CEETEPS - Centro Estadual de Educação Tecnológica
FATEC-SP - Faculdade de Tecnologia de São Paulo
Paula Souza
Governo do Estado de São Paulo
ADILSON MACEDO
CONTAGEM DE CÉLULAS DE CIANOBACTÉRIAS:
UM LEVANTAMENTO DOS PROCEDIMENTOS UTILIZADOS
PELAS EMPRESAS DE SANEAMENTO DO BRASIL
SÃO PAULO
2006
CEETEPS - Centro Estadual de Educação Tecnológica
FATEC-SP - Faculdade de Tecnologia de São Paulo
Paula Souza
Governo do Estado de São Paulo
ADILSON MACEDO
CONTAGEM DE CÉLULAS DE CIANOBACTÉRIAS:
UM LEVANTAMENTO DOS PROCEDIMENTOS UTILIZADOS
PELAS EMPRESAS DE SANEAMENTO DO BRASIL
Monografia apresentada à Faculdade
de Tecnologia de São Paulo, como
requisito parcial para obtenção do
título de Especialista em Tecnologias
Ambientais, sob orientação da Profª.
Dr.ª Regiane Maria Tironi de
Menezes.
SÃO PAULO
2006
2
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me dar disposição e saúde.
À minha esposa Marcia.
À Profª. Dr.ª Regiane Maria Tironi de Menezes pelo respeito e dedicação na
orientação deste trabalho.
Aos meus amigos e colegas de trabalho da SABESP.
A todos os biólogos e profissionais das entidades que consultei para realizar
este trabalho: AGESPISA do Piauí, CAERD de Rondônia, CAESB de Brasília Distrito Federal, CAGECE do Ceará, CAGEPA da Paraíba, CASAL de Alagoas,
CEDAE do Rio de Janeiro, CESAN do Espírito Santo, COPASA de Minas Gerais,
CORSAN do Rio Grande do Sul, EMBASA da Bahia, SAMAE de Blumenau – Santa
Catarina, SANASA de Campinas – São Paulo, SANEAGO de Goiás, SANEATINS de
Tocantins, SANEPAR do Paraná, SANESUL do Mato Grosso do Sul e SEMAE de
Piracicaba – São Paulo.
3
RESUMO
Em ambientes eutrofizados com enriquecimento de nutrientes, principalmente
nitrogênio e fósforo, favorecem o crescimento de cianobactérias.
A floração ou bloom destes microrganismos podem causar entupimento de
filtros nas estações de tratamento de água; trazer riscos à saúde associado a toxina;
causam um desequilíbrio neste ecossistema, diminuindo assim a diversidade; podem
provocar a morte de peixes e outros animais; podem conferir gosto e odor
desagradáveis à água e impedir a recreação, pois, formam camadas densas na
superfície da água quando as espécies possuem aerótopos.
O monitoramento das cianobactérias é essencial para detectar esse
crescimento e acompanhar a evolução dos indivíduos, que são classificados como
potencialmente tóxicos; permite também avaliar as características dos ecossistemas
aquáticos e dar subsídios para a tomada de decisões quanto ao tratamento da água
em estações de tratamento.
Atualmente a Portaria 518 (BRASIL, 2004) e a Resolução 357 (BRASIL,
2005a) que tratam da potabilidade e enquadramento dos corpos d’água,
respectivamente, obrigam o monitoramento de cianobactérias e a quantificação
destes microrganismos em células por mililitro ou biovolume. Definem também o
plano de amostragem e as classes em que deverão ser alcançadas como
enquadramento, considerando valores preestabelecidos para todo o território
brasileiro.
A Portaria 518 (BRASIL, 2004) estabelece no artigo 17 que metodologias para
determinação de parâmetros biológicos, deverão atender as especificações de
normas nacionais, a publicação mais recente do Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater ou as normas publicadas pela ISO
(International Standartization Organization) e para análise de cianobactérias, até o
estabelecimento de normas nacionais ou internacionais, devem ser adotadas as
metodologias propostas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em sua
publicação Toxic cyanobacteria in water: A guide to their public health
consequences, monitoring and management. Portanto, as metodologias que não
forem citadas na publicação acima, deverão receber aprovação e registro pelo
Ministério da Saúde e as empresas que não realizarem as análises em laboratório
próprio, poderão contratar este serviço, em qualquer caso, deverá manter-se
programas de controle de qualidade ou ainda serem acreditados ou certificados por
órgãos competentes para esse fim.
No presente trabalho foi realizado um levantamento dos procedimentos
adotados por 19 empresas de saneamento ambiental de 16 estados brasileiros, mais
o Distrito Federal. Foi possível fazer um breve relato de vários métodos que
envolvem a mensuração de cianobactérias desde a coleta até a contagem
propriamente dita.
Com essas informações foi criado uma tabela que exemplifica todo esse
processo: A preparação da amostra, se utiliza ou não algum preservativo; Qual o
método de concentração; Qual o microscópio utilizado; Qual a câmara de contagem
e qual a principal fonte para a elaboração de cada método.
Pretende-se com isso contribuir para o enriquecimento do tema
Monitoramento de cianobactérias.
4
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES..........................................................................................5
LISTA DE TABELAS...................................................................................................6
1. Introdução...............................................................................................................7
1.1 Considerações preliminares.................................................................................7
1.2 Objetivos...............................................................................................................9
1.2.1 Geral................................................................................................................9
1.2.2 Específico........................................................................................................9
2. Revisão da literatura.............................................................................…............10
2.1 Meio ambiente e cianobactérias.........................................................................10
2.2 Porque monitorar ?.............................................................................................11
2.3 Legislação..........................................................................................................12
2.4 Biologia das cianobactérias................................................................................14
2.5 Toxinas...............................................................................................................17
2.6 Contagem de cianobactérias..............................................................................19
2.6.1 Tecnologias e equipamentos.........................................................................19
2.6.2 Técnicas de concentração de amostras........................................................23
2.6.2.1 Filtração em membranas..........................................................................23
2.6.2.2 Centrifugação...........................................................................................24
2.6.2.3 Sedimentação ( Utermöhl ).......................................................................25
2.6.2.4 Sedimentação em proveta........................................................................27
2.6.2.5 Método de Sedgwick-Rafter.....................................................................27
3. Material e métodos...............................................................................................30
3.1 Coleta de informações........................................................................................30
3.2 Resumo dos procedimentos...............................................................................31
4. Discussão..............................................................................................................46
5. Considerações finais....................................................................…....................51
6. Referências bibliográficas...................................................................................52
5
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Superfície da água com floração de Microcystis.........................................12
Figura 2: Gêneros de cianobactérias freqüentemente encontrados em ambientes
aquáticos....................................................................................................................16
Figura 3: Câmaras de Sedgwick-Rafter, dimensões: 50mm por 20mm de lado e 1mm
de profundidade, com capacidade de 1ml de amostra...............................................20
Figura 4: Câmaras de Utermöhl.................................................................................21
Figura 5: Microscópio binocular ótico comum com câmara de Sedgwick-Rafter e
Microscópio invertido, com câmera digital acoplada ao computador e dispositivo de
epifluorescência..........................................................................................................22
Figura 6: Retículo de Whipple com uma colônia de Microcystis................................23
Figura 7: Diagrama que mostra o processo de sedimentação de uma amostra de
fitoplâncton.................................................................................................................26
Figura 8: Método de concentração com funil de Sedgwick-Rafter.............................28
Figura 9: Mapa do Brasil, círculo em vermelho indicam as regiões consultadas para o
trabalho.......................................................................................................................30
6
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classificação dos corpos d`água, considerando densidade de
cianobactérias.................................................................. .........................................14
Tabela 2: Principais gêneros de cianobactérias potencialmente produtoras de
toxinas........................................................................................................................19
Tabela 3: Relação das empresas de saneamento consultadas.................................31
Tabela 4: Tabulação das informações sobre os procedimentos para contagem de
cianobactérias............................................................................................................44
Tabela 5: Teste de contagem de cianofíceas ( Oscillatoria sp ) com amostras da
Lagoa Facultativa de Valinhos, SP, coletadas em maio de 1985..............................47
7
1. INTRODUÇÃO
1.1 Considerações preliminares
A água é uma das substâncias mais abundantes da Terra. Ela cobre
aproximadamente 71%
da superfície do globo, em sua maioria composta por
oceanos. Estima-se que 97% do volume total de água esteja nos oceanos e que 3%
seja água doce, porém, somente uma pequena parcela da água doce encontra-se
disponível para seres humanos, animais e plantas. A maior parte dos 3% de água
doce permanece congelada nas calotas polares. A água doce de lagos, rios e
subsolo representa somente 0,3% do total de água doce existente na Terra. Essa
água doce representa a maior parcela da potável (10%), industrial (21%) e agrícola
(69%) (UNEP, 2001).
A simplicidade da composição química parece disfarçar a importância da
água para o desenvolvimento e preservação de todas as formas de vida existentes
na terra. Sem a água, que constitui 70% do corpo humano, a vida, tal como a
conhecemos, não seria possível. A sociedade tem negligenciando a possibilidade de
esgotamento dos recursos hídricos e vem promovendo intervenções no meio
ambiente que prejudicam numerosos mananciais (INIGO, 2000)
A conseqüência dos impactos antrópicos nos ecossistemas aquáticos é a
ocorrência de acelerados processos de eutrofização, causando um enriquecimento
artificial desses ecossistemas pelo aumento das concentrações de nutrientes na
água, principalmente compostos nitrogenados e fosfatados, que resulta num
aumento dos processos naturais da produção biológica em rios, lagos e
reservatórios. As principais fontes desse enriquecimento têm sido identificadas como
sendo as descargas de esgotos domésticos e industriais dos centros urbanos e das
regiões agricultáveis (FUNASA, 2003).
Essas modificações que ocorrem num determinado ambiente aquático ao
longo de uma escala temporal variada desencadeiam diferentes respostas por parte
da comunidade planctônica, que podem ser utilizadas como parâmetros em estudos
limnológicos. A utilização desta comunidade como bioindicadora se fundamenta na
avaliação da base de uma cadeia ou teia alimentar, na qual os efeitos oriundos
8
dessas
alterações
serão
refletidos
em
todos
os
seus
componentes
e,
conseqüentemente, no bioma como um todo. Mudanças na comunidade
fitoplanctônica são reflexos das alterações físicas, químicas e/ou biológicas que
ocorrem num corpo d’água.
Um grupo de microrganismos que merece atenção neste processo de
alteração ambiental são as cianobactérias, cianofíceas ou algas azuis.
