICLOS A PARTIR DE AZIRIDINAS
CHALCÔNICAS DE INTERESSE BIOLÓGICO
BRUNA PROISS FENNER DA COSTA
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias
Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________
Rogério Corrêa, Prof. Dr.
Orientador
__________________________________________________________
Clóvis Antônio Rodrigues, Prof. Dr.
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Prof. Dr. Rogério Corrêa (UNIVALI)
Presidente
______________________________________
Prof. Dr. Clóvis Antônio Rodrigues (UNIVALI)
Membro Interno
______________________________________
Prof. Dr. Rivaldo Niero (UNIVALI)
Membro Interno
____________________________________
Prof. Dr. Ricardo José Nunes (UFSC)
Membro Externo
Itajaí (SC), 20, fevereiro e 2015
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me ajudar a ser firme e não desistir diante das dificuldades.
Ao meu marido Jean, por ser e oferecer tudo que precisei em cada momento.
A minha mãe Luiza, pelo incentivo, apesar da distância.
A família, de longe e de perto, pela torcida, pela ajuda, pelas orações.
A equipe da Drogaria, que acompanhou os momentos de ânimo e desanimo.
Ao pessoal do Lab. de Síntese, pelo auxílio em vários momentos.
A Ivana, pela contribuição na conclusão deste trabalho.
Ao Prof. Rogério, que me orienta desde a graduação, obrigada pela
confiança.
Aos professores da banca, Clóvis, Niero e Ricardo, pela disponibilidade e
contribuições.
As professoras Márcia e Fátima pela imensa ajuda com a avaliação
biológica dos compostos.
A CAPES, pelo apoio financeiro.
A todos que de alguma forma contribuíram na realização deste trabalho.
SÍNTESE DE DIAZABICICLOS A PARTIR DE AZIRIDINAS
CHALCÔNICAS DE INTERESSE BIOLÓGICO
Bruna Proiss Fenner da Costa
Fevereiro/2015
Orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa.
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas
Número de Páginas: 118.
A busca por fármacos inovadores, capazes de limitar ou curar patologias com o
mínimo de efeitos adversos tem impulsionado a realização de inúmeras pesquisas
envolvendo a descoberta e otimização de uma molécula protótipo. O presente
trabalho aborda a síntese e avaliação biológica de compostos diazabiciclos
derivados de aziridinas chalcônicas, precursores que possuem amplamente
estudadas suas diversas atividades biológicas. Tais compostos cíclicos são obtidos
através de quatro processos subsequentes de síntese orgânica, ocorrendo em
brandas condições reacionias, a saber: obtenção da chalcona, bromação, formação
da aziridina e obtenção do diazabiciclo. Neste trabalho reporta-se o processo de
obtenção de diversos derivados que contemplam o núcleo 1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex3-eno além do processo de síntese de aldeídos de Meervein, os quais foram
utilizados na formação de novos derivados. Foram obtidos 30 compostos
diazabicíclicos, sendo 15 inéditos. Os compostos foram caracterizados por ponto de
fusão, métodos espectroscópicos usuais e, os diazabiciclos também por
espectrometria de UV-visível. Todos os rendimentos reacionais foram satisfatórios,
variando de 44 a 90%. Avaliou-se a atividade antinociceptiva e sobre o sistema
nervoso central dos compostos possuidores de substituintes propostos por Topliss
(B1, B2, B3, B4 e B6). O composto B6 foi o mais ativo em ambas as avaliações,
sendo o possuidor do substituinte 4-CH3. Avaliando-se a atividade antinociceptiva,
B6 foi 19 vezes mais potente que o AAS quando avaliado pelo modelo de
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, além disso, apresentou 69% de
inibição da reação dolorosa neurogênica induzida pela formalina e 68,6% de inibição
quando o agente flogístico utilizado foi o glutamato. Além disso, no modelo de
hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina observou-se que B6 foi capaz
de inibir em 66,5% a frequência de resposta ao estímulo mecânico. Os compostos
B1, B2, B3, B4 e B6 (10mg/kg) foram administrados intraperitonealmente em
camundongos, os quais foram avaliados em modelos de ansiedade, depressão,
convulsão, sono, memória e deambulação. Somente os compostos B1, B2 e B6
demonstraram ter efeitos sobre o sistema nervoso central dos animais (efeito
antidepressivo), tendo o composto B6 efeito antidepressivo comparável à fluoxetina.
O mecanismo de ação da propriedade antidepressiva foi investigado e os resultados
demostram que o efeito antidepressivo do composto B6 parece ser mediado pelos
sistemas noradrenérgico e dopaminérgico (mas não o serotonérgico) uma vez que
foi revertido pelo pré-tratamento dos animais com antagonistas de receptores
farmacológicos da noradrenalina e dopamina.
Palavras-chave: Aziridinas.Bioatividade.Chalconas.Diazabiciclos.
SYNTHESIS OF DIAZABICYCLES FROM CHALCONE AZIRIDINES
OF BIOLOGICAL INTEREST
Bruna Proiss Fenner da Costa
February/2015
Supervisor: Rogério Corrêa, Dr.
Concentration Area: Natural Products and Synthetic Substances Bioactive
Number of Pages: 118.
The search for innovative drugs capable of limiting or curing diseases, with minimal
adverse effects has prompted numerous studies seeking to discover and optimize a
prototype molecule. This work discusses the synthesis and biological evaluation of
diazabicyclic compounds derived from chalcone aziridines, precursors that have
been widely studied for their various biological activities. These cyclic compounds are
obtained through four subsequent processes of organic synthesis occurring in mild
reaction conditions, namely: obtaining the chalcone, bromination, formation of
aziridine, and obtaining diazabicycles. This work reports the process of obtaining
various derivatives that include the core-1,3-diazabicyclo [3.1.0] hex-3-ene, as well
as Meerwein’s process of aldehyde synthesis, which were used in the formation of
new derivatives. Thirty diazabicyclic compounds were obtained, including 15
previously unpublished. The compounds were characterized by melting point and the
usual spectroscopic methods. The diazabicycles were also submitted to UV-visible
spectroscopy assays to verify the photochromic effect. All reaction yields were
satisfactory, ranging from 44 to 90%. We evaluated the antinociceptive activity and
activity on the central nervous system of compounds possessing substituents
proposed by Topliss (B1, B2, B3, B4, and B6). Compound B6 was the most active in
both evaluations. It’s structure contains a 4-CH3 substituent. Evaluating the
antinociceptive activity, B6 was 19 times more potent than aspirin when evaluated by
the model of acetic acid-induced writhing. It also showed 69% inhibition of
neurogenic pain response induced by formalin, and 68.6% inhibition when the
phlogistic agent was used glutamate. Moreover, in the model of mechanical
hyperalgesia induced by carrageenan, it was observed that B6 was inhibited the
frequency response to mechanical stimuli by 66.5%. Compounds B1, B2, B3, B4 and
B6 (10mg/kg) were administered intraperitoneally in mice, which were evaluated in
models of anxiety, depression, convulsions, sleep, memory and ambulation. Only
compounds B1, B2 and B6 had effects on the animals’ central nervous system
(antidepressant effect), with compound B6 having antidepressant effect comparable
to that of fluoxetine. The mechanism of action of the antidepressant property was
investigated, and the results demonstrate that the antidepressant effect of compound
B6 appears to be mediated by the noradrenergic and dopaminergic (but not the
serotonergic) systems, as it was reversed by pretreatment of animals with the drugreceptor antagonists noradrenaline and dopamine.
Keywords: Aziridines. Bioactivity. Chalcones. Diazabicycles.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Estrutura geral de uma chalcona, onde X e Y são hidrogênios ou
grupamentos
substituintes
quaisquer
situados
nos
anéis
aromáticos..........................................................................................
16
Figura 2
Estereoisômeros de chalconas........................................................... 17
Figura 3
Estrutura
química
da
sofalcona
(a),
metochalcona
(b)
e
licochalcona A (c)...............................................................................
Figura 4
19
Estrutura química do PABA (a), sulfanilamida (b), sulfametoxazol
(c), hidroclorotiazida (d) e furosemida (e)........................................... 22
Figura 5
Estrutura geral do anel aziridina.........................................................
24
Figura 6
Estrutura química da mitomicina C.....................................................
25
Figura 7
Estrutura química do metronidazol (a), miconazol (b) e teofilina (c)..
27
Figura 8
Porção 1,3-diazabicliclo[3,1,0]hex-3-eno (a) e estrutura química do
imexon (b)........................................................................................... 28
Figura 9
Estrutura química da nitrofurantoína (a) e da ranitidina (b)................
Figura 10
Esquema do mecanismo de condensação aldólica da (2E)-3-(4nitrofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (B31)..............................................
Figura 11
49
Esquema do mecanismo de obtenção da [3-(4-nitrofenil)aziridina-2il](fenil)-metanona (B26).....................................................................
Figura 12
28
Esquema
reacional
de
obtenção
dos
derivados
51
1,3-
diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B1-B34)................................................ 54
Figura 13
Estrutura química do composto B2..................................................... 58
Figura 14
Espectro de IV de B2 (DRIFTS, cm-1)................................................. 59
Figura 15
Esquema de formação da espécie zwiteriônica. R e R1: quaisquer
substituintes hidrocarbônicos.............................................................. 60
Figura 16
Espectro de RMN1H de B2 (C3D6O, 300 MHz)................................... 60
Figura 17
Espectro de RMN13C de B2 (C3D6O, 75 MHz)...................................
61
Figura 18
Espectro de absorção UV-Vis de B2..................................................
62
Figura 19
Composto B2 – (A): antes da irradiação UV; (B): após 15 minutos
Figura 20
de irradiação.......................................................................................
62
Espectro de absorção UV-Vis de B15................................................
63
Figura 21
Composto B25 – (A): antes da exposição à luz; (B): após 1 minuto
de exposição....................................................................................... 64
Figura 22
Esquema geral da obtenção dos aldeídos. X: -Cl, 3,4-Cl...................
Figura 23
Esquema geral do mecanismo obtenção dos aldeídos. X: -Cl, 3,4-
81
Cl......................................................................................................... 82
Figura 24
Efeito do tratamento dos animais com os compostos em estudo
(10mg/kg, i.p.) e do diazepam
(0,75 mg/kg, i.p.), sobre os
parámetros comportamentais: frequência de entradas (A) e tempo
de permanência (B) nos braços abertos do LCE. Cada coluna
representa a média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA seguido de
Bonferroni ***p<0.001 **p<0.01 e *p<0.05 quando comparado com
o controle…………………………………………………………………..
Figura 25
87
Efeito do tratamento dos animais com os compostos em estudo
(10mg/kg, i.p.) e do lorazepam (2 mg/kg, i.p.), sobre a Latencia (A)
e Tempo total de sono (B) induzido por barbitúricos. Cada coluna
representa a média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA seguido de
Bonferroni **p<0.01
e
*p<0.05
quando comparado com o
controle…………………………………………………………………….. 88
Figura 26
Efeito do tratamento dos animais com os compostos em estudo
(10mg/kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/kg, i.p.), sobre a Latência
(A) para a crise convulsiva e o número de crises (B) induzidas por
pentilenotetrazol. Cada coluna representa a média e o E.P.M de 89 animais. ANOVA seguido de Bonferroni ***p<0.001 e *p<0.05
quando comparado com o controle…………………………………….
Figura 27
90
Efeito do tratamento dos animais com os compostos em estudo
(10mg/kg, i.p.) sobre a Latência de decida na sessão de teste da
esquiva inibitória. Cada coluna representa a mediana e os
intervalos interquativos (25 e 75) de 8-9 animais. ANOVA seguido
de de kruskall Wallis e test de Duns *p<0.05 quando comparado
com o controle…………………………………………………………….
Figura 28
Efeito do tratamento dos animais com os compostos em estudo
(10mg/kg, i.p.) e da fluoxetina (A) e curva dose-resposta (B) da
propriedade antidepressiva do composto B6, sobre o tempo de
92
imobilidade dos animais avaliados no teste de nado. Cada coluna
representa a média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA seguido de
Bonferroni **p<0.01
e *p<0.05
quando comparado com o
controle…………………………………………………………………….. 93
Figura 29
Influencia do pré-tratamento dos antagonistas 5-HT1A (NAN 190)
(A) 5HT2A/2C (Ketanserina) (B) e 5-HT3 (Ondansetron) (C) sobre
o efeito antidepressivo do composto B6 (10mg/kg, i.p.), em animais
avaliados no teste de nado forçado. Cada coluna representa a
média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA seguido de Bonferroni.
Asteriscos(*) denotam diferenças significativas quando comparado
ao controle ***p<0.001 e **p<0.01……………………………………... 95
Figura 30
Influencia do pré-tratamento dos antagonistas α1 (Prazosin) (A) e
α2 (Yoimbina) (B) sobre o efeito antidepressivo do composto B6
(10mg/kg, i.p.), em animais avaliados no teste de nado forçado.
Cada coluna representa a média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA
seguido
de
Bonferroni.
Asteriscos(*)
denotam
diferenças
significativas quando comparado ao controle ***p<0.001 e *p<0.05
e
hashtag(#) denotam
significancias estatisticas quando
comparado com grupo que recebeu B6 sem o antagonista
###
p<0.001………………………………………………………………….
Figura 31
96
Influência do pré-tratamento dos antagonistas seletivos D1
(SCH23390) (A), D2 (Pimozide) (B) e não seletivo (Haloperidol) (C)
sobre o efeito antidepressivo do composto B6 (10mg/kg, i.p.), em
animais avaliados no teste de nado forçado. Cada coluna
representa a média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA seguido de
Bonferroni. Asteriscos(*) denotam diferenças significativas quando
comparado ao controle (veículo) ***p<0.001 e hashtag(#) denotam
significancias estatisticas quando comparado com grupo que
recebeu B6 sem o antagonista ### p<0.001……………………………
97
Figura 32
Estrutura química dos compostos avaliados......................................
98
Figura 33
Estrutura química dos compostos propostos por Topliss para futura
avaliação biológica.............................................................................. 100
Figura 34
Efeito do composto B6 administrado na concentração de 10 mg/kg,
via intraperitoneal na Fase I – fase neurogênica no modelo de dor
induzida pela formalina 2,5%. Cada coluna representa uma média
de 6 experimentos e as barras verticais indicam o EPM.................... 101
Figura 35
Efeito do composto B6 administrado nas concentrações de 0.1, 1 e
10 mg/kg, via intraperitoneal no modelo de dor induzida pela
capsaicina. Cada coluna representa uma média de 6 experimentos
e as barras verticais indicam o EPM................................................... 102
Figura 36
Efeito do composto B6 administrado nas concentrações de 0.1, 1 e
10 mg/kg, via intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo
glutamato. Cada coluna representa uma média de 6 experimentos
e as barras verticais indicam o EPM................................................... 103
Figura 37
Efeito do composto B6 administrado nas concentrações de 0.1, 1 e
10 mg/kg, via intraperitoneal no modelo de hipernocicepção
mecânica induzida pela carragenina. Cada coluna representa uma
média de 6 experimentos e as barras verticais indicam o EPM......... 103
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Ordem de potência para diversos parâmetros físico-quimicos
proposta por Topliss.............................................................................
Tabela 2
Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em
31
função dos prováveis parâmetros mais ativos......................................
Tabela 3
31
Dados analíticos dos diazabiciclos derivados de diferentes cetonas... 55
Tabela 4
Dados analíticos dos diazabiciclos derivados de diferentes aldeídos.. 56
Tabela 5
Efeito
dos
compostos
em
estudo
sobre
os
parâmetros
comportamentais no modelo do campo aberto (MCA).........................
Tabela 6
Efeito dos compostos em estudo sobre a percentagem de
86
mortalidade dos animais após a indução das crises convulsivas
induzidas por pentilenotetrazol............................................................. 91
Tabela 7
Atividade antinociceptiva dos derivados diazabiciclos no modelo de
dor induzida pelo ácido acético 0,6% via i.p.........................................
99
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 7
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 11
2.1 Objetivo Geral: ......................................................................................... 11
2.2 Objetivos Específicos: ............................................................................ 11
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 13
3.1 Síntese orgânica e a obtenção de novos fármacos ....................................... 13
3.2 Chalconas .......................................................................................................... 16
3.3 Heterociclos ....................................................................................................... 20
3.3.1 Aziridinas ........................................................................................................ 24
3.4 Fotocromismo ................................................................................................... 29
3.5 Atividade biológica............................................................................................ 29
3.5.1 Atividade no sistema nervoso central .......................................................... 32
3.5.2 Antinocicepção............................................................................................... 33
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 35
4.1 Síntese................................................................................................................ 35
4.1.2 Chalcona ......................................................................................................... 35
4.1.3 Chalcona bromada e azirinina ....................................................................... 35
4.1.4 Diazabiciclos................................................................................................... 36
4.1.4.1 Diazabiciclos derivados de aldeídos e cetonas alifáticas ....................... 36
4.1.4.2 Diazabiciclos derivados de cetonas aromáticas ...................................... 37
4.1.5 Aldeídos heterocíclicos de Meerwein ........................................................... 37
4.1.6 Procedimentos de caracterização estrutural ............................................... 38
4.1.6.1 Avaliação do efeito fotocrômico por UV ................................................... 39
4.2 Ensaios Farmacológicos .................................................................................. 39
4.2.1 Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central .......................... 39
4.2.1.1 Animais ........................................................................................................ 39
4.2.1.2 Avaliação do efeito dos compostos sobre a deambulação dos animais
através do modelo campo aberto (MCA) ............................................................... 40
4.2.1.3 Avaliação do efeito hipnótico dos compostos através do teste do sono
induzido por barbitúrico (SIB) ................................................................................ 40
4.2.1.4 Avaliação do efeito anticonvulsivante dos compostos através do
modelo da convulsão induzida por pentilenotetrazol (TPTZ).............................. 41
4.2.1.5 Avaliação do efeito nootrópico dos compostos através do - teste de
memória- modelo da esquiva inibitória ................................................................. 41
4.2.1.6 Avaliação do efeito Ansiolítico dos compostos através do modelo de
ansiedade, teste de labirinto em cruz elevada (LCE) ........................................... 42
4.2.1.7 Avaliação do efeito antidepressivo - Modelo de depressão-teste do nado
forçado (TNF) ........................................................................................................... 42
4.2.2 Avaliação do mecanismo de ação da propriedade antidepressiva do
composto B6............................................................................................................ 43
4.2.2.1 Avaliação da participação do sistema serotonérgico .............................. 43
4.2.2.2 Avaliação da participação do sistema dopaminérgico ............................ 44
4.2.1.1 Avaliação da participação do sistema noradrenérgico............................ 44
4.2.3 Análise estatística .......................................................................................... 44
4.2.4 Avaliação da atividade antinociceptiva ........................................................ 45
4.2.4.1 Animais ........................................................................................................ 45
4.2.4.2 Modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético .......... 45
4.2.4.3 Modelo de dor induzida pela formalina ..................................................... 46
4.2.4.4 Modelo de dor induzida pela capsaicina ................................................... 46
4.2.4.5 Modelo de dor induzida pelo glutamato .................................................... 47
4.2.4.6 Hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina ........................... 47
4.2.5 Análise estatística .......................................................................................... 48
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 49
5.1 Síntese................................................................................................................ 49
5.2 Atividade Biológica ........................................................................................... 85
5.2.1 Avaliação sobre o sistema nervoso central ................................................. 85
5.2.2 Avaliação da atividade antinociceptiva ........................................................ 98
6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................... 104
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 107
ANEXO A - Perfil... .....................................................................................................
APÊNDICE A - ............................................................................................................
LISTA DE ABREVIATURAS
5-HT
-
Serotonina
AAS
-
Ácido acetilsalicílico
Ar
-
Aromático
CCD
-
Cromatografia de camada delgada
CDCl3
-
Clorofórmio deuterado
C3D6O
-
Acetona deuterada
CEUA
-
Comitê de Ética de Uso de Animais
d
-
Dupleto
DA
-
Dopamina
dd
-
Duplo dupleto
DI50
-
Dose que reduz a resposta para 50% em relação ao grupo controle
DNA
-
Deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico)
DRIFTS
-
Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy (método
de reflectância difusa no infravermelho com transformada de Fourier)
Es
-
Parâmetros estéreos
Et
-
Etil
FT-IR
-
Infravermelho por Transformada de Fourier
GABA
-
Ácido gama-aminobutírico
IMAO
-
Inibidor da monoamina oxidase
IV
-
Infravermelho
J
-
Constante de acoplamento (Hz)
LCE
-
Teste de labirinto em cruz elevada
m
-
Multipleto
NA
-
Noradrenalina
PABA
-
Ácido para-aminobenzóico
Ph
-
Fenil
P.F.
-
Ponto de Fusão
PTZ
-
Pentilenotetrazol
R
-
Radical
RMN ¹H
-
Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio1
RMN 13C
-
Ressonância Magnética Nuclear de Carbono13
RNA
Ribonucleic acid (ácido ribonucleico)
s
-
Simpleto
SIB
-
Teste do sono induzido por barbitúrico
SNC
-
Sistema nervoso central
t
-
Tripleto
TMS
-
Tetrametilsilano
TNF
-
Teste do nado forçado
TOC
-
Transtorno obsessivo compulsivo
TPTZ
-
Teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol
UV
Ultravioleta
σ
-
Parâmetros eletrônicos
π
-
Parâmetros hidrofóbicos
7
1 INTRODUÇÃO
Ao analisar dados históricos podemos perceber que os seres humanos têm
contado com a natureza para atender suas necessidades mais básicas, como o uso
de substâncias naturais para o tratamento de inúmeras enfermidades. As plantas,
em particular, formaram a base do sistema sofisticado da medicina popular e
continuam a desempenhar um papel essencial no cuidado à saúde, sendo ainda
amplamente utilizadas em diferentes culturas (GUIDO et al., 2010).
