Haje DP, Thomazini JA, Volpon JB
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ARTIGO ORIGINAL
Efeitos do processamento químico, da esterilização em
óxido de etileno e da usinagem em parafusos de osso
bovino: estudo com microscopia eletrônica de varredura*
Effects of chemical processing, oxide ethylene sterilization,
and machining on screws made of bovine bone:
a scanning by electron microscopy study
DAVI
DE
PODESTA HAJE1, JOSÉ ANTONIO THOMAZINI2, JOSÉ B. VOLPON3
RESUMO
Objetivo: Avaliar a influência do processo de preparação química, esterilização em óxido de etileno e usinagem
sobre a microestrutura da superfície óssea visando a estudos futuros para confecção de parafusos ósseos. Métodos:
A partir de osso obtido do córtex externo de tíbias bovinas
foram obtidas amostras em formato de cubos e confeccionados parafusos, com o uso de técnicas de mecânica de
precisão. Metade desse material foi conservada sob refrigeração e, a outra metade, processada quimicamente, com
fixação em álcool etílico, clareamento em água oxigenada,
desengorduramento em éter etílico, secagem em estufa e
esterilização em óxido de etileno. A repercussão desse tratamento sobre a estrutura óssea foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura realizada em todas as amos-
* Trabalho realizado no Laboratório de Bioengenharia e no Laboratório de
Microscopia Eletrônica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP,
com apoio CAPES.
1. Doutor em Ciências Médicas; Preceptor de Residência Médica e Ortopedista Pediátrico e de Pé Adulto do Hospital de Base do Distrito Federal, do
Centro Clínico Orthopectus, da Clinor e Hospital Anchieta, Brasília (DF),
Brasil.
2. Professor Assistente Doutor do Departamento de Cirurgia e Anatomia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo –
Ribeirão Preto (SP), Brasil.
3. Professor Titular do Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto –
Universidade de São Paulo – Ribeirão Preto (SP), Brasil.
Endereço para correspondência: Davi P. Haje, SHIS QL 12, conj. 10, casa 18,
Lago Sul – 71630-305 – Brasília (DF), Brasil. E-mail: [email protected]
Recebido em 10/ 10/06. Aprovado para publicação em 12/4/ 07.
Copyright RBO2007
Rev Bras Ortop. 2007;42(4):120-4
tras. A comparação foi com os corpos do mesmo material
e formato, mas apenas mantidos refrigerados. Resultados:
Observou-se que a esterilização e o processamento químico utilizado causaram amalgamação da estrutura fibrilar
da superfície óssea, apenas notada em grande aumento,
tanto nos cubos ósseos, quanto nos parafusos. Com relação à usinagem, as ranhuras causadas pela instrumentação eram mais nítidas nos parafusos de osso in natura, mas
as microfraturas existentes foram qualitativamente iguais
nos dois grupos. As roscas dos parafusos apresentaram
irregularidades e microfraturas, tanto nos parafusos tratados quanto nos não tratados. Conclusão: O tratamento
químico usado e a esterilização em óxido de etileno causaram alterações de amalgamação na superfície do osso e a
usinagem provocou microfraturas, tanto nos parafusos
processados quanto nos não processados. As ranhuras causadas pela ferramenta de usinagem foram mais nítidas nas
amostras in natura dos parafusos. A repercussão desses
achados sobre o desempenho mecânico dos parafusos necessita investigações futuras.
Descritores – Parafusos ósseos; Óxido de etileno; Microscopia eletrônica de varredura; Esterilização; Processos químicos
ABSTRACT
Objective: To evaluate the effects of chemical processing,
ethylene oxide sterilization, and machining on the
microstructure of bone surface in order to contribute to future
studies on the manufacture of screws made of bone. Methods:
Specimens were obtained from the outer cortical bone of
bovine tibia, which were shaped as cubes and also as screws
by precision mechanics techniques. Half of the material was
Efeitos do processamento químico, da esterilização em óxido de etileno e da usinagem em parafusos de osso bovino: estudo com microscopia eletrônica de varredura
kept under refrigeration, and the other half was chemically
processed, fixated with ethanol, cleared in oxygenated water,
fat removed with ethylic ether, dried in an oven, and sterilized
with ethylene oxide. The impact of this treatment on the bone
structure was evaluated by scanning with an electron
microscope performed in all of the samples. The treated
specimens were compared to the similar specimens that were
kept only under refrigeration. Results: Sterilization and the
chemical processing used caused amalgamation of bone
surface fibers both in the cubes and in the screws, that could
be seen only under big Machining produced scratches that
were more easily visible in the screws made of in natura bone,
but the existing microfractures were qualitatively equal in
both groups. The threads had irregularities and
microfractures both in treated screws and in non-treated
screws. Conclusion: The chemical treatment used and the
ethylene oxide sterilization caused amalgamation changes in
bone surface, and machining caused microfractures both in
processed and in non-processed screws. Scratches caused by
the machining tool were more easily seen in the in natura
specimens of the screws. The effect of these findings on the
performance of the screw needs to be further investigated.