As cianobactérias representam um risco à saúde humana, quando em
reservatórios de abastecimento acontece o fenômeno chamado floração ou bloom,
causado pela multiplicação excessiva. Esse fenômeno ocorre através de alguma
interferência, que enriquece a água com fósforo e nitrogênio, a chamada
eutrofização. As florações de cianobactérias formam geralmente uma imensa massa
na superfície da água causando desequilíbrio ecológico e problemas à saúde.
Assim, pode ocorrer mortandade de peixes e de outros animais e como algumas
espécies de cianobactérias produzem as cianotoxinas, estas florações podem
representar sérios riscos à saúde humana.
As toxinas liberadas podem lesar o
fígado (hepatotoxinas), o sistema nervoso (neurotoxinas), ou apenas provocar
irritações na pele. A única forma de saber se uma espécie de cianobactéria está
produzindo toxinas é através de análises laboratoriais (AZEVEDO et al., 2005).
Considerando a interferência que estes microrganismos podem promover nos
ecossistemas aquáticos, a Portaria 518 (BRASIL, 2004) e Resolução 357 (BRASIL,
2005a) exigem a o monitoramento e a contagem em número de células por mililitro.
9
1.2 Objetivos
1.2.1 - Geral
Apresentar
as
empresas
de
saneamento
e
relatar
os
diferentes
procedimentos metodológicos utilizados na contagem de células de cianobactérias,
objetivando:
1.2.2 – Específico
O conhecimento das normas existentes, e das empresas de saneamento que
necessitam operacionalmente dos resultados dessa contagem objetivando monitorar
e operar os diversos ambientes aquáticos para abastecimento público;
A divulgação dos procedimentos adotados pelas empresas de saneamento
para quantificação de cianobactérias, desde o momento da coleta, preparação da
amostra, microscópio utilizado e calibração do mesmo.
10
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Meio ambiente e cianobactérias
Em fevereiro de 1996, um fato inédito despertou a atenção das autoridades
médicas do estado de Pernambuco, Brasil. Em uma clínica de hemodiálise em
Caruaru pacientes começaram a apresentar náuseas, vômitos após procedimentos
nos dialisadores. Mais de sessenta pacientes morreram. Após investigação das
autoridades de saúde, se descobriu a causa das mortes: toxinas de cianobactérias.
Em 1999 o Rio Darling, na Austrália, ficou coberto por um tapete verde de
cianobactérias, que teve como conseqüência a morte de vários animais selvagens e
também do gado. A descrição de ocorrências de cianobactérias e a contaminação
de ambientes aquáticos por suas toxinas têm sido relatadas em vários países como
Austrália, Inglaterra, China, África do Sul, Alemanha, Itália, Argentina e Brasil, sendo,
portanto, parte da literatura toxicológica mundial. Estes fatos e outros envolvendo
morte de animais, desequilíbrio dos ecossistemas aquáticos e perda de recursos
financeiros trouxeram varias perguntas à cena. O que são cianobactérias? Como
afetam o Meio Ambiente? Existe remediação para um ambiente impactado por
toxinas de cianobactérias? (YUNES, 2005).
A origem das cianobactérias foi estimada em cerca de 3,5 bilhões de anos
pela descoberta de fósseis do que foram certamente esses microorganismos, em
rochas sedimentares encontradas no noroeste da Austrália. As cianobactérias estão,
portanto, entre os organismos pioneiros na Terra, sendo provavelmente os primeiros
produtores primários de matéria orgânica a liberarem oxigênio elementar na
atmosfera primitiva. A capacidade de crescimento nos mais diferentes meios é uma
das características marcantes das cianobactérias. Várias espécies vivem em solos e
rochas onde desempenham um importante papel nos processos funcionais do
ecossistema e na ciclagem de nutrientes. Entretanto, ambientes de água doce são
os mais importantes para o crescimento de cianobactérias, visto que a maioria das
espécies apresenta um melhor crescimento em águas neutro alcalinas (pH 6-9),
temperatura entre 15 a 30ºC e alta concentração de nutrientes, principalmente
nitrogênio e fósforo (AZEVEDO, 1998).
11
2.2 Porque monitorar ?
O controle das cianobactérias em mananciais de abastecimento é importante
devido ao seu potencial tóxico. A Portaria 518 (BRASIL, 2004), relativa às normas de
qualidade para água de consumo humano (Potabilidade), estabelece que os
responsáveis por estações de tratamento de água para abastecimento público
devem realizar monitoramento de cianobactérias e controle de cianotoxinas nos
mananciais.
Também
a
Resolução
357
(BRASIL,
2005a)
contempla
o
monitoramento destes organismos (CETESB, 2005a).
As toxinas presentes na água doce são produzidas quase exclusivamente por
cianobactérias. Os vários gêneros e espécies de cianobactérias produzem diferentes
compostos tóxicos, normalmente classificados como neurotoxinas, hepatotoxinas,
citotoxinas e endotoxinas. Embora as neurotoxinas sejam altamente tóxicas, sua
degradação na coluna de água geralmente é rápida. Entretanto, as saxitoxinas são
exceção, e as reações para sua depuração podem levar semanas. Além disso,
torna-se
difícil
a
remoção
de
hepatotoxinas
de
reservatórios
contendo
cianobactérias, já que algumas formas são estáveis e resistentes à hidrólise química,
ou oxidação, podendo persistir por meses, ou anos, e permanecer potentes mesmo
após fervura (UNEP, 2001).
O monitoramento de cianobactérias promove o diagnóstico de floração ou
bloom (Figura 1) destes gêneros ou espécies que são potencialmente tóxicos,
auxiliam na avaliação da estrutura dos ecossistemas aquáticos, permite analisar o
desequilíbrio na abundância das espécies e fornece informações para a tomada de
decisões no monitoramento e gerenciamento de lagos e represas, proporcionando
desta maneira uma redução nos impactos causados por esses microrganismos.
12
Figura 1 – Superfície da água com floração de Microcystis
Fonte : Imagem cedida por SOUZA, (2001).
2.3 Legislação
A
portaria
518
(BRASIL,
2004)
estabelece
os
procedimentos
e
responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para
consumo humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências.
Esta portaria obriga o monitoramento já no seu artigo 2º. “...obrigação do
monitoramento de cianobactérias e cianotoxinas.” e cita no § 1º. do artigo 17 que,
para análise de cianobactérias, “...até o estabelecimento de especificações em
normas nacionais ou internacionais que disciplinem a matéria, devem ser adotadas
as metodologias propostas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) em sua
publicação Toxic Cyanobacteria in Water: a guide to their public health
consequences, monitoring and management”. Portanto, as metodologias que não
forem citadas na publicação acima, deverão receber aprovação e registro pelo
Ministério da Saúde e as empresas que não realizarem as análises em laboratório
próprio, poderão contratar este serviço, em qualquer caso, deverá manter-se
13
programas de controle de qualidade ou ainda serem acreditados ou certificados por
órgãos competentes para esse fim.
O artigo 18 § 5º. diz que o monitoramento de cianobactérias deverá ser
agregado de monitoramento semanal de cianotoxinas quando o número de células
exceder 20.000 cel/ml. Já no artigo 19 § 1º. o monitoramento deverá ser mensal
quando o valor total de cianobactérias não ultrapassar 10.000 cel/ml e semanal
quando o número de cianobactérias exceder este valor. Ainda no artigo 19 § 2º.
considerando também uma questão de saúde coletiva e riscos envolvidos no
processo de controle de crescimento algal associado a cianotoxinas que podem ser
liberadas pelas cianobactérias no momento de lise celular, ficou estabelecido o veto
a aplicação de algicidas no manancial quando a densidade de cianobactérias
exceder 20.000 cel/ml no ponto de captação.
A Resolução 357 (BRASIL, 2005a) dispõe sobre a classificação dos corpos de
água e cita diretrizes para o seu enquadramento, bem como estabelece as
condições e padrões de lançamento de efluentes e dá outras providências.
A citação sobre a densidade de cianobactérias neste ato jurídico ocorre
primeiramente como parâmetro na Tabela 1 do Artigo 14 que trata das águas doces
de Classe 1 (Tabela 1) e define o valor de 20.000 cel/ml como valor máximo
permitido para o enquadramento de águas desta classe.
14
Tabela 1 – Classificação dos corpos d’água, considerando a densidade de cianobactérias.
Classificação dos corpos d’água e diretrizes para o enquadramento,
considerando a densidade de cianobactérias
CLASSE
CLASSE 1
CLASSE 2
CLASSE 3
Descrição
Densidade
Abastecimento humano após tratamento simplificado, recreação
com contato primário, irrigação de hortaliças consumidas cruas.
Abastecimento após tratamento convencional, recreação de contato
primário, irrigação hortaliças e frutíferas, aqüicultura e pesca.
Abastecimento
após
tratamento
convencional
ou
avançado,
recreação de contato secundário, dessedentação de animais.
20.000 cel/ml
50.000 cel/ml
100.000 cel/ml
Fonte : Adaptado de BRASIL, (2005a).
O valor máximo permitido nas águas de Classe 2 é de até 50.000 cel/ml,
tratado no artigo 15, item VIII.
Para águas de Classe 3, que trata o artigo 16, existe uma peculiaridade, pois,
separa o valor máximo permitido para dessedentação de animais e o valor
efetivamente aplicado como máximo permitido. No item h, a densidade de
cianobactérias não deverá exceder 50.000 cel/ml quando o uso desta água for para
dessedentação de animais, mas existe um outro valor máximo na tabela III de
100.000 cel/ml permitido para o enquadramento deste corpo d’água.
2.4 Biologia das cianobactérias
São microrganismos procarióticos autotróficos, também denominados como
cianofíceas (algas azuis), capazes de ocorrer em qualquer manancial superficial
especialmente naqueles com elevados níveis de nutrientes (nitrogênio e fósforo),
podendo produzir toxinas com efeitos adversos à saúde (BRASIL, 2004). São
componentes naturais do fitoplâncton e habitam ambientes marinhos, estuarinos e
de água doce (CARMICHAEL, 2001 apud COSTA, 2003).
A fotossíntese é seu principal meio para obtenção de energia e manutenção
metabólica. Seus processos vitais requerem somente água, dióxido de carbono,
substâncias inorgânicas e luz (AQUAHOBBY, 2005).
15
As formas e organização das células são variadas, podendo ser unicelulares,
coloniais ou filamentosas (CETESB, 2005c).
