Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências Matemáticas e da Natureza - CCMN
Instituto de Química – IQ
Departamento de Bioquímica
Ayla Sant’Ana da Silva
PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM
LÍQUIDOS IÔNICOS: EFEITO NA DESESTRUTURAÇÃO DA PAREDE
CELULAR E NA EFICIÊNCIA DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pósgraduação em Bioquímica, Instituto de Química, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte
dos requisitos necessários à obtenção do título de
Doutor em Ciências - Bioquímica.
Orientadora: Elba P. S. Bon
Rio de Janeiro
Março de 2013
Silva, Ayla Sant’Ana da.
Pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar com líquidos iônicos:
efeito na desestruturação da parede celular e na eficiência da
hidrólise enzimática/ Ayla Sant’Ana da Silva. – Rio de Janeiro:
IQ/UFRJ, 2013.
127f.: il.; 31 cm.
Orientador: Elba P. S. Bon
Tese (doutorado) – UFRJ/ Instituto de Química/ Programa de Pósgraduação em Bioquímica, 2013.
Referências bibliográficas: f. 128-149.
1.
Etanol lignocelulósico. 2. Pré-tratamento. I. Bon, Elba P. S.
II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Química. III.
Título
FOLHA DE APROVAÇÃO
Ayla Sant’Ana da Silva
PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR COM LÍQUIDOS
IÔNICOS: EFEITO NA DESESTRUTURAÇÃO DA PAREDE CELULAR E NA
EFICIÊNCIA DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pósgraduação em Bioquímica, Instituto de Química, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte
dos requisitos necessários à obtenção do título de
Doutor em Ciências - Bioquímica.
Aprovada em ______/______/_______:
_____________________________________
Elba P. S. Bon, Ph.D., Instituto de Química/UFRJ
____________________________________
Denise M. G. Freire, D.Sc., Instituto de Química/UFRJ
_____________________________________
Elis C. A. Eleuthério, D.Sc., Instituto de Química/UFRJ
_____________________________________
Nei Pereira Junior, Ph.D., Escola de Química/UFRJ
____________________________________
Luiz Pereira Ramos, Ph.D., Instituto de Química/UFPR
____________________________________
Anderson de Sá Pinheiro, D.Sc., Instituto de Química/UFRJ (suplente externo)
____________________________________
Leda M. F. Gottschalk, D.Sc., Embrapa Agroindústria de Alimentos (suplente externo)
Rio de Janeiro
2013
Aos meus pais Carlos Alberto e Maria Lucimar
pelo amor e suporte.
Agradecimentos
Durante os últimos três anos, tive o prazer e o privilégio de conviver com muitas
pessoas que contribuíram não só diretamente na execução deste trabalho, mas em vários
aspectos da minha formação profissional e pessoal. Gostaria de agradecer, em especial:
À Prof.ª Elba P. S. Bon, por sua orientação nesses quase dez anos em que faço parte
do Laboratório de Tecnologia Enzimática, por sua confiança no meu trabalho, pelas inúmeras
oportunidades proporcionadas desde que nos conhecemos, que muito contribuíram para o meu
desenvolvimento profissional e pessoal e, principalmente, por sempre se mostrar disponível
quando precisei, mesmo estando sempre muito ocupada.
Ao Ricardo S. S. Teixeira, por sua valiosa parceria no desenvolvimento de várias
etapas deste trabalho, por nossas incessantes discussões, pelas sugestões e pela amizade; à
Marcella F. Souza, pela revisão cuidadosa deste documento e pela parceria em outros projetos
desenvolvidos em paralelo a esta tese; à Maria Antonieta Ferrara, pela leitura da revisão
bibliográfica e pelas sugestões feitas. A toda equipe do Laboratório de Tecnologia
Enzimática, por tornarem o dia a dia agradável e pelo companheirismo.
A todos os professores do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da
UFRJ que de alguma forma contribuíram na minha formação profissional e pessoal ao
compartilharam seus conhecimentos e experiência. Em especial, aos professores Rodrigo
Volcan Almeida e Gilberto B. Dumont, por me fazerem pensar e refletir sobre a Ciência de
outra forma.
I am also grateful to the members of the Biomass Technology Refinery Center from
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), in Japan.
Especially, I would like to thank Dr. Seung-Hwan Lee for his never ending flow of ideas,
excitement with the work and for introducing me to new research areas.
À Usina Itarumã (Complexo Bionergético Itarumã S.A, Goiás, Brasil), pelo
fornecimento do bagaço e da palha de cana-de-açúcar utilizados nesse trabalho.
À Japan International Cooperation Agency (JICA), por proporcionar as viagens ao
Japão.
Ao CNPq/Petrobras, pela concessão da bolsa de estudos.
À minha família e ao Bruno, que mesmo quando longe, estiveram sempre comigo me
dando o apoio necessário para cumprir essa jornada.
(...)Não há verdades primeiras, só erros primeiros. A primeira e
mais rica função do sujeito é a de se enganar. Quanto mais
completo for seu erro, mais rica será sua experiência. A
experiência é a lembrança dos erros retificados.
(Georges Canguilhem)
RESUMO
da SILVA, Ayla Sant’Ana. PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
COM LÍQUIDOS IÔNICOS: EFEITO NA DESESTRUTURAÇÃO DA PAREDE
CELULAR E NA EFICIÊNCIA DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA. Rio de Janeiro, 2013.
Tese (Doutorado em Bioquímica). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de
Janeiro.
Em um processo de produção de etanol lignocelulósico, o pré-tratamento é crucial
para aumentar a acessibilidade das enzimas ao substrato durante a hidrólise. O pré-tratamento
com líquidos iônicos (LIs) é uma alternativa promissora que resulta em rendimentos e
produtividade de hidrólise superiores aos pré-tratamentos convencionais. Neste trabalho, em
uma primeira etapa, seis LIs foram avaliados para o pré-tratamento do bagaço de cana-deaçúcar utilizando a concepção convencional dos LIs como solventes da biomassa
lignocelulósica. Uma razão de bagaço:LI de 1:20 foi utilizada em todos os ensaios de prétratamento, que foram realizados a 120 °C por 120 min. Verificou-se que o LI acetato de 1etil-3-metil-imidazólio ([Emim][Ac]) foi o mais eficiente para o pré-tratamento do bagaço,
tendo a hidrólise enzimática do material pré-tratado resultado em um rendimento de
conversão da celulose em glicose de 98%. Os produtos pré-tratados apresentaram
considerável redução da cristalinidade e acentuado aumento na área de superfície específica.
Além disso, foi constatado que o bagaço e a celulose microcristalina pré-tratados com
[Emim][Ac] podem ser hidrolisados com eficiência por misturas enzimáticas deficientes em
celobioidrolases. Em uma segunda etapa, foi proposta uma nova abordagem para o uso do LI
no pré-tratamento, onde o [Emim][Ac] foi utilizado em um processo de pré-tratamento com
alta carga de sólidos, contrariando a concepção de que os LIs devem exercer a função de
solventes e serem utilizados em grande excesso em relação à biomassa. Para tal, uma
extrusora de rosca-dupla foi utilizada como um reator de pré-tratamento para promover uma
mistura eficiente do [Emim][Ac] com o bagaço nas razões de bagaço:[Emim][Ac] de 1:1, 1:3,
1:5 e 1:8, a fim de avaliar a influência da quantidade de LI na eficiência do pré-tratamento.
Quando o pré-tratamento foi realizado a 140 °C, por 8 min utilizando uma razão de
bagaço:[Emim][Ac] de 1:3, um rendimento em glicose de 90% foi alcançado em 24 h de
sacarificação. Esse rendimento em glicose foi comparável ao obtido na hidrólise do bagaço
pré-tratado com uma razão de bagaço:[Emim][Ac] de 1:20 por 120 min, a 120 °C. A
utilização da razão de bagaço:[Emim][Ac] de 1:1 também resultou em um rendimento
satisfatório de 76,4% em 24 h de hidrólise. Dessa forma, o uso da extrusora para facilitar o
pré-tratamento do bagaço em alto teor de sólidos com [Emim][Ac] possibilitou não só uma
redução significativa na quantidade de LI requerida por grama de bagaço (cerca de sete
vezes), como também reduziu o tempo necessário de interação entre o [Emim][Ac] e o bagaço
de 120 min para 8 min. Além disso, o uso da extrusora permitiu um processo de prétratamento contínuo, que é vantajoso para o processamento de grandes quantidades de
biomassa em comparação a métodos operados em batelada. Assim, abriu-se um espaço
importante para o avanço no uso dos LIs em condições economicamente mais favoráveis.
Palavras-chaves: bagaço de cana-de-açúcar, pré-tratamento, líquido iônico, hidrólise
enzimática, acetato de 1-etil-3-metilimidazólio
ABSTRACT
da SILVA, Ayla Sant’Ana. PRETREATMENT OF SUGARCANE BAGASSE WITH IONIC
LIQUIDS: EFFECT ON PLANT CELL WALL DISSASSEMBLY AND ON THE
ENZYMATIC HYDROLYSIS EFFICIENCY. Rio de Janeiro, 2013. Tese (Doutorado em
Bioquímica). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
In a process for ligncellulosic ethanol production, the pretreatment step is essencial to
increase the enzyme’s accessibility to the substrate during hydrolysis. The pretreatment with
ionic liquids (ILs) is a promising option that results in superior hydrolysis rates and yields
when compared to conventional pretreatment methods. In this study, in a first step, six ILs
were evaluated for the pretreatment of sugarcane bagasse as solvents of lignocellulosic
biomassa. A bagasse:IL ratio of 1:20 was used in all pretreatment assays, conducted at 120
°C, for 120 min. The IL 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate ([Emim][Ac]) was found to be
the most efficient for bagasse pretreatment, as the hydrolysis of the pretreated material
resulted in 98% conversion of cellulose to glucose. The pretreated products presented a
considerable reduction in the crystallinity and a prominent increase in the specific surface
area. Additionally, a set of experiments performed with purified endoglucanases indicated that
bagasse and microcrystalline cellulose samples pretreated with [Emim][Ac] could be
efficiently hydrolysed by enzyme blends which are deficient in celobiohydrolase activity. In a
second step, a new concept for the use of IL in the pretreatment was evaluated, where the IL
[Emim][Ac] was used in a process with high solid loadings, which is in opposition with the
idea that ILs should be used as solvents and in high excess in relation to the biomass content.
In this sense, a twin-screw extruder was used as a pretreatment reactor to promote the
effective mixture of [Emim][Ac] with bagasse in bagasse:[Emim][Ac] ratios of 1:1, 1:3, 1:5
and 1:8, to evaluate the effect of IL loading in the pretreatment efficiency. When the
pretreatment was performed at 140 °C, for 8 min using a bagasse:[Emim][Ac] ratio of 1:3, a
glucose yield of 90% was obtained in 24 h hydrolysis. This glucose yield was comparable to
that obtained by the hydrolysis of samples pretreated with a bagasse:[Emim][Ac] ratio of
1:20, for 120 min, at 120 °C, and applying the same conditions for enzymatic hydrolysis. The
use of a higher bagasse:[Emim][Ac] ratio of 1:1 also afforded a high glucose yield of 76.4%
in 24 h. Thus, the use of the extruder for facilitating the pretreatment of bagasse in high solid
contents allowed a significantly reduction on the requirement per gram of bagasse (around 7fold) and reduced the necessary interaction time between bagasse and [Emim][Ac] from 120
min to 8 min. In addition, the extruder allowed a continuous reactive process, which is
advantageous for the pretreatment of large amounts of biomass in comparison to batch
procedures. Thus, this work improves the outlook of using ILs in a cost-effective pretreatment
of lignocellulosic biomass.
Keywords: sugarcane bagasse, pretreatment, ionic liquid, enzymatic hydrolysis, hidrólise
enzimática, 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1. Composição da biomassa lignocelulósica. ..........................................................
30
Figura 2. Estrutura molecular da celulose (n= grau de polimerização). Adaptado de
Klemm et al., 2005. ............................................................................................................
Figura 3. Interconversão dos polimorfos da celulose. ........................................................
31
32
Figura 4. Modelo da estrutura da microfibrila (em corte transversal), constituída por
fibrilas elementares. Adaptado de Fengel e Wegener, 1984. .............................................
Figura
5.
Estrutura
esquemática
da
glucuronoarabinoxilana,
descrita
33
como
predominantes em monocotiledôneas. “Fer” representa a esterificação com ácido
ferúlico. Adaptado de Scheller e Ulvskov, 2010. ...............................................................
35
Figura 6. Tipos de monolignóis mais comumente encontrados como precursores da
lignina. (1) álcool p-coumarílico, (2) álcool coniferilíco e (3) álcool sinapílico.
Adaptado de Gellerstedt e Henriksson, 2008. ....................................................................
36
Figura 7. Ilustração da cana-de-açúcar e denominação de suas diferentes partes
(SEABRA et al., 2010). ......................................................................................................
36
Figura 8. Produção de etanol no Brasil e nos Estados Unidos de 2001 a 2012. Fonte dos
dados brasileiros: UnicaData (www.unicadata.com.br); fonte dos dados americanos: US
Energy Information Administration (www.eia.gov). .........................................................
38
Figura 9. Esquema simplificado de uma possível configuração para o processo de
produção de etanol lignocelulósico. SSF: fermentação e sacarificação simultâneas
(simultaneous saccharification and fermentation). ............................................................
40
Figura 10. Possíveis aplicações dos componentes da biomassa lignocelulósica
(Adaptado de Sun et al., 2011). ..........................................................................................
41
Figura 11. Visão esquemática do sistema celulolítico. Uma rota de formação de
soforose pela atividade de transglicosilação da β-glicosidase também está apresentada.
(Adaptado de Aro et al., 2005). ..........................................................................................
42
Figura 12. Estrutura química do anel imidazólico. .............................................................
46
Figura 13. Reprodução do título do artigo de Paul Walden publicado em 1914 sobre a
síntese de nitrato de etilamônio. .........................................................................................
48
Figura 14. Título da patente americana de 1934 (US 1943176) e da patente suíça
original de 1930 (CH 283446) (Sun et al., 2011). ..............................................................
49
Figura 15. Representação esquemática do mecanismo de dissolução da celulose no
líquido iônico cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio (Feng e Chen, 2008). ........................
51
Figura 16. Estudo in-situ da dissolução de switchgrass em acetato de 1-etil-3metilimidazólio. Imagens de fluorescência confocal da biomassa (a) antes do prétratamento; (b) 20 min depois; (c) 50 min depois; (d) 120 min depois (Singh et al.,
2009). ..................................................................................................................................
52
Figura 17. Estrutura química de líquidos iônicos comumente descritos para o prétratamento da biomassa: (a) cloreto de 1-alquil(ou alil)-3-metilimidazólio; (b) acetato de
1-alquil-3-metilimidazólio; (c) formato de 1-alquil-3-metilimidazólio; (d) brometo de 1butil-3-metil-imidazólio; (e) dialquil fosfato de 1-alquil-3-metilimidazólio; (f) cloreto
de 1-butil-3-metilpiridínio. .................................................................................................
Figura 18. Representação esquemática simplificada de uma extrusora. ............................
53
61
Figura 19. (a) Exemplos de diferentes modelos de elementos de mistura e transporte; (b)
Montagem de uma rosca de extrusão (Adaptado de KOLTER et al., 2010). .....................
62
Figura 20. Características de dupla-roscas corrotantes e contrarrotantes (Adaptado de
Kolter et al., 2010). .............................................................................................................
Figura 21. Líquidos iônicos utilizados nesse estudo. a) cloreto de 1-butil-3metilimidazólio ([Bmim][Cl]), b) acetato de 1-etil-3-metilimidazólio ([Emim][Ac]), c)
cloreto de 1-alil-3-metilimidazólio ([Amim][Cl]), d) fosfato de dimetila de 1,3dimetilimidazólio ([Mmim][DMP]), e) bis(trifluormetanosulfonil) imida de 1-n-butil-3metilimidazólio ([Bmim][NTf2]) e f) sulfato de etila de 1-etil-3-hidroximetil piridina.
62
70
Figura 22. Fluxograma de utilização das de diversas frações da biomassa moída. ............
71
Figura 23. Representação das etapas realizadas para o pré-tratamento da biomassa. ........
73
Figura 24. Configuração experimental utilizada em ensaios contendo 1 g de bagaço e 20
g de [Emim][Ac]. O frasco ao fundo contém apenas o líquido iônico. ..............................
74
Figura 25. Extrusora utilizada neste estudo. .......................................................................
74
Figura 26. Configuração da dupla-rosca utilizada neste estudo. Os números representam
o tamanho da rosca, dos elementos ou dos passos dos elementos, em mm. ......................
75
Figura 27. Equipamento utilizado para o pré-tratamento por moinho de bolas. (a) visão
geral do moinho; (b) copos e bolas utilizadas para a moagem. ..........................................
76
Figura 28. Esquematização do perfil de difração de raios-X de uma biomassa
lignocelulósica. I200: intensidade de difração do plano cristalino 200; I am: intensidade de
difração no valor mínimo obtido entre os picos de difração 200 e 110; I 110: intensidade
de difração do plano cristalino 110. ...................................................................................
Figura 29. Efeito do pré-tratamento utilizando diferentes líquidos iônicos na hidrólise
enzimática do bagaço pré-tratado a 120 °C, por 120 min. (a) Rendimento em glicose e
(b) rendimento em xilose. ♦: in natura, ▲: [Bmim] [Cl], ●: [Emim] [Ac], ◇: [Amim]
[Cl], □: [Mmin] [DMP], ○: [Bmim] [NTf2], ∆: Sulfato de etila de 1-etil-3-hidroximetil
piridina. Os rendimentos de conversão de celulose em glicose e xilana em xilose foram
calculados com base no conteúdo de celulose do bagaço in natura, levando em
consideração o percentual de sólidos que foram extraídos durante o pré-tratamento com
cada líquido iônico. ............................................................................................................
82
88
Figura 30. Solução obtida após rotaevaporação da fração líquido iônico-água obtida
após o pré-tratamento em diversas temperaturas. ...............................................................
91
Figura 31. Efeito do pré-tratamento com [Emim][Ac] por diferentes tempo de incubação
na hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado a 120 °C. ◆: in natura, ▲: 5min, ●: 15
min, ◇: 30 min, □: 60 min, ○: 120 min. ............................................................................
93
Figura 32. Perfil de difração de raios-X do bagaço in natura e pré-tratado com
[Emim][Ac] por diferentes tempos de reação. As linhas, de baixo para cima,
representam (a) bagaço in natura e bagaço tratado por (b) 5 min, (c) 15 min, (d) 30 min,
(e) 60 min, (f) 120 min. As linhas verticais foram traçados para facilitar a visualização
do deslocamento/desaparecimento dos picos referentes à difração de planos cristalinos
da celulose. .........................................................................................................................
94
Figura 33. Morfologia do bagaço in natura e pré-tratado com [Emim][Ac]. (a) in natura
(X5.000), (b) in natura (X60.000), (c) tratado com [Emim] [Ac] por 120 min
(X20.000), e (d) tratado com [Emim] [Ac] por 120 min (X60.000). A marcação em
vermelho em (c) representa a área magnificada, mostrada em d. ......................................
95
Figura 34. Perfis das fermentações dos hidrolisados da biomassa pré-tratada com
[Emim][Ac] (linhas sólidas) e das soluções controle (linhas tracejadas). (a)
concentração de (●) glicose e (□) etanol ao longo da fermentação; (b) concentração de
(∆) xilose ao longo da fermentação com a linhagem de S. cerevisiae IR-2. ......................
96
Figura 35. (a) Etapas experimentais realizadas para a avaliação da necessidade de
celobioidrolases na hidrólise de biomassas com cristalinidade reduzida. (b) Bagaço e
celulose pré-tratados com moinho de bolas (MB) e líquico iônico (LI). ...........................
99
Figura 36. Perfis de hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com (a) MB e (b) LI
utilizando as enzimas EGPh/BGPf, Optimash e Acremonium Cellulase. A linha
tracejada representa o rendimento teórico em glicose obtido com a Optimash
considerando a conversão da celobiose em glicose. ........................................................... 101
Figura 37. Perfis de difração de raios-X do bagaço in natura e pré-tratado com (a)
moinho de bolas e (b) líquido iônico antes e após a hidrólise enzimática com Optimash
e EGPh/BGPf. .....................................................................................................................
103
Figura 38. Perfis de hidrólise enzimática da celulose pré-tratada com (a) MB e (b) LI
utilizando as enzimas EGPh/BGPf, Optimash e Acremonium Cellulase. A linha
tracejada representa o rendimento teórico em glicose obtido com a Optimash
considerando a conversão da celobiose acumulada em glicose. ........................................ 103
Figura 39. Perfis de difração de raios-X da celulose não tratada e pré-tratada com (a)
moinho de bolas e (b) líquido iônico antes e após a hidrólise enzimática com Optimash
e EGPh/BGPf. ..................................................................................................................... 106
Figura 40. Efeito da razão de bagaço:[Emim][Ac] utilizada e do número de ciclos de
extrusão realizados durante o pré-tratamento nos rendimentos em glicose e xilose
obtidos após 24 h de hidrólise enzimática das amostras pré-tratadas. NT representa o
bagaço não tratado (in natura). Todos os experimentos de pré-tratamento foram
realizados a 140 °C. ............................................................................................................ 112
Figura 41. (a) Perfil de hidrólise enzimática do bagaço (×) in natura; (♦) extrusado sem
adição de [Emim][Ac]; extrusado utilizando as razões de bagaço:[Emim][Ac] de: (■)
1:1; (+) 1:3; (●) 1:5; (▲)1:8; (b) Produtividade da hidrólise enzimática após 9h de
sacarificação. Todos os experimentos de pré-tratamento foram realizados a 140 °C e os
resultados são relativos às amostras tratadas por dois ciclos de extrusão . ............................... 114
Figura 42. Evolução do torque ao longo da extrusão do bagaço sem aditivo e da mistura
bagaço-[Emim][Ac]. ...........................................................................................................
115
Figura 43. Perfil da difração de raios-X das amostras de bagaço in natura e pré-tratadas
por dois ciclos de extrusão utilizando diferentes razões de bagaço:[Emim][Ac]. (a)
bagaço in natura; bagaço extrusado com [Emim][Ac] em uma razão de: (b) 1:1; (c) 1:3;
(d) 1:5; (e) 1:8. As setas indicam o ângulo de difração do maior pico. ..............................
116
Figura 44. Micrografias do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado a 140 °C com uma
razão de bagaço:[Emim][Ac] de (a) 1:1 por três ciclos de extrusão; (b) 1:3 por dois
ciclos de extrusão; (c) 1:5 por dois ciclos de extrusão. ......................................................
117
Figura 45. Efeito da temperatura do cilindro de extrusão e do número de ciclos
realizados nos rendimentos em glicose e xilose obtidos após 24 h de hidrólise
enzimática das amostras pré-tratadas. NT representa o bagaço não-tratado (in natura). ...
118
Figura 46. (a) Mistura de bagaço-[Emim][Ac] na razão de 1:5 a 180 ºC; (b) Parafusos
de extrusão após o pré-tratamento da mistura bagaço-[Emim][Ac] na razão de 1:5 a 180
ºC. .......................................................................................................................................
119
Figura 47. Perfis de difração de raios-X das amostras pré-tratadas em diferentes
temperaturas com a razão de bagaço:[Emim][Ac] de 1:3. As setas indicam o ângulo de
difração do maior pico. .......................................................................................................
120
Figura 48. Micrografias do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com uma razão
bagaço:[Emim][Ac] de 1:3 por um ciclo de extrusão a (a) 80 °C, (b) 120 °C, (c) 140 °C,
(d) 160 °C, (e) 180 °C. .......................................................................................................
121
Figura 49. Comparação dos rendimentos em glicose obtidos após a hidrólise enzimática
das amostras pré-tratadas com as razões de bagaço:[Emim][Ac] de 1:20, por 30 min e
120 min, e bagaço:[Emim][Ac] de 1:3, por até 3 ciclos de extrusão. ................................
121
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Composição média do colmo da cana-de-açúcar. ..............................................
37
Tabela 2. Principais enzimas necessárias para a hidrólise dos polissacarídeos presentes
em materiais lignocelulósicos a monômeros. .....................................................................
42
Tabela 3. Vantagens e desvantagens de processos de pré-tratamento comumente
reportados. ..........................................................................................................................
Tabela 4. Ponto de fusão de alguns sais contendo o ânion Cl (RODRIGUES, 2010). ......
45
47
Tabela 5. Comparação dos rendimentos de sacarificação de biomassas pré-tratadas com
diversos LIs, evidenciando as diferentes condições de processo utilizadas. ......................
54
Tabela 6. Condições de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar utilizadas em
estudos publicados e resultados de sacarificação obtidos. .................................................
56
Tabela 7. Condições utilizadas para o pré-tratamento por extrusão de diversos tipos de
biomassas e rendimentos obtidos após hidrólise enzimática do material pré-tratado. .......
Tabela 8. Composição das biomassas in natura expressa em percentual da matéria seca.
63
85
Tabela 9. Concentrações de glicose e xilose obtidas após 48 h de hidrólise enzimática
do bagaço e da palha de cana-de-açúcar pré-tratados com diferentes líquidos iônicos. ....
86
Tabela 10. Percentual de sólidos que foram extraídos e que permaneceram solúveis na
fração líquido iônico-água após adição do antissolvente (com base na matéria seca). ......
89
Tabela 11. Efeito da temperatura utilizada no pré-tratamento com [Emim][Ac] na
hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado por 120 min e no percentual de sólidos que
foram extraídos e que permaneceram solúveis após adição do antissolvente. ...................
90
Tabela 12. Percentual de sólidos extraídos, rendimentos em glicose e xilose obtidos
após 72 h de hidrólise enzimática e área de superfície específica (ASS) do bagaço prétratado a 120 °C por diferentes tempos de pré-tratamento. ................................................
92
Tabela 13. Composição do hidrolisado, produção de etanol e rendimentos de etanol
após 24 horas de fermentação com a cepa industrial floculante S. cerevisiae IR-2. ..........
Tabela 14. Composição do bagaço pré-tratado expressa em percentual da matéria seca.
97
99
Tabela 15. Rendimentos da hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com moinho de
bolas utilizando as enzimas EGPh/BGPf, Optimash BG e Acremonium Cellulase. .......... 100
Tabela 16. Rendimentos da hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com o LI
[Emim][Ac] utilizando as enzimas EGPh/BGPf, Optimash BG e Acremonium
Cellulase. ............................................................................................................................ 100
Tabela 17. Rendimentos da hidrólise enzimática da celulose pré-tratada com moinho de
bolas utilizando as enzimas EGPh/BGPf, Optimash BG e Acremonium Cellulase. .......... 104
Tabela 18. Rendimentos da hidrólise enzimática da celulose pré-tratada com o líquido
iônico utilizando as enzimas EGPh/BGPf, Optimash BG e Acremonium Cellulase. ........ 104
Tabela 19. Área de superfície específica do bagaço e da celulose não tratados, tratados
com moinho de bolas (MB) e tratados com líquido iônico (LI) antes da hidrólise
enzimática e após 72 h de hidrólise com EGPh/BGPf e Optimash BG. ............................ 107
Tabela 20. Composição química das amostras pré-tratadas com diferentes razões de
bagaço:[Emim][Ac] e por diferentes ciclos de extrusão. Os resultados representam a
média de pelo menos duas replicatas. ................................................................................. 111
Tabela 21. Efeito da razão de bagaço:[Emim][Ac] utilizada para o pré-tratamento na
área de superfície específica (ASS) do bagaço pré-tratado. ............................................... 117
Tabela 22. Composição química das amostras pré-tratadas em diferentes temperaturas e
por diferentes ciclos de extrusão com a razão de bagaço:[Emim][Ac] de 1:3. Os
resultados representam a média de pelo menos duas replicatas. ........................................ 118
Tabela 23. Efeito da temperatura utilizada durante o pré-tratamento na área de
superfície específica (ASS) do bagaço pré-tratado com a razão bagaço:[Emim][Ac] de
1:3. ...................................................................................................................................... 119
LISTA DE ABREVIAÇÕES
1G
Etanol de primeira geração
2G
Etanol de segunda geração
AFEX
Explosão com amônia (Ammonia Fiber Explosion)
AIST
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
BG
β-glicosidase
BGPf
β-glicosidase de Pyrococcus furiosus
BGU
Unidade de atividade de β-glicosidase (β-glucosidase unit)
CMC
Carboximetilcelulose
CMCase
Atividade de endoglucanases sobre o CMC
CNPq
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CONAB
Companhia Nacional de Abastecimento
DNS
Ácido 3,5-dinitrosalicílico
EG
Endoglucanase
EGPh
Endoglucanase de Pyrococcus hoshikoshii
FPase
Atividade de celulases total sobre o papel de filtro (Fiter paper activity)
FPU
Unidade de papel de filtro (Filter paper unit)
HPLC
Cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance/Pressure
Liquid Chromatography)
ICr
Índice de cristalinidade
IR-2
Cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae
MB
Moinho de bolas
LI
Líquido iônico
NREL
National Renewable Energy Laboratory
SSF
Fermentação e sacarificação simultâneas (Simultaneous saccharification
and fermentation)
UI
Unidades internacionais
Lista de Líquidos Iônicos
[Amim][Cl]
Cloreto de 1-alil-3-metilimidazólio
[Bmim][Cl]
Cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio
[Bmim][HSO4]
Sulfato hidrogenado de 1-butil-3-metilimidazólio
[Bmim][NTf2]
Bis(trifluormetanossulfonil) imida de 1-n-butil-3-metilimidazólio
Ch[Ac]
Chlorine acetate
[Emim][Ac]
Acetato de 1-etil-3-metilimidazólio
[Emim][Cl]
Cloreto de 1-etil-3-metilimidazólio
[Emim][DEP]
Fosfato de dietila de 1-etil-3-metilimidazólio
[Bmim][MeCO2] Metanossulfonato de 1-butil-3-metilimidazólio
HEMA
Sulfato de metila de tris-(2-hidroxietil)-metil amônio
[Mmim][DMP]
Fosfato de dimetila de 1,3-dimetilimidazólio
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................
24
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...............................................................................
29
2.1. A biomassa lignocelulósica ............................................................................... 30
2.1.1. Celulose .................................................................................................
30
2.1.2. Hemiceluloses .......................................................................................
33
2.1.3. Lignina ................................................................................................... 35
2.1.4. A biomassa da cana-de-açúcar ..............................................................
36
2.2. Produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica .................................. 38
2.3. Hidrólise Enzimática .........................................................................................
41
2.4. O pré-tratamento ...............................................................................................
44
2.4.1. Pré-tratamento com líquidos iônicos (LIs) .............................................
46
2.4.1.1. Características gerais dos líquidos iônicos ................................
46
2.4.1.2. Histórico
da
aplicação
de
líquidos
iônicos
para
o
processamento da celulose .........................................................
48
2.4.1.3. A técnica de pré-tratamento ........................................................ 49
2.4.1.4. Efeito do pré-tratamento com líquidos iônicos na hidrólise
enzimática da biomassa ..............................................................
53
2.4.1.5. Efeito dos líquidos iônicos na atividade e estabilidade de
celulases ......................................................................................
56
2.4.1.6. Efeito dos líquidos iônicos em Saccharomyces cerevisiae ........
59
2.4.1.7. Vantagens e desvantagens do pré-tratamento com líquidos
iônicos ......................................................................................... 59
2.4.2. Pré-tratamento por extrusão ...................................................................
60
2.4.2.1. Vantagens e desvantagens do pré-tratamento por extrusão ........ 64
3. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 65
4. OBJETIVOS ............................................................................................................
67
5. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 70
5.1. Materiais ...........................................................................................................
71
5.2. Determinação da composição química da biomassa ......................................... 71
5.2.1. Método gravimétrico .............................................................................
71
5.2.2. Método baseado na análise de açúcares ................................................
72
5.3. Condições de pré-tratamento............................................................................
72
5.3.1. Processo de pré-tratamento para seleção do líquido iônico mais
eficiente ..................................................................................................
72
5.3.2. Processo de pré-tratamento de alto teor de sólidos com líquidos
iônicos ....................................................................................................
74
5.3.3. Processo por moinho de bolas ...............................................................
75
5.4. Dosagens enzimáticas .......................................................................................
76
5.4.1. Preparo do reagente DNS ......................................................................
76
5.4.2. Atividade FPase ..................................................................................... 76
5.4.3. Atividade CMCase ................................................................................
77
5.4.4. Atividades de β-glicosidade, β-xilosidase e α-L-arabinofuranosidase .. 77
5.4.5. Atividade de xilanase ............................................................................
78
5.4.6. Dosagem das enzimas hipertermofílicas ...............................................
78
5.5. Hidrólise enzimática .........................................................................................
78
5.5.1. Hidrólise para avaliação da eficiência de pré-tratamento .....................
78
5.5.2. Hidrólise para avaliação do requerimento de celobioidrolases ...........
80
5.6. Fermentação alcoólica ......................................................................................
80
5.7. Quantificação dos monossacarídeos, dissacarídeos e etanol ............................
81
5.8. Análise da cristalinidade por difração de raios-X.............................................. 81
5.9. Análise da área de superfície específica e morfologia.......................................
82
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................
84
PARTE I
6.1. Seleção de um líquido iônico para o pré-tratamento da biomassa de cana-deaçúcar ...............................................................................................................
85
6.1.1. Composição da biomassa utilizada ......................................................... 85
6.1.2. Escolha da biomassa de estudo .............................................................
86
6.1.3. Avaliação do efeito dos líquidos iônicos testados no bagaço de canade-açúcar ................................................................................................
87
6.1.4. Avaliação do efeito da temperatura e do tempo de pré-tratamento do
bagaço com o líquido iônico [Emim][Ac] .............................................. 90
6.1.5. Fermentação alcoólica dos hidrolisados do bagaço tratado com
[Emim][Ac] ............................................................................................
95
6.1.6. Considerações finais – Parte I ……………….......................................
97
PARTE II
6.2. Avaliação da necessidade de celobioidrolases (CBH) nas misturas
enzimáticas para a hidrólise de materiais pré-tratados com líquido iônico .......
98
6.2.1. Requerimento de celobioidrolases (CBH) para a hidrólise do bagaço
pré-tratado ..............................................................................................
99
6.2.2. Requerimento de celobioidrolases (CBH) para a hidrólise da celulose
pré-tratada .................................................................................
6.2.3. Avaliação da área de superfície específica ............................................
103
106
6.2.4. Considerações finais - Parte II ................................................................ 108
PARTE III
6.3.Pré-tratamento do bagaço em alta carga de sólidos com o líquido iônico
[Emim][Ac] ........................................................................................................
110
6.3.1. Efeito da carga de biomassa e do número de ciclos de extrusão na
eficiência do pré-tratamento ..................................................................
110
6.3.2. Efeito da temperatura do cilindro de extrusão na eficiência do prétratamento ...............................................................................................
117
6.3.3. Comparação da extrusão com o processo de dissolução do
bagaço...................................................................................................... 121
6.3.4. Considerações finais – Parte III .............................................................. 122
7. CONCLUSÕES .......................................................................................................
124
8. TRABALHOS FUTUROS ...................................................................................... 126
REFERÊNCIAS ......................................................................................................
128
ANEXOS ..................................................................................................................
150
1. Introdução
25
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Introdução
A produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica é uma das tecnologias mais
pesquisadas atualmente visando a produção de combustíveis renováveis. A rota de
transformação da biomassa em etanol que é comumente reportada é constituída das seguintes
etapas: pré-tratamento da biomassa, produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas,
hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada, fermentação dos açúcares a etanol e destilação
do produto final.