Keywords – Bone screws; Ethylene oxide; Microscopy, electron,
scanning; Sterilization; Chemical process
INTRODUÇÃO
O microscópio eletrônico de varredura (MEV) é um instrumento freqüentemente utilizado na avaliação da superfície de
implantes cirúrgicos e biomateriais, como, por exemplo, na
investigação das macro e microestruturas da superfície de
implantes de titânio(1-2) e de osso(3-5), e na quantificação da
porosidade de enxertos de fosfato de cálcio(6). A análise microscópica da superfície de implantes é necessária para buscar melhores condições de acabamento superficial e osteointegração. Além disso, a análise microscópica da superfície
óssea pode revelar indícios de alterações provocadas por um
meio físico ou químico sobre o tecido ósseo.
Parafusos feitos de osso têm sido desenvolvidos(3,5,7-9) com
o objetivo de superar complicações indesejáveis relatadas em
implantes confeccionados a partir de ligas metálicas e polímeros bioabsorvíveis, embora em fase experimental. Entretanto, potencialmente, poderiam ser usados apenas em algumas condições específicas que não exigem grande resistência,
como, por exemplo, epifisiodese ou fixação de uma fratura
por avulsão na região epifisária do osso da criança.
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Previamente ao uso de parafusos ósseos, é imperativo avaliar os efeitos da usinagem e de diferentes métodos de processamento químico e de esterilização sobre as características
mecânicas e estruturais do tecido ósseo. A influência dos métodos de esterilização sobre as propriedades mecânicas e a
capacidade de incorporação do enxerto ósseo são assuntos
muito discutidos na literatura(3-4,10-11). Entretanto, a avaliação
da estrutura superficial do osso processado, esterilizado e usinado é tema que necessita maior investigação.
MÉTODOS
Um parafuso ósseo (figura 1 e tabela 1) foi obtido a partir
da usinagem em torno horizontal (NDT 650, Nardini ®, Brasil).
Serviu como modelo um parafuso de aço inoxidável, cujas
características metrológicas estão apresentadas na tabela 1.
TABELA 1
Especificações técnicas dos parafusos de
osso bovino e seu correspondente metálico
Especificações
Diâmetro externo
Diâmetro do vástago
Diâmetro interno
Diâmetro externo da cabeça
Altura da cabeça
Comprimento total
Comprimento da rosca
Inclinação da rosca
Desenho da rosca
Dimensões
Parafuso
ósseo
Parafuso
metálico
04,5mm
04,5mm
03,0mm
07,0mm
10mm0,
45mm0,
22mm0,
*
*
04,5mm
04,5mm
03,0mm
08,0mm
04,6mm
40mm0.
13mm0.
*
*
* segundo a norma NBR ISO 5.835.
O osso para obtenção do parafuso foi retirado da porção
medial da diáfise da tíbia bovina de animal jovem. A usinagem da porção proximal do parafuso foi realizada com ferramentaria de aço (bits quadrado, de aço rápido com 12% de
cobalto, Steelma Ster ®, Estados Unidos). As roscas do parafuso foram confeccionadas com a utilização de um rebolo de
ponta montada de óxido de alumínio (grupo B-71, Brasilex ®,
Brasil). Depois, os parafusos foram seccionados transversalmente com uso de uma serra de precisão (Isomet 1000, Precision Saw, Buehler ®, Estados Unidos), sob refrigeração, totalizando 12 espécimes, de bases de 4,5 x 3mm, sendo metade
das amostras proveniente da porção rosqueada e o restante,
da porção lisa proximal.
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Figura 1 – Parafuso confeccionado de osso bovino, cujas superfícies lisa e rosqueada foram analisadas pela microscopia eletrônica de varredura, tanto para peças in natura, como processadas quimicamente e esterilizadas em óxido de etileno
Além dos parafusos, da mesma tíbia bovina e da mesma
região de onde fora obtido o osso para confecção do parafuso,
foram retiradas, com serra de precisão, amostras da superfície
óssea, que depois foram recortadas de modo a fornecer seis
blocos cúbicos de 3,0 x 3,0mm. No preparo dos espécimes, a
superfície da córtex externa foi limpa, sendo o periósteo retirado manualmente e o osso lavado com banhos sucessivos de
soro fisiológico.