Indivíduos unicelulares podem ser esféricos, ovóides, cilíndricos, oblongos,
elípticos ou coloniais com divisão em um, dois ou três planos (ordem Chroococcales)
ou divisão celular com formação de exósporos (ordem Chamaesiphonales ) e divisão
em vários planos (ordem Pleurocapsales ). Em ambos os tipos, as células podem
apresentar ou não envelope mucilaginoso. As colônias podem ser formadas por
poucas células (2 a 16) ou centenas de células e podem apresentar diversas formas
como: arredondadas, alongadas, tabulares, cúbicas ou
irregulares. As formas
unicelulares e coloniais são denominadas genericamente de cianofíceas cocóides
(CETESB, 2005c).
Indivíduos filamentosos, formados por cadeias de células resultantes da
divisão celular em um único plano (filamentos), envolvidos ou não por bainha
mucilaginosa, constituindo os tricomas. Tricomas unisseriados, não ramificados e
com apenas células vegetativas (homocitados) são características da Ordem
Oscillatoriales. Tricomas que apresentam células especializadas (heterocitados) do
tipo heterócitos (Figura 2 – B – última célula abaixo), cuja função é a fixação
biológica do nitrogênio atmosférico ou apresentam esporos, denominamos acinetos
(Figura 2 – B – 1ª célula acima) (células geralmente bem maiores que as demais e
com membrana espessa devido a presença de maior concentração de substância de
reserva) constituem as Ordens Nostocales e Stigonematales. Nestas ordens, os
tricomas podem apresentar ramificações do tipo falsa, quando um ramo é formado a
partir de divisão celular sempre perpendicular ao eixo maior do tricoma ou
verdadeira, quando o ramo é formado a partir da divisão celular paralela ao eixo
maior do tricoma (CETESB, 2005c).
Algumas espécies como as do gênero Pseudanabaena (Figura 2 – F),
Geitlerinema, Oscillatoria (Figura 2 – C), por exemplo, possuem capacidade de
movimento, possivelmente por difusão da mucilagem no meio líquido (CETESB,
2005c).
16
Figura 2 – Gêneros de cianobactérias freqüentemente encontrados em ambientes aquáticos.
A – Anabaena (1000x); B – Anabaena com acineto e heterocito (1000x); C – Oscillatoria (400x);
D – Merismopedia (1000x); E – Microcystis (400x); F – Pseudanabaena (1000x).
Fonte : Imagens produzidas por MACEDO, (2005).
A reprodução das cianobactérias é sempre assexuada do tipo fissão binária
em um ou mais planos, ou múltiplas com a formação de baeócitos (anteriormente
chamados de endósporos). As formas coloniais também se multiplicam pela
fragmentação das colônias, além da simples divisão celular e os filamentos pela
simples quebra do tricoma em pequenas partes denominadas hormogônios ou a
partir de uma célula morta denominada necrídio (CETESB, 2005c; AQUAHOBBY,
2005).
Em alguns grupos de cianofíceas, os hormogônios formam-se envoltos numa
espessa bainha e neste caso, como funcionam com uma estrutura de resistência são
chamados hormocistos (CETESB, 2005c).
17
2.5 Toxinas
Nos programas de monitoramento das cianobactérias para águas de
abastecimento, normalmente é exigida apenas a contagem do número de células
que são as unidades produtoras da toxina. Porém é importante a identificação dos
organismos dominantes, pelo menos até o nível genérico, para saber se já são
conhecidos seus efeitos tóxicos, já que diferentes gêneros e espécies produzem
diferentes toxinas (SANT’ANNA et al., 2006).
CARMICHAEL, (1992) apud Di BERNARDO, (2003) define toxinas como
compostos secundários que produzem efeitos nocivos em outros tecidos, células ou
organismos. Compostos secundários referem-se àqueles compostos que não são
usados pelo organismo no metabolismo primário. Incluem hormônios, antibióticos,
aleloquímicos e toxinas. De acordo com suas estruturas químicas, as toxinas de
algas podem ser divididas em três grandes grupos: os peptídeos cíclicos, os
alcalóides e os lipopolissacarídeos. Os peptídeos cíclicos mais comumente
encontrados em florações de cianobactérias tóxicas de águas doces e salobras são
das famílias da microcistina e nodularina. A microcistina é um heptapeptídeo e a
nodularina, um pentapeptídeo.
Os alcalóides, em geral, compreendem grande grupo de compostos
nitrogenados heterocíclicos (apresentam estrutura em anel com um nitrogênio ligado
ao último anel). Dentre os alcalóides destacam-se: as anatoxinas e as saxitoxinas,
produzidas
por
cianobactérias
de
água
doce
dos
gêneros
Anabaena,
Aphanizomenon, Lyngbia e Cylindrospermopsis. As saxitoxinas também são
conhecidas como veneno paralisante de mariscos (paralytic shellfish poisoning –
PSP), pois foram isoladas primeiramente de dinoflagelados marinhos, responsáveis
pelas marés vermelhas. A cilindrospermopsina é um alcalóide sulfatado que bloqueia
a síntese protéica com primeiro impacto nas células do fígado. Algumas
cianobactérias marinhas também contêm alcalóides que são principalmente
dermatotóxicas. Os lipopolissacarídeos são integrantes da parede celular de todas
as bactérias gram-negativas, incluindo as cianobactérias, e podem causar irritações
ao contato e respostas alérgicas na pele de humanos e de mamíferos (Di
BERNARDO, 2003).
18
As toxinas de cianobactérias, ou cianotoxinas, apresentam mecanismos
tóxicos específicos em vertebrados e podem ser classificadas de acordo com o
modo de ação em: neurotoxinas (anatoxina-a, anatoxina-a(s) e saxitoxinas),
hepatotoxinas (microcistinas, nodularina e cilindrospermopsina) e endotoxinas ou
dermatotoxinas (lipopolissacarídeos, lingbiatoxinas e aplisiatoxinas). Em geral,
algumas
dessas
toxinas,
especificamente
os
alcalóides
neurotóxicos,
são
caracterizadas por sua ação rápida, causando a morte de mamíferos por parada
respiratória após poucos minutos de exposição. Há aquelas que atuam menos
rapidamente e são identificadas como peptídeos ou alcalóides hepatotóxicos. Outras
ainda (endotoxinas pirogênicas) causam irritações ao contato. Estudos disponíveis
indicam que os lipopolissacarídeos produzidos pelas cianobactérias são menos
tóxicos que os de outras bactérias, como, por exemplo, Salmonella. Em geral, os
sintomas de intoxicação podem ser sintetizados da seguinte forma: a) em águas de
uso recreacional, incluindo as marinhas, são verificadas irritações na pele e nos
olhos, febre, tonturas fadiga e gastroenterite aguda; b) quanto à água potável, são
observadas dores abdominais, náuseas, vômitos, diarréia, irritação da laringe, tosse
seca, dor de cabeça, etc., e elevados níveis de enzima no soro, indicando danos ao
fígado. Na Tabela 2 são apresentados os principais gêneros de cianobactérias
potencialmente produtoras de toxinas e os tecidos (órgãos) afetados em seres
humanos (Di BERNARDO, 2003).
19
Tabela 2 - Principais gêneros de cianobactérias potencialmente produtoras de toxinas.
Fonte : Di BERNARDO, (2003).
2.6 Contagem de cianobactérias
2.6.1 – Tecnologias e equipamentos
Existem diversos métodos para quantificar o fitoplâncton.
Pode-se quantificar a densidade e biomassa de cianobactérias de diversas
formas, seja diretamente pelo número de células ou do número de organismos, por
estimativa de biomassa (biovolume), ou indiretamente pela media de clorofila a.
(SANT’ANNA et all., 2006). Os métodos diretos de quantificação envolvem o uso de
câmaras especiais para microscópio. Os métodos indiretos incluem técnicas
nefelométricas, medição de clorofila, medição de ATP, estimação de DNA, uso de
citometria de fluxo e de contadores eletrônicos de partículas. Este último é
particularmente útil quando se necessita de uma informação relativamente rápida e
precisa das categorias de tamanhos presentes na comunidade, mas sua principal
desvantagem está na impossibilidade de observar e identificar os organismos e de
distinguir o material orgânico do inorgânico (VILLAFAÑE & REID 1995).
Utilizando também um espectrofotômetro, como cita DUARTE et al. (1990), é
possível realizar uma correlação entre (número de células/ml) e absorbância, lida
através de espectrofotômetro em comprimento de onda igual a 750 nm, (para a
20
Cloforícea Chlorella homosphaera) e a partir de diluições consecutivas da cultura no
início da fase estacionária de crescimento são feitas medidas e determina-se a curva
de correlação entre a população de algas e a absorbância.
A contagem celular por microscópio óptico, apesar de trabalhosa quando
utilizado um grande número de réplicas e concentrações, permite observar
anormalidades que podem ocorrer com relação ao tamanho ou ao formato das
células. Existem vários tipos de câmaras que podem ser utilizadas para contagem de
algas, tais como: Sedgwick-Rafter (Figura 3), Neubauer, Utermöhl (Figura 4),
Palmer-Maloney, dentre outras. A escolha do tipo de câmara dependerá do tamanho
e da abundância das algas em estudo (ARAÚJO, 2001).
Figura 3 – Câmaras de Sedgwick-Rafter, dimensões: 50 mm por 20 mm de lado e 1 mm de
profundidade, com capacidade de 1ml de amostra.
Fonte : Imagens produzidas por MACEDO, (2005).
21
B
A
C
Figura 4 – Câmaras de Utermöhl.
Fontes : A – VILLAFAÑE & REID, (1995); B – MACEDO, (2005); C – AGUJARO, (2005).
Pode-se utilizar microscópio ótico, comum (Figura 5 - A) para observação
qualitativa do material e para observação quantitativa quando for utilizada câmara de
Sedgwick-Rafter. A ocular utilizada é geralmente de 10x e as objetivas de 10, 20, 40,
63 (opcional) e 100x são recomendadas. Esta última é importante para visualização
de indivíduos de dimensões muito pequenas e para evidenciar septos em filamentos
ou inclusões celulares. A contagem é realizada com objetiva 40x (esta deverá ser de
longa distância), podendo ser utilizada a de 20x quando há dominância de indivíduos
com grandes dimensões (SANT’ANNA, et al., 2006)
22
A
B
Figura 5 – A – Microscópio binocular ótico comum com câmara de Sedgwick-Rafter, B - Microscópio
invertido, com câmera digital acoplada ao computador e dispositivo de epifluorescência.
Fonte : Imagens produzidas por MACEDO, (2005).
A contagem pelo método de Sedgwick-Rafter apresenta a vantagem de ser
uma das mais precisas, desde que se proceda com cuidado em todas as operações
e que se utilize grande número de campos. No caso de águas excepcionalmente
ricas em algas ou cujos microrganismos existentes sejam de tamanho muito
reduzido, o emprego da ocular micrométrica de Whipple permite que se contenham
os organismos existentes apenas em uma parte do campo, desde que,
naturalmente, se inclua esse fator no equacionamento final (BRANCO, 1986).