Até meados do século XIX a farmácia permaneceu uma ciência empírica
guiada pela medicina tradicional, aplicando e transferindo conhecimentos herdados
pelos ancestrais. Os medicamentos disponíveis eram geralmente preparados com
extratos vegetais, que em sua maioria eram eficazes. A tecnologia da fabricação de
medicamentos era rudimentar, produzindo apenas tinturas, emplastros, sopas e
infusões hidroalcoólicas preparadas com ervas secas ou recém-coletadas ou ainda
produtos animais, como ossos e gordura (CHAST, 2008).
Apesar da notória importância das plantas no desenvolvimento de novos
medicamentos e considerando o fato de cerca de 20% das plantas com substâncias
medicinais conhecidas serem encontradas no Brasil, percebe-se que o número de
produtos fitoterápicos comercializados no país é extremamente modesto e sua fatia
de mercado se restringe a apenas 2%, circunstância que ressalta a importante
colaboração da química farmacêutica moderna na obtenção de novos fármacos
(BARREIRO, 2007; NIERO, 2010).
Atualmente, de posse do conhecimento etnofarmacológico, faz-se a
purificação da matéria vegetal, com isolamento, determinação e identificação de
seus princípios ativos. Com o advento da tecnologia pode-se observar que alguns
compostos orgânicos ou metabólitos secundários de ocorrência natural apresentam
em sua estrutura outros átomos além de carbono e hidrogênio, os quais se
denominam heteroátomos. Inúmeras atividades farmacológicas importantes estão
relacionadas à presença destes heteroátomos, principalmente nitrogênio, oxigênio e
enxofre, pois através deles formam-se novos grupos funcionais e heterociclos que
contribuem significativamente no processo de interação com o receptor biológico
(QUIN; TYRELL, 2010).
8
Ao observar a estrutura dos fármacos empregados na terapêutica, constatase que cerca de 62% deles são heterocíclicos, dentre os quais aproximadamente
95% apresentam-se nitrogenados, 28% comportam átomos de enxofre e 18%
átomos de oxigênio. Os valores acima expostos assinalam a importância da química
dos heterociclos, demonstrando que muitas vezes pode-se observar a presença de
dois heteroátomos em um mesmo ciclo (MENEGATTI; FRAGA; BARREIRO, 2001).
Um exemplo de heterociclo nitrogenado observado em inúmeras substâncias
de ocorrência natural, como plantas e produtos de metabolismo microbiano,
podendo inclusive ser sintetizado, são os anéis aziridinicos, também conhecidos por
outras denominações como etilenoimina e azaciclo-propano, que são ciclos
nitrogenados de três membros. Este núcleo tem sido amplamente investigado por
exibir várias atividades biológicas, tendo sido considerado promissor para o
desenvolvimento de novos fármacos (BISOL; SÁ, 2007; ISMAIL, 2009).
Aziridinas representam um dos mais valiosos heterociclos na química sintética
moderna devido a sua versatilidade, servindo como base para obtenção de grupos
funcionais e sendo precursoras de outros heterociclos contendo nitrogênio, como
exemplo os diazabiciclos (HU, 2004; KIYANI et al., 2009a, 2009b; MAHMOODI;
KIYANI, 2004).
Estes biciclos podem ser obtidos sinteticamente através de vários métodos,
inclusive a partir de aziridinas chalcônicas. Ao analisar a literatura científica
disponível percebe-se que os compostos que contemplam apenas o anel aziridínico
já possuem amplamente estudadas suas propriedades biológicas (BISOL; SÁ, 2007;
SAXENA et al., 2007; CORRÊA, 2008; ISMAIL; LEVITSKY; DEMBITSKY, 2009;
VANDEKERCKHOVE; D’HOOGHE, 2013), entretanto, compostos contendo o núcleo
diazabiciclo, preservando ainda a função aziridina, não apresentam bioatividades
descritas, sendo de extrema importância sua investigação, considerando o grande
investimento em estudos dedicado a seus precursores, chalconas e aziridinas. Tal
união parece não ter sido ainda suficientemente estudada, uma vez que na literatura
reporta-se, principalmente, a utilidade de compostos aziridinicos como intermediários
reacionais (BISOL; SÁ, 2007; BOBKA et al., 2008).
Considerando a importância dos núcleos farmacofóricos em questão, a pouca
disponibilidade de informação na literatura científica atual e a necessidade de se
investigar novas moléculas com propriedades biológicas, este trabalho concentra-se
na síntese de derivados diazabiciclos a partir de aziridinas chalcônicas e a
9
investigação de suas propriedades biológicas – mais especialmente, da atividade
antinociceptiva e no sistema nervoso central.
10
11
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Sintetizar, caracterizar e avaliar o potencial de aplicação biológica, em
modelos de antinocicepção e no sistema nervoso central, de diferentes derivados
diazabiciclos obtidos a partir de aziridinas chalcônicas.
2.2 Objetivos Específicos:
- Sintetizar uma chalcona derivada do 4-nitrobenzaldeído;
- Sintetizar uma aziridina a partir da chalcona previamente obtida;
- Sintetizar aldeídos heterocíclicos pelo método de Meerwein;
- Proceder à reação da aziridina sintetizada com benzaldeídos e acetofenonas
substituídos e com aldeídos heterocíclicos;
- Caracterizar todos os compostos sintetizados;
- Avaliar biologicamente os compostos possuidores dos substituintes de Topliss em
modelos de sistema nervoso central e antinocicepção;
12
13
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Síntese orgânica e a obtenção de novos fármacos
O conhecimento adquirido pelos povos primitivos e indígenas com relação à
diversidade química encontrada na natureza pode ser considerado fator essencial
para o descobrimento de substâncias tóxicas e terapêuticas ao longo do tempo. O
aprendizado com estes povos proporcionou valiosas contribuições para o
desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais, propiciando-nos conhecer a
estreita relação entre a estrutura química de um determinado composto e suas
propriedades biológicas e consequentemente esclarecer a intrigante interação entre
animais/insetos e plantas. Neste sentido, a natureza forneceu muitos modelos
moleculares que fundamentaram estudos de relação estrutura-atividade e inspiraram
o desenvolvimento da síntese orgânica de fármacos (NIERO, 2010; QUIN; TYRELL,
2010; VIEGAS JR.; FRAGA; BARREIRO, 2006).
A variedade e complexidade de metabólitos secundários, ou seja, de origem
não proteica, biossintetizados pelas plantas, os quais despertam tanto interesse
dentro da química medicinal, formaram-se e evoluíram, desempenhando um papel
fundamental na sobrevivência do vegetal essencialmente estacionário, fornecendo
compostos fisiologicamente importantes e facilitando assim as condições de
adaptação e regulação, além de suprir a necessidade básica de substâncias
defensivas (KENAKIN, 2014; LI; JOHNSON, 2010; NEWMAN; CRAGG; KINGSTON,
2008).
Estas moléculas distintas e complexas geralmente são detentoras de vários
centros estereogênicos, devido aos quais possivelmente, sejam-lhes atribuídas
inúmeras finalidades alelopáticas e biológicas (MONTANARI; BOLZANI, 2001). Entre
as várias classes de produtos de metabolismo das plantas, que têm servido como
estrutura modelo para o planejamento tecnológico de fármacos inovadores
encontram-se os alcalóides, terpenóides, esteróides, lignanas, flavonóides, entre
outros (CALIXTO et al., 1990; MONTANARI; BOLZANI, 2001; SILVA JR.; VIZOTTO,
1996).
Apesar da notória importância das plantas no desenvolvimento de novos
medicamentos, percebe-se que o número de produtos fitoterápicos é extremamente
14
modesto considerando o fato de cerca de 85% do arsenal terapêutico disponível ser
composto por fármacos obtidos através de síntese total, circunstância que ressalta a
importante colaboração da química farmacêutica moderna na obtenção de novos
medicamentos (BARREIRO, 2007; LI; JOHNSON, 2010; NIERO, 2010).
A maioria dos fármacos pertencentes às classes dos analgésicos,
antidepressivos,
antihistamínicos,
ansiolíticos,
cardiotônicos,
hipnóticos,
antifúngicos, antiinflamatórios e anti-hipertensivos são de origem sintética. Por outro
lado, entre as principais classes de fármacos de origem natural estão os
antibacterianos e antineoplásicos (FARDELONE; BRANCHI, 2006; LI; JOHNSON,
2010; VIEGAS JR.; FRAGA; BARREIRO, 2006).
Podemos tomar como exemplo os 866 fármacos mundialmente usados na
terapêutica até o ano de 1991, dos quais, 680 (79%) eram obtidos de forma
sintética, os restantes 186 (21%) correspondiam àqueles com princípios ativos
provenientes de fontes naturais ou semi-sintéticos, confirmando esta estatística
temos dados mais recentes que demonstram que dos 530 novos medicamentos
lançados no mercado norte-americano entre 1993 e 2011, a maioria era composta
por fármacos obtidos através de síntese química total
(LI; JOHNSON, 2010;
MENEGATT; FRAGA; BARREIRO, 2001).
Um dos mais importantes aspectos a serem observados na busca de novas
moléculas bioativas é a investigação de uma molécula protótipo ou modelo, a partir
da qual se procede a síntese de derivados ou análogos com propriedades
farmacológicas mais intensas desenvolvendo-se a avaliação da relação entre
estrutura química e bioatividade (POLINSKY, 2008). Esta relação é o objeto de
estudo da química medicinal, a qual possui base multidisciplinar englobando as
ciências químicas, biológicas, farmacêuticas, médicas, físicas e computacionais,
estando preocupada com invenção, descobrimento, projeção, identificação e
preparação de novas entidades químicas biologicamente ativas (BARREIRO;
FRAGA, 2008; GUIDO; ANDRICOPULO; OLIVA, 2010; LIMA, 2007).
Dentro da química medicinal, podemos definir, de um modo geral, as etapas
comuns do processo de obtenção de um novo fármaco. O ponto de partida é a
eleição de um alvo terapêutico; em seguida inicia-se a otimização estrutural de uma
molécula protótipo, a qual irá interagir com sítio ativo do alvo selecionado. Esta
etapa visa o aumento da potência, seletividade, diminuição da toxicidade,
adequação do perfil farmacocinético e estabelecimento da relação estrutura-
15
atividade. Finalmente, inicia-se o melhoramento do protótipo, fase que objetiva o
melhoramento de suas propriedades farmacocinéticas e farmacêuticas, como
solubilidade, odor, sabor, de modo a viabilizar seu uso clínico (GUIDO;
ANDRICOPULO; OLIVA, 2010; LIMA, 2007).
Métodos semiquantitativos também podem ser utilizados na busca racional de
novos protótipos a fármacos. O método manual de Topliss é fundamentado na
síntese de cinco derivados contendo os seguintes substituintes: H, 4-Cl, 3,4-Cl, 4CH3 e 4-OCH3, escolhidos devido à acessível obtenção sintética desses derivados
como ponto de partida e então avaliar-se a ordem de potência destes substituintes
em relação aos parâmetros hidrofóbicos (π), estéreos (Es) e eletrônicos (σ)
(CAMPOS-BUZZI; CECHINEL-FILHO; CORRÊA, 2010). A partir da análise do
comportamento destes compostos pode-se propor novos substituintes a fim de
otimizar a atividade biológica dos compostos em estudo (YUNES et al., 2002).
As pesquisas em torno da obtenção de novos fármacos vêm se destacando
gradativamente através de investimentos maciços em matérias-primas e treinamento
de recursos humanos. É expressivo o número de cientistas com extensa formação
acadêmica que trabalham nos setores de pesquisa e desenvolvimento de
laboratórios industriais em busca de estratégias inovadoras para o encaminhamento
farmacológico de patologias como diabetes, dores agudas e crônicas, câncer,
doenças cardiovasculares, neurodegenerativas, artrite, osteoporose, fibrose cística,
AIDS, entre outras (FARDELONE; BRANCHI, 2006; FOUCE et al., 2014).
Apesar de todo este investimento, estima-se que apenas uma em cada 25
novas entidades químicas, que adquirem o status de possível novo fármaco, se
tornará um fármaco comercializado, revelando um processo com baixo índice de
êxito. As principais razões para o desfecho mal sucedido deste processo incluem
perda de eficácia clínica, propriedades farmacocinéticas inadequadas, toxicidade,
reações adversas, razões comerciais e limitações farmacotécnicas (LIMA, 2007;
MARGINEANU, 2014).
Considerando este contexto, justifica-se a necessidade da obtenção de novos
fármacos eficazes e seguros que contribuam no encaminhamento de doenças
prevalentes e endemias não controladas, conforme as necessidades de saúde,
seguindo critérios epidemiológicos e sociais. A falta de novas opções para o
tratamento de determinadas doenças infecciosas, por exemplo, leva a utilização de
medicamentos já disponíveis, os quais além de muitas vezes ineficazes e pouco
16
seguros, são tóxicos e promovem elevados índices de resistência (KENAKIN, 2014;
VIDOTTI, 2007).
3.2 Chalconas
Do ponto de vista químico, as chalconas são definidas como moléculas de
cadeia aberta, constituídas por dois anéis aromáticos (substituídos ou não) ligados
por um fragmento enona de três carbonos caracterizando uma cetona α,β-insaturada
que apresenta o núcleo fundamental 1,3-diaril-2-propen-1-ona (Figura 1). Seus anéis
aromáticos são identificados como anel A (advindo da cetona) e anel B (advindo do
aldeído).
Figura 1. Estrutura geral de uma chalcona, onde X e Y são hidrogênios ou
grupamentos substituintes quaisquer situados nos anéis aromáticos.
O
β
2'
2
3'
A
4'
X
6'
5'
B
α
3
4
6
5
Y
Em função da presença da dupla ligação entre os carbonos α e β, as
chalconas podem adotar configuração E/trans ou Z/cis (Figura 2), no entanto o
estereoisômero E é termodinamicamente favorável sendo encontrado em maior
concentração nas plantas (PADHYE, 2009) e geralmente obtido de forma pura
através de métodos sintéticos (CORDEIRO, 2010; DUCKI et al., 1998) .
A metodologia comum de síntese das chalconas, baseada na condensação
aldólica de Claisen-Schmidt, além de promover a obtenção de compostos
estereoquimicamente puros, ainda possibilita alcançar grande variedade de
moléculas, levando em conta a existência de inúmeros benzaldeídos e acetofenonas
comerciais que podem ser combinados contemplando a diversidade estrutural
desejada (DUCKI, et al., 1998; CORDEIRO, M., 2010).
17
Figura 2. Estereoisômeros de chalconas
O
Isoforma E/trans
O
Isoforma Z/cis
Partindo para uma abordagem biológica, chalconas também podem ser
definidas como uma classe de compostos fenólicos pertencentes à família das
fitoalexinas, precursores produzidos durante a via de biossíntese de flavonóides.
Abundantemente encontradas na natureza, seja em plantas rasteiras ou
superiores, em diferentes órgãos vegetais, sobretudo como pigmento nas pétalas, as
chalconas vem ganhando destaque como alvo de estudos de isolamento,
identificação e investigação de propriedades biológicas (BOECK et al., 2006;
CAMPOS-BUZZI, 2007; CORRÊA, 2008; SAXENA et al., 2007).
No reino vegetal a presença de pigmentação, radicais hidroxilas e insaturação
α,β são características marcantes, peculiaridades às quais são atribuídas uma série
de bioatividades, tais como antioxidante, antimicrobiana, antifúngica, fotoreceptora,
atraente visual e repelente de predadores.
A ação terapêutica atribuída a compostos pertencentes à classe das
chalconas e seus derivados sintéticos, comprovada através de diversas pesquisas
desenvolvidas in vitro e in vivo, vem se destacando no âmbito da química medicinal.
Grande parte desses estudos engloba a avaliação da relação estrutura-atividade na
tentativa de elucidar as variáveis estruturais interferentes na atividade biológica
desempenhada por esses compostos (BANDGAR et al., 2010; BANDGAR et al.,
2012; CAMPOS-BUZZI, 2007; LEE; SOLOMON, 2012; PADARATZ, 2009).
Além das características supracitadas, parte do interesse despertado por esta
classe de compostos se dá também em função de seu núcleo fundamental, o qual
pode ser considerado privilegiado no processo tecnológico de desenho de fármacos
18
(POLINSKY, 2008). Neste núcleo encontram-se dois anéis aromáticos de seis
membros interligados por apenas três carbonos, constituindo uma estrutura
relativamente rígida, o que minimiza a variabilidade conformacional da molécula,
fator considerado como uma complicação enfrentada rotineiramente nos estudos de
modelagem molecular. A etapa de análise conformacional é o primeiro passo nesses
estudos, buscando identificar aquela mais estável e a conformação bioativa ideal
(VERLI; BARREIRO, 2005). Outra característica interessante é a versatilidade dos
anéis, os quais comportam inúmeras possibilidades de substituintes que podem
contribuir para modificar e/ou melhorar a atividade farmacológica da molécula
(CORDEIRO, 2010).
Em
alguns
países
como
Japão,
Itália
e
Espanha
são utilizados
medicamentos que possuem uma chalcona como princípio ativo. No Japão
comercializa-se um medicamento com ação mucoprotetora, que possui como
princípio ativo a sofalcona (Figura 3 - a), a qual é utilizada para o tratamento de
gastrite e úlcera péptica, além disso, demonstrou bons resultados quando
combinada com medicamentos já utilizados clinicamente na erradicação de
infecções desencadeadas por Helicobacter pylori. Já na Itália e Espanha existem
medicamentos que possuem em sua formulação a metochalcona (Figura 3 - b), a
qual tem a função de estimular a produção da bile pelas células hepáticas
(ISOMOTO et al., 2005; SWEETMAN, 2011).
A atividade antioxidante exibida pela licochalcona A (Figura 3 - c) também
ganha destaque através uma linha de cosméticos comercializada em diversos
países. Além destas, várias outras chalconas são utilizadas clinicamente para tratar
enfermidades como câncer, infecções parasitárias, doenças cardíacas, problemas
circulatórios, no tratamento da dor e algumas ainda passam por avaliações préclinicas (LEE et al., 2006).
19
Figura 3. Estrutura química da sofalcona (a), metochalcona (b) e licochalcona A (c).
H3C
O
O
O
OH
CH3
O
CH3
CH3
CH3
O
O
O
O
H3C
O
CH3
(b)
(a)
O
O
HO
CH3
OH
H3C
CH3
H2C
(c)
A ação terapêutica de vários compostos pertencentes à classe das
chalconas e seus derivados sintéticos, tem sido reportada por diversos autores
(CORRÊA et al., 2001; DOMINGUEZ et al., 2005; NIELSEN et al, 2005; HSU et al.,
2006; CAMPOS-BUZZI et al., 2006, 2007; NOWAKOWSKA, 2007).
Entre as mais conhecidas ações pode-se citar a potente inibição do
crescimento de bactérias patogênicas comuns (NOWAKOWSKA, 2008; BANDGAR
et al., 2009; EL-SAWY et al., 2013) e de cepas resistentes a antibioticoterapia
convencional (SIDDIQUI et al., 2011); relevante atividade antifúngica (SIDDIQUI et
al., 2011); atividade antiproliferativa (SOLOMON; LEE, 2012) e citotóxica contra
diferentes células tumorais (EL-SAWY et al., 2013); inibição da enzima xantina
oxidase, que está envolvida na produção endógena de ácido úrico, ao qual estão
associadas algumas desordens metabólicas de produção anormal, como gota e
hiperuricemia, que podem levar ao desenvolvimento de doenças renais crônicas e
cardiovasculares; e inibição da enzima tirosinase, que participa da biosíntese de
20
melanina, intimamente ligada ao desenvolvimento de melanomas (BANDGAR et al.,
2012). Além destas, destacam-se também as atividades antimalarial, antileishmanial,
imunossupressiva, antituberculose, anti-inflamatória e analgésica (CAMPOS-BUZZI,
2007; LIU et al., 2007; BANDGAR et al., 2009; CORRÊA, 2008).
Desde 1940, quando o potencial biológico das chalconas começou a ser
explorado, o número de publicações científicas que tem o núcleo chalcônico e suas
variações como alvo de pesquisa cresce intensamente, proporcionando maior
conhecimento a respeito da estreita relação estabelecida entre a estrutura química
dos derivados e a atividade biológica que desempenham (NI et al., 2004). Este
conhecimento permitirá a futura obtenção de novas entidades químicas a serem
utilizadas
no
encaminhamento
terapêutico
de
diversas
enfermidades
que
continuamente afligem grande parte da população.
3.3 Heterociclos
Heterociclos são compostos orgânicos cíclicos que contemplam em seu anel
um ou mais átomos além do carbono, os quais recebem o nome de heteroátomos.
Os principais elementos que figuram como heteroátomos são nitogênio, enxofre e
oxigênio (QUIN; TYRELL, 2010).
Dentre os cerca de 20 milhões de compostos químicos identificados até o final
do segundo milenio, os heterocíclicos estão presentes em aproximadamente
metade. Diversos sistemas que comportam heterociclos têm suas atividades
farmacológicas amplamente investigadas, como é o caso das piridinas, piperidinas,
piperazinas, pirrolidinas, imidazóis, pirazóis, indóis, β-lactâmas e aziridinas (DUA et
al., 2011; TAYLOR et al., 2010).