No passado, a hidrólise ácida da biomassa com ácido sulfúrico concentrado ou diluído,
sem adição de enzimas, foi um método muito pesquisado para a obtenção de um xarope de
monossacarídeos a partir dos polissacarídeos da biomassa lignocelulósica (FARONE e
CUZENS, 1996). No entanto, cada vez mais esse enfoque tem sido abandonado por diversas
razões, entre elas: (i) a utilização de ácidos causa a corrosão de equipamentos, o que requer
altos investimentos em equipamentos resistentes à corrosão; (ii) o alto gasto energético com o
processo e com etapas de recuperação do ácido; (iii) geração de efluentes tóxicos; (iv)
necessidade de correção do pH para a etapa de fermentação; (v) produção de subprodutos que
inibem a fermentação alcoólica (TAHERZADEH e KARIMI, 2007a).
Nesse sentido, a hidrólise enzimática da biomassa se mostra como uma alternativa
interessante, já que esta não apresenta as desvantagens descritas para a hidrólise catalisada por
ácidos (GALBE e ZACCHI, 2007). Por outro lado, esse processo apresenta outras
dificuldades, como a baixa velocidade da reação de hidrólise, que ocorre devido à
acessibilidade limitada das enzimas aos polissacarídeos presentes na biomassa in natura. Por
isso, ao se optar por um processo de hidrólise enzimática, uma etapa de pré-tratamento da
biomassa faz-se necessária. O pré-tratamento tem o objetivo de desorganizar a estrutura
compacta da parede celular dos vegetais, aumentando assim a acessibilidade das enzimas ao
substrato durante a hidrólise (JØRGENSEN et al., 2007; TAHERZADEH e KARIMI,
2007b).
Nos últimos 30 anos, diversos métodos de pré-tratamento foram desenvolvidos,
incluindo processos biológicos, físicos, químicos e físico-químicos (ALVIRA et al., 2010).
Apesar dos esforços contínuos para o desenvolvimento de pré-tratamentos efetivos e
economicamente viáveis, as pesquisas ainda estão em andamento. Recentemente, o uso de
líquidos iônicos para o pré-tratamento da biomassa lignocelulósica ganhou bastante evidência,
principalmente devido à denominação desses reagentes como “solventes verdes” (EARLE e
SEDDON, 2000).
Os líquidos iônicos podem ser classificados como materiais constituídos puramente
por íons que apresentam uma temperatura de fusão abaixo de 100 °C, sendo muitos deles
26
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Introdução
líquidos a temperatura ambiente. Os líquidos iônicos apresentam características muito
interessantes, podendo ser projetados de acordo com as características físico-químicas
almejadas através da combinação de diferentes cátions e ânions. Além disso, normalmente,
apresentam pressão de vapor não mensurável e, geralmente, uma estabilidade térmica em uma
ampla faixa de temperaturas (FENG et al., 2010). Como resultado, os líquidos iônicos têm
sido utilizados com sucesso na substituição de solventes tradicionais em diversos processos
industriais e apresentam potencial para diminuir a dependência da indústria química de
compostos orgânicos voláteis (ROGERS e SEDDON, 2003). No entanto, é importante
ressaltar que os líquidos iônicos não são intrinsecamente “verdes” (alguns são de fato
extremamente tóxicos), mas eles podem ser projetados para serem inócuos ao meio ambiente,
apresentando assim muitas oportunidades para o desenvolvimento de processos químicos
sustentáveis.
Os líquidos iônicos já foram relatados como capazes de dissolver a celulose e
materiais lignocelulósicos, como palha de arroz, palha de trigo, gramíneas como Panicum
virgatum (switchgrass), madeira, entre outros (LI et al., 2010; MÄKI-ARVELA et al., 2010;
NGUYEN et al., 2010; SUN et al., 2009; ZHU et al., 2006). Lee e colaboradores (2009a)
mostraram que alguns líquidos iônicos podem ser utilizados para realizar uma extração
seletiva da lignina e propuseram uma nova rota de fracionamento da biomassa.
No tratamento da biomassa com líquidos iônicos, após a dissolução, a fração da
biomassa rica em celulose pode ser precipitada através da adição de um antissolvente como,
por exemplo, a água. A lignina extraída e outros extrativos podem ser removidos com a
lavagem. O mais relevante é que, após o pré-tratamento com líquidos iônicos, o tempo de
hidrólise enzimática pode ser reduzido drasticamente e rendimentos de conversão de celulose
em glicose próximos a 100% podem ser obtidos. Os resultados são ainda mais relevantes
quando se compara a eficiência do pré-tratamento com líquidos iônicos com outros métodos
já bem descritos. Li e colaboradores (2010) mostraram que foram necessárias apenas 12 h de
hidrólise enzimática da gramínea Panicum virgatum (switchgrass) pré-tratada com líquido
iônico para atingir mais de 90% de rendimento, enquanto a hidrólise da mesma biomassa
tratada com ácido diluído necessitou de 72 h de sacarificação para atingir 80% de conversão
da celulose a glicose.
Apesar de existirem muitas vantagens relacionadas ao pré-tratamento mediado por
líquidos iônicos, a utilização desses reagentes em larga escala para essa aplicação é ainda uma
realidade distante, principalmente devido ao seu custo atual (MORA-PALE et al., 2011). A
maioria dos métodos de pré-tratamento da biomassa com líquidos iônicos descritos tem
27
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Introdução
utilizado uma razão de biomassa:líquido iônico em uma faixa de 1:15 – 1:20 (p/p) (MORAPALE et al., 2011), assumindo que os líquidos iônicos precisam ser utilizados em grande
excesso em relação à biomassa, exercendo dessa forma a função de um solvente e não de um
aditivo químico capaz que promover modificações na estrutura da biomassa.
Tais
quantidades de liquido iônico (15 a 20 vezes maiores que a quantidade de biomassa a ser
tratada) podem constituir um impedimento futuro para a utilização desses reagentes, mesmo
que o custo tenda a diminuir com o aumento da demanda. Apesar disso, pouca atenção tem
sido dada a este fato e ainda existem informações insuficientes sobre qual seria realmente a
quantidade mínima necessária de líquidos iônicos para um pré-tratamento efetivo da
biomassa.
Dessa forma, este trabalho buscou selecionar um líquido iônico para o pré-tratamento
da biomassa da cana-de-açúcar e propor um novo método de pré-tratamento da biomassa com
líquidos iônicos utilizando uma razão de biomassa:líquido iônico maior do que a usualmente
reportada. Ao se propor um processo de pré-tratamento onde o líquido iônico atuará como um
aditivo químico e não mais como um solvente, ou seja, com altos teores de biomassa, deve-se
considerar a dificuldade de se obter uma agitação eficiente. Em geral, quando sistemas
operacionais usuais são utilizados, isto é, através do emprego de reatores equipados com um
sistema de agitação contínuo, as transferências de massa e calor não são realizadas de forma
ideal quando o teor de sólidos é maior que 20%. Vale resaltar que, como o efeito da
temperatura é primordial para a atuação efetiva do líquido iônico na biomassa, uma
transferência de calor homogênea é de extrema importância para o pré-tratamento.
Por isso, um sistema de mistura eficiente seria necessário para promover a interação
efetiva do líquido iônico com toda a estrutura da biomassa na temperatura correta. Nesse
sentido, foi proposta a utilização de uma extrusora de dupla-rosca, já que esta poderia
representar um sistema interessante, onde seria possível promover uma mistura eficaz da
biomassa com o líquido iônico e ao mesmo tempo, controlar a temperatura de reação, além do
tempo de pré-tratamento (através do design da rosca e da velocidade de alimentação).
O sistema de extrusão é de fácil operação e economicamente viável para aplicação
em larga escala (LEE et al., 2010a). A extrusão da biomassa lignocelulósica sem aditivos é
um processo difícil, devido à baixa propriedade de fluxo da matéria fibrosa dentro do cilindro
de extrusão, ocasionando acúmulo de biomassa e bloqueio da extrusão durante o processo
(YOO et al., 2011). No entanto, na proposta desse trabalho foi pensando um sistema onde o
material extrusado seria uma mistura de materiais lignocelulósicos com líquidos iônicos, o
que aumentaria a viscosidade e a capacidade de fluxo, reduzindo drasticamente o torque
28
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Introdução
operacional, transpondo assim os problemas citados acima. Através dessa abordagem, seria
possível diminuir a quantidade de líquido iônico necessária ao processo, utilizando um
sistema de mistura eficiente, melhorando assim as perspectivas de uso desses reagentes de
forma economicamente favorável.
Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo explorar o pré-tratamento da
biomassa de cana-de-açúcar com líquidos iônicos, buscando em uma primeira etapa a seleção
de um líquido iônico eficiente e a otimização das condições de pré-tratamento. Em uma
segunda etapa, pretendeu-se aplicar uma nova visão para o uso de líquido iônico no prétratamento, buscando investigar o uso de tais reagentes não somente como solventes da
biomassa, mas também como aditivos químicos capazes de causar transformação na estrutura
da parede celular.
2. Revisão
Bibliográfica
30
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
2.1. A biomassa lignocelulósica
A biomassa lignocelulósica é um recurso renovável derivado da parede celular vegetal
cujos principais componentes são a celulose, a hemicelulose e a lignina, contendo também
pequenas quantidades de pectina, proteínas, extrativos e cinzas. O completo potencial
energético e tecnológico dessa matéria-prima ainda não é explorado pelo homem, em parte
devido à formação de uma cadeia produtiva mundial baseada na produção de insumos pela
indústria petroquímica, desenvolvida a partir do século XX. Outros fatores estão relacionados
à natureza recalcitrante da biomassa e à dificuldade de modificar as propriedades de seus
constituintes, tornando seu processamento dispendioso.
Tipicamente, a distribuição dos componentes da biomassa varia entre 40-50% de
celulose, 20-40% de hemicelulose e 18-35% de lignina (SUN et al., 2011) (Figura 1). Cada
um desses componentes será descrito em mais detalhes a seguir.
Figura 1. Composição média da biomassa lignocelulósica.
2.1.1. Celulose
A celulose é o polímero orgânico mais abundante na natureza e o principal constituinte
da parede celular vegetal, sendo a sua produção na natureza estimada em 1,5 x 1012 toneladas
anualmente (KLEMM et al., 2005). A celulose é definida como um polímero linear formado
por resíduos de glicose conectados por ligações do tipo β-(1,4). A formação da ligação
glicosídica β-(1,4) requer que os resídudos glicosídicos adjacentes estejam posicionados 180 °
em relação um ao outro, formando a unidade de celobiose (O’SULLIVAN, 1997). O grau de
polimerização da celulose de plantas varia entre 500-15.000 resíduos de D-glicose,
dependendo da sua localização na parede celular primária ou secundária (Figura 2)
(ALBERSHEIM et al., 2011).
31
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
Os resíduos de D-glicose estão posicionados de forma que as moléculas adjacentes
podem formar ligações de hidrogênio entre os átomos de oxigênio de uma unidade glicosídica
com o grupo hidroxil do átomo C-3 de outra unidade. Estas ligações de hidrogênio dificultam
a livre rotação dos anéis em torno das ligações glicosídicas, resultando no enrijecimento da
cadeia. O caráter linear observado nas cadeias de celulose permite que cadeias adjacentes se
posicionem próximas uma das outras (DUFRENSE, 2012). Dessa forma, nas celuloses
naturais, as cadeias se alinham formando fibrilas organizadas que apresentam regiões com
estrutura cristalina (ordenada) e regiões com estrutura amorfa (menos ordenadas).
Figura 2. Estrutura molecular da celulose (n+4= grau de polimerização). Adaptado de Klemm et al., 2005.
Nos vegetais superiores, dois tipos de estrutura cristalina podem ocorrer, as celuloses
Iα e Iβ, conjuntamente referidas como celulose I, sendo o sistema Iβ descrito como
predominante (SILVA e D’ALMEIDA, 2009). No entanto, as proporções entre as formas Iα e
Iβ, o percentual de cristalinidade e o tamanho das fibras variam de acordo com a origem da
celulose e da sua localização na parede celular (LANGAN et al., 2011).
Além da celulose I, outros alomorfos da estrutura cristalina podem ser obtidos após
processamento mecânico, témico ou químico da celulose (celulose II, III e IV). A celulose II,
um alomorfo comumente reportado na literatura, pode ser formada pela dissolução da celulose
em
um
solvente
compatível,
seguida
de
uma
etapa
de
recristalização
por
precipitação/regeneração ou pelo tratamento com solução aquosa de hidróxido de sódio
(também chamado de mercerização) (O’SULLIVAN, 1997). Em uma solução alcalina, alguns
átomos de hidrogênio dos grupos hidroxil da celulose são substituídos por átomos de sódio,
sendo estabelecido um sistema iônico. Por causa da osmose, a água tende a entrar no sistema
e outras ligações de hidrogênio tendem a se quebrar e serem substituídas por ligações com o
álcali. Quando a solução alcalina é removida, a pressão osmótica diminui e a as fibras de
celulose, antes inchadas pelo tratamento, se contraem. Durante a contração, as ligações de
hidrogênio são refeitas, mas em uma orientação diferente, formando a celulose II (DINAND
et al., 2002).
32
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
Os alomorfos celulose IIII e celulose IIIII podem ser formados, em um processo
reversível a partir da celulose I e II, respectivamente, pelo tratamento com amônia líquida (80 °C) ou algumas aminas e a subsequente evaporação do excesso de amônia. Os alomorfos
IVI e IVII podem ser preparados pelo aquecimento das celuloses IIII e IIIII, respectivamente, a
260 °C, na presença de glicerol (O’SULLIVAN, 1997). A conversão dos alomorfos da
celulose está mostrada na Figura 3.
Figura 3. Interconversão dos polimorfos da celulose. A dissolução da celulose em um solvente compatível
ou o seu tratamento com uma solução concentrada de NaOH ocasiona a formação irreversível do
polimorfo cristalino cellulose II. O tratamento da celulose I ou cellulose II com amônia líquida gera,
reversívelmente, os polimorfos IIII e IIIII, respectivamente. Já o tratamento por aquecimento dos
polimorfos IIII e IIIII gera, respectivamente, os polimorfos IVI e IVII. Adaptado de O’SULLIVAN, 1997.
A conversão da celulose I em II é irreversível, devido à conformação da celulose II ser
termodinamicamente mais estável (DUFRENSE, 2012). Enquanto na celulose I é formada por
cadeias orientadas de forma palarela, na celulose II as cadeias estão arranjadas de forma
antiparalela (LANGAN et al., 1999; NISHIYAMA et al., 2002). Ainda não se entende bem
como essa transição ocorre sem que haja uma dispersão das cadeias de celulose (KLEMM et
al., 2005). Foi sugerido que as interações de van der Walls são as forças que determinam a
formação do cristal de celulose II (NISHIYAMA et al., 2000).
O sistema de ligações de hidrogênio cria uma estrutura extremamente organizada, que
pode ser classificada hierarquicamente de acordo com a sua morfologia, podendo formar
fibrilas elementares, microfibrilas e agregados de microfibrilas. As dimensões laterais dessas
estruturas estão entre 1,5 e 3,5 nm para fibrilas elementares, entre 10 e 30 nm para
33
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
microfibrilas e na ordem de 100 nm para agregados de microfibrilas. O comprimento das
microfibrilas está na ordem de várias centenas de nm (KLEMM et al., 2005).
A Figura 4a apresenta um modelo para a estrutura da microfibrila de celulose em um
material lignocelulósico, enquanto a Figura 4b mostra uma esquematização mais detalhada de
um corte transversal da parede celular secundária de madeira conífera. Essa associação íntima
entre os três componentes majoritários da parede celular vegetal é um dos principais
fatoresresponsáveis pela recalcitrância desse material (HIMMEL e PICCATAGGIO, 2008).
Figura 4. (a) Modelo da estrutura da microfibrila (em corte transversal), constituída por fibrilas
elementares. Adaptado de Fengel e Wegener, 1984. (b) Ilustração esquemática de um corte transversal da
parede celular secundária (S2) de madeira de pinheiro, rica em glucomanana na fração hemicelulósica
(Adaptado de Fahlén e Salmén, 2005).
2.1.2. Hemiceluloses
As hemiceluloses são heteropolímeros ramificados com baixa massa molecular,
apresentando um grau de polimerização de 80-200 (PENG et al., 2012). Recentemente,
Scheller e Ulvskov (2010) revisaram a estrutura e a biossíntese das hemiceluloses, definindoas como um grupo de polissacarídeos caracterizados por serem estruturalmente diferenciados
da celulose ou da pectina e por terem esqueletos constituídos por resíduos de glicose, xilose
ou manose unidos por ligações β-(1→4).
As hemiceluloses podem conter pentoses (xilose e arabinose), hexoses (manose,
glicose, galactose) e/ou ácidos urônicos (ácidos glucurônico e galacturônico), que se ligam
uns aos outros essencialmente por ligações glicosídicas β-(1→4), sendo também possível
encontrar ligações glicosídicas β-(1→3), β-(1→6), α-(1→2), α-(1→3) e α-(1→6) nas
34
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Revisão Bibliográfica
ramificações. Outros açúcares como ramnose e fucose também podem estar presentes em
pequenas quantidades e os grupos hidroxil dos açúcares podem estar parcialmente
substituídos por grupos acetil (GÍRIO et al., 2010). A variedade de ligações e de ramificações,
assim como a presença de diferentes unidades monoméricas, contribuem para a complexidade
da estrutura hemicelulósica, sendo necessário um sistema enzimático complexo para a sua
degradação. No entanto, a ausência de propriedade cristalina e de uma estrutura microfibrilar,
como ocorre na celulose, torna a hemicelulose mais susceptível à hidrólise ácida (PARAJÓ et
al., 1998).
Na parede celular, as hemiceluloses estão associadas a vários componentes, como
celulose, proteínas, pectina e lignina (SUN et al., 2000). As hemiceluloses aderem fortemente
à superfície das microfibrilas de celulose via ligações de hidrogênio, sendo sugerido que essa
adesão evitaria a formação de fibrilas maiores de celulose por agregação lateral
(ALBERSHEIM et al., 2011). Ainda, a formação de ligações covalentes entre a pectina e a
xiloglucana já foi reportada, mas os aspectos químicos envolvidos neste tipo de ligação ainda
são desconhecidos (POPPER e FRY, 2005; BRETT et al., 2005). A formação de ligações de
hidrogênio com a celulose, ligações covalentes com a lignina (ligações do tipo éter) e ligações
do tipo éster entre as unidades acetil e ácidos hidroxicinâmicos (principalmente ácidos
ferúlico e p-coumárico) evitam a liberação dos polímeros hemicelulósicos da matriz da parede
celular (XU et al., 2005).
Grandes variações no percentual de hemicelulose e na sua estrutura química podem
ocorrer entre diferentes biomassas e diferentes componente de uma única biomassa (caule,
folhas, raízes, casca) (PENG et al., 2012). As hemiceluloses mais relevantes são as xilanas e
as glucomananas. As xilanas são as mais abundantes e estão disponíveis em grandes
quantidades em resíduos florestais e agroindustriais. Em relação às biomassas madeireiras, as
hemiceluloses contendo manana, como glucomananas e galactomananas são os principais
componentes da hemicelulose de coníferas ou softwoods (Pinus, Araucaria, entre outras),
enquanto em madeiras folhosas ou hardwoods (maioria das árvores brasileiras e o eucalipto)
as glucuronoxilanas são mais representativas (GÍRIO et al., 2010).
Nas culturas agrícolas, o tipo de hemicelulose mais abundante é a arabinoxilana,
constituída por um esqueleto de resíduos de xilose ligado por ligações β-(1→4). Ligados a
estes resíduos, nas posições C-2 e/ou C-3, estão resíduos de L-arabinose e ácido glucurônico
(ou seu derivado 4-O-metil) (PENG et al., 2009). Além disso, os resíduos de xilose podem
conter grupos O-acetil substituindo alguns dos grupos hidroxil. No bagaço de cana-de-açúcar,
o tipo de hemicelulose descrita como predominante é o 4-O-metil-glucuronoarabinoxilana
35
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(PENG et al., 2009; BIAN et al., 2012). A estrutura esquemática da glucuronoarabinoxilana
está representada na Figura 5.
Figura 5. Estrutura esquemática da glucuronoarabinoxilana, descrita como predominante em
monocotiledôneas. “Fer” representa a esterificação com ácido ferúlico. Adaptado de Scheller e Ulvskov,
2010.
2.1.3. Lignina
A lignina é uma macromolécula presente em todas as plantas vasculares, sendo a sua
produção anual estimada em 5–36 x 108 toneladas. A lignina não é homogeneamente
distribuída na parede celular, estando ausente na parede celular primária e apresentando
grande concentração na lamela média e na parede celular secundária (GELLERSTEDT e
HENRIKSSON, 2008).
É conhecida por conferir aos tecidos vegetais rigidez,
impermeabilidade e resistência a ataques microbianos e mecânicos (GRABBER, 2005), sendo
apontada como um dos principais fatores limitantes ao ataque enzimático da celulose (ZHU et
al., 2008).
A lignina é formada pela polimerização de alcoóis cinamílicos (monolignóis) que
diferem em estrutura dependendo do tipo de planta. Em coníferas (softwood), a lignina é
composta quase que exclusivamente pelo álcool coniferílico, apresentando pequenas
quantidades de álcool p-coumarílico Em árvores folhosas (hardwoods), estão presentes os
alcoóis coniferílico e sinapílico, enquanto em monocotiledôneas, como a cana-de-açúcar, os
três alcoóis estão presentes como precursores da lignina (FENGEL e WEGENER, 1984;
SJÖSTRÖM, 1993; SAKAKIBARA et al., 2001). A Figura 6 mostra a estrutura dos três
principais monolignóis encontrados na composição da lignina de diversos vegetais.
36
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Figura 6. Tipos de monolignóis mais comumente encontrados como precursores da lignina. (1) álcool pcoumarílico, (2) álcool coniferílico e (3) álcool sinapílico. Adaptado de Gellerstedt e Henriksson, 2008.
2.1.4. A biomassa da cana-de-açúcar
No Brasil são produzidos cerca de 600 milhões de toneladas de resíduos
agroindustriais por ano, incluindo resíduos de culturas de cana-de-açúcar, milho, arroz,
mandioca, trigo, frutas cítricas, coco e gramíneas, sendo os resíduos provenientes do cultivo
da cana-de-açúcar os mais representativos (FERREIRA-LEITÃO et al., 2010a).
A estrutura da cana-de-açúcar é composta por um colmo e por folhas dispostas
radialmente ao seu redor (Figura 7). Em geral, a massa do colmo corresponde a 80% da massa
da planta. Rodrigues e coautores (1997) encontraram uma variação de 72,7 a 88,4% na
proporção de massa dos colmos em relação a planta inteira, após avaliação de 11 variedades
de cana-de-açúcar.
Figura 7. Ilustração da cana-de-açúcar e denominação de suas diferentes partes (SEABRA et al., 2010).
A composição química dos colmos é extremamente variável em função de diversos
fatores como: variedade da cultura, idade fisiológica, condições climáticas durante o
desenvolvimento e maturação, propriedades físicas, químicas e microbiológicas do solo, tipo
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de cultivo, entre outros (PARANHOS, 1987). A composição média do colmo da cana-deaçúcar está apresentada na Tabela 1.
Tabela 1. Composição média do colmo da cana-de-açúcar.
Componentes do colmo
(%) da massa no colmo
Água
Sólidos totais
Sólidos insolúveis
Sólidos solúveis
73-76
24-27
11-16
10-16
Constituintes dos sólidos solúveis
Açúcares
Sacarose
Glicose
Frutose
Sais
Ácidos orgânicos
Ácidos carboxílicos
Aminoácidos
Outros
Proteínas
Amido
Gomas
Ceras, gorduras, fosfolipídeos
(%) dos sólidos solúveis
71-92
70-88
2-4
2-4
3,0-0,45
1,5-5,5
1,1-3,0
0,5-2,5
0,5-0,6
0,001-0,100
0,3-0,6
0,05-0,15
FONTE: Chen e Chou (1993) – formatação modificada.
Os resíduos fibrosos que podem ser obtidos após a colheita da cana-de-açúcar são
denominados bagaço e palha. O bagaço é o material fibroso obtido após o processamento da
cana-de-açúcar para a extração do caldo (DEEPCHAND, 1986). Já a palha, também
conhecida como trash, é caracterizada pela mistura de folhas secas e verdes e dos ponteiros da
cana-de-açúcar deixados no solo após a colheita. De acordo com a Tabela 1, cada tonelada
úmida de colmo contém cerca de 150 kg de açúcares (seco) e 150 kg de resíduos fibrosos
(seco). Hassuani et al. (2005) descreveram que para cada tonelada de colmo processado, 140
kg de palha são deixados no solo. Dessa forma, pode-se calcular que o bagaço e a palha da
cana-de-açúcar contêm dois terços da energia armazenada na planta (PIPPO et al., 2011).
A produção total de cana-de-açúcar no Brasil em 2012 foi estimada em 595 milhões de
toneladas (CONAB, 2012). Logo, calcula-se que aproximadamente 90 e 85 milhões de
toneladas de bagaço e palha (peso seco), respectivamente, tenham sido produzidas em 2012.
No atual sistema de produção das usinas, 92% do bagaço são utilizados para a produção de
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vapor e eletricidade (processo de cogeração) (MACEDO, 2005). Contudo, espera-se que a
substituição gradual de caldeiras de baixa pressão (22 bar) por sistemas mais eficientes de
cogeração aumente a disponibilidade de bagaço residual nas usinas (COELHO et al., 2006). A
palha é atualmente um resíduo não aproveitado, sendo deixada no campo. Estima-se que 50%
da palha possam ser recolhidos do campo sem que haja prejuízos para a qualidade do solo e
para o controle de pestes (MACRELLI et al., 2012). Dessa forma, com a perspectiva da
expansão do cultivo da cana-de-açúcar, o avanço das tecnologias de cogeração e a
mecanização da colheita, há uma tendência ao aumento dos excedentes de bagaço e palha, que
então estariam disponíveis para utilização em outros processos. A seguir, será apresentado um
dos potenciais usos dessa biomassa no Brasil: a produção de etanol lignocelulósico.
2.2. Produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica
Ao longo da última década, a produção de etanol mundial aumentou expressivamente.
Considerando a produção conjunta dos dois principais produtores mundiais, Brasil e Estados
Unidos, de 2000 a 2012 a produção aumentou de 18,4 para 71,7 bilhões de litros. O máximo
da produção no Brasil foi registrado em 2008, correspondendo a 27,5 bilhões de litros, e em
109 litros
2011 nos Estados Unidos, equivalendo a 52,7 bilhões de litros (Figura 8).
50
Brasil
40
EUA
30
20
10
0
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
Safra (ano)
Figura 8. Produção de etanol no Brasil e nos Estados Unidos de 2001 a 2012. Fonte dos dados brasileiros:
UnicaData (www.unicadata.com.br); fonte dos dados americanos: US Energy Information Administration
(www.eia.gov).
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Atualmente, o etanol é majoritariamente produzido a partir de açúcares fermentáveis
presentes em matérias-primas como cana-de-açúcar, milho, sorgo sacarino, mandioca e
beterraba. No Brasil, a produção de etanol está baseada na fermentação alcoólica da sacarose
presente no caldo da cana-de-açúcar. Já nos Estados Unidos, o amido de milho é hidrolisado
enzimaticamente a glicose, que é fermentada a etanol pela levedura Saccharomyces
cerevisiae. Em ambos os casos, as tecnologias e os mercados já são maduros e consolidados.
O etanol produzido a partir desses processos é também conhecido como “etanol de primeira
geração” (1G) (COELHO et al., 2006).
No entanto, desafios do setor relacionados ao fornecimento e à disponibilidade da
matéria-prima, competição entre alimentos e combustíveis, uso de água e terras
agriculturáveis levam à busca por novas tecnologias alternativas para a produção de
biocombustíveis. Nesse contexto, a biomassa lignocelulósica foi apontada como um dos
recursos naturais mais importantes para a geração de biocombustíveis e outros produtos com
valor agregado. A produção de combustíveis líquidos a partir de fontes lignocelulósicas,
também conhecido como “etanol de segunda geração” (2G), além de não competir pelo uso de
terras destinadas a produção de alimentos, pode promover benefícios ambientais e
econômicos, representando um suprimento energético seguro e limpo (MACRELLI et al.
2012).
Apesar de parecer um fenômeno atual, a proposta de utilização de materiais
lignocelulósicos para obtenção de etanol não é recente e existem relatos que datam do final do
século XIX, como as tentivas de comercialização de etanol produzido pela hidrólise ácida da
madeira na Alemanha em 1898 e nos Estados Unidos em 1910 (RAPIER, 2009;
SHERRARD, 1945). Em meados da década de 70, houve um reestímulo a esta pesquisa,
devido à crise mundial do petróleo. Vários grupos de pesquisa estudaram a hidrólise ácida e
enzimática da celulose e hemicelulose para a produção de etanol, inclusive no Brasil, contudo,
a redução do preço do petróleo no cenário internacional tornou desinteressante o uso dessa
matéria-prima, reconhecidamente recalcitrante, tendo muitos estudos sido retomados somente
no início do século XXI.
Como já descrito, os materiais lignocelulósicos mais atraentes no Brasil são o bagaço e
a palha de cana-de-açúcar por já se encontrarem próximos às usinas, evitando o custo com
transporte da biomassa ao local de processamento. Entretanto, o Brasil é um país de
dimensões continentais e com atividade agrícola diversificada, o que abre várias
possibilidades de utilização de diferentes resíduos agroindustriais na produção de etanol
combustível (FERREIRA-LEITÃO et al., 2010a).
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A produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica utiliza os açúcares
fermentáveis obtidos após a hidrólise da celulose e hemicelulose. Em geral, processos
descritos para o processamento da biomassa a etanol envolvem pelo menos as seguintes
etapas principais: o pré-tratamento da biomassa, a sua hidrólise, a fermentação dos açúcares
resultantes da hidrólise e a destilação do etanol (Figura 9). A etapa de hidrólise da biomassa a
monômeros pode ocorrer por um processo enzimático ou químico. A hidrólise da celulose
com ácidos foi bastante estudada no passado, mas é uma opção que está cada vez mais sendo
abandonada, sendo a via que pressupõe a utilização de enzimas mais bem aceita entre os
pesquisadores da área.
No entanto, um dos principais obstáculos para o estabelecimento dessa tecnologia
reside no custo das enzimas que, apesar de ter reduzido exponencialmente nos últimos anos,
ainda é incompatível com o processo (VIIKARI et al., 2012). Outro desafio é o
desenvolvimento de um sistema de pré-tratamento adequado e economicamente viável para
cada tipo de biomassa. Essa etapa é crucial, pois as fibras vegetais são naturalmente
organizadas de forma muito compacta, como descrito no tópico 2.1, o que dificulta a ação
efetiva das enzimas. Em um pré-tratamento eficiente ocorre a desestruturação das fibras
vegetais, o que facilita a conversão dos polissacarídeos da biomassa em açúcares pela ação
das enzimas.
Figura 9. Esquema simplificado de uma possível configuração para o processo de produção de etanol
lignocelulósico. SSF: fermentação e sacarificação simultâneas (simultaneous saccharification and
fermentation). Dependendo do pré-tratamento, a lignina pode ser recuperada também após essa etapa.
Embora o pacote tecnológico que compreende a produção de etanol de biomassa
necessite de investimentos importantes, o seu estabelecimento no Brasil significaria uma
blindagem estratégica para o agronegócio da cana-de-açúcar. A diversidade de produtos
possíveis, incluindo produtos de maior valor agregado, impulsionaria outras áreas, tais como
indústrias químicas, alcoolquímica e produção de plásticos verdes, através do conceito de
biorrefinaria (Figura 10).
41
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Figura 10. Possíveis aplicações dos componentes da biomassa lignocelulósica (Adaptado de Sun et al.,
2011).
O conceito de biorrefinaria é análogo ao que se conhece hoje como “refinarias de
petróleo”, que produzem múltiplos produtos a partir do petróleo. As biorrefinarias industriais
têm sido consideradas como a rota mais promissora para criação de novas indústrias baseadas
em biotecnologia (DEMIRBAS, 2009).
A seguir, as etapas de hidrólise enzimática e pré-tratamento da biomassa, focos deste
estudo, serão detalhadas. Apesar de a hidrólise enzimática ser uma etapa posterior ao prétratamento no processo de produção de etanol lignocelulósico, esta será apresentada
anteriormente, a fim de facilitar o entendimento da etapa de pré-tratamento, que é muitas
vezes avaliada de acordo sua eficiência em facilitar a hidrólise enzimática.
2.3. Hidrólise Enzimática
A hidrólise dos polissacarídeos contidos em materiais lignocelulósicos requer uma
grande variedade de enzimas com diferentes especificidades. A Tabela 2 faz um pequeno
resumo dos tipos de enzimas necessárias para hidrolisar um substrato lignocelulósico
complexo. Apesar das enzimas serem os agentes mais importantes nesse processo, existem
indícios da contribuição de outras proteínas na degradação enzimática da lignocelulose, que
possuem mecanismos de ação ainda pouco conhecidos, como as glicosilidrolases da família
61 (HARRIS et al., 2010) e a “suolenina” (swollenin) (proteína com sequência similar ao de
uma expansina vegetal) (SALOHEIMO et al., 2002; MERINO e CHERRY, 2007).
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Tabela 2. Principais enzimas necessárias para a hidrólise dos polissacarídeos presentes em
materiais lignocelulósicos a monômeros.
Polissacarídeo Enzima
Celulose
Hemicelulose
Pectina
Celobioidrolase, endoglucanase, β-glicosidase
Endoxilanase, acetil-xilana esterase, β-xilosidase, endomananase,
β-manosidase, α-L-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, feruloil esterase,
α-galactosidase, ácido p-coumárico esterase
Pectina metilesterase, pectato liase, poligalacturonase,
ramnogalacturonana liase
Para que ocorra a hidrólise enzimática da celulose a glicose, pelo menos três de
enzimas precisam atuar: as exoglucanases/celobioidrolases (CBH) (EC 3.2.1.91), as
endoglucanases (EG) (EC 3.2.1.4) e as β-glicosidases (EC 3.2.1.21) (LYND et al., 2002).
Individualmente, uma única enzima do complexo celulolítico é incapaz de hidrolisar a
celulose de maneira eficiente, sendo necessária a ação sinérgica do complexo (BÉGUIN e
AUBERT, 1994). As CBHs atacam o final da cadeia de celulose, podendo ter preferência em
atacar os terminais redutores ou não redutores e liberam como produto moléculas de celobiose
(TEERI, 1997). Além disso, as CBHs possuem alta eficiência de degradação da celulose
cristalina. Já as EGs clivam as cadeias no seu interior e reduzem o grau de polimerização,
sendo mais eficientes para a hidrólise de regiões amorfas (WILSON, 2009, 2011).
Finalmente, as β-glicosidases hidrolisam a celobiose em duas moléculas de glicose (Figura
11).
Figura 11. Visão esquemática do sistema celulolítico. Uma rota de formação de soforose pela atividade de
transglicosilação da β-glicosidase também está apresentada. (Adaptado de Aro et al., 2005).
Comumente, em ensaios laboratoriais de hidrólise enzimática da biomassa, um dos
parâmetros mais importantes a ser avaliado é a dosagem enzimática das celulases e a
proporção entre as atividades celulolíticas. Para uma hidrólise eficiente, na prática, leva-se em
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conta as dosagens das atividades de FPase (Filter paper activity) e de β-glicosidase. A
atividade FPase representa a atividade total de celulases na degradação de uma fita de papel
de filtro (GHOSE, 1987). Como o papel de filtro apresenta um alto índice de cristalinidade,
acredita-se que a atividade mais expressiva para a degradação do papel seja a de
celobioidrolase. Assim, ao se dosar as atividades FPase e β-glicosidase, é possível balancear
as atividades necessárias para degradação total da celulose à glicose. Alguns trabalhos relatam
que para que haja a hidrólise completa da celulose uma relação de celobioidrolase:βglicosidases de 1:1 é necessária (JUHÁSZ et al., 2005). A maior parte dos estudos de
hidrólise estabelece uma dosagem de 10-15 FPU (unidade de FPase – Filter paper unit) por
grama de substrato a ser hidrolisado.
Como já descrito, a hemicelulose possui uma composição mais variada que a celulose
e, por isso, necessita de um número de enzimas maior para ser hidrolisada eficientemente. As
enzimas que hidrolisam a hemicelulose podem ser divididas em enzimas que atuam na cadeia
principal e em enzimas que clivam as ramificações, também chamadas de acessórias. As
principais enzimas para a hidrólise da xilana são as endoxilanases, que clivam o esqueleto de
xilana em oligossacarídeos, e as β-xilosidases, que clivam pequenos xilooligossacarídeos em
xilose. Analogamente, as principais enzimas para a degradação da manana são as
endomananases e β-manosidases. A remoção dos grupos laterais da xilana ou manana
aumenta o acesso das xilanases/manases à cadeia principal. Dessa forma, enzimas acessórias
como α-L-arabinofuranosidases, α-glucuronidase, feruloil esterase, α-galactosidase, acetilxilana esterase e acetil-manana esterase são geralmente reportadas como importantes para
melhorar a eficiência de hidrólise. As feruloil esterases apresentam papel de destaque por
clivarem ligações entre a hemicellulose e a lignina (MEYER et al., 2009). A presença de α-Larabinofuranosidases para a degradação da biomassa da cana-de-açúcar é extremamente
importante, já que a hemicelulose da cana é uma arabinoxilana. As α-L-arabinofuranosidases
apresentam especificidades diferentes, clivando ligações α-(12) ou α-(13), enquanto
algumas são capazes de clivar resíduos com dupla substituição (SØRENSEN et al., 2007).
Apesar da relevância, a presença e requerimento de hemicelulases é muitas vezes
negligenciada em estudos que avaliam a eficiência de misturas enzimáticas para a hidrólise da
biomassa. No entanto, mesmo em materiais tratados onde a maior parte da hemicelulose tenha
sido removida, existe ainda uma pequena proporção que está em associação com a celulose e
a lignina, limitando o acesso das celulases à celulose. Já foi demonstrado que a adição de
hemicelulases melhora o desempenho das celulases, aumentando a conversão da celulose em
glicose da palha de milho (GAO et al., 2011).
44
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Apesar de todas as vantagens da hidrólise enzimática frente à hidrólise ácida, a
hidrólise enzimática da lignocelulose pode enfrentar vários obstáculos que diminuem a
velocidade da reação, relacionados à recalcitrância do substrato. Dessa forma, a fim de
aumentar a acessibilidade das enzimas a seus substratos e, consequentemente, a eficiência de
hidrólise, uma etapa de pré-tratamento da biomassa faz-se necessária.
2.4. O pré-tratamento
Nas plantas, a parede celular atua como uma proteção física contra patógenos
(CANTU et al., 2008). Portanto, materiais lignocelulósicos nativos são altamente resistentes à
hidrólise enzimática (HIMMEL et al., 2007). Wei e coautores (2009) calcularam a dificuldade
de degradar diferentes substratos definindo o índice de recalcitrância (IR), calculado pela
razão de carbono residual após a hidrólise enzimática pelo carbono inicial presente na
biomassa. O IR de diferentes substratos foi bastante diverso, sendo de 0,87 para softwoods,
0,56 para hardwoods e 0,25-0,45 para resíduos agroindustriais. Essa recalcitrância se deve a
vários fatores físico-químicos e estruturais relacionados ao substrato, estando normalmente
relacionada à presença de lignina, à sua composição e às ligações da lignina com a
hemicelulose (GRABBER et al., 2008; BESLE, et al., 1994, CHANDRA et al., 2007), ao
índice de cristalinidade da celulose (PARK et al., 2010), ao grau de polimerização dos
polissacarídeos (MERINO e CHERRY, 2007) e a porosidade e superfície disponível
(ISHIZAWA et al., 2007).
Deste modo, para que ocorra uma conversão eficiente da biomassa em açúcares
fermentáveis, é importante que as propriedades físicas e químicas da parede celular sejam
modificadas através da etapa de pré-tratamento. O pré-tratamento é uma etapa crucial, já que
a hidrólise de substratos nativos leva, geralmente, a menos de 20% de conversão da celulose
em glicose (ZHANG e LYND, 2004). Dependendo do tipo de pré-tratamento, diferentes
efeitos podem ser observados na biomassa pré-tratada, como:

Remoção parcial ou quase total da lignina

Rompimento da estrutura da lignina e de suas ligações com o restante da biomassa

Redistribuição da lignina

Remoção parcial ou quase total da hemicelulose

Redução da cristalinidade da celulose

Redução do grau de polimerização da celulose

Aumento da porosidade e da área superficial
45
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Ao longo dos anos, muitas técnicas de pré-tratamento foram desenvolvidas, incluindo
métodos físicos, químicos, biológicos ou uma combinação desses métodos (MOSIER et al.,
2005; ALVIRA et al., 2010; KUMAR et al., 2009). Exemplos de diferentes métodos já
reportados são: pré-tratamento com ácido diluído (BITANCUR e PEREIRA JR, 2010; DIEN
et al., 2006), pré-tratamento alcalino (PARK e KIM, 2012), explosão a vapor (RAMOS,
2003), explosão com amônia (ammonia fiber expansion - AFEX) (SENDICH et al., 2008),
organosolv (BOZELL et al., 2011), pré-tratamento hidrotérmico (SAHA et al., 2013), por
moagem (SILVA et al., 2010; HIDENO et al., 2008), com líquidos iônicos (MORA-PALE et
al., 2011), por extrusão (LAMSAL et al., 2010), entre outros. Algumas vantagens e
desvantagens de pré-tratamentos comumente descritos estão apresentadas na Tabela 3.
Tabela 3. Vantagens e desvantagens de processos de pré-tratamento comumente reportados.
Prétratamento
Mecânicos
(moagem,
extrusão)
Explosão a
vapor
AFEX
Categoria
Físico
Desvantagens
Ref.
A energia necessária
para tratamento de
madeiras é alta
A hemicelulose é
parcialmente degradada;
liberação de ácido
acético
Sousa et al., 2009;
Silva et al., 2010
Redução da cristalinidade de
celulose dependendo das
condições; curto tempo de
residência (15 min); grande
aumento na digestibilidade
resíduos agroindustriais; baixa
produção de inibidores
Curto tempo de residência;
remoção parcial da
hemicelulose e da lignina
Requer um sistema de
reciclo de amônia;
Pouco efetivo para
hardwoods
Chundawat et al.,
2010; Holtzapple et
al., 1991; Jin et al.,
2010; Krishnan et
al., 2010
Corrosão e formação de
inibidores
Shuai et al., 2010;
Llyod e Wyman,
2005; Um et al, 2003
Redução da cristalinidade da
celulose e do grau de
polimerização dos
carboidratos; remoção da
lignina
Pequeno aumento na
digestibilidade de
softwoods
Kim e Hotzapple,
2005; Rabelo et al.,
2009; Zhao et al.,
2008
Remoção da lignina; os
solventes podem ser
recuperados por destilação
Traços remanescentes
dos solventes podem
inibir processos
biológicos; Risco de
incêndio e explosão
Longos tempos de
reação; degradação da
lignina impede seu
reaproveitamento em
outros processos
Zhao et al., 2009a;
Ni e VanHeiningen,
1996
Efetivo para resíduos
herbáceos e agroindustriais
Efetivo para o tratamento de
hardwoods
Físicoquímico
Ácido
Alcalino
Químico
Solventes
orgânicos
Degradação
fungíca
Vantagens
Biológico
Degradação da lignina; baixo
requerimento de energia;
condições brandas de reação
Adaptado de Mora-Pale e co-autores, 2011.
Ramos, 2003; Kaar
et al., 1998; Schultz
et al., 1983
Singh et al., 2008;
Müller e Trösch,
1986; Lee et al.,
2007
46
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
Já que existe uma extensa variedade de materiais lignocelulósicos que diferem nas
suas propriedades químicas e físicas, há uma interdependência entre o pré-tratamento e o tipo
de substrato. É evidente que diferentes pré-tratamentos terão impactos diversos nas
propriedades físico-químicas da biomassa pré-tratada. Essas propriedades afetarão processos à
montante, como o pré-acondicionamento do material, e à jusante, como a escolha das misturas
enzimáticas, a seleção de microrganismos, o tratamento de resíduos e a recuperação de etanol.
Consequentemente, a escolha do pré-tratamento tem um impacto econômico em várias etapas
de uma biorrefinaria.
A seguir, o pré-tratamento com líquidos iônicos e por extrusão, focos deste estudo,
serão detalhados.
2.4.1. Pré-tratamento com líquidos iônicos (LIs)
2.4.1.1. Características gerais dos líquidos iônicos
Desde a organização do workshop “Green Industrial Applications of Ionic Liquids”
(Creta, Grécia, 12-16 de abril de 2000), os LIs foram definidos como sais compostos apenas
de espécies iônicas que apresentam uma temperatura de fusão inferior a 100 °C (SUN et al.,
2011). Essa definição, bastante ampla, pode comportar uma grande variedade de sais, sendo
relatada constantemente a síntese de novos compostos que se encaixam nesse perfil.
Para compreender como certas substâncias iônicas podem ser líquidas a temperatura
ambiente, é preciso observar as tendências do ponto de fusão. Em geral, a presença de fortes
interações iônicas confere a uma substância um elevado ponto de fusão e ebulição, como
ocorre nos sais inorgânicos. No entanto, como os LIs são sais compostos por cátions
orgânicos grandes, constata-se uma redução na simetria dos íons, levando a uma dificuldade
de empacotamento na estrutura cristalina (ROSA, 2003).
Entre os sais inorgânicos, o ponto de fusão também se reduz com o aumento do
tamanho do cátion, o que é esperado já que a maior distância entre os íons reduz as forças
iônicas, o que é observado mais acentuadamente nos LIs (KROSSING et al., 2006). A Tabela
4 mostra a influência do tamanho do cátion no ponto fusão de sais inorgânicos e de LIs
derivados do anel imidazólico (Figura 12).
Figura 12. Estrutura química do anel imidazólico.
47
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
Tabela 4. Ponto de fusão de alguns sais contendo o ânion Cl (RODRIGUES, 2010).
Sal
Ponto de fusão
Sal
Ponto de fusão
NaCl
803 °C
[C1 mim]Cl
125 °C
KCl
772 °C
[C2 mim]Cl
87 °C
CsCl
645 °C
[C4 mim]Cl
65 °C
[Cxmim] = alquil-metilimidazólio
Da mesma forma como discutido para o ponto de fusão, outras propriedades dos LIs
tais como solubilidade em outros solventes, densidade, hidrofobicidade, janela eletroquímica,
resistência térmica, temperatura de transição vítrea, etc., podem ser alteradas variando-se
aspectos como comprimento da cadeia carbônica, presença de grupos funcionais, substituintes
em diversas posições do cátion e tipo de ânion, originando o conceito de LIs projetados para
ter o melhor desempenho para determinada tarefa, o que ficou conhecido na literatura como
task-specific ionic liquids ou designer solvents (SMIGLAK et al., 2007). Alguns autores
estimam que com a variação de todos esses parâmetros seria possível obter mais de 10 18
sistemas diferentes, isto é, LIs com propriedades físico-químicas distintas (ROGER e
SEDDON, 2003). Mais recentemente, as propriedades biológicas dos LIs também têm sido
consideradas como alvos primários na síntese de novos LIs, o que pode promover a aplicação
de uma nova tecnologia na produção de compostos com alto valor agregado na indústria
farmacêutica (STOIMENOVSKI et al., 2009).
Uma das características dos LIs mais ressaltada é a sua baixa pressão de vapor, já que
grande parte dos LIs descritos são não voláteis e, portanto, a temperatura máxima que se pode
atingir é próxima à de decomposição. Dessa forma, muitos trabalhos identificaram essa
propriedade como vantajosa e apontaram os LIs como candidatos a substituir solventes
moleculares com baixo ponto de ebulição, como tolueno, éter dietílico ou metanol, tendo por
isso sido denominados “solventes verdes” (FREMANTLE, 1998; EARLE e SEDDON, 2000).
No entanto, alguns autores apontaram para o fato desta associação com a Química
Verde ter levado a generalizações errôneas ao longo dos últimos anos (FENG et al., 2010;
SUN et al., 2011). Isso porque muitas das características dos LIs descritas hoje, como pressão
de vapor não mensurável, baixa toxicidade, estabilidade química e física, etc., foram
assinaladas quando variedades limitadas de LIs existiam e eram majoritariamente baseadas no
cátion imidazólico. Com o desenvolvimento da área e a síntese de novos LIs, as descrições
usuais se tornam em alguns casos incompletas ou inapropriadas. É preciso ter em mente que
os LIs são reagentes muito heterogêneos, definidos apenas pelo seu ponto de fusão e sua
48
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
característica iônica. Logo, é de se esperar que nem todos os LIs apresentem todas as
características descritas em muitos trabalhos, especialmente no que diz respeito a sua
característica “verde”.
2.4.1.2. Histórico da aplicação de líquidos iônicos para o processamento da celulose
Nas últimas décadas, o número de publicações reportando o uso de LIs para o
processamento da biomassa cresceu exponencialmente. No entanto, o histórico do estudo de
tais reagentes químicos não é tão recente. Muitos autores citam o trabalho de Paul Walden
publicado em 1914 (Figura 13) como o primeiro relato de preparo de um LI (nitrato de
etilamônio) (WALDEN, 1914), apesar de haver certo debate acerca desse fato, já que este
composto em estado líquido apresenta espécies iônicas em um complexo equilíbrio químico
com espécies neutras (SUN et al., 2011).
Figura 13. Reprodução do título do artigo de Paul Walden publicado em 1914 sobre a síntese de nitrato de
etilamônio.
Em 1930, uma patente depositada na Suíça (e nos EUA em 1934) reivindicou o fato de
certos líquidos orgânicos serem capazes de dissolver a celulose e alterar a sua reatividade
(GRAENACHER, 1934). A Figura 14 mostra o título da patente original e do depósito
americano. Essa patente tem sido citada como o marco do início da aplicação industrial dos
LIs (PLECHKOVA e SEDDON, 2008). No entanto, um trabalho recente reportou a
irreprodutibilidade dos experimentos descritos por Graenacher e alertou para o fato de ser
discutível classificar a patente suíça como o primeiro registro de aplicação industrial de um
LI, baseando-se somente no fato do reagente químico descrito se encaixar na classificação
atual de um líquido iônico. Os autores discutem que, na verdade, o conceito moderno dos
líquidos iônicos só foi definido quando se enxergou um conjunto de propriedades e
possibilidades a partir da síntese de LIs binários (SUN et al., 2011; EARLE e SEDDON,
2000).
49
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
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Figura 14. Título da patente americana de 1934 (US 1943176) e da patente suíça original de 1930 (CH
283446) (SUN et al., 2011).
Foi apenas em 2002, então, que o grupo de pesquisa liderado pelo Dr. Robin D.
Rogers, da Universidade do Alabama, começou a investigar se os líquidos iônicos binários
modernos teriam a mesma propriedade dos “sais fundidos” descritos por Graenacher em 1934.
Eles mostraram que o LI cloreto de 1-metil-3-butilimidazólio ([Bmim][Cl]) era capaz de
dissolver a celulose em concentrações de até 10% sob agitação e aquecimento (100 °C) e que
uma dissolução de até 25% poderia ser alcançada caso o aquecimento fosse realizado por
micro-ondas (SWATLOSKI et al., 2002). Esse trabalho já foi citado mais de 1000 vezes e
pode ser considerado um divisor de águas que estabeleceu as bases para um novo conceito de
pré-tratamento da biomassa lignocelulósica. Desde então, os LIs foram estudados para o prétratamento da celulose cristalina (HA et al., 2011), biomassa de algas (ZHOU et al, 2012) e
diversos materiais lignocelulósicos como, por exemplo, a palha de arroz (NGUYEN et al.,
2010), o bagaço de cana-de-açúcar (SILVA et al., 2011; KIMON et al., 2011), a palha de
trigo (LI et al., 2009), as gramíneas Panicum virgatum (switchgrass) (LI et al., 2010) e
Miscanthus (BRANDT et al., 2011), madeira (LEE et al., 2009a; SUN et al., 2009; BRANDT
et al., 2011), dentre outros.
2.4.1.3. A técnica de pré-tratamento
Baseados no conceito de dissolução da celulose descrito por Swatloski e colaboradores
(2002) e posteriormente por Fort e colaboradores (2007), que mostrou que o LI [Bmim][Cl]
também era capaz de dissolver parcialmente amostras de madeira, muitos grupos de pesquisa
estudaram o processamento da biomassa lignocelulósica com LIs, buscando tanto o
50
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
fracionamento dos seus componentes, quanto o estabelecimento de um pré-tratamento para
facilitar um posterior ataque enzimático. Neste tópico, apenas processos de pré-tratamento da
biomassa lignocelulósica serão evidenciados. A descrição de processos buscando o
fracionamento parcial da lignocelulose com LIs para obtenção de outros bioprodutos pode ser
encontrada na revisão de Sun e colaboradores (2011).
Em geral, o pré-tratamento da biomassa com LIs pode ser divido em três etapas: (i)
dissolução total ou parcial da lignocelulose sob aquecimento; (ii) recuperação da biomassa
pré-tratada por precipitação com um antissolvente (em geral água); (iii) lavagem do resíduo
para eliminar traços de LIs que possam ser inibitórios às etapas subsequentes. A seguir, as
propriedades dos LIs que possibilitam a dissolução da celulose e da lignocelulose serão
discutidas.
Mecanismo de ação
Os primeiros estudos que buscaram explicação para a dissolução da celulose em LIs
propuseram que a basicidade do ânion e sua habilidade de formar ligações de hidrogênio eram
os principais fatores a serem considerados no design de LIs para este fim (SWATLOSKI et
al., 2002; ANDERSON et al., 2002; MÄKI-ARVELA et al., 2010).
Para suportar essa ideia, o mecanismo envolvido na dissolução da celulose em LIs foi
investigado através de diversos métodos analíticos. Em um estudo, medidas da relaxação por
ressonância nuclear magnética (RMN) utilizando [Bmim][Cl] confirmaram que os íons
cloreto formam ligações de hidrogênio com os grupos hidroxil da celulose em uma proporção
estequiométrica de 1:1 (MOULTHROP et al., 2005). Essa interação causa o rompimento de
ligações de hidrogênio inter e intramolecular entre as fibrilas de celulose, o que
consequentemente leva a sua dissolução.
Mais tarde, foi descrito que apesar do potencial de formação de ligações de hidrogênio
do ânion do LI parecer ter contribuição majoritária para a habilidade de dissolução da celulose
no mesmo, esse não seria o único fator atuante; o cátion também parece influenciar na
dissolução, apesar desse não ser um fenômeno ainda completamente entendido. Um estudo de
RMN da solvatação da celobiose em [Emim][Ac] sugeriu a formação de ligações de
hidrogênio entre os oxigênios do grupo hidroxil da celobiose e os hidrogênios na posição C-2
do anel imidazólico (ZHANG et al., 2010). A Figura 15 ilustra o mecanismo proposto para a
dissolução da celulose no LI [Bmim][Cl].
51
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
Figura 15. Representação esquemática do mecanismo de dissolução da celulose no líquido iônico cloreto
de 1-butil-3-metilimidazólio ([C4mim]Cl (Feng e Chen, 2008).
Após a dissolução, a celulose pode ser recuperada pela adição de um antissolvente. No
entanto, o produto regenerado não apresenta mais a estrutura cristalina e recalcitrante da
celulose I nativa, sendo mais susceptível ao ataque enzimático por ser essencialmente amorfa,
o que propicia o aumento da velocidade inicial de hidrólise e do rendimento final de
conversão da celulose (DADI et al., 2006).
Como já mencionado, após a demonstração da possibilidade de dissolver a celulose
em LIs, outros trabalhos mostraram também a possibilidade de processar a biomassa
lignocelulósica com esses reagentes (FORT et al., 2007; XIE et al., 2007). Foi demonstrado
que, dependendo do tipo de LI utilizado, ocorre extração de grande parte da fração de lignina,
que fica exposta ao solvente com a dissolução da celulose (FORT et al., 2007; LEE et al.,
2009a). Dessa forma, como a lignina é altamente solúvel em certos LIs, após a recuperação
dos polissacarídeos por adição do antissolvente, grande parte da lignina permanece
solubilizada no LI. Estudos mostraram que os LIs geralmente não degradam as cadeias de
celulose ou reduzem o seu grau de polimerização e que a estrutura da lignina e da
hemicelulose permanecem inalteradas após o pré-tratamento (ZHU et al.; 2006; SAMAYAM
e SCHALL, 2010).
Singh e coautores (2009) utilizaram a autofluorescência da parede celular vegetal para
rastrear o mecanismo de solubilização durante o pré-tratamento de switchgrass com
[Emim][Ac]. Foi mostrado que após poucos minutos de incubação da biomassa com o LI
ocorre a turgidez da parede celular, levando a um aumento de oito vezes no volume da parede,
o que os autores relacionaram com o rompimento das ligações de hidrogênio inter e
intramoleculares da celulose. Diferentemente do reportado por Lee e colaboradores (2009a), o
estudo mostrou que todos os componentes da biomassa estudada foram solubilizados após
120 min de pré-tratamento (Figura 16). Após a adição de água como antissolvente, o produto
regenerado não continha lignina. Foi observado que o pré-tratamento com LIs enfraqueceu as
52
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
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interações de van de Waal’s entre os constituintes da parede celular e que ligações covalentes
entre os mesmos foram rompidas. Como a hemicelulose forma ligações covalentes com a
lignina, através de ácidos ferúlicos, e com a celulose, via pectina, os autores não conseguiram
concluir qual ligação estaria sendo rompida e levando à formação de um produto regenerado
deficiente em lignina.
Figura 16. Estudo in-situ da dissolução de switchgrass em acetato de 1-etil-3-metilimidazólio. Imagens de
fluorescência confocal da biomassa (a) antes do pré-tratamento; (b) 20 min depois; (c) 50 min depois; (d)
120 min depois (Singh et al., 2009).
Considerando que a dissolução dos componentes da parede celular vegetal é afetada
pela natureza do LI, diferentes combinações de cátions e ânions foram examinadas para o prétratamento de diversas biomassas. Apesar do crescimento exponencial na síntese de novos
líquidos iônicos, a maior parte dos estudos ainda se baseia em LIs com ânions de caráter
básico como cloretos, acetatos, formatos e fosfatos e cátions com um núcleo metilimidazólico
ou metilpiridínico com cadeias laterais alil-, etil- ou butil- (TADESSE e LUQUE, 2011). As
estruturas químicas dos LIs mais comumente reportados para a dissolução da celulose e prétratamento da biomassa estão mostradas na Figura 17.
Apesar de os primeiros trabalhos de dissolução da celulose terem majoritariamente
utilizado o [Bmim][Cl], o LI [Emim][Ac] foi mais tarde identificado como mais vantajoso,
devido ao seu baixo ponto de fusão (-45 °C vs 69 °C), menor viscosidade (10 mPa vs 147
mPa, a 80 °C) e menor caráter corrosivo (muito pequeno vs forte). Adicionalmente, durante o
registro de um processo utilizando LIs pela BASF para adequação à legislação europeia,
testes de toxicidade indicaram o [Emim][Ac] como atóxico (LD 50 >2000 mg kg-1), enquanto o
[Bmim][Cl] foi classificado como moderadamente tóxico (50 mg kg -1 < LD50 >300 mg kg-1)
(SUN et al., 2011).
53
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
Figura 17. Estrutura química de líquidos iônicos comumente descritos para o pré-tratamento da
biomassa: (a) cloreto de 1-alquil(ou alil)-3-metilimidazólio; (b) acetato de 1-alquil-3-metilimidazólio; (c)
formato de 1-alquil-3-metilimidazólio; (d) brometo de 1-butil-3-metil-imidazólio; (e) dialquil fosfato de 1alquil-3-metilimidazólio; (f) cloreto de 1-butil-3-metilpiridínio.
2.4.1.4. Efeito do pré-tratamento com LIs na hidrólise enzimática da biomassa
O pré-tratamento com LIs tem se mostrado como um método efetivo para promover
uma sacarificação rápida e completa da celulose em glicose; após o pré-tratamento com LIs, o
tempo de hidrólise enzimática pode ser reduzido drasticamente e rendimentos de conversão de
celulose em glicose próximos a 100% podem ser obtidos. A Tabela 5 compara os resultados
de sacarificação obtidos após o pré-tratamento de diversas biomassas com LIs diversos,
evidenciando as diferentes condições de processo utilizadas.
Muitos trabalhos correlacionaram a eficiência do pré-tratamento com LIs com diversos
efeitos na estrutura e composição da biomassa pré-tratada capazes de aumentar a
acessibilidade das enzimas, como: diminuição do percentual de lignina, diminuição do índice
de cristalinidade da celulose, aumento do tamanho dos poros e aumento da área de superfície
específica. Além de melhorar os rendimentos de sacarificação da celulose, alguns trabalhos
também mostraram o aumento na eficiência de hidrólise da xilana do material pré-tratado
(ZHAO et al., 2010a; WU et al., 2011). No entanto, dependendo das condições de processo
utilizadas, a extração de grande parte da fração hemicelulósica também foi reportada (LI et
al., 2011).
Quando comparado a outros pré-tratamentos já bem descritos, os resultados
provenientes do uso de LI são expressivos. Li e colaboradores (2010) mostraram que foram
necessárias apenas 12 h de hidrólise enzimática do switchgrass pré-tratado com [Emim][Ac]
para atingir mais de 90% de rendimento, enquanto a hidrólise da mesma biomassa tratada com
ácido diluído necessitou de 72 h de sacarificação para atingir 80% de conversão.
54
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
Tabela 5. Comparação dos rendimentos de sacarificação de biomassas pré-tratadas com
diversos LIs, evidenciando as diferentes condições de processo utilizadas.
Condições de
Hidrólise
Condições de Pré-tratamento
η
glicose
(%)
Ref.
Biomassa
LI
T
(°C)
Tempo
(h)
Teor de
sólidos
(%)
Celulose
[Emim][Ac]
110
0,5
2
NI
2,0
46
Switchgrass
[Emim][Ac]
160
3
3
NI
0,5
96b
Corn stover
[Emim][Ac]
160
3
3
NI
0,5
90b
[Emim][Ac]
130
1,5
5
NI
NI
95
[Emim][Ac]
120/
150
0,5
5
20
1,5
93/81
Torr et al.,
2012
[Emim][Ac]
120
0,5
5
30a
1,0
87
Qiu et al.,
2012
[Emim][Ac]
160
3
15
NI
15
90
PerezPimienta,
2013
[Emim][Ac]
125
2
33
4.9
1,0
80
[Emim][Ac]
125
2
33
4.9
1,0
72
[Emim][Ac]
125
2
33
4.9
1,0
65
Bambu
[Emim][Ac]
110
3
25
>1000
0,6
80
Ninomiya
et al., 2013
Bambu
Ch[Ac]
110
3
25
>1000
0,6
90
Ninomiya
et al., 2013
[Emim][Cl]
150
1
5
180
5,0
30
[Emim][Cl]
150
0,5
5
180
5,0
40
Celulose
[Bmim][Cl]
130
2
5
115
1,7
72
Celulose
[Bmim][Cl]
110
0,5
2
NI
2,0
51
Palha de
trigo
[Emim]DEP
130
0,5
4
30
1,0
55b
Miscanthus
[Bmim][HSO4]
120
22
10
60 a
2,0
90
[Bmim][HSO4]
120
22
10
60 a
2,0
80
[Bmim][HSO4]
120
22
10
60 a
2,0
30
[Bmim]MeCO2
120
22
10
60 a
2
60
[Bmim]MeCO2
120
22
10
60 a
2
25
Serragem de
Bordo
Pinus
radiata
Cana
selvagem
Bagaço de
agave
Corn stover
Serragem de
Bordo
Populus
nigra
Eucalyptus
globulus
Nathofagus
pumilo
Salix
viminalis
Pinus
sylvestris
Salix
viminalis
Pinus
sylvestris
a
FPU/g
Biomassa
(%)
Ha et al.,
2011
Li et al.,
2010
Li et al.,
2011
Lee et al.,
2009a
Wu et al.,
2011
Wu et al.,
2011
Wu et al.,
2011
Pezoa et
al., 2010
Pezoa et
al., 2010
Dadi et
al., 2006
Ha et al.,
2011
Li et al.,
2009
Brandt et
al., 2011
Brandt et
al., 2011
Brandt et
al., 2011
Brandt et
al., 2011
Brandt et
al., 2011
Dosagem de enzima por grama de celulose; NI – não informado; b Rendimento calculado com base em açúcares redutores;
η = rendimento.
55
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
Em outro estudo (LI et al., 2011), o pré-tratamento de corn stover por AFEX foi
comparado ao pré-tratamento com [Emim][Ac]. Os resultados mostraram que o corn stover
pré-tratado com LI exibiu uma cinética de sacarificação mais rápida, atingindo 78,9% de
conversão da celulose em açúcares redutores em 24 h, enquanto a biomassa pré-tratada por
AFEX atingiu somente 51,6% após o mesmo intervalo. A velocidade inicial de hidrólise do
corn stover pré-tratado com LI foi 2,9 vezes maior que do tratado por AFEX e 15,2 vezes
mais rápida que o corn stover não tratado.
Efeito do pré-tratamento com LIs na hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar
Ainda existem poucos trabalhos relatando o pré-tratamento do bagaço de cana-deaçúcar com LIs. Foi reportado um rendimento de 69,7% em açúcares redutores após a
hidrólise enzimática (30 FPU/g de substrato) de bagaço pré-tratado com [Emim][Ac] por 15
min, a 145 °C utilizando um teor de sólidos de 14% durante o pré-tratamento (YOON et al.,
2012). Os autores sugeriram que o pré-tratamento não foi tão eficiente devido ao alto teor de
sólidos utilizado, o que impediu que o [Emim][Ac] propiciasse uma deslignificação efetiva,
apesar do índice de cristalinidade ter sido reduzido. Outro trabalho reportou rendimento 62%
de conversão da celulose após pré-tratamento do bagaço a 140 °C por 90 min utilizando
somente [Bmim][Cl] (KIMON et al., 2011).
Alguns grupos combinaram outras estratégias de pré-tratamento do bagaço de cana-deaçúcar com o uso de LI, de forma a reduzir o tempo de incubação e aumentar a eficiência do
processo. Zhang e colaboradores (2012) realizaram o pré-tratamento em soluções aquosas de
LIs catalisado com HCl. Nesse trabalho, as condições ótimas de pré-tratamento do bagaço de
cana-de-açúcar foram incubação a 130 °C, por 30 min, utilizando uma solução de
água/[Bmim][Cl]/HCl de 20/78,8/1.2 (%). Rendimentos de hidrólise correspondentes a 94,5%
foram alcançados após 24 h de sacarificação utilizando enzimas comerciais em uma dosagem
de 20 FPU/g de glucana, enquanto o pré-tratamento por 120 min utilizando somente
[Bmim][Cl] resultou em 29,5% de conversão da celulose.
Outros estudos realizaram o pré-tratamento do bagaço com LIs catalisado por ácidos