O equipamento deverá ter Retículo de Whipple (Figura 6) para a contagem e
ocular de medição usada para realizar medidas dos organismos necessárias à sua
identificação (SANT’ANNA, et al., 2006).
A mesma configuração deverá apresentar o microscópio invertido (Figura 5-B)
quando for utilizado o método de quantificação, segundo a técnica de Utermöhl, que
é o mais preciso e recomendado para a quantificação desses organismos
(SANT’ANNA, et al., 2006).
23
Figura 6 – Retículo de Whipple com uma colônia de Microcystis sobreposta, sem escala.
Fonte : Imagem produzida por MACEDO, (2005).
2.6.2 – Técnicas de concentração de amostras
Os organismos contidos em amostras de água, às vezes, necessitam ser
concentrados em laboratório antes da análise (A.P.H.A., 1998). Várias técnicas
foram desenvolvidas, todas elas apresentando vantagens e desvantagens, devendo
cada qual ser aplicada de acordo com o objetivo do estudo (SANT’ANNA, et al.,
2006; CETESB, 2005a).
2.6.2.1 – Filtração em membranas
O método de filtração da amostra de água através das membranas especiais
de celulose, utilizadas para contagem de bactérias, pode ser empregado, também,
para identificação e contagem de plâncton (BRANCO, 1986).
delicadas
de
flagelados
são
destruídas,
mesmo
com
Porém, formas
baixas
pressões
(A.P.H.A.,1998).
Geralmente as membranas utilizadas têm o diâmetro de poro de 0,45 µm com
47 mm de diâmetro e espessura de 0,15mm (BRANCO, 1986; A.P.H.A., 1998).
A utilização dessas membranas requer um aparelho especial de filtração a
vácuo que consiste, geralmente, em um funil de vidro ou de aço inoxidável, em cuja
24
abertura inferior, que tem aproximadamente o diâmetro da membrana, ajusta-se uma
peça, também em forma de funil com a boca fechada por uma superfície de vidro
poroso, sobre a qual se apóia a membrana. O tubo de saída desse segundo funil, é
ajustado à rolha de um frasco de Kitassato, ligado a um bomba pneumática
(BRANCO, 1986).
Após
preparado
a
aparelhagem
acrescenta-se
a
amostra,
pequena
quantidade de iodeto de potássio em solução saturada ou então 4% de formalina.
Na finalização do procedimento a membrana deverá ficar secando por 24 horas para
depois visualizar no microscópio (BRANCO, 1986).
2.6.2.2 – Centrifugação
O método da centrifugação fornece resposta mais rápida, porém pode causar
perda de organismos nas diferentes etapas do processo, alteração de seu aspecto e
rompimento das células (SANT’ANNA et al., 2006).
No tipo mais comum de centrífuga de laboratório, coloca-se um volume
conhecido e a amostra é centrifugada por 20 minutos a aproximadamente 1000 rpm.
(VILLAFAÑE & REID, 1995). Segundo CETESB (2005a), considerando dois tubos de
50ml, a amostra é centrifugada a 2500 rpm para o mesmo tempo.
Após a centrifugação elimina-se o sobrenadante cuidadosamente, até chegar
a um volume concentrado de amostra necessária para contagem, se a contagem for
feita em câmaras de Sedgwick-Rafter, utiliza-se 1ml (VILLAFAÑE & REID, 1995).
Devido principalmente à sua rapidez, como também a simplicidade de
execução, o método de centrifugação pode ser utilizado para programas de controle
de qualidade de água e mesmo monitoramento, quando a decantação não é viável
(CETESB, 2005a).
25
2.6.2.3 – Sedimentação (Utermöhl)
É o método mais conhecido e envolve o uso do microscópio invertido. Este
método foi introduzido por Utermöhl em 1931, embora a versão utilizada atualmente
é aquela descrita por UTERMÖHL (1958), apud VILLAFAÑE & REID, (1995). O
princípio da técnica do microscópio invertido consiste em deixar sedimentar uma
amostra em um cilindro de sedimentação, de maneira tal, que, depois de um certo
tempo pode-se assumir que todos os organismos presentes na amostra se
encontram na base de vidro da câmara de sedimentação. Então o cilindro se separa
da câmara e é possível observar os organismos no microscópio invertido
(VILLAFAÑE & REID, 1995).
A concentração da amostra em câmaras de Utermöhl é a mais recomendada,
pois evita perdas ou danos dos organismos durante o processo. Dependendo do
número de algas presentes na amostra, utilizam-se câmaras de volumes diferentes:
2, 5, 10, 50 ou 100ml (Figura 4 – A). As de 2,5 e 10ml são as mais comumente
empregadas para ambientes eutróficos (SANT’ANNA et al., 2006).
Na preparação da amostra, esta, deve estar bem homogeneizada antes de
colocar no cilindro de sedimentação, para isto é necessário agitar suavemente para
não destruir as colônias. Uma vez colocada a amostra no cilindro, tampa-se a parte
superior (Figura 7 – a) para evitar a perda do material pela parte inferior devido a
pressão hidrostática. Depois de um tempo (variável de acordo com o volume da
amostra), o cilindro com o sobrenadante se separa da base usando um vidro
quadrado, que serve também para tampar a amostra que contem o fitoplâncton
(Figura 7 – b). O sobrenadante da amostra é eliminado por um pequeno orifício que
existe na base retangular, quando retira-se a tampa circular que se encontrava sobre
o cilindro de sedimentação (Figura 7 – c). A câmara, coberta com um vidro, contem
os organismos que serão contados (Figura 7 – d) (VILLAFAÑE & REID, 1995).
26
Figura 7 – Diagrama que mostra o processo de sedimentação de
uma amostra de fitoplâncton. a) A amostra é colocada no cilindro
de sedimentação e é tampada; b) Depois de um tempo, o
fitoplâncton terá sedimentado na câmara e o cilindro desliza para
o orifício pequeno da base; c) O cilindro é descoberto para
eliminar a água; d) A câmara contém agora somente o material
sedimentado.
Fonte : VILLAFAÑE & REID (1995).
Geralmente quando utiliza-se câmaras de sedimentação de 10ml o tempo de
sedimentação é de pelo menos 3 horas (até 4 horas) para cada centímetro de altura
do líquido (CHORUS & BARTRAM, 1999) (LUND et al., 1958 apud VILLAFAÑE e
REID 1995). O problema do tempo necessário para alcançar uma completa
sedimentação de todos os organismos da amostra tem sido tratado em vários
trabalhos (LUND et al., 1958; MARGALEF, 1969; EVANS, 1972; FURET &
BENSON-EVANS, 1982 apud VILLAFAÑE e REID 1995). O tempo de sedimentação
não depende só da quantidade da amostra, também do fixador utilizado. Em geral,
considera-se que as amostras fixadas com lugol sedimentam mais rapidamente que
aquelas fixadas com formol (HASLE, 1978 apud VILLAFAÑE e REID 1995).
UTERMÖHL, (1958) apud VILLAFAÑE e REID, (1995), recomendava um
tempo de sedimentação de pelo menos 24 horas, enquanto que LUND et al., (1958)
apud VILLAFAÑE e REID (1995) recomendava 18horas para cilindros de 100ml e
1 hora para os de 1ml WILLÉN, (1976) apud VILLAFAÑE e REID, (1995), sugeria
8 horas para cilindros de 10ml e 48 horas para os de 50ml e 100ml. Porém cada
pesquisador deve avaliar qual é o tempo adequado de sedimentação, de acordo
com o volume, tipo da amostra e fixador ou preservativo utilizado. Em geral, não é
recomendável o uso de cilindros de sedimentação muito altos (por exemplo, de
27
100ml), devido a tendência de alguns organismos (especialmente coloniais) ficarem
aderidos na parede (PAASCHE, 1960 apud VILLAFAÑE & REID, 1995).
2.6.2.4 – Sedimentação em proveta
Se não houver disponibilidade de um microscópio invertido ou centrífuga,
também é possível sedimentar a amostra em proveta e desprezar o sobrenadante
(SANT’ANNA, et al., 2006), (CETESB, 2005a), deixando um volume conhecido para
ser utilizado em câmara de Sedgwick-Rafter (SANT’ANNA, et al., 2006). Neste
procedimento pode haver perda de organismos (CHORUS & BARTRAM, 1999)
(SANT’ANNA et al. 2006).
Geralmente as amostras fixadas com lugol são transferidas para uma proveta
de 1000ml e deixadas em repouso por tempo variado, dependendo da concentração
este tempo pode variar de 12 horas, 24 horas ou mais, caso seja evidenciado
floração de cianobactérias que possuem aerótopos (JARDIM1, informação verbal).
É possível adicionar algumas gotas de detergente que quebra a tensão
superficial, se a dominância de indivíduos na amostra for de células que apresentam
aerótopos ou grandes bainhas mucilaginosas que interferem na sedimentação
(SANT’ANNA et al., 2006).
Após o período de repouso é retirado 900ml ou 950ml por sifonação com
auxílio de uma bomba de vácuo e do concentrado é retirado uma alíquota para a
análise (JARDIM1, informação verbal).
2.6.2.5 – Método de sedgwick-rafter
Este método é descrito na 11ª publicação de A.P.H.A., (1960). Nesta
publicação é possível encontrar o método, exatamente com este nome, já na 12ª
edição A.P.H.A., (1965) o nome foi alterado para Filtração em areia.
O sistema de filtração, diagrama fotográfico, descrito em A.P.H.A. edições 11ª
e 12ª tem origem nos trabalhos de WHIPPLE et al. (1927) apud A.P.H.A. (1960 e
1965), e a partir da 13ª. edição de A.P.H.A. (1970) não mais foi descrita esta técnica.
28
Nesse método, a amostra é, inicialmente, concentrada por meio de filtração
através de areia fina. Isto é realizado em um funil especial, denominado funil de
Sedgwick-Rafter, (Figura 8) com capacidade geralmente, para 500ml de água. À
abertura inferior desse funil é ajustada uma rolha de borracha, com uma perfuração
no centro, onde se adapta um tubo fino de vidro, que servirá como sifão, que se
adapta, pela outra extremidade, a um tubo de borracha, ligado a um aparelho de
sucção. Sobre o orifício superior da rolha é colocado um disco de tecido de malhas
muito finas (o mesmo que são feitas as redes de plâncton) e, sobre esta, uma
camada de aproximadamente 10 ou 12mm de altura de areia fina. Essa areia pode
ser de praia, branca, lavada, que passe em peneira n.º 60 ( série U.S.) e que seja
retida pela n.º 120 (BRANCO, 1986)
Figura 8 – Método de concentração com funil de Sedgwick-Rafter
Fonte : Imagem produzida por MACEDO, (2005).