Os heterociclos possuem grande importância dentro da química orgânica,
constituindo unidades estruturais comuns nos medicamentos e permanecendo
extremamente importantes no processo de descoberta de novos fármacos. Estimase que mais de 80% dos fármacos vendidos nos Estados Unidos, em 2010,
contemplavam pelo menos um fragmento heterocíclico em suas estruturas
(GOMTSYAN, 2012).
21
A razão por trás da alta prevalência de nitrogênio, enxofre e oxigênio,
especialmente nos anéis presentes nestas moléculas pode ser explicada através da
observação do processo de pesquisa que conduz à obtenção de um tratamento
terapêutico eficaz, o qual é amplamente baseado na observação da natureza e do
próprio corpo humano.
Em função dos heterociclos serem elementos centrais de uma vasta gama de
substâncias de origem natural, algumas até participantes em reações químicas do
nosso organismo, tais como ácidos nucleicos, aminoácidos, carboidratos, vitaminas
e alcalóides, os esforços da química medicinal muitas vezes evoluiu em torno da
mimetização de tais estruturas (DUA et al., 2011). Além do mais, com a inserção de
heterociclos, certas propriedades moleculares, como potência e seletividade, podem
ser moduladas, pois através de substituições bioisostéricas se torna possível
adequar lipofilicidade, polaridade e solubilidade do composto.
O fato dos heterociclos serem capazes empregar maior potência e
seletividade pode, em muitos casos, ser explicado por sua capacidade em promover
pontes de hidrogênio com proteínas presentes no alvo terapêutico. Dependendo da
estrutura do heterociclo ele pode comportar-se como aceptor ou doador de prótons.
Analisando as estruturas das seguintes substâncias demosntradas na Figura
4: ácido para-aminobenzóico (PABA) (a), sulfanilamida (b), sulfametoxazol (c),
hidroclorotiazida (d) e furosemida (e), pode-se perceber que a inserção de
determinados heterociclos em diferentes posições da molécula original pode ser
decisivo para a bioatividade, proporcionando marcantes diferenças em suas
propriedades biológicas.
22
Figura 4. Estrutura química do PABA (a), sulfanilamida (b), sulfametoxazol (c),
hidroclorotiazida (d) e furosemida (e).
O
NH 2
NH 2
NH 2
HN
HN
NH
S
OH
O
O
O
Cl
Cl
HO
O
O
S
O
NH 2
O
S
O
HN
O
S
O
NH 2
N
O
S
O
NH 2
O
CH 3
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
O PABA é uma substância de origem natural indispensável para
sobrevivência das bactérias, pois através dele lhes é possível sintetizar ácido fólico,
um precursor do DNA e RNA bacteriano. Sua estrutura serviu de base para
construção da primeira classe de antibióticos utilizados para tratar infecções em
humanos, as sulfas (BORGES et al., 2005).
A primeira molécula antimicrobiana análoga do PABA a ser produzida foi a
sulfanilamida. Entretanto observou-se que tal composto possuía além do efeito
antibiótico, propriedades diuréticas e por este motivo passou a servir como modelo
para o desenvolvimento de novas moléculas de ambas as classes terapêuticas
(AFONSO, 2008).
O sulfametoxazol é um representante dos antibióticos sulfonamídicos
heterocíclicos derivados da sulfanilamida, criado com a intenção de aumentar a
eficácia e diminuir a toxicidade de seus antecessores. Possui amplo espectro de
ação e boa biodisponibilidade via oral (BORGES et al., 2005).
Furosemida e hidroclotiazida, por sua vez são diuréticos sulfonamídicos
também derivados da sulfanilamida, ambos são amplamente utilizados no
tratamento da hipertensão arterial, todavia tal atividade é promovida de forma
diferente por cada molécula.
A sulfanilamida foi o primeiro composto inibidor da enzima anidrase carbônica
a ser reconhecido como diurético. No entanto, seu principal efeito adverso era o
23
desenvolvimento de acidose metabólica, devido à grande excreção de bicarbonato
urinário. Com o desenvolvimento de pesquisas, foram sintetizadas substâncias com
atividade inibitória muitas vezes maior do que a sulfanilamida, as quais não
ocasionaram excessiva eliminação de bicarbonato, como é o caso da acetazolamida
(MOTA, 2012).
A criação da hidroclorotiazida se deu com o intuito de tornar os inibidores da
anidrase carbônica medicamentos de ação mais potente. Ela pertence à classe dos
diuréticos saluréticos moderados que atuam, sobretudo, nos túbulos contornados
distais dos rins e possuem inicio de ação relativamente lento e efeito de longa
duração.
Com estrutura muito similar a da hidroclorotiazida, a furosemida é
considerado um diurético salurético potente que atua majoritariamente na alça de
Henle, possuindo inicio de ação rápido e curta duração.
Através de estudos de relação estrutura-atividade envolvendo tais moléculas,
foi possível perceber que a presença da porção sulfonamídica é essencial para o
efeito farmacológico de ambas as classes terapêuticas e que pequenas alterações
estruturais, como a inserção de heterociclos em diferentes posições, foram capazes
de promover significativas mudanças na farmacocinética e até mesmo nas
propriedades biológicas dos compostos.
Se o intuito for preservar a atividade diurética, o átomo de nitrogênio da
porção sulfamoila deve permanecer insubstituído, pois tal grupo é essencial para o
efeito inibidor sobre enzima anidrase carbônica in vitro e para a produção in vivo da
diurese. Esta característica explica por que todas as sulfonamidas antibacterianas,
com exceção da sulfanilamida não são capazes de inibir a anidrase carbônica ou
promover diurese, o que corrobora com o fato de moléculas com substituintes
aromáticos na porção sulfamoila possuirem atividade antimicrobiana extremamente
maior que a desempenhada pela precursora sulfanilamida (BORGES, 2005; MOTA,
2012).
24
3.3.1 Aziridinas e outros heterociclos
Devido a sua presença em um grande número de alcalóides biologicamente
ativos, compostos nitrogenados como os N-heterociclos, caracterizados por núcleos
com um ou mais átomos de nitrogênio, representam um interessante campo de
aplicação da química farmacêutica, principalmente através da investigação e
otimização de estruturas complexas observadas em produtos vegetais (SILVA,
2006).
As aziridinas representam um dos mais valiosos anéis heterociclicos de três
membros na química sintética moderna. Este fato se deve a sua ampla versatilidade,
sendo precursoras e proporcionando régio e estereoseletividade na síntese de
outros heterociclos contendo nitrogênio, na elaboração de ligações químicas e
obtenção de outros grupos funcionais (HU, 2004).
Aziridinas, também chamadas de azaetileno ou etilenimina (Figura 5), são
moléculas consideradas análogos nitrogenados de epóxidos, configurando um anel
de três membros ligados a um grupamento amina. Moléculas que possuem o anel
aziridínico em sua estrutura são encontradas em várias substâncias de ocorrência
natural, como plantas e produtos de metabolismo microbiano. Além disso, tais
estruturas podem facilmente ser obtidas por diversos processos de síntese orgânica
a partir de metodologias simples, em condições reacionais brandas, reagentes e
produtos pouco tóxicos e geração mínima de resíduos (BISOL; SÁ, 2007; ISMAL;
LEVITSKY; DEMBITSKY, 2009).
Figura 5. Estrutura geral do anel aziridina.
H
N
R
R'
Atualmente, as aziridinas têm sido exploradas devido a diversas atividades
biológicas como antibiótica, antitumoral, anticarcinogênica, citotoxicas e inseticidas.
Além disso, configuram como importantes intermediários na síntese de compostos
25
nitrogenados, como aminoácidos, açúcares e alcalóides (YADAV; KAPOOR, 2009).
O núcleo aziridínico é considerado extremamente reativo devido à tensão
entre suas ligações, no entanto aziridinas de alto peso molecular geralmente são
estáveis
a
temperatura
ambiente
(BISOL;
SÁ,
2007;
ISMAL;
LEVITSKY;
DEMBITSKY, 2009).
Entre as mais importantes estruturas aziridínicas de interesse biológico
encontramos as mitomicinas A, B e C, que formam um grupo de antibióticos com
propriedades citotóxica e antibacteriana, derivadas de uma estrutura comum
denominada mitosana produzida por espécies do gênero Streptomyces. Das
mitomicinas já identificadas, a mais investigada é a mitomicina C (Figura 6), que foi
isolada da bacteria Streptomyces caespitosus na década de 50. Esta molécula
contém um grupo uretano e um grupo quinona em sua estrutura, assim como um
anel de aziridina, que é essencial para atividade antineoplásica (MONTE et al.,
2004). No tratamento de neoplasias, a mitomicina C atua como um antimetabólito
alquilante, bloqueando a replicação de DNA e RNA e inibindo a síntese protéica,
sem ciclo celular específico de ação, porém células em rápida atividade proliferativa
demonstram ser mais suscetíveis (WALLAU et al., 2005).
Figura 6. Estrutura química da mitomicina C.
O
O
O
H2N
O
N
H3C
NH2
CH3
NH
O
Além da atividade antineoplásica exibida pelas mitomicinas, outras aziridinas
apresentaram ainda ação tripanocida (VICIK et al., 2006), antifúngica e
antibacteriana (HEGDE et al., 2013). Todavia, grande parte dos trabalhos científicos
envolvendo o anel de aziridina é dedicada a salientar sua utilização apenas como
26
intermediário reacional (BISOL; SÁ, 2007).
Com o auxílio do anel aziridínico e através de inúmeros métodos reacionais é
possível obter a formação de outros heterociclos a partir de interessantes estruturas
precursoras como é o caso das chalconas, que possuem como característica
importante sua capacidade de atuar como base estrutural para a síntese de diversos
compostos heterocíclicos biologicamente ativos (EL-SAWY et al., 2013). Na
estrutura fundamental das chalconas encontramos possibilidade de inserção de
grupos heterocíclicos nos anéis A e B e a formação destes a partir da porção enona
da molécula (HAMADA; SHARSHIRA, 2011; HWANG et al., 2012).
Atualmente vários estudos de relação estrutura-atividade de compostos
heterocíclicos baseados na estrutura chalcônica são relatados na literatura (FILOSA
et al., 2007; FOUCE et al., 2014; HWANG et al., 2012; PINNA et al., 2000; SHARMA
et al., 2009). Dentre as interessantes estruturas cíclicas obtidas a partir das
chalconas podemos destacar compostos di-nitrogenados com potencial atividade
biológica, os conhecidos diazabicilos, entretanto o número de estudos que
investigam as propriedades farmacológicas de compostos que contemplam tal
grupamento é relativamente modesto, levando em consideração a quantidade de
pesquisas voltadas para avaliação de outros heterociclos nitrogenados já citados
anteriormente. Entre as bioatividades atribuídas a moléculas que detém um grupo
diazabicíclico destacam-se a antiviral, analgésica, antiarrítmica (FILOSA et al., 2007;
PINNA et al., 2000; SHARMA et al., 2009; VILLA et al., 2001) e antitumoral, onde
observou-se atividade antiproliferativa destes compostos contra células tumorais de
bexiga, pulmão, mama e pâncreas (HOLL et al., 2009).
A partir da porção enona do núcleo chalcônico podem ser obtidos compostos
diazabicíclicos detentores de um anel de aziridina, os quais possuem suas
propriedades físico-químicas intensamente investigadas em função da observação
de fenômenos fotocrômicos (KIYANI et al., 2013; GHAVIDAST; MAHMOODI ;
ZANJANCHI, 2013; MAHMOODI; NADAMANI; BEHZADI, 2013)
Atualmente, não encontram-se relatos sobre a atividade biológica de tais
moléculas fotocrômicos na literatura, no entanto, chama atenção o fato de sua
estrutura comportar um núcleo aziridínico condensado a um anel imidazólico,
fragmento que pode contribuir decisivamente para o efeito biológico desempenhado
pelos compostos. Pode-se citar como exemplos das diferentes atividades biológicas
desempenhadas por fármacos possuidores do fragmento imidazol, o metronidazol
27
(Figura 7- a), amplamente utilizado como antiprotozoário e antibacteriano de amplo
espectro, o miconazol (Figura 7- b), detentor de excelente atividade antifúngica
tópica e a teofilina (Figura 7- c), utilizada no tratamento de enfermidades do trato
respiratório inferior.
Figura 7. Estrutura química do metronidazol (a), miconazol (b) e teofilina (c).
Cl
Cl
N
H3C
O
O
N
NO2
H3C
Cl
(a)
N
N
N
OH
H
N
O
N
N
CH3
Cl
(b)
(c)
Baseando-se neste contexto e na semelhança estrutural com a porção 1,3diazabicliclo[3,1,0]hex-3-eno (Figura 8- a), conforme demonstrado na Figura 8, vale
ressaltar ainda a interessante atividade biológica desempenhada pelo composto
diazabicíclico, neste caso não derivado de chalcona, imexon (Figura 8- b). Uma
pequena molécula que vem sendo estudada e tem apresentado resultados
extremamente satisfatórios no combate ao melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer
de pâncreas, pulmão, mama e próstata (DVORAKOVA et al., 2000; WEBER et al.,
2010).
28
Figura 8. Porção 1,3-diazabicliclo[3,1,0]hex-3-eno (a) e estrutura química do imexon (b).
Ar
1
Ar
N
R
2
NH
N
N
NH
1
O
R
(b)
(a)
Além do mais, destaca-se também a versatilidade sintética dos diazabiciclos
obtidos a partir de chalconas, sendo possível a inserção de variados substituintes
nas porções superior e inferior da molécula (posições Ar1, Ar2, R e R1 (Figura 8- a)).
Dentre os grupos que podem compor sua estrutura encontram-se os “adutos de
Meerwein”, que são constituídos por aldeídos aromáticos obtidos através da reação
entre anilinas substituídas e furano ou pirrolcarboxaldeído (CHE et al., 2014).
Uma interessante rota sintética para obtenção de derivados arilfurano e
arilpirrol é arilação direta de compostos insaturados catalisada por sal de cobre
através da formação de sais de arenodiazônio, descrita por Meerwein e
colaboradores em 1939.
O interesse na arilação de derivados de furano e pirrol é largamente
determinado por perspectivas na busca de substâncias biologicamente ativas entre
as séries derivadas destes grupos (LOU et al., 2014). Entre os medicamentos
derivados de um grupamento arilfurano encontra-se a nitrofurantoína (Figura 9- a),
um antibacteriano habitualmente utilizado no tratamento de infecções do trato
urinário e a ranitidina (Figura 9- b), um antagonista dos receptores H2, utilizados no
tratamento de problemas estomacais.
Figura 9. Estrutura química da nitrofurantoína (a) e da ranitidina (b).
O
O2N
O
N
(a)
N
NH
O
H3C
O
N
S
NH
CH3
(b)
O 2N
NH
CH3
29
3.4 Fotocromismo
Fotocromismo é um fenômeno associado à transformação reversível de
espécies químicas, observado através de mudança em sua coloração, a partir da
incidência de luz solar ou artificial. A molécula de origem e a resultante após
exposição a luz apresentam diferentes espectros de absorção por fotoirradiação,
geometria e estrutura eletrônica. (TSIVGOULIS, 2000 ; BOUAS-LAURENT ; DÜRR,
2001; MAHMOODI et al., 2004; KIYANI et al., 2009/a,b).
Os derivados de 1,3-diazabicliclo[3,1,0]hex-3-eno constituem uma classe de
compostos fotocrômicos amplamente explorada. Estes compostos, quando expostos
a luz solar durante cinco a quinze segundos, desenvolvem uma coloração que varia
de verde-azulado a azul royal de acordo com os efeitos eletrônicos e estéreos dos
substituintes presentes nos anéis aromáticos de sua estrutura (KIYANI et al.,
2009/b).
No ano de 1971 Cooper e seus colaboradores registraram a patente de 28
compostos
derivados
de
1,3-diazabicliclo[3,1,0]hex-3-eno
(HEINE;
WEESE;
COOPER, 1971), desde então estas moléculas têm suas propriedades físicoquímicas e possíveis aplicabilidades tecnológicas intensamente estudadas por
alguns grupos de pesquisadores. Os compostos 1,3-diazabicliclo[3,1,0]hex-3-eno
são conhecidos também pelo nome de Cooper Blue referendando um dos
pesquisadores que o sintetizou, Robert Cooper (MAHMOODI et al., 2004; KIYANI et
al., 2009/a,b).
Inúmeros
compostos
fotossensíveis
são
investigados,
porém,
raros
apresentam reações fotocrômicas em estado sólido, como é o caso dos derivados
de 1,3-diazabicliclo[3,1,0]hex-3-eno, que permanecem com suas propriedades
fotocrômicas no estado cristalino. Este é um dos fatores que fazem com que
aumente o interesse tecnológico nessa classe de compostos (CHEN et al., 2007;
KIYANI et al., 2009/a).
3.5 Atividade biológica
No processo de descoberta de um novo fármaco, quando a estrutura do alvo
terapêutico não é conhecida, o desenho molecular de novos padrões estruturais do
30
candidato a composto-protótipo desejado pode ser conduzido a partir do emprego de
estratégias de planejamento estrutural da química medicinal, como a identificação de
novos análogos ativos do substrato natural do receptor ou do agonista da enzima
eventualmente eleita como alvo-terapêutico (QUIN; TYRELL, 2010).
O planejamento molecular racional destes análogos ativos pode se dar pelo
emprego do bioisosterismo, da simplificação molecular, da hibridação molecular,
entre outras metodologias de planejamento molecular da química medicinal. Sabe-se
que a substituição de um átomo de hidrogênio por um determinado substituinte pode
modificar profundamente a potência, duração e ainda o efeito farmacológico de uma
molécula (BARREIRO; FRAGA, 2005).
Os estudos de correlação estrutura-atividade, fundamentados no efeito do
substituinte em um determinado anel aromático, são muito comuns na química
medicinal, uma vez que mais de 50% dos fármacos ou compostos bioativos
possuem esse tipo de anel. As modificações produzidas pela introdução de um
substituinte podem atingir várias propriedades físico-químicas da molécula, tais
como a hidrofobicidade, a densidade eletrônica, a conformação estrutural, as
propriedades farmacocinéticas, entre outras (CECHINEL-FILHO, YUNES, 2001).
Uma vez definidos e sintetizados, os novos compostos são ensaiados
farmacologicamente, empregando-se protocolos in vivo, o que permite a
identificação de novos compostos-protótipos de fármacos (BARREIRO; FRAGA,
2005).
O perfil terapêutico de um fármaco pode ser influenciado por muitos fatores
relacionados à sua estrutura química, pode-se formular uma relação entre a
estrutura química e a atividade biológica como, por exemplo, o modelo semiquantitativo desenvolvido por Topliss, o qual é de grande aplicabilidade na predição
de moléculas candidatas a futuros fármacos.
Topliss sugere um método não estatístico baseado no fato de que alguma
correlação quantitativa deve existir entre atividade biológica, a hidrofobicidade e a
descrição molecular eletrônica dos substituintes aromáticos (YUNES et al., 2002).
O método manual consiste na análise dos resultados da atividade
farmacológica de cinco compostos que possuam anel aromático na sua estrutura e
que estejam presentes os seguintes substituintes: H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH3 e 4-OCH3
(CECHINEL-FILHO; NUNES; YUNES, 1993).
A avaliação da atividade biológica
está relacionada aos parâmetros hidrofóbicos (π), eletrônicos (σ) e estéreos (Es)
31
conforme demonstrado na Tabela 1.
Tabela 1. Ordem de potência para diversos parâmetros físico-quimicos proposta por
Topliss
Parâmetros físico-quimicos de Topliss
E4a
Substituintes
π
2π−π2
σ
−σ
π+σ
2π− σ
π−σ
3,4-Cl2
1
1-2
1
5
1
1
1-2
3-4
5
2-5
4-Cl
2
1-2
2
4
2
2-3
3
3-4
3-4
2-5
4-CH3
3
3
4
2
3
2-3
1-2
1
1
2-5
4-OCH3
4-5
4-5
5
1
5
4
4
2
2
2-5
H
4-5
4-5
3
3
4
5
5
5
3-4
1
π−2σ π−3σ
A tabela 2 indica a proposta de seleção de novos substituintes que podem
otimizar a atividade farmacológica dos compostos em estudo. Aos parâmetros
relacionados π e σ, baseados nos estudos de correlação de Hansch, Topliss incluiu
também os efeitos estéreos (Es), que muitas vezes exercem influência dominante.
Este método visa uma síntese mais racional e objetiva, visto que, fazendo
primeiramente a análise e comparação dos resultados da atividade biológica com a
estrutura química dos compostos pode-se determinar futuras modificações
estruturais com o objetivo de obter um composto ainda mais potente que os iniciais.
Tabela 2. Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em função dos
prováveis parâmetros mais ativos.
Prováveis parâmetros mais ativos
Seleção de novos substituintes
π, π+σ, σ
π, 2π-σ, π-σ
π-2σ, π-3σ, σ
2π-π2
3-CF3, 4-Cl; 3-CF3, 4-NO2; 4-CF3; 2,4-Cl2; 4C-C5H9
4-CH(CH3)2;
4-C(CH3)3;
3,4(CH3)2;
O(CH2)3CH3; 4-OCH2Ph; 4-NEt2
4-
4-N(C2H5)2; 4-N(CH3)2; 4-NH2; 4-NHC4H9; 4OH; 4-OCH(CH3)2; 3-CH3; 4-OCH3
4-Br, 3CF3; 3,4(CH3)2; 4-C2H5; 3Cl; 3CH3; 3-OCH3; 3-N(CH3)2; 3-CF3; 3,5-Cl
32
3.5.1 Atividade no sistema nervoso central
Os múltiplos fatores que podem levar as pessoas a desenvolverem um
quadro de desordem no sistema nervoso central estão presentes no cotidiano da
sociedade, fazendo com que este quadro se manifeste em qualquer indivíduo,
independente de raça, cor, sexo ou classe social. Desta forma, observa-se cada vez
mais elevada a incidência destes quadros clínicos, fazendo com que um número
também cada vez maior de pessoas procure ajuda médica e tratamentos eficazes
para superar estes transtornos (TOLARDO, 2008).
