Pergunta 1
Na E. coli, o operon AB fictício é induzido pela presença do composto W. Um diagrama do
operon e de suas proteínas e regiões reguladoras é mostrado abaixo:
Px promotor da proteína reguladora
X gene da proteína reguladora do operon AB
P promotor dos genes AB
S seqüência mostrada por ser importante para a regulação por W
A gene estrutural da enzima A
B gene estrutural da enzima B
A tabela abaixo mostra os genótipos de diferentes grupos de E. coli com um operon AB tipo
selvagem e vários operons AB mutantes e o número de moléculas de proteína A para cada
célula na ausência ou na presença do composto W (-W ou +W, respectivamente).
a) Na tabela abaixo, o sinal “+” indica que o gene ou o elemento de controle é funcional (wt),
e o sinal “-“ indica que o gene ou o elemento de controle não é funcional. Considere os genes
não relacionados como sendo do tipo selvagem.
Moléculas de A
Grupo
X
P
S
A
-W
+W
Expressão
Tipo selvagem
+
+
+
+
0
200
Induzida
M1
-
+
+
+
200
200
M2
+
-
+
+
0
0
M3
+
+
-
+
200
200
M4
+
+
+
-
0
0
i) Para cada grupo da tabela acima, identifique a expressão como induzida, não-induzida ou
constitutiva.
ii) Com base nos dados mostrados acima, responda se a proteína reguladora X atua como um
repressor ou um ativador do operon AB. Explique sua resposta.
3
Continuação da Pergunta 1
b) Você cria diplóides parciais de vários grupos mutantes de E. coli, utilizando um plasmídeo
de cópia única introduzido na célula de E. coli. Nas células dos genótipos a seguir, calcule o
número de moléculas de enzima A para cada célula (0, 200, 400) produzidas na ausência ou
na presença do composto W (-W ou +W, respectivamente). Preencha as linhas com o número
total de moléculas de enzima A.
4
Continuação da Pergunta 1
Você analisa um operon diferente, o operon H, que contém os genes 1 e 2 que codificam as
enzimas 1 e 2. Nesse operon, o composto H atua como um indutor. Você mede os níveis de
DNA, mRNA e proteína em uma célula de E. coli típica. Os resultados obtidos estão
relacionados abaixo:
-H
+H
DNA
Nº de cópias do gene 1 para cada
célula
1
1
MRNA
Nº de cópias do mRNA do gene 1
para cada célula
50
50
Proteína
Nº de moléculas da enzima 1 para
cada célula
0
200
c) Em que estágio da expressão do gene essa regulação poderia ocorrer? Explique sua
resposta.
d) No operon lac, regulado no nível de transcrição, a proteína repressora está presente na E.
coli a aproximadamente quatro moléculas para cada célula. No operon H, a proteína
repressora está presente a aproximadamente 200 moléculas em cada célula. Com base na
reposta à Parte c, responda por que devemos esperar que existam mais moléculas da proteína
repressora do operon H do que moléculas de repressor lac para cada célula?
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Pergunta 2
A pólio foi praticamente eliminada da população americana. Entretanto, em países onde as
pessoas têm pouco ou nenhum acesso às vacinas, a doença ainda existe. Como um biólogo
com uma visão global, você procura criar uma banana transgênica que produza a proteína
utilizada na vacina contra a pólio. Ao consumirem esse tipo de banana, os indivíduos
desenvolveriam uma imunidade contra a doença. O gene dessa proteína foi clonado em um
plasmídeo com um gene de resistência à kanamicina (pKR-polio). É necessário fixar ao gene
um promotor específico da banana e as seqüências de DNA que permitirão ao gene ser
incorporado ao DNA da banana. Essas seqüências estão contidas no plasmídeo pBAN, que
contém um gene de resistência à ampicilina. Mapas desses dois plasmídeos são mostrados
abaixo, incluindo regiões de restrição importantes e distâncias (em pares-base) entre as
regiões.
a) Uma extremidade gerada por digestão com BamHI pode ser ligada a uma extremidade
gerada por digestão com BglII. Por que isso é possível?