A filtração é realizada do seguinte modo: ajusta-se à extremidade inferior do
funil, a rolha já presa ao sifão de vidro e levando, na sua superfície superior, o disco
de seda, exatamente no centro, de maneira a cobrir perfeitamente o orifício por onde
se vai dar a saída da água. A areia deve ser colocada, previamente, em um copo
com água; agitando-se rapidamente o copo, em seguida, pequenas quantidades do
1
Informação fornecida por JARDIM, F., em São Paulo, em 2006.
29
seu conteúdo no funil, repetidas vezes, até que a areia levada em suspensão na
água, complete a altura desejada sobre a rolha, na saída do funil. Retira-se a água
por sucção, para, em seguida, adicionar-se o volume de amostra a ser concentrado.
Esta deve ser derramada suave e lentamente, escorrendo junto à parede interna do
funil, a fim de não provocar a agitação da areia. Uma vez colocado todo o volume
desejado, faz-se funcionar o aparelho de sucção, procedendo-se à filtração. Essa
filtração não deve ser muito rápida. De quando em quando, deve-se proceder a uma
agitação do líquido, por meio de um bastão de vidro, a fim de impedir a precipitação
das algas sobre a parede interna do funil, especialmente na região cônica deste.
Outra maneira de remover o material aderente consiste em lavar, de quando em
quando, as paredes internas do funil, com água isenta de algas. Não é muito
aconselhável o uso de água destilada, uma vez que esta, não contendo uma
concentração adequada de sais, poderá causar o rompimento (plasmólise) ou
deformação das células (BRANCO, 1986)
Após sugada toda a água, retira-se a rolha, juntamente com o disco de seda e
recolhe-se num becker. A seguir, adiciona-se água isenta de algas nas paredes
internas do funil, de modo a lavá-las, removendo toda a areia (e organismos). Essa
água deverá ser totalmente recolhida por meio do frasco onde já estão a areia e o
disco de seda. Agita-se repetidas vezes, esse Becker, a fim de desprender todos os
organismos dos grãos de areia, deixa-se decantar rapidamente esta última, para, em
seguida, com uma pipeta de um mililitro, retirar a amostra do sobrenadante, que será
utilizada para contagem (BRANCO, 1986).
30
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta de informações
As informações para este trabalho foram obtidas através de contato telefônico
e/ou correio eletrônico com os biólogos e outros profissionais que atuam em diversas
empresas de 16 estados brasileiros mais o Distrito Federal (Figura 9), totalizando 19
empresas que atuam no setor de saneamento ambiental, sendo elas de nível
estadual ou municipal (Tabela 3). Os analistas consultados atuam no monitoramento
de cianobactérias direta ou indiretamente e puderam informar com clareza o
procedimento adotado por cada uma delas.
Figura 9 – Mapa do Brasil, círculo em vermelho indicam as regiões consultadas para o trabalho.
Fonte : Adaptado de WIKIPEDIA, (2006).
31
Tabela 3 – Relação das empresas de saneamento consultadas.
Localização
Instituição
Alagoas
CASAL
Companhia de Abastecimento D’água e Saneamento de Alagoas
Bahia
EMBASA
Empresa Baiana de Águas e Saneamento S.A.
Ceará
CAGECE
Companhia de Águas e Esgotos do Ceará
Distrito Federal - Brasília
CAESB
Companhia de Saneamento Ambiental do Distrito Federal
Espírito Santo
CESAN
Companhia Espírito Santense de Saneamento
Goiás
SANEAGO
Companhia de Saneamento de Goiás
Mato Grosso do Sul
SANESUL
Companhia de Saneamento do Estado do Mato Grosso do Sul
Minas Gerais
COPASA
Companhia de Saneamento de Minas Gerais
Paraíba
CAGEPA
Companhia de Água e Esgotos da Paraíba
Paraná
SANEPAR
Companhia de Saneamento do Paraná
Piauí
AGESPISA
Companhia de Águas e Esgotos do Piauí S.A.
Rio de Janeiro
CEDAE
Companhia Estadual de Águas e Esgotos
Rio Grande do Sul
CORSAN
Companhia Riograndense de Saneamento
Rondônia
CAERD
Companhia de Águas e Esgotos de Rondônia
Santa Catarina - Blumenau
SAMAE
Serviço Autônomo Municipal de Água e Esgoto
São Paulo
SABESP
Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo
São Paulo - Campinas
SANASA
Sociedade de Abastecimento de Água e Saneamento S/A
São Paulo - Piracicaba
SEMAE
Serviço Municipal de Água e Esgoto
Tocantins
SANEATINS
Companhia de Saneamento do Tocantins
Fonte : Adaptado de AESBE, (2006).
3.2 Resumo dos procedimentos
AGESPISA e CAGEPA
AGESPISA – Companhia de Águas e Esgotos do Piauí S.A.
Piauí
CAGEPA – Companhia de Água e Esgotos da Paraíba
Paraíba
Estas empresas não realizam contagem de cianobactérias, mas enviam ao
ITEP – Instituto Tecnológico de Pernambuco (ALENCAR
2
, MENESES
3
comunicação pessoal).
2
ALENCAR, B.B. Informações sobre análise de fitoplâncton de água bruta [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por
<[email protected]> em 13. abr. 2006.
,
32
Segundo MENESES3, (comunicação pessoal):
* O método utilizado pelo ITEP é o Utermöhl. As amostras para análise
quantitativa são fixadas com solução de lugol;
* As amostras de água bruta são sedimentadas em câmaras de 2,973ml e as
amostras de água tratada sedimentam em câmaras de 10ml;
* A contagem do número de células é realizada em microscópio invertido,
num aumento de 400 vezes.
CAERD
CAERD – Companhia de Águas e Esgotos de Rondônia
Rondônia
Esta empresa está se adequando para instalar um laboratório nos próximos
meses (BAHIA4, informação verbal).
CAESB
Companhia de Saneamento Ambiental do Distrito Federal
Brasília - Distrito Federal
Segundo CAVALCANTI5, (comunicação pessoal); CAESB, (2005):
* Possui um procedimento para análise quantitativa de fitoplâncton, é feita a
contagem dos grupos de algas e para as cianobactérias a contagem de células é
feita somente para o gênero Cylindrospermopsis;
* Nas análises utilizam microscópio invertido, juntamente com câmaras de
Utermöhl com volumes variados (0,13ml; 5ml e 10ml);
* As amostras coletadas são fixadas com lugol e transferidas para câmaras de
sedimentação, cujo volume, a ser decidido pelo analista responsável, deve variar
com a abundância dos organismos a ser determinada;
3
MENESES, A.C.L.S.M.de Análises hidrobiológicas de água bruta – Cianobactérias [mensagem pessoal]. Mensagem
recebida por <[email protected]> em 18. abr. 2006.
4
Informação fornecida por BAHIA,M.A. da S., em São Paulo, em 2006.
CAVALCANTI, C. Análises hidrobiológicas [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por
<[email protected]> em 30. mar. 2006.
5
33
* São utilizados câmaras de 5ml ou 10ml e tempo de sedimentação de 12
horas;
* Depois de finalizado o processo de sedimentação, as câmaras são levadas
ao microscópio invertido e as algas são contadas por toda a câmara ou uma fração
desta. Quando se conta uma fração pode-se fazê-lo sistematicamente (diagonal) ou
aleatoriamente (10 campos escolhidos ao acaso);
* A análise da água tratada também é feita e comparada com a água bruta
para obter o percentual de remoção.
CAGECE
Companhia de Águas e Esgotos do Ceará
Ceará
Segundo CARVALHO6, (comunicação pessoal):
* A CAGECE implantou os trabalhos e análise de fitoplâncton e contagem de
cianobactérias através de parceria e cursos com o biólogo Fernando Jardim da
COPASA de Minas Gerais;
* As amostras coletadas são fixadas com lugol e transferidas para uma
proveta de 1000ml (que será o volume inicial), então esta proveta é deixada em
repouso por 24 horas;
* Após esse período é feito a sifonação de 950ml da amostra com o auxílio de
uma bomba de vácuo e transfere-se 50ml restante (que será o volume final) para um
recipiente, então retira-se 1ml para colocar na câmara de Sedgwick-Rafter;
* O microscópio utilizado é o invertido sem o retículo de Whipple, faz-se a
média dos tricomas e emite os resultados em Org/ml e Cel/ml;
* A análise pode ser efetuada por campos ou por faixas, considera-se para
isso a concentração de organismos na amostra. A contagem deve ser efetuada até
contar 100 organismos do organismo predominante. Normalmente, se em um campo
observa-se 10 ou mais organismos do organismos predominante, a contagem é feita
por campos. Caso contrário, será necessário a contagem por faixas, de um extremo
ao outro da câmara. Ao contar por campos, deve-se atentar para que um campo
jamais sobreponha o outro, evitando contar o mesmo organismo mais de uma vez.
6
CARVALHO, S.M. de C. Procedimento de contagem fitoplâncton [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por
<[email protected]> em 18. abr. 2006.
34
CASAL
CASAL – Companhia de Abastecimento D’água e Saneamento de Alagoas
Alagoas
Esta empresa não realiza este tipo de análise (BISPO7, informação verbal).
CEDAE
Companhia Estadual de Águas e Esgotos
Rio de Janeiro
Segundo SOARES8, (comunicação pessoal):
* As amostras são fixadas em campo, com solução de lugol. Chegando ao
laboratório são colocadas para sedimentar em câmaras de Utermöhl por 24 horas
quando for utilizado câmaras de 10ml e 48 horas para câmaras de 50ml;
* A densidade fitoplanctônica (cel/ml) é estimada segundo a técnica de
Utermöhl em microscópio invertido a 400 vezes. O volume sedimentado é definido
de acordo com a concentração de algas e/ou detritos. O tempo de sedimentação é
de pelo menos três horas para cada centímetro de altura da câmara;
* Os indivíduos (células) são enumerados em campos aleatórios, em número
suficiente para alcançar 100 indivíduos da espécie mais freqüente, sendo o erro
inferior a 20%, a um coeficiente de confiança de 95%. Quando não é possível utilizar
esse critério (amostras com algas escassas e detrito abundante) são contados
indivíduos em tantos campos aleatórios quantos os necessários para que se
estabilize o número de espécies adicionadas por campo (método da área mínima), a
fim de garantir uma representatividade qualitativa mínima de espécies;
* A análise de água tratada não é feita coma a mesma freqüência que a água
bruta, mas quando existe a necessidade é utilizado câmara de Utermöhl de 50ml.