A ansiedade é uma resposta natural do indivíduo frente a um perido dito
potencial. Teoricamente, certo grau de ansiedade confere ao indivíduo o aumento da
capacidade cognitiva e de desempenho. Entretanto, quando seus sintomas se
manifestam sem que haja uma causa específica e se mantem por um longo período
de tempo estamos diante da ansiedade patológica. O tratamento atual consiste em
antidepressivos tricíclicos, benzodiazepínicos, dentre outros. Grande parte dos
medicamentos exibe uma vasta gama de efeitos colaterais e/ou adversos levando
muitas vezes o paciente a não adesão do tratamento (FISCHER, 2007).
Os transtornos de ansiedade não podem ser desvinculados totalmente de
outros distúrbios psiquiátricos, já que estão associados, com grande frequência, à
depressão, sendo esta uma doença caracterizada por contínua alteração no humor e
falta de interesse em atividades prazerosas. O estado depressivo se diferencia do
comportamento melancólico ou triste que afeta a maioria das pessoas, por se tratar
de uma condição duradoura de origem neurológica (MELO, 2006).
Queixas de problemas no sono também são correlatos subjetivos de
transtorno de depressão e podem representar fatores de risco para o primeiro
episódio depressivo, bem como antecipar a recorrência do quadro. A insônia é um
distúrbio do sono que pode ser sintoma de várias condições patológicas dentre as
quais destaca-se a depressão. Assim, a avaliação cautelosa dos distúrbios do sono,
especialmente quando já instalado um transtorno depressivo, é importante pela
relevância clínica e pelo valor prognóstico (HALES; YUDOFSKY, 2006).
A insônia deixou de ser uma raclamação trivial, pois entende-se que a falta de
descanso pode gerar fadiga diurna, reduzir a qualidade de vida e aumentar os
custos com cuidados e saúde (COELHO et al., 2010).
33
Os efeitos centrais de compostos aziridínicos e das chalconas tem sido
estudados. Chalconas exibem efeito ansiolítico (JAMAL; ANSARI; RIZVI, 2008),
neuroprotetor (NOBRE et al., 2009), neuroléptico (BUKHARI; JASAMAI; JANTAN,
2012), nootrópico, antiepiléptico (CHO et al., 2011), dentre outros. As chalconas
também tem efeito inibitório sobre a deposição do peptídeo beta-amiloide sendo
alvos promissores para o tratamento do Alzheimer (KWAK et al., 2012).
Vários compostos aziridínicos exibem efeito ansiolítico e hipnótico (CHO et al.,
2011), nootrópico, melhorando déficits cognitivos de animais avaliados em testes de
memória (ZHU et al., 2012; KOUPILOVÁ, 2009) além de efeitos neuroprotetores
(HWANG, 2012).
3.5.2 Antinocicepção
A dor é definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP)
como sendo “uma experiência emocional e sensorial desagradável associada com
uma lesão tecidual real ou potencial ou descrita em termos de tal lesão”. A sensação
dolorosa tem papel fisiológico e funciona como um sinal de alerta para percepção de
algo que está ameaçando a integridade física do organismo. Já está bem
estabelecido que a dor é uma experiência complexa e que não envolve apenas a
transdução de estímulo nocivo ambiental, mas também o processamento cognitivo e
emocional pelo encéfalo (VITOR et al., 2008).
O componente fisiológico da dor é chamado nocicepção, que consiste nos
processos de transdução, transmissão e modulação de sinais neurais gerados em
resposta a um estímulo nocivo externo. De forma simplificada, pode ser considerado
como uma cadeia de três-neurônios, com o neurônio de primeira ordem originado na
periferia e projetando-se para a medula espinhal, o neurônio de segunda ordem
ascende pela medula espinhal e o neurônio de terceira ordem projeta-se para o
córtex cerebral (FISCHER, 2007).
O primeiro processo da nocicepção é a decodificação de sensações
mecânica, térmica e química em impulsos elétricos por terminais nervosos
especializados denominados nociceptores. Os nociceptores são terminações
nervosas livres dos neurônios de primeira ordem, cuja função é preservar a
34
homeostasia tecidual, assinalando uma injúria potencial ou real (KLAUMANN;
WOUK; SILLAS, 2008).
Chalconas possuem seu potencial antinociceptivo amplamente avaliado.
Dentre os estudos consultados destaca-se a avaliação de uma série de
acetamidochalconas através de testes antinociceptivos in vivo, apresentando efeitos
duas vezes maiores que fármacos de referência como ácido acetil salicílico e
acetoaminofeno (CAMPOS-BUZZI et al., 2007), além deste, outro estudo revela
ainda a atividade anti-inflamatória de derivados de chalcona, através da inibição na
produção de citocinas induzida pela carragenina (RIBEIRO et al., 2015).
Em outro trabalho, derivados de chalconas também apresentaram significativa
atividade antinociceptiva nos modelos de dor neurogênica e anti-inflamatória, com
valores cerca de 20 vezes superiores quando comparados aos fármacos de
referência AAS e acetaminofeno (CORRÊA et al., 2001).
35
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Síntese
4.1.2 Chalcona
A chalcona foi sintetizada segundo uma derivação do método geral de
condensação aldólica de Claisen-Schmidt (CAMPOS-BUZZI et al., 2007; CORRÊA
et al., 2001; CORRÊA , 2008).
O método prevê uma mistura equimolar de benzaldeídos e acetofenonas
(substituídos ou não) dissolvidos em etanol, na presença de hidróxido de sódio a
10%. Segundo o método, a solução é deixada em agitação mecânica por 24 horas,
ou até o ponto em que não foi mais possível agitar-se a mistura (devido à formação
de precipitados). Como forma de confirmar o efetivo término da reação, a formação
do produto reacional foi acompanhada por cromatografia de camada delgada. O
produto reacional foi então filtrado à pressão reduzida e lavado, sucessivas vezes,
com água destilada fria, até que as águas de lavagem se apresentassem neutras. A
utilização de ácido clorídrico diluído também pode ser adotada, na lavagem do
produto final. O produto isolado foi seco sob vácuo, na presença de pentóxido de
fósforo.
4.1.3 Chalcona bromada e aziridina
A chalcona previamente sintetizada foi dissolvida em clorofórmio. Esta
solução foi submetida a um banho de gelo e nela se adicionou, gota a gota, uma
solução de bromo em clorofórmio, com agitação mecânica constante. Após todo o
bromo ter sido adicionado, retirou-se a mistura do banho de gelo. A agitação foi
mantida à temperatura ambiente até que a coloração avermelhada característica do
36
bromo não pôde mais ser percebida na mistura reacional e uma coloração de
tonalidade amarelo-limão se fixou. Neste ponto, uma quantidade adicional da
solução de bromo em clorofórmio foi adicionada à mistura reacional. Quando a
coloração avermelhada persistiu, por mais de trinta minutos, a reação de bromação
da chalcona foi considerada como completa. A solução remanescente foi, então,
evaporada sob pressão reduzida e o resíduo sólido foi purificado por cromatografia
de coluna em silicagel e recristalizado com diclorometano/hexano (50:50) para o
isolamento da chalcona di-bromada pura.
A chalcona di-bromada foi então solubilizada em etanol a 96% e adicionada,
sob agitação constante, a uma solução concentrada de hidróxido de amônio, à
temperatura ambiente. Depois de quatro dias, a mistura reacional foi filtrada, o sólido
foi lavado com metanol e seco ao ar. A aziridina resultante foi purificada através de
cromatografia de coluna em silicagel e recristalizada em etanol (MAHMOODI et al,
2007).
4.1.4 Diazabiciclos
4.1.4.1 Diazabiciclos derivados de aldeídos e cetonas alifáticas
À aziridina previamente formada (1 mmol), juntou-se brometo de amônio (1
mmol) e o benzaldeído ou cetona apropriados (1 mmol). Estes componentes foram
dissolvidos em etanol absoluto e a solução foi agitada a temperatura ambiente por
30 minutos. Em seguida, adicionou-se acetato de amônio (5 mmol) e a mistura
reacional permaneceu em agitação por mais quatro dias. Com o passar do tempo foi
possível perceber uma mudança na coloração da mistura reacional, que passa de
tons de alaranjado para azul, ou azul esverdeado. O progresso da reação foi
acompanhado por CCD. Após constatar o término da reação, a mistura reacional foi
filtrada, lavada com etanol, seca ao ar e o diazabiciclo resultante foi purificado
através de recristalização em etanol (MAHMOODI et al, 2007).
37
4.1.4.2 Diazabiciclos derivados de cetonas aromáticas
Os diazabiciclos derivados de cetonas aromáticas foram sintetizados segundo
uma derivação do método geral descrito por Kiyani e colaboradores (2013). À
aziridina previamente formada (1 mmol), se adicionou brometo de amônio (1 mmol),
acetato de amônio (10mmol) e a acetofenona apropriada (1 mmol). A estes
componentes se adicionou 0,1mL de etanol absoluto e a solução foi irradiada por
micro-ondas, a temperatura de 50 ºC e potência de 300W. Foi possível perceber
uma mudança na coloração da mistura reacional, que passa de tons de alaranjado
para azul, ou azul esverdeado. O progresso da reação foi acompanhado por CCD.
Após constatar o término da reação a mistura reacional foi filtrada, lavada com
etanol, seca ao ar e o diazabiciclo resultante foi purificado por recristalização em
etanol.
4.1.5 Aldeídos heterocíclicos de Meerwein
Os aldeídos utilizados na formação dos diazabiciclos foram sintetizados
através de uma reação de arilação de Meerwein, a qual envolve a
diazotização de uma anilina e o posterior acoplamento do íon diazônio
formado com o aldeído de escolha (OBUSHAK et al., 2009).
Uma solução de cloreto de benzenodiazônio, preparada com anilina
substituída (0,025 mol), ácido clorídrico (6,5 mL), água (10,0 mL) e nitrito de
sódio (0,026 mol) foi adicionada lentamente a uma mistura de cloreto de cobre
(0,7g), furfural (0,03 mol) e água (25,0 mL). A mistura foi deixada em repouso
por dois dias, após este período foi diluída com água, o precipitado foi filtrado
a vácuo, lavado com água, etanol e éter etílico. O
sólido
purificado por recristalização em tetracloreto de carbono.
resultante
foi
38
4.1.6 Procedimentos de caracterização estrutural
O andamento das reações durante os procedimentos reacionais, bem como a
pureza preliminar dos compostos utilizando-se como comparação os padrões dos
reagentes, foram monitorados por cromatografia de camada delgada. Os
procedimentos de purificação foram os usuais, por recristalização com etanol. A
caracterização de todos os compostos sintetizados foi realizada através de ponto de
fusão, espectroscopia no infravermelho e espectroscopia de ressonância magnética
nuclear de hidrogênio e carbono (NIQFAR/UNIVALI).
Na técnica de cromatografia em camada delgada (CCD) foram utilizadas
placas pré-revestidas de sílica gel com indicador de fluorescência, em folhas com
base de alumínio, Merck. Em todos os procedimentos cromatográficos foram
utilizados gradientes do sistema de solventes hexano/acetato de etila. Os solventes
utilizados foram adquiridos comercialmente das marcas Aldrich, Vetec e Merck. Os
compostos foram visualizados como manchas (spots) através de luz UV de ondas
curtas. Para a recristalização dos compostos foram utilizados diferentes solventes.
Os pontos de fusão, dos compostos obtidos, foram determinados de forma direta,
com o equipamento Microquímica APF-301, não necessitando correção por curva de
calibração.
As análises espectrométricas no infravermelho foram realizadas em
espectrômetro
interfotométrico
por
transformada
de
Fourier,
IR-PRESTIGE
21(SHIMADZU, Tokyo, Japan), pelo método de reflectância difusa – DRIFTS. Os
espectros foram obtidos registrando transmitância versus número de onda (cm-1) e
foram corrigidos pelo algoritmo Kubelka Munk.
Os espectros de RMN1H e RMN13C foram obtidos em espectrômetro de
ressonância magnética nuclear Bruker DPX-300 Advance (Bruker, Karlsruhe,
Germany). Os deslocamentos químicos foram expressos em valores adimensionais
(δ = ppm) em relação a um padrão de referência de tetrametilsilano (TMS). Foram
utilizados os solventes deuterados dimetilsulfóxido-d6, acetona-d6 e clorofórmio-d1
adquiridos comercialmente. As constantes de acoplamento (J) foram expressas em
Hertz (Hz). As multiplicidades dos sinais foram indicadas como segue: s=simpleto,
39
d=dupleto, dd=duplo dupleto, t=tripleto e m=multipleto. A visualização foi realizada
no programa ACDSpec Manager 10.08 e Bruker TopSpin 5.0.
Os espectros de ultravioleta foram obtidos no equipamento JASCO V-630
(JASCO, Tokyo, Japan) utilizando cubetas de quartzo com caminho ótico de 1 cm.
4.1.6.1 Avaliação do efeito fotocrômico por UV
Os espectros de absorção no ultravioleta foram obtidos da seguinte maneira:
primeiramente cada composto foi diluído em etanol para se obter uma solução na
concentração de 1,0 x 10-4 mol.dm-3, esta solução foi deixada em repouso cerca de
duas horas, então iniciou-se o procedimento no equipamento JASCO V-630
(JASCO, Tokyo, Japan) utilizando cubetas de quartzo com caminho ótico de 1 cm. O
primeiro espectro obtido foi o da solução não irradiada (0 s), em seguida a solução
foi irradiada com luz UV a 254 nm durante 30 s e rapidamente foi obtido um segundo
espectro. A formação do fotoisômero aberto (forma com anel aziridina aberto) foi
obtido através da irradiação, das soluções contendo composto, com luz UV a 254nm
em diferentes tempos (0s, 30s, 1, 3, 5, 10 e 15 min), após cada tempo de irradiação
foi obtido um espectro de UV e ao final de cada experimento os espectros foram
sobrepostos para avaliar as mudanças nos máximos de absorção entre os diferentes
tempos de irradiação.
4.2 Ensaios Farmacológicos
4.2.1 Avaliação da atividade sobre o Sistema Nervoso Central
4.2.1.1 Animais
40
Para os experimentos foram utilizados camundongos Swiss Webster fêmeas
de 3 meses, obtidos do Biotério Central da UNIVALI. Os animais foram mantidos no
biotério, com ciclo claro/escuro de 12 horas. Os mesmos foram aclimatados a
temperatura de 22 ± 2 °C e tratados com água e ração “ad libitum”, exceto durante
os experimentos.
Os protocolos experimentais foram submetidos ao CEUA /UNIVALI em
dezembro de 2012, aprovados com o parecer 47/2012 CEUA-UNIVALI. Todos os
tratamentos foram feitos por via intraperitoneal (0,10mL/ 10 g de peso) e os testes
comportamentais foram realizados 30 minutos após. Grupos de animais - controle
negativo (utilizando o veículo no qual os compostos foram dissolvidos) e positivo
(utilizando o fármaco de referência, dependendo do protocolo) foram utilizados.
Os ensaios foram realizados no Laboratório de Farmacologia da UNIVALI, por
equipe coordenada pela Professora Márcia Maria de Souza.
4.2.1.2 Avaliação do efeito dos compostos sobre a deambulação dos animais
através do modelo campo aberto (MCA)
O aparato utilizado para os experimentos com os camundongos foi
confeccionado em madeira 30 X 30 X 15 cm com a frente de vidro para melhor
visualizar os animais. O interior do aparato é subdividido em 9 quadrantes.
O teste consiste na colocação do animal em estudo no aparato sendo a fuga
evitada pelas paredes circundantes. Durante a sessão de teste foi registrado o
número de rearings (levantamento do corpo sob as patas traseiras para exploração
do ambiente) bem como o número de crossing (cruzamento dos quadrantes).
Os animais foram tratados com os compostos (10 mg/Kg), e veículo e após 30
minutos foram avaliados no campo aberto para observação dos parâmetros
descritos anteriormente (TOLARDO et al., 2010).
4.2.1.3 Avaliação do efeito hipnótico dos compostos através do teste do sono
induzido por barbitúrico (SIB)
41
O teste foi conduzido conforme descrito por Tolardo e colaboradores (2010).
Os animais foram tratados com os compostos intraperitonealmente (10mg/Kg),
lorazepam (2,0 mg/Kg), e veículo e, 30 minutos após foi administrado o pentobarbital
sódico (50 mg/Kg) pela mesma via. Imediatamente após aplicação do pentobarbital,
os animais foram colocados sob funis de vidro e foi cronometrada a latência para o
sono, bem como o tempo total de sono, representado respectivamente pela perda e
posterior recuperação do reflexo postural.
4.2.1.4 Avaliação do efeito anticonvulsivante dos compostos através do
modelo da convulsão induzida por pentilenotetrazol (TPTZ)
Para esse teste os procedimentos foram realizados conforme descrito por
Holzemann e colaboradores (HOLZMANN et al., 2011).
Os animais foram pré-tratados intraperitonealmente com os compostos
(10mg/kg) e fenobarbital (50mg/kg), 30 minutos antes da indução da crise
convulsiva. Após esse tempo receberam PTZ (80 mg/kg, i.p.) sendo imediatamente
transferidos para um recipiente de contenção de vidro, onde foi cronometrado o
tempo de latência para o aparecimento da primeira crise convulsiva durante 60
minutos, o número de crises, bem como o número de óbitos até 24 horas após a
aplicação do PTZ (TOLARDO et al., 2010).
4.2.1.5 Avaliação do efeito nootrópico dos compostos através do - teste de
memória- modelo da esquiva inibitória
A tarefa de esquiva inibitória é um dos modelos mais utilizados no estudo da
memória, e/ou patologias experimentais que possuem como sintomas déficits de
memória. O teste consiste em inibir a exploração do ambiente pelo animal através da
aplicação de choques de pequena intensidade.
42
O aparelho é uma caixa medindo 50 cm de comprimento, 25 de largura e 25
de altura automatizada (INSIGTH). Parte do chão do aparelho possui grade com
barras de bronze, com 1 mm de diâmetro, com espaço de 1 cm. Inicialmente o
animal é treinado. No procedimento de treino, coloca-se o mesmo sobre a
plataforma e mede-se o tempo de latência para a descida da mesma. Quando isso
ocorre o animal começa a levar choques (0,4 mA°) por um período de 2 s e, 24
horas depois seguem-se os testes.
Durante a sessão de teste há a omissão dos choques e os animais são
observados quanto à esquiva do choque. O aprendizado consiste em o animal não
descer da plataforma. Para o estudo dos efeitos dos tratamentos com os compostos
sobre a consolidação da memória de animais, os mesmos foram tratados (10mg/kg)
30 minutos após treino (WOLLMANN, 2011).
4.2.1.6 Avaliação do efeito Ansiolítico dos compostos através do modelo de
ansiedade, teste de labirinto em cruz elevada (LCE)
Os procedimentos experimentais foram conduzidos conforme descrito
anteriormente (HOLZMANN et al., 2011; FILE; WARDILL, 1975)
O LCE para camundongos consiste de dois braços abertos (30 X 5 X 25 cm) e
dois fechados (30 X 5 X 25 cm) em forma de cruz grega, os braços são conectados
por uma área central (5 X 5 cm), as paredes podem ser de acrílico transparente e
LCE deve estar a uma altura de 45 cm do chão.
Os animais foram tratados com os compostos (10mg/kg), diazepam
(0,75mg/kg) e/ou veículo. Decorridos 30 minutos de cada tratamento, foram
transferidos ao LCE e, durante 5 minutos foi registrado a frequência e o tempo de
permanência dos animais nos braços fechados e abertos.
4.2.1.7 Avaliação do efeito antidepressivo - Modelo de depressão-teste do nado
forçado (TNF)
43
Os procedimentos foram realizados segundo descrição de Tolardo e
colaboradores (2010).
O método consiste em colocar os animais em uma cuba de vidro contendo
água à temperatura de 25ºC, de modo que por mais que se esforcem, não consigam
fugir. O parâmetro observado é o tempo de imobilidade dos animais adquirido após o
esforço desprendido para sair do tanque.
O animal é considerado imóvel quando se movimenta somente para evitar o
afundamento. Esse comportamento indica um estado de desesperança do animal,
após ter aprendido que a fuga é impossível, com o qual é feita a uma analogia com o
estado de anedonia dos pacientes depressivos.
Num primeiro experimento, os animais foram tratados com todos os
compostos (10mg/kg) e os controles positivo (fluoxetina, 10mg/kg) e negativo
(veículo e, 30 minutos após foram avaliados durante 6 minutos o tempo de
imobilidade dos mesmos. Num segundo experimento foi feita uma curva doseresposta com o compostos B6 nas doses de 1, 10 e 30mg/kg, i.p. e após 30 minutos
foram submetidos ao teste do nado forçado, para a escolha da dose ideal para os
experimentos de investigação do mecanismos de ação antidepressiva do composto .
4.2.2 Avaliação do mecanismo de ação da propriedade antidepressiva do
composto B6
Dentre os compostos avaliados, o derivado B6 apresentou os resultados mais
significativos e, portanto, foi selecionado para dar seguimento aos testes de
avaliação do mecanismo de ação da propriedade antidepressiva.