utilizando misturas de HCl-[Bmim][Cl] (ZHANG et al., 2013) ou H2SO4-1-butil-3metetilimidazólio metilsulfato ([Bmim][MeSO4]) (DIEDERICKS et al., 2011) mostrando que
apesar da cristalinidade da celulose ter se mantido inalterada, um aumento significativo na
digestibilidade da celulose foi atingido, devido a remoção simultânea de xilana e lignina.
A Tabela 6 apresenta as condições de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar
com LIs utilizadas em diversos trabalhos e rendimentos de hidrólise obtidos.
56
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
Tabela 6. Condições de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar utilizadas em estudos
publicados e resultados de sacarificação obtidos.
LI
Prétratamento
associado
T (°C)
Tempo
(min)
Carga de
sólidos
(%)
FPU/g
[biomassa](%)
η glicose
(%)
[Emim][Ac]
-
120
30
5
15/1,0
87,0
[Emim][Ac]
-
145
15
14
30/1,0
69,7b
[Bmim][Cl]
-
140/150
90
5
15 a/1,0
62,0/100
[Bmim][Cl]
-
130
120
10
20 a/2,0
29,5
[Bmim][Cl]
H2SO4/HCl
130
30
10
20 a/2,0
93,5/94,5
100
60
3
20/2,0
90,0b
100
60
3
20/2,0
91,4b
[Bmim][Cl]
[Amim][Cl]
NH4OHH2O2
NH4OHH2O2
[Bmim][MeSO4]
-
125/150
120
10
60/1,0
79,0/100
[Bmim][MeSO4]
H2SO4
100
120
10
60/1,0
74,0
a
Ref.
Qui et al.,
2012
Yoon, et
al., 2012
Kimmon et
al., 2011
Zhang et
al., 2012
Zhang et
al., 2012
Zhu et al.,
2012
Zhu et al.,
2012
Diedericks
et al., 2012
Diedericks
et al., 2012
b
Dosagem de enzima por grama de celulose; Rendimento calculado com base nos açúcares redutores.
2.4.1.5. Efeito dos líquidos iônicos na atividade e estabilidade de celulases
Logo após o aparecimento das primeiras publicações reportando a dissolução de
celulose em LIs, surgiram estudos sobre a verificação dos possíveis efeitos desses sais nos
sistemas celulolíticos (TURNER et al., 2003). Como os LIs são sais e as celulases, assim
como a maioria das enzimas, desnaturam em ambientes com alta concentração de sais, os
pesquisadores rapidamente concluíram que traços de LIs que permanecessem na biomassa
após o pré-tratamento poderiam afetar negativamente a hidrólise enzimática ou impedir que a
hidrólise ocorresse in situ após a dissolução (ZHAO et al., 2009b; ENGEL et al., 2010).
De fato, estudos posteriores demonstraram que os LIs podem afetar as reações
enzimáticas através da alteração da estrutura, da atividade, da enantioseletividade e da
estabilidade das enzimas (NAUSHAD et al., 2012). Como diferentes LIs apresentam
propriedades físico-químicas que variam amplamente dependendo da natureza dos cátions ou
57
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
ânions, os efeitos observados nas diversas enzimas dependem muito da combinação entre o LI
estudado e a enzima alvo, podendo resultar em efeitos positivos ou negativos. Enquanto
efeitos negativos foram reportados em geral para enzimas que atuam em meios aquosos,
efeitos positivos foram relatados para reações que normalmente ocorrem em meios não
aquosos, como processos de síntese orgânica mediados por lipases (LAU et al., 2000). Em
geral, foi reportado que os LIs que apresentam cátions com uma cadeia alquil longa ou ânions
apresentando uma alta capacidade de formar ligações de hidrogênio têm um impacto negativo
na atividade enzimática, pelo fato de interagirem fortemente com a enzima levando a
alterações na conformação nativa (KAAR et al., 2003; ZHAO, 2010b).
Um dos primeiros trabalhos que estudaram a atividade de celulases em LIs
demonstrou que as celulases de Trichoderma reesei se inativavam na presença do líquido
iônico cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio ([Bmim][Cl]) e sugeriram que a inativação foi
induzida por desenovelamento e consequente desnaturação da proteína. Foi concluído que os
íons Cl- são, em parte, responsáveis pela inativação das celulases, pelo fato de os LIs com alta
basicidade produzirem um ambiente de desidratação que é desvantajoso para a maioria das
enzimas. No entanto, o mecanismo de desenovelamento das celulases observado na presença
de LIs, determinado por medidas de emissão de fluorescência, foi diferente daquele observado
em NaCl. Logo, os autores sugeriram que outros fatores além dos íons Cl- poderiam estar
envolvidos no processo de desnaturação (TURNER et al., 2003).
Em uma tentativa de entender os efeitos dos LIs nas enzimas do complexo celulolítico
individualmente, foram avaliadas as enzimas endoglucanase I e celobioidrolase I, purificadas
de uma preparação comercial derivada de T. reesei (Celluclast 1.5L, Novozymes), em ensaios
contendo até 30% (v/v) de fosfato de dimetila de 1,3-dimetil imidazólio ([Mmim][DMP]). As
enzimas purificadas retiveram cerca de 60% da sua atividade original em soluções de até 10%
[Mmim][DMP]; no entanto, as atividades diminuíram para menos de 30% em concentrações
de 30% do LI (ENGEL et al., 2012). Esses resultados mostraram que as celulases de T. reesei
são mais ativas e estáveis na presença de [Mmim][DMP] que de [Bmim][Cl], sugerindo que a
inativação total das celulases na presença de LIs não é um fenômeno que pode ser
generalizado. Wolski e colaboradores (2011) também confirmaram que o [Mmim][DMP] é
um LI que resulta em menor decréscimo da atividade celulolítica de T. reesei, mostrando que
a conversão completa de Avicel em glicose pode ser obtida após 16 h de hidrólise em
misturas contendo 10 e 20% (p/p) do LI.
Além de buscar novos LIs, alguns estudos identificaram a necessidade de
desenvolver/isolar celulases estáveis na presença de pequenas quantidade de LIs
58
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
coprecipitados com a biomassa. Nesse sentido, muitos grupos de pesquisa iniciaram o
screening de novas celulases provenientes de outros microrganismos não pertencentes ao
gênero Trichoderma ou por metagenômica (SINGER et al., 2011; POTTKÄMPER et al.,
2009). Também foi sugerido que melhores resultados podem ser obtidos através da obtenção
de celulases de ambientes extremos, já que organismos hipertermofílicos têm condições de
crescimento nativas em ambientes altamente redutores (TURNER et al., 2007). De fato, foi
descrito que as endoglucanases hipertermofílicas de Thermatoga maritime (Tma Cel5A) e
Pyrococcus horikoshii (EGPho) apresentaram uma tolerância significativamente maior ao
([Emim][Ac]) que as celulases de T. viride (DATTA et al., 2010).
Outro estudo propôs o uso de um coquetel enzimático composto por celulases
termofílicas para um processo pré-tratamento e hidrólise simultâneo. Um sobrenadante rico
em endoglucanases produzido por um consórcio de bactérias termofílicas foi suplementado
com celobioidrolase de Caldicellulosiruptor saccharolyticus e β-glicosidase de Thermatoga
petrophila. Enquanto o coquetel comercial Cellic CTec2 (Novozymes) reteve somente 23%
da atividade em 10% (p/v) de [Emim][Ac] a 50 °C, o coquetel termofílico reteve 97% e 65%
de sua atividade a 70 °C e 80 °C, respectivamente (PARK et al., 2012).
No entanto, apesar de todos os estudos citados acima reportarem certo nível de
inativação das enzimas na presença de LIs, recentemente foi publicado um estudo em que
uma endoglucanase de Aspergillus niger foi estabilizada na presença de sulfato de metila de
tris-(2-hidroxietil)-metil amônio (HEMA). A temperatura de desnaturação e precipitação da
enzima mudou de 55 °C, quando em tampão, para 75 °C, na presença de HEMA, tendo a
enzima adquirido maior tolerância à temperatura na presença do LI. Os autores concluíram
que esta propriedade está relacionada ao cátion do LI em questão e discutiram que LIs
baseados no cátion imidazol podem ter um efeito desestabilizante na endoglucanase (BOSE et
al., 2011).. Este fato também está de acordo com outro estudo que mostrou que uma
peroxidase de raiz forte tem sua atividade melhorada na presença de trifluoro metano
sulfonato de tetraquis-(2-hidroxietil) amônio, que apresenta um cátion similar ao LI HEMA
(DAS et al., 2007)
O design de LIs que tenham alta habilidade de transformar a biomassa e
simultaneamente não afetar as enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas ainda permanece um
desafio. O desenvolvimento de LIs menos nocivos às enzimas combinado ao screening de
novas celulases tolerantes a LIs podem levar ao desenvolvimento futuro de processos
biotecnológicos muito atraentes.
59
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
2.4.1.6. Efeito dos líquidos iônicos em Saccharomyces cerevisiae
Ainda existem poucos estudos relatando o efeito dos LIs em microrganismos
fermentativos. Oulelet e coautores (2011) avaliaram o impacto da utilização de açúcares
derivados da hidrólise de biomassas pré-tratadas com [Emim][Ac] no crescimento aeróbico e
fermentativo de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados indicaram que o crescimento e a
produção de etanol foram influenciados por resíduos de LIs (10-15%) na biomassa recuperada
após o pré-tratamento e que traços de [Emim][Ac] (0,1%) não tiveram impacto no resultado
final. Foi mostrado que existe um efeito sinérgico de inibição do cátion e do ânion, já que
experimentos controle contendo a mesma concentração de acetato, conhecido inibidor do
metabolismo de S. cerevisiae, resultaram em rendimentos maiores de fermentação da glicose
a etanol.
Apesar de ser um indicativo da toxicidade do [Emim][Ac] para S. cerevisiae, o estudo
de Ouletet e coautores (2011) utilizou uma cepa laboratorial e concentrações relativamente
altas de LIs. Ainda são necessários estudos que testem a resistência de cepas industriais mais
robustas e que utilizem concentrações de LIs intermediárias à faixa utilizada no estudo (entre
0,1-10%).
Em outro estudo, uma linhagem modificada geneticamente de S. cerevisiae
expressando celulases de T. reesei e β-glicosidase de Aspergillus aculeatus foi utilizada para a
realização de um bioprocesso consolidado, onde as etapas de pré-tratamento, hidrólise
enzimática e fermentação ocorreram todas dentro de um mesmo reator. O líquido iônico
utilizado foi o [Emim][DEP], que foi identificado como tendo pouco efeito na viabilidade das
células em concentração <200 mM. Como o pré-tratamento com líquidos iônicos gera uma
biomassa de alta digestibilidade e parcialmente amorfa, a hidrólise de materiais tratados com
LIs por celulases expressas em S. cerevisiae, normalmente menos eficientes que enzimas
comerciais, atingiu níveis de conversão elevados. Dessa forma, o pré-tratamento com LIs
pode possibilitar a realização de um bioprocesso consolidado eficiente, o que pode representar
um sistema atraente no futuro (NAKASHIMA et al., 2011).
2.4.1.7. Vantagens e desvantagens do pré-tratamento com líquidos iônicos
Como discutido nos tópicos anteriores, os LIs são capazes de romper a estrutura da
parede celular e fracionar parcialmente os seus componentes, alterando também a
cristalinidade da celulose e sua estrutura. Essa combinação de fatores resulta em um material
pré-tratado que pode ser facilmente hidrolisado em açúcares monoméricos e aumenta as taxas
iniciais de hidrólise acentuadamente em relação a outras tecnologias de pré-tratamento. Para
60
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
se obter altas taxas de conversão da celulose (>80%) utilizando outros processos de prétratamento, a hidrólise enzimática precisa ser mantida por períodos de 48-72 h. No entanto,
para biomassas pré-tratadas com LIs, esse rendimento pode ser obtido em menos de 24 h de
hidrólise. Ainda, a possibilidade de recuperar uma fração de lignina relativamente pura é uma
oportunidade para a produção de produtos com alto valor agregado em adição à produção de
etanol, o que pode favorecer a economicidade de uma biorrefinaria baseada no pré-tratamento
com LIs. De fato, estudos mostraram que a venda da lignina pode abaixar efetivamente o
preço mínimo de venda do etanol a ponto de a lignina se tornar a maior fonte de renda de uma
biorrefinaria baseada no uso de LIs (KLEIN-MARCUSCHAMER et al., 2011).
No entanto, ainda existem muitos desafios a serem resolvidos antes que os LIs possam
ser considerados uma opção real de pré-tratamento, começando pelo seu alto custo e a
necessidade de recuperação e reciclo. Até o momento, a maior parte dos processos de prétratamento com LIs propôs métodos utilizando baixo teor de sólidos (em torno de 5%). No
entanto, Klein-Marcuschamer e colaboradores (2011) mostraram que na verdade é muito mais
importante reduzir a quantidade de LI que aumentar a taxa de reciclo.
Alguns trabalhos também relataram o reciclo de LIs por até 10 ciclos sem que
houvesse perda significativa da eficiência de pré-tratamento (LEE et al., 2009a; WU et al.,
2011; ZHANG et al., 2012a). No entanto, o desenvolvimento de métodos de reciclo
energeticamente eficientes para aplicações em larga escala ainda precisa ser estudado em
detalhe. Também é importante ressaltar que estudos de hidrólise enzimática da biomassa prétratada com LIs com alto teores de sólidos (>20%) precisam ser avaliados para validar a
eficiência do pré-tratamento, já que a maior parte dos estudos publicados utiliza
concentrações de biomassa pré-tratada menores que 5% na etapa de hidrólise. A toxicidade de
traços de LIs para enzimas e microrganismos fermentativos também precisa ser avaliada em
detalhes, já que podem afetar negativamente o desempenho hidrolítico (TURNER et al.,
2010) e a produção de etanol (OUELLET et al., 2011). Apesar das atuais limitações, os LIs
apresentam um grande potencial para o desenvolvimento de uma biorrefinaria baseada não
somente na produção em larga escala de etanol, mas também de produtos de alto valor
agregado.
2.4.2. Pré-tratamento por extrusão
Nos últimos 30 anos, o número de estudos sobre a utilização da extrusão para o
processamento da biomassa vem crescendo, sendo as aplicações mais expressivas voltadas
para extração de compostos (ISOBE et al., 1992; N’DYANE et al., 1996), densificação
61
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
(RIAZ, 2000; KALIYAN e MOREY, 2009) e pré-tratamento da biomassa para a hidrólise
enzimática (LEE et al., 2009b, 2010a, 2010b; KARUNANITHY e MUTHUKUMARAPPAN,
2010a, 2010b, 2011a, 2011b). A extrusão é uma tecnologia de pré-tratamento atraente, de alta
versatilidade, eficiência e produtividade, de baixo custo e curto tempo de reação, sendo
vantajosa quando comparada a processos em batelada (LEE et al., 2009b).
As extrusoras foram originalmente desenvolvidas com o objetivo de processar
polímeros e matérias-primas na indústria de alimentos (MERCIER e FEILLET, 1975). O
equipamento consiste em um cilindro com um ou dois parafusos (roscas) rotatórios que
comprimem e carreiam o material continuamente de uma porta de alimentação até uma saída.
O cilindro é normalmente divido em seguimentos, o que permite que a temperatura seja
controlada ao longo do comprimento, além de permitir a alimentação de aditivos por portas
posicionadas em pontos selecionados (Figura 18).
Figura 18. Representação esquemática simplificada de uma extrusora.
Uma extrusora pode ter muitas funções, tais como amassar, desgaseificar, desidratar,
expandir, homogeneizar, esterilizar, misturar, densificar, cozer e promover o cisalhamento
(GONZALEZ-VALADEZ et al., 2008).
Em um mesmo processo, a extrusora pode
desempenhar simultaneamente diversas funções, dependendo de seu tamanho e do design das
roscas.
Os diferentes tipos de elementos que compõe a rosca de extrusão, tanto de transporte
(diretos ou reversos) ou mistura, podem ser dispostos em diferentes combinações de forma a
promover a homogeneização, o cisalhamento, alongar o tempo de retenção e aumentar a
pressão. A possibilidade de alterar a configuração das roscas faz com que o processo de
extrusão seja bastante flexível. A utilização de elementos de mistura, que podem estar
dispostos em diferentes ângulos (tipicamente 30°, 45°, 60° e 90°), aumenta a força de
cisalhamento, já que o material é forçado a passar por espaços menores entres os discos e a
62
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
parede do cilindro (KALYON e MALIK, 2007; SENTURK-OZER et al., 2011). A Figura 19
ilustra exemplos de elementos que podem compor uma rosca de extrusão.
Figura 19. (a) Exemplos de diferentes modelos de elementos de mistura e transporte; (b) Montagem de
uma rosca de extrusão (Adaptado de KOLTER et al., 2010).
Existem diferentes tipos de extrusoras, que podem ser classificadas como monorrosca,
dupla-rosca ou múltiplas roscas. A extrusora monorrosca é mais indicada para a obtenção de
misturas homogêneas sem que haja mudanças nas características dos materiais. Já as
extrusoras dupla-rosca, que podem ser classificadas como corrotantes ou contrarrotantes, são
normalmente utilizadas para obter mudanças nas propriedades físicas das matérias-primas
pela aplicação de forças de cisalhamento (SENTURK-OZER et al., 2011). As roscas
contrarrotantes são utilizadas para obtenção de alto grau de cisalhamento; no entanto, podem
resultar em desgaste excessivo do material. Já as roscas corrotantes podem ser operadas em
velocidades maiores, resultando em alta produtividade e ainda assim mantendo considerável
eficiência de cisalhamento, mistura e fluxo (Figura 20).
Figura 20. Características de dupla-roscas corrotantes e contrarrotantes (Adaptado de Kolter et al., 2010)
O uso de extrusoras dupla-rosca é ideal para promover a extração da fração de
hemicelulose da biomassa lignocelulósica, já que é possível comprimir o material entre os
elementos de mistura e de transporte reverso, permitindo que ocorra simultaneamente a
63
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
extração e a separação líquido/sólido de forma eficiente (N'DIAYE et al., 1996), sendo as
roscas corrotantes apontadas como as mais promissoras para o processamento da biomassa
(LEE et al., 2010a).
No entanto, em geral, a extrusão da biomassa lignocelulósica é um processo difícil,
levando ao acúmulo e queima da biomassa e consequente bloqueio da matriz de saída (YOO
et al., 2011). Para transpor tais dificuldades, o material pode ser misturado com água ou
aditivos, como bases (CARR e DOANE, 1984; DALE et al., 1999) ou ácidos (CHEN et al.,
2011; CHOI e OH, 2012), que visem aumentar a viscosidade e as propriedades de fluxo,
reduzindo assim o torque operacional.
A Tabela 7 lista exemplos de trabalhos que estudaram o pré-tratamento por extrusão
de diversas biomassas, ressaltando as condições utilizadas e os rendimentos obtidos após
hidrólise enzimática das biomassas pré-tratadas.
Tabela 7. Condições utilizadas para o pré-tratamento por extrusão de diversos tipos de
biomassas e rendimentos obtidos após hidrólise enzimática do material pré-tratado.
Aditivo ou prétratamento combinado
η glicose
(%)*
tratamento hidrotérmico, 170
27,7/34,3
°C
(48h)
etilenoglicol
62,4 (48h)
Lee et al.,
2009b
73,0/36,0a
Lamsal et
al., 2010
Biomassa
Tipo de
extrusora
Douglas fir/Eucalipto
dupla-rosca
corrotante
Douglas fir
dupla-rosca
contrarrotante
Farelo de trigo / casca
de soja
dupla-rosca
corrotante
Casca de soja
dupla-rosca
corrotante
amido
94,8 (72h)
Spartina pectinata
(praire cordgrass)
extrusora monorrosca
tratamento alcalino
86,8 (72h)
Miscanthus
dupla-rosca
corrotante
tratamento alcalino
69,4 (72h)
Panicum virgatum
(switchgrass)
extrusora monorrosca
-
41,4 (72h)
dupla-rosca
corrotante
dupla-rosca
corrotante
H2SO4 diluído (1-3%)
65,5 (72h)
H2SO4 diluído (3,5%)
70,9 (48h)
extrusora monorrosca
-
75,0 (72h)
Palha de arroz
Palha de canola
Palha de milho
mistura de NaOH,
ureia e tioureia
Ref.
Lee et al.,
2010
Yoo et al.,
2011
Karunanithy
et al., 2011
De Vrije et
al., 2002
Karunanithy
et al., 2011b
Chen et al.,
2011
Choi et al.,
2012
Karunanithy
et al., 2010
Dale et al.,
1999
dupla-rosca
2,4 vezes
AFEX
corrotante
maiorb
*
Rendimento em glicose alcançado após a hidrólise enzimática do resíduo sólido obtido. Os números entre
parêntesis representam o tempo de sacarificação.
a
Calculado com base nos açúcares redutores
b
Os autores não mencionam os rendimentos absolutos, citando apenas que o rendimento em glicose aumentou
em 2,4 vezes em relação ao material não tratado.
Palha de milho
64
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Revisão Bibliográfica
O mecanismo de ação do pré-tratamento por extrusão está relacionado à fibrilação da
parede celular e ao aumento da área de superfície (LEE et al., 2009b; 2010a, 2010b;
KARUNANITHY e MUTHUKUMARAPPAN, 2011a, 2011b) e do tamanho dos poros,
fatores que facilitam o acesso das enzimas à celulose. Alguns autores já relataram que a
cristalinidade da celulose não é alterada significativamente na biomassa extrusada (LEE et al.,
2009b; LAMSAL et al., 2010), enquanto um aumento de 82% na cristalinidade de casca de
soja pré-tratada foi reportada após o pré-tratamento termomecânico utilizando uma extrusora
dupla-rosca (YOO et al., 2011). Como a composição do material não foi alterada com o prétratamento por extrusão, foi sugerido que o tratamento resultou na cristalização de estruturas
amorfas. Assim, ainda que a extrusão não reduza a cristalinidade da celulose, a
desestruturação da parede celular em nível nanoscópico é suficiente para obter uma hidrólise
enzimática eficiente, independentemente do índice de cristalinidade (LEE et al., 2009b).
2.4.2.1. Vantagens e desvantagens do pré-tratamento por extrusão
O pré-tratamento por extrusão, além de ser um processo contínuo, apresenta a
vantagem de possibilitar o pré-tratamento com alto teor de sólidos e, consequentemente, a
redução do consumo de água. Em geral, a extrusão requer menos energia que outros prétratamentos mecânicos, como a moagem. No entanto, a extrusão da biomassa lignocelulósica
requer, na maior parte das vezes, o uso de aditivos para aumentar as propriedades de fluxo.
Ainda assim, a extrusão combinada a tratamentos químicos apresenta vantagens, pois o
requerimento de reagentes é menor, reduzindo o volume de efluentes tóxicos gerados quando
comparada a tratamentos realizados em batelada por processos convencionais. Ainda, a
combinação com pré-tratamentos térmicos e/ou químicos pode levar à remoção de parte da
hemicelulose e da lignina, facilitando a digestibilidade da biomassa.
Apesar dos diversos benefícios inerentes ao processo de extrusão, alguns estudos
reportaram rendimentos máximos de hidrólise enzimática inferiores a 70% (ver Tabela 7),
demonstrando que este tipo tratamento não é adequado para todos os tipos de biomassa.
3. Justificativa
66
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Justificativa
A escolha do pré-tratamento pode gerar impactos em várias etapas do processo de
produção de etanol lignocelulósico, tanto à montante (como condicionamento da biomassa),
quanto à jusante (aproveitamento de frações extraídas, escolha da mistura enzimática e
microrganismos, etc). Por isso, é dito que o pré-tratamento terá um papel central no
planejamento de biorrefinarias de produção de etanol baseadas no aproveitamento da integral
da biomassa.
Nesse contexto, o pré-tratamento com líquidos iônicos é uma alternativa promissora,
resultando em rendimentos e produtividade de hidrólise enzimática muito superiores aos prétratamentos convencionais. Além disso, a recuperar uma fração de lignina relativamente pura
extraída durante o pré-tratamento é uma oportunidade para a produção de produtos com alto
valor agregado em adição a produção de etanol, o que pode favorecer a economicidade de
uma biorrefinaria baseada no pré-tratamento com líquidos iônicos. Independentemente da
viabilidade econômica atual desses processos, esse é um tópico de elevado interesse
acadêmico e tecnológico e por isso, o desenvolvimento da área deve ser estimulado visando
não só o melhor entendimento dos mecanismos que fazem dos líquidos iônicos reagentes
extraordinários para a desestruturação da biomassa, como também o aprofundamento de
estudos de caráter mais prático que enfoquem o desenvolvimento de técnicas de barateamento
e reuso.
Na ocasião da apresentação do projeto de tese durante o processo seletivo do
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica (fevereiro de 2010), o estudo do pré-tratamento
da biomassa com líquidos iônicos encontrava-se em seu estágio inicial, não havendo, até
então, nenhum estudo publicado que avaliasse o pré-tratamento da biomassa da cana-deaçúcar com esses reagentes. Dessa forma, identificou-se uma lacuna a ser preenchida, tendo
este estudo sido planejado para suprir a necessidade de se explorar essa nova técnica de prétratamento, tanto nos seus aspectos fundamentais como mais aplicados, além de contribuir
para o aumento do conjunto de dados disponíveis sobre a biomassa da cana-de-açúcar, que é
reconhecidamente de enorme relevância para o país.
4. Objetivos
68
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Objetivos
3.1. Objetivo Geral
Avaliar a eficiência do pré-tratamento da biomassa da cana-de-açúcar com líquidos
iônicos, buscando entender a correlação entre as transformações observadas na estrutura da
biomassa tratada com os dados de hidrólise enzimática. Além disso, propor uma nova
abordagem para o uso de líquidos iônicos, visando o desenvolvimento de um processo no qual
seja possível realizar o pré-tratamento com alto teor de sólidos.
3.2. Objetivos Específicos