7
Informação fornecida por BISPO, F., em São Paulo, em 2006.
SOARES, M.C.S. Informações CEDAE [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por <[email protected]> em 26.
abr. 2006
8
35
CESAN
Companhia Espírito Santense de Saneamento
Espírito Santo
Segundo ROBIN9, (informação verbal):
* O método de concentração de amostra é a sedimentação em câmaras de
Utermöhl, previamente fixada com lugol. Utilizam câmaras de 5ml, 10ml ou 25ml,
esta última para análise de água tratada;
* A contagem é feita com microscópio invertido no aumento de 400 vezes e
identificam até o nível de gênero;
* O retículo de Whipple é utilizado quando são encontrados cianobactérias
cocóides, como por exemplo Synechocystis, que são comuns nesta região.
COPASA
Companhia de Saneamento de Minas Gerais
Minas Gerais
Segundo JARDIM1, (informação verbal):
* O método de concentração nesta empresa pode variar entre a sedimentação
em câmaras de Utermöhl ou sedimentação em proveta de 1000ml. O preservativo
utilizado é o lugol acético a 5ml adicionado num frasco âmbar de coleta para 1000ml
de amostra;
* Depois de sedimentado a amostra na proveta de 1000ml, com tempo de
repouso de 12 a 24 horas, é feito a sifonação de 900ml e transfere-se o restante
para um outro recipiente. Caso a contagem de organismos não atenda a Distribuição
de Poisson que corresponde a 100 indivíduos da espécie predominante é feita uma
nova concentração, agora, em proveta de 100ml, utilizando a amostra restante da
concentração anterior e permanece em repouso por mais 12 horas, após esse
período retira-se 90ml e dos 10ml restante é feito a contagem;
* As contagens podem ser feitas em microscópio invertido ou ótico comum.
36
Segundo (JARDIM, 2002):
* O aumento utilizado no microscópio invertido nas contagens de células é
200 vezes, mas para contagem de células menores como de algumas
Chroococcaceae utilizam-se aumentos maiores, chegando até 320 vezes;
* No microscópio ótico comum o aumento utilizado é o de 200 vezes com
objetiva de longa distância;
* Na etapa inicial da contagem é feita uma média do número de células em 30
colônias contadas no quadrado maior do retículo de Whipple, isso para as cocóides.
Para as filamentosas, é feito uma média do número de células em 30 tricomas
aleatórios;
* Durante a contagem são contados quantos quadrados sobrepõe as colônias
encontradas e todos os tricomas são contados;
* Para obter o número de células das coloniais basta multiplicar o número de
quadrados maiores contados pela média do número de células e para as
filamentosas basta multiplicar a média do número de células por tricoma pelo
número de tricomas encontrados.
Para verificar a eficiência de remoção na Estação de Tratamento de água
também são feitas análises da água final (JARDIM1, informação verbal).
CORSAN
Companhia Riograndense de Saneamento
Rio Grande do Sul
Segundo GIORDANI10, (comunicação pessoal):
* As análises hidrobiológicas para quantificação de fitoplâncton são realizadas
a mais de 30 anos nesta empresa. Utiliza a Norma Técnica CORSAN – Águas –
Determinação de Fitoplâncton de Água Doce – Técnica de Sedgwick-Rafter, que
teve como base para sua elaboração a Norma Técnica CETESB L5.303 de 1991,
A.P.H.A. de 1995 e CHORUS & BARTRAM de 1999;
9
Informação fornecida por ROBIN, K., em São Paulo, em 2006.
GIORDANI, A.T. Resposta Corsan [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por <[email protected]> em 12.
mai. 2006
10
37
* Após o procedimento de coleta a amostra é trabalhada in vivo e não é
utilizado nenhum reagente para fixar, salvo as condições com grande quantidade de
fitoflagelados, em que é acrescentado Lugol na alíquota da amostra;
* Como método de concentração utiliza a centrífuga e a contagem é feita no
microscópio ótico comum no aumento de 100 vezes e quando necessário altera a
objetiva para 20x, chegando a 200 vezes de aumento;
* Para as cianobactérias filamentosas a contagem é feita de todos os tricomas
em faixas ou campos. As cocóides são contadas no retículo de Whipple, mas
quando apresenta floração é feita a desagregação das colônias;
* São realizadas análises de água final semanalmente e sempre que o
número de células na água bruta estiver acima de 20.000 cel/ml.
EMBASA
Empresa Baiana de Águas e Saneamento S.A.
Bahia
Segundo AMARAL11, (comunicação pessoal); EMBASA, (2005):
* A EMBASA implantou os trabalhos de análise de fitoplâncton e contagem de
cianobactérias através de parceria e cursos com o biólogo Fernando Jardim da
COPASA de Minas Gerais e a partir daí a empresa criou o seu próprio procedimento
operacional;
* As amostras coletadas são fixadas com lugol acético e transferidas para
uma proveta de 1000ml (que será o volume inicial), então esta proveta é coberta
com papel alumínio e deixado em repouso por no mínimo 12 horas e, no máximo 15
dias;
* Após esse período é feito a sifonação de 900ml da amostra com auxílio de
uma bomba de vácuo e transferido os 100ml restantes para uma outra proveta,
agora de 100ml. Deixa-se então em repouso, para sedimentação por um período de
24 a 48 horas. Após esse período, faz-se a sifonação de 50ml e transfere-se os 50ml
restante (que será o volume final) para um erlenmeyer;
11
AMARAL, D. Informações cianobactérias MONOGRAFIA [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por
<[email protected]> em 23. mai. 2006
38
* Quando a amostra apresenta grande quantidade de algas, não é feita a
concentração, simplesmente retira-se 1ml do frasco de coleta e coloca-se na câmara
de Sedgwick-Rafter (volume inicial 1ml e volume final 1ml);
* Utiliza microscópio ótico comum com retículo de Whipple e câmara de
Sedgwick-Rafter no aumento mais apropriado para a amostra;
* Na contagem os biólogos escolhem a objetiva mais apropriada à amostra e
contam as células por campo ou faixas, seguindo a distribuição de “Poisson“;
* Para cianobactérias cocóides como Microcystis, conta-se quantas células
contém num quadrado maior do retículo de Whipple e faz-se uma média para depois
contar quantos quadrados maiores do retículo de Whipple se sobrepõe as colônias
encontradas, então multiplica-se o número de quadrados encontrados pela média do
número de células;
* Para as filamentosas, conta-se a quantidade de células encontradas e
multiplica-se pelo número de filamentos encontrados;
* A empresa possui um sistema informatizado que armazena e disponibiliza
em tempo real os resultados obtidos para todos os usuários conectados, mas esses
resultados são somente de células totais de cianobactérias, conforme obriga a
Portaria 518 (BRASIL, 2004) e não são feitas distinções de gêneros ou espécies.
SABESP
Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo
São Paulo
O histórico de análise de fitoplâncton na SABESP tem praticamente 30 anos,
para resultados em UPA/ml e Org/ml, e os resultados de cianobactérias em
células/ml foram implantados a partir de 1999 (SAWADA12, informação verbal).
Após o procedimento da coleta, a amostra é trabalhada in vivo e não é
utilizado nenhum reagente para fixar, salvo as condições com grande quantidade de
fitoflagelados, então faz-se necessário o preservativo lugol na própria câmara de
Sedgwick-Rafter ou numa alíquota da amostra.
12
Informação fornecida por SAWADA, C., em São Paulo, em 2006.
39
A concentração de amostra e a metodologia de contagem são feitas pelo
método de Sedgwick-Rafter, didaticamente descrita por BRANCO (1986).
As amostras são concentradas em funis de Sedgwick-Rafter através de areia
fina de praia, devidamente esterilizada com solução sulfocrômica na proporção 1:1.
Este método possui a vantagem de ser rápido, pois é possível concentrar uma
amostra em aproximadamente 10 minutos, desde 100ml para água bruta, até
3000ml para análise de água tratada, com auxílio de uma bomba de vácuo, como já
é realizado rotineiramente por esta entidade para quantificar os microrganismos nas
Estações de Tratamento de Água e pelo resultado obtido nas etapas do processo da
ETA é feito a análise estatística e determina-se a eficiência na remoção de
fitoplâncton.
Segundo SABESP, (2005):
* O microscópio utilizado é o ótico comum com objetiva de 10x ou 6,3x e
ocular de 10x e Retículo de Whipple calibrado em 1000 µm de lado;
* Portanto, a contagem das cianobactérias é realizada em aumento de 100
vezes e com retículo de Whipple padronizado em 400 µm2 para cada UPA;
* A contagem de cianobactérias inicia-se da seguinte maneira: Verifica-se a
média de células cocóides que cabem no quadrado menor do retículo de Whipple e
para as filamentosas, a média do número de células que cabem num quadrado
maior do retículo de Whipple (1 organismo = 100µm);
* Para cada tipo de água existe um método de contagem e a definição de qual
método a ser escolhido depende da quantidade de organismos na câmara. Portanto
as filamentosas e as cocóides maiores que 2 UPA são contadas em faixa e as
cocóides menores que 2 UPA em campo, mas, caso a concentração de cocóides for
muito baixa, poderá optar-se pela contagem em faixa.
Este procedimento procura fazer a varredura da maior quantidade de
organismos possível, para que a amostragem seja considerável.
40
SAMAE
Serviço Autônomo Municipal de Água e Esgoto
Blumenau – Santa Catarina
Segundo SCHULZE13, (comunicação pessoal):
* As amostras coletadas são fixadas com lugol, numa proporção de 0,3ml do
reagente para cada 100ml de amostra e transferidas para uma das câmaras de
Utermöhl de volume variado: 2, 10, 50 ou 100ml e permanece em repouso por 24
horas em câmara úmida;
* A escolha da câmara de Utermöhl varia de acordo com a turbidez, conforme
descrito abaixo:
- Turbidez menor que 30 NTU = Utermöhl de 100ml;
- Turbidez maior que 30 NTU até 100 NTU = Utermöhl de 50ml;
- Turbidez maior que 100 NTU até 200 NTU = Utermöhl de 10ml;
- Turbidez acima de 200 NTU é necessário uma diluição da amostra;
* O microscópio utilizado é o invertido no aumento de 400 vezes sem retículo
de Whipple;
* A contagem de células de cianobactérias é feita perpendicularmente, pelo
centro do fundo da câmara de Utermöhl em campo contínuo.