Metade de todo material (parafusos e cubos ósseos) foi armazenada sob refrigeração, em temperatura média de 4°C. A
outra metade das amostras foi processada quimicamente e
esterilizada em óxido de etileno, conforme descrito por Volpon et al (12), e que, basicamente, consistiu nos seguintes passos: fixação em álcool absoluto por 48 horas, clareamento em
água oxigenada por 24 horas, remoção da gordura em éter
etílico por 24 horas, desidratação em álcool absoluto por 48
horas e secagem em estufa durante 24 horas.
Depois, as amostras foram acondicionadas em embalagens
próprias e esterilizadas em óxido de etileno (utilizando 2,0kg
de gás por ciclo, com tempo de esterilização de três horas e
aeração e hiperventilação de duas horas cada, à temperatura
de 55°C, na pressão de 0,5kgf/cm2, com –0,5kgf/cm2 de vácuo, no aparelho da marca Sercon®, Alemanha).
Para o exame em microscopia eletrônica, todas as amostras
foram recortadas para um tamanho adequado e submetidas ao
seguinte preparo: (1) desidratação em concentrações crescentes de etanol (30°-50°-75°-85°-95°-100°, por 10 minutos cada);
(2) secagens em dióxido de carbono líquido na temperatura
de 37°C em um equipamento CPD 030 (Critical Point Dryer,
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Bal-Tec ®, Alemanha); (3) fixação em suportes de alumínio
com cola condutora à base de prata, a qual foi aplicada nas
adjacências das peças para melhorar o escoamento de elétrons; (4) cobertura com uma fina camada de ouro 24k em
alto vácuo em um sputter coater modelo SCD 050 (Super Cool
Sputtering System, Bal-Tec ®, Alemanha), tornando as amostras refletoras para o feixe de elétrons.
Por fim, as amostras foram observadas e fotografadas utilizando-se filmes da Kodak ® Tmax iso100 de 120mm, em um
MEV (JSM – 5200, Jeal ®, Japão), sendo estudada a porção correspondente ao córtex externo da tíbia e à superfície do parafuso. As imagens foram analisadas em aumentos de 35 a 5.000
vezes (x), quando foram observados o aspecto geral da peça e
a regularidade da superfície. Nos aumentos de 1.000x e 5.000x
foram estudadas a regularidade da superfície e a presença ou
ausência de microfissuras. Nas amostras obtidas do córtex
externo da tíbia também foi avaliado o padrão do trabeculado
ósseo. As comparações realizadas foram as seguintes:
a) Blocos do córtex externo da tíbia: processado x in natura,
b) Blocos do córtex externo do osso in natura x superfície
lisa e rosqueada do parafuso in natura,
c) Porções lisas e rosqueadas do parafuso: processado x in
natura,
d) Porção lisa x porção rosqueada do parafuso in natura.
RESULTADOS
Blocos do córtex externo da tíbia bovina – processado x in
natura: não foram encontradas diferenças na superfície óssea
nos aumentos de 35 a 1.000x entre as amostras. Entretanto,
no osso processado, com o aumento de 5.000x, a superfície
óssea estava mais lisa que na amostra de osso in natura, aparentemente com condensação das fibras colágenas, em processo de amalgamação (figura 2, A e B).
Blocos do córtex externo da tíbia in natura x superfície lisa
e rosqueada do parafuso in natura: na análise das imagens
das amostras do parafuso, houve a presença de microfissuras
na superfície, tanto na porção lisa, quanto rosqueada (figura
2, F e G), o que não ocorreu nos blocos do córtex externo da
tíbia.
Porção lisa e porção rosqueada do parafuso: processado x
in natura: nas amostras da porção lisa do parafuso, nos aumentos de 35 a 1.000 x, foram encontradas ranhuras do passo
da ferramenta de usinagem (figura 2, C), principalmente nas
amostras de osso in natura. A análise da porção rosqueada no
aumento de 35x mostrou, em algumas peças, a presença de
irregularidades grosseiras no ápice das roscas (figura 2, D),
Efeitos do processamento químico, da esterilização em óxido de etileno e da usinagem em parafusos de osso bovino: estudo com microscopia eletrônica de varredura
A
D
G
B
C
C
E
FF
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Figura 2 – Micrografia eletrônica de varredura de amostras do córtex externo da tíbia (A
e B) e do parafuso ósseo (C-G). As ilustrações A, C, D, F e G, e B e E correspondem a
amostras ósseas in natura e processadas, respectivamente. Nas amostras do córtex
externo da tíbia (5.000x) foi observada presença de estrutura fibrilar normal nas amostras de osso in natura (A) e verificada superfície mais lisa nas amostras de osso processado (B). Nas amostras de osso in natura observou-se a presença de bactérias (setas em
A). No aumento de 35x, nas amostras da porção proximal do parafuso foi possível observar os passos da ferramenta (C), enquanto que nas amostras da porção rosqueada
foram vistas irregularidades nos ápices das roscas (seta em D) e comprimentos diferentes de ápice de roscas (D e E). No aumento de 5.000x, a porção rosqueada (F), de forma
geral, apresentou superfície óssea mais irregular que a porção proximal do parafuso
(G), tendo ambas mostrado microfissuras em sua superfície (setas).
além de comprimentos de ápice de roscas visivelmente diferentes (figura 2, D e E).
