Estrutura dos
Ácidos Nucléicos
Aspectos Moleculares
&
Enfoques Conceituais
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
 1866: Gregor Mendel
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
 1869 →
Miescher
#
Johann
Friedrich
Buscava determinar os componentes
químicos do núcleo celular.
# Usava os glóbulos brancos contidos no
pus para suas pesquisas (células que
apresentam núcleos grandes e fáceis de
serem isolados do citoplasma).
# Descobriu a presença de um composto de
natureza ácida desconhecido até o
momento (rico em fósforo e em
nitrogênio, desprovido de enxofre e
resistente à ação da pepsina - enzima
proteolítica)) → nucleína
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
 1880 → Albrecht Kossel
# Demonstrou que a nucleína continha
bases nitrogenadas em sua estrutura.
1889 → Richard Altmann
# Obteve nucleína com alto grau de pureza,
comprovando sua natureza ácida e dandolhe o nome de ácido nucléico.
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
 1900: Hugo de Vries, Erich von Tschermak e Carl Correns
Redescoberta de Mendel
Leis da Hereditariedade
Leis de Mendel
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
 1928: Frederick Griffith:Transformação
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
 1944: Avery, MacLeod e MacCarty: Princípio transformante
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
 1953: Alfred Hershey e Martha Chase
DNA 
32P
Proteína 
35S
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
 1953: James Watson e Francis Crick
Maurice Wilkins e Rosalind Franklin
DNA → INTRODUÇÃO
• Entre todas as propriedades dos organismos vivos, a capacidade de
auto-replicação é fundamental.
• Conter a informação genética significa armazená-la, transmiti-la ao
longo das gerações, e expressá-la na forma de proteínas.
• Avanços significativos tem sido alcançados na área da Biologia
Molecular a partir do isolamento, análise e síntese de seqüências de
DNA.
• DNA recombinante → estudos de função e dos mecanismos que
controlam a expressão gênica
ÁCIDO NUCLÉICO → PROTEÍNA
DNA → INTRODUÇÃO
DNA → INTRODUÇÃO
GENOMA HUMANO
Autossomos x Sexuais
99%
1%
GENOMA HUMANO
Nucleotídeo
DNA
Genoma
Cromossomo
DEFINIÇÃO DE GENE
rRNA
Ribossomos
tRNA
RNP
snRNA
AA
mRNA
Proteína
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Pentose (Açúcar)
R
OH
Ribose
-D-Ribofuranose
H
2’-Desoxirribose
-D-2-desoxirribofuranose
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Bases Nitrogenadas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos
PURINAS
Bicíclicas
Purina
Adenina
Guanina
PIRIMIDINAS
Monocíclicas
Pirimidina
Citosina
Adenina = Timina
Uracil
Uracil
Timina
Guanina  Citosina
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Curiosidade sobre as Bases Nitrogenadas
PIRIMIDINAS
Uracil
Timina
5-Metiluracil
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Posições dos Átomos
Grupamento Fosfato
Bases Nitrogenadas
Pentose
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Nucleotídeo



(2’-) Desoxirribonucleotídeo
Nucleosídeo



Ribonucleotídeo
Nucleosídeo
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato
Monofosfato
-
5’-Monofosfato de Adenosina - AMP
5’-Monofosfato de Desoxiadenosina - dAMP
Difosfato
-
5’-Difosfato de Adenosina - ADP
5’-Difosfato de Desoxiadenosina - dADP
Trifosfato
-
5’-Trifosfato de Adenosina - ATP
5’-Trifosfato de Desoxiadenosina - dATP
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Grupamento Fosfato = Ésteres de Fosfato
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Bases Nitrogenadas
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Sentido da Fita de DNA
Base
Base
Base
5’  3’
5’AACGTTGCTATCGT3’
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Bases Nitrogenadas
Grupo Ceto (C=O) e Amino (C-NH2)
Relação Molar (1949)
(A+G) = (T+C)
Chargaff
A
= 1,0
T
C
= 1,0
G
AT = CG (?)
ESTRUTURA PRIMÁRIA DO DNA
Ligações Importantes
Ligações Fosfodiéster
Ligação (-) Glicosídica (Glicosílica)
DUPLA-HÉLICE DO DNA
Estabilidade do DNA: Integridade e Flexibilidade
Ligações Covalentes
Forças de Van der Walls
Interações Iônicas (Mg+2)
Sítios Hidrofóbicos
Sítios Hidrofílicos
Pontes de
Hidrogênio
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
• Fenômenos físicos que ocorrem com o DNA
dupla-hélice fundamentais para os processos
de replicação, transcrição e recombinação.