SANASA
Sociedade de Abastecimento de Água e Saneamento S/A
Campinas – São Paulo
Segundo PINTO14, (informação verbal):
* Para concentração das amostras utiliza-se o método de sedimentação em
câmaras de Utermöhl. Faz-se a fixação da amostra, calibração do microscópio
invertido e a metodologia de contagem segundo a norma CETESB L5.303;
* Quando necessitam realizar pesquisa em águas na saída do tratamento das
ETAs, a água é filtrada numa membrana de 0,45 µm, então é feito a raspagem e
13
SCHULZE, E. Confirmação de informações [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por <[email protected]> em
09. mai. 2006
41
posteriormente aplicada sobre uma lâmina comum e visualizada em microscópio.
Este procedimento pode ser considerado como uma análise qualitativa e uma
maneira encontrada pelos biólogos para analisar águas tratadas.
SANEAGO
Companhia de Saneamento de Goiás
Goiás
Segundo CRISTIANA15, (informação verbal):
* Após a coleta de 150ml a 200ml de água bruta as amostras são fixadas com
lugol e adicionadas em câmaras de Utermöhl para a sedimentação;
* A contagem é feita no microscópio invertido com aumento de 400 vezes e
não utilizam retículo de Whipple.
SANEATINS
Companhia de Saneamento do Tocantins
Tocantins
Segundo SILVA16, (comunicação pessoal):
* Os trabalhos desta empresa para quantificação e identificação de
cianobactérias foram propostos por Fernando Jardim da COPASA de Minas Gerais e
baseado também nas Normas técnicas CETESB, A.P.H.A. e Chorus & Bartram;
* As amostras coletadas são fixadas com lugol acético ou Transeau. No
laboratório é adicionado no frasco de vidro âmbar de 1000ml, 5 ml de lugol acético e
transportados ao laboratório para análise;
* No procedimento para realização da contagem pode ocorrer uma alternância
entre as câmaras de Sedgwick-Rafter e de Utermöhl, considerando o tempo para
sedimentação nas câmaras de Utermöhl
pode-se variar entre as de Sedgwick-
Rafter;
14
Informação fornecida por PINTO, A.C.P.P., em São Paulo, em 2006.
Informação fornecida por CRISTIANA., em São Paulo, em 2006.
16
SILVA, J.R.L. Informações cianobactérias MONOGRAFIA [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por
<[email protected]> em 10. mai. 2006
15
42
* Quando as análises são feitas em câmaras de Sedgwick-Rafter, num
aumento de 100 vezes é feito uma sedimentação anteriormente de 1 hora;
* Nas análises em câmaras de Utermöhl são feitas no aumento de 400 vezes,
aguardando 24 horas para a sedimentação e a utilização do Retículo de Whipple
não é freqüente.
SANEPAR
Companhia de Saneamento do Paraná
Paraná
Segundo FARIA17, (comunicação pessoal):
* A SANEPAR baseia-se nos métodos descritos na norma CETESB L5.303 e
na publicação do Standard methods for the examination of water and wastewater;
* As amostras são fixadas com lugol e a concentração é feita em câmaras de
Utermöhl com volume 10ml;
* O microscópio utilizado é o invertido com aumento de 400 vezes.
SANESUL
Companhia de Saneamento do Estado do Mato Grosso do Sul
Mato Grosso do Sul
Esta empresa está se adequando para a implantação deste tipo de análise
(ROBERTO18, informação verbal).
17
FARIA, S.M. da S.S. de. Cianobactérias [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por <[email protected]> em
17. abr. 2006.
43
SEMAE
Serviço Municipal de Água e Esgoto
Piracicaba – São Paulo
Segundo CANALE19, (comunicação pessoal):
* A metodologia adotada como referência para os trabalhos desta empresa é
a Norma Técnica CETESB L5.318;
* As amostras são preservadas com lugol e o procedimento de concentração
pode ser feito por centrifugação (2500 rpm x 20 min.) ou sedimentação em proveta
de 50ml e tempo de repouso de 24 horas. No caso de concentração por
sedimentação, adiciona-se ainda detergente neutro (2 gotas) para quebrar a tensão
superficial, caso a dominância for de cianobactérias que possuem aerótopos;
* O microscópio utilizado é o ótico comum com câmaras de Sedgwick-Rafter
no aumento de 400 vezes com retículo de Whipple;
* Quando existe a necessidade de promover a dissolução da mucilagem de
cianobactérias do gênero Microcystis, por exemplo, adiciona-se hidróxido de
potássio (KOH) à amostra, seguido pelo aquecimento em banho Maria (75ºC) por
30-40 min., e a contagem é feita com as células desprendidas da colônia.
18
Informação fornecida por ROBERTO, J., em São Paulo, em 2006.
CANALE, I. ATT.Ivan Canale – Monografia Adilson [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por
<[email protected]> em 12. mai. 2006.
19
44
Tabela 4 – Tabulação das informações sobre os procedimentos para contagem de cianobactérias.
Reagente fixador /
Localização
Instituição
Câmara de contagem
Fonte
Alagoas
CASAL
Não realizam este tipo de análise
Bahia
EMBASA
Lugol
Sedgwick-Rafter
Norma EMBASA
Ceará
CAGECE
Lugol
Invertido e não usa Retículo de Whipple
Sedgwick-Rafter
Fernando Jardim
CAESB **
Lugol
Sedimentação em Utermöhl
Invertido ou Ótico comum
Utermöhl
CESAN
Lugol
Sedimentação em Utermöhl
Invertido com aumento de 400x
Utermöhl
Utermöhl
SANEAGO
Lugol
Sedimentação em Utermöhl
Invertido com aumento de 400x
Utermöhl
Utermöhl
SANESUL
Em fase de implantação
Minas Gerais
COPASA
Lugol
Sedimentação em Utermöhl ou
Invertido com aumento de 200x e ótico
Proveta de 1000ml
comum com 200x e Retículo de Whipple
Paraíba
CAGEPA *
Lugol
Sedimentação em Utermöhl
Invertido com aumento de 400x
Utermöhl
Paraná
SANEPAR
Lugol
Sedimentação em Utermöhl
Invertido com aumento de 400x
Utermöhl
L5.303 e Standard
Piauí
AGESPISA *
Lugol
Sedimentação em Utermöhl
Invertido com aumento de 400x
Utermöhl
Utermöhl
CEDAE
Lugol
Sedimentação em Utermöhl
Utermöhl
Utermöhl
CORSAN
Não utiliza
Centrifugação
CAERD
Não realizam este tipo de análise
SAMAE
Lugol
Distrito
Federal
Espírito
Santo
Goiás
Mato Grosso
do Sul
Preservativo
Método de concentração
Microscópio
Sedimentação em proveta de
Ótico comum e Retículo de Whipple com
1000ml
aumento de 100x
Sedimentação em Proveta de
1000ml
Utermöhl ou Sedgwick-Rafter
Norma Técnica
CETESB NT 06
Norma COPASA –
Fernando Jardim
Utermöhl
CETESB Norma
Methods
Rio de
Janeiro
Rio Grande
do Sul
Rondônia
Santa
Catarina
Sedimentação em Utermöhl
Invertido com aumento de 400x, não usa
Retículo de Whipple
Ótico comum com aumento de 100x e 200x
Retículo de Whipple
Invertido com aumento de 400x, não usa
retículo de Whipple
Sedgwick-Rafter
Utermöhl
Norma Técnica
CORSAN
Utermöhl
45
Tabela 4 – Tabulação das informações sobre os procedimentos para contagem de cianobactérias. (Continuação)
Reagente fixador /
Localização
Instituição
São Paulo
SABESP
Não utiliza
Sedgwick-Rafter
São Paulo
SANASA
Lugol
Sedimentação em Utermöhl
São Paulo
SEMAE
Lugol
Tocantins
SANEATINS
Preservativo
Método de concentração
Microscópio
Câmara de contagem
Ótico comum com aumento de 100x e
Retículo de Whipple
Invertido com aumento de 400x e Retículo
de Whipple
Centrifugação ou Sedimentação
Ótico comum com aumento de 400x e
em Proveta de 50ml
retículo de Whipple
Lugol acético ou
Sedimentação em Utermöhl ou
Invertido no aumento de 400x ou Ótico
Transeau
Proveta
comum com aumento de 100x
Fonte
Branco, 1986 e
Sedgwick-Rafter
Standard Methods
CETESB Norma
Utermöhl
L5.303
CETESB Norma
Sedgwick-Rafter
L5.318
Norma COPASA,
Utermöhl ou Sedgwick-Rafter CETESB, APHA e
Chorus & Bartram
* Estas empresas realizam as análises através do Instituto Tecnológico de Pernambuco - ITEP
** A CAESB emite laudos de células de cianobactérias somente para Cylindrospermopsis, utiliza microscópio invertido ou ótico comum (para Cylindrospermopsis e demais algas aumento de 32x) e
micrômetro na ocular do microscópio.
1
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15
Fonte : JARDIM ; ALENCAR ; MENESES ; BAHIA ; CAVALCANTI ; CARVALHO ; BISPO ; SOARES ; ROBIN ; GIORDANI ; AMARAL ; SAWADA ; SCHULZE ; PINTO ; CRISTIANA ;
16
17
18
19
SILVA ; FARIA ; ROBERTO ; CANALE ; (Notas de rodapé referente a fonte, citadas nas páginas anteriores); CAESB, (2005); SABESP, (2005); EMBASA, (2005); JARDIM, (2002).
46
4. DISCUSSÃO
No item 3.2 resumo dos procedimentos e também na Tabela 4 é possível
verificar a diversidade de métodos para concentrar as amostras, uma variação na
utilização do microscópio ótico comum com o invertido e também a calibração destes
microscópios, aspectos quem podem contribuir para o aumento de interferentes.
ROBERTO & PEREIRA, (1987) fizeram uma série de considerações e
observações realizadas em laboratório em relação à interferência nos resultados de
estudos quantitativos e qualitativos de organismos fitoplânctonicos provocados pelos
procedimentos de coleta, homogeneização, estocagem, manuseio, transporte e
preservação indevidos ou não observados a contento, causando alterações
significativas e mascarando os resultados finais de contagem, bem como conduzindo
a erros na identificação. Apresentam ainda diversas formas de preservação de
amostras e citam que os dois reagentes mais utilizados são o formol e a solução de
lugol.
O lugol fornece uma concentração suficiente para uma preservação por
aproximadamente seis meses para amostras de locais oligotróficos utilizando-se
1ml/l, e para ambientes eutróficos 2ml/l, quando estocados em local escuro, devido à
degradação sofrida pela solução de lugol através da ação da luz. (ROBERTO &
PEREIRA,1987; CETESB, 2005a)
No levantamento apresentado na Tabela 4 observou-se que a solução de
lugol é o preservativo mais utilizado e que duas empresas não utilizam nenhum
preservativo, pois trabalham com amostras in vivo, salvo as condições com grande
quantidade de fitoflagelados, então se faz necessário a solução de lugol numa
alíquota da amostra.