Selecionar um líquido iônico que seja eficiente para o pré-tratamento do bagaço e da
palha de cana-de-açúcar;

A partir dos dados iniciais de conversão enzimática da celulose, escolher a biomassa
de estudo (bagaço ou palha) de acordo com os melhores rendimentos obtidos nas
condições testadas;

Otimizar as condições de reação em relação à temperatura e ao tempo de prétratamento;

Avaliar as modificações estruturais e morfológicas na biomassa pré-tratada;

Avaliar o requerimento de celobioidrolases para a hidrólise de amostras tratadas com
líquidos iônicos;

Avaliar a possibilidade de utilização de uma extrusora de dupla-rosca como um
misturador para promover o pré-tratamento com líquido iônico em alto teor de
biomassa;

Estudar a quantidade mínima de líquido iônico necessária para promover um prétratamento eficiente, estudando diferentes razões de biomassa:líquido iônico para o
tratamento.
5. Materiais e
Métodos
70
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Materiais e Métodos
5.1. Materiais
Os líquidos iônicos (LIs) utilizados nesse trabalho foram: cloreto de 1-butil-3metilimidazólio ([Bmim][Cl]), acetato de 1-etil-3-metilimidazólio ([Emim][Ac]), cloreto de
1-alil-3-metilimidazólio ([Amim][Cl]), fosfato de dimetila de 1,3-dimetilimidazólio
([Mmim][DMP]),
bis(trifluormetanosulfonil)
imida
de
1-n-butil-3-metilimidazólio
([Bmim][NTf2]) e sulfato de etila de 1-etil-3-hidroximetil piridina.
Figura 21. Líquidos iônicos utilizados nesse estudo. a) cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio ([Bmim][Cl]),
b) acetato de 1-etil-3-metilimidazólio ([Emim][Ac]), c) cloreto de 1-alil-3-metilimidazólio ([Amim][Cl]), d)
fosfato de dimetila de 1,3-dimetilimidazólio ([Mmim][DMP]), e) bis(trifluormetanosulfonil) imida de 1-nbutil-3-metilimidazólio ([Bmim][NTf2]) e f) sulfato de etila de 1-etil-3-hidroximetil piridina.
Todos os líquidos iônicos foram obtidos de fontes comerciais (Ioliec, Alemanha –
[Emim][Ac] e Sigma-Aldrich, EUA – todos os outros) e utilizados sem nenhuma purificação
adicional. O bagaço e a palha de cana-de-açúcar foram gentilmente fornecidos pelo Complexo
Bioenergético Itarumã localizado no estado de Goiás, Brasil.
As amostras de bagaço e palha de cana-de-açúcar foram moídas em um moinho de
facas e as partículas que passaram através de uma peneira de 2,0 mm foram coletadas para
experimentos e fracionadas com o auxílio de um peneirador em frações com tamanhos de
partículas de 125 µm a 250 µm, de 250 µm a 425 µm e de 425 µm a 1000 µm, que foram
utilizadas para diferentes propósitos (Figura 21).
71
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Materiais e Métodos
Figura 22. Fluxograma de utilização das de diversas frações da biomassa moída.
5.2. Determinação da composição química da biomassa
5.2.1. Método gravimétrico
No primeiro procedimento utilizado, a composição foi determinada de acordo com
Teramoto e coautores (2008), com algumas modificações descritas a seguir. As amostras
(tamanho de partícula entre 125 e 250 µm) foram secas a vácuo (40 °C) por 24 h e
subsequentemente extraídas em um extrator Soxhlet por 6 h com uma solução mista de
etanol:tolueno (1:2 em volume). A solução contendo os extrativos foi então submetida à
rotaevaporação e o percentual de extrativos calculado gravimetricamente. O conteúdo de
holocelulose (celulose + hemicelulose) foi determinado como o resíduo proveniente da
deslignificação com NaClO2, de acordo com procedimento a seguir: 0,2 g de NaClO 2 foram
adicionados a 30 mL de solução de ácido acético 7,5% contendo 0,5 g da amostra extraída.
A mistura foi incubada em banho de água a 80 °C por 1 h e a adição de NaClO 2 repetida 3
vezes, totalizando 4 h de deslignificação. O produto deslignificado foi filtrado, lavado
diversas vezes com água destilada e seco a vácuo (40 °C) por 24 h, sendo então pesado para
determinação do percentual de holocelulose (WISE et al., 1946). A hidrólise ácida da
holocelulose para a determinação do conteúdo das frações xilana e arabinana foi realizada
como descrito em Silva et al. (2010). O conteúdo de α-celulose foi determinado como o
resíduo insolúvel em uma solução aquosa de 17,5% de NaOH, de acordo com o procedimento
a seguir: 5 mL de uma solução de 17,5% de NaOH foram adicionados a 0,2 g de amostra de
holocelulose obtida como descrito acima e a mistura homogeneizada em um frasco com o
auxílio de um bastão de vidro. Após essa etapa, 5 mL de água destilada foram adicionados e a
mistura filtrada, sendo então a bomba de vácuo interrompida após a filtragem e 5 mL de uma
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Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Materiais e Métodos
solução 10% de ácido acético adicionados. A nova mistura foi homogeneizada, filtrada e
lavada diversas vezes com água destilada. Depois de secar o resíduo a vácuo (40 °C) por 24 h,
o percentual de α-celulose foi determinado gravimetricamente. O conteúdo de lignina Klason
foi determinado como o resíduo insolúvel em uma solução aquosa de ácido sulfúrico em uma
concentração de 72%, como descrito a seguir: 3 mL de uma solução 72% de ácido sulfúrico
foram adicionados a 0,2 g da amostra extraída com a solução de etanol:tolueno. A mistura foi
agitada à temperatura ambiente por 4 h. A seguir, 112 mL de água destilada foram
adicionados e a mistura incubada à temperatura elevada de modo que a água fosse recirculada
por mais 4 h. A mistura foi então filtrada e o resíduo obtido lavado com água destilada, seco a
105 °C e então pesado para o cálculo do percentual de lignina Klason (BROWNING, 1967).
5.2.2. Método baseado na análise de açúcares
O segundo procedimento de caracterização da composição química seguiu o protocolo
analítico descrito por Slutier e coautores (2011), conforme detalhado a seguir. As amostras
moídas e peneiradas de bagaço in natura ou pré-tratado foram secam a 40 °C em uma estufa a
vácuo até atingirem menos de 10% de umidade. As amostras secas (300 ± 10 mg) foram
hidrolisadas com ácido sulfúrico 72% (4.92 ± 0.02 g) a 30 °C por 1 h, sob agitação, seguido
de uma diluição para uma concentração final de ácido de 4% pela adição de água destilada
(84 mL). As misturas foram autoclavadas a 121 °C por 1 h, resfriadas e filtradas em um filtro
de fibra de vidro (Whatman GF/A 47 mm, Whatman International Ltd., Inglaterra), utilizando
uma bomba a vácuo. A fração sólida obtida foi seca a 105 °C e utilizada para a derterminação
gravimétrica da lignina insolúvel e cinzas insolúveis em ácido. Uma amostra do líquido
recuperado como filtrado (20 mL) foi neutralizada com CaCO3, filtrada por filtros com 0,2
µm de poro e analisada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para determinar
as concentrações dos açúcares monoméricos, descrita no item 5.7. As análises foram
realizadas em duplicata para todas as amostras e em triplicata ou mais repetições quando se
julgou necessário.
5.3. Condições de pré-tratamento
5.3.1. Processo de pré-tratamento para seleção do líquido iônico mais eficiente
Os líquidos iônicos (4,0 g) foram adicionados em tubos de vidro contendo 200 mg de
bagaço ou palha de cana-de-açúcar (razão de biomassa:líquido iônico de 1:20 p/p) e
incubados em temperaturas que variaram de 60 a 120 °C, por 120 min, utilizando o
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Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Materiais e Métodos
equipamento Carousel 12 Plus (Radleys, Reino Unido). O tamanho de partícula da biomassa
utilizado foi de 425 µm a 1,0 mm. Após o tempo de pré-tratamento estabelecido, os tubos
foram resfriados em banho de água e 10 mL de água foram adicionados, sendo os tubos
agitados para promover a regeneração e precipitação da biomassa dissolvida. A biomassa foi
recuperada por centrifugação e filtração, sendo lavada com 1 L de água destilada, visando a
remoção de resíduos de líquidos iônicos. Os ensaios de pré-tratamentos foram realizados em
duplicata. A Figura 22 mostra a sequência de etapas realizadas durante o pré-tratamento.
Figura 23. Representação das etapas realizadas para o pré-tratamento da biomassa.
A biomassa foi mantida úmida para evitar a coagregação das fibras durante o processo
de secagem, visando manter a morfologia da biomassa pré-tratada, sendo o conteúdo de
umidade determinado antes dos ensaios de hidrólise enzimática. Experimentos paralelos
foram realizados para determinar o conteúdo de sólidos extraídos e que permaneceu solúvel
na mistura líquido iônico-água após o pré-tratamento e adição do antissolvente. O percentual
de sólidos extraídos foi determinado através da Equação [1].
Sólidos extraídos (%) =
;
Eq. [1]
Onde a massa do resíduo recuperado por filtração foi medida após secagem a peso constante em forno a 105 °C.
Para determinar o efeito do tempo de pré-tratamento, entre 5 e 120 min de incubação,
experimentos em escala maior foram conduzidos a 120 °C, utilizando 20 g do líquido iônico
[Emim][Ac] e 1g de bagaço, em ensaios utilizando uma placa de agitação com aquecimento
controlado, conforme mostrado na Figura 23.
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Materiais e Métodos
Figura 24. Configuração experimental utilizada em ensaios contendo 1 g de bagaço e 20 g de [Emim][Ac].
O frasco ao fundo contém apenas o líquido iônico.
5.3.2. Processo de pré-tratamento de alto teor de sólidos com líquidos iônicos
Foi utilizada uma unidade motora (Labo Plastomill, modelo 30C150, Toyo Seiki,
Tóquio, Japão), equipada com uma extrusora de dupla-rosca (2D15W, Toyo Seiki, Tokyo,
Japão), apresentando uma razão de comprimento do cilindro para o diâmetro da rosca (L/D)
de 17:1 (Figura 24).
Figura 25. Extrusora utilizada neste estudo.
A configuração da dupla-rosca utilizada nesse trabalho, de 272 mm de comprimento,
está representada na Figura 25, mostrando o arranjo entre os elementos de transporte e mistura
utilizados.
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Materiais e Métodos
Figura 26. Configuração da dupla-rosca utilizada neste estudo. Os números representam o tamanho da
rosca, dos elementos ou dos passos dos elementos, em mm.
Para o pré-tratamento, 6,0 g de bagaço de cana-de-açúcar (tamanho de partícula 425
µm a 1000 µm) foram misturados a quantidades determinadas do liquido iônico [Emim][Ac],
a fim de preparar quatro razões diferentes de bagaço:[Emim][Ac] (p/p), equivalentes a 1:8,
1:5, 1:3 e 1:1. As misturadas foram agitadas por 15 min e alimentadas manualmente na
extrusora, que foi pré-aquecida a temperaturas que variaram de 80 a 180 ºC e programada
para uma velocidade de extrusão de 15 rpm. Após toda a amostra inicial ter sido extrusada,
cerca de 30% da massa da mistura de bagaço-líquido iônico foi recuperada para ensaios de
determinação da composição da biomassa e hidrólises enzimáticas, sendo o produto
remanescente extrusado novamente. Essa operação foi repetida por até 3 ciclos. Após as
misturas de bagaço-líquido iônico terem sido recuperadas, 50 mL de água destilada foram
adicionados. A biomassa foi lavada com 1L de água destilada, dispersa com a ajuda de um
homogeneizador de alta velocidade (Ultra Turrax T 25 Basic, Ika), filtrada e mantida úmida
para os experimentos de hidrólise enzimática e avaliação da morfologia. O conteúdo de
umidade foi determinado antes dos ensaios de hidrólise enzimática. Os ensaios de prétratamento foram realizados pelo menos em duplicata.
5.3.3. Processo por moinho de bolas
Para estabelecer uma comparação com o pré-tratamento com líquidos iônicos, em
alguns experimentos de hidrólise foram utilizados também materiais pré-tratados por moinho
de bolas, conforme descrito previamente (SILVA et al., 2010). Resumidamente, as matériasprimas foram tratadas utilizando um moinho de bolas do tipo planetário (Planetaty Micro Mill
pulverisette 7, Frisch, Alemanha) (Figura 26). As amostras (1 g) foram moídas a 400 rpm em
um copo de 45 mL contendo 7 esferas (φ = 15 mm) por 120 minutos a temperatura ambiente.
O moinho foi operado em modo cíclico de tal forma que a cada 10 minutos de moagem houve
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Materiais e Métodos
uma pausa de 10 minutos. O tempo de moagem a que se refere neste trabalho corresponde ao
tempo de moagem real, excluindo as pausas.
Figura 27. Equipamento utilizado para o pré-tratamento por moinho de bolas. (a) visão geral do moinho;
(b) copos e bolas utilizadas para a moagem.
5.4. Dosagens enzimáticas
5.4.1. Preparo do reagente DNS
O reagente DNS foi utilizado para a dosagem da concentração dos açúcares redutores
liberados durantes algumas reações enzimáticas. O reagente foi preparado pela adição em
água destilada de 10 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico, 16 g de hidróxido de sódio e 300 g de sal
de Rochelle (tartarato duplo de sódio e potássio) para perfazer um volume final de 1000 mL.
O reagente foi preparado sem a adição de fenol e metabissulfito (TEIXEIRA et al., 2012).
5.4.2. Atividade de FPase
A atividade de papel de filtro (FPase - Filter paper activity) foi determinada de acordo
com a metodologia padrão descrita pela IUPAC e expressa em FPU/mL (GHOSE, 1987). O
método baseia-se na dosagem da concentração de açúcares redutores liberados durante a
degradação de uma fita de papel de filtro. O meio reacional constituiu-se de 0,5 mL do extrato
enzimático (diluído em tampão citrato de sódio 50 mmol/L, pH 4,8, quando necessário), 1,0
mL de tampão citrato de sódio 50 mmol/L, pH 4,8 e uma tira de papel de filtro Whatman no 1
medindo 1,0 cm X 6,0 cm (aproximadamente 50 mg). A mistura reacional foi incubada a 50º
C, durante 60 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 3,0 mL de DNS, fervida por
5 min e resfriada em banho de gelo. Para a determinação da concentração de açúcares
77
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Materiais e Métodos
redutores pelo método do DNS, 0,2 mL da mistura resultante após a adição de DNS foram
adicionados a cubetas descartáveis contendo 2,5 mL de água destilada e a absorbância da
mistura foi lida a 540 nm. Para a determinação da concentração de açúcares, uma curva
padrão de glicose foi construída de acordo com o recomendado por Ghose (1987).
É importante ressaltar que para a obtenção de resultados comparativos, as preparações
enzimáticas precisam ser dosadas com base em níveis equivalentes de conversão. Na
metodologia da IUPAC foi determinado um valor padrão para se calcular unidades de papel
de filtro (FPU), correspondente a liberação de 2,0 mg de açúcares redutores a partir de 50 mg
da fita de papel de filtro (~4% de conversão) em 60 minutos. Como a concentração de
açúcares redutores não é uma função linear da quantidade de enzima na mistura reacional, a
unidade de FPU pode ser definida somente nessa faixa de conversão. O procedimento, então,
tem o objetivo de encontrar o fator de diluição da enzima original que resulte em 4% de
conversão em 60 minutos de reação. O cálculo da atividade (em FPU/mL) da enzima deve ser
feito com base na diluição requerida para obter a conversão estabelecida (ou em termos
práticos, achar duas diluições, uma que catalise um pouco menos de 4% de conversão e outra
um pouco mais, sendo possível achar a diluição exata por interpolação com certa precisão).
5.4.3. Atividade de CMCase
O método se baseia na dosagem da concentração de açúcares redutores liberados
durante a degradação de carboximetilcelulose (CMC). A atividade de CMCase foi
determinadas de acordo com Ghose (1987), com pequenas modificações, descritas a seguir. O
mistura reacional constituiu-se de 0,25 mL de uma solução de CMC 2% p/v em tampão
citrato de sódio 50 mmol/L, pH 4,8 e 0,25 mL do extrato enzimático (diluído em tampão
citrato de sódio 50 mmol/L, pH 4,8, quando necessário). A mistura reacional foi incubada a
50 ºC, durante 30 minutos. A reação enzimática foi interrompida pela adição imediata de 0,5
mL de DNS, sendo em seguida fervida por 5 minutos, resfriada em banho de gelo e diluída
com 6,5 mL de água destilada antes da leitura da absorbância a 540 nm. Para a determinação
da concentração de açúcares, uma curva padrão de glicose foi construída de acordo com o
recomendado por Ghose (1987).
5.4.4. Atividades de β-glicosidade, β-xilosidase e α-L-arabinofuranosidase
As atividades de β-glicosidade, β-xilosidase e α-L-arabinofuranosidase foram
determinadas utilizando 100 µL de 10 mmol/L p-nitrofenil-β-D-glucopiranosídeo, pnitrofenil-β-D-xilopiranosídeo, p-nitrofenil-α-L-furanosídeo, respectivamente, 200 µL de
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Materiais e Métodos
tampão acetato de sódio 0,5 mol/L, pH 5,0, 650 µL de água Milli-Q e 50 µL da diluição
apropriada da enzima. Após incubar a mistura reacional a 50 ºC por 10 minutos, a reação foi
interrompida pela adição de 500 µL de Na2CO3, 1 mol/L. A absorbância das misturas
reacionais foi medida a 400 nm e concentração de p-nitrofenol liberada foi calculada contra
uma curva padrão de p-nitrofenol construída com as seguintes concentrações (mmol/L): 0,2,
0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, 0,006125. Uma unidade de β-glicosidade, β-xilosidase e α-Larabinofuranosidase foi definida como a concentração de enzima capaz de liberar 1 µmol de
p-nitrofenol a 50 ºC em 1 minuto.
5.4.5. Atividade de xilanase
A atividade de xilanase determinada de acordo com Milanezi e coautores (2012). As
misturas reacionais contendo 100 µL de 2% de xilana solúvel (xilana birchwood, Sigma) e 50
µL do extrato enzimático apropriadamente diluído em tampão acetato de sódio, 50 mmol/L,
pH 5,0, foram incubadas a 50 ºC por 10 minutos. A reação foi interrompida pela adição de
300 µL de DNS, fervida por 5 min, resfriada em banho de gelo e diluída com 1,5 mL de água
destilada antes da leituta da absorbância a 540 nm. Uma unidade de atividade de xilanase foi
definida como a quantidade de enzima requerida para produzir 1 µmol de açúcares redutores
em 1 minuto a 50 ºC.
5.4.6. Dosagem das enzimas hipertermofílicas
Enzimas hipertermofílicas de Pyrococcus horikoshii (endoglucanase - EGPh) e de
Pyrococcus furiosus (β-glicosidase - BGPf) expressas em Escherichia coli e purificadas de
acordo com Ando et al. (2002) e Kado et al. (2011) também foram utilizadas em alguns
experimentos deste trabalho. As dosagens enzimáticas das atividades de CMCase e βglicosidase foram realizadas conforme descrito anteriormente, porém utilizando uma
temperatura de incubação de 85 °C.
5.5. Hidrólise enzimática
5.5.1. Hidrólise para avaliação da eficiência de pré-tratamento
Os ensaios de hidrólise enzimática foram conduzidos a 45 ºC, 230 rpm, por até 72 h,
utilizando uma concentração de biomassa pré-tratada de 2,5% e um coquetel enzimático
contendo 15 FPU da enzima comercial Acremonium Cellulase (Meiji Seika Co, Japão) e 0,2%
(v/v) da enzima OptimashTM BG (Genencor ® International, EUA), como um suplemento da
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Materiais e Métodos
atividade de β-xilosidase, porém sem nenhuma atividade de FPase. O coquetel enzimático
utilizado nos experimentos continha a uma dosagem enzimática, por grama de biomassa, de
15 FPU de FPase, 79,7 BGU de β-glicosidase, 262,4 UI de CMCase, 576,3 UI de xilanase, 1,4
UI de β-xilosidase e 22,5 UI de α-L-arabinofuranosidase. Para os experimentos de hidrólise
enzimática da biomassa pré-tratada com uma razão de biomassa:líquido iônico de 1:20, 2,0
mL do coquetel enzimático preparado em tampão acetato de sódio, 50 mmol/L, pH 5,0,
foram adicionados a 0,05 g de biomassa pré-tratada ou in natura. Os rendimentos de hidrólise
para esses ensaios foram calculados de acordo com a Equação [2] para glicose e xilose e [3]
para celobiose.
η=
;
Eq. [2]
onde mg açúcar corresponde à quantidade de glicose ou xilose absoluta obtida após a hidrólise enzimática e f
açúcar corresponde ao fator de conversão da celulose (0,9) ou xilana (0,88) em glicose ou xilose.
η celobiose=
;
Eq. [3]
onde os rendimentos em celobiose foram calculados considerando a sua conversão total para glicose, sendo
então o valor obtido divido pelo máximo teórico de concentração de glicose que seria possível obter na hidrólise.
Já os ensaios de hidrólise enzimática dos materiais que foram pré-tratados com o
auxílio da extrusora consistiram de 10 mL do coquetel enzimático preparado em tampão
acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 e 0,250 g de biomassa. Os rendimentos de hidrólise para
esses ensaios foram calculados de acordo com a Equação [4] para glicose e xilose.
η gli,xil =
;
Eq. [4]
Onde [açúcar] corresponde à concentração de glicose ou xilose absoluta obtida após a hidrólise enzimática e f
açúcar corresponde ao fator de conversão da celulose (0,9) ou xilana (0,88) em glicose ou xilose.
Em todos os ensaios de hidrólise enzimática foram adicionados os antibióticos
tetraciclina e aureobasidina A em concentrações de 50 µg/mL e 5 µg/mL, respectivamente,
para evitar contaminação microbiana. Os ensaios de hidrólise enzimática foram realizados em
triplicata.
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Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Materiais e Métodos
5.5.2. Hidrólise para avaliação do requerimento de celobioidrolases
A endoglucanase de Pyrococcus horikoshii (EGPh) e a β-glicosidase de Pyrococcus
furiosus (BGPf), ambas expressas em Escherichia coli e purificadas de acordo com Ando et
al. (2002) e Kado et al. (2011), respectivamente, foram utilizadas para a hidrólise enzimática
de amostras de bagaço de cana-de-açúcar e de celulose microcristalina pré-tratadas com
[Emim][Ac] e moinho de bolas. Essas enzimas foram misturadas na razão de EGPh/BGPf de
5:1 (utilizando soluções de EGPh e BGPf de 10 µM, preparadas em tampão citrato 50 mM,
pH 5.0) e utilizadas para os ensaios de hidrólise. As enzimas purificadas foram gentilmente
cedidas pelos Dr. Kazuhiko Ishikawa e Dr. Han-Woo Kim, do AIST.
Uma solução de 4% (v/v) da enzima comercial OptimashTM BG (Genencor®
International, EUA) contendo diversas atividades enzimáticas, como CMCase (223,9 IU/mL),
β-glicosidase (3,31 IU/mL) xilanase (54,93 IU/mL), α-L-arabinofuranosidases (1,39 IU/mL),
β-xilosidase (0,65 IU/mL) e nenhuma atividade de FPase também foi utilizada para avaliar a
performance hidrolítica de uma preparação enzimática com baixa atividade de
celobioidrolase. A enzima comercial Acremonium Cellulase (Meiji Seika Co., Japão), que
contém alta atividade de celobioidrolase (CBH), foi testada para avaliar a necessidade de
CBHs para a obtenção de altos rendimento na hidrólise de biomassas pré-tratadas com LIs e
por moinho de bolas
A hidrólise enzimática de 1% de substrato, em um volume final de 35 mL, foi
realizada a 85 °C, para EGPh/BGPf, e a 45 °C, para OptimashTM BG ou Acremonium
Cellulase, no equipamento Carousel 12 Plus (Radleys, United Kingdom) ou em um shaker,
respectivamente. A dosagem das enzimas utilizadas para hidrólise foi equivalente a 345 UI de
CMCase por grama de substrato. As enzimas foram diluídas em tampão citrato de sódio, 50
mM, pH 5,0 e adicionadas a 0,350 g de bagaço ou celulose pré-tratados com LIs ou por
moinho de bolas. Os ensaios foram realizados em duplicata.
5.6. Fermentação alcoólica
A cepa floculante industrial Saccharomyces cerevisiae IR-2 foi utilizada neste trabalho
(KURIYAMA et al., 1985). As pré-culturas para as fermentações, inoculadas de placas de
meio YPD (yeast extract, peptone e dextrose - 10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de
peptona, 20 g/L de glicose), foram crescidas em 10 mL de meio YPD a 30 ºC overnight em
frascos de 100 mL sob agitação de 120 rpm. As células foram recolhidas por centrifugação a 4
ºC, 500 rpm por 5 minutos e lavadas duas vezes com água destilada. A densidade inicial de
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Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Materiais e Métodos
células foi ajustada em 2,4 g (peso seco celular)/L (MATSUSHIKA et al., 2009). Os
experimentos de fermentação foram realizados a 30 ºC em frascos fechados (20 mL) contendo
10 mL de hidrolisado suplementado com nutrientes correspondendo a uma concentração final
de 1 g/L de extrato de levedura, 0,5 g/L de (NH4)2SO4, 0,025 g/L de MgSO4 . 7 H2O e 1,38
g/L NaH2PO4. O pH inicial foi ajustado em 5,5 com NaOH 2 mol/L. Agitadores magnéticos
foram utilizados e as culturas agitadas a 100 rpm. Como controle, a fermentação de soluções
contendo 35 g/L de glicose e 15 g/L de xilose, suplementadas com os mesmo nutrientes
citados acima, foi realizada.
Os hidrolisados utilizados para as fermentações foram preparados com as mesmas
enzimas e utilizando as mesmas dosagens descritas no item 5.5.1, porém a concentração de
biomassa foi aumentada para 7,5% e o volume final da hidrólise foi de 10 mL, a fim de obter
uma concentração de glicose mais elevada para a fermentação. O tampão acetato utilizado na
preparação das enzimas e utilizado para as hidrólises descritas anteriormente também foi
substituído pelo tampão citrato de sódio, pH 5,0, 50 mM, para não interferir no crescimento
do microrganismos, já que o acetato é um conhecido inibidor do metabolismo de S.
cerevisiae.
5.7. Quantificação dos monossacarídeos, dissacarídeos e etanol
Os monossacarídeos e dissacarídeos presentes nos hidrolisados foram analisados
utilizando um sistema de HPLC equipado com um detector de índice de refração (RI-2031
Plus, Jasco Co., Japão), utilizando uma coluna Aminex HPX-87P (7,8 mm I.D. x 30 cm, BioRad, EUA) equipada com uma pré-coluna Carbo-P (Bio-Rad, EUA) e um sistema de remoção
de cinzas (deashing system, Bio-Rad, EUA). A fase móvel utilizada foi água deionizada em
um fluxo de 0,7 mL/min e a temperatura do forno da coluna foi de 80 ºC. A concentração de
etanol, no meio de fermentação foi determinada utilizando a coluna Aminex HPX-87H (7.8
mm I.D. x 30 cm, Bio-Rad, EUA), equipada com uma pré-coluna Cation H (Bio-Rad, EUA).
A coluna foi eluida com H2SO4 1 mM em um fluxo de 0,6 mL/min, 60 ºC.
5.8. Análise da cristalinidade por difração de raios-X
Pastilhas em forma de disco (1 cm de diâmetro, 0,8 cm de espessura e 0,1 g de peso)
foram preparadas por compressão a 2 ton para a análise de difração de raios-X, empregando
uma prensa de pastilhas tipicamente utilizada para o preparo de amostras para análises de
espectroscopia de infravermelho. As amostras foram liofilizadas, de acordo com estudos
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Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Materiais e Métodos
prévios que relataram que a estrutura cristalina original da celulose é mais bem preservada
quando esse método de secagem é utilizado (HEYN, 1965). Os experimentos foram
realizados utilizando o difratômetro Ringaku RINT-TTR III. A radiação Cu Kα (λ = 0,1542
nm), filtro de níquel, foi utilizada a 50 kV e 300 mA. A intensidade da difração foi medida na
faixa de 2θ = 2 – 60º utilizando uma variação de 0,02º e uma frequência de 2º/min. O índice
de cristalinidade (ICr) foi medido de acordo com a Equação [5] (SEGAL et al., 1959) e a
indicação dos parâmetros utilizados no cálculo está demonstrado na Figura 27.
ICr =
;
Eq. [5]
onde I200 representa a contribuição para a intensidade de difração dada pela presença de frações cristalinas e
amorfas e Iam representa a contribuição para a intensidade dada apenas pela fração amorfa (o valor mínimo
obtido entre os picos de difração 200 e 110).
Figura 28. Esquematização do perfil de difração de raios-X de uma biomassa lignocelulósica. I200:
intensidade de difração do plano cristalino 200; Iam: intensidade de difração no valor mínimo obtido entre
os picos de difração 200 e 110; I110: intensidade de difração do plano cristalino 110.
5.9. Análise da área de superfície específica e morfologia
Para as análises da área de superfície específica (ASS) e a observação da morfologia
por microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (MEV), as amostras de
biomassa pré-tratadas foram cuidadosamente lavadas com terc-butanol diversas vezes, de
forma a trocar o conteúdo de água nas amostras pelo terc-butanol, sendo subsequentemente
liofilizadas, com o objetivo de manter a superfície e morfologia da biomassa o mais próximo
possível do original. Para as análises da área superficial específica, após liofilização, as
83
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Materiais e Métodos
amostras foram inicialmente degasadas a 105 ºC por 6h. O equipamento utilizado foi o
BELSORP-Max (Bel Japan Inc., Japão) e os valores de ASS foram obtidos pela análise das
isotermas de adsorção-dessorção do gás nitrogênio, na temperatura de 77K do nitrogênio
líquido, pelo método de Brunaue-Emmett-Teller (BET) (BRUNAUE et al., 1938).
As características morfológicas da superfície dos materiais in natura ou pré-tratados
foram observadas através da utilização de um microscópio eletrônico de varredura de emissão
de campo de alta resolução (>100.000X) (S-4800 Hitachi High Technologies Co., Tóquio,
Japão). Uma baixa aceleração de voltagem de 1,5 kV foi utilizada, a fim de evitar danos
causados pelo feixe de elétrons na estrutura da amostra. As amostras foram impregnadas com
uma camada ultrafina de ósmio (cerca de 1 nm), utilizando um equipamento de impregnação
de ósmio sob forma de plasma (NEOC-NA, Meiwa Fosis, Tóquio, Japão) imediatamente
antes da observação. Um dia antes das análises, as amostras foram mantidas em uma estufa a
vácuo na temperatura de 40 ºC, com o objetivo de reduzir sua umidade.
6. Resultados
e Discussão
85
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
Os resultados deste trabalho foram divididos em três partes. A primeira parte irá
abordar sobre a escolha de um líquido iônico para o pré-tratamento da biomassa da cana-deaçúcar em condições similares às usualmente reportadas na literatura e avaliar as
características do material pré-tratado que favorecem a sua hidrólise enzimática. Na segunda
parte, será feita uma discussão sobre a necessidade de celobioidrolases para a hidrólise do
bagaço pré-tratado com líquidos iônicos. Por fim, na terceira parte, será discutida uma nova
proposta de pré-tratamento do bagaço com líquidos iônicos, utilizando alta carga de sólidos.
PARTE I
6.1. Seleção de um líquido iônico para o pré-tratamento da biomassa de cana-de-açúcar
6.1.1. Composição da biomassa utilizada
A composição do bagaço e da palha in natura utilizados nos experimentos de prétratamento para a seleção do líquido iônico mais promissor está representada na Tabela 8. Os
valores correspondem às médias de duplicatas independentes.
Tabela 8. Composição das biomassas in natura expressa em percentual da matéria seca.
Componente
Composição da biomassa (%)
Bagaço
Palha
Holocelulose
74,7
71,8
α-Celulose
46,0
42,4
Hemicelulose*
28,7 1
29,5 2
Lignina Klason
22,6
21,8
Cinzas
2,8
5,7
Extrativos em etanol e tolueno
2,04
2,23
*Valor obtido através da subtração do valor da α-celulose do valor total obtido para a holocelulose; O valor
obtido através da hidrólise ácida de acordo com o método do NREL foi de 23,5% de xilana e 2,5% de arabinana
para o bagaço1 e de 25,5% de xilana e 3,4% de arabinana para a palha2.
Os valores obtidos para a composição das biomassas são compatíveis com os obtidos
em outros estudos. Rocha e coautores (2010) analisaram a composição de 50 amostras de
bagaço de cana-de-açúcar provenientes de diferentes usinas localizadas em diversas regiões
do Brasil e obtiveram uma composição média (%) de 43,03 (máx. = 46,17, mín. = 40,54) de
glucana, 25,42 (máx. = 28,31, mín. = 18,90) de hemicellulose, 23,05 (máx. = 26,48, mín. =
86
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
19,95) de lignina, 2,92 (máx. = 5,50, mín. = 1,01) de cinzas e 4,78 (máx. = 13,29, mín. =
1,96) de extrativos.
Ferreira-Leitão e colaboradores (2010b) também reportaram uma composição de
bagaço similar à obtida neste estudo (41,4% de celulose, 28,5% de hemicelulose e 23,6% de
lignina), enquanto a composição da palha foi ligeiramente diferente (33,3% de celulose,
24,2% de hemicelulose, 36,1% de lignina), o que pode estar correlacionado ao caráter mais
heterogêneo da palha de cana-de-açúcar, que é composta tanto por folhas como pelos
ponteiros da planta. Em contrapartida, uma composição da palha de cana-de-açúcar similar à
obtida neste estudo, correspondente a 39,4% de celulose, 26,2% de hemicelulose e 21,5% de
lignina, foi obtida em outro estudo (SAAD et al., 2008)
6.1.2. Escolha da biomassa de estudo
Um primeiro conjunto de ensaios foi realizado para avaliar se haveria diferença na
eficiência dos seis líquidos iônicos estudados para o pré-tratamento a 120 °C, por 120 min,
das duas biomassas utilizadas. A Tabela 9 apresenta as concentrações de glicose e xilose
medidas nos hidrolisados após 48 h de hidrólise enzimática das biomassas pré-tratadas com os
diferentes líquidos iônicos. Os dados de experimentos controles, utilizando o bagaço e a palha
in natura, também estão apresentados.
Tabela 9. Concentrações de glicose e xilose obtidas após 48 h de hidrólise enzimática do
bagaço e da palha de cana-de-açúcar pré-tratados com diferentes líquidos iônicos.
Líquido iônico utilizado
Bagaço
Palha
Glicose (g/L) Xilose (g/L) Glicose (g/L) Xilose (g/L)
--2,9
0,9
3,3
1,1
[Emim][Ac]
15,9
5,1
14,0
5,2
[Bmim][Cl]
5,2
1,9
4,8
1,7
[Bmim][NTf2]
3,7
2,0
3,5
1,4
[Mmim][DMP]
8,2
3,0
6,3
2,5
[Amim][Cl]
5,7
1,1
5,5
1,1
Sulfato de etila de 1-etil-34,7
2,1
4,3
2,1
hidroximetil piridina
A partir dos resultados obtidos foi possível concluir que o pré-tratamento com os seis
líquidos iônicos testados resultou em melhorias na digestibilidade enzimática das biomassas.
O efeito de um mesmo líquido iônico para o pré-tratamento do bagaço ou da palha foi
semelhante, tendo o líquido iônico [Emim][Ac] resultado no maior aumento de digestibilidade
enzimática de ambas as biomassas. Além disso, a concentração de glicose no hidrolisado do
bagaço tratado com [Emim][Ac] foi superior à concentração de glicose no hidrolisado da
87
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
palha tratada com este mesmo líquido iônico. Contudo, não é possível afirmar que o prétratamento foi mais eficiente para o bagaço do que para a palha, pois os rendimentos de
conversão de celulose em glicose não foram calculados nessa etapa do trabalho, já que as
biomassas pré-tratadas não foram caracterizadas quanto a sua composição.
Como não foi observada uma grande diferença no efeito de um mesmo líquido iônico
para ambas as biomassas, para dar continuidade ao trabalho, o bagaço foi escolhido como a
biomassa de estudo. Dessa forma, visou-se reduzir o número de experimentos e o consumo de
líquidos iônicos.
6.1.3. Avaliação do efeito dos líquidos iônicos testados no bagaço de cana-de-açúcar
A Figura 28 apresenta o perfil de hidrólise enzimática do bagaço in natura e prétratado com diferentes líquidos iônicos a 120 °C por 120 min e os rendimentos de conversão
de celulose e xilose, calculados com base no conteúdo inicial de glucana e xilana contidos na
biomassa in natura, levando em consideração o percentual de sólidos que permaneceram
solúveis na fração líquido iônico-água após o pré-tratamento (Tabela 10).
O [Emim][Ac], o líquido iônico mais eficiente para o pré-tratamento, resultou em
rendimentos em glicose e xilose de 98,2% e 60,7%, respectivamente, após 48 h de
sacarificação, o que correspondeu a um rendimento em glicose 4,5 vezes superior ao obtido
na hidrólise do bagaço in natura. Também foi observado que a produtividade de conversão da
celulose em glicose aumentou drasticamente quando o [Emim][Ac] foi utilizado para o prétratamento do bagaço. A produtividade, calculada a partir dos dados de concentração de
glicose obtidos após 6 h de reação, foi de 35,5 mg/L.h, um valor seis vezes maior que o