6
Continuação da Pergunta 2
b) Você deve inserir o gene que codifica o antígeno da pólio no pBAN. Planeje uma estratégia
para fazer isso. Identifique as enzimas que você utilizaria para cortar o pBAN e o pKR-polio e
as etapas necessárias para a geração do plasmídeo intacto.
c) Então, você transforma a E. coli, utilizando os plasmídeos criados. As células
transformadas são cultivadas em um meio contendo (marque com um circulo uma das
opções):
ampicilina
kanamicina
ampicilina e kanamicina
nem ampicilina nem kanamicina
Por quê?
d) Você isola o DNA dos plasmídeos de três colônias que são aprovadas no teste de
resistência a antibióticos. Você prepara o DNA, utilizando a enzima de restrição EcoRI. Os
fragmentos resultantes de cada plasmídeo são separados por tamanho em um gel de agarose.
Os resultados a seguir são obtidos. O tamanho dos fragmentos de DNA estão indicados no
lado esquerdo.
7
Continuação da Pergunta 2
d) i) Utilizando os dados da página anterior, esboce um esquema dos plasmídeos associados
às colônias 1, 2 e 3. Indique todos os componentes relevantes como o promotor, a origem de
replicação, os genes de resistência à ampicilina e o antígeno da pólio.
ii) Qual dos três plasmídeos permitiria a síntese da proteína em uma banana? Explique sua
resposta.
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Pergunta 3
Utilize este diagrama de uma célula como referência para responder às questões a seguir.
a) Considere a proteína receptora a seguir:
i) Onde a proteína receptora estaria localizada se houvesse falta de SRP na célula? A
célula seria funcional?
ii) Onde a proteína receptora estaria localizada se o domínio de sinalização fosse
eliminado? A célula seria funcional?
iii) Que característica comum é compartilhada pelas cadeias laterais dos amino-ácidos
encontrados em um domínio transmembrana? Explique.
iv) Qual domínio (de fixação do ligando, transmembrana ou de sinalização) da
proteína receptora tipo selvagem é inserido no lúmen ER durante a translação? Por que
a proteína receptora deve ser inserida desse modo para se tornar funcional?
9
Continuação da Pergunta 3
b) O mRNA maduro que codifica uma proteína a ser secretada especifica uma cadeia de
polipeptídeos de 497 amino-ácidos. Porém, a proteína realmente secretada pela célula tem um
comprimento de 475 amino-ácidos.
i) Como você explica essa diferença de tamanho?
ii) Uma proteína transmembrana também apresentaria essa diferença? Explique
brevemente sua resposta.
Pergunta 4
Considere o seguinte percurso de transdução de sinais utilizado quando se cheira uma torta de
abóbora.
1) Uma molécula odorante (π) da torta, um dos vários compostos aromáticos presentes na
torta de abóbora, fixa-se a um determinado receptor olfativo associado à proteína G em uma
célula olfativa de seu nariz.
2) O sistema receptor-odorante ativa uma proteína G, que remove o GDP e se fixa a uma
molécula de GTP.
3) A subunidade α da proteína G desassocia e ativa a adenilato ciclase, que catalisa a
produção do cAMP a partir do ATP.
4) O cAMP se fixa a um canal de sódio, abrindo-o e permitindo que o Na+ entre na célula.
Isso cria um estímulo nervoso que atravessa o cérebro . Seu cérebro integra o sinal odorante π
com sinais de outros receptores olfativos em seu nariz. O cérebro interpreta o sinal como o
odor da torta de abóbora. E você pensa, “Mmm... torta”.
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Continuação da Pergunta 4
a) Como a fixação da molécula odorante π estimula a proteína do receptor e como isso ativa a
proteína G?
b) Apesar de ser bom ter a sensação do odor da torta continuamente, após o odorante π ser
eliminado, a sinalização é interrompida. Como o percurso de sinalização é desativado?
Explique por que quando a proteína G é ativada a adenilato ciclase não é ativada
continuamente. Que reação química está envolvida no processo?
c) Relacione duas vantagens dos vários estágios em um percurso de transdução de sinais.
d) Uma molécula odorante de peru entra em contato com o receptor de odorante π. Isso teria
algum efeito sobre a emissão de um estímulo nervoso a partir dessa célula olfativa? Explique
sua resposta.
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Pergunta 5
a) Preencha as lacunas (*____) no esquema da junção neuromuscular abaixo.
b) Descreva brevemente os eventos que provocam a liberação do neurotransmissor na sinapse.
c) Descreva brevemente os eventos que ocorrem após o neurotransmissor ser liberado
resultantes de uma despolarização suficiente para causar um tique nervoso.