4.2.2.1 Avaliação da participação do sistema serotonérgico
Para investigação da participação dos receptores serotonérgicos 5HT1A,
5HT2A/C e 5HT3. Os animais foram respectivamente pré-tratados com os
antagonistas: NAN-190 (0,5mg/kg, i.p.), Ketanserina (5,0mg/kg, i.p.) e Ondansetron
44
(0,3mg/kg, i.p.) e 15 minutos depois foram tratados com o composto B6 (10mg/kg,
i.p.). Decorrido 30 minutos do tratamento com o composto, os animais foram
submetidos ao teste do nado forçado (GONÇALVES et al., 2012).
4.2.2.2 Avaliação da participação do sistema dopaminérgico
Com o objetivo de avaliar a influência do sistema dopaminérgico no
mecanismo da ação antidepressiva do composto B6, os animais foram pré-tratados
com Haloperidol (1mg/kg, i.p.) antagonista não seletivo dos receptores de dopamina;
SCH23390 (0,5mg/kg, i.p.), antagonista D1 seletivo e Pimozida (0,5mg/kg, i.p.),
antagonista D2 seletivo e 15 minutos depois foram tratados com o composto BRCB6
(10mg/kg, i.p.). Após 30 minutos do tratamento com o composto os animais foram
submetidos ao teste do nado forçado (WANG et al., 2009).
4.2.2.3 Avaliação da participação do sistema noradrenérgico
Em ordem para investigar a influencia do sistema adrenérgico no mecanismo
de ação da propriedade antidepressiva do composto B6, os animais foram prétratados com Prazosin (1mg/kg, i.p.) antagonista dos receptores noradrenérgicos α1
e Yoimbina (1mg/kg, i.p) antagonista seletivo dos receptores α2. Após 30 minutos
do tratamento com o composto os animais foram submetidos ao teste do nado
forçado (GONÇALVES et al., 2012).
4.2.3 Análise estatística
Para os testes paramétricos (LCE, TNF, SIB, MCA e TPTZ) os dados obtidos
foram apresentados com médias seguidas pelos respectivos erro padrão médio
(EMP), e os dados foram submetidos à análises de variância (ANOVA), quando
45
necessários, foram seguidos de teste de múltipla comparação a partir dos modelos
pos hoc de Dunnett, Bonferroni e Newman-Keuls utilizando o software GraphPad
PRISM®. Para testes não paramétricos (TEI) os dados foram apresentados como
medianas seguidas de intervalos interquatil. Foram seguidos de teste de múltipla
comparação a partir do modelo post hoc de kruskall Wallis e test de Duns, utilizando
o software GraphPad PRISM®. Em ambos os casos foram considerados
estatisticamente significantes os valores de p menor do que 0,05 (p < 0,05).
4.2.4 Avaliação da atividade antinociceptiva
4.2.4.1 Animais
Para os experimentos foram utilizados camundongos Swiss machos ou
fêmeas pesando entre 25 a 35 gramas, aclimatados a temperatura de 22 ± 2 °C com
ciclo claro/escuro de 12 horas mantidos no biotério central da UNIVALI, tratados com
água e ração “ad libitum”. Os animais permaneceram no ambiente do teste pelo
menos 1 h antes da realização dos experimentos para se adaptarem.
Considerando esses aspectos éticos, os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical ou câmara de CO2, a fim de evitar ao máximo o sofrimento
desnecessário. Todos os experimentos foram aprovados pela Comissão de Ética em
Pesquisa da UNIVALI.
4.2.4.2 Modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
Os animais receberam, intraperitonealmente (i.p.), ácido acético (0,6 % (v/v),
dissolvido em NaCl 0,9% (p/v) previamente tamponado em pH 7,4 numa dose de
0,10 mL/10 g de peso, de acordo com método descrito anteriormente (MANJAVACHI
et al., 2009). Os animais foram tratados com diferentes doses (0,1 mg/ kg, 1 mg/ kg
e 10 mg/ kg) de composto (B1, B2, B3, B4 e B6) ou veículo (10 mL/ kg, 1% de
46
Tween 80 em solução de NaCl 0,9%), uma hora antes da injeção de ácido acético.
Quantificaram-se as contorções cumulativamente durante 20 minutos e o indicativo
de antinocicepção foi a redução da resposta nociceptiva à contorção, em relação ao
grupo controle.
Basicamente as contorções abdominais consistem na contração da
musculatura abdominal juntamente com a extensão de uma das patas posteriores. A
partir deste experimento foi calculada a DI50 de todos compostos avaliados.
4.2.4.3 Modelo de dor induzida pela formalina
Os camundongos receberam via intraplantar, na pata posterior direita, 20 µL
de solução formalina a 2,5 % (v/v), e foram imediatamente colocados sob um funil de
vidro invertido ao lado de um espelho para auxiliar na observação. Foi registrada,
durante os 5 minutos iniciais, a dor de origem neurogênica, expressa pelo tempo
gasto (latência) com o comportamento de lamber ou morder a pata injetada.
Decorridos 15 minutos ocorreu o início da segunda fase do processo
doloroso, na qual, foi observada a dor inflamatória durante 15 minutos (HUNSKAAR;
FASMER; HOLE, 1985). No grupo controle realizou-se a injeção intraplantar de
solução salina.
4.2.4.4 Modelo de dor induzida pela capsaicina
Durante o teste os animais inicialmente passaram por um período de
adaptação de 20 minutos (sob um funil de vidro). Após este período os animais
foram tratados intraperitonealmente com diferentes doses (0.1, 1 e 10 mg/ kg) de
composto (B1, B2, B3, B4 e B6) ou salina (10mL/ kg) 30 minutos antes da
administração da capsaicina.
Os animais receberam pela via intraplantar 20 µL de capsaicina (1,6 µg / pata)
na pata posterior direita. Em seguida, os animais foram novamente colocados sob o
funil de vidro e então foi cronometrado o tempo em que permaneceram mordendo ou
47
lambendo a pata injetada por um período de 5 minutos, sendo este o indicativo de
dor (SAKURADA et al., 1992).
4.2.4.5 Modelo de dor induzida pelo glutamato
Com o intuito de observar a possível interação dos compostos sintetizados
com o sistema glutamatérgico, foi investigado se estes compostos antagonizam ou
não a dor induzida pelo glutamato. O procedimento utilizado foi similar ao descrito
anteriormente (BEIRITH et al., 2002).
Após este período os animais foram tratados intraperitonealmente com
diferentes doses (0.1, 1 e 10 mg/ kg) dos compostos (B1, B2, B3, B4 e B6) ou salina
(10mL/ kg) 30 minutos antes da administração do glutamato.
Um volume de 20 µL de solução de glutamato (30 µmol/pata), feita em salina
tamponada com fosfato (PBS, composição mol/L: NaCl 137, KCl 2,7 e tampão
fosfato 10), foi injetada pela via intraplantar na pata posterior direita.
Em seguida, os animais foram colocados individualmente em funis de vidro de
20 cm de diâmetro e observados por 15 minutos. O tempo gasto em lamber ou
morder a pata injetada foi cronometrado e considerado indicativo de dor.
4.2.4.6 Hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina
Para a indução de dor inflamatória, os animais receberam uma injeção i.pl. de
50µL carragenina (300µg/ pata) sob a superfície da pata posterior direita
(MANJAVACHI
et
al.,
2009).
Inicialmente,
os
animais
foram
tratados
intraperitonealmente com diferentes doses (0.1, 1 e 10 mg/ kg) do compostos (B1,
B2, B3, B4 e B6) ou veículo (10 mL/ kg, 1% de Tween 80 em solução de NaCl 0,9%
), 30 minutos antes da indução da hipernocicepção. Em seguida, os animais
receberam uma injeção intraplantar de carragenina e foram avaliados quanto à
hipernocicepção mecânica através do filamento de von Frey 0,6g, nos intervalos de
1, 3, 4, 6, 24 e 48 horas após a injeção de carragenina.
48
4.2.5 Análise estatística
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média. A
significância estatística entre os grupos foi analisada por meio do teste t ou por meio
de análise de variância seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o
método de Dunnett, quando apropriado. Valores de p < 0,05 foram considerados
como indicativos de significância. Quando apropriado, os valores de DI50 (dose que
reduz a resposta para 50% em relação ao grupo controle) foram estimados por
interpolação gráfica a partir de experimentos individuais.
49
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Síntese
A chalcona (B31) e a aziridina (B26) utilizadas como base estrutural para
síntese dos diazabiciclos, foram obtidas utilizando-se métodos de síntese
convencionais.
O método de obtenção da chalcona foi a reação de condensação aldólica de
Claisen-Schmidt, cujo mecanismo encontra-se demonstrado na Figura 10.
Figura 10. Esquema do mecanismo de condensação aldólica da (2E)-3-(4-nitrofenil)-1fenilprop-2-en-1-ona (B31).
1ª etapa
O
O
-
OH
-
+
H
O
CH2
-
H2C
CH2
+ H2O
2ª etapa
O
O
H
+
-
O
-
O
CH2
O2N
O2N
3ª etapa
O
O H
H
-
OH
O
O
+
+ OH
-
O 2N
O 2N
4ª etapa
O 2N
OH
O
H
H
OH
+
OH
-
O
O
-
+ OH-
+ H2O
O2N
O 2N
50
A reação de condensação aldólica é uma reação geral para todas as cetonas
e aldeídos com átomos de hidrogênio alfa (α). O mecanismo destas reações de
condensação aldólica ocorre em quatro etapas (CLAISEN; LAPAREDE, 1981;
SCHMIDT, 1981; SMITH; MARCH, 2001). Na primeira delas, ocorre a remoção de
um próton do carbono metílico proveniente da acetofenona, através da catálise
básica promovida pelo NaOH, ocorrendo a formação do íon enolato que se estabiliza
pela ressonância. Na segunda etapa este, age como nucleófilo (carbânion) atacando
o carbono carbonílico do aldeído aromático, produzindo um alcóxido que na terceira
etapa remove um próton de uma molécula de água para formar o aldol. Na quarta, e
última etapa, ocorre a remoção do hidrogênio α devido à sua acidez e em seguida, a
eliminação da hidroxila β formando a dupla ligação. Desta forma, ocorre a
estabilização do produto final pela ressonância das duplas ligações conjugadas
(SANTOS, 2008).
Nesta reação envolvendo o 4-nitrobenzaldeído, verifica-se que o ataque
nucleofílico promovido pelo carbânion formado in situ é facilitado pela alta
eletrofilicidade do carbono carbonílico do benzaldeído, que além de possuir
hibridização sp2, ainda sofre a influência eletronssacadora do grupamento nitro
ligado ao anel aromático.
(2E)-3-(4-nitrofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (B31)
βH
O
αH
NO2
Rendimento: 91%
P.F. (°C): 166,0-167,0.
Fórmula molecular: C15H11NO3
IV (Pastilha de KBr, cm-1)= 1657 (ν, -C=O); 1607 (ν, -C=C); 1517, 1337 (ν, -NO2).
RMN1H (300 MHz,C3D6O, δ ppm): 7,88-7,83 (d, 1H, Hα, J=15 Hz); 7,71-7,66 (d, 1H,
Hβ, J=15 Hz); 7,61-8,32 (m, Ar).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 124,1 – 141,1 (10 C, Ar); 125,8 (Cα); 141,5
(Cβ); 148,1 (C-NO2); 189,2 (C=O).
51
Na espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (1H – RMN) ficam
evidenciados, além dos anéis aromáticos, a insaturação olefínica da nitrochalcona.
Geralmente, os sinais dos prótons (Hα e Hβ) ligados aos carbonos sp2 da
insaturação olefínica ficam sobrepostos aos sinais dos prótons aromáticos, onde os
sinais referentes aos prótons olefínicos se encontram na região de δ=7,88ppm a
δ=7,66ppm.
A constante de acoplamento (J) é o indicativo do posicionamento estérico da
molécula representada no espectro, demonstrando a presença de configuração E ou
Z para o grupo funcional alceno, estando J situado na faixa de 15 a 16 Hz pode-se
concluir que a molécula apresenta-se na isoforma E (CORRÊA, 2008). Através da
análise do espectro de RMN 1H, obtido a partir da nitrochalcona, observamos uma
constante de acoplamento igual a 15, portanto, podemos inferir que o composto
encontra-se na configuração E.
A formação da aziridina (B26) se dá após a obtenção de um intermediário
bromado (B35) da chalcona inicial (B31), conforme ilustrado no esquema da Figura
11. O tratamento do dibrometo com uma solução saturada de amônia em etanol
inicia uma série de três reações sequenciais que conduzem finalmente à formação in
situ da aziridina através dos intermediários (a) e (b), seguido por uma substituição
nucleofílica intramolecular (KIYANI et al., 2009).
Figura 11. Esquema do mecanismo de obtenção da [3-(4-nitrofenil)aziridina-2-il](fenil)metanona (B26)
O
Br H O
O
β
Br2
CHCl 3
O 2N
α
NH4OH
H
O 2N
(B31)
Br
EtOH
Br
O 2N
(B35)
O 2N
(a)
O 2N
O
H
H
O
H
N
H
(B26)
Br
H2N
H
(b)
52
O intermediário insaturado (a) é formado através de uma reação de
eliminação E2, sendo esta promovida pela base forte presente no meio reacional,
dando origem à porção alceno, a qual posteriormente torna-se alvo de uma reação
de adição de Michael (b), caracterizada pela adição de um nucleófilo (doador de
Michael) a uma olefina ativada (aceptor de Michael). O resultado da condensação
destas duas espécies é um aduto de Michael. As espécies aceptoras têm como sítio
susceptível ao ataque nucleofílico a posição β a um grupo retirador de elétrons,
condição observada na ilustração acima (MATTOS; MARZORATI, 1998; NACIUK,
2010).
O mecanismo desta reação de adição de Michael envolve basicamente três
etapas, iniciando pela abstração de um próton do doador pela base, formando um
enolato, em seguida, ocorre o ataque nucleofílico ao carbono β do aceptor,
originando primeiramente um complexo ativado e em seguida dando lugar a um
intermediário aniônico. Finalmente, ocorre a abstração de um próton do meio
reacional pelo intermediário aniônico, formando o aduto de Michael. Esta reação é
particularmente interessante devido à sua simplicidade experimental, além de ser
uma poderosa ferramenta na formação de ligações C – C. A aziridina foi obtida num
tempo reacional de aproximadamente 48 horas, sendo que a reação não demanda
maiores cuidados de acompanhamento, como o uso de CCD.
2,3-dibromo-3-(4-nitrofenil)-1-fenilpropan-1-ona (B35)
O a Br
H
H
Br b
NO2
Rendimento 98%
P.F. (°C): 131,0-132,0.
Fórmula molecular: C15H11Br2NO3 (413,06 g/mol).
RMN1H (300 MHz,C3D6O, δ ppm): 8,35-8,27 (m, 4H, Ar); 8,17-8,08 (q, 2H, Ar); 7,797,77 (t, 1H, Ar); 7,66-7,61 (t, 2H, Ar); 6,61-6,57 (d, 1H, Ha, J=12 Hz); 5,93-5,89 (d,
1H, Hb, J=12 Hz).
53
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 124,5 (Ca), 129,7 (Cb), 195,2 (-C=O), 130,8
(-C-NO2)
[3-(4-nitrofenil)aziridina-2-il](fenil)-metanona (B26)
NO2
O
H
a
b
H
N
H
c
Rendimento: 65,18%
P.F. (°C): 142,0-143,0.
Fórmula molecular: C15H12N2O3 (268,27 g/mol).
RMN1H (300 MHz, CDCl3, δ ppm): 8,23 (d, 2H, Ar); 8,01 (d, 2H, Ar); 7,67-7,49 (m,
5H, Ar); 3,54 (d, 1H, Hb); 3,29 (d, 1H, Ha); 2,78 (t, 1H, Hc).
RMN13C (75,47 MHz, CDCl3, δ ppm): 194,7 (C=O), 147,5 (C4’), 145,7 (Ca), 135,5
(Cb)
Após a obtenção da aziridina procede-se a síntese dos derivados
diazabicíclicos, que mecanisticamente acredita-se que ocorra através da adição do
grupamento amônia na carbonila da aziridina (Figura12 - caminho a) ou,
alternativamente, na carbonila do aldeído ou cetona, para formação da aldimina
(Figura 12 - caminho b), para posterior desidratação e obtenção do produto desejado
(MAHMOODI et al., 2007).
54
Figura 12. Esquema reacional de obtenção dos derivados 1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno
(B1-B34)
O 2N
O
H
H
NH4Br
NH4OOCCH 3
NH
C
(caminho b)
R
1
R
NH4Br
N
H
NH4OOCCH 3
O 2N
2
HN
H
H
O 2N
O
N
H
H
H
N
H
NH
R
1
R
R
2
1
O
C
(caminho a)
R
2
O 2N
H
O 2N
H
N
H
H
O
-
N
R
H
+
H
2
R
N
R
1
NH
1
R
2
OH
-H2O
O 2N
O2N
H
H
HO
H
H
-H2O
N
N
R
H
2
R
N
1
R
1
N
R
2
Os diazabiciclos derivados de aldeídos e cetonas alifáticas foram obtidos
através do método convencional, sendo o tempo reacional médio de 24 horas. Em
contrapartida, todos os derivados de acetofenonas foram sintetizados por microondas em função da impossibilidade de se obter a formação de produto pelo método
comum. As reações assistidas por micro-ondas resultaram em bons rendimentos,
assim como as reações pelo método tradicional, porém em tempos reacionais mais
curtos, sendo o tempo reacional máximo de 3 horas. Analisando este fato, podemos
inferir que fatores eletrônicos e estéricos parecem ser determinantes no progresso
das reações que envolvem acetofenonas. Foram sintetizados 6 compostos
diazabicíclicos derivados de cetonas, sendo 3 inéditos, conforme demonstrado na
Tabela 3.
55
Tabela 3 – Dados analíticos dos diazabiciclos derivados de diferentes cetonas
H
H
N
O 2N
Substituinte
-R
H3C
CH3
Cl
CH3
CH3
Cl
CH3
R
N
CH3
Rend.
(%)
64
68
90
P. F. (°C)
Inédito
B7
B22
B25
Massa Molecular
(g/mol)
321,37
341,79
307,34
128,3-NI
144,8-146,8
161,2-NI
I
-
B29
369,41
81
188,6-NI
-
B30
438,30
70
190,8-191,5
I
B32
403,86
76
167,3-NI
I
Código
CH3
Cl
CH3
Cl
Legenda: Rend.: rendimento da reação; P.F.: ponto de fusão; NI: sofre carbonização
I: composto inédito.
Quanto aos diazabiciclos derivados de aldeídos, foram obtidos 24 compostos,
dos quais 12 são inéditos, conforme demonstrado na Tabela 4. A maioria das
reações apresentaram bons rendimentos (acima de 60%), porém observa-se que, a
exemplo
das
acetofenonas,
fatores
estéricos
(tamanho
dos
grupamentos
substituintes) e/ou eletrônicos (sistema de conjugação envolvendo o anel aromático)
parecem interferir no rendimento reacional, como é o caso dos derivados B18, B33 e
B34, que apresentaram rendimento inferior.
56
Tabela 4 – Dados analíticos dos diazabiciclos derivados de diferentes aldeídos
H
H
N
O 2N
Substituinte
-R
R
N
H
Código
Massa Molecular
(g/mol)
Rend.
(%)
P. F. (°C)
Inédito
B1
355,39
81
146,0-148,0
-
B2
385,42
78
138,0-140,0
-
B3
424,28
86
146,0-147,0
I
B4
389,83
90
147,0-149,0
-
B5
400,38
90
173,0-174,0
-
B6
369,42
54
141,0-143,0
-
B8
400,38
85
170,0-NI
I
B9
400,38
79
189,7-NI
I
B10
371,38
72
194,1-195,4
-
B11
371,38
65
141,5-143,2
-
CH3
CH
H3C
O
CH3
Cl
Cl
CH3
Cl
CH3
O 2N
CH3
H3C
NO2
CH3
O 2N
CH3
CH3
HO
OH
CH3
57
Continua
CH3
O
CH3
H3C
B12
385,41
59
131,7-NI
I
B13
385,41
74
163,2-NI
I
B14
387,38
88
173,6-NI
I
B15
398,45
79
143,0-145,0
-
B16
399,40
88
157,5-158,3
I
B17
361,41
73
147,6-148,8
-
B18
381,42
44
108,3-NI
-
B19
434,28
89
157,2-158,9
I
B20
346,33
55
153,4-NI
I
B21
362,40
68
142,2-142,8
I
B23
B24
293,32
279,30
72
60
127,8-NI
165,7-NI
-
B33
455,89
56
194,1-195,9
I
B34
490,33
46
152,3-153,8
I
O
CH3
HO
CH3
HO
CH
H3C
N
CH3
CH3
O
O
S
CH3
CH
CH3
Br
CH3
N
O
CH3
S
N
CH3
H
O
C
Cl
Cl
O
Cl
C
Legenda: Rend.: rendimento da reação; P.F.: ponto de fusão; NI: sofre carbonização;
I: composto inédito.
58
Os produtos foram confirmados através da análise de seus dados físicoquímicos e espectrais. Os dados provenientes das análises espectroscópicas de IV e
RMN, assim como de UV-visível, estão descritos a seguir, junto da estrutura de cada
derivado, no entanto, o derivado (B2) foi selecionado aleatoriamente, no intuito de
caracterizar o perfil dos espectros obtidos (Figura 13).
Figura 13. Estrutura química do composto B2.