calculado para o bagaço in natura (5,9 mg/L.h).
Como rendimentos em glicose próximos ao máximo teórico foram obtidos, é possível
afirmar que a perda da fração celulósica foi pouco significativa durante o pré-tratamento com
[Emim][Ac]. No entanto, como o rendimento máximo em xilose foi relativamente menor, de
60,7%, é possível que parte da fração de hemicelulose tenha sido removida ou degradada
durante o pré-tratamento, não estando disponível para a hidrólise enzimática. Lee e
colaboradores (2009a) relataram resultados semelhantes, onde 26% da hemicelulose da
serragem de madeira foi removida após pré-tratamento com [Emim][Ac]. O pré-tratamento de
palha de cevada com [Emim][Ac] também resultou em uma recuperação da fração
hemicelulósica no sólido precipitado na faixa de 77,3 a 94,1%, dependendo da condição de
pré-tratamento (SÁEZ et al., 2012). Já foi descrito que o líquido iônico [Emim][Ac] tem
habilidade de extrair parte da fração de lignina, que permanece solúvel após a adição do
88
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Resultados e Discussão
antissolvente (LEE et al., 2009a; SINGH et al., 2009). Assim, como a hemicelulose está
ligada à lignina por ligações covalentes, é possível que parte da hemicelulose seja removida
conjuntamente com a lignina para a fração líquido iônico-água, o que reduz sua
disponibilidade no sólido precipitado para a hidrólise enzimática. No entanto, foi reportado
que, apesar de haver remoção de parte da hemicelulose dependendo das condições de prétratamento, a sua degradação não é significativa já que a concentração de monossacarídeos
reportada na fração líquido iônico-água foi de menos de 1g para cada 100g de material prétratado (SÁEZ et al., 2012; UJU et al., 2012)
Figura 29. Efeito do pré-tratamento utilizando diferentes líquidos iônicos na hidrólise enzimática do bagaço prétratado a 120 °C, por 120 min. (a) Rendimento em glicose e (b) rendimento em xilose. ♦: in natura, ▲: [Bmim]
[Cl], ●: [Emim] [Ac], ◇: [Amim] [Cl], □: [Mmin] [DMP], ○: [Bmim] [NTf2], ∆: Sulfato de etila de 1-etil-3hidroximetil piridina. Os rendimentos de conversão de celulose em glicose e xilana em xilose foram calculados
com base no conteúdo de celulose do bagaço in natura, levando em consideração o percentual de sólidos que
foram extraídos durante o pré-tratamento com cada líquido iônico.
89
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
A Tabela 10 lista o percentual de sólidos que permaneceram solúveis na fração de
líquido iônico-água após o pré-tratamento com cada líquido iônico testado. A massa do sólido
precipitado recuperado variou entre 79,3 e 99,6% da massa inicial de bagaço utilizada para o
pré-tratamento. O [Emim][Ac] foi o mais eficiente na extração de componentes do bagaço,
resultando em 20,70% de dissolução de sólidos na fração de líquido iônico-água. A rápida
atuação do [Emim][Ac] na dissolução da biomassa pode ser observada pela mudança de
coloração da mistura para marrom escura poucos minutos após o início da reação, sendo este
um indicativo da excelente habilidade desde líquido iônico de extrair lignina do bagaço.
Tabela 10. Percentual de sólidos que foram extraídos e que permaneceram solúveis na fração
líquido iônico-água após adição do antissolvente (com base na matéria seca).
Líquido iônico
Sólidos extraídos (%)
[Emim][Ac]
20,70
[Bmim][Cl]
4,17
[Bmim][NTf2]
2,75
[Mmim][DMP]
2,17
[Amim][Cl]
0,38
Sulfato de etila de 1-etil-3-hidroximetil piridina
3,61
A diferença entre as duplicatas foi menor que 2%.
De acordo com os resultados de sacarificação, o segundo líquido iônico mais efetivo
foi o [Mmim][DMP], que resultou em rendimentos em glicose e xilose de 61,9% e 43,9%,
respectivamente. No entanto, o percentual de sólidos extraídos por esse líquido iônico foi de
apenas 2,75%. Os rendimentos em glicose e xilose obtidos a partir da hidrólise do bagaço prétratado com [Mmim][DMP] foram superiores aos obtidos com [Bmim][Cl], apesar deste
líquido iônico ter extraído 4,17% de sólidos do bagaço.
Logo, esses dados em conjunto indicam que não existe uma relação direta entre os
rendimentos de hidrólise e o percentual de sólidos extraídos quando líquidos iônicos com
baixa capacidade de extração de sólidos são comparados. É provável que outras modificações
promovidas pelos líquidos iônicos na biomassa além da extração de componentes, como de
porosidadade e cristalinidade,
estejam
influenciando
no
melhor
desempenho
do
[Mmim][DMP] em relação ao [Bmim][Cl]. Alguns estudos relataram o [Bmim][Cl] como um
líquido iônico efetivo para dissolver e facilitar a hidrólise enzimática da celulose
microcristalina (OHNO e FUKUYA, 2009; HA et al., 2011). Apesar disso, sua utilização para
90
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
o pré-tratamento do bagaço nas condições empregadas neste estudo resultou em baixos
rendimentos de hidrólise. Analogamente, outros trabalhos reportaram baixos rendimentos de
hidrólise enzimática do bagaço e de amostras de madeira pré-tratadas com [Bmim][Cl] a 130
ºC (ZHANG et al., 2012; KILPELÄINEN et al., 2007). Kimmon e coautores (2011), no
entanto, mostraram que rendimentos em glicose maiores puderam ser obtidos após o prétratamento do bagaço com [Bmim][Cl] em temperaturas mais altas, chegando a 62% após
tratamento a 140 ºC e a 100% de conversão quando o pré-tratamento foi realizado a 150 ºC.
Com base nos resultados obtidos, o líquido iônico [Emim][Ac] foi selecionado para a
continuação do estudo, onde as condições de pré-tratamento, como temperatura e tempo de
reação, foram estudadas e algumas características estruturais e morfológicas dos materiais
pré-tratados foram analisadas.
6.1.4. Avaliação do efeito da temperatura e do tempo de pré-tratamento do bagaço com
o líquido iônico [Emim][Ac]
O efeito da temperatura na eficiência do pré-tratamento foi avaliado em ensaios onde a
temperatura de reação foi variada em uma faixa de 60-120 °C, mantendo um tempo de prétratamento de 120 min. Os rendimentos de hidrólise e o percentual de sólidos extraídos
obtidos para cada condição estão sumarizados na Tabela 11.
Tabela 11. Efeito da temperatura utilizada no pré-tratamento com [Emim][Ac] na hidrólise
enzimática do bagaço pré-tratado por 120 min e no percentual de sólidos que foram extraídos
e que permaneceram solúveis após adição do antissolvente.
Sólidos extraídos (%)
Rendimento em
glicose (%)a
Rendimento em
xilose (%)b
-
21,9
13,0
60 ºC
1,9
48,8
35,7
80 ºC
5,7
51,1
41,2
100 ºC
9,5
81,5
68,1
120 ºC
20,7
98,2
60,7
Temperatura
in natura
A diferença entre as duplicatas foi menor que 5%.
a
Calculado com base no conteúdo inicial de celulose (92 mg) em 200 mg de bagaço in natura utilizados para o
pré-tratamento e levando em consideração o percentual de sólidos extraídos em cada condição. Resultados
obtidos após 48 h de hidrólise enzimática.
b
Calculado com base no conteúdo inicial de xilana (47 mg) em 200 mg de bagaço in natura utilizados para o
pré-tratamento e levando em consideração o percentual de sólidos extraídos em cada condição. Resultados
obtidos após 48 h de hidrólise enzimática.
91
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
Foi observado um aumento crescente na extração de sólidos com o aumento da
temperatura, chegando ao máximo de extração de 20,7% da massa inicial de bagaço, ocorrido
a 120 °C, confirmando o valor obtido no experimento de seleção do melhor líquido iônico. O
rendimento de conversão de celulose em glicose também seguiu o mesmo perfil, aumentando
de 48,8%, quando o tratamento foi feito a 60 °C, para 98,2%, quando a temperatura foi de 120
°C. O rendimento em xilose aumentou paralelamente com o aumento da temperatura na faixa
de 60 °C a 100 °C, atingindo um máximo de 68,1%, e decaiu quando a temperatura foi
elevada de 100 °C para 120 °C. Esse resultado indica que a extração conjunta da hemicelulose
com a lignina ou sua degradação em compostos de baixa massa molecular que são solúveis na
fração de líquido iônico-água, como já discutido anteriormente, é influenciada pela
temperatura de pré-tratamento. Dessa forma, é possível que o percentual de xilana disponível
na biomassa pré-tratada a 100 °C seja maior, devido à menor extração ocorrida, que na
biomassa pré-tratada a 120 °C. A influência da temperatura na extração de parte da ligninahemicelulose pelo [Emim][Ac] também pode ser acompanhada visualmente pela coloração da
solução obtida após rotaevaporação da fração líquido iônico-água, mostrada na Figura 29.
Figura 30. Solução obtida após rotaevaporação da fração líquido iônico-água resultante do prétratamento em diversas temperaturas.
Numa segunda etapa, o efeito do tempo de incubação na eficiência do pré-tratamento
foi investigado em ensaios onde a temperatura foi mantida a 120 °C e os tempos de incubação
variados entre 5 min e 120 min. Os resultados obtidos estão sumarizados na Tabela 12. Esses
experimentos foram realizados utilizando 20 g de [Emim][Ac] e 1,0 g de bagaço, de forma a
obter material pré-tratado suficiente para realizar as análises de área de superfície específica,
da cristalinidade e da morfologia dos materiais pré-tratados.
92
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
Tabela 12. Percentual de sólidos extraídos, rendimentos em glicose e xilose obtidos após
72 h de hidrólise enzimática e área de superfície específica (ASS) do bagaço pré-tratado a
120 °C por diferentes tempos de pré-tratamento.
Tempo de préSólidos
Rendimento em
Rendimento em ASS
tratamento (min) extraídos (%)
glicose (%) a
xilose (%) b
(m2/g)
in natura
23,3
14,1
1,4
5
3,5
84,5
69,2
33,0
15
7,2
93,5
75,4
35,1
30
9,7
95,3
76,0
61,2
60
12,2
99,7
74,5
106,4
120
20,1
99,8
60,0
131,9
A diferença entre as duplicatas foi menor que 5%.
a
Calculado com base no conteúdo inicial de celulose (460 mg) em 1,0 g de bagaço in natura utilizado para o prétratamento e levando em consideração o percentual de sólidos extraídos em cada condição. Resultados obtidos
após 72 h de hidrólise enzimática.
b
Calculado com base no conteúdo inicial de xilana (235 mg) em 1,0 g de bagaço in natura utilizado para o prétratamento e levando em consideração o percentual de sólidos extraídos em cada condição. Resultados obtidos
após 72 h de hidrólise enzimática.
O resultado obtido com o tratamento de 1g de bagaço a 120 °C por 120 min foi similar
ao alcançado com a configuração experimental utilizando 0,2 g de bagaço (20,1 vs 20,7% de
extração de sólidos), mostrando a reprodutibilidade do efeito do pré-tratamento nas duas
escalas experimentais. O aumento no tempo de pré-tratamento resultou em um aumento no
percentual de sólidos extraídos, de 3,5%, quando o tempo foi de 5 min, para 20,1%, quando o
pré-tratamento durou 120 min. Esse processo de extração é capaz de gerar estruturas porosas
na parede celular, o que acarreta uma melhor dissolução da celulose no líquido iônico durante
o pré-tratamento. Após a adição de água para a precipitação do produto dissolvido, um
material rico em celulose pode ser obtido, como consequência da perda de parte do material
inicial que foi extraída durante a reação e permaneceu solúvel após adição do antissolvente.
Como a lignina age como uma “capa” de proteção às fibras na biomassa in natura, sua
remoção resulta na obtenção de um produto muito mais acessível às enzimas hidrolíticas,
deixando as fibras mais expostas, o que consequentemente ocasiona também o aumento de
quase 100 vezes na área de superfície apresentada na Tabela 12, de 1,4 m2/g para o bagaço
não tratado para 131,9 m2/g para o bagaço pré-tratado por 120 min.
Os rendimentos de conversão da celulose em glicose atingiram mais de 90% após 72 h
de hidrólise enzimática quando tempos de pré-tratamento superiores a 15 min foram testados.
No entanto, quando comparados os rendimentos nas primeiras horas de hidrólise, o tempo de
pré-tratamento teve influência na cinética inicial de hidrólise (Figura 30). Este resultado
93
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
indica que, apesar de o tempo de pré-tratamento não ter uma influência muito grande no
rendimento final após 72 h de hidrólise, tempos de pré-tratamento mais longos são
importantes para manter uma alta taxa de conversão na fase inicial da sacarificação.
Figura 31. Efeito do pré-tratamento com [Emim][Ac] por diferentes tempo de incubação na hidrólise
enzimática do bagaço pré-tratado a 120 °C. ◆: in natura, ▲: 5min, ●: 15 min, ◇: 30 min, □: 60 min, ○:
120 min.
Também já foi reportado que o pré-tratamento com [Emim][Ac] pode desestruturar a
parede celular da biomassa através da ruptura da ligações de hidrogênio inter e
intramoleculares das fibras de celulose (Singh et al., 2009). Neste trabalho, o grau de
cristalinidade relativa da celulose também foi alterado de acordo com o tempo de prétratamento.
A Figura 31 mostra o perfil de difração de raios-X (DRX) do bagaço in natura e prétratado por diferentes tempos. A cristalinidade do bagaço in natura diminui como
consequência do pré-tratamento com [Emim][Ac], o que pode ser notado com o
desaparecimento, após 60 min de tratamento, da intensidade de difração do pico observado no
valor de 2θ de 15,8°, correspondente à sobreposição dos picos que equivalem aos planos
cristalinos da celulose (1,-1,0) e (1,1,0), de acordo com o índice de Miller utilizados por Sarko
e Muggli (1974). Adicionalmente, o pico correspondente ao plano cristalino (2,0,0),
correspondente a 21,9° no bagaço in natura, também diminuiu de intensidade nas amostras
pré-tratadas por 5 e 15 min, indicando a redução da cristalinidade nas amostras. Ocorreu um
94
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
considerável deslocamento do mesmo pico para materiais pré-tratados por 60 e 120 min,
sendo os ângulos de difração correspondentes a 20,8 e 20,6°, respectivamente. Esses perfis
são equivalentes ao de amostras predominantemente amorfas com provável presença de uma
pequena fração de celulose II, que pode ser formada após dissolução da celulose I, seguida da
regeneração com antissolvente (KLEMM et al., 2005). No entanto, a confirmação da
alteração do polimorfo da celulose de I para II não pode ser afirmada apenas pela técnica de
DRX. Resultados semelhantes foram obtidos em um estudo que avaliou o pré-tratamento de
switchgrass com [Emim][Ac] (SINGH et al., 2009).
Figura 32. Perfil de difração de raios-X do bagaço in natura e pré-tratado com [Emim][Ac] por diferentes
tempos de reação. As linhas, de baixo para cima, representam (a) bagaço in natura e bagaço tratado por
(b) 5 min, (c) 15 min, (d) 30 min, (e) 60 min, (f) 120 min. As linhas verticais foram traçados para facilitar a
visualização do deslocamento/desaparecimento dos picos referentes à difração de planos cristalinos da
celulose.
É sabido que a celulose cristalina apresenta uma rede de ligações de hidrogênio entre
suas cadeias que acarreta em uma alta resistência à hidrólise enzimática, enquanto a celulose
amorfa é prontamente digerida (NISHIYAMA et al., 2002). A habilidade do [Emim][Ac] de
desestruturar essa rede cristalina e extrair lignina, causa, simultaneamente, o aumento da área
de superfície e o decréscimo do grau de cristalinidade do bagaço pré-tratado, o que é
primordial para melhorar os rendimentos e aumentar a velocidade inicial de hidrólise.
A avaliação das modificações na morfologia do bagaço a nível nanoscópico ocorridas
após o pré-tratamento com [Emim][Ac] foi realizada por análises de microscopia eletrônica
95
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
de varredura (MEV) de alta resolução. A Figura 32 compara a morfologia da superfície do
bagaço in natura e após o pré-tratamento com [Emim][Ac]. O bagaço in natura apresentou
uma superfície “lisa” e compacta, enquanto a biomassa pré-tratada exibiu estruturas fibrilares
de morfologia nanoscópica da ordem de 50 nm de espessura. As estruturas observadas
confirmam o aumento expressivo na área de superfície do bagaço, o que também pode
explicar as altas taxas de hidrólise e rendimentos obtidos neste estudo, já que esse tipo de
estrutura facilita o acesso das enzimas à superfície da celulose.
Figura 33. Morfologia do bagaço in natura e pré-tratado com [Emim][Ac]. (a) in natura (X5.000), (b) in
natura (X60.000), (c) tratado com [Emim] [Ac] por 120 min (X20.000), e (d) tratado com [Emim] [Ac] por
120 min (X60.000). A marcação em vermelho em (c) representa a área magnificada, mostrada em d.
6.1.5. Fermentação alcoólica dos hidrolisados do bagaço tratado com [Emim][Ac]
A fermentação dos hidrolisados obtidos após sacarificação do bagaço pré-tratado com
[Emim][Ac] foi avaliada através da utilização da cepa floculante industrial S. cerevisiae IR-2
(KURIYAMA et al., 1985). Este foi um experimento preliminar realizado apenas para
verificar se a possível presença de traços de [Emim][Ac], remanescentes após a lavagem da
biomassa pré-tratada, poderiam interferir na eficiência da fermentação alcoólica. Dessa forma,
96
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
as condições de fermentação utilizadas não foram estudadas, sendo utilizadas condições
previamente reportadas na literatura (MATSUSHIKA et al., 2009).
A Figura 33 mostra os perfis das fermentações realizadas. A composição dos
hidrolisados, do meio de referência utilizado como controle e dos rendimentos de etanol estão
presentes nas Tabelas 13.
Figura 34. Perfis das fermentações dos hidrolisados da biomassa pré-tratada com [Emim][Ac] (linhas
sólidas) e das soluções controle (linhas tracejadas). (a) concentração de ( ●) glicose e (□) etanol ao longo da
fermentação; (b) concentração de (∆) xilose ao longo da fermentação com a linhagem de S. cerevisiae IR-2.
Nas fermentações dos hidrolisados, foi observada uma depleção da glicose em 3 horas
de fermentação (Figura 33a) e a xilose não foi metabolizada, como esperado (Figura 33b).
Independentemente da maior concentração de glicose inicial na solução controle, a cinética de
consumo da glicose neste meio foi um pouco mais lenta, tendo sido completamente
consumida após 7 h de fermentação. Essa diferença não foi investigada, mas pode estar
relacionada a uma variação no pH da solução controle ao longo da fermentação.
Neste intervalo de tempo, as concentrações de etanol atingiram uma média de 12,6
g/L e 16,4 g/L a partir dos hidrolisados e das soluções controle, respectivamente. Os altos
rendimentos em etanol próximos a 100% (Tabela 13), considerando o rendimento máximo
teórico para o metabolismo da glicose, indicam que os xaropes de açúcares utilizados não
contem inibidores da fermentação alcoólica ou que traços de LI presentes não interferiram no
processo. O rendimento obtido para o hidrolisado 2 de 103% (Tabela 13) pode estar
relacionado à fermentação de outros monossacarídeos presentes nos hidrolisados em menor
concentração, como a galactose, ou por uma pequena evaporação do meio.
97
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
Tabela 13. Composição do hidrolisado, produção de etanol e rendimentos de etanol após 24
horas de fermentação com a cepa industrial floculante S. cerevisiae IR-2.
Meio
Hidrolisado
1
Hidrolisado
2
Controle
1
Controle
2
Composição do hidrolisado
(g/L)
Glicose
Xilose
Etanol
(g/L)
Rendimento
em etanol
(g/g)
Rendimento
teórico (%)
25,0
7,5
12,56
0,502
98,2
24,0
7,3
12,65
0,527
103,0
33,9
12,0
16,85
0,506
99,0
33,3
11,8
15,78
0,474
92,8
6.1.6. Considerações finais – Parte I
O [Emim][Ac] foi selecionado entre seis líquidos iônicos testados por ser capaz de
promover um aumento significativo nos rendimentos finais e nas taxas iniciais de
sacarificação do bagaço. Um aumento na extração de componentes da biomassa para a fração
líquido iônico-água, conjuntamente com o aumento na ASS e a diminuição da cristalinidade,
foram observados paralelamente ao aumento na temperatura e tempo de pré-tratamento. A
observação da morfologia mostrou que o bagaço pré-tratado apresentou uma característica
com fibras finas em escala nanométrica. Os resultados apresentados foram publicados em
2011 na revista Bioresource Technology (Anexo 1), tendo sido o primeiro trabalho publicado
a utilizar o [Emim][Ac] para o pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar, que seja do nosso
conhecimento.
98
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
Parte II
6.2. Avaliação da necessidade de celobioidrolases (CBH) nas misturas enzimáticas para
hidrólise de materiais pré-tratados com líquido iônico
Na Parte I deste trabalho, o pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar com o líquido
iônico [Emim][Ac] foi realizado com sucesso. Como discutido, uma das características do
pré-tratamento com [Emim][Ac] que o fazem eficiente está relacionada ao fato deste reagente
ser capaz de reduzir a cristalinidade da celulose drasticamente, tendo vários trabalhos
reportado os materiais pré-tratados como praticamente amorfos.
Adicionalmente, o pré-tratamento com moinho de bolas (MB), estudado pelo nosso
grupo anteriormente (SILVA et al., 2010), também é comumente reportado como sendo capaz
de reduzir a cristalinidade da celulose (HIDENO et al., 2008; INOUE et al., 2008; BUABAN
et al., 2010)
Logo, como as celobioidrolases (CBH) são enzimas conhecidas pela sua atuação
eficiente nas regiões cristalinas da celulose (CAO e TAN, 2002), enquanto as endoglucanases
(EG) são descritas como importantes para a despolimerização da celulose, atuando
principalmente em regiões amorfas (CAO e TAN, 2002; AL-ZUHAIR, 2008), é possível
conjecturar que a hidrólise efetiva de biomassas com reduzida cristalinidade requer uma
menor dosagem de CBH e pode ser eficientemente realizada por EGs.
Dessa forma, para investigar sobre a necessidade de CBH para a hidrólise de materiais
celulósicos com reduzida cristalinidade, o desempenho de coquetéis enzimáticos livres de
CBH foi avaliado na hidrólise do bagaço e da celulose microcristalina pré-tratados por 120
minutos com MB e LI. Para tal, foram utilizados três coquetéis enzimáticos diferentes: (i)
uma mistura de duas enzimas hipertermofílicas purificadas, contendo uma endoglucanase de
Pyrococcus horikoshii (EGPh) (ANDO et al., 2002) e uma β-glucosidase de Pyrococcus
furiosus (BGPf) (KADO et al., 2011), ambas expressas em Escherichia coli; (ii) a enzima
comercial OptimashTM BG (Genencor® International, EUA), caracterizada pelo fabricante
como uma enzima para redução da viscosidade e neste estudo como uma mistura de
hemicelulases, endoglucanases e β-glicosidase, sem atividade contra a celulose cristalina; (iii)
a enzima comercial Acremonium Cellulase (Meiji Seika Co., Japão), um coquetel enzimático
completo para a hidrólise da lignocelulose, rico em CBH. As hidrólises com a mistura
hipertermofílica foram realizadas a 85 °C, enquanto com as outras duas enzimas a 45 °C.
99
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Resultados e Discussão
Na Figura 34 está representado o esquema experimental utilizado nessa etapa do
trabalho. Os resultados da hidrólise do bagaço e da celulose pré-tratados com MB e LI por
essas enzimas estão descritos a seguir.
Figura 35. (a) Etapas experimentais realizadas para a avaliação da necessidade de celobioidrolases na
hidrólise de biomassas com cristalinidade reduzida. (b) Bagaço e celulose pré-tratados com moinho de
bolas (MB) e líquico iônico (LI).
6.2.1 Requerimento de celobioidrolases (CBH) para a hidrólise do bagaço pré-tratado
A composição dos bagaços pré-tratados com MB e LI utilizados nessa etapa do estudo
está apresentada na Tabela 14. Enquanto o pré-tratamento com MB não alterou a composição
do bagaço, o LI ocasionou a diminuição das frações de lignina e hemicelulose. O bagaço in
natura utilizado nas Partes II e III deste trabalho foi proveniente de um lote diferente do
utilizado na Parte I, apresentando a mesma composição descrita na Tabela 14 para o bagaço
pré-tratado com MB.
Tabela 14. Composição do bagaço pré-tratado expressa em percentual da matéria seca.
Pré-tratamento
Celulose (%)
Xilana (%)
Lignina (%)
Moinho de bolas
41,9 ± 1,15
25,0 ± 0,65
22,7 ± 0,86
Líquido iônico
50,9 ± 0,92
22,5 ± 0,34
15,7 ± 0,35
Valores calculados como médias de triplicatas de análise.
Os rendimentos de hidrólise do bagaço pré-tratado com MB e LI com as diferentes
enzimas estão apresentados nas Tabelas 15 e 16, respectivamente. A hidrólise enzimática do
bagaço in natura, que não está mostrada nas Tabelas, alcançou rendimentos máximos de
conversão da celulose em glicose de apenas 20% e 3% utilizando as enzimas Acremonium
Cellulase e a mistura EGPh/BGPf, respectivamente, mostrando que na ausência de CBH a
hidrólise da biomassa não tratada é praticamente nula.
100
Resultados e Discussão
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Tabela 15. Rendimentos da hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com moinho de bolas
utilizando as enzimas EGPh/BGPf, Optimash BG e Acremonium Cellulase.
Rendimento de hidrólise (%)
Glicose
Xilose
Celobiosea
Glicose
Optimash
Glicose
BG
teóricab
Xilose
Celobiose
Acremonium
Glicose
Cellulase
Xilose
EGPh/BGPf
3h
10,3
0,0
9,8
15,6
6h
13,8
0,0
10,1
22,5
9h
18,2
2,0
10,2
27,6
24 h
25,7
4,1
10,6
42,3
48 h
32,4
10,8
9,3
55,3
72 h
33,4
10,8
6,1
62,1
25,32
15,5
13,2
58,6
6,4
32,6
23,9
9,2
76,2
9,5
37,8
30,2
7,3
86,4
11,6
52,9
43,2
3,8
91,1
16,5
64,7
49,3
0,00
93,2
21,6
68,1
51,8
0,00
93,3
24,7
a
b
Celobiose: rendimento considerando a conversão total da celobiose acumulada em glicose; Glicose teórica:
rendimento considerando a soma da concentração da glicose obtida àquela que seria proveninete da conversãod a
celobiose
Tabela 16. Rendimentos da hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com o LI [Emim][Ac]
utilizando as enzimas EGPh/BGPf, Optimash BG e Acremonium Cellulase.
Rendimento de hidrólise (%)
Glicose
Xilose
Celobiosea
Glicose
Optimash
Glicose
BG
teóricab
Xilose
Celobiose
Acremonium
Glicose
Cellulase
Xilose
EGPh/BGPf
a
3h
33,7
0,0
21,6
18,1
6h
43,1
0,0
21,3
25,9
9h
50,7
6,7
22,7
32,5
24 h
65,4
15,9
24,9
46,6
48 h
70,9
24,8
21,9
58,9
72 h
72,4
27,5
20,2
67,5
39,6
25,1
12,5
58,2
6,4
47,1
38,4
9,1
73,3
10,5
55,2
46,0
6,66
84,0
11,9
71,4
53,8
2,04
98,9
16,4
80,7
58,3
0,00
100,0
23,1
87,7
61,7
0,0
100,0
22,01
b
Celobiose: rendimento considerando a conversão total da celobiose acumulada em glicose; Glicose teórica:
rendimento considerando a soma da concentração da glicose obtida àquela que seria proveninete da conversãod a
celobiose
Perfis de hidrólise análogos foram observados para a hidrólise do bagaço pré-tratado
com MB e LI com a enzima Acremonium Cellulase, resultando em 93% e 100% de
rendimento em glicose em 72 h de sacarificação, respectivamente. A hidrólise do bagaço prétratado com MB e LI com a enzima Optimash também resultou em perfis similares, tendo
alcançado 62% e 67% de rendimento em glicose em 72 h, respectivamente. No entanto,
quando a enzima Optimash foi utilizada, um acúmulo significativo de celobiose foi observado
nos hidrolisados do bagaço pré-tratado com LI, o que indicou uma quantidade insuficiente de
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
101
Resultados e Discussão
β-glicosidase nessa preparação enzimática, já que essa enzima é essencial para evitar o
acúmulo de celobiose. De fato, a razão das atividades de CMCase: β-glucosidase na Optimash
de 67:1 foi significativamente maior que a calculada para as enzimas Acremonium Cellulase
(3:1) e EGPh/BGPf (5:1), onde não se detectou um acúmulo de celobiose acentuado. A
conversão da celobiose acumulada no hidrolisado do bagaço pré-tratado com LI em glicose
resultaria em um aumento do rendimento em 72 h de 67% para 87%. Para facilitar a
visualização, os rendimentos e as concentrações de glicose obtidas ao longo da hidrólise
também estão representados na Figura 35.
Figura 36. Perfis de hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com (a) MB e (b) LI utilizando as enzimas
EGPh/BGPf, Optimash e Acremonium Cellulase. A linha tracejada representa o rendimento teórico em
glicose obtido com a Optimash considerando a conversão da celobiose em glicose.
Comparando a hidrólise do bagaço pré-tratado com MB utilizando a Optimash e
EGPh/BGPf, os rendimentos em glicose obtidos com a Optimash foram cerca de duas vezes
maiores. Os maiores rendimentos em xilose, de 51% e 61% para o bagaço pré-tratado com
MB e LI, respectivamente, também foram observados na hidrólise com a Optimash. Logo, a
presença de atividades hemicelulolíticas diversificadas na Optimash poderia estar
contribuindo para o aumento da acessibilidade das endoglucanases à celulose, através da
hidrólise da xilana. Já os baixos rendimentos em xilose obtidos com a enzima Acremonium
Cellulase são reflexo da sua baixa atividade de β-xilosidase, já reportada por Inoue et al.
(2008), o que leva a um acúmulo de xilobiose nos hidrolisados que não é convertida a xilose.
No entanto, a Acremonium Cellulase é capaz de promover uma efetiva despolimeração da
xilana a oligossacarídeos, pois a preparação é rica em endoxilanases, o que também reflete no
aumento da acessibilidade das celulases à celulose, não obstante o baixo rendimento em
xilose (SILVA, 2010).
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
102
Resultados e Discussão
A Optimash também teve melhor desempenho que a mistura EGPh/BGPf
considerando a hidrólise do bagaço pré-tratado com LI. No entanto, a diferença de
desempenho não foi tão acentuada quanto aquela observada na hidrólise do bagaço prétratado com MB, o que pode estar relacionado ao fato do pré-tratamento com LI remover
parte da lignina e da hemicelulose. Essa remoção aumenta a razão de celulose/hemicelulose
no material pré-tratado, o que pode, em parte, reduzir a necessidade de hemicelulases para
expor a celulose ao ataque da EGPh. Esse sinergismo de atuação das celulases e
hemicelulases já foi amplamente descrito (HU et al., 2011; BARR et al., 2012; GAO et al.,
2011). Barr e colaboradores (2012) estudaram a hidrólise enzimática de amostras de
switchgrass pré-tratada com [Emim][Ac] utilizando diferentes dosagens e misturas de CBH,
EG, BG e hemicelulases e reportaram uma melhora significativa nos rendimentos tanto de
xilana quanto de glucana após o aumento da atividade de xilanase, quando a dosagem de
celulases foi mantida constante.
A mistura EGPh/BGPf teve um desempenho melhor na hidrólise do bagaço prétratado com LI, alcançando um rendimento em glicose de 73%, contra apenas 33% na
hidrólise do bagaço pré-tratado com MB. Esse resultado pode ser justificado também por
outros fatores além da remoção de parte da lignina e da hemicelulose pelo LI, como pela
avaliação da cristalinidade do resíduo obtido antes e após a hidrólise enzimática (Figura 36a).
Após ambos pré-tratamentos, ocorreu uma variação significativa nos padrões de difração,
como já discutido no item 6.1.4 para o pré-tratamento com LI e por Silva et al. (2010), para o
pré-tratamento com MB. No entanto, os perfis de DRX do material residual obtido após a
hidrólise enzimática com EGPh/BGPf e Optimash, mostrado na Figura 36b, indicam a
presença de material cristalino, sugerindo que as técnicas de pré-tratamento não foram
suficientes para destruir completamente a estrutura cristalina da celulose, que ficou exposta no
resíduo recuperado após a hidrólise das porções amorfas. Park e colaboradores (2010)
discutiram que a conversão da celulose amorfa produz mais regiões amorfas, pois a hidrólise
das fibras superficiais mais desordenadas gera a exposição de cadeias internas que, quando
expostas à superfície, se tornam menos ordenadas e mais susceptíveis ao ataque enzimático.
No entanto, foi observado nesse estudo que a hidrólise de materiais com baixa cristalinidade
por EG e BG leva à exposição de estruturas mais cristalinas e mais resistentes ao ataque
enzimático. O material residual recuperado após a hidrólise do bagaço tratado com MB
apresentou um padrão de difração que sugere que esse material é mais cristalino que o resíduo
da hidrólise do bagaço tratado com LI, o que indica que o tratamento por MB é menos
eficiente na redução da cristalinidade e corrobora os resultados de hidrólise obtidos.
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
103
Resultados e Discussão
Figura 37. Perfis de difração de raios-X do bagaço in natura e pré-tratado com (a) moinho de bolas e (b)
líquido iônico antes e após a hidrólise enzimática com Optimash e EGPh/BGPf.
6.2.2. Requerimento de celobioidrolases (CBH) para a hidrólise da celulose pré-tratada
A celulose microcristalina também foi utilizada como um modelo para entender
melhor a correlação entre a diminuição da cristalinidade pelo pré-tratamento com LI e o
requerimento de CBH, já que neste material não existe a interferência da presença de
hemicelulose e lignina. Para facilitar a visualização, além nas Tabelas 17 e 18, os rendimentos
em glicose estão representados também na Figura 37.
Figura 38. Perfis de hidrólise enzimática da celulose pré-tratada com (a) MB e (b) LI utilizando as enzimas
EGPh/BGPf, Optimash e Acremonium Cellulase. A linha tracejada representa o rendimento teórico em
glicose obtido com a Optimash considerando a conversão da celobiose acumulada em glicose.
104
Resultados e Discussão
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Tabela 17. Rendimentos da hidrólise enzimática da celulose pré-tratada com moinho de bolas
utilizando as enzimas EGPh/BGPf, Optimash BG e Acremonium Cellulase.
Rendimento de hidrólise (%)
EGPh/BGPf
3h
6h
9h
24 h
48 h
72 h
6,3
10,4
13,2
26,8
43,1
54,9
Celobiose
2,6
2,8
3,2
4,9
5,5
5,7
Glicose
4,9
7,1
8,9
15,1
21,9
27,2
Glicose
teóricab
7,5
9,9
12,1
20,0
27,4
32,9
Glicose
16,5
25,7
30,6
44,3
65,6
Glicose
a
Optimash
BG
Acremonium
Cellulase
a
77,6
b
Celobiose: rendimento considerando a conversão total da celobiose acumulada em glicose; Glicose teórica:
rendimento considerando a soma da concentração da glicose obtida àquela que seria proveninete da conversãod a
celobiose
Tabela 18. Rendimentos da hidrólise enzimática da celulose pré-tratada com o líquido iônico
utilizando as enzimas EGPh/BGPf, Optimash BG e Acremonium Cellulase.
Rendimento de hidrólise (%)
EGPh/BGPf
3h
6h
9h
24 h
48 h
72 h
72,4
78,0
81,4
85,3
86,0
84,1
Celobiose
13,9
14,8
14,8
13,1
10,0
9,6
Glicose
11,4
15,2
17,7
26,2
34,1
37,3
Glicose
teóricab
25,2
30,0
32,5
39,3
44,1
46,9
40,7
54,0
63,0
83,8
88,7
88,9
Glicose
a
Optimash BG
Acremonium
Cellulase
a
Glicose
b
Celobiose: rendimento considerando a conversão total da celobiose acumulada em glicose; Glicose teórica:
rendimento considerando a soma da concentração da glicose obtida àquela que seria proveninete da conversãod a
celobiose
Em 72 h de hidrólise utilizando as enzimas Acremonium, EGPh/BGPf e Optimash, o
rendimento em glicose foi de 77%, 55% e 27% para a celulose pré-tratada com MB e de 88%,
85% e 37% para a celulose pré-tratada com LI, respectivamente. Do mesmo modo que
observado para o bagaço, o pré-tratamento com LI foi mais efetivo que o pré-tratamento com
MB para reduzir a recalcitrância da celulose microcristalina. O pré-tratamento com LI
favoreceu a hidrólise da celulose pela mistura EGPh/BGPf, o que pode ser observado não só
pelo rendimento final em 72 h, mas pela rápida cinética de hidrólise, atingindo 72% de
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
105
Resultados e Discussão
conversão após 3 h de sacarificação. A produtividade em glicose atingida com a mistura
EGPh/BGPf foi superior à obtida com a Acremonium Cellulase pelo menos até 9 h de
hidrólise enzimática. Adicionalmente, o rendimento em glicose da hidrólise com EGPh/BGPf
da celulose pré-tratada com LI e BM em 72 h foi mais de duas vezes superior ao da hidrólise
com a Optimash, oposto ao que foi observado para a hidrólise do bagaço pré-tratado. Logo,