Segundo SANT’ANNA et al., (2006); ROBERTO & PEREIRA, (1987) mesmo
com o lugol é possível que cianobactérias que possuem aerótopos permaneçam na
superfície.
A resolução do problema da contagem em câmaras de Sedgwick-Rafter se
torna relativamente simples, uma vez que apenas a mudança de foco e a realização
de uma segunda leitura no plano superior da lâmina, complementariam a contagem.
Quando utilizada a câmara de Utermöhl, no microscópio invertido, a solução de
alteração de foco não pode ser aplicada, uma vez que a distância entre a superfície
47
do líquido e a objetiva impede a aproximação suficiente para visualização dos
organismos não sedimentados. Em função dessa dificuldade, verifica-se que a
adição de 0,125ml ou quatro gotas com a pipeta de 1ml de detergente, para uma
alíquota de 50ml de amostra, proporciona, após 30 minutos de homogeneização, a
sedimentação desses organismos (ROBERTO & PEREIRA, 1987).
Para evitar erros na identificação é importante preparar outra amostra sem a
adição de detergente, pois, podem ocorrer alterações morfológicas e estruturais.
ROBERTO & PEREIRA, (1987) coletaram amostras da Lagoa Facultativa de
Valinhos, SP com a presença de Oscillatoria e fizeram experimentos comparando
diversos preservativos (Tabela 5). Observaram que a porcentagem variou entre 3 e
96% de organismos não sedimentados ficando evidenciada a contribuição do
detergente para a sedimentação destas cianobactérias.
Tabela 5 – Teste de contagem de cianofíceas (Oscillatoria sp) com amostras da Lagoa Facultativa de
Valinhos, SP, coletadas em maio de 1985.
Organismos
Organismos não
sedimentados
sedimentados (2º. nível
( 1º. nível )
junto à lamínula)
Reagentes
(n.º org/ml)
Lugol (1ml/l)
Níveis de
Total dos
Porcentagem
organismos
de erro
n.º org/ml
n.º org/ml
%
5508
133914
139422
96,04
5616
141846
147462
96,19
4968
126915
131883
96,23
Formol (2%)
5114
132514
137628
96,28
Lugol + detergente
153511
5832
159343
3,66
focalização
Formol + lugol (2%)
(1ml/l)
Lugol + mertiolato
(1ml/l) (1ml/250ml)
Obs.: Contagens efetuadas em câmaras de Sedgwick-Rafter
Fonte : ROBERTO & PEREIRA, (1987).
48
A técnica de concentração observada com maior freqüência foi a
sedimentação em câmaras de Utermöhl, mas sem um critério padrão entre elas
quanto a definição do volume da câmara para cada amostra, no geral observa-se a
quantidade de algas presentes na amostra. O tempo de sedimentação mais comum
foi o de 24 horas para câmaras de 10ml. Segundo SANT’ANNA et al., (2006) as
câmaras de 2,5 e 10ml são as mais comumente empregadas para ambientes
eutróficos.
A técnica de centrifugação foi citada por duas empresas.
A técnica de concentração Sedgwick-Rafter, utilizando o funil com o mesmo
nome, foi descrita somente por uma empresa.
A técnica de sedimentação em proveta foi verificada em cinco empresas.
Destas cinco, quatro delas foram implantadas através de cursos ministrados pelo
biólogo Fernando Jardim da COPASA. No procedimento quando utiliza-se proveta
de 1000ml faz-se posteriormente a sifonação da amostra, de modo que resulte um
sedimentado de 5 a 10% do volume inicial. Quando usada proveta de 50ml também
deve resultar a mesma porcentagem de volume final.
Todas as técnicas de concentração de amostras apresentadas possuem
vantagens e desvantagens, e considerando que as empresas consultadas utilizam
os resultados para monitoramento de mananciais e abastecimento público deve-se
levar em consideração o tempo para esta concentração, devido a necessidade de
uma resposta rápida a Estação de Tratamento de Água.
Como o microscópio invertido foi o mais citado dentre as empresas, a câmara
de contagem mais freqüente foi a de Utermöhl. A calibração do microscópio invertido
está padronizada em 400 vezes em quase todas as empresas. SANT’ANNA et al.
(2006), afirmam que o tipo de microscópio determina a técnica de preparação da
amostra.
A utilização do microscópio ótico comum com aumento de 100 vezes ou 200
vezes com auxílio do retículo de Whipple também foi citado.
O retículo de Whipple utilizado para realizar as medidas dos organismos foi
citado por algumas empresas, outras não utilizam deste recurso de medida.
49
O fato das empresas de saneamento trabalharem com procedimentos
diferenciados não caracteriza um problema operacional, e considerando que cada
empresa tem o seu histórico e promove o monitoramento utilizando sempre a
mesma metodologia, os resultados poderão ser considerados como válidos para
cada uma delas, mas para existir confiabilidade neste processo é importante que se
estabeleça programas de organização no trabalho e qualidade analítica, para que os
resultados possam ser confiáveis, possibilitando a comparação entre as empresas.
Os programas de controle de qualidade em laboratórios podem ser
genericamente definidos como um conjunto de ações, com o objetivo de garantir a
produção de resultados com a máxima confiabilidade. Devem, preferencialmente,
ser formalizados em documentação específica, abrangendo os seguintes aspectos,
atividades e/ou metas:
•
Recursos humanos: descrição da qualificação e capacitação necessárias às
diversas atividades técnicas ou gerenciais;
•
Equipamentos e instrumentação: cadastro dos equipamentos, estado de
conservação, procedimentos de calibração, requerimentos e freqüência de
manutenção;
•
Especificação de suprimentos: de forma a garantir que todos os reagentes e
suprimentos em geral atendam aos requisitos específicos de qualidade e
orientem testes de controle de qualidade;
•
Padronização de procedimentos: documentação detalhada de todos os
procedimentos de rotina do laboratório, incluindo regras de segurança, métodos e
técnicas analíticas, procedimentos de coleta e armazenamento de amostras,
calibração de instrumentos, preparo de armazenamento de reagentes, etc.
Métodos analíticos devem ser padronizados e/ou validados, mantendo-se
documentadas as respectivas precisão, sensibilidade e especificidade;
•
Organização de banco de dados: incluindo fluxo de informações e arquivo;
•
Medidas de controle de qualidade analítica: incluindo verificações de rotina por
meio de análises em réplicas, controles positivos e negativos, controle
interlaboratorial, calibração de instrumentos e equipamentos, etc (BRASIL,
2005b).
50
A Portaria 518 (BRASIL, 2004) obriga o monitoramento de cianobactérias e a
quantificação em células por mililitro, também a Resolução 357 (BRASIL, 2005a)
define valores de densidade somente em número de células, e de fato, algumas
empresas atendem estes atos jurídicos emitindo laudos somente com valores de
células por ml e não fazem a identificação dos organismos. Mais do que obter o
resultado de número de células de cianobactérias, para uma empresa de
saneamento que promove a gestão do manancial, é importante conhecer estas
cianobactérias até o nível genérico, desta maneira é possível direcionar
metodologias para detecção de toxinas, definir estratégias para o controle da
floração de gêneros com algicidas específicos, tomar as devidas precauções quanto
ao tratamento da água e implantar sistema de carvão ativado em pó quando
necessário, entre outras.
Para o monitoramento de um manancial é importante também relacionar o
resultado de número de células com outras unidades de medida, como UPA/ml ou
Org/ml considerando que podem existir indivíduos maiores e indivíduos menores,
como, por exemplo, Anabaena e Merismopedia.
Na legislação não existe a citação de monitoramento de algas e
cianobactérias na água tratada, já que estes e outros microrganismos devem estar
ausentes, mas algumas empresas fazem estas análises periodicamente ou
dependendo da densidade de cianobactérias na captação para medir a eficiência de
remoção do tratamento.
51
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho apresentou os métodos efetivamente utilizados por empresas
de saneamento do Brasil para quantificar cianobactérias. Apesar de terem sido
demonstradas diferenças nos procedimentos adotados por estas empresas é
importante ressaltar que todas elas conhecem o sistema e têm critérios de qualidade
para minimizar possíveis interferentes. Todas as empresas levam em consideração
o histórico dos mananciais atendidos e buscam melhorias para o tratamento da
água.
Em função da exigência da legislação no monitoramento e quantificação de
cianobactérias em número de células por ml é imprescindível o desenvolvimento de
planos de calibração destas metodologias.
Durante a pesquisa, praticamente todos os entrevistados evidenciaram a
necessidade de promover com freqüência encontros e eventos para estreitar cada
vez mais o relacionamento entre as empresas de saneamento, buscando assim,
através de troca de informações uma qualidade nos trabalhos relacionados a
cianobactérias e outros assuntos ligados a mananciais para abastecimento público.
Com respeito a treinamento, também foi discutida a necessidade de
capacitação e atualização técnica dos biólogos e profissionais encarregados de
realizar este tipo de análise, além de promover cada vez mais a qualidade analítica,
devido a carência deste tipo de profissional em algumas regiões brasileiras.
Considerando a necessidade de uma padronização, já está sendo discutido a
proposta de um Guia de Referência para Identificação e contagem de cianobactérias
pela ANA – Agência Nacional de Águas e CFBio – Conselho Federal de Biologia em
um grupo de trabalho que tem como objetivos, propor diferentes métodos para
identificação e quantificação de cianobactérias que atendam às legislações e
programas de avaliação ecológica de águas superficiais de acordo com as
especificidades e infra-estruturas locais, além de informações sobre coleta,
procedimentos analíticos e controle de qualidade.
Portanto, o presente trabalho vem contribuir para o conhecimento; das
técnicas utilizadas para contagem de cianobactérias e dos procedimentos
metodológicos para esta contagem, utilizados pelas empresas de saneamento do
Brasil.
52
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AESBE - Associação das Empresas de Saneamento Básico – Companhias de
Saneamento Associadas. Disponível em: <http://www.aesbe.org.br>. Acesso em: 28
Mai. 2006
AGUJARO, L. F. Contagem de cianobactérias – Proposta de um guia de referência.
In: III SEMINÁRIO REGIONAL DE ACREDITAÇÃO DE LABORATÓRIOS EM
ANÁLISES DA QUALIDADE DA ÁGUA, 04 nov. 2005, Mato Grosso do Sul. Anais
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