Em nenhum aumento, na análise da superfície do parafuso,
foram observadas diferenças entre as peças in natura e aquelas processadas, salvo pelas alterações descritas anteriormente. Para um mesmo grupo de peças, usinadas pela mesma ferramenta, a quantidade e o padrão das microfissuras pareceram
semelhantes nas peças de osso processado e in natura. A quantidade de microfissuras variou em diferentes regiões analisadas de uma mesma peça. Foram observadas bactérias na superfície do osso in natura no aumento de 5.000x.
Porção lisa x porção rosqueada do parafuso in natura: nas
amostras analisadas, o rebolo de ponta montada, de forma
geral, produziu uma superfície óssea mais irregular que o bits
de aço. Mas a quantidade e o padrão das microfissuras presentes pareceu igual na comparação entre esses dois tipos de
peças (figura 2, F e G).
DISCUSSÃO
Os efeitos de diferentes métodos de esterilização sobre a
estrutura do tecido ósseo são relatados em alguns estudos. O
aquecimento do osso causa desnaturação e retração do colágeno(13). Voggenreiter et al (14), por meio de microscopia eletrônica, concluíram que a autoclavagem a 134°C causa desnaturação da matriz orgânica óssea, que se acentua com o
aumento do tempo em que o osso permanece na autoclave.
As alterações no osso verificadas por Actis et al (3-4), que
analisaram em microscopia eletrônica de varredura parafusos
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ósseos autoclavados, foram semelhantes às encontradas em
nosso estudo para as amostras do córtex externo da tíbia (processadas pela técnica de Volpon et al (12)), ou seja, ocorreu condensação das fibras colágenas superficiais. Essas alterações
estruturais superficiais podem ter-se estendido a um plano mais
profundo do tecido ósseo e ser causa de repercussões na resistência mecânica de parafusos de osso. Doherty et al (10) encontraram, com uso de microscopia eletrônica de transmissão,
que o óxido de etileno causou alterações microestruturais na
superfície óssea e que a profundidade das alterações foi dependente do tempo de exposição ao gás, principalmente quando o período de esterilização excedeu uma hora.
Outro ponto a ser discutido é a situação da superfície óssea
produzida após a usinagem. A usinagem causou microfissuras na superfície óssea, mas ferramentas menos duras que o
aço, como o rebolo de óxido de alumínio, por exemplo, produziriam superfície mais rugosa ou irregular. Porém, não se
sabe se essas microfraturas poderão ser responsáveis por menor resistência mecânica clinicamente significante em parafusos de osso. Mora(5) mostrou, com a usinagem do osso cortical, com variações dos parâmetros de corte e da geometria
da ferramenta, que é possível manipular a morfologia da superfície do osso. Segundo esse mesmo autor, o grau de dano
causado pelo processo de usinagem sobre as camadas superficiais do implante é dependente das condições de corte, sen-
do de importância relevante, tanto para o comportamento
mecânico, quanto para a resposta biológica dos tecidos do
receptor sobre o implante. Não existem estudos que mostrem
como deve ser a superfície ideal de um implante de osso, ou
seja, que permita sua osteointegração mais rápida, sem comprometer significativamente a resistência mecânica do material.
CONCLUSÃO
O tratamento químico aqui usado e a esterilização em óxido de etileno causaram alterações na superfície do osso caracterizadas por amalgamação das fibras. A usinagem causou
microfraturas e não apresentou precisão suficiente a ponto de
produzir roscas semelhantes, tanto nos parafusos processados
quanto nos não processados. As ranhuras causadas pela ferramenta de usinagem foram mais nítidas nas amostras in natura
do parafuso. A repercussão desses achados sobre o desempenho mecânico do parafuso necessita investigações futuras.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao Laboratório de Microscopia Eletrônica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, pelo processamento das
amostras ósseas para a microscopia eletrônica de varredura, e à Oficina de Precisão da Prefeitura do Campus de Ribeirão Preto-USP,
pela usinagem das peças.
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