• DESNATURAÇÃO → rompimento das
pontes de hidrogênio entre as cadeias
complementares do DNA.
• RENATURAÇÃO → ligamento das pontes de
hidrogênio entre as cadeias complementares
do DNA.
• Esses processos podem ser observados in
vitro
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
A desnaturação da estrutura secundária do DNA pode ser obtida através
dos seguintes mecanismos:
→ aumento de temperatura
→ titulação com ácidos ou álcalis (protonizam ou desprotonizam os anéis
aromáticos)
→ agentes desnaturantes (formamida)
# Tais tratamentos geram grupos carregados no interior da dupla-hélice
(levando ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases
complementares).
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
A desnaturação do DNA pode ser acompanhada pela medida em espectrofotômetro de
absorbância de luz ultravioleta (UV).
Efeito
Hipercrômico
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
A temperatura necessária para a desnaturação de um dado DNA está
diretamente relacionada com sua seqüências de pares de bases.
Adenina = Timina
Uracil
Guanina  Citosina
Tm (oC) = 69,3 + 0,41(GC%)
• Em condições fisiológicas, a dupla-hélice é
muito estável.
• Para que estes processos ocorram há a
necessidade
da
participação
de
enzimas
especializadas (DNA-helicases e SSBs)
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
Rompimento das Pontes de Hidrogênio
Tm (oC) = 69,3 + 0,41(GC%)
T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
• Mesmo quando as duas fitas do DNA estão completamente separadas,
o processo pode ser revertido.
• Se uma solução contendo DNA desnaturado por calor for lentamente
resfriada, as fitas complementares reassociam-se.
T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC
• No início, a renaturação ocorre lentamente. Porém, à medida que as
bases complementares se associam, a velocidade do processo aumenta.
• Resfriamentos abruptos colapsam a renaturação
# Quanto maior a complexidade do genoma, maior será o tempo de sua
renaturação.
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
DUPLA-HÉLICE DO DNA
As ligações glicosídicas no DNA, por não estarem diretamente opostas na
dupla-hélice, geram duas cavidades desiguais em seu contorno:
→ cavidade maior
→ cavidade menor
# Nestas regiões, as bases estão expostas ao meio solvente.
# Moléculas que agem com seqüências específicas de bases (proteínas)
podem identificar estas seqüências sem romper a estrutura da duplahélice.
DUPLA-HÉLICE DO DNA
Antiparalelas
DUPLA-HÉLICE DO DNA
Cavidades Maior e Menor
Cavidade
Menor
Cavidade
Maior
Volta
0.34 nm
DUPLA-HÉLICE DO DNA
Cavidades Maior e Menor
DUPLA-HÉLICE DO DNA
Cavidades Maior e Menor
TIPOS DE DNA
O DNA pode assumir diferentes conformações, dependendo da sua
composição de bases e do meio em que se encontra
→ DNA A
→ DNA B
→ DNA Z
Tipo A → forma mais abundante encontrada na célula (forma de duplahélice clássica)
Tipo B → formado a partir da desidratação ou diminuição do teor de sal
no meio em que se encontra o Tipo A.
TIPOS DE DNA
Tipo Z → encontrado, aparentemente, em apenas algumas regiões do DNA
Tipo B ou Tipo A.
# Fatores que estabilizam sua formação:
→ metilação ou bromação de bases
→ estresse torcional
→ ligação de proteínas específicas ao DNA
• Alterações nas conformações podem facilitar ou dificultar a interação do
DNA com proteínas.
TIPOS DE DNA
TIPOS DE DNA
DNA B
DNA A
DNA Z
TIPOS DE DNA
DNA B
DNA A
DNA Z
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
Conformação anti e syn
 Umidade
Relativa (92%)
Dupla RNA
DNA B
Etanol 75%
 [Sal]
C2’-endo
DNA A
C3’-endo
DNA Z
Metilação ou Bromação
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO
Principais características dos DNAs A, B e Z
CARACTERÍSTICAS
FORMA A
FORMA B
FORMA Z
Sentido helicoidal
(Giro)
Direita
Direita
Esquerda
Diâmetro (nm)
~2,6
~2,0
~1,8
Pb por giro (n)
11
10
12
Espaço entre as
bases (nm)
0,26
0,34
0,37
Inclinação da base
20o
6o
7o
Sulco maior
Estreito/Profundo
Largo/Profundo
Achatado
Sulco menor
Largo/Raso
Estreito/Profundo
Estreito/Profundo
Ligação glicosídica
anti
anti
anti(pir) sin(pur)
RNA x DNA
H
H
H
H
RNA x DNA
RNA mensageiro (mRNA)
Sinal de ligação ao
Ribossomo
CAU
AUG
Códon de
Iniciação
(Start Códon)
AGGAGGU
Início da Transcrição
AAAAA
Hairpin
Fim da
mensagem
RNA transportador (tRNA)
RNA ribossomal (rRNA)
OUTROS RNAs
hnRNA
snRNA
snoRNA
RNA DE INTERFERÊNCIA (RNAi)
Premio Nobel de Medicina 2006
Andrew Fire e Craig Mello
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
O DNA nem sempre está na forma de um bastão de dupla-hélice (linear).