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SOLUÇÕES
Pergunta 1
a)
i)
Grupo
Tipo selvagem
X
S
+
A
+
P
+
M1
-
+
M2
+
M3
M4
+
-W
0
+W
200
Expressão
Induzida
+
+
200
200
Constitutiva
-
+
+
0
0
Não-induzida
+
+
-
+
200
200
Constitutiva
+
+
+
-
0
0
Não-induzida
ii) A proteína X atua como um repressor. Nos mutantes 1 e 3 com falta de repressores
ou regiões de fixação de repressores, a expressão é constitutiva (alta, com ou sem W).
b) Preencha as linhas com o número total de moléculas de enzima A.
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Continuação da Pergunta 1
c) Em que estágio da expressão do gene essa regulação poderia ocorrer? Explique sua
resposta.
A regulação ocorre na translação. Na ausência ou na presença do composto H, o número de
cópias de DNA e mRNA é o mesmo. Entretanto, o número de moléculas de enzima 1 aumenta
na presença do indutor. Somente os níveis de proteína variam na presença ou na ausência do
indutor. Portanto, a regulação deve estar ocorrendo na síntese da proteína.
d) Com base na reposta à Parte c, responda por que devemos esperar que existam mais
moléculas da proteína repressora do operon H do que moléculas de repressor lac para cada
célula?
Neste caso, a proteína repressora se fixa a uma região no mRNA e bloqueia a translação. O
mRNA está presente a aproximadamente 50 cópias para cada célula. Portanto, um excesso de
proteínas repressoras é necessário para a regulação. No sistema lac, o repressor lac se fixa
ao operador no DNA. Cada célula haplóide contém somente uma cópia do operon lac e
possui somente uma região na qual o repressor lac pode se fixar. Por isso, o repressor lac é
necessário somente a níveis muito baixos.
Pergunta 2
a) Uma extremidade gerada por digestão com BamHI pode ser ligada a uma extremidade
gerada por digestão com BglII. Por que isso é possível?
A digestão com BamHI ou BglII produz as mesmas projeções ou extremidades de fixação.
Assim as extremidades produzidas pelo corte utilizando o BglII são complementares em
relação às extremidades produzidas com o BamHI, possibilitando a paridade de base e a
ligação.
b) Você deve inserir o gene que codifica o antígeno da pólio no pBAN. Planeje uma estratégia
para fazer isso. Identifique as enzimas que você utilizaria para cortar o pBAN e o pKR-polio e
as etapas necessárias para a geração do plasmídeo intacto.
Corte o pBAN utilizando o BamHI para linearizar.
Corte o pKR-polio utilizando o BglII. Isso produz um fragmento de 1.400 bp contendo o gene
do antígeno da pólio e um fragmento de 3.100 bp.
Selecione por tamanho o DNA do plasmídeo pKR-polio para obter o fragmento de 1.400 bp.
Junte o fragmento de 1.400 bp com o plasmídeo pBAN cortado.
c) Então, você transforma a E. coli, utilizando os plasmídeos criados. As células transformadas
são cultivadas em um meio contendo (marque com um circulo uma das opções):
ampicilina
kanamicina
ampicilina e kanamicina
nem ampicilina nem kanamicina
Por quê? O meio deve conter somente ampicilina, pois o plasmídeo com o promotor e as
seqüências de inserção da banana possui um gene de resistência à ampicilina.
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d) i) Esboce um esquema dos plasmídeos 1, 2 e 3. Indique todos os componentes relevantes
como o promotor, a origem de replicação, os genes de resistência à ampicilina, o antígeno
da pólio, as regiões de restrição e as distâncias (em pares-base) entre as regiões.
ii) Qual dos três plasmídeos permitiria a síntese da proteína em uma banana? Explique
sua resposta.
Somente o plasmídeo 2 permitiria a síntese da proteína funcional. O gene do antígeno
da pólio deve ser posicionado corretamente em relação ao promotor.
Pergunta 3
a)
i) Onde a proteína receptora estaria localizada se houvesse falta de SRP na célula?
A proteína receptora seria encontrada no citosol e não seria funcional.
ii) Onde a proteína receptora estaria localizada se o domínio de sinalização fosse
eliminado?