apesar de todas as preparações enzimáticas terem apresentado a mesma carga enzimática,
baseada na atividade de CMCase, a menor eficiência da Optimash na hidrólise da celulose
também poderia estar relacionada à diferença no mecanismo catalítico das EG e BG contidas
nessa preparação em relação ao mecanismo da EGPh e da BGPf. A EGPh, classificada como
uma glicosil hidrolase da família 5 (GH5), foi descrita como capaz de hidrolisar celooligossacarídeos de até 5 unidades (ANDO et al., 2002) e de liberar celobiose eficientemente
após o ataque inicial para despolimerizar as cadeias de celulose (KIM e ISHIKAWA, 2010).
Já a BGPf, classificada como uma glicosil hidrolase da família 1 (GH1), foi descrita como
sendo capaz de hidrolisar diversos substratos, sendo mais eficiente na hidrólise de celooligossacarídeos (BAUER et al., 1996; KAPER et al., 2000). O sinergismos de atuação na
liberação/hidrólise de celo-oligosacarídeos pela EGPh e pela BGPf pode não ocorrer na
Optimash, já que a especificidade por substratos varia muito de uma enzima para outra. Além
disso, Ando e colaboradores (2002) também reportaram que a EGPh tem a capacidade de
hidrolisar moderadamente a celulose cristalina, o que também poderia contribuir para o seu
melhor desempenho em comparação com a Optimash.
Esse dado foi confirmado no presente estudo, já que a hidrólise da celulose
microcristalina não tratada resultou em rendimentos em glicose após 72 h de 13%, 2,8% e
68% utilizando as preparações EGPh/BGPf, Optimash e
Acremonium, respectivamente,
mostrando uma atividade modesta da EGPh na hidrólise da celulose microcristalina e uma alta
eficiência da enzima Acremonium Cellulase. É interessante notar que a hidrólise da celulose
microcristalina não tratada com a Acremonium Cellulase resultou em rendimentos em glicose
3,4 vezes maiores que os obtidos para a hidrólise do bagaço (68% vs 20%). Esse resultado
corrobora as constatações de que a presença de lignina e hemicelulose dificulta a hidrólise
eficiente da celulose presente na biomassa lignocelulósica.
Os perfis de DRX da celulose não tratada, pré-tratada e dos resíduos obtidos após a
hidrólise estão mostrados na Figura 38. A hidrólise da celulose pré-tratada com EGPh/BGPf
não resultou em material residual suficiente após 72 h de hidrólise para realizar as análises de
DXR. Três picos em 2θ igual a 15,00° (1-10), 16,38° (110) e 22,52°(200) confirmaram a
estrutura cristalina reportada para a celulose I. No entanto, o padrão de difração observado
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
106
Resultados e Discussão
para o resíduo da hidrólise da celulose pré-tratada com MB indica a presença de um arranjo
cristalino diverso, com dos dois picos em 2θ iguais a 20,1° e 21,53°, indicando a formação da
celulose II.
O perfil de DRX do material residual recuperado após hidrólise com Optimash do
bagaço pré-tratado com LI também sugere a formação de celulose II, apesar dos picos serem
mais discretos (ver Figura 36b). Alguns trabalhos já reportaram a transformação da celulose I
em celulose II após o pré-tratamento da celulose com [Amim][Cl] (ZHANG et al., 2005) e
[BMIM][Cl] (XIAO et al., 2012). No entanto, na busca bibliográfica realizada não foram
encontrados relatos dessa transformação para a biomassa lignocelulósica, já que essa
observação é difícil de ser feita no material pré-tratado, tendo sido possível somente após a
hidrólise das estruturas amorfas por EG.
Figura 39. Perfis de difração de raios-X da celulose não tratada e pré-tratada com (a) moinho de bolas e
(b) líquido iônico antes e após a hidrólise enzimática com Optimash e EGPh/BGPf.
6.2.3. Avaliação da área de superfície específica
A área de superfície específica (ASS) do bagaço e da celulose não tratados, prétratados e dos resíduos obtidos após as hidrólises enzimáticas estão apresentadas na Tabela
19. O pré-tratamento com MB teve um efeito pouco significativo na alteração da ASS. Apesar
107
Resultados e Discussão
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
de o pré-tratamento por MB resultar na pulverização do material, gerando uma distribuição de
tamanho de partícula da ordem de 10 a 100 µm (SILVA et al., 2010) (Tabela 19), parece que
não há influência na porosidade do material ou que há ocorrência de compactação/agregação
do mesmo. Já o pré-tratamento com LI, além de aumentar a área de superfície do bagaço,
como já reportado no tópico 6.1.4, também teve um efeito proeminente sobre a celulose
microcristalina, aumentando a ASS de 1,2 para 336,5 m2/g.
Tabela 19. Área de superfície específica do bagaço e da celulose não tratados, tratados com
moinho de bolas (MB) e tratados com líquido iônico (LI) antes da hidrólise enzimática e após
72 h de hidrólise com EGPh/BGPf e Optimash BG.
ASS (m2/g)
Amostra
Antes da
hidrólise
Hidrólise com
EGPh/BGPf
Hidrólise com
Optimash BG
Bagaço nativo
0,8
8,3
*
1,3
97,6
116,1
135,2
65,4
42,7
1,2
33,8
*
0,6
25,6
36,21
336,5
nd
171,3
Bagaço prétratado com MB
Bagaço prétratado com LI
Celulose nativa
Celulose prétratada com MB
Celulose prétratada com LI
nd: não determinado, pois o material residual ao final da hidrólise não foi suficiente.
* Experimento não realizado.
As taxas iniciais de hidrólise mais baixas observadas para as hidrólises com
EGPh/BGPf e a Optimash após pré-tratamento com MB tanto da celulose quanto do bagaço,
podem estar relacionadas ao fato do pré-tratamento com MB afetar em parte a cristalinidade,
mas não alterar a ASS, diferentemente do que ocorre com os materiais pré-tratados com LI,
onde ambos efeitos são observados. Os valores da ASS dos produtos residuais após 72h de
hidrólise do bagaço pré-tratado por MB com EGPh/BGPf e Optimash foi 78 e 92 vezes
maiores que antes da hidrólise, respectivamente. Já os materiais pré-tratados com LI, que
apresentaram uma ASS muito elevada após o pré-tratamento, tiveram a ASS diminuída no
resíduo recuperado, devido à hidrólise enzimática efetiva das fibras expostas pelo prétratamento.
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
108
Resultados e Discussão
6.2.4. Considerações finais - Parte II
Nessa parte do estudo, a interdependência entre o tipo de pré-tratamento da biomassa e
o requerimento de diferentes enzimas para a hidrólise foi discutida. Apesar de o bagaço e da
celulose pré-tratados com MB terem apresentado um padrão de DRX com um pico largo em
20,5°, o que corresponde a um material predominantemente amorfo, a presença da atividade
de CBH na enzima Acremonium Cellulase foi essencial para uma hidrólise eficiente desses
materiais. A enzima Acremonium Cellulase aumentou os rendimentos de hidrólise da celulose
e do bagaço pré-tratados com MB de 54% e 33%, obtidos com a mistura EGPh/BGPf, para
78% e 94%, respectivamente.
Em contraste, uma hidrólise efetiva com a mistura EGPh/BGPf da celulose e do
bagaço pré-tratados com LI foi obtida, sugerindo um requerimento menor de CBH para a
hidrólise desses materiais. A mistura EGPh/BGPf resultou em 72% de rendimento em glicose
após 72 h de hidrólise do bagaço pré-tratado com LI e após apenas 3 h de hidrólise da
celulose pré-tratada com LI, alcançando um rendimento final de 84% após 72 h.
Esses resultados estão de acordo com o relato de Barr e colaboradores (2012), que
descreveram que baixos níveis de CBH foram necessários apenas para a hidrólisar a celulose
cristalina residual em amostras de Poplus nigra e switchgrass pré-tratadas com o mesmo LI
utilizado neste estudo, enquanto o aumento da carga de EG dobrou o rendimento em glicose
para Poplus nigra e teve um aumento moderado para a hidrólise do switchgrass.
Apesar de várias enzimas requeridas para uma hidrólise da celulose e da hemicelulose
já terem sido expressas com alta eficiência em microrganismos fermentativos (VIIKARI et
al., 2012), um menor requerimento de CBH para hidrólise de materiais pré-tratados pode
facilitar a obtenção de um processo de conversão da celulose a etanol em uma única etapa.
Isso porque os microrganismos fermentativos poderiam expressar somente endoglucanases e
β-glicosidases ou serem expressas conjuntamente com uma CBH que não precisaria ser
secretada em quantidades acentuadas. De fato, o aumento da atividade específica e da
secreção de CBHs expressas em Saccharomyces cerevisiae é um grande desafio na construção
de linhagens efetivas para a hidrólise da celulose cristalina, já que os relatos de secreção de
CBHs clonadas em S. cerevisiae estão na faixa de 0,002-1% do total de proteínas celular
(HANN et al., 2013). Apenas recentemente foram descritas construções de linhagens capazes
de secretar níveis mais elevados, correspondentes a 4% do total de proteínas (ILMEN et al.,
2011; YAMADA et al., 2010).
Nesse sentido, Hann e co-autores (2007) expressaram genes da endoglucanase de T.
reesei (EG I) e β-glicosidase de Saccharomycopsis fibuligera em S. cerevisiae e foram bem
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
109
Resultados e Discussão
sucedidos em obter etanol a partir de celulose amorfa, pré-tratada com ácido fosfórico. A
expressão da CBH II e da EG II de T. reesei e da β-glicosidase de Aspergillus aculeatus em S.
cerevisiae também levou à produção de etanol a partir da celulose pré-tratada com
[Emim]DEP (NAKASHIMA et al., 2011).
Além disso, as enzimas hipertermofílicas são promissoras para a hidrólise da biomassa
em processos que utilizem LIs, já que foram descritas como tolerantes a quantidades de até
20% de [Emim][Ac] e [Bmim][Cl] (TURNER et al., 2007; DATTA et al., 2010; PARK et al.,
2012), enquanto enzimas de fungos mesofílicos, como as celulases provenientes de T. reesei,
são normalmente inativadas na presença de quantidades residuais da maioria dos LIs
utilizados para o pré-tratamento da biomassa (TURNER et al., 2003). No entanto, é preciso
avaliar a eficiência das enzimas termofílicas na temperatura de crescimento de
microrganismos fermentativos para a obtenção de um bioprocesso consolidado efetivo.
Em resumo, a possibilidade de utilização de coquetéis enzimáticos que não contêm
CBH ou com reduzida quantidade da mesma, propiciada pelo tratamento com LI, pode reduzir
o custo das enzimas ou facilitar o desenvolvimento de um processo de conversão da celulose a
etanol em apenas uma etapa.
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
110
Resultados e Discussão
Parte III
6.3. Pré-tratamento do bagaço em alta carga de sólidos com o líquido iônico [Emim][Ac]
Na primeira parte deste trabalho, descrita nos tópicos anteriores, o líquido iônico
[Emim][Ac] foi utilizado para o pré-tratamento do bagaço de forma convencional, ou seja,
aplicando o conceito do líquido iônico como um solvente parcial ou total da biomassa. Dessa
forma, uma proporção de bagaço:[Emim][Ac] de 1:20 foi utilizada em todos os ensaios.
No entanto, na etapa descrita a seguir, uma nova proposta de uso do líquido iônico foi
colocada em prática, onde não mais se pensou em utilizar o [Emim][Ac] como um solvente,
mas como um aditivo químico capaz de promover transformações na estrutura do bagaço,
visando assim reduzir substancialmente a carga de líquido iônico necessária para um prétratamento eficiente. Para tal, o uso de um sistema de mistura eficiente foi necessário para
promover a interação efetiva do líquido iônico com todo o bagaço em alta carga de sólidos na
temperatura correta. Nesse sentido, uma extrusora de dupla-rosca foi escolhida como um
sistema promissor, pois seria possível promover uma mistura eficaz da biomassa com o
líquido iônico e, ao mesmo tempo, controlar a temperatura de reação, além do tempo de prétratamento (através do design da rosca e da velocidade de alimentação). Mais importante
ainda, como a extrusão constitui um processo contínuo, grandes quantidades de biomassa
podem ser processadas, representando assim uma grande vantagem em relação aos sistemas
de pré-tratamento em batelada.
6.3.1. Efeito da carga de biomassa e do número de ciclos de extrusão na eficiência do
pré-tratamento
O efeito de diferentes razões de bagaço:[Emim][Ac] foi avaliado através de
experimentos que utilizaram razões correspondentes a 1:1, 1:3, 1:5 e 1:8, a 140 °C. Com o
objetivo de aumentar o tempo de pré-tratamento, as misturas de bagaço-[Emim][Ac] foram
extrusadas e realimentadas no extrusor por até três ciclos de extrusão. A temperatura de prétratamento foi escolhida de acordo com testes preliminares realizados em uma faixa de 130150 °C, que indicaram a temperatura de 140 °C como potencialmente favorável.
Para as condições que utilizaram as razões de 1:1 e 1:3, três ciclos de extrusão foram
realizados, enquanto para os pré-tratamentos utilizando as razões de 1:5 e 1:8, apenas dois
ciclos de extrusão foram efetuados. As amostras resultantes de um terceiro ciclo de extrusão,
utilizando as razões de 1:5 e 1:8, apresentaram um endurecimento, provavelmente devido à
carbonização parcial da biomassa, dificultando o processamento para as análises de
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
111
Resultados e Discussão
composição química; por isso estas amostras foram descartadas do estudo. A composição
química das amostras pré-tratadas, caracterizadas de acordo com o protocolo do NREL, está
mostrada na Tabela 20.
Tabela 20. Composição química das amostras pré-tratadas com diferentes razões de
bagaço:[Emim][Ac] e por diferentes ciclos de extrusão. Os resultados representam a média de
pelo menos duas replicatas.
Composição da biomassa (%)
Amostra
Lignina
Glicana
Xilana
22,7
41,9
25,0
Bagaço in natura
1:1 - 1 ciclo
21,5
45,6
26,1
1:1 - 2 ciclos
20,9
46,3
24,3
21,6
47,4
24,8
1:1 - 3 ciclos
20,9
44,8
26,5
1:3 - 1 ciclo
19,8
46,4
26,2
1:3 - 2 ciclos
20,4
46,7
26,8
1:3 - 3 ciclos
19,9
44,6
25,6
1:5 - 1 ciclo
19,0
45,8
25,0
1:5 - 2 ciclos
1:8 - 1 ciclo
18,6
46,9
26,5
1:8 - 2 ciclos
19,3
46,6
25,1
As condições de pré-tratamento utilizadas não resultaram em uma redução acentuada
do conteúdo original de lignina, ao contrário dos resultados mostrados no item 6.2.1, onde o
pré-tratamento do bagaço com a razão de 1:20 resultou em uma deslignificação acentuada.
Outros estudos também já reportaram valores de deslignificação maiores que 40% em
biomassas pré-tratadas com baixo teor de sólidos (~5%) com [Emim][Ac] (LEE et al, 2009a;
DOHERTY et al., 2010). Em concordância com os resultados apresentados, Wu e coautores
(2011) também reportaram uma deslignificação máxima de 15% quando o pré-tratamento da
palha de milho foi realizado com uma razão de biomassa:[Emim][Ac] de 1:2 a 130 ºC, por 1
h.
A Figura 39 apresenta os rendimentos em glicose e xilose após 24 h de hidrólise
enzimática do bagaço tratado com [Emim][Ac] com o auxílio da extrusora de dupla-rosca.
Todas as condições de pré-tratamento resultaram em rendimento em glicose e xilose após 24
h de hidrólise de no mínimo 3,5 e 6,9 vezes maiores, respectivamente, que o bagaço in natura.
O número de ciclos de extrusão teve um efeito significativo nos rendimentos em glicose
principalmente para as condições que utilizaram razões de bagaço:[Emim][Ac] de 1:1 e 1:3. O
aumento do número de ciclos de um para três para a razão de 1:1 resultou em um aumento nos
rendimentos em glicose de 59,4% para 76,4%, enquanto, para a razão de bagaço:[Emim][Ac]
112
Resultados e Discussão
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de 1:3, a realização do segundo ciclo de extrusão promoveu um aumento nos rendimentos em
glicose de 10% em relação ao primeiro ciclo (de 81,6% para 91%) e a execução de um
terceiro ciclo não teve efeito significativo.
Figura 40. Efeito da razão de bagaço:[Emim][Ac] utilizada e do número de ciclos de extrusão realizados
durante o pré-tratamento nos rendimentos em glicose e xilose obtidos após 24 h de hidrólise enzimática
das amostras pré-tratadas. NT representa o bagaço não tratado (in natura). Todos os experimentos de
pré-tratamento foram realizados a 140 °C.
Considerando as condições que utilizaram as razões de 1:3 (a partir do segundo ciclo
de extrusão), 1:5 e 1:8, os rendimentos em glicose obtidos após apenas 24 h de sacarificação
foram similares, estando numa faixa de 86,7% a 92,9%. Esses valores de rendimento são tão
altos quanto os obtidos em estudos que utilizaram menores cargas de biomassa e períodos
longos de incubação (o tempo de residência médio da mistura bagaço-LI no cilindro extrusão
foi de apenas 4 min). Por exemplo, Zhang e coautores (2012a) reportaram um rendimento de
90,5% na hidrólise do bagaço pré-tratado com [Bmim][Cl]-HCl a 130 °C por 30 min
utilizando uma razão de bagaço:LI de 1:10. Em outro estudo, 96% de digestibilidade da
celulose
foi
obtido
após
pré-tratamento
de
switchgrass
com
uma
razão
de
biomassa:[Emim][Ac] de 1:33 por 3 h e 160 °C (LI et al., 2010). Ainda, 90% de rendimento
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
113
Resultados e Discussão
em glicose foi reportado para a sacarificação de amostras de madeira pré-tratadas com uma
razão de biomassa:[Emim][Ac] de 1:20 por 1,5 h e 110 °C (LEE et al., 2009a).
A avaliação do efeito da carga de biomassa na eficiência do pré-tratamento da palha de
milho também foi avaliada em um estudo recente (WU et al., 2011). Rendimentos em glicose
de ~80% foram reportados para razões de palha de milho:[Emim][Ac] em uma faixa de 1:2 1:10 e de 55% para uma razão de palha de milho:[Emim][Ac] de 1:1. Esses rendimentos são
menores que os observados neste estudo, que corresponderam 91% e 76% para o bagaço prétratado utilizando a razão de 1:3 e 1:1, respectivamente.
De forma similar ao observado para os rendimentos em glicose, os rendimentos em
xilose aumentaram com a realização de um segundo ciclo de extrusão. No entanto, não houve
diferença significativa entre a realização de um ou dois ciclos de extrusão para a razão
bagaço:[Emim][Ac] de 1:8, que resultou em rendimentos em xilose de 85,9% e 84,1%,
respectivamente. Esses rendimentos em xilose são maiores que os obtidos para a hidrólise da
hemicelulose de outras biomassas tratadas com [Emim][Ac]; rendimentos em xilose de 52,5%
e 50% para a cana selvagem e palha de milho foram reportados por Qiu e coautores (2012) e
Wu e colaboradores (2011), respectivamente.
Experimentos controles, onde o bagaço foi extrusado sem a adição de [Emim][Ac],
também foram realizados. A Figura 40 mostra o perfil e a produtividade de hidrólise do
bagaço pré-tratado nas diferentes condições testadas.
A produtividade em glicose (mg/mL·h) calculada em 9 h de hidrólise foi de 7 a 7,5
vezes maior para amostras pré-tratadas com razões de bagaço:[Emim][Ac] de 1:3, 1:5 e 1:8 do
que para o bagaço in natura, enquanto produtividades 4,8 e 2,4 vezes maiores foram obtidas
para amostras pré-tratadas com razão bagaço:[Emim][Ac] de 1:1 ou extrusadas sem adição de
líquido iônico, respectivamente.
Apesar do processo de extrusão de materiais lignocelulósicos já ter sido reportado
como uma técnica de pré-tratamento eficiente, a extrusão é normalmente realizada na
presença de aditivos, como álcalis, amido (YOO et al., 2011), etilenoglicol e glicerol (LEE et
al., 2009), para diminuir o torque operacional. Os experimentos controle de extrusão
realizados sem adição de [Emim][Ac] resultaram em baixos rendimentos em glicose de 43,3%
após 72 h de hidrólise, o que pode estar relacionado a baixa fluidez e alta resistência do
bagaço seco durante a extrusão. Além disso, esse resultado pode indicar que o aumento da
velocidade de hidrólise e dos rendimentos se dá mais em função da atuação do líquido iônico
do que do processo de extrusão em si. Essa constatação também pode ser correlacionada com
o baixo torque durante o processo de extrusão com a adição do líquido iônico (Figura 41),
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
114
Resultados e Discussão
indicando que as forças de cisalhamento e pressão observadas no processo de extrusão do
bagaço puro podem não ter um efeito acentuado durante a extrusão da mistura bagaço-líquido
iônico, tendo a extrusora, nesse caso, o papel de um reator de mistura eficiente.
Figura 41. (a) Perfil de hidrólise enzimática do bagaço (×) in natura; (♦) extrusado sem adição de
[Emim][Ac]; extrusado utilizando as razões de bagaço:[Emim][Ac] de: (■) 1:1; (+) 1:3; (●) 1:5; (▲)1:8;
(b) Produtividade da hidrólise enzimática após 9h de sacarificação. Todos os experimentos de prétratamento foram realizados a 140 °C e os resultados são relativos às amostras tratadas por dois ciclos de
extrusão.
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
115
Resultados e Discussão
Figura 42. Evolução do torque ao longo da extrusão do bagaço sem aditivo e da mistura bagaço[Emim][Ac].
Apesar de um rendimento em glicose relativamente alto (73,5%) ter sido obtido após
24 h de hidrólise do bagaço pré-tratado com a razão de bagaço:[Emim][Ac] de 1:1, ficou claro
que a quantidade de líquido iônico utilizada nesta condição limitou o efeito do pré-tratamento,
já que as taxas iniciais de hidrólise do bagaço pré-tratado foram inferiores às obtidas para as
amostras tratadas com uma maior quantidade de líquido iônico por grama de biomassa.
Esse fato pode ser correlacionado com os resultados de DRX das amostras pré-tratadas
(Figura 42). Os perfis de DRX do produto pré-tratado com a razão de bagaço:[Emim][Ac] de
1:1 mostraram apenas uma pequena variação em relação ao bagaço in natura. De fato, o
índice de cristalinidade (ICr) calculado de acordo com o método de Segal e colaboradores
(1959) foi de 57,9% para o bagaço pré-tratado com a razão 1:1 por dois ciclos de extrusão e
de 58,9% para o bagço in natura.
No entanto, o bagaço pré-tratado com as razões de bagaço:[Emim][Ac] de 1:3, 1:5 e
1:8 apresentaram perfis de DRX alterados com desaparecimento do pico I 110 e um
deslocamento do ângulo de difração do pico principal (I 200) de 22,4° para ângulos menores
(21,2°–20,9°), o que é consistente com a predominância de celulose amorfa nesses materiais.
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
116
Resultados e Discussão
Figura 43. Perfil da difração de raios-X das amostras de bagaço in natura e pré-tratadas por dois ciclos de
extrusão utilizando diferentes razões de bagaço:[Emim][Ac]. (a) bagaço in natura; bagaço extrusado com
[Emim][Ac] em uma razão de: (b) 1:1; (c) 1:3; (d) 1:5; (e) 1:8. As setas indicam o ângulo de difração do
maior pico.
Como a área de superfície específica (ASS) é um dos fatores mais importantes que
afetam a acessibilidade das enzimas, o menor efeito do pré-tratamento com a razão 1:1 na
ASS em comparação com as outras condições avaliadas também pode explicar os menores
rendimentos de hidrólise obtidos (Tabela 21). Enquanto o pré-tratamento por dois ciclos de
extrusão com as razões 1:3, 1:5 e 1:8 resultou em valores de ASS em uma faixa de 130 a 135
m2/g, o tratamento com a razão de 1:1 (considerando três ciclos de extrusão) resultou em um
valor de ASS de 98,4 m2/g. No entanto, comparando com o valor da ASS do bagaço in natura
com o do bagaço pré-tratado com a razão 1:1, uma aumento de mais de 100 vezes foi obtido.
Logo, como a cristalinidade dos materiais tratados nessa condição permaneceu praticamente
inalterada, é provável que o aumento na digestibilidade das amostras tratadas com a condição
de bagaço:[Emim][Ac] de 1:1 seja majoritariamente devido ao aumento na ASS.
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
117
Resultados e Discussão
Tabela 21. Efeito da razão de bagaço:[Emim][Ac] utilizada para o pré-tratamento na área de
superfície específica (ASS) do bagaço pré-tratado.
Razão de bagaço:[Emim][Ac]
In natura
1:1*
1:3
1:5
1:8
ASS (m2/g)
0,8
98,4
132,1
136,4
131,1
*Os valores correspondem a ASS de amostras obtidas após dois ciclos de extrusão a 140 °C, exceto a condição
de pré-tratamento com a razão de 1:1, que corresponde a três ciclos de extrusão.
As características morfológicas das amostras pré-tratadas (Figura 43) também
evidenciaram o efeito da quantidade de líquido iônico utilizada na desestruturação da parede
celular, o que está de acordo com os dados de hidrólise e ASS discutidos acima.
Figura 44. Micrografias do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado a 140 °C com uma razão de
bagaço:[Emim][Ac] de (a) 1:1 por três ciclos de extrusão; (b) 1:3 por dois ciclos de extrusão; (c) 1:5 por
dois ciclos de extrusão.
6.3.2. Efeito da temperatura do cilindro de extrusão na eficiência do pré-tratamento
O efeito da temperatura durante o pré-tratamento foi avaliado utilizando as razões de
bagaço:[Emim][Ac] de 1:3 e 1:5 e a temperatura foi variada em um faixa de 80 °C a 180 °C,
já que o [Emim][Ac] foi descrito como sendo termicamente estável até 192 °C (ALMEIDA
et al., 2012). A composição química das amostras pré-tratadas nas condições citadas acima
está mostrada na Tabela 22.
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
118
Resultados e Discussão
Tabela 22. Composição química das amostras pré-tratadas em diferentes temperaturas e por
diferentes ciclos de extrusão com a razão de bagaço:[Emim][Ac] de 1:3. Os resultados
representam a média de pelo menos duas replicatas.
Bagaço:[Emim][Ac]
Amostra
--
Bagaço in natura
80 °C - 1 ciclo
80 °C - 2 ciclos
120 °C - 1 ciclo
120 °C - 2 ciclos
140 °C - 1 ciclo
140 °C - 2 ciclos
160 °C - 1 ciclo
180 °C - 1 ciclo
140 °C - 1 ciclo
160 °C - 1 ciclo
180 °C - 1 ciclo
1:3
1:5
Composição da biomassa (%)
Lignina
Glicana
Xilana
22,7
41,9
25,0
21,1
45,5
26,2
21,2
45,3
26,0
20,3
45,8
27,0
19,9
45,8
26,9
20,9
44,8
26,5
19,8
46,4
26,2
17,7
47,9
24,4
15,7
49,1
26,8
19,9
44,6
25,6
18,8
48,1
26,1
13,7
50,0
22,9
Um único ciclo de extrusão foi realizado para as temperaturas de 160 °C e 180 °C,
porque as amostras extrusadas por dois ciclos apresentaram sinais de carbonização parcial. A
Figura 44 apresentra os rendimentos em glicose e xilose obtidos após 24 h de hidrólise
enzimática.
Figura 45. Efeito da temperatura do cilindro de extrusão e do número de ciclos realizados nos
rendimentos em glicose e xilose obtidos após 24 h de hidrólise enzimática das amostras pré-tratadas. NT
representa o bagaço não-tratado (in natura).
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
119
Resultados e Discussão
Os rendimentos em glicose obtidos com um ciclo de extrusão utilizando a razão de 1:5
nas temperaturas de 160 °C e 180 °C foram próximos a 90%. No entanto, como a biomassa se
tornou mais solúvel no [Emim][Ac] nessas temperaturas, essas condições não são
aconselháveis devido à excessiva perda de material nas roscas e no barril de extrusão (Figura
45).
Figura 46. (a) Mistura de bagaço-[Emim][Ac] na razão de 1:5 a 180 ºC; (b) Parafusos de extrusão após o
pré-tratamento da mistura bagaço-[Emim][Ac] na razão de 1:5 a 180 ºC.
Para a razão de bagaço:[Emim][Ac] de 1:3, foram testadas também as temperaturas de
80 °C e 120 °C, que após dois ciclos de extrusão resultaram em rendimento em glicose de
42,3% e 68,9%, respectivamente, e em xilose de 39,9% e 63,2%. De acordo com os resultados
apresentados na Parte I, utilizando uma razão de bagaço:[Emim][Ac] de 1:20 foram
necessários pelo menos 30 minutos de incubação a 120 °C para atingir cerca de 90% de
rendimento em 24 h. Considerando que o tempo de residência da biomassa no cilindro de
extrusão foi de aproximadamente 4 minutos, é possível que os rendimentos de hidrólise
possam aumentar com a execução de um maior número de ciclos ou pelo aumento do tempo
de residência, que pode ser proporcionado pelo uso de extrusoras maiores.
As diferenças nos rendimentos obtidos para as amostras extrusadas em temperaturas
diferentes podem ser correlacionadas com o aumento da ASS (Tabela 23).
Tabela 23. Efeito da temperatura utilizada durante o pré-tratamento na área de superfície
específica (ASS) do bagaço pré-tratado com a razão bagaço:[Emim][Ac] de 1:3.
Temperatura (°C) e n° de ciclos
80 – 1 ciclo
120 – 1 ciclo
140 – 1 ciclo
140 – 2 ciclos
160 – 1 ciclo
180 – 1 ciclo
ASS (m2/g)
21,3
30,1
58,4
132,1
145,1
206,0
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
120
Resultados e Discussão
Como mostrado na Tabela 23, a ASS aumentou com o aumento da temperatura.
Comparando com os dados apresentados na Tabela 21, é possível dizer que um aumento
acentuado na ASS (> 100 m2/g) é necessário para se obter um alto rendimento de hidrólise nas
condições de pré-tratamento utilizadas. Ainda, analisando conjuntamente os dados das
Figuras 39 e 44, observa-se que os pré-tratamentos com a razão de 1:3 a 140 °C por dois
ciclos de extrusão ou a 160 °C por um ciclo de extrusão são igualmente eficientes.
A Figura 46 mostra os perfis de DRX dos produtos extrusados por um ciclo na faixa
de temperatura de 80 a 180 °C. Perfis de DRX das amostras tratadas na faixa de 80–140 °C
indicaram a presença ainda de um percentual significativo de cristalinidade, evidenciado pela
presença de difração relativa ao plano cristalino I 110 (em torno de 16,5º), enquanto os perfis
das amostras pré-tratadas a 160 °C e 180 °C mostraram que a estrutura cristalina foi altamente
modificada.
Figura 47. Perfis de difração de raios-X das amostras pré-tratadas em diferentes temperaturas com a
razão de bagaço:[Emim][Ac] de 1:3. As setas indicam o ângulo de difração do maior pico.
A Figura 47 apresenta micrografias de amostras pré-tratadas nas diversas
temperaturas. As imagens são consistentes com os resultados de hidrólise enzimática,
mostrando uma maior desestruturação da morfologia da superfície com o aumento da
temperatura (Figuras 47a-d). As amostras pré-tratadas a 160 °C exibiram uma morfologia
com estruturas que apresentaram espessura menor que 100 mm e menos ordenadas que as
tratadas a 80 °C e 120 °C. Na Figura 47e, correspondente à amostra tratada a 180 °C,
estruturas mais agregadas foram observadas, o que pode estar relacionado ao preparo da
amostra ou a efeitos negativos da temperatura elevada.
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
121
Resultados e Discussão
Figura 48. Micrografias do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com uma razão bagaço:[Emim][Ac] de
1:3 por um ciclo de extrusão a (a) 80 °C, (b) 120 °C, (c) 140 °C, (d) 160 °C, (e) 180 °C.
6.3.3. Comparação da extrusão com o processo de dissolução do bagaço
A Figura 48 apresenta uma comparação resumida dos dados apresentados na Parte I
com os dados desta sessão do trabalho, mostrando os perfis de hidrólise do bagaço pré-tratado
com uma razão de biomassa:[Emim][Ac] de 1:20, a 120 °C por 30 e 120 min e com a razão de
1:3, a 140 °C por até três ciclos de extrusão.
Figura 49. Comparação dos rendimentos em glicose obtidos após a hidrólise enzimática das amostras prétratadas com as razões de bagaço:[Emim][Ac] de 1:20, por 30 min e 120 min, e bagaço:[Emim][Ac] de 1:3,
por até 3 ciclos de extrusão.
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
122
Resultados e Discussão
Após 24 h de hidrólise, o rendimento em glicose para o pré-tratamento por 120 min foi
de 94%, enquanto o pré-tratamento por dois ciclos de extrusão (aproximadamente 8 min),
resultou em 90,6% de rendimento. O valor da ASS para ambas as condições foi semelhante,
sendo de 131,8 m2/g (ver Tabela 12) para o tratamento com a razão de 1:20, por 120 min e
132,1 m2/g (ver Tabela 23) para o pré-tratamento com a razão 1:3 por dois ciclos de extrusão.
Da mesma forma, o perfil de hidrólise e a ASS do bagaço pré-tratado com a razão 1:20
por 30 min foram semelhantes ao do bagaço pré-tratado com a razão 1:3 por um ciclo de
extrusão (~4min), correspondendo a 61,2 m2/g (ver Tabela 12) e 58,4 m2/g (ver Tabela 23),
respectivamente.
Experimentos controles do pré-tratamento com a razão bagaço:[Emim][Ac] de 1:3
também foram realizados no mesmo equipamento utilizado para fazer os pré-tratamentos com
razão de 1:20 (Carousel 12 Plus - Radleys, Reino Unido), empregando um tempo de
incubação (12 min), que seria equivalente ao tempo de pré-tratamento utilizando 3 ciclos de
extrusão. Nessas condições, o rendimento máximo de conversão da celulose em glicose
obtido foi de 46%, mostrando a importância da utilização da extrusora.
Este é o primeiro trabalho que mostra a possibilidade de uso de líquidos iônicos em
um pré-tratamento contínuo e com um curto tempo de reação. Comumente, trabalhos de prétratamento do bagaço e de outroas biomassa com líquidos iônicos têm empregado tempos de
reação de pelo menos 30 minutos (ver Tabelas 5 e 6 da revisão bibliográfica), sendo muitas
vezes o pré-tratamento realizado por mais de uma hora para a obtenção de rendimentos
satisfatórios.
6.3.4. Considerações finais – Parte III
A síntese de líquidos iônicos mais baratos, preferencialmente derivados de compostos
biológicos e a redução da carga de líquido iônico necessária para o pré-tratamento foram
apontados como fatores chave para a viabilidade tecno-econômica de uma biorrefinaria
baseada nesta tecnologia (KLEIN-MARCUSCHAMER et al., 2011).
Estes autores também concluíram que reduzir a carga de líquido iônico é mais
importante que aumentar a sua taxa de reciclo, pois traria mais benefícios para a biorrefinaria,
como menor custo de capital e menor gasto de energia. Apesar disso, muitos trabalhos focam
preferencialmente em estudar a taxa de reciclo e reuso do líquido iônico do que avaliar a
possibilidade de redução de seu consumo (REF).
Neste trabalho, o uso da extrusora para facilitar o pré-tratamento do bagaço em alto
teor de sólidos com o líquido iônico [Emim][Ac] possibilitou não só uma redução
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
123
Resultados e Discussão
significativa na quantidade de líquido iônico requerida por grama de bagaço, como também
reduziu o tempo necessário de interação entre o [Emim][Ac] e o bagaço para obter um prétratamento efetivo, de 120 min para 8 min, obtendo rendimentos em glicose de cerca de 90%,
após 24 h de sacarificação.
Adicionalmente, como uma extrusora de escala laboratorial com a razão L/D de 17 foi
utilizada (27 cm de comprimento), a necessidade de ciclos de extrusão pode ser eliminada
com o uso de extrusoras maiores e o estudo de designs de roscas mais eficientes para este
propósito, possibilitando um maior tempo de interação entre a biomassa e o liquido iônico.
Dessa forma, resultados ainda melhores talvez possam ser atingidos.
É importante ressaltar que esta é uma proposta inovadora de um pré-tratamento
contínuo empregando o uso de um líquido iônico. Apesar de atualmente os líquidos iônicos
apresentarem um custo incompatível com sua aplicação para o pré-tratamento da biomassa, o
desenvolvimento futuro de líquidos iônicos com menor custo (BRANDT et al., 2011; HU et
al., 2007; FUKUYA et al., 2007; PLECHKOVA e SEDDON, 2008) pode viabilizar o uso
dessa técnica. Além disso, o pré-tratamento com líquidos iônicos pode ser otimizado para a
obtenção de uma fração de lignina altamente pura, com alto valor agregado. Este modelo pode
representar uma opção para uma biorrefinaria autossustentável, já que o ganho com a fração
de lignina pode ser relevante a ponto de tornar-se a principal fonte de renda da biorrefinaria, o
que viabilizaria o preço do etanol de biomassa.
7. Conclusões
125
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Conclusões
Apesar do atual cenário do alto custo dos líquidos iônicos, que pode restringir o seu
uso, e da clara necessidade de mais investimentos em P&D, os líquidos iônicos apresentam
um potencial único de uso na perspectiva de uma biorrefinaria, devido às suas características e
capacidade incomuns de promover modificações na estrutura da biomassa e sua
especificidade no processamento da mesma.
Neste trabalho, o uso de líquidos iônicos para o pré-tratamento do bagaço de cana-deaçúcar foi planejado visando explorar essa nova técnica de pré-tratamento, tanto nos seus
aspectos fundamentais como nos mais aplicados. Um resumo dos principais resultados e
conclusões do estudo encontra-se listado abaixo:

O [Emim][Ac] foi selecionado entre seis líquidos iônicos testados por ser capaz de
promover um aumento significativo nos rendimentos finais e nas taxas iniciais de
sacarificação do bagaço. Um aumento na extração de componentes da biomassa para a
fração líquido iônico-água, conjuntamente com o aumento na ASS e diminuição da
cristalinidade foram observados paralelamente ao aumento na temperatura e no tempo
de pré-tratamento, sugerindo que esses são fatores importantes para o aumento da
digestibilidade do bagaço;

Uma hidrólise efetiva do bagaço e da celulose pré-tratados com [Emim][Ac]
utilizando-se endoglucanases foi obtida, implicando em um requerimento menor de
CBH para a hidrólise desses materiais. Esses resultados mostram que o pré-tratamento
com [Emim][Ac] poderia facilitar o desenvolvimento de um processo de conversão da
celulose a etanol em uma única etapa por linhagens de microrganismos fermentativos
que expressem celulases, mesmo que a CBH destes microrganismos não seja secretada
em altos níveis;

Um pré-tratamento inovador e eficiente acoplando o uso de um líquido iônico com o
processamento contínuo da biomassa foi desenvolvido. Essa abordagem permitiu uma
considerável diminuição da quantidade de líquido iônico e do tempo necessários ao
processamento da biomassa. Dessa forma, abre-se um espaço para o avanço do uso
dos líquidos iônicos em condições economicamente mais favoráveis.
8. Trabalhos
Futuros
127
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Trabalhos Futuros
O uso de líquidos iônicos para o processamento da biomassa é uma área em expansão,
com ainda muitos aspectos a serem explorados. Como continuidade deste trabalho, projetos
futuros estão sendo planejados visando avaliar outros parâmetros e opções que não fizeram
parte deste estudo, como:

Realização de testes de novos líquidos iônicos para o pré-tratamento da biomassa da
cana-de-açúcar, em parceria com o Instituto Nacional de Tecnologia (INT/MCTI). Os
líquidos iônicos a serem testados são inéditos e estão sendo sintetizados na
Universidade Federal de Juiz de Fora;

Avaliação do desempenho de outros líquidos iônicos potencialmente mais baratos que
o [Emim][Ac] no sistema de pré-tratamento com alta carga de sólidos acoplado à
extrusão desenvolvido nesse trabalho. Para tal, uma extrusora de escala laboratorial de
rosca-dupla da Thermo-Haake, modelo PTW16, está sendo adquirida e será instalada
no prédio Bioetanol (IQ/COPPE), localizado no campus da UFRJ;

Avaliação de outros parâmetros do pré-tratamento com líquido iônico acoplado à
extrusão, como diferentes configurações das roscas de extrusão e controle da
alimentação;

Realização de estudos visando a avaliação dos aspectos econômicos do processo de
pré-tratamento desenvolvido. Este estudo poderá ser realizado com o auxílio do
software SuperPro Designer (Intelligen, EUA), que já foi utilizado por pesquisadores
do Joint BioEnergy Institute (Berkeley, EUA) para a avaliação tecno-econômica de
uma biorrefinaria baseada em líquidos iônicos;

Avaliação do pré-tratamento por extrusão da biomassa da cana-de-açúcar com outros
aditivos, já que experimentos preliminares realizados no decorrer desta tese, que não
foram incluídos na descrição dos resultados, indicaram a possibilidade de realização
de um pré-tratamento efetivo do bagaço de cana-de-açúcar por extrusão utilizando o
glicerol como um aditivo.
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Anexos
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Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Anexos
1. Publicações em periódicos e patente relacionadas ao tema da tese:

Silva, A.S.; Lee, S-H.; Endo, T.; Bon, E.P.S.
Major improvement in the rate and yield of enzymatic saccharification of sugarcane bagasse via
pretreatment with the ionic liquid 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate ([Emim] [Ac]).
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
Silva, A.S.; Teixeira, R. S. S.; Endo, T.; Bon, E.P.S.; Lee, S-H.
Continuous pretreatment of sugarcane bagasse at high loading in an ionic liquid using a twinscrew extruder. Green Chem., v. 15 (7), p. 1991 – 2001, 2013.

Teixeira, R. S. S*.; Silva, A.S.*; Kim, H-W.; Ishikawa, K.; Endo, T.; Lee, S-H.;
Bon, E.P.S.
Use of cellobiohydrolase-free cellulase blends for the hydrolysis of microcrystalline cellulose
and sugarcane bagasse pretreated by either ball milling or ionic liquid [Emim][Ac]. Bioresource
Technology, v. 149, p. 551-555, 2013.
*os autores contribuiram igualmente para esse trabalho

Silva, A. S.; Teixeira, R. S. S.; Bon, E. P. S.; Endo, T.; Lee, S-H.
Processo de produção de moléculas orgânicas a partir da biomassa. 2013, Brasil.
Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro: BR10201301041, data de depósito:
30/04/2013, título: "Processo de produção de moléculas orgânicas a partir da biomassa",
Instituição de registro:INPI - Instituto Nacional da Propriedade Industrial.
2. Outras publicações em periódicos no período do doutorado:

Teixeira, R. S. S*.; Silva, A.S.*, Ferreira-Leitão V.; Bon, E.P.S.
Amino acids interference on the quantification of reducing sugars by the 3,5-dinitrosalicylic acid
assay mislead the measurement of carbohydrases activity. Carbohydrate Research, v. 363, p. 3337, 2012.
*os autores contribuiram igualmente para esse trabalho

Gottschalk, L.M.F.; Paredes, R.S.; Teixeira, R.S.S.; Silva, A.S.; Bon, E.P.S.
Efficient production of lignocellulolytic enzymes xylanase, β-xylosidase, ferulic acid esterase
and β-glucosidase by the mutant strain Aspergillus awamori 2B.361 U2/1. Brazilian Journal of
Microbiology, v. 44, p. 569-576, 2013.
3. Capítulo de livro:
 Molinari, H. B. C.; Silva, A.S.; Teixeira, R.S.S.; Barcelos, C.A.; Júnior, N.P.; Bon, E.P.S.;
Ferreira-Leitão, V. Matérias-primas Sacarinas e Lignocelulósicas para Biorrefinarias. In:
Sílvio Vaz Jr.. (Org.). Biorrefinarias: Cenários e Perspectivas. Brasília - DF: Athalaia Gráfica
e Editora, 2012, v. 1, p. 45-65.

Silva, A. S.; Teixeira, R. S. S.; Moutta, R.; Barros, R. R. O.; Ferrara, M. A.; Ferreira-Leitão,
V.; Bon, E. P. S. Sugarcane and woody biomass pretreatments for ethanol production. In:
Chandel, A. K.; Silva; S. S. (Org.). Sustainable Degradation of Lignocellulosic Biomass Techniques, Applications and Commercialization. 1ed. Reijka: InTech Europe, 2012, v. 1, p.
47-88. ISBN: 980-953-307-446-2.

Silva, A. S.; Teixeira, R. S. S.; Barcelos, C. A.; Martins, M. T. B.; Molinari, H. B. C., Pereira
Jr., N.; Ferreira-Leitão, V.; Bon, E.P.S. Biomassa como fonte de energia renovável. In: Reis,
152
Tese de doutorado - Ayla Sant’Ana da Silva
Anexos
R. A., Bernardes, T. F., Siqueira, G. F. (Editores) Forragicultura: Ciência, Tecnologia e
Gestão dos Recursos Forrageiros. (Em processo final de editoração).
4. Prêmios:

Student Award 2011 na 19th European Biomass Conference and Exhibition, Berlim.

Menção Honrosa na categoria de doutorado do evento dos 50 anos do Programa de Pósgraduação em Bioquímica.