# Quando as duas extremidades de um DNA ligam-se covalentemente,
formam-se as chamadas estruturas circulares.
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Linear x Circular
Plamídeos e Vírus
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
• Além da estrutura secundária da
dupla-hélice, o DNA assume uma
conformação
tridimensional
supertorcida.
# A dupla-hélice enrola-se sob si
mesma (extremamente importante
nos processos de replicação,
transcrição,
recombinação
e
expressão gênica).
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Supertorções
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Estrutura Supertorcida, Suprerenrolada ou Super-hélice
B
C
Topoisômeros
A
Grau de superenrolamento crescente
A: Relaxada
B: Superenrolamentos parciais
C: Totalmente Superenrolado
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Tipos de Superenrolamentos
• Plectonêmico → DNA em solução.
• Toroidal → DNA enrolado em proteínas (histonas), para formar os
nucleossomos.
# O desenrolamento das hélices pode induzir à formação de estruturas
criciformes, triplex ou DNA Tipo Z.
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Tipos de Superenrolamentos
Plectonêmico
Solução
Toroidal
Histonas
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
TOPOISOMERASES
 Topoisômeros → moléculas com seqüências e tamanhos idênticos, que
diferem apenas na sua topologia.
 Topoisômerases → enzimas que, quando presentes, promovem a quebra
transitória nas pontes fosfodiéster
adicionando ou removendo
superenrolamentos.
• A enzima permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas
passem umas sobre as outras.
• Estas enzimas mostram-se presentes tanto em células procarióticas como
eucarióticas.
TOPOISOMERASES
 Topoisômerase I → quebram apenas uma das fitas de DNA
 Topoisômerase II → quebram as duas fitas da dupla-hélice
Participam de importantes etapas nos processos de replicação,
transcrição e recombinação
# o grau de superenrolamento, sua geração e remoção em moléculas
de DNA pode ser medido de diferentes maneiras.
TOPOISOMERASES
Topoisomerase do tipo I
Relaxamento de Superenrolamento
 ATP
Ligação
Fosfotirosina
Restauração
do DNA
Ligação e
Desnaturação
E. coli
 Topo I: Monômero de 100 kDa (+ e –)
 Mutação no Gene topA  Inviável
 Topo III: Monômero de 74 kDa (+)
 Mutação no Gene topB  Viável
TOPOISOMERASES
Topoisomerase do tipo II
E. coli
 Topo II  Tetrâmero 400 kDa
 DNA-Girase  Sub A e B
 Adiciona Supertorções –
 Gene gyrA e gene gyrB
 Topo IV  Catenadas
 Antibióticos e Antitumorais
105 a 140 pb
5’-Tyr(122)A
Central: 20 pb (AT)
Lateral: Rica em GC
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Métodos de aferição do grau de superenrolamento
•
Eletroforese em gel de agarose
→ separa as moléculas de DNA em função da sua forma e compactação
(funções diretas do superenrolamento)
→ o DNA migra em géis com diferentes velocidades (dependendo de seu
tamanho e forma)
# Moléculas de DNA de mesmo tamanho migram com diferentes
velocidades se estiverem na forma circular relaxada, linear ou
supertorcida.
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Métodos de aferição do grau de superenrolamento
Velocidade de Sedimentação
Gel Agarose
Microscopia
Eletrônica
FORMAS DE DNA E SUPERTORÇÃO
Tratamento com Topoisomerase
5 Min
30 Min
CONSIDERAÇÕES FINAIS
 Ácidos Nucléicos  maiores representantes do genótipo (DNA)
 Proteínas  maiores representantes do fenótipo
 DNA  Envolvido com todo metabolismo do organismo
 Molécula da Hereditariedade: Seqüências de bases nitrogenadas 
Informações
 DNA  Moléculas principais
 RNA  Moléculas intermediárias
 Proteína  Resultado final da informação