H
H
N
O 2N
N
H
O
CH3
As bandas características de absorção na região do infra-vermelho (IV) dos
compostos diazabicíclicos e seu
precursor aziridínico foram determinadas pelo
método de reflectância difusa – DRIFTS, utilizando KBr pulverizado de grau
espectroscópico. No espectro de IV dos produtos finais, a ausência da absorção
C=O relacionada com as cetonas e aldeídos precursores e do estiramento referente
a ligação N – H proveniente da cetoaziridina, em conjunto com o aparecimento de
uma nova absorção da banda C=N na região de 1597-1605 cm-1 indicam que a
porção 1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno foi formada (MAHMOODI et al., 2007;
KIYANI et al., 2013).
No espectro de IV de (B2) (Figura 14) verifica-se a presença de deformações
axiais situadas em 1574, 1509 e 1348 cm-1, referentes à ligação N=O, a presença de
uma deformação axial em 1602 cm-1 e uma deformação angular em 1449 cm-1 que
caracterizam a presença de ligação C=N e Csp3-H do alcano presente no substituinte
metoxi do anel aromático, respectivamente (SILVERSTEIN, 1994).
59
Figura 14. Espectro de IV de B2 (DRIFTS, cm-1).
T(%)
90
2834
60
1574
1449
1045
1602
1247
30
1509
3000
2500
2000
1348
1500
1000
-1
λ (cm )
No espectro de RMN de H1 e C13 podemos observar um conjunto de sinais
característicos atribuídos à porção 1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno. Os espectros de
RMN-H1 do composto B2 indicam uma mistura de dois fotoisômeros com proporção
estável desconhecida (formas fechada e aberta), entretanto, ao analisarmos a razão
entre a integral de certos picos, podemos deduzir que, em função da fraca
intensidade de luz ambiente, a forma fechada ocorre em maior proporção. Mudanças
características são observadas nos seus Ha, Hb e Hc quando analisamos os
espectros (MAHMOODI et al., 2007; KIYANI et al., 2013).
Todos os compostos, exceto B8, B18, B24, B25, B29, B30 e B32, apresentam
sinais que demonstram a presença de dois fotoisômeros, os quais se formam a partir
da clivagem heterolítica do anel de três membros sob irradiação com fonte de luz de
comprimento de onda apropriado (254 nm). A fotoisomerização destes compostos
fotocrômicos ocorre através da formação de uma espécie zwitteriônica, dando
origem a um ileto de imina duplamente carregado, conforme retratado na Figura 15.
60
Figura 15. Esquema de formação da espécie zwiteriônica. R e R1: quaisquer substituintes
hidrocarbônicos.
O 2N
H
6
H
5
H
1N
6
2
R
-5
H
4
N1
3N
2
3N
R
4
+
R
1
R
1
O 2N
B
B'
(forma fechada)
(forma aberta)
Conforme demonstrado na Figura 16, os sinais de Hb e Hb’ do anel imidazol
aparecem em δ=4,03 ppm e os sinais de Hc e Hc’ ocorrem em δ=6,67 e δ=6,24 ppm,
respectivamente. O sinal de Ha aparece em δ=2,63 ppm para B2 (forma fechada) e
em δ=2,98 ppm para B2’ (forma aberta), seu deslocamento químico ocorre num
campo mais alto quando comparado com Hb e Hc em razão do próton Ha, localizado
acima do plano do anel imidazol, ser protegido por um efeito anisotrópico. Todos os
prótons aromáticos de B2 foram observados na região δ=6,88 ppm - δ=8,24 ppm. Os
sinais correspondentes dos outros compostos semelhantes apareceram na mesma
região do espectro de RMN1H.
Figura 16. Espectro de RMN1H de B2 (C3D6O, 300 MHz).
Hb
Hb'
0.9
+
N
N
a' H
Hc
N
H c'
0.6
O
B2
CH3
B2'
0.1
b
b'
c'
a'
2.63
4.03
c
6.24
6.24
6.67
6.96
6.91
6.88
7.56
7.52
7.45
7.42
7.59
7.55
7.70
0.2
8.24
8.21 8.18
8.15
8.07
8.03 8.05
0.4
0.3
CH3
2.99
2.98
O
0.5
água
0.7
Normalized Intensity
-
N
0.8
3.80
Ha
1.0
3.76
O2N
O2N
A903659_001.esp
a
0
0.03
8.0
7.5
7.0
0.01
6.5
0.04
6.0
5.5
5.0
Chemical Shift (ppm)
4.5
4.0
0.02
3.5
3.0
0.03
2.5
61
O espectro de RMN13C de B2 (Figura 17) revelou 22 sinais distintos, de
acordo com as estruturas sugeridas. Percebe-se a presença de um sinal em δ=96,2
ppm e δ=97,6 ppm indicando a presença do carbono na posição C2 das formas
fechada e aberta, sinais em δ=58,1; δ=57,2 ppm e δ=41,7; δ=48,0 ppm indicando a
presença dos átomos de carbono do anel aziridina, nas posições 5 e 6,
respectivamente. A ressonância C=N apareceu a δ=171,2 ppm e δ=169,8 ppm
(KIYANI et al., 2013). Os compostos B8, B18, B24, B25, B29, B30 e B32 possuem
sinais que pertencem a apenas um estereoisômero, fato que pode estar relacionado
com a baixa intensidade de luz sobre a amostra durante a obtenção dos espectros,
levando a predominância da forma fechada.
Figura 17. Espectro de RMN13C de B2 (C3D6O, 75 MHz).
O2N
O2N
H
H
129.39
129.24
6
1N
144
espectros
136
de
6
H
O
CH3
O
B2
4
2 3N
absorção
112
104
Chemical Shift (ppm)
96
eletrônica
88
80
72
(UV-visível)
64
dos
56
48
41.74
58.18
97.61
96.20
120
B2'
CH3
114.28
128
+
N1
48.04
123.93
152
-5
3N
H
132.16
Os
160
147.93
147.41
147.10
160.21
159.98
171.28
168
2
H
0.10
0.05
H
4
134.79
132.71
132.02
Normalized Intensity
128.35
0.15
5
57.20
55.26
A903659_013.esp
40
compostos
diazabiciclicos foram realizados em etanol após irradiação a 254 nm a temperatura
ambiente. Antes da irradiação de luz UV o composto B2 apresentava uma discreta
banda de absorção a 280nm (Figura 18). Quando o mesmo foi irradiado, a
intensidade de absorção a 280nm aumentou gradualmente e uma nova banda de
absorção a 415nm apareceu.
62
Figura 18. Espectro de absorção UV-Vis de B2.
Visualmente também foi possível perceber a ocorrência do fonômeno
fotocrômico através da observação da mudança de coloração apresentada pela
solução antes e após ser irradiada (Figura 19).
Figura 19. Composto B2 – (A): antes da irradiação UV; (B): após 15 minutos de irradiação.
63
Através deste experimento percebe-se que a porção aziridina é afetada pela
irradiação UV e que a estabilização do ileto de imina é influenciada pelo efeito e
posição do grupamento substituinte presente no C2 do anel imidazol, podendo assim
ser explicada a variação de tonalidade na coloração exibida pelos derivados quando
expostos à luz, alguns apresentando coloração azul royal intensa e outros uma leve
cor verde-azulada (MAHMOODI et al., 2013).
Em diferentes tempos de irradiação, entre 0-15 minutos, um ponto isosbéstico
a 237nm foi observado no composto B15 (Figura 20), indicando a ocorrência de uma
transformação fotoquímica pura, fato que confirma a existência de apenas dois
isômeros (KIYANI et al., 2009).
Figura 20. Espectro de absorção UV-Vis de B15.
O comportamento fotocrômico dos derivados 1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno
baseia-se na abertura reversível do anel aziridina, ocorrendo o rompimento da
ligação C – C, estimulado pela incidência de luz UV, que converte uma forma incolor
(anel fechado) em uma forma colorida (anel aberto). Todos os compostos analisados
através da espectrometria de UV-visível apresentaram reação fotocrômica
64
característica, inclusive os compostos que apresentaram apenas um estereisômero
nos espectros de RMN13C e 1H (B8, B18, B24, B25, B29, B30 e B32). Como
esperado, a contínua exposição dos compostos à luz UV resultou no aumento da
intensidade da banda de absorção na região do visível, enquanto na região do
ultravioleta foi diminuída. A mudança de cor no estado sólido foi observada a vista
desarmada quando os compostos foram expostos à luz ambiente ou luz solar (Figura
21) (KIYANI et al., 2013).
Figura 21. Composto B25 – (A): antes da exposição à luz; (B): após 1 minuto de exposição.
6-(4-nitrofenil)-2,4-difenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B1)
a
H
5
6
4
1N
2
O 2N
O2N
b
H
H b'
3N
H
c
Rendimento: 81%
P.F. (°C): 146,0-148,0
Fórmula molecular: C22H17N3O2
6
a'H
-5
+
N
1
c' H
4
2 3N
65
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 3054, 3031 (C-H), 1598 (C=N), 1574, 1514 (N=O), 1448
(C=C, Ar) 1346 (N=O).
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 6,74 (s,1H, Hc), 6,30 (d, 1H, Hc’), 4,06 (dd, 1H,
Hb), 4,07 (t, 1H, Hb’), 3,03 (d, 1H, Ha’), 2,62 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 170,24 e 171,60 (C4), 96,61 e 97,99 (C2),
57,35 e 58,24 (C5), 42,04 e 48,10 (C6).
2-(4-metoxifenil)-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B2)
a
H
5
6
1N
O 2N
O2N
b
H
H b'
4
2 3N
6
cH
a'H
+
N
1
5
4
2 3N
c' H
O
H3C
O
H3C
Rendimento: 78%
P.F. (°C): 138,0-140,0
Fórmula molecular: C23H19N3O3
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2834 (-C-H), 1602 (ν -C=N), 1574 (ν -N=O), 1509 (νass. N=O), 1449 (δass. -Csp3-H), 1348 (νsim. -N=O), 1247 (νass. -C-O-C) e 1045 (νsim. -C-OC).
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 6,67 (s, 1H, Hc), 6,24 (d, 1H, Hc’), 4,03 (t, 2H, Hb
e Hb’), 3,80 e 3,76 (s, 3H, O-CH3), 2,98 (d, 1H, Ha’), 2,63 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 171,3 e 169,8 (C4), 96,2 e 97,6 (C2), 58,7 e
57,2 (C5), 41,7 e 48,0 (C6).
66
2-(3,4-diclorofenil)-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B3)
O2N
O 2N
b
H
Ha
6
H b'
5 4
1N
2 3N
cH
+
N
1
a'H
4
2 3N
c' H
1'"
Cl
-5
6
Cl
Cl
Cl
Rendimento: 86%
P.F. (°C): 146,0-147,0
Fórmula molecular: C22H15Cl2N3O2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 3062 e 2853 (C-H), 1599 (C=N), 1574, 1513 (N=O), 1447
(C=C, Ar), 1345 (N=O).
RMN1H (300 MHz, CDCl3, δ ppm): 6,69 (s, 1H, Hc), 6,20 (d, 1H, Hc’), 3,78 (t, 1H,
Hb’) 3,75 (t, 1H, Hb), 2,80 (d, 1H, Ha’), 2,49 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, CDCl3, δ ppm): 170,4 e 171,2 (C4), 94,8 e 96,0 (C2), 56,9 e
57,9 (C5), 41,8 e 47,8 (C6).
2-(4-clorofenil)-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B4)
O2N
a
H
b
H
6 5
1N
O 2N
H b'
4
6
2 3N
a'H
cH
-5
+
N
1
4
2 3N
c' H
Cl
Cl
Rendimento: 90%
P.F. (°C): 147,0-149,0
Fórmula molecular: C22H16ClN3O2
67
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 1602 (C=N), 1574, 1517 (N=O), 1448 (C=C, Ar), 1347
(N=O).
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 6,72 (s, 1H, Hc), 6,32 (d, 1H, Hc’), 4,10 (t, 1H,
Hb’) 4,08 (t, 1H, Hb), 3,05 (d, 1H, Ha’), 2,63 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 170,6 e 171,9 (C4), 95,9 e 97,0 (C2), 57,4 e
58,3 (C5), 42,1 e 48,1 (C6).
2,6-bis(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B5)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
a'H
+
N
1
5
4
2 3N
c' H
NO2
NO2
Rendimento: 90%
P.F. (°C): 173,0-174,0
Fórmula molecular: C22H16N4O4
RMN1H (300 MHz, CDCl3, δ ppm): 6,81 (s, 1H, Hc), 6,33 (d, 1H, Hc’), 3,82 (t, 1H,
Hb’), 3,77 (t, 1H, Hb), 2,87 (d, 1H, Ha’), 2,37 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, CDCl3, δ ppm): 170,7 e 171,4 (C4), 95,3 e 96,2 (C2), 57,0 e
57,9 (C5), 42,05 e 47,8 (C6).
68
2-(4-metilfenil)-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B6)
O2N
a
H
O 2N
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
+
N
1
a'H
5
4
2 3N
c' H
CH3
CH3
Rendimento: 54%
P.F. (°C): 141,0-143,0
Fórmula molecular: C23H19N3O2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 1601 (C=N), 1574, 1514 (N=O), 1448 (C=C, Ar), 1347
(N=O).
RMN1H (300 MHz, CDCl3, δ ppm): 6,76 (s, 1H, Hc), 6,23 (d, 1H, Hc’), 3,74 (t, 1H,
Hb’) 3,72 (t, 1H, Hb), 2,37 e 2,33 (s, 3H, -CH3), 2,74 (d, 1H, Ha’), 2,50 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, CDCl3, δ ppm): 169,5 e 170,3 (C4), 96,0 e 97,4 (C2), 56,8 e
57,7 (C5), 41,4 e 47,9 (C6).
2-etil-2-metil-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B7)
O2N
a
H
O 2N
b
H
6
1'
1N
H3C
H b'
5 4
6
2 3N
CH3
a'H
+
N
1
5
4
2 3N
H3C
CH3
Rendimento: 64%
P.F. (°C): 128,3
Fórmula molecular: C19H19N3O2
69
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 3,86 (d, 1H, Hb’) 3,81 (d, 1H, Hb), 1,80 (m, 2H, CH2), 1,50 (d, 3H, -CH3), 1,03 (m, 3H, -CH3).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 167,8 e 168,7 (C4), 98,4 e 99,2 (C2), 56,4 e
57,3 (C5), 37,3 e 43,9 (C6).
2-(2-nitrofenil)-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B8)
a
H
O 2N
6
1N
cH
b
H
5
4
2 3N
NO2
Rendimento: 85%
P.F. (°C): 170,0
Fórmula molecular: C22H16N4O4
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 7,20 (s, 1H, Hc), 4,07 (t, 1H, Hb), 2,55 (s, 1H,
Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 172,8 (C4), 92,5 (C2), 58,0 (C5), 42,3 (C6).
2-(3-nitrofenil)-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B9)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
a'H
+
N
1
5
4
2 3N
c' H
NO2
Rendimento: 79%
P.F. (°C): 189,7
NO2
70
Fórmula molecular: C22H16N4O4
RMN1H (300 MHz, CDCl3, δ ppm): 6,81 (s, 1H, Hc), 6,33 (d, 1H, Hc’), 3,83 (t, 1H,
Hb’) 3,80 (t, 1H, Hb), 2,87 (d, 1H, Ha’), 2,42 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, CDCl3, δ ppm): 170,7 e 171,6 (C4), 95,0 e 96,1 (C2), 57,1 e
58,0 (C5), 41,8 e 47,9 (C6).
4-[6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-en-2-il]fenol (B10)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
a'H
+
N
1
5
4
2 3N
c' H
OH d
OH d'
Rendimento: 72%
P.F. (°C): 194,1-195,4
Fórmula molecular: C22H17N3O3
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 8,45 (s, 2H, Hd e Hd’), 6,65 (s, 1H, Hc), 6,21 (d,
1H, Hc’), 4,03 (t, 1H, Hb’) 4,02 (t, 1H, Hb), 2,63 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 171,3 (C4), 96,5 e 97,9 (C2), 57,3 e 58,3 (C5),
41,9 e 48,2 (C6).
71
2-[6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-em-2-il]fenol (B11)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
N
1
a'H
OH
+
5
4
2 3N
OH
c' H
Rendimento: 65%
P.F. (°C): 141,5-143,2
Fórmula molecular: C22H17N3O3
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 9,28 (s, 2H, Hd), 9,24 (s, 2H, Hd’), 6,76 (s, 1H,
Hc), 6,58 (d, 1H, Hc’), 4,22 (t, 1H, Hb’), 4,19 (t, 1H, Hb), 3,14 (d, 1H, Ha’), 2,74 (s,
1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 170,5 e 172,4 (C4), 94,4 e 94,6 (C2), 57,3 e
57,8 (C5), 43,1 e 48,2 (C6).
2-(3-metoxifenil)-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B12)
O 2N
O 2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
a'H
-5
+
N
1
4
2 3N
c' H
O
CH3
Rendimento: 59%
P.F. (°C): 131,7
Fórmula molecular: C23H19N3O3
O
CH3
72
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 6,70 (s, 1H, Hc), 6,28 (d, 1H, Hc’), 4,05 (q, 2H,
Hb e Hb’), 3,80 e 3,73 (s, 3H, O-CH3), 3,02 (d, 1H, Ha’), 2,64 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 170,3 e 171,6 (C4), 96,6 e 97,9 (C2), 57,4 e
58,3 (C5), 42,3 e 48,2 (C6).
2-(2-metoxifenil)-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B13)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
O
CH3
a'H
+
N
1
c' H
5
4
2 3N
O CH3
Rendimento: 74%
P.F. (°C): 163,2
Fórmula molecular: C23H19N3O3
RMN1H (300 MHz, CDCl3, δ ppm): 6,88 (s, 1H, Hc), 6,64 (d, 1H, Hc’), 3,77 (s, 1H,
Hb’), 3,70 (s, 1H, Hb), 3,93 e 3,90 (s, 3H, O-CH3), 2,80 (d, 1H, Ha’), 2,60 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, CDCl3, δ ppm): 169,7 e 170,9 (C4), 91,4 e 92,3 (C2), 56,8 e
57,0 (C5), 40,5 e 48,1 (C6).
73
4-[6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-en-2-il]benzeno-1,2-diol
(B14)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
-5
+
N
1
a'H
4
2 3N
c' H
OH
OH
OH
OH
Rendimento: 88%
P.F. (°C): 173,6
Fórmula molecular: C22H17N3O4
RMN1H (300 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 6,69 (s, 1H, Hc), 6,56 (d, 1H, Hc’), 4,21 (t, 2H,
Hb’ e Hb), 2,98 (d, 1H, Ha’), 2,58 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 168,7 e 170,2 (C4), 95,0 e 96,4 (C2), 55,7 e
56,9 (C5), 40,7 e 46,7 (C6).
N,N-dimetil-4-[6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-en-2-il]anilina
(B15)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
a'H
-5
+
N
1
4
2 3N
c' H
N
H3C
CH3
N
H3C
Rendimento: 88%
CH3
74
P.F. (°C): 143,0-145,0
Fórmula molecular: C22H22N4O2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 6,63 (s, 1H, Hc), 6,18 (d, 1H, Hc’), 3,99 (t, 2H,
Hb’ e Hb), 3,10 (d, 1H, Ha’), 2,64 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 169,5 e 171,0 (C4), 96,7 e 98,2 (C2), 57,3 e
58,3 (C5), 41,8 e 48,2 (C6).
2-(1,3-benzodioxol-5-il)-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno
(B16)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
a'H
+
N
1
5
4
2 3N
c' H
O
O
O
O
Rendimento: 88%
P.F. (°C): 157,5-158,3
Fórmula molecular: C23H17N3O4
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 6,64 (s, 1H, Hc), 6,22 (d, 1H, Hc’), 4,06 (t, 1H,
Hb’), 4,05 (t, 1H, Hb), 3,00 (d, 1H, Ha’), 2,67 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 170,2 e 171,7 (C4), 96,3 e 97,8 (C2), 57,4 e
58,4 (C5), 42,0 e 48,2 (C6).
75
6-(4-nitrofenil)-4-fenil-2-(tiofen-2-il)-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B17)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
a'H
S
-5
+
N
1
c' H
4
2 3N
S
Rendimento: 73%
P.F. (°C): 147,6-148,8
Fórmula molecular: C20H15N3O2S
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 6,82 (s, 1H, Hc), 6,53 (d, 1H, Hc’), 4,11 (t, 1H,
Hb’), 4,07 (t, 1H, Hb), 3,06 (d, 1H, Ha’), 2,77 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 170,9 e 172,1 (C4), 93,5 e 94,1 (C2), 57,1 e
58,7 (C5), 43,0 e 47,3 (C6).
6-(4-nitrofenil)-4-fenil-2-[(E)-2-feniletil]-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B18)
O 2N
a
H
6
1N
b
H
5
4
2 3N
cH
Rendimento: 44%
P.F. (°C): 108,3
Fórmula molecular: C24H19N3O2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 5,89 (s, 1H, Hc), 4,00 (t, 1H, Hb), 3,39 (d, 1H,
Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 170,3 (C4), 96,8 (C2), 57,0 (C5), 47,7 (C6).
76
2-(4-bromofenil)-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B19)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
-5
+
N
1
a'H
4
2 3N
c' H
Br
Br
Rendimento: 89%
P.F. (°C): 157,2-158,9
Fórmula molecular: C22H16BrN3O2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 6,70 (s, 1H, Hc), 6,31 (d, 1H, Hc’), 4,08 (t, 1H,
Hb), 4,11 (t, 1H, Hb’), 3,06 (d, 1H, Ha’), 2,63 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 170,7 e 172,1 (C4), 96,0 e 97,2 (C2), 57,5 e
58,4 (C5), 42,2 e 48,2 (C6).