A proteína estaria inserida na membrana plasmática, mas não seria funcional sem um
domínio de sinalização.
iii) Que característica comum é compartilhada pelas cadeias laterais dos amino-ácidos
encontrados em um domínio transmembrana? Explique.
O domínio transmembrana é composto por amino-ácidos com cadeias laterais
hidrofóbicas, pois o interior da bicamada lipídica é hidrofóbico.
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Continuação da Pergunta 3
iv) Qual domínio (de fixação do ligando, transmembrana ou de sinalização) da
proteína receptora tipo selvagem é inserido no lúmen ER durante a translação? Por que
a proteína receptora deve ser inserida desse modo para se tornar funcional?
O domínio de fixação do ligando é inserido no lúmen ER. Após a fusão da vesícula
secretora com a membrana plasmática, o interior do ER se torna o exterior da célula
onde o domínio de fixação do ligando deve estar para que seja possível fixar o ligando.
b)
i) Como você explica essa diferença de tamanho?
Uma seqüência de sinais de 22 amino-ácidos é dividida durante a translação no ER.
ii) Uma proteína transmembrana também apresentaria essa diferença? Explique
brevemente sua resposta.
Sim. Uma proteína transmembrana também possui uma seqüência de sinais que
também é dividida durante a translação no ER.
Pergunta 4
a) Como a fixação da molécula odorante π estimula a proteína do receptor e como isso ativa a
proteína G?
A fixação de uma molécula odorante π ao domínio extracelular do receptor altera a
conformação da proteína. Isso permite que o domínio intracelular do receptor para a fixação
do heterotrímero da proteína G. Essa fixação induz a troca entre GDP e GTP pela
subunidade α, que é ativada e liberada da subunidade βγ.
b) Apesar de ser bom ter a sensação do odor da torta continuamente, após o odorante π ser
eliminado, a sinalização é interrompida. Como o percurso de sinalização é desativado?
Explique por que quando a proteína G é ativada a adenilato ciclase não é ativada
continuamente. Que reação química está envolvida no processo?
A subunidade α da proteína G possui uma atividade GTPase intrínseca. Essa atividade
converte o GTP ligado à subunidade α em GDP. O GTP é necessário para que a subunidade
α seja ativada. Portanto, a conversão de GTP em GDP desativa a subunidade α da proteína
G. Então, a subunidade α inativa pode se ligar novamente à subunidade βγ para esperar
outro sinal do receptor.
c) Relacione duas vantagens dos vários estágios em um percurso de transdução de sinais.
Os vários estágios no percurso podem criar uma grande amplificação dos sinais e
possibilitam a existência de vários pontos de regulação. Além disso, caso vários receptores
funcionem ao longo do mesmo percurso de transdução, a integração de diferentes entradas é
possibilitada.
d) Uma molécula odorante de peru entra em contato com o receptor de odorante π. Isso teria
algum efeito sobre a emissão de um estímulo nervoso a partir dessa célula olfativa? Explique
sua resposta.
Não. Uma molécula odorante de peru não teria efeito sobre o estímulo dessa célula. O
receptor de odorante π reconhece exclusivamente o odorante π. Entretanto, a molécula
odorante de peru afetaria células olfativas especiais para o odorante de peru.
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Pergunta 5
a) Preencha as lacunas (*____) no esquema da junção neuromuscular abaixo.
b) Descreva brevemente os eventos que provocam a liberação do neurotransmissor na sinapse.
Um potencial de ação alcança o terminal da célula pré-sináptica, despolarizando-o. Os
canais de Ca2+ sensíveis à tensão se abrem, permitindo que o Ca2+ entre na célula.
O Ca2+ provoca a fusão das vesículas que contêm acetilcolina com a membrana plasmática,
liberando o NT.
c) Descreva brevemente os eventos que ocorrem após o neurotransmissor ser liberado
resultantes de uma despolarização suficiente para causar um tique nervoso.
A acetilcolina (ACh) se fixa ao receptor, causando uma alteração de conformação que
permite ao receptor funcionar como um canal de Na+. O Na+ alcança a célula muscular,
despolarizando-a. Se a despolarização é suficiente, os canais de Na+ sensíveis à tensão se
abrem na célula muscular, resultando em uma grande despolarização do músculo.
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