1975 - Stanley Cohen
Plasmídeo
Conferencia de Asilomar - 1975
Pacific Grove - California USA
- 139 cientistas de 17 nações
- Recombinant DNA Advisory Commitee - RAC
Normas para contenção biológica - P1  P4
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
W. Alber
H. Smith
D. Nathans
Ferramentas de trabalho
Enzimas de restrição
Sistema restrição/modificação
Tipo II - utilizadas na TDR: reconhecem seqüências
específicas de nucleotídeos no DNA - palíndromos,
atuam como verdadeiras tesouras moleculares
Tipos de cortes:
Produção
de
protuberantes)
terminais
coesivos
Produção de terminais abruptos (ou cegos)
(adesivos,
a) Clivagem no eixo de simetria
...TC GA...
...AG CT...
3 ’
b) Clivagem simétricamente situada ao
redor do eixo de simetria
...GAA TTC...
...CTT AAG...
5 ’
+
5 ’
3 ’
3 ’
5 ’
+
5 ’
Moléculas com extremidades
abruptas
3 ’
Moléculas com extremidades
coesivas
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Gênero
EcoRI
Espécie
Enzima
Organismo
Ordem de descoberta
Linhagem
Sequênciab
AluI
Arthrobacter luteus
5’ AG CT
BamHI
Bacillus amyloliquefasciens H
5’ G GATCC
HaeIII
Haemophilus aegyptius
5’ GG CC
HindIII
Haemophilus influenzae Rd
5’ A AGCTT
EcoRI
Escherichia coli RY13
5’ G AATTC
Enzima de restrição EcoRI
A tecnologia do DNA recombinante
Ligação
Extremidades coesivas
Fragmento
de DNA inserto
LIGASE
DNA
plasmidial vetor
Construção do DNA Recombinante
Molécula de DNA de
um plasmídeo circular
Molécula de DNA de um plasmídeo
linear com extremidades coesivas
anelamento
Clivagem com
enzima de
restrição
Ligação covalente
pela DNA ligase
Inserção em
uma célula
hospedeira
Molécula de DNA
plasmidial contendo
o inserto
Vetores
Plasmídeos
Hospedeiros
Bactérias / leveduras
Utilização
clonagem
Cosmídeos
Bacteriófagos
Virus
Células eucarióticas
Terapia gênica
Tipos de Vetores
Plasmídeos: são usados para clonar fragmentos de DNA de
vários pares de bases a centenas de pares de bases.
Bacteriófagos: são usados para clonar fragmentos de DNA de
10.000 - 20.000 pares de bases.
Cosmídeos: são estruturas híbridas que possuem
características do bacteriófago associadas à do plasmídeo
pBR322, e são utilizadas para a clonagem dos maiores
segmentos de DNA.
Chromosomos artificiais para bactérias (BAC) e leveduras
(YACs): podem ser usados para clonagem de fragmentos de
DNA com centenas a milhões de pares de bases.
Plasmídeo
pBR 322
Plasmídeo
pUC 18
Bacteriófago
Plasmídeo
para leveduras
Cosmídeos para leveduras
Cromossomo
artificial para
bactéria
Cromossomo
artificial para
leveduras
A tecnologia do DNA recombinante
Cortar o DNA
com enzimas
de restrição
Fragmento 1
Fragmento 3
Fragmento 2
Fragmento 4
Inserir
fragmentos em
vetores
Introduzir
vetores em
bactérias por:
eletroporação
ou choque
térmico
Eletroporação
Transformação
bacteriana
Plaqueamento