6-(4-nitrofenil)-2-(1,3-oxazol-4-il)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B20)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
N
a'H
-5
+
N
1
4
2 3N
c' H
N
O
O
Rendimento: 55%
P.F. (°C): 153,4
Fórmula molecular: C19H14N4O3
RMN1H (300 MHz, CDCl3, δ ppm): 6,61 (s, 1H, Hc), 6,27 (d, 1H, Hc’), 3,80 (t, 1H,
Hb’), 3,79 (t, 1H, Hb), 3,05 (d, 1H, Ha’), 2,78 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, CDCl3, δ ppm): 171,9 (C4), 89,6 e 91,2 (C2), 56,6 e 57,3 (C5),
41,9 e 47,5 (C6).
77
6-(4-nitrofenil)-4-fenil-2-(1,3-tiazol-2-il)-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B21)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
N
1
a'H
N
-5
+
4
2 3N
c' H
S
N
S
Rendimento: 68%
P.F. (°C): 142,2-142,8
Fórmula molecular: C19H14N4O2S
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 6,86 (s, 1H, Hc), 6,62 (d, 1H, Hc’), 4,18 (t, 1H,
Hb’), 4,16 (t, 1H, Hb), 3,20 (d, 1H, Ha’), 3,00 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 171,1 e 173,6 (C4), 94,3 e 95,2 (C2), 57,2 e
58,4 (C5), 43,2 e 48,6 (C6).
2-(clorometil)-2-metil-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno
(B22)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
H3C
Cl
a'H
+
N
1
H3C
5
4
2 3N
Cl
Rendimento: 68%
P.F. (°C): 144,8-146,8
Fórmula molecular: C18H16ClN3O2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 3,95 (t, 1H, Hb’), 3,84 (t, 1H, Hb), 3,16 (d, 1H,
Ha), 2,99 (d, 1H, Ha’).
78
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 170,6 e 171,6 (C4), 97,2 e 98,1 (C2), 56,8 e
58,0 (C5), 43,6 e 48,1 (C6).
2-metil-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B23)
O 2N
O2N
a
H
b
H
6
1N
cH
H b'
5 4
6
2 3N
a'H
CH3
+
N
1
c' H
5
4
2 3N
CH3
Rendimento: 72%
P.F. (°C): 127,8
Fórmula molecular: C17H15N3O2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 5,65 (s, 1H, Hc), 5,61 (d, 1H, Hc’), 3,89 (t, 1H,
Hb’), 3,83 (t, 1H, Hb), 2,89 (s, 1H, Ha), 2,72 (d, 1H, Ha’).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 169,0 e 170,3 (C4), 91,6 e 93,4 (C2), 56,8 e
57,6 (C5), 40,9 e 47,5 (C6).
6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B24)
O 2N
a
H
6
1N
cH
b
H
5
4
2 3N
Hd
Rendimento: 60%
P.F. (°C): 165,7
Fórmula molecular: C16H13N3O2
RMN1H (300 MHz, CDCl3, δ ppm): 5,32 (d, 1H, Hc), 5,23 (dd, 1H, Hd), 3,61 (t, 1H,
Hb), 2,53 (d, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, CDCl3, δ ppm): 170,0 (C4), 86,4 (C2), 56,7 (C5), 46,4 (C6).
79
2,2-dimetil-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B25)
O 2N
a
H
6
1N
H3C
b
H
5 4
2 3N
CH3
Rendimento: 90%
P.F. (°C): 161,2
Fórmula molecular: C18H17N3O2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 3,87 (d, 1H, Hb), 2,86 (d, 1H, Ha), 1,53 (s, 3H, CH3), 1,52 (s, 3H, -CH3).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 168,2 (C4), 96,1 (C2), 56,7 (C5), 43,9 (C6).
2-metil-6-(4-nitrofenil)-2,4-difenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno (B29)
O 2N
a
H
6
1N
b
H
5
4
2 3N
H3C
Rendimento: 81%
P.F. (°C): 188,6
Fórmula molecular: C23H19N3O2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 3,91 (d, 1H, Hb), 3,20 (d, 1H, Ha), 1,82 (s, 3H, CH3)
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 169,2 (C4), 99,2 (C2), 57,1 (C5), 44,4 (C6).
80
2-(3,4-diclorofenil)-2-metil-6-(4-nitrofenil)-,4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3eno (B30)
O 2N
a
H
6
1N
b
H
5
4
2 3N
H3C
Cl
Cl
Rendimento: 70%
P.F. (°C): 190,8-191,5
Fórmula molecular: C23H17Cl2N3O2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 4,12 (d, 1H, Hb), 2,56 (d, 1H, Ha), 1,82 (s, 3H, CH3)
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 169,0 (C4), 97,2 (C2), 55,8 (C5), 43,2 (C6).
2-(4-clorofenil)-2-metil-6-(4-nitrofenil)-,4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno
(B32)
O 2N
a
H
6
1N
b
H
5
4
2 3N
H3C
Cl
Rendimento: 76%
P.F. (°C): 167,3
Fórmula molecular: C23H18Cl1N3O2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 3,94 (d, 1H, Hb), 3,23 (d, 1H, Ha), 1,82 (s, 3H, CH3)
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 169,5 (C4), 98,8 (C2), 57,1 (C5), 44,4 (C6).
81
Com o objetivo de introduzir de diferentes núcleos heterocíclicos na base
molecular dos compostos e baseando-se no interesse da química medicinal na
versátil atividade biológica desempenhada por moléculas que contemplam um
fragmento furano, foram obtidos derivados heterocíclicos utilizando-se adutos de
Meerwein.
O método convencional para síntese de arilfuranos é a arilação, catalisada
por cobre, de furano derivados com sais de arenodiazônio (Figura 22), realizados
pela primeira vez por Meerwein em 1939 (OBUSHAK et al., 2008). Estas reações
foram relatadas principalmente para furanos com substituição em C2, que se
submeteram a arilação na posição C5.
Figura 22. Esquema geral da obtenção dos aldeídos. X: 4-Cl, 3,4-Cl.
+
NH2
N2 Cl
NaNO2, HCl
aldeído
H2O, CuCl2
X
X
O
O
X
H
A etapa inicial do mecanismo desta reação ocorre através da transferência de
elétrons da molécula do substrato (furfural) para o íon diazônio (Figura 23), mediada
pelo cobre(II), conforme a convencional arilação de Meerwein. Como resultado, o
cátion do radical furfural é formado, o que é típico para compostos heterocíclicos.
Alguns compostos heterocíclicos são capazes de sofrer a oxidação de um elétron
com íons diazônio para formar radicais cátions. Obviamente, a forte complexação
furfural-CuCl2 favorece esta transferência de elétrons. O sistema catalítico de
Cu+↔Cu2+ medeia a transferência de elétrons do furfural para o íon diazônio. O
radical aril formado dentro do complexo ativado [arenodiazôniotetraclorocuprato(II)furfural ou arenodiazônio-sal catalítico-furfural] reage com uma segunda molécula de
furfural para formar o radical aduto A. A última doação de elétrons ocorre através de
do íon cobre(II) para o radical cátion B (gerado no primeiro ciclo) para formar o
produto C (OBUSHAK; LESYUK; MATIICHUK, 2009).
82
Figura 23. Esquema geral do mecanismo obtenção dos aldeídos. X: -Cl, 3,4-Cl.
O
(A)
X
O
O
H
O
.
H
O
Cu+
.
O
Cu 2+
H
H+
X
N2
+
O
O
N2
H
+
Cu
.
2+
O
Cu+
X
(B)
X
O
H
(C)
Fonte: OBUSHAK et al., 2009, p. 1378.
Com a intenção de seguir a indicação proposta por Topliss foram realizadas
tentativas de síntese de aldeídos de Meerwein detentores dos substituintes
sugeridos,
entretanto,
foram
obtidos
apenas
derivados
com
substituintes
eletronssacadores. A impossibilidade de obtenção dos demais derivados merece
maior tempo para investigação e melhoramento das condições reacionais utilizadas,
uma das metodologias a ser desenvolvida é a síntese assistida por micro-ondas.
5-(4-clorofenil)furano-2-carbaldeído (B27)
12
Cl
13
O
11
14
10
8
5
O
1
7
2
9
4
3
6
H
6a
Rendimento: 21%
P.F. (°C): 130,0-132,0
Fórmula molecular: C11H7ClO2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 9,71 (s, 1H, CHO), 7,56 (d, 1H, H3), 7,30 (d, 1H,
H4)
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 178,2 (CHO), 156,7 (C5), 153,7 (C2), 127,5
(C4), 124,3 (C3)
83
5-(3,4-diclorofenil)furano-2-carbaldeído (B28)
12
13
Cl
15 11
Cl
10
14
8
O
5
O
1
7
2
6
9
4
3
H
6a
Rendimento: 32,9%
P.F. (°C):
Fórmula molecular: C11H6Cl2O2
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 9,68 (s, 1H, CHO), 7,53 (d, 1H, H3), 7,20 (d, 1H,
H4)
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 178,0 (CHO), 158,2 (C5), 153,4 (C2), 127,5
(C4), 124,6 (C3)
Após obtenção e análise espectral dos aldeídos de Meerwein foi realizada sua
reação
com
a
aziridina
(B26)
para
dar
origem
aos
derivados
1,3-
diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno.
O método de obtenção dos diazabiciclos derivados dos aldeídos de Meerwein
seguiu a mesma metodologia convencional descrita para os outros derivados. Estes
compostos
foram
obtidos
com
características espectrais analisadas.
moderados
rendimentos
e
tiveram
suas
84
2-[5-(4-clorofenil)furan-2-il]-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex-3eno (B33)
O 2N
O 2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
N
1
a'H
O
-5
+
4
2 3N
c' H
O
Cl
Cl
Rendimento: 56%
P.F. (°C): 194,1-195,9
Fórmula molecular: C26H18ClN3O3
RMN1H (300 MHz, CDCl3, δ ppm): 6,46 (d, 1H, Hc), 6,32 (d, 1H, Hc’), 3,78 (s, 1H,
Hb’), 3,77 (t, 1H, Hb), 2,95 (s, 1H, Ha’), 2,77 (s, 1H, Ha).
RMN13C (75,47 MHz, CDCl3, δ ppm): 171,9 (C4), 90,8 e 91,6 (C2), 56,5 e 57,3 (C5),
42,6 e 47,9 (C6).
2-[5-(3,4-diclorofenil)furan-2-il]-6-(4-nitrofenil)-4-fenil-1,3-diazabiciclo[3.1.0]hex3-eno (B34)
O 2N
O 2N
a
H
b
H
6
1N
H b'
5 4
6
2 3N
cH
a'H
O
Cl
Cl
Rendimento: 46%
P.F. (°C): 152,3-153,8
-5
+
N
1
c' H
4
2 3N
O
Cl
Cl
85
Fórmula molecular: C26H17Cl2N3O3
RMN1H (300 MHz, C3D6O, δ ppm): 6,67 (s, 1H, Hc), 6,42 (d, 1H, Hc’), 4,13 (t, 2H, Hb
e Hb’), 3,21 (s, 1H, Ha), 3,07 (s, 1H, Ha’).
RMN13C (75,47 MHz, C3D6O, δ ppm): 172,3 e 173,0 (C4), 91,3 e 92,0 (C2), 57,1 e
57,9 (C5), 43,3 e 48,2 (C6).
5.2 Atividade Biológica
Apesar dos testes terem sido realizados apenas com compostos possuidores
de substituintes que seguem a indicação proposta por Topliss (4-CH3; 4-OCH3; 4-Cl;
3,4-Cl; H), realizou-se a síntese de diversos derivados diazabicíclicos com a
intenção de aumentar a diversidade química dentro da mesma estrutura base dos
compostos. Assim, com a futura avaliação biológica de todos os derivados,
pretende-se predizer a possível relação estrutura-atividade e validar o método
utilizando os substituintes selecionados da correlação.
5.2.1 Avaliação da ação sobre o sistema nervoso central
As desordens neuropsiquiátricas constituem um grupo de patologias que vêm
crescendo nos últimos anos. Muitas delas são refratárias ao tratamento
farmacológico vigente, os quais podem apresentar uma série de efeitos adversos
que levam a sua não adesão (JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005). A busca por novas
alternativas farmacológicas sintéticas ou naturais tem sido uma constante ao que
tange aos medicamentos psicotrópicos. Na química medicinal, a adesão de
estruturas de moléculas com conhecidos efeitos farmacológicos é uma constante e
podem originar compostos novos com características interessantes (CORRÊA;
BATISTA; QUINTAS, 2003). No presente estudo, uma série de compostos híbridos
de aziridinas e chalconas, os diazabiciclos, foram avaliados em vários modelos
farmacologicos utilizados no screening farmacológico de agentes psicotrópicos.
86
Para detectar possíveis efeitos inespecíficos dos compostos e efeitos sobre a
coordenação motora dos animais que pudessem interferir nos resultados de outros
experimentos, os quais exigem funcionamento do sistema motor, foi utilizado o teste
do campo aberto. Segundo Oliveira e colaboradores (2008), o número total de
crossings, que é um dos parâmetros analisados no modelo de campo aberto, pode
ser alterado por fármacos de atividade ansiolítica e ansiogênica e o número total de
rearings, que avalia a atividade exploratória do animal, pode ser afetada por
fármacos com ação no SNC ou relaxantes musculares periféricos. Fármacos que
atuam no sistema motor dos animais também alteram os parâmetros acima
mencionados e podem fornecer, nos demais modelos animais usados para o
screening de psicofármacos, resultados contraditórios.
No presente estudo, o pré-tratamento dos animais com os compostos e a
avaliação dos parâmetros comportamentais dos mesmos no teste do campo aberto
sugerem que estes não comprometem o sistema motor dos animais, tão pouco
promovem efeitos sedativos no SNC (Tabela 5).
Tabela 5- Efeito dos compostos em estudo sobre os parâmetros comportamentais
no modelo do campo aberto (MCA)
Tratamento
Rearing (Levantamentos)
Crossing (Cruzamentos)
Controle
58,7 ± 14,716
124,3 ± 22,894
B1
68 ± 17,279
115,1 ± 40,501
B2
56,1 ± 7,270
127,1 ± 31,094
B3
56,1 ± 19,438
96,1 ± 21,037
B4
45,2 ± 9,587
103,2 ± 27,544
B6
61,3 ± 11,346
109,7 ± 31,419
Como reportado anteriormente, chalconas e aziridinas exibem efeitos
ansiolíticos quando avaliados em modelos animais de ansiedade (JAMAL; ANSARI;
RIZVI, 2008; CHO et al., 2011). A propriedade ansiolítica dos compostos foi avaliada
através do teste do LCE. Substâncias ansiolíticas induzem um comportamento de
exploração dos braços abertos do labirinto, aumentando a freqüência de entradas
nesses braços, bem como o tempo em que os animais o exploram (SOUZA et al.,
2006). Melo (2006), relata que substâncias ansiogênicas restringuem as atividades
dos animais aos braços fechados, a frequência de entradas nesses braços, assim
87
como seu tempo de permanência. No presente estudo, na dose utilizada, os
compostos testados não promoveram alterações comportamentais no LCE, que
pudessem sugerir efeito ansiolítico (Figura 24).
Figura 24. Efeito do tratamento dos animais com os compostos em estudo (10mg/kg, i.p.) e
do diazepam (0,75 mg/kg, i.p.), sobre os parámetros comportamentais: frequência de
entradas (A) e tempo de permanência (B) nos braços abertos do LCE. Cada coluna
representa a média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA seguido de Bonferroni ***p<0.001
**p<0.01 e *p<0.05 quando comparado com o controle.
A atividade hipnótica também foi descrita na literatura para chalconas e
aziridinas (CHO et al., 2011). Uma substância com propriedades hipnóticas é aquela
que diminui a latência para o sono e aumenta seu tempo total. Desta forma, em
modelos farmacológicos de sono, os compostos que interferem nesses dois
parâmetros de forma significativa, possuem efeito hipnótico (SOUZA et al., 2006). No
presente estudo, o modelo farmacologico utilizado para avaliar o efeito hipnótico dos
88
compostos foi o modelo de indução do sono por barbitúricos. Os resultados nos
mostraram que o pré-tratamento dos animais com os compostos não alterou os
parâmetros experimentais, na dose administrada, quando comparado com o grupo
controle e Lorazepam, (medicamento que potencializa a ação sedativa do
pentobarbital), sugerindo que os compostos não apresentam uma ação sedativa
(Figura 25).
Figura 25. Efeito do tratamento dos animais com os compostos em estudo (10mg/kg, i.p.) e
do lorazepam (2 mg/kg, i.p.), sobre a Latencia (A) e Tempo total de sono (B) induzido por
barbitúricos. Cada coluna representa a média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA seguido de
Bonferroni **p<0.01 e *p<0.05 quando comparado com o controle.
A atividade anticonvulsivante dos compostos foi avaliada através do modelo
da convulsão induzida pelo pentilenotetrazol (PTZ). O PTZ possui efeito
convulsivante em animais ao bloquear os canais de cloreto do receptor GABAA
89
(TOLARDO et al., 2010; HOLZMANN et al., 2011). Compostos com ação
anticonvulsivante neste modelo, potencializam de alguma forma a ação inibitória
GABAérgica no SNC (TOLARDO et al., 2010; HOLZMANN et al., 2011). Agentes
anticonvulsivantes não só diminuem a latência para o aparecimento de uma crise,
como também agem como neuroprotetores (MUSSULINI, 2013). Nesse modelo o
fármaco padrão utilizado foi o fenobarbital. O fenobarbital é o protótipo do grupo
barbitúrico possuindo atividade antiepilética específica em doses inferiores das que
produzem sono. O mecanismo de ação não está totalmente esclarecido, se supõe
que está relacionado em parte com o responsável da ação hipnosedante. É
conhecido que o fenobarbital atua como estabilizante da membrana neuronal por
afinidade fisicoquímica pelos lipídios de membrana, afetando a sua permeabilidade e
seu fluxo iônico; na verdade, pré-sinapticamente reduzem a entrada de cálcio no
neurônio e com ele a exocitose de neurotransmissores, embora que sinapticamente
é reduzida a condutância dos íons Na+ e K+, bloqueando as descargas repetidas.
Estudos a nível celular mostram depressão da transmissão sináptica, sem
diminuição da excitabilidade neuronal, porém esta ação não é uniforme em todos os
neurônios.
Além desta condição "inespecífica" o fenobarbital atua pós-sinapticamente
facilitando a inibição mediada por GABA e reduzindo a excitação produzida pelo
glutamato e/ou acetilcolina (VARONA; ESCRIBANO; MARTIN-CALDERÓN, 2001).
Embora a propriedade anticonvulsivante tenha sido descrita para as chalconas e
aziridinas (CHO et al., 2011; YAMAZAKI et al., 2005), os compostos hibridos,
avaliados nesse estudo não exibiram efeito anticonvulsivante (Figura 26).
90
Figura 26. Efeito do tratamento dos animais com os compostos em estudo (10mg/kg, i.p.) e
do fenobarbital (50 mg/kg, i.p.), sobre a Latência (A) para a crise convulsiva e o número de
crises (B) induzidas por pentilenotetrazol. Cada coluna representa a média e o E.P.M de 8-9
animais. ANOVA seguido de Bonferroni ***p<0.001 e *p<0.05 quando comparado com o
controle.
Os animais expostos ao fenobarbital apresentaram baixa taxa de mortalidade
e número de crises e alta latência para a convulsão. Já os animais tratados com os
compostos B1, B3 e B4 apresentaram altas taxas de mortalidade quando
comparados com o controle e o fenobarbital (Tabela 6).
91
Tabela 6- Efeito dos compostos em estudo sobre a percentagem de mortalidade dos
animais após a indução das crises convulsivas induzidas por pentilenotetrazol.
Tratamento
Mortalidade
Sobrevivência
Controle
60%
40%
B1
90%
10%
B2
60%
40%
B3
100%
0%
B4
90%
10%
B6
60%
40%
Fenobarbital
10%
90%
Os efeitos dos compostos sobre a memória dos animais tambem foi avaliado
no presente estudo. Para tanto foi utilizado como modelo de memória o teste da
esquiva inibitória. O teste consiste em inibir a exploração do ambiente pelo animal
através da aplicação de choques de pequena intensidade. Portanto, trata-se um
modelo animal de memória aversiva ou emocional (TOLARDO et al., 2010;
HOLZMANN et al., 2011). O parâmetro analisado foi o tempo de latência para
descida da plataforma de madeira para a de metal onde os animais levavam os
choques. A diferença entre as latências de descida obtidas entre as sessões de
treino e teste no modelo são consideradas como índice de memória (YAMAZAKI et
al., 2005).
Vários neurotransmissores estão envolvidos na modulação da memória,
destacando-se negativamente o sistema GABAérgico, canabinoide, histaminérgico,
e,
positivamente
o sistema
noradrenérgico, dopaminérgico, dentre outros
(TOLARDO et al., 2010; HOLZMANN et al., 2011; YAMAZAKI et al., 2005; MC
GAUGH, 2000; CARDOSO, 2010). O sistema colinérgico tem importante papel nos
processos de formação da memória e há evidências tanto em animais como em
humanos, de que o aprendizado e memória podem ser modificados por drogas que
afetam a função colinérgica central (YAMAZAKI et al., 2005; MC GAUGH, 2000;
KANDEL; JESSELL; SCHWARTZ, 2000). Em nosso estudo, o único composto a
apresentar alteração significativa da memória dos animais foi o B6, mostrando um
comprometimento da memória de longo prazo, evidenciando um perfil amnésico
(Figura 27).
92
Figura 27. Efeito do tratamento dos animais com os compostos em estudo (10mg/kg, i.p.)
sobre a Latência de decida na sessão de teste da esquiva inibitória. Cada coluna representa
a mediana e os intervalos interquativos (25 e 75) de 8-9 animais. ANOVA seguido de de
kruskall Wallis e test de Duns *p<0.05 quando comparado com o controle.
A propriedade antidepressiva dos compostos em estudo foi avaliada através
do modelo de depressão, o teste do nado forçado, onde foi analisado como
parâmetro específico de efeito depressivo o de tempo de imobilidade do animal.
Borcini e colaboradores reportam que animais com tempo alto de imobilidade, no
teste do nado forçado, indica um perfil depressivo, analogia feita a “anedonia” um
dos principais sintomas da depressão (TOLARDO et al., 2010; HOLZMANN et al.,
2011; GUAN et al., 2013; GUAN et al., 2014). Nossos resultados demonstraram que
os compostos B1, B2 e B6 exibiram efeito antidepressivo, e que B6,
especificamente, teve uma propriedade antidepressiva semelhante a fluoxetina, um
antidepressivo utilizado clinicamente (Figura 28). Os resultados apresentados são
similares ao estudo de Guan et al. (2013, 2014), onde dois derivados de chalcona
possuem potencial antidepressivo nas doses 1, 5 e 10mg/kg i.p.
No modelo depressão, o controle positivo utilizado nesse estudo foi a
fluoxetina. A fluoxetina é um potente e seletivo inibidor da recaptação de serotonina
amplamente empregada no tratamento da depressão. É efetiva no tratamento da
doença bipolar, no TOC, bulimia nervosa, doença disfórica pré-menstrual, doença do
pânico, distimia e, ainda, ansiedade, manifestações clínicas da depressão (PISSATO
et al., 2006).
93
Figura 28. Efeito do tratamento dos animais com os compostos em estudo (10mg/kg, i.p.) e
da fluoxetina (A) e curva dose-resposta (B) da propriedade antidepressiva do composto B6,
sobre o tempo de imobilidade dos animais avaliados no teste de nado. Cada coluna
representa a média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA seguido de Bonferroni **p<0.01 e
*p<0.05 quando comparado com o controle.
Uma vez evidenciado o efeito antidepressivo dos compostos, escolheu-se o
composto B6 para avaliar o mecanismo de ação da atividade antidepressiva, uma
vez que este foi o mais ativo dentre os compostos avaliados.
Vários sistemas de neurotransmissores estão envolvidos na patogênese da
depressão. As principais teorias relacionadas à base biológica da depressão situamse nos estudos sobre neurotransmissores cerebrais e seus receptores, embora
outras áreas também estejam sob investigação. A hipótese das monoaminas,
baseada na deficiência de monoaminas, como serotonina (5-HT), noradrenalina (NA)
e dopamina (DA), é comumente utilizada para explicar a gênese dos transtornos
depressivos (MILLAN, 2004) e é a mais vigente e fortalecida pelo mecanismo de
ação dos fármacos antidepressivos presentes no mercado, os quais independentes
do mecanismo de ação que possuam, promovem aumentos das concentrações das
monoaminas no SNC.
94
Confirmando a hipótese das monoaminas, Taylor e Stein (2006) afirmam que
a maioria dos antidepressivos precritos inibe a recaptação de serotonina ou
noradrenalina e/ou inibem a atividade da monoamina oxidase por aumentarem a
disponibilidade sináptica destes neurotransmissores.
A 5-HT é considerada atualmente a amina biogênica mais envolvida nos
transtornos afetivos. Segundo Ansorge et al. (2007), o sistema serotonérgico
desempenha um papel central na fisiopatologia e na etiologia da depressão e um
papel importante na ação de antidepressivos (MILLAN, 2004; ZENI et al., 2013).
Estudos mostram uma reduzida concentração do líquido cefalorraquidiano de 5-HT e
do seu metabólito principal ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) em tecido cerebral
post-mortem de paciente deprimidos ou suicidas.
A 5-HT pode interagir com
múltiplos receptores, e até o momento sete famílias foram caracterizadas (5HT1R5HT7R) e com exceção o receptor 5HT3 que é um canal iônico operado por ligante,
todas os demais são receptores acoplados à proteína G, ou seja, metabotrópicos
(LUKDA et al., 2014).
Avaliando a influência do sistema serotonérgico no efeito antidepressivo do
composto B6, verificou-se que tal efeito não foi revertido pelo pré-tratamento com
NAN-190, Ketanserina e Ondansetron, antagonista dos receptores 5HT1A, 5HT2A/C
e 5HT3 respectivamente (Figura 29). Desta forma pode-se observar através da
comparação dos resultados com o grupo controle e o padrão positivo, que não
houve envolvimento da via serotonérgica.
95
Figura 29. Influencia do pré-tratamento dos antagonistas 5-HT1A (NAN 190) (A) 5HT2A/2C
(Ketanserina) (B) e 5-HT3 (Ondansetron) (C) sobre o efeito antidepressivo do composto B6
(10mg/kg, i.p.), em animais avaliados no teste de nado forçado. Cada coluna representa a
média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA seguido de Bonferroni. Asteriscos(*) denotam
diferenças significativas quando comparado ao controle ***p<0.001 e **p<0.01.
O sistema noradrenérgico também tem sua importância na patogênese da
depressão. A hipótese monoaminérgica, baseada no mecanismo de ação dos
antidepressivos tricíclicos e dos inibidores da monoamina oxidase (IMAOs), postula
que a depleção de noradrenalina na fenda sináptica seria também componente
substrato biológico da depressão (SCHILDKRAUT, 1965; KALIA, 2005; HALES;
YUDOFSKY, 2006). Certos componentes do sistema noradrenérgico parecem estar
envolvidos com excitação e medo, enquanto outros, em conjunto com componentes
mesolímbicos dopaminérgicos, com motivação e prazer. Assim, a ansiedade e a
perda de prazer características da melancolia e da depressão atípica podem estar
relacionadas a desregulação do sistema noradrenérgico (SCHILDKRAUT, 1965;
KALIA, 2005; KANDEL; JESSELL; SCHWARTZ, 2000).
No presente estudo, o efeito antidepressivo do B6 foi revertido pelo prétratamento dos animais com a Yohimbina, antagonista do receptor α2 de ação pré-
96
sináptica (Figura 30). Não foi detectada a influencia dos receptores α1 sobre os
efeitos do composto.
Figura 30. Influencia do pré-tratamento dos antagonistas α1 (Prazosin) (A) e α2 (Yoimbina)
(B) sobre o efeito antidepressivo do composto B6 (10mg/kg, i.p.), em animais avaliados no
teste de nado forçado. Cada coluna representa a média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA
seguido de Bonferroni. Asteriscos(*) denotam diferenças significativas quando comparado
ao controle ***p<0.001 e *p<0.05 e hashtag(#) denotam significancias estatisticas quando
comparado com grupo que recebeu B6 sem o antagonista ###p<0.001.
Ainda com relação à hipótese monoaminérgica, foi avaliada também nesse
estudo a influência do sistema dopaminérgico. O sistema dopaminérgico também é
um alvo importante implicado na regulação dos transtornos do humor (DAILLY et al.,
2004). Estudos clínicos e pré-clínicos indicaram que uma diminuição das
concentrações centrais de dopamina pode influenciar na patogênese da depressão
(ELHWUEGI, 2004). A dopamina é considerada o principal neurotransmissor
envolvido na via mesolímbica de recompensa e tem sido proposto que um aumento
na neurotransmissão dopaminérgica, contrária à anedonia, o que é considerado uma
97
característica padrão de depressão maior (GORWOOD, 2008). No presente estudo,
foi observado que os antagonistas dos receptores D1 e D2 seletivos reverteram o
efeito antidepressivo do composto B6, indicando que a via dopaminérgica está
envolvida na ação do mesmo (Figura 31).
Figura 31: Influência do pré-tratamento dos antagonistas seletivos D1 (SCH23390) (A), D2
(Pimozide) (B) e não seletivo (Haloperidol) (C) sobre o efeito antidepressivo do composto B6
(10mg/kg, i.p.), em animais avaliados no teste de nado forçado. Cada coluna representa a
média e o E.P.M de 8-9 animais. ANOVA seguido de Bonferroni. Asteriscos(*) denotam
diferenças significativas quando comparado ao controle (veículo) ***p<0.001 e hashtag(#)
denotam significancias estatisticas quando comparado com grupo que recebeu B6 sem o
antagonista ### p<0.001.
Observa-se que os compostos mais ativos, no modelo de atividade biológica
em estudo, são aqueles que possuem grupamentos eletrondoadores no anel
aromático ligado no carbono 2 do anel aziridínico, conforme ilustrado (Figura 32): B1
possui um anel não substituído (todos os carbonos, com exceção daquele conectado
ao núcleo aziridínico, são ligados a átomos de hidrogênio), B2 possui um
grupamento metóxi na posição 4 (-OCH3 - eletrondoador) e B6 possui um
grupamento metil na posição 4 (-CH3 – eletrondoador). Por sua vez, os compostos
98
menos ativos, B3 e B4 são substituídos por grupamentos 3,4-Cl e 4-Cl,
respectivamente, que são eletronssacadores.
Figura 32. Estrutura química dos compostos avaliados.
H
N
O2N
H
H
N
N
O2N
H
H
H
H
N
N
O 2N
H
N
H
Cl
(B1)
H
(B3)
O2N
Cl
Cl
H
N
N
H
(B4)
CH3
H
H
N
O2N
O
(B2)
N
H
(B6)
CH3
Portanto, pode-se deduzir que a demanda eletrônica molecular é importante
para a atividade biológica em estudo, sendo que a diminuição do fluxo eletrônico do
sistema conjugado, através do efeito retirador de elétrons de grupos como 4-Cl e
3,4-Cl, tende a diminuir o efeito biológico esperado.
5.2.2 Avaliação da atividade antinociceptiva
Em uma análise preliminar, os derivados diazabiciclos foram testados no
modelo de contorções abdominais induzídas pelo agente flogístico ácido acético.
Conforme pode ser observado na Tabela 7, em todos os compostos testados foi
observada inibição das contorções, quando comparados com o grupo controle. Os
99
resultados
indicam
que
todos
os
compostos
testados
exibiram,
quando
administrados por via intraperitoneal, pronunciada atividade antinociceptiva,
entretanto, B6 apresentou resultados mais relevantes, sendo 19 vezes mais potente
que o ácido acetilsalicílico (AAS), fato que nos levou a seleciona-lo para estudos
mais detalhados.
Tabela 7. Atividade antinociceptiva dos derivados diazabiciclos no
modelo de dor induzida pelo ácido acético 0,6% via i.p.
H
H
N
O 2N
N
H
X
Substituinte (X)
H
4-OCH3
3,4-Cl
4-Cl
4-CH3
AAS
Código
B1
B2
B3
B4
B6
DI50 (µ
µmol/kg) i.p.
14,91 (12,46-17,86)
9,88 (8,17-11,98)
16,85 (15,72-18,05)
16,80 (15,69-17,98)
7,33 (4,11-13,07)
133,21 (73,02-243,12)
Com relação aos parâmetros que permitem avaliar a estrutura-atividade,
procedimentos sugeridos por Topliss assumem que a atividade biológica é
dependente de alguns efeitos hidrofóbicos (π) e eletrônicos (σ) dos substituintes
aromáticos. Ensaios preliminares com os derivados B1, B2, B3, B4 e B6, quando
comparados à tabela sugerida por Topliss (Tabela 1, p. 31), sugerem que, da
mesma forma que os resultados obtidos na avaliação do efeito dos compostos sobre
o sistema nervoso central, a demanda eletrônica molecular neste caso também é
importante para a atividade antinociceptiva. Neste comparativo a combinação de
parâmetros π-3σ é dominante na árvore de decisão de Topliss, que sugere uma lista
de substituintes provavelmente mais ativos a serem investigados posteriormente
(Figura 33).
100
Figura 33. Estrutura química dos compostos propostos por Topliss para futura avaliação
biológica.
H
N
O2N
H
H
N
N
O 2N
H
(B10)
H
OH
N
H
N
(B15)
CH3
H3C
O segundo modelo avaliado foi o de dor induzida pela formalina, que avalia
duas fases distintas de dor, as quais são consequências da liberação de diferentes
mediadores (DUBUISSON; DENNIS, 1977; HUNSKAAR; HOLE, 1987). A primeira
fase tem início logo após a injeção da formalina e mantem-se por 5 minutos,
acredita-se que ela decorra da estimulação química direta dos nociceptores
(aferentes tipo C e A), por mediadores químicos como a substância P, o glutamato e
a bradicinina, responsáveis pela nocicepção neurogênica (HUNSKAAR et al., 1985;
1987).
Nesta primeira fase do teste, que se refere ao processo doloroso conhecido
como neurogênico ou agudo, o composto B6 apresentou uma atividade inibitória
significativa de 69 ±10% na dose de 10 mg/kg (Figura 34), sendo os AINES AAS e
paracetamol inativos nesta fase. A segunda fase tem início com 15 minutos e
termina aos 30 minutos, após a injeção da formalina. Esta resposta é decorrente da
liberação de vários mediadores químicos pró-inflamatórios, como a histamina,
serotonina, prostaglandinas e bradicinina. Quando comparado com outros modelos
para o estudo da dor, o teste da formalina, é o que mais se assemelha com as
características da dor clínica aguda, seja ela de natureza química, elétrica ou
mecânica (HUNSKAAR; HOLE, 1985; 1987; TJØLSEN; HOLE, 1997). Na segunda
fase, designada de crônica ou inflamatória, observou-se redução da reação dolorosa
com uma inibição de 31,7 ±10%.
101
Figura 34. Efeito do composto B6 administrado na concentração de 10 mg/kg, via
intraperitoneal na Fase I – fase neurogênica no modelo de dor induzida pela formalina 2,5%.
Cada coluna representa uma média de 6 experimentos e as barras verticais indicam o EPM.
Com o objetivo de melhor avaliar a atividade destes compostos sobre a dor
neurogênica, devido à inatividade observada na primeira fase do modelo da
formalina, pelo composto B6, foram realizados ensaios no modelo de dor induzida
pela capsaicina. Esta é uma amina neurotóxica que causa uma intensa atividade
nociceptiva seguida por dessensibilização. Diversos mediadores químicos estão
envolvidos nesta ação, tais como as neurocininas (substância P, neurocinina A e
neurocinina
B),
peptídeos
relacionados
ao
gene
da
calcitocina
(CGRP),
somastotatina, óxido nítrico e aminoácidos excitatórios (SAKURADA et al., 1992;
1996). Além disto, tem sido proposto um receptor vanilóide próprio para a
capsaicina, presente em neurônios sensitivos primários (CATERINA et al., 1997).
Neste modelo, B6 mostrou-se ativo reduzindo a resposta morder/lamber em
35,9 ± 1,9, 50 ± 2,4 e 68,6 ± 2,6%, apresentando assim indícios de atividade sobre a
dor neurogênica sob a via das taquicininas (Figura 35).
102
Figura 35. Efeito do composto B6 administrado nas concentrações de 0.1, 1 e 10 mg/kg, via
intraperitoneal no modelo de dor induzida pela capsaicina. Cada coluna representa uma
média de 6 experimentos e as barras verticais indicam o EPM.
Na tentativa de elucidar um pouco mais o mecanismo de ação destes
compostos, realizou-se o ensaio do glutamato, modelo proposto recentemente por
Beirith e colaboradores (1998) o qual é aplicado para o estudo de substâncias que
atuam sobre o sistema glutamatérgico envolvido na transmissão nociceptiva. O
glutamato, maior neurotransmissor excitatório no cérebro e na medula espinhal
exerce seus efeitos pós-sinápticos via diversos receptores de membrana
pertencentes tanto a classe dos metabotrópicos quanto ionotrópicos. A resposta
nociceptiva induzida por glutamato parece envolver sítios de ação periférica,
espinhais e supraespinhais (influenciados pela liberação do NO), os quais são
mediados por ambos os tipos de receptores NMDA e os não-NMDA. Há
consideráveis evidências que a dor associada com a injúria tecidual ou nervosa
perférica, envolve a ativação dos receptores NMDA (BEIRITH et al., 1998;
PETRENKO et al., 2003). Neste modelo, o composto B6, testado nas doses de 0.1,
1 e 10mg/kg, exibiu uma atividade bastante significativa de 44,2 ± 7,5, 54,4 ± 3,1 e
66,5 ± 3,8%, respectivamente (Figura 36).
103
Figura 36. Efeito do composto B6 administrado nas concentrações de 0.1, 1 e 10 mg/kg, via
intraperitoneal no modelo de dor induzida pelo glutamato. Cada coluna representa uma
média de 6 experimentos e as barras verticais indicam o EPM.
No modelo de hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina observase que o composto B6, administrado nas doses de 0.1, 1 e 10mg/kg
intraperitonealmente, foi capaz de reduzir de maneira significativa a frequência de
resposta ao estímulo mecânico, perdurando este efeito por até 48 horas após a
injeção intraplantar de carragenina. Os valores de inibição foram de 65, 9 ± 7,6, 61,5
± 8 e 68 ± 6,9%, respectivamente, quando comparados com a indometacina,
utilizada como um controle positivo, a qual mostrou inibição de 92,1 ± 5,3% (Figura
37).
Figura 37. Efeito do composto B6 administrado nas concentrações de 0.1, 1 e 10 mg/kg, via
intraperitoneal no modelo de hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina. Cada
coluna representa uma média de 6 experimentos e as barras verticais indicam o EPM.
104
6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados obtidos permitem concluir que:
-
Foram
sintetizados
30
compostos
que
contemplam
a
porção
1,3-
diazabiciclo[3.1.0]hex-3-eno, sendo que destes 15 são estruturas inéditas (B3, B8,
B9, B12, B13, B14, B16, B19, B20, B21, B22, B30, B32, B33 e B34).
- A proposta de síntese de compostos diazabiciclos envolve várias etapas reacionais
de relativa complexidade, em que se faz necessário o uso de procedimentos de
controle das variantes reacionais, focando a obtenção de pureza e melhores
rendimentos.
- A maioria dos derivados (27 compostos) foi obtida pelo método convencional de
síntese para esses compostos.
- A série de derivados de acetofenonas teve sua síntese assistida por micro-ondas,
já que pelo método tradicional os produtos não puderam ser obtidos.
- Independentemente do método sintético utilizado os produtos foram obtidos com
elevado grau de pureza e bons rendimentos (44 – 90%), não apresentando nenhum
subproduto, o que garantiu uma boa caracterização através dos métodos
espectroscópicos usuais, pelos quais foi possível comprovar que os compostos
sintetizados foram os propostos neste trabalho.
- Alguns derivados (B1, B2, B3, B4 e B6) tiveram seu potencial de aplicabilidade
biológica avaliado quanto à ação no sistema nervoso central e através de modelos
de antinocicepção. Foram testados os compostos possuidores dos substituintes
sugeridos pelo método de Topliss, dos quais o mais ativo, em ambas as avaliações,
foi o derivado 4-CH3 substituído (B6).
105
Estrutura química do composto B6
H
H
N
O 2N
N
H
CH3
- Através do teste do nado forçado foi possível observar que o composto B6 possui
efeito antidepressivo semelhante ao da fluoxetina.
- Ao estudar as possíveis vias de ação do composto, os resultados apresentados
demonstraram que o sistema dopaminérgico está envolvido através de receptores
não específicos, D1 e D2 no efeito do composto, onde os antagonistas reverteram o
efeito antidepressivo. A via noradrenérgica também estudada, apresentou
envolvimento através do receptor α2.
- Os resultados farmacológicos indicam que todos os compostos testados (B1, B2,
B3, B4 e B6) exibiram uma atividade antinociceptiva no teste de contorções
abdominais (0.1, 1 e 10 mg / kg, ip), no entanto B6 apresentou resultados mais
relevantes, sendo 19 vezes mais potente que o AAS, o que nos levou a selecioná-lo
para estudos mais detalhados.
- No modelo de nocicepçãp induzida pela formalina, o composto B6 inibiu em 69% a
dor neurogênica e em 31,7% a dor inflamatória, quando comparado com o controle.
- B6 reduziu a resposta lamber/morder no teste de injeção intraplantar de capsaicina,
com 35,9 ± 1,9%, 50,0 ± 2,4% e 68,6 ± 2,6% de inibição, o que forneceu evidência
mais direta do efeito analgésico do presente composto sobre a dor neurogênica.
106
- O pré-tratamento com B6 (0.1, 1 e 10 mg / kg, pi), administrado de 30 minutos
antes da indução da nocicepção por glutamato, alterou significativamente a
nocicepção espontânea evocada, com percentagens de inibição de 44,2 ± 7,5%,
54,4 ± 3,1% e 66,5 ± 3,8%, respectivamente.
- Como perspectiva para estudos futuros propõe-se o aprimoramento das
metodologias de síntese para obtenção dos compostos possuidores de substituintes
eletrondoadores que completam as séries derivadas de acetofenonas e aldeídos de
Meerwein; a ampliação da diversidade química dos compostos através da inserção
de diferentes heterociclos nos anéis provenientes da chalcona de partida e o estudo
das possíveis ocorrências de relação estrutura-atividade nas séries sintetizadas